CN101228249B

CN101228249B - 含疏水蛋白的钻井液

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Publication number: CN101228249B
Application number: CN2006800191888A
Authority: CN
Inventors: M·古茨曼; Y·刘; U·鲍斯
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2005-04-01
Filing date: 2006-03-29
Publication date: 2011-11-30
Anticipated expiration: 2026-03-29
Also published as: EP1869138B1; DE502006005460D1; NO20074866L; ATE449829T1; BRPI0608678A2; CA2602706C; US7799741B2; WO2006103253A3; MX2007011741A; CN101228249A; MX270311B; US20090131281A1; CA2602706A1; EP1869138A2; WO2006103253A2; DK1869138T3

Abstract

本发明涉及至少一种疏水蛋白或至少一种其衍生物用作钻井液助剂的用途。

Description

含疏水蛋白的钻井液

描述

本发明涉及含疏水蛋白或其衍生物之一的钻井液，并涉及疏水蛋白用作钻井液的助剂的用途。

通常，钻井液的任务是简化开发新沉积物(例如矿物油或天然气)过程中经常艰难的钻探操作。目的是支持钻探操作和输送此过程中产生的岩石碎片。钻头和钻杆需要润滑和冷却。此外，需要补偿沉积物的流体静压力，这是经常使用高比重钻井液的原因。井壁也应当有衬。

商业使用的钻井液的重要特性包括适当的粘度和流体性质、密度、热稳定性、乳化和分散能力、pH控制、尤其是高度的环境相容性。

既然对新原材料的搜寻在世界的许多地方仍在继续，并且也需要在闭塞的地点(例如远离海岸或在热带丛林中)经常进行深层钻探，那么就存在新钻探助剂，尤其是满足高水平技术需求并可廉价生产和现场使用的钻井液助剂的需要。此外，钻井液也应该是保藏稳定的并且经长时间可使用的。

在释放到环境的事件中钻井液不导致动物和植物世界的持续破坏也是尤其重要的。

疏水蛋白是100-150个氨基酸的小蛋白质，其可从丝状真菌产生，如从裂褶菌(Schizophyllum commune)产生。它们通常每个分子具有8个半胱氨酸单位。

疏水蛋白对界面具有显著的亲和力并因此适于包被表面，例如通过形成双亲性膜改变界面的性质。例如，可通过疏水蛋白的方法包被塑料特氟隆以获得两亲表面。

疏水蛋白可从天然来源分离。此外，也已知疏水蛋白及其衍生物的合成生产方法。例如，德国专利申请DE 10 2005 007 480.4公开了疏水蛋白及其衍生物的生产方法。

现有技术已经提出疏水蛋白在各种应用中的用途。

例如，EP-A 05 016 962描述了蛋白质促进例如油/水或燃料/水混合物分相的用途。本领域技术人员已知个别双亲性分子取决于使用浓度和周围介质可对相界面具有稳定或去稳定作用。

WO 96/41882提出了疏水蛋白用作乳化剂、增稠剂、表面活性剂的用途，用于疏水表面亲水化、提高亲水基质的抗水性、产生水包油或油包水的乳浊液的用途。还提出了药学应用(如生产软膏或乳剂)和美容应用(如护肤或生产洗发香波或洗发剂)。WO 96/41882还描述了例如用于药学应用的含疏水蛋白的组合物。

EP-A 1 252 516公开了在30-80℃的温度用含疏水蛋白溶液包被窗户、隐形镜片、生物传感器、医疗仪器、进行检测或用于存储的管道、船舶外壳、固体颗粒或客车的车价和地盘。

WO 03/53383描述了疏水蛋白在美容应用中用于处理角蛋白材料的用途。

WO 03/10331公开了疏水蛋白具有表面活性性质。例如，公开了疏水蛋白包被的传感器，例如非共价结合另外的物质(例如电活性物质、抗体或酶)的检测电极。

WO 2004/000880提出了用疏水蛋白或疏水蛋白样物质包被表面。同样公开了水包油或油包水乳浊液也可通过加入疏水蛋白稳定。

涉及疏水蛋白样蛋白质的WO 01/74864也描述了它们可用于稳定分散液和乳浊液。

蛋白质用于分相的用途也基本已知。例如，GB 195,876描述了用胶体破坏油包水乳浊液的方法。以举例方式提到的胶体为蛋白质，如明胶、酪蛋白、清蛋白，或者为多糖，如阿拉伯胶或黄蓍树胶。

JP-A 11-169177公开了具有脂酶活性的蛋白质用于破坏乳浊液的用途。

WO 01/60916公开了至少一种水溶性蛋白质、至少一种水溶性多糖和至少一种水溶性高聚物(例如聚环氧乙烷)的无表面活性剂的混合物的多种用途，也包括原油破乳化的用途。

然而，所引用的文献中都没有公开疏水蛋白用作钻井液中的助剂的用途。

本发明提供了疏水蛋白用作钻井液的助剂的用途，所用的疏水蛋白特别地用作钻井液中的乳化剂。

所用的疏水蛋白优选地为融合疏水蛋白，尤其为选自之后提到的yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的融合疏水蛋白，其中yaad也可为具有20-293个氨基酸的截短融合配偶体yaad’。

钻井液通常由一种或更多种液体和悬浮或溶解的固体组成，所述的液体例如水、原油和有机添加剂或溶剂。水成钻井液、基于油的钻井液和合成钻井液的差别取决于主要液体成分的类型。

在发明的钻井液中，优选使用基于油的钻井液(例如柴油、矿物油)。同样，优选使用基于全部组成的0.1-10000ppm、优选地1-1000ppm、尤其是1-600ppm量的疏水蛋白(也可以同时使用多种疏水蛋白)。优势之一是所用的疏水蛋白的量显著低于常规乳化剂情况中所用的量，后者使用以重量计为2-10％的量。

钻井液优选地为基于油的钻井液，其包含以重量计为40-95％、优选地以重量计为70-95％的至少一种油成分、以重量计为2-80％、优选地以重量计为2-30％的水，以及根据需要的另外的成分。

另外的有用成分包括例如下列物质：

a)盐(例如碱金属和碱土金属氯化物、碱金属和碱土金属溴化物、碱金属和碱土金属碳酸盐；这些盐也经常起到控制pH值的作用)，

b)补偿液体损失的添加剂(例如膨润土、淀粉、纤维素或其衍生物)，

c)着湿剂(使上述添加剂(例如膨润土)可油湿润)，

d)流动改进剂(降低流阻，例如丙烯酸类树脂、聚硅氧烷、聚氨基甲酸酯)，

e)增加钻井液比重的添加剂(例如重晶石、赤铁矿、磁铁矿、钛铁矿、菱铁矿、白云石、方解石、氯化钠)，

f)乳化剂(例如脂肪酸盐、聚酰胺)，

g)其它添加剂，例如分散剂、流体损失添加剂、聚合物或共聚物、胺(例如聚丙烯酰胺)，

h)增粘添加剂(例如膨润土、石绒)。

在本发明优选的实施方案中，使用至少一种促进乳浊液形成的另外的化合物和疏水蛋白。

本发明也涉及钻井的方法，尤其涉及开发地下沉积物、尤其是开发油和气的方法，其中使用包含至少一种疏水蛋白或其衍生物的钻井液。优选使用上述融合疏水蛋白。

在钻探过程中，通常使用基于油的钻井液，其包含以重量计为40-95％的至少一种油成分(例如生物柴油)、以重量计为2-60％的水(例如淡水或海水)以及根据需要的另外的成分。

本发明还提供了钻井液本身，其包含至少一种疏水蛋白。

在特别的实施方案中，钻井液包含以重量计为70-95％的至少一种油成分(例如生物柴油)、以重量计为2-30％的水，以及根据需要以重量计最多为13％的另外的成分(例如膨润土和/或氯化钙)。

本发明也涉及生产钻井液的方法，其中疏水蛋白成分和钻井液的其余成分完全混合。这可在工业生产地点或其它地点完成，例如在钻井平台完成。

使用蛋白质(如疏水蛋白)作为钻探助剂具有这样的优势，它们是天然存在的或天然类似的物质，其是可生物降解的从而不引起对环境的持续破坏。

在例如钻探油沉积物的许多大规模应用中，关键因素是所用助剂的非常长时间的持续可用性。本发明的目的是提供使用特定蛋白质进行地球钻探的改进的方法。

在本发明中，疏水蛋白也理解为是指其衍生物或经修饰的疏水蛋白。经修饰的或衍生的疏水蛋白可例如为疏水蛋白融合蛋白或与疏水蛋白的序列具有至少60％同一性，例如至少70％同一性、尤其至少80％同一性、更优选地至少90％同一性、甚至优选地至少95％同一性的蛋白质和满足疏水蛋白生物学特性达50％的程度，例如达60％的程度、特别是达70％的程度、更优选地达80％的程度的蛋白质，特别是通过用这些蛋白质包被改变表面性质以使用蛋白质包被玻璃表面之前或之后的水滴接触角增加至少20°、优选地至少25°、尤其是至少30°的性质。

已经惊奇地发现疏水蛋白或其衍生物在寻找和开发沉积物中提高钻探性能。这也是基于防止钻井液和所输送物质的快速分相的事实。在本文中，甚至小量的疏水蛋白都相当有效。

对定义疏水蛋白来说关键的是疏水蛋白的结构特异性而非序列特异性。天然疏水蛋白的氨基酸序列非常多样，但是它们都具有8个保守半胱氨酸残基的高度特征性模式。这些残基形成四个分子内二硫键。N端和C端可在相对大的范围内变化。在此可以通过本领域技术人员已知的分子生物学技术向融合配偶体添加一个长10-500个氨基酸的蛋白质。此外，疏水蛋白及其衍生物在本发明中理解为是指具有相似结构并且功能相当的蛋白质。

在本发明中，术语“疏水蛋白”在此后应理解为是指通用结构式(I)的多肽：

X_n-C¹-X_1-50-C²-X_0-5-C³-X_1-100-C⁴-X_1-100-C⁵-X_1-50-C⁶-X_0-5-C⁷-X_1-50-C⁸-X_m(I)其中X可为20个天然存在氨基酸(Phe、Leu、Ser、Tyr、Cys、Trp、Pro、His、Gln、Arg、Ile、Met、Thr、Asn、Lys、Val、Ala、Asp、Glu、Gly)中的任何一个。在式中，X在每一种情况中可相同或不同。X旁边的每一个指数为氨基酸的量，C为半胱氨酸、丙氨酸、丝氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸，其中至少四个命名为C的残基为半胱氨酸，指数n和m为0-500间，优选地15-300间的互相独立的自然数。

式(I)多肽的特征也在于，室温包被玻璃表面之后与未包被玻璃表面上相同大小水滴的接触角的每一种情况相比，它们引起水滴的接触角增加至少20°，优选地至少25°并且更优选地至少30°。

命名为C¹到C⁸的氨基酸优选地为半胱氨酸；然而，它们也可以由其它具有相似空间填充的氨基酸替代，优选地由丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸或甘氨酸替代。然而，位点C¹到C⁸的至少4个、优选地至少5个、更优选地至少6个和尤其是至少7个应该由半胱氨酸组成。在发明的蛋白质中，半胱氨酸可以还原形式存在或与另一个氨基酸形成二硫键。尤其优选的是分子内形成C-C键，特别是至少一个分子内二硫键、优选地至少2个、更优选地至少3个和最优选地至少4个分子内二硫键。在上述半胱氨酸交换为具有相似空间填充的氨基酸的情况中，此类C位点有利地成对交换，其可与另一个氨基酸形成分子内二硫键。

如果半胱氨酸、丝氨酸、丙氨酸、甘氨酸、甲硫氨酸或苏氨酸也用在命名为X的位置，通式中各个C位置的编号可相应地改变。

优选使用通式(II)的疏水蛋白开展本发明：

X_n-C¹-X_3-25-C²-X_0-2-C³-X_5-50-C⁴-X_2-35-C⁵-X_2-15-C⁶-X_0-2-C⁷-X_3-35-C⁸-X_m(II)

其中X、C以及X和C旁的每一个指数如上所定义，指数n和m每一个为0-300的数字，蛋白质还具有上述接触角变化的特点，此外，至少6个命名为C的残基为半胱氨酸。更优选地，所有C残基为半胱氨酸。

尤其优选使用通式(III)的疏水蛋白：

X_n-C¹-X_5-9-C²-C³-X_11-39-C⁴-X_2-23-C⁵-X_5-9-C⁶-C⁷-X_6-18-C⁸-X_m (III)

其中X、C以及X旁的每一个指数为如上所定义，指数n和m每一个为0-200的数字，蛋白质还具有上述接触角变化的特点，命名为C的残基中至少6个为半胱氨酸。更优选地，所有的C残基为半胱氨酸。

X_n和X_m残基可为天然地也与疏水蛋白连接的肽序列。然而，一个或两个残基也可为天然不与疏水蛋白连接的肽序列。这也理解为是指疏水蛋白中天然存在的肽序列中的X_n和/或X_m残基由疏水蛋白中天然不存在的肽序列延长。

如果X_n和/或X_m为天然不与疏水蛋白连接的肽序列，此类序列通常长度为至少20个、优选地至少35个、更优选地至少50个并且最优选地100个氨基酸。天然不与疏水蛋白连接的此残基在此后也称为融合配偶体。这意在表达可由至少一个疏水蛋白部分和天然不以这种方式一起出现的融合配偶体部分组成。

融合配偶体部分可选自多种蛋白质。许多融合配偶体也可以与一个疏水蛋白部分连接，例如在疏水蛋白部分的氨基端(X_n)和羧基端(X_m)上连接。然而，也可以例如两个融合配偶体连接到本发明蛋白质的一个位置(X_n或X_m)。

尤其适合的融合配偶体为微生物中天然存在的蛋白质，特别是大肠杆菌(E.coli)或枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)中存在的蛋白质。此类融合配偶体的实例为序列yaad(SEQ ID NO：15和16)、yaae(SEQ ID NO：17和18)和硫氧还蛋白。

同样非常适合的是这些序列的片段或衍生物，其只包含一些所述序列，例如所述序列的70-99％、优选地5-50％、更优选地10-40％、或者与所述序列相比改变了单个氨基酸或核苷酸，其中每一个百分数基于氨基酸的量。

在其它优选的实施方案中，融合疏水蛋白以及作为X_n或X_m基团的融合配偶体也具有所谓的亲和结构域(亲和标签/亲和尾部)。这以理论上已知的方式包含可与特定互补基团相互作用并可帮助简化蛋白质操作和纯化的锚定基团。此类亲和结构域的实例包括(His)_k、(Arg)_k、(Asp)_k、(Phe)_k或(Cys)_k基团，其中k通常为1-10的自然数。其可优选地为(His)_k基团，其中k为4-6。

根据本发明作为疏水蛋白或其衍生物使用的蛋白质也可在其多肽序列中得到修饰，例如通过糖基化、乙酰化修饰或者另外通过化学交联修饰，例如用戊二醛修饰。

根据本发明使用的疏水蛋白或其衍生物的一个特性是当表面用蛋白质包被时表面性质的改变。可实验测定表面性质的变化，例如通过测量用蛋白质包被表面之前和之后的水滴接触角并确定两个测量的差异。

接触角测量的操作为本领域技术人员在理论上已知的。测量是基于室温、5μl水滴和用玻璃板作为基质。实验部分给出了精确的实验条件，例如测量接触角的适当方法。在其中所述条件下，与每一种情况未包被玻璃板上的等大水滴的接触角相比根据本发明使用的融合蛋白具有增加接触角至少20°、优选地至少25°、更优选地至少30°的特性。

开展本发明尤其优选的疏水蛋白为dewA、rodA、hypA、hypB、sc3、basf1、basf2型的疏水蛋白，其结构特征见下文序列表。它们也可仅为部分或其衍生物。具有相同或不同结构的多个疏水蛋白部分(优选2个或3个)也可以互相连接和连接到天然不与疏水蛋白连接的相应适当多肽序列上。

根据本发明同样特别适用的是具有括号中所述多肽序列和编码其的核酸序列，尤其是根据SEQ ID NO：19、21、23的序列的融合蛋白yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)。通过交换、插入或删除所有氨基酸中的至少10个、优选地至少5个氨基酸、更优选地5％的氨基酸从SEQID NO.20、22或24所示的多肽序列加工产生的蛋白质和仍具有起始蛋白质的生物学特性达至少50％的程度的蛋白质也是尤其优选的实施方案。蛋白质的生物学特性在本文理解为是指已经描述的接触角改变至少20°。

尤其适于开展本发明的衍生物为通过截短yaad融合配偶体而衍生自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的残基。可有利地使用截短的yaad残基替代具有294个氨基酸的完整yaad融合配偶体(SEQ ID NO：16)。但是截短的残基应包含至少20个、更优选地至少35个氨基酸。例如，可使用20-293个、优选地25-250个、更优选地35-150个和例如35-100个氨基酸的截短基团。

疏水蛋白和融合配偶体间的切割位点可用于以非衍生的形式释放纯的疏水蛋白(例如通过甲硫氨酸处的BrCN切割、因子Xa切割、肠激酶切割、凝血酶切割、TEV切割等等)。

也可以产生依次为一个融合配偶体例如yaad或yaae、甚至不同序列的多种疏水蛋白例如DewA-RodA或Sc3-DewA、Sc3-RodA的融合蛋白。同样可以使用疏水蛋白片段(例如N端或C端截短物)或具有70％同源性的突变蛋白。根据特定用途(即待分离的液相)选择每一种情况的最佳构建体。

根据本发明使用的或本发明的组合物中存在的疏水蛋白可通过已知的肽合成方法制备，例如通过Merrifield固相合成制备。

可通过适当方法从天然来源分离天然存在的疏水蛋白。以举例方式引用W

sten等人，Eur.J Cell Bio.63，122-129(1994)或WO 96/41882。

融合蛋白可优选地通过基因工程方法制备，其中一个核酸序列，特别是编码融合配偶体的DNA序列和编码疏水蛋白部分的DNA序列以如下方式组合，即所需蛋白质在宿主生物中作为组合核酸序列的基因表达的结果而产生的方式。此制备方法例如在DE 102005007480.4中公开。

用于所述制备方法的适当宿主生物(生产生物)可为原核生物(包括古生菌)或真核生物，尤其是细菌(包括嗜盐菌和methanococcia)、真菌、昆虫细胞、植物细胞和哺乳动物细胞，其中更优选地是大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、钩巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、假单胞菌某种(Pseudomonas spec.)、乳杆菌、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、SF9(或相关细胞)。

本发明也基于使用表达构建体，其包含在调节核酸序列的遗传控制下编码根据本发明使用的多肽的核酸序列，并且也基于包含这些表达构建体的至少一个的载体。所用的构建体优选地包含在每一种情况中与编码序列有效连接的特定编码序列的5’上游、启动子和3’下游、终止子序列以及根据需要的其它常用调节元件。在本发明中，“有效连接”理解为是指启动子、编码序列、终止子以及根据需要的其它调节元件依次排列以使每一个调节元件可在表达编码序列过程中按所预期实现其功能。

可有效连接序列的实例为引导肽，以及增强子和多聚腺苷酸化信号等等。

更多的调节元件包括选择标记、扩增信号、复制起点等等。适当的调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。

除了这些调节序列之外，真正结构基因的上游还可存在这些序列的天然调节并且根据需要被遗传修饰以关闭天然调节并增强基因的表达。

优选的核酸构建体也有利地包含与启动子功能性连接的一个或更多个所谓的“增强子”序列，其能增强核酸序列的表达。在DNA序列的3’端也可以插入额外有利的序列，如另外的调节元件或终止子。

核酸序列可以一个或更多个拷贝存在于构建体中。更多的标记，如抗生素抗性或补充辅源营养的基因也可以存在于构建体中并且根据需要的用于选择构建体。

启动子中存在用于制备的有利调节序列，如cos、tac、trp、tet、trp-tet、Ipp、lac、Ipp-lac、laclq-T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、lambda-PR或imlambda-P启动子，其有利地用于革兰氏阴性细菌。其它有利调节序列例如存在于革兰氏阳性启动子amy和SP02中，存在于酵母和真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。

也可以用合成启动子进行调节。

为在宿主生物中表达，核酸构建体有利地插入载体，例如能在宿主中最优表达基因的质粒或噬菌体。除了质粒和噬菌体以外，载体理解为是指本领域技术人员已知的所有其它载体，例如病毒(如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒)、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒和线性或环状DNA，并且也包括农杆菌系统。

这些载体可在宿主中自主复制或在染色体上复制。适当的质粒为例如大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III″3-B1、tgt11或pBdCI，链霉菌属的plJ101、pIJ364、plJ702或plJ361，芽孢杆菌属的pUB110、pC194或pBD214，棒杆菌属的pSA77或pAJ667，真菌的pALS1、plL2或pBB116，酵母的2alpha、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或者植物的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。所述质粒构成了可以选择质粒的一小部分。本领域技术人员已知其它质粒并可例如从Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中选择。

表达所提供的其它基因的核酸构建体还有利地包含增强表达的3’和/或5’端调节序列，其取决于所选宿主生物和基因而选择用于最佳表达。

这些调节序列意在能控制基因表达和蛋白质表达。取决于宿主生物这可以指例如基因仅在诱导后表达或过量表达，或者其立即表达和/或过量表达。

调节序列或因子可优选地发挥积极作用并从而增强引入基因的基因表达。因此，可通过使用强转录信号(如启动子和/或增强子)在转录水平实现调节元件的扩增。此外，也可以通过例如提高mRNA的稳定性增强转录。

在载体的其它实施方案中，包含核酸构建体或核酸的载体也可以线性DNA的形式有利地引入微生物中并通过异源或同源重组整合到宿主生物的基因组中。此线性DNA可由线性化载体(如质粒)组成或仅由核酸构建体或核酸组成。

有利地根据生物中所用的特定“密码子选择”改变核酸序列以在生物中最佳表达异源基因。“密码子选择”可根据该生物其它已知基因的计算机评价容易地确定。

通过融合适当的启动子与适当的编码核苷酸序列和终止子信号或多聚腺苷酸化信号制备表达盒。为此，使用常用重组和克隆技术，例如如T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)；T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments withGene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1984)；Ausubel，F.M.等人，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所述。

为在适当宿主生物中表达，重组核酸构建体或基因构建体有利地插入到能在宿主中最佳表达基因的宿主特异性载体中。载体为本领域技术人员所熟知并可例如从“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人编辑，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中选择。

借助于载体，可以制备例如用至少一个载体转化的重组微生物，并可用于生产根据本发明使用的疏水蛋白或其衍生物。上述重组构建体有利地引入到适当宿主系统中并表达。优选使用本领域技术人员熟悉的克隆和转染方法(例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等等)实现所述核酸在特定表达系统中的表达。适当的系统在例如Current Protocolsin Molecular Biology，F.Ausubel等人编辑，Wiley Interscience，New York1997或Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。

也可以制备同源重组微生物。为此，制备包含至少一部分所用基因或编码序列的载体，其中根据需要引入至少一个氨基酸缺失、添加或取代以改变，例如功能性破坏序列(“敲除”序列)。引入的序列例如也可为相关微生物的同系物或者衍生自哺乳动物、酵母或昆虫来源。用于同源重组的载体可备选地如下构建，以使同源重组情况中的内源基因以另一种方式突变或改变但仍编码功能蛋白(例如可改变上游调节区域以改变内源蛋白质的表达)。根据本发明使用的基因的改变部分在同源重组载体中。适当的同源重组载体的构建例如在Thomas，K.R.和Capecchi，M.R.(1987)Cell 51：503中描述。

在理论上，原核和真核生物都可用作此类核酸或此类核酸构建体的重组体宿主生物。宿主生物有利地为微生物，如细菌、真菌或酵母。有利地使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌，优选地使用肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科或诺卡氏菌科的细菌，更优选地使用埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardia)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、沙门菌属(Salmonella)、农杆菌属(Agrobacterium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。

取决于宿主生物，用于上述融合蛋白制备方法的生物可以本领域技术人员已知的方式生长或培养。微生物通常在包含碳源(通常为糖的形式)、氮源(通常为有机氮源，如酵母提取物的形式)或盐(如硫酸铵)、痕量元素(如铁、锰和镁盐)并且根据需要还包含维生素的液体培养基中于0-100℃、优选地10-60℃在氧喷雾条件下生长。营养液的pH值可保持在固定值，即在生长过程中调节或不调节。生长可分批发酵、半分批发酵或连续进行。可在发酵起始引入营养成分或者半连续或连续地补充。可通过实施例中所述的方法从生物中分离酶或酶用于作为粗提取物反应。

根据本发明使用的疏水蛋白或其功能性、生物学活性的片段可通过重组制备的方法制备，其中培养产生多肽的微生物，根据需要诱导蛋白质的表达并从培养物中分离它们。如果需要蛋白质可在工业规模上以这种方式产生。可通过已知方法培养和发酵重组微生物。细菌可在例如TB或LB培养基中，温度20-40℃和pH值6-9的条件下增殖。适当的培养条件例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1989)中具体描述。

如果蛋白质不分泌到培养基中，那么然后可将细胞破坏并通过已知的蛋白质分离方法从裂解物中获得产物。根据需要，细胞可通过高频超声、高压(例如在弗氏压碎器中)、渗透裂解、去垢剂的作用、分解酶或有机溶剂、匀浆或所列多种方法的组合破坏。

蛋白质可通过已知的层析方法纯化，如分子筛层析(凝胶过滤)，如Q琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析纯化，并且也可用其它常用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳纯化。适当的方法例如在Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemical Techniques]，VerlagWalter de Gruyter，Berlin，New York或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述。

尤其有利的是，可通过提供其可结合的固体支持物(特别是适当聚合物)上相应互补基团的特定锚定基团简化融合疏水蛋白的分离和纯化。此类固体支持物可例如用于填充层析柱，并且以这种方式分离效率通常可显著增加。此类分离方法也称为亲和层析。为掺入锚定基团可以在蛋白质制备过程中使用通过特定核苷酸序列延长cDNA并从而编码改变的蛋白质或融合蛋白的载体系统或寡核苷酸。为了更容易纯化，修饰的蛋白质包含作为锚发挥功能的所谓标签，例如也称为六个组氨酸锚的修饰。用组氨酸锚修饰的融合疏水蛋白可通过层析纯化，例如用镍-Sepharose作为柱填料。随后融合疏水蛋白可通过适当的洗脱试剂(例如咪唑溶液)从柱上再次洗脱。

在简化的纯化方法中，也可以不用层析纯化。为此，首先通过适当方法(例如微量过滤或离心)将细胞从发酵培养液中取出。随后可通过适当方法(例如上文提到的方法)破坏细胞，然后可从包涵体中分离细胞残渣。后者可有利地通过离心实现。最后，包涵体可以理论已知的方式破坏以释放融合疏水蛋白。这可通过例如酸、碱和/或去垢剂的方法完成。根据本发明使用的含融合疏水蛋白的包涵体可通常甚至用0.1M NaOH在大约1h内完全溶解。通过此简化方法获得的融合疏水蛋白的纯度基于全部蛋白质的量以重量计通常为60-80％。通过所述简化方法获得的溶液可不经进一步纯化而用于开展本发明。

如所述制备的疏水蛋白可作为融合蛋白直接使用或在脱离或去掉融合配偶体之后作为“纯”疏水蛋白使用。

当想要去掉融合配偶体时，建议在融合蛋白的疏水蛋白部分和融合配偶体部分间掺入潜在的切割位点(蛋白酶的特异识别位点)。适当的切割位点特别是疏水蛋白部分和融合配偶体部分中都不存在的那些肽序列，其可用生物信息学工具容易地确定。尤其适当的例子是BrCN在甲硫氨酸处的切割、用Xa因子切割的蛋白酶介导性切割、肠激酶切割、凝血酶切割、TEV(烟草蚀刻病毒蛋白酶)切割。

根据本发明，疏水蛋白或其衍生物可用于包含至少一种液相的钻井液。钻井液可为任何组合物，条件是它们具有至少一种液相，特别是基于油的液相。在本发明中组合物也具有另外的相。

根据本发明，基于油的钻井液中的油优选地为生物柴油、内烯烃、α烯烃、植物酯、链烷烃或其混合物。

适当的其它溶剂为例如有机溶剂，如醚、芳香化合物，如甲苯、醇、烷、烯、环烷、环烯、酯、酮、萘或卤代烃。

可根据要进行的钻探的类型和根据需要根据土壤中存在的任何物质(矿石、盐、矿物来源)调整钻井液以获得最佳作用。也可通过提高温度额外地改进使用钻井液的钻探，例如0-400℃的温度，例如30-200℃的温度，特别是40-150℃的温度。

所用的疏水蛋白或其衍生物的量可在大范围内变化，并且有利地根据组合物本身和组合物中存在的任何另外的成分调整数量。

需要根据特定条件调整钻井液(特别是其密度)，例如待钻探通过的地岩层的特性、钻探深度、压力和温度。

已经惊奇地发现即使少量的疏水蛋白或其衍生物都会提高钻井液稳定性并从而也提高钻探操作的稳定性。

根据本发明可以任何适当的量使用至少一种疏水蛋白或其衍生物。通常，可以基于全部成分的0.1-10000ppm的量、优选地以1-1000ppm的量、更优选地以1-600ppm的量和最优选地以4-500ppm的量使用至少一种疏水蛋白或其衍生物。在本应用中，单位ppm指毫克/千克。

本发明的钻井液可与其它常用成分和添加剂组合。在此应提到的有例如不具有或具有突出去垢剂作用的载体油。

适当的矿物载体油为矿物油加工过程中获得的级分，如具有例如SN500-2000级别粘度的光亮油或基础油；还有芳香烃、链烷烃和烷氧基链烷醇。根据本发明同样适用的是矿物油提炼过程中获得的级分并且也称为“加氢裂化油”(具有360-500℃沸点的真空馏分，可从催化加氢、在高压条件下异构化并且还去链烷烃的天然矿物油中获得)。同样适用的是上述矿物载体油的混合物。

可根据本发明使用的合成载体油的实例选自：聚烯烃(聚α烯烃或聚内烯烃)、(聚)酯、(聚)烷氧化物、聚醚、脂肪族聚醚酰胺、烷基酚起始的聚醚、烷基酚起始的聚醚酰胺和长链烷醇的羧酸酯。适当聚烯烃的实例为尤其基于聚丁烯或聚异丁烯(氢化或未氢化的)的烯烃聚合物，其中Mn＝400-1800。

其它适当载体油系统例如在DE-A 38 26 608、DE-A 41 42 241、DE-A43 09 074、EP-A 0 452 328和EP-A 0 548 617中描述，其在此明确引用作为参考。所述载体油以本领域技术人员认为对于特定应用而言合适的量使用。

其它常用添加剂为腐蚀抑制剂，例如基于有机羧酸的铵盐的腐蚀抑制剂，所述的盐倾向于形成薄膜，或者在非铁金属防腐的情况中基于杂环芳族化合物的腐蚀抑制剂；抗氧化剂或稳定剂，例如基于胺、其它常规乳化剂的抗氧化剂或稳定剂；抗静电剂；金属茂，如二茂铁；润滑性改进剂，如特定的脂肪酸、烯基琥珀酸酯、二(羟基烷基)脂肪族胺、羟基乙酰胺或蓖麻油；染料(标记物)、失水剂(例如聚合物)、调节密度的物质、流变改性剂，还有构建滤饼的物质(例如膨润土或粘土)、石灰或其它乳化剂。根据需要也加入胺以降低pH值。

本发明在此后通过实施例详细描述。

实施例

实施例1：克隆yaad-His₆/yaaE-His₆

使用寡核苷酸Hal570和Hal571(Hal 572/Hal 573)进行聚合酶链式反应。所用的模板DNA为细菌枯草芽胞杆菌的基因组DNA。得到的PCR片段包含枯草芽胞杆菌yaaD/yaaE基因编码序列并在每一个末端分别包含NcoI与BglII限制性酶切位点。纯化PCR片段并用限制性内切酶NcoI和BglII切割。此DNA片段用作插入片段并克隆到已预先用限制性内切酶NcoI和BglII线性化的来自Qiagen的pQE60载体中。如此形成的载体pQE60YAAD#2/pQE60YaaE#5 可用于表达由 YAAD::HIS₆ 或YAAE::HIS₆组成的蛋白质。

Hal570：gcgcgcccatggctcaaacaggtactga

Hal571：gcagatctccagccgcgttcttgcatac

Hal572：ggccatgggattaacaataggtgtactagg

Hal573：gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc

实施例2：克隆yaad疏水蛋白DewA-His₆

使用寡核苷酸KaM 416和KaM 417进行聚合酶链式反应。所用的模板DNA为霉菌钩巢曲霉的基因组DNA。得到的PCR片段包含疏水蛋白基因dewA的编码序列和N端因子Xa蛋白酶切割位点。纯化PCR片段并用限制性内切酶BamHI切割。此DNA片段用作插入片段并克隆到已预先用限制性内切酶BglII线性化的载体pQE60YAAD#2中。

如此形成的载体#508可用于表达由YAAD::Xa::dewA::HIS₆组成的融合蛋白。

KaM416：GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC

KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTT

CTCCGTCTCCGC

实施例3：克隆yaad疏水蛋白RodA-His₆

与质粒#508类似地，使用寡核苷酸KaM 434和KaM 435克隆质粒#513。

KaM434：GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCA

TTGCTGC

KaM435：CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG

实施例4：克隆yaad疏水蛋白BASF1-His₆

与质粒#508类似地，使用寡核苷酸KaM 417和KaM 418克隆质粒#507。

所用的模板DNA为合成的DNA序列(疏水蛋白BASF1)(见后附的SEQ ID NO.11和12)。

KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTT

CTCCGTCTCCGC

KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

实施例5：克隆yaad疏水蛋白BASF2-His₆

与质粒#508类似地，使用寡核苷酸KaM 417和KaM 418克隆质粒#506。

所用的模板DNA为合成的DNA序列(疏水蛋白BASF2)(见后附分SEQ ID NO.13和14)。

KaM417：CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTT

CTCCGTCTCCGC

KaM418：CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG

实施例6：克隆yaad疏水蛋白SC3-His₆

与质粒#508类似地，使用寡核苷酸KaM 464和KaM 465克隆质粒#526。

所用的模板DNA为裂褶菌(Schyzophyllum commune)的cDNA(见后附的SEQ ID NO.9和10)。

KaM464：CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC

KaM465：GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT

实施例7：重组大肠杆菌菌株yaad疏水蛋白DewA-His₆的发酵

在15ml Greiner管中接种3ml含表达yaad疏水蛋白DewA-His₆的大肠杆菌菌株的LB液体培养基。在摇床中以200转/分于37℃接种8h。每一种情况中，两个带挡板的1 l锥形瓶和250ml LB培养基(+100μg/ml的氨苄青霉素)用每一种情况1ml预培养物接种并在摇床中以180转/分于37℃孵育9h。

在20l发酵罐中用0.5l预培养物(OD_600nm 1∶10，对水测量)接种于13.5lLB培养基(+100μg/ml氨苄青霉素)中。在OD_60nm为～3.5时加入140ml100mM IPTG。3h后将发酵罐冷却到10℃并离心去掉培养液。用细胞沉淀进行进一步纯化。

实施例8：重组疏水蛋白融合蛋白的纯化

用50mM pH 7.5的磷酸钠缓冲液使100g细胞沉淀(100-500mg的疏水蛋白)的总体积达200ml并重悬。悬液用Ultraturrax T25型(Janke andKunkel；IKA-Labortechnik)处理10分钟，随后用500单位Benzonase(Merck，Darmstadt；货号1.01697.0001)在室温孵育1小时降解核酸。破坏细胞前用玻璃管(P1)进行过滤。为破坏细胞和分离残余基因组DNA，以1500巴进行两个匀浆循环(Microfluidizer M-110EH；Microfluidics Corp.)。离心匀浆物(Sorvall RC-5B，GSA转子，250ml离心杯，60分钟，4℃，12000转/分，23000g)，将上清液放于冰上并将沉淀重悬于100ml pH 7.5的磷酸钠缓冲液中。重复离心和重悬三次，在第三次重复中加入含1％SDS的磷酸钠缓冲液。重悬后，将混合物搅拌1小时并进行最后的离心(Sorvall RC-5B，GSA转子，250ml离心杯，60分钟，4℃，12000转/分，23000g)。根据SDS-PAGE分析，疏水蛋白在最后离心之后存在于上清液中(图1)。实验表明疏水蛋白在相应的大肠杆菌细胞中可能以包涵体形式存在。将50ml含疏水蛋白的上清液应用于50ml用50mM Tris-Cl pH 8.0缓冲液平衡的镍Sepharose High Performance17-5268-02柱(Amersham)。用50mM Tris-Cl pH 8.0缓冲液洗柱子，随后用含200mM咪唑的50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液洗脱疏水蛋白。在50mM pH 8.0的Tris-Cl缓冲液中透析溶液以去除咪唑。

图1显示了所制备的疏水蛋白的纯化：

泳道A：用于镍-Sepharose柱样品(1∶10稀释)

泳道B：流过液＝洗涤步骤洗脱物

泳道C-E：OD 280最高的洗脱级分(WP1、WP2、WP3)

泳道F显示了所用的分子量标准。

图1的疏水蛋白具有大约53kD的分子量。一些较小的带代表了疏水蛋白的降解产物。

实施例9：性能检测：通过在玻璃上水滴接触角的改变表征疏水蛋白基质：玻璃(窗玻璃，Süddeutsche glass，Mannheim)：

使用根据实施例8纯化的疏水蛋白。

-溶液中疏水蛋白浓度：100μg/ml，溶液还包含50mM醋酸钠缓冲液和0.1％聚氧乙烯(20)-失水山梨醇单月桂酸酯(Tween

20)，溶液的pH值：4

-将玻璃板浸没在此溶液中过夜(温度80℃)

-然后从溶液中取出疏水蛋白包被的玻璃板并在蒸馏水中洗涤，

-然后在蒸馏水中孵育10min/80℃/1％SDS，

-再次在蒸馏水中洗涤

在空气中干燥样品并在室温测定包被玻璃表面5μl水滴的接触角(以度为单位)。

在Dataphysics OCA 15+接触角系统，软件(2002年11月)上测量接触角。根据制造商的说明进行测量。

未处理玻璃给出30±5°的接触角。

用根据实施例8的疏水蛋白(yaad-dewA-his₆)包被的玻璃板给出75±5°的接触角。

接触角增加：45°。

实施例10：产生含疏水蛋白浓缩物(yaad-Xa-dewA-His₆)的基于油的钻井液

以下列量向含222ml生物柴油和61ml氯化钙溶液(25％)的制剂中加入疏水蛋白浓缩物：

a)0ppm

b)10ppm

c)100ppm

d)10000ppm

用乳化装置(Ultra Turrax T50)以2000、6000和10000转/分的速度与5分钟和10分钟的搅拌时间产生各种试验中的各种乳浊液。

用每一种钻井液样品开展乳化试验(与DIN 51415类似)。

在这些试验中，化合物在所述条件下(搅拌时间和旋转速度)互相混合。之后，观察到分层是时间的函数。

参考标准进行评价，其中1代表乳浊液完全开裂，2代表释放水的部分开裂，3代表检测不到开裂。

所述疏水蛋白浓度的试验结果汇总于表1中。对于每一种情况列出了1分钟/、24小时和48小时(每一种情况下在室温，23℃)后分相层的评价。此外，也在80℃的均一温度下试验。

表1

实例	条件	1分钟	24h	48h	24h，80℃
						10a(比较)	5分钟6000转/分	3	1	1	1
10a(比较)	10分钟6000转/分	3	1	1	1
						10b	5分钟6000转/分	3	3	3	1
10b	10分钟6000转/分	3	3	3	1
						10c	5分钟6000转/分	3	3	3	2
10c	10分钟6000转/分	3	3	3	2
						10d	5分钟6000转/分	3	3	3	2
10d	10分钟6000转/分	3	3	3	3

评价：

不加入疏水蛋白A时观察到钻探混合物的快速分离。评价1是实践中的油钻探不可接受的。甚至很少量的疏水蛋白都具有良好的乳化作用。甚至10ppm的疏水蛋白(低于1mg)会带来可接受的结果。在以更高量使用疏水蛋白的情况中，甚至可以获得更好的结果，特别是热稳定性更好。

对序列表中的DNA和多肽序列指定的序列名称

dewA DNA和多肽序列	SEQ ID NO：1
		dewA多肽序列	SEQ ID NO：2
rodA DNA和多肽序列	SEQ ID NO：3
		rodA多肽序列	SEQ ID NO：4
hypA DNA和多肽序列	SEQ ID NO：5
		hypA多肽序列	SEQ ID NO：6
hypB DNA和多肽序列	SEQ ID NO：7
		hypB多肽序列	SEQ ID NO：8
sc3 DNA和多肽序列	SEQ ID NO：9
		sc3多肽序列	SEQ ID NO：10
basf1 DNA和多肽序列	SEQ ID NO：11
		basf1多肽序列	SEQ ID NO：12
basf2 DNA和多肽序列	SEQ ID NO：13
		basf2多肽序列	SEQ ID NO：14
yaad DNA和多肽序列	SEQ ID NO：15
		yaad多肽序列	SEQ ID NO：16
yaae DNA和多肽序列	SEQ ID NO：17
		yaae多肽序列	SEQ ID NO：18
yaad-Xa-dewA-his DNA和多肽序列	SEQ ID NO：19
		yaad-Xa-dewA-his多肽序列	SEQ ID NO：20
yaad-Xa-rodA-his DNA和多肽序列	SEQ ID NO：21
		yaad-Xa-rodA-his多肽序列	SEQ ID NO：22
yaad-Xa-basf1-his DNA和多肽序列	SEQ ID NO：23
		yaad-Xa-basf1-his多肽序列	SEQ ID NO：24

序列表

<110>巴斯福股份公司(BASF Aktiengesellschaft)

<120>含疏水蛋白的钻井液

<130>AE 200500040

<160>24

<170>PatentIn 3.1版

<210>1

<211>405

<212>DNA

<213>basf-dewA

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(405)

<223>

<400>1

atg cgc ttc atc gtc tct ctc ctc gcc ttc act gcc gcg gcc acc gcg 48

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala

1 5 10 15

acc gcc ctc ccg gcc tct gcc gca aag aac gcg aag ctg gcc acc tcg 96

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser

20 25 30

gcg gcc ttc gcc aag cag gct gaa ggc acc acc tgc aat gtc ggc tcg 144

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser

35 40 45

atc gct tgc tgc aac tcc ccc gct gag acc aac aac gac agt ctg ttg 192

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu

50 55 60

agc ggt ctg ctc ggt gct ggc ctt ctc aac ggg ctc tcg ggc aac act 240

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr

65 70 75 80

ggc agc gcc tgc gcc aag gcg agc ttg att gac cag ctg ggt ctg ctc 288

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu

85 90 95

gct ctc gtc gac cac act gag gaa ggc ccc gtc tgc aag aac atc gtc 336

Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val

100 105 110

gct tgc tgc cct gag gga acc acc aac tgt gtt gcc gtc gac aac gct 384

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala

115 120 125

ggc gct ggt acc aag gct gag 405

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu

130 135

<210>2

<211>135

<212>PRT

<213>basf-dewA

<400>2

Met Arg Phe Ile Val Ser Leu Leu Ala Phe Thr Ala Ala Ala Thr Ala

1 5 10 15

Thr Ala Leu Pro Ala Ser Ala Ala Lys Asn Ala Lys Leu Ala Thr Ser

20 25 30

Ala Ala Phe Ala Lys Gln Ala Glu Gly Thr Thr Cys Asn Val Gly Ser

35 40 45

Ile Ala Cys Cys Asn Ser Pro Ala Glu Thr Asn Asn Asp Ser Leu Leu

50 55 60

Ser Gly Leu Leu Gly Ala Gly Leu Leu Asn Gly Leu Ser Gly Asn Thr

65 70 75 80

Gly Ser Ala Cys Ala Lys Ala Ser Leu Ile Asp Gln Leu Gly Leu Leu

85 90 95

Ala Leu Val Asp His Thr Glu Glu Gly Pro Val Cys Lys Asn Ile Val

100 105 110

Ala Cys Cys Pro Glu Gly Thr Thr Asn Cys Val Ala Val Asp Asn Ala

115 120 125

Gly Ala Gly Thr Lys Ala Glu

130 135

<210>3

<211>471

<212>DNA

<213>basf-rodA

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(471)

<223>

<400>3

atg aag ttc tcc att gct gcc gct gtc gtt gct ttc gcc gcc tcc gtc 48

Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

gcg gcc ctc cct cct gcc cat gat tcc cag ttc gct ggc aat ggt gtt 96

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val

20 25 30

ggc aac aag ggc aac agc aac gtc aag ttc cct gtc ccc gaa aac gtg 144

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val

35 40 45

acc gtc aag cag gcc tcc gac aag tgc ggt gac cag gcc cag ctc tct 192

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser

50 55 60

tgc tgc aac aag gcc acg tac gcc ggt gac acc aca acc gtt gat gag 240

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu

65 70 75 80

ggt ctt ctg tct ggt gcc ctc agc ggc ctc atc ggc gcc ggg tct ggt 288

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly

85 90 95

gcc gaa ggt ctt ggt ctc ttc gat cag tgc tcc aag ctt gat gtt gct 336

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala

100 105 110

gtc ctc att ggc atc caa gat ctt gtc aac cag aag tgc aag caa aac 384

Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn

115 120 125

att gcc tgc tgc cag aac tcc ccc tcc agc gcg gat ggc aac ctt att 432

Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile

130 135 140

ggt gtc ggt ctc cct tgc gtt gcc ctt ggc tcc atc ctc 471

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu

145 150 155

<210>4

<211>157

<212>PRT

<213>basf-rodA

<400>4

Met Lys Phe Ser Ile Ala Ala Ala Val Val Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Pro Ala His Asp Ser Gln Phe Ala Gly Asn Gly Val

20 25 30

Gly Asn Lys Gly Asn Ser Asn Val Lys Phe Pro Val Pro Glu Asn Val

35 40 45

Thr Val Lys Gln Ala Ser Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser

50 55 60

Cys Cys Asn Lys Ala Thr Tyr Ala Gly Asp Thr Thr Thr Val Asp Glu

65 70 75 80

Gly Leu Leu Ser Gly Ala Leu Ser Gly Leu Ile Gly Ala Gly Ser Gly

85 90 95

Ala Glu Gly Leu Gly Leu Phe Asp Gln Cys Ser Lys Leu Asp Val Ala

100 105 110

Val Leu Ile Gly Ile Gln Asp Leu Val Asn Gln Lys Cys Lys Gln Asn

115 120 125

Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gly Asn Leu Ile

130 135 140

Gly Val Gly Leu Pro Cys Val Ala Leu Gly Ser Ile Leu

145 150 155

<210>5

<211>336

<212>DNA

<213>basf-HypA

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(336)

<223>

<400>5

atg atc tct cgc gtc ctt gtc gct gct ctc gtc gct ctc ccc gct ctt 48

Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

gtt act gca act cct gct ccc gga aag cct aaa gcc agc agt cag tgc 96

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

gac gtc ggt gaa atc cat tgc tgt gac act cag cag act ccc gac cac 144

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

acc agc gcc gcc gcg tct ggt ttg ctt ggt gtt ccc atc aac ctt ggt 192

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

gct ttc ctc ggt ttc gac tgt acc ccc att tcc gtc ctt ggc gtc ggt 240

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly

65 70 75 80

ggc aac aac tgt gct gct cag cct gtc tgc tgc aca gga aat caa ttc 288

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

acc gca ttg att aac gct ctt gac tgc tct cct gtc aat gtc aac ctc 336

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu

100 105 110

<210>6

<211>112

<212>PRT

<213>basf-HypA

<400>6

Met Ile Ser Arg Val Leu Val Ala Ala Leu Val Ala Leu Pro Ala Leu

1 5 10 15

Val Thr Ala Thr Pro Ala Pro Gly Lys Pro Lys Ala Ser Ser Gln Cys

20 25 30

Asp Val Gly Glu Ile His Cys Cys Asp Thr Gln Gln Thr Pro Asp His

35 40 45

Thr Ser Ala Ala Ala Ser Gly Leu Leu Gly Val Pro Ile Asn Leu Gly

50 55 60

Ala Phe Leu Gly Phe Asp Cys Thr Pro Ile Ser Val Leu Gly Val Gly

65 70 75 80

Gly Asn Asn Cys Ala Ala Gln Pro Val Cys Cys Thr Gly Asn Gln Phe

85 90 95

Thr Ala Leu Ile Asn Ala Leu Asp Cys Ser Pro Val Asn Val Asn Leu

100 105 110

<210>7

<211>357

<212>DNA

<213>basf-HypB

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(357)

<223>

<400>7

atg gtc agc acg ttc atc act gtc gca aag acc ctt ctc gtc gcg ctc 48

Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

ctc ttc gtc aat atc aat atc gtc gtt ggt act gca act acc ggc aag 96

Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys

20 25 30

cat tgt agc acc ggt cct atc gag tgc tgc aag cag gtc atg gat tct 144

His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser

35 40 45

aag agc cct cag gct acg gag ctt ctt acg aag aat ggc ctt ggc ctg 192

Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu

50 55 60

ggt gtc ctt gct ggc gtg aag ggt ctt gtt ggc gcg aat tgc agc cct 240

Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro

65 70 75 80

atc acg gca att ggt att ggc tcc ggc agc caa tgc tct ggc cag acc 288

Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr

85 90 95

gtt tgc tgc cag aat aat aat ttc aac ggt gtt gtc gct att ggt tgc 336

Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys

100 105 110

act ccc att aat gcc aat gtg 357

Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val

115

<210>8

<211>119

<212>PRT

<213>basf-HypB

<400>8

Met Val Ser Thr Phe Ile Thr Val Ala Lys Thr Leu Leu Val Ala Leu

1 5 10 15

Leu Phe Val Asn Ile Asn Ile Val Val Gly Thr Ala Thr Thr Gly Lys

20 25 30

His Cys Ser Thr Gly Pro Ile Glu Cys Cys Lys Gln Val Met Asp Ser

35 40 45

Lys Ser Pro Gln Ala Thr Glu Leu Leu Thr Lys Asn Gly Leu Gly Leu

50 55 60

Gly Val Leu Ala Gly Val Lys Gly Leu Val Gly Ala Asn Cys Ser Pro

65 70 75 80

Ile Thr Ala Ile Gly Ile Gly Ser Gly Ser Gln Cys Ser Gly Gln Thr

85 90 95

Val Cys Cys Gln Asn Asn Asn Phe Asn Gly Val Val Ala Ile Gly Cys

100 105 110

Thr Pro Ile Asn Ala Asn Val

115

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<212>DNA

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<222>(1)..(408)

<223>

<400>9

atg ttc gcc cgt ctc ccc gtc gtg ttc ctc tac gcc ttc gtc gcg ttc 48

Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe

1 5 10 15

ggc gcc ctc gtc gct gcc ctc cca ggt ggc cac ccg ggc acg acc acg 96

Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr

20 25 30

ccg ccg gtt acg acg acg gtg acg gtg acc acg ccg ccc tcg acg acg 144

Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr

35 40 45

acc atc gcc gcc ggt ggc acg tgt act acg ggg tcg ctc tct tgc tgc 192

Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys

50 55 60

aac cag gtt caa tcg gcg agc agc agc cct gtt acc gcc ctc ctc ggc 240

Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly

65 70 75 80

ctg ctc ggc att gtc ctc agc gac ctc aac gtt ctc gtt ggc atc agc 288

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser

85 90 95

tgc tct ccc ctc act gtc atc ggt gtc gga ggc agc ggc tgt tcg gcg 336

Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala

100 105 110

cag acc gtc tgc tgc gaa aac acc caa ttc aac ggg ctg atc aac atc 384

Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile

115 120 125

ggt tgc acc ccc atc aac atc ctc 408

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu

130 135

<210>10

<211>136

<212>PRT

<213>basf-sc3

<400>10

Met Phe Ala Arg Leu Pro Val Val Phe Leu Tyr Ala Phe Val Ala Phe

1 5 10 15

Gly Ala Leu Val Ala Ala Leu Pro Gly Gly His Pro Gly Thr Thr Thr

20 25 30

Pro Pro Val Thr Thr Thr Val Thr Val Thr Thr Pro Pro Ser Thr Thr

35 40 45

Thr Ile Ala Ala Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Ser Leu Ser Cys Cys

50 55 60

Asn Gln Val Gln Ser Ala Ser Ser Ser Pro Val Thr Ala Leu Leu Gly

65 70 75 80

Leu Leu Gly Ile Val Leu Ser Asp Leu Asn Val Leu Val Gly Ile Ser

85 90 95

Cys Ser Pro Leu Thr Val Ile Gly Val Gly Gly Ser Gly Cys Ser Ala

100 105 110

Gln Thr Val Cys Cys Glu Asn Thr Gln Phe Asn Gly Leu Ile Asn Ile

115 120 125

Gly Cys Thr Pro Ile Asn Ile Leu

130 135

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<211>483

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<222>(1)..(483)

<223>

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atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val

20 25 30

ggc aac aag ttc cct gtc cct gac gac gtc acc gtc aag cag gcc acc 144

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr

35 40 45

gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr

50 55 60

tac gcc ggc gac gtc ctc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc 240

Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly

65 70 75 80

ctc ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc 288

Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly

85 90 95

ctc ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc 336

Leu Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly

100 105 110

atc cct atc cag gac ctc ctc aac cag gtc aac aag cag tgc aag cag 384

Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln

115 120 125

aac atc gcc tgc tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc 432

Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu

130 135 140

gtc aac ctc ggc ctc ggc aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat 480

Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His

145 150 155 160

atg 483

Met

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<212>PRT

<213>basf-BASF1

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Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val

20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr

35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr

50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Val Leu Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly

65 70 75 80

Leu Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly

85 90 95

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100 105 110

Ile Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Val Asn Lys Gln Cys Lys Gln

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Asn Ile Ala Cys Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu

130 135 140

Val Asn Leu Gly Leu Gly Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His

145 150 155 160

Met

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<223>

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atg aag ttc tcc gtc tcc gcc gcc gtc ctc gcc ttc gcc gcc tcc gtc 48

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

gcc gcc ctc cct cag cac gac tcc gcc gcc ggc aac ggc aac ggc gtc 96

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val

20 25 30

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Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr

35 40 45

gac aag tgc ggc gac cag gcc cag ctc tcc tgc tgc aac aag gcc acc 192

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr

50 55 60

tac gcc ggc gac gtc acc gac atc gac gag ggc atc ctc gcc ggc ctc 240

Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu

65 70 75 80

ctc aag aac ctc atc ggc ggc ggc tcc ggc tcc gag ggc ctc ggc ctc 288

Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu

85 90 95

ttc gac cag tgc gtc aag ctc gac ctc cag atc tcc gtc atc ggc atc 336

Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile

100 105 110

cct atc cag gac ctc ctc aac cag cag tgc aag cag aac atc gcc tgc 384

Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys

115 120 125

tgc cag aac tcc cct tcc gac gcc acc ggc tcc ctc gtc aac ctc ggc 432

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly

130 135 140

aac cct tgc atc cct gtc tcc ctc ctc cat atg 465

Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met

145 150 155

<210>14

<211>155

<212>PRT

<213>basf-BASF2

<400>14

Met Lys Phe Ser Val Ser Ala Ala Val Leu Ala Phe Ala Ala Ser Val

1 5 10 15

Ala Ala Leu Pro Gln His Asp Ser Ala Ala Gly Asn Gly Asn Gly Val

20 25 30

Gly Asn Lys Phe Pro Val Pro Asp Asp Val Thr Val Lys Gln Ala Thr

35 40 45

Asp Lys Cys Gly Asp Gln Ala Gln Leu Ser Cys Cys Asn Lys Ala Thr

50 55 60

Tyr Ala Gly Asp Val Thr Asp Ile Asp Glu Gly Ile Leu Ala Gly Leu

65 70 75 80

Leu Lys Asn Leu Ile Gly Gly Gly Ser Gly Ser Glu Gly Leu Gly Leu

85 90 95

Phe Asp Gln Cys Val Lys Leu Asp Leu Gln Ile Ser Val Ile Gly Ile

100 105 110

Pro Ile Gln Asp Leu Leu Asn Gln Gln Cys Lys Gln Asn Ile Ala Cys

115 120 125

Cys Gln Asn Ser Pro Ser Asp Ala Thr Gly Ser Leu Val Asn Leu Gly

130 135 140

Asn Pro Cys Ile Pro Val Ser Leu Leu His Met

145 150 155

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<212>DNA

<213>basf-yaad

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(882)

<223>

<400>15

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met

1 5 10 15

caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala

65 70 75 80

aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala

145 150 155 160

gtt cgc cat atg cgt aaa gtt aac gct caa gtg cgc aaa gta gtt gcg 528

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

atg agt gag gat gag cta atg aca gaa gcg aaa aac cta ggt gct cct 576

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

tac gag ctt ctt ctt caa att aaa aaa gac ggc aag ctt cct gtc gtt 624

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

aac ttt gcc gct ggc ggc gta gca act cca gct gat gct gct ctc atg 672

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

atg cag ctt ggt gct gac gga gta ttt gtt ggt tct ggt att ttt aaa 720

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys

225 230 235 240

tca gac aac cct gct aaa ttt gcg aaa gca att gtg gaa gca aca act 768

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

cac ttt act gat tac aaa tta atc gct gag ttg tca aaa gag ctt ggt 816

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

act gca atg aaa ggg att gaa atc tca aac tta ctt cca gaa cag cgt 864

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg

275 280 285

atg caa gaa cgc ggc tgg 882

Met Gln Glu Arg Gly Trp

290

<210>16

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<212>PRT

<213>basf-yaad

<400>16

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met

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Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala

65 70 75 80

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala

145 150 155 160

Val Arg His Met Arg Lys Val Asn Ala Gln Val Arg Lys Val Val Ala

165 170 175

Met Ser Glu Asp Glu Leu Met Thr Glu Ala Lys Asn Leu Gly Ala Pro

180 185 190

Tyr Glu Leu Leu Leu Gln Ile Lys Lys Asp Gly Lys Leu Pro Val Val

195 200 205

Asn Phe Ala Ala Gly Gly Val Ala Thr Pro Ala Asp Ala Ala Leu Met

210 215 220

Met Gln Leu Gly Ala Asp Gly Val Phe Val Gly Ser Gly Ile Phe Lys

225 230 235 240

Ser Asp Asn Pro Ala Lys Phe Ala Lys Ala Ile Val Glu Ala Thr Thr

245 250 255

His Phe Thr Asp Tyr Lys Leu Ile Ala Glu Leu Ser Lys Glu Leu Gly

260 265 270

Thr Ala Met Lys Gly Ile Glu Ile Ser Asn Leu Leu Pro Glu Gln Arg

275 280 285

Met Gln Glu Arg Gly Trp

290

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<211>591

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<213>basf-yaae

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(591)

<223>

<400>17

atg gga tta aca ata ggt gta cta gga ctt caa gga gca gtt aga gag 48

Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu

1 5 10 15

cac atc cat gcg att gaa gca tgc ggc gcg gct ggt ctt gtc gta aaa 96

His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys

20 25 30

cgt ccg gag cag ctg aac gaa gtt gac ggg ttg att ttg ccg ggc ggt 144

Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly

35 40 45

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Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu

50 55 60

ccg ctt cgt gaa ttc gct gct cag ggc aaa ccg atg ttt gga aca tgt 240

Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys

65 70 75 80

gcc gga tta att ata tta gca aaa gaa att gcc ggt tca gat aat cct 288

Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro

85 90 95

cat tta ggt ctt ctg aat gtg gtt gta gaa cgt aat tca ttt ggc cgg 336

His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg

100 105 110

cag gtt gac agc ttt gaa gct gat tta aca att aaa ggc ttg gac gag 384

Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu

115 120 125

cct ttt act ggg gta ttc atc cgt gct ccg cat att tta gaa gct ggt 432

Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

130 135 140

gaa aat gtt gaa gtt cta tcg gag cat aat ggt cgt att gta gcc gcg 480

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala

145 150 155 160

aaa cag ggg caa ttc ctt ggc tgc tca ttc cat ccg gag ctg aca gaa 528

Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

165 170 175

gat cac cga gtg acg cag ctg ttt gtt gaa atg gtt gag gaa tat aag 576

Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

180 185 190

caa aag gca ctt gta 591

Gln Lys Ala Leu Val

195

<210>18

<211>197

<212>PRT

<213>basf-yaae

<400>18

Met Gly Leu Thr Ile Gly Val Leu Gly Leu Gln Gly Ala Val Arg Glu

1 5 10 15

His Ile His Ala Ile Glu Ala Cys Gly Ala Ala Gly Leu Val Val Lys

20 25 30

Arg Pro Glu Gln Leu Asn Glu Val Asp Gly Leu Ile Leu Pro Gly Gly

35 40 45

Glu Ser Thr Thr Met Arg Arg Leu Ile Asp Thr Tyr Gln Phe Met Glu

50 55 60

Pro Leu Arg Glu Phe Ala Ala Gln Gly Lys Pro Met Phe Gly Thr Cys

65 70 75 80

Ala Gly Leu Ile Ile Leu Ala Lys Glu Ile Ala Gly Ser Asp Asn Pro

85 90 95

His Leu Gly Leu Leu Asn Val Val Val Glu Arg Asn Ser Phe Gly Arg

100 105 110

Gln Val Asp Ser Phe Glu Ala Asp Leu Thr Ile Lys Gly Leu Asp Glu

115 120 125

Pro Phe Thr Gly Val Phe Ile Arg Ala Pro His Ile Leu Glu Ala Gly

130 135 140

Glu Asn Val Glu Val Leu Ser Glu His Asn Gly Arg Ile Val Ala Ala

145 150 155 160

Lys Gln Gly Gln Phe Leu Gly Cys Ser Phe His Pro Glu Leu Thr Glu

165 170 175

Asp His Arg Val Thr Gln Leu Phe Val Glu Met Val Glu Glu Tyr Lys

180 185 190

Gln Lys Ala Leu Val

195

<210>19

<211>1329

<212>DNA

<213>basf-yaad-Xa-dewA-his

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1329)

<223>

<400>19

atg gct caa aca ggt act gaa cgt gta aaa cgc gga atg gca gaa atg 48

Met Ala Gln Thr Gly Thr Glu Arg Val Lys Arg Gly Met Ala Glu Met

1 5 10 15

caa aaa ggc ggc gtc atc atg gac gtc atc aat gcg gaa caa gcg aaa 96

Gln Lys Gly Gly Val Ile Met Asp Val Ile Asn Ala Glu Gln Ala Lys

20 25 30

atc gct gaa gaa gct gga gct gtc gct gta atg gcg cta gaa cgt gtg 144

Ile Ala Glu Glu Ala Gly Ala Val Ala Val Met Ala Leu Glu Arg Val

35 40 45

cca gca gat att cgc gcg gct gga gga gtt gcc cgt atg gct gac cct 192

Pro Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Gly Val Ala Arg Met Ala Asp Pro

50 55 60

aca atc gtg gaa gaa gta atg aat gca gta tct atc ccg gta atg gca 240

Thr Ile Val Glu Glu Val Met Asn Ala Val Ser Ile Pro Val Met Ala

65 70 75 80

aaa gcg cgt atc gga cat att gtt gaa gcg cgt gtg ctt gaa gct atg 288

Lys Ala Arg Ile Gly His Ile Val Glu Ala Arg Val Leu Glu Ala Met

85 90 95

ggt gtt gac tat att gat gaa agt gaa gtt ctg acg ccg gct gac gaa 336

Gly Val Asp Tyr Ile Asp Glu Ser Glu Val Leu Thr Pro Ala Asp Glu

100 105 110

gaa ttt cat tta aat aaa aat gaa tac aca gtt cct ttt gtc tgt ggc 384

Glu Phe His Leu Asn Lys Asn Glu Tyr Thr Val Pro Phe Val Cys Gly

115 120 125

tgc cgt gat ctt ggt gaa gca aca cgc cgt att gcg gaa ggt gct tct 432

Cys Arg Asp Leu Gly Glu Ala Thr Arg Arg Ile Ala Glu Gly Ala Ser

130 135 140

atg ctt cgc aca aaa ggt gag cct gga aca ggt aat att gtt gag gct 480

Met Leu Arg Thr Lys Gly Glu Pro Gly Thr Gly Asn Ile Val Glu Ala

145 150 155 160

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Claims

1.疏水蛋白用作基于油的钻井液中的助剂的用途，其中所述疏水蛋白是选自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ IDNO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的融合疏水蛋白；其中所述钻井液包含以重量计为70-95％的至少一种油成分和以重量计为2-30％的水；且其中基于油的钻井液中的油组分是生物柴油、内烯烃、α烯烃、植物酯、链烷烃或它们的混合物，并且其中所述钻井液包含基于全部成分的0.1-10000ppm量的疏水蛋白。

2.根据权利要求1的用途，其中疏水蛋白用作钻井液中的乳化剂。

3.根据权利要求1或2的用途，其中疏水蛋白以基于全部成分的1-1000ppm的量使用。

4.根据权利要求1或2的用途，其中使用疏水蛋白和促进乳浊液形成的至少一种另外的化合物，所述至少一种另外的化合物选自盐、补偿液体损失的添加剂、着湿剂、流动改进剂、增加钻井液比重的添加剂、乳化剂、分散剂、流体损失添加剂、聚合物或共聚物、胺、和增粘添加剂。

5.钻井开发地下沉积物的方法，其中使用包含基于全部成分的0.1-10000ppm量的至少一种选自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的融合疏水蛋白；其中所述钻井液包含以重量计为70-95％的至少一种油成分和以重量计为2-30％的水；且其中基于油的钻井液中的油组分是生物柴油、内烯烃、α烯烃、植物酯、链烷烃或它们的混合物。

6.根据权利要求5的方法，其中疏水蛋白以基于全部成分的1-1000ppm的量使用。

7.根据权利要求5的方法，其中钻井液为基于油的钻井液，其包含以重量计为70-95％的至少一种油成分、以重量计为2-30％的水以及根据需要以重量计最多13％的另外的成分，所述另外的成分选自盐、补偿液体损失的添加剂、着湿剂、流动改进剂、增加钻井液比重的添加剂、乳化剂、分散剂、流体损失添加剂、聚合物或共聚物、胺、和增粘添加剂。

8.包含基于全部成分的0.1-10000ppm量的至少一种选自yaad-Xa-dewA-his(SEQ ID NO：20)、yaad-Xa-rodA-his(SEQ ID NO：22)或yaad-Xa-basf1-his(SEQ ID NO：24)的融合疏水蛋白的基于油的钻井液，其中所述钻井液包含以重量计为70-95％的至少一种油成分和以重量计为2-30％的水；且其中基于油的钻井液中的油组分是生物柴油、内烯烃、α烯烃、植物酯、链烷烃或它们的混合物。

9.根据权利要求8的钻井液，其包含基于全部成分的1-1000ppm的疏水蛋白。

10.根据权利要求8的钻井液，其为基于油的钻井液，其包含以重量计为70-95％的至少一种油成分、以重量计为2-30％的水以及根据需要的以重量计最多13％的另外的成分，所述另外的成分选自盐、补偿液体损失的添加剂、着湿剂、流动改进剂、增加钻井液比重的添加剂、乳化剂、分散剂、流体损失添加剂、聚合物或共聚物、胺、和增粘添加剂。

11.产生根据权利要求8的钻井液的方法，其中疏水蛋白成分与钻井液的其余成分充分混合。