WO2006103252A2 - Verwendung von hydrophobin als phasen-stabilisator - Google Patents

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WO2006103252A2
WO2006103252A2 PCT/EP2006/061133 EP2006061133W WO2006103252A2 WO 2006103252 A2 WO2006103252 A2 WO 2006103252A2 EP 2006061133 W EP2006061133 W EP 2006061133W WO 2006103252 A2 WO2006103252 A2 WO 2006103252A2
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yaad
water
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fuel
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Peter Eck
Ulf Baus
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Definitions

  • hydrophobin as a phase stabilizer
  • the present invention relates to the use of hydrophobin and / or one of its derivatives for the stabilization of phases in compositions comprising at least two liquid phases, in particular oil and water.
  • Hydrophobins are small proteins of about 100 to 150 amino acids, which are characteristic of filamentous fungi, for example Schizophyllum ses. They usually have 8 cysteine units.
  • Hydrophobins have a marked affinity for interfaces and are therefore suitable for coating surfaces to alter the properties of the interfaces by forming amphiphatic membranes.
  • Teflon can be coated by means of hydrophobins to obtain a hydrophilic surface.
  • Hydrophobins can be isolated from natural sources. Likewise known are preparation processes for hydrophobins and derivatives thereof. For example, German patent application DE 10 2005 007 480 discloses a preparation process for hydrophobins and derivatives thereof.
  • WO 96/41882 proposes the use of hydrophobins as emulsifiers, thickeners, surface-active substances, for hydrophilicizing hydrophobic surfaces, for improving the water resistance of hydrophilic substrates, for producing oil-in-water emulsions or for water-in-oil emulsions. Furthermore, pharmaceutical applications such as the production of ointments or creams and cosmetic applications such as skin protection or the production of hair shampoos or hair rinses are proposed. WO 96/41882 moreover describes compositions, in particular compositions for pharmaceutical applications, containing hydrophobins.
  • EP-A 1 252 516 discloses the coating of windows, contact lenses, biosensors, medical devices, containers for carrying out tests or for storage, ship hulls, solid particles or frame or body of passenger cars with a solution containing hydrophobins at a temperature of 30 to 80 0 C.
  • WO 03/53383 describes the use of hydrophobin for treating keratin materials in cosmetic applications.
  • hydrophobins have surface-active properties.
  • a hydrophobin coated sensor is presented, for example a measuring electrode to which non-covalently further substances, e.g. electroactive substances, antibodies or enzymes are bound.
  • WO 2004/000880 also relates to the coating of surfaces with hydrophobin or hydrophobin-like substances.
  • WO 01/74864 which relates to hydrophobin-like proteins, discloses that these can be used to stabilize dispersions and emulsions.
  • GB 195,876 discloses a method of breaking water-in-oil emulsions using colloids.
  • colloids are proteins such as gelatin, casein, albumin or polysaccharides such as gum arabic or gum tragacanth.
  • JP-A 11-169177 describes the use of proteins having lipase activity for breaking emulsions.
  • WO 01/60916 discloses the use of surfactant-free mixtures of at least one water-soluble protein, at least one water-soluble polysaccharide and at least one water-soluble polymer such as polyethylene oxide for various applications, including for demulsifying crude oil. None of the cited documents discloses the use of hydrophobins to prevent re-emulsification.
  • proteins have the general advantage that they are naturally occurring substances that are biodegradable and thus do not lead to a permanent burden on the environment.
  • the object of the invention was to provide an improved process for stabilizing the phases by using proteins.
  • this object is achieved by the use of at least one hydrophobin in compositions comprising at least two liquid phases, in particular oil and water.
  • the hydrophobin according to the invention can be used in any desired amount, as long as it is ensured that the phase stabilization in the compositions containing at least two liquid phases is improved.
  • phase stabilization is understood as meaning that the re-emulsification of two liquid phases takes place more slowly when a substance is added to a mixture than in the same mixture without the addition of the substance or by the addition of the substance the re-emulsification of two liquid phases is avoided.
  • a hydrophobin is also understood as meaning derivatives thereof or modified hydrophobins.
  • Modified or derivatized hydrophobins may, for example, be hydrophobin fusion proteins or proteins which have an amino acid sequence which is at least 60%, for example at least 70%, in particular at least 80%, particularly preferably at least 90%, particularly preferably at least 95% identity having the sequence of a hydrophobin, and which still satisfy 50%, for example 60%, especially 70%, particularly preferably 80% of the biological properties of a hydrophobin, in particular the property that the surface properties changed by coating with these proteins be that the contact angle of a water drop before and after the coating of a glass surface with the protein to a magnification at least 20 °, preferably by at least 25 °, in particular by at least 30 °.
  • hydrophobins or derivatives thereof reduce or avoid the formation of new emulsions after phase separation. This is particularly advantageous when a longer coexistence of two phases is given side by side or the occurrence of re-emulsions is to be prevented. In this case, even small amounts of the peptide are extremely effective.
  • hydrophobins For the definition of hydrophobins, the structural and not the sequence specificity of the hydrophobins is decisive.
  • the amino acid sequence of the natural hydrophobins is very diverse, but they all have a highly characteristic pattern of 8 conserved cysteine residues. These residues form four intramolecular disulfide bridges.
  • N- and C-terminus is variable over a larger range.
  • fusion partner proteins with a length of 10 to 500 amino acids can be added by means of molecular biological techniques known to those skilled in the art.
  • hydrophobins and derivatives thereof are understood as meaning proteins having a similar structure and functional equivalence.
  • hydrophobin is to be understood below to mean polypeptides of the general structural formula (I)
  • X is selected for each of the 20 naturally occurring amino acids (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, Ala, Asp, Glu, GIy) can stand.
  • X may be the same or different.
  • the indices standing at X each represent the number of amino acids
  • C stands for cysteine, alanine, serine, glycine, methionine or threonine, wherein at least four of the radicals named C are cysteine, and the indices n and m are independent of each other for natural numbers between 0 and 500, preferably between 15 and 300.
  • polypeptides according to formula (I) are further characterized by the property that, at room temperature, after coating a glass surface, they give rise to a tion of the contact angle of a water droplet of at least 20 °, preferably at least 25 ° and particularly preferably 30 ° cause, in each case compared with the contact angle of an equal drop of water with the uncoated glass surface.
  • the amino acids designated C 1 to C 8 are preferably cysteines; but they can also be replaced by other amino acids of similar space filling, preferably by alanine, serine, threonine, methionine or glycine. However, at least four, preferably at least 5, more preferably at least 6 and in particular at least 7, of the positions C 1 to C 8 should consist of cysteines. Cysteines can either be reduced in the proteins according to the invention or can form disulfide bridges with one another. Particularly preferred is the intramolecular formation of CC bridges, in particular those with at least one, preferably 2, more preferably 3 and most preferably 4 intramolecular disulfide bridges. In the exchange of cysteines described above by amino acids of similar space filling, it is advantageous to replace those C positions in pairs, which can form intramolecular disulfide bridges with one another.
  • cysteines, serines, alanines, glycines, methionines or threonines are also used in the positions indicated by X, the numbering of the individual C positions in the general formulas may change accordingly.
  • X, C and the indices standing at X and C have the above meaning
  • the indices n and m are numbers between 0 and 300
  • the proteins are further characterized by the contact angle change mentioned above, and furthermore, at least 6 of the radicals named C are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • the proteins continue to be distinguished by the abovementioned contact angle change, and at least at least 6 of the residues named C are cysteine. Most preferably, all of the C radicals are cysteine.
  • radicals X n and X m may it be peptide sequences that are growing naturally, also linked to a hydrophobin. However, one or both residues may also be peptide sequences that are not naturally linked to a hydrophobin. Including such radicals X N and / or X are m to understand, in which a naturally occurring in a hydrophobin peptide sequence is extended tidsequenz by a non-naturally occurring in a hydrophobin.
  • X n and / or X n are naturally non-hydrophobin-linked peptide sequences, such sequences are generally at least 20, preferably at least 35, more preferably at least 50 and most preferably at least 100 amino acids in length.
  • Such a residue, which is not naturally linked to a hydrophobin will also be referred to below as a fusion partner.
  • the proteins may consist of at least one hydrophobin part and one fusion partner part which in nature do not coexist in this form.
  • the fusion partner portion can be selected from a variety of proteins. It is also possible to link a plurality of fusion partners with a hydrophobin part, for example at the amino terminus (X n ) and at the carboxy terminus (X n ,) of the hydrophobin part. However, it is also possible, for example, to link two fusion partners with a position (X n or X n ,) of the protein according to the invention.
  • fusion partners are proteins that occur naturally in microorganisms, in particular in E. coli or Bacillus subtilis.
  • fusion partners are the sequences yaad (SEQ ID NO: 15 and 16), yaae (SEQ ID NO: 17 and 18), and thioredoxin.
  • fragments or derivatives of said sequences which comprise only a part, for example 70 to 99%, preferably 5 to 50%, and particularly preferably 10 to 40% of said sequences, or in which individual amino acids or nucleotides are opposite to those mentioned Sequence are changed, wherein the percentages in each case refers to the number of amino acids.
  • the fusion hydrophobin in addition to the fusion partner as a group X n or X n , nor a so-called affinity domain (affin ity tag / affine ity tail) on.
  • affinity domains include (His) k , (Arg) k , (Asp) k , (Phe) k , or (Cys) k groups, where k is generally a natural number from 1 to 10. It may preferably be a (His) k group, where k is 4 to 6.
  • proteins used according to the invention as hydrophobins or derivatives thereof may also be modified in their polypeptide sequence, for example by glycosylation, acetylation or else by chemical crosslinking, for example with glutaric dialdehyde.
  • One property of the hydrophobins or their derivatives used according to the invention is the change of surface properties when the surfaces are coated with the proteins.
  • the change in the surface properties can be experimentally determined, for example, by measuring the contact angle of a water drop before and after coating the surface with the protein and determining the difference between the two measurements.
  • contact angle measurements is known in principle to the person skilled in the art.
  • the measurements refer to room temperature and water drops of 5 ⁇ l and the use of glass slides as substrate.
  • the exact experimental conditions for an exemplary method for measuring the contact angle are shown in the experimental part.
  • the fusion proteins used according to the invention have the property of increasing the contact angle by at least 20 °, preferably at least 25 °, particularly preferably at least 30 °, in each case compared with the contact angle of a water droplet of the same size with the uncoated glass surface.
  • hydrophobins for practicing the present invention are the dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi, basf2 hydrophobins which are structurally characterized in the Sequence Listing below. It may also be just parts or derivatives thereof. It is also possible to link together a plurality of hydrophobin moieties, preferably 2 or 3, of the same or different structure and to link them to a corresponding suitable polypeptide sequence which is not naturally associated with a hydrophobin.
  • proteins which, starting from the SEQ ID NO. 20, 22 or 24 shown by exchange, insertion or deletion of at least one, up to 10, preferably 5, more preferably 5% of all amino acids, and still have at least 50% of the biological property of the starting proteins particularly preferred embodiments.
  • the biological property of the proteins is hereby understood as the change in the contact angle already described by at least 20 °.
  • Derivatives particularly useful in the practice of the invention are those of yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 22), yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) or yaad-Xa-basf 1 -his
  • the truncated residue should comprise at least 20, preferably at least 35, amino acids.
  • a truncated radical having 20 to 293, preferably 25 to 250, particularly preferably 35 to
  • a cleavage site between the hydrophobin and the fusion partner or the fusion partners can be used to release the pure hydrophobin in underivatized form (for example by BrCN cleavage to methionine, factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage, etc.).
  • fusion proteins from one fusion partner, for example yaad or yaae, and several hydrophobins, also of different sequence, for example DewA-RodA or Sc3-DewA, Sc3-RodA), one behind the other.
  • hydrophobin fragments for example N- or C-terminal truncations
  • muteins having up to 70% homology can be used. The selection of the optimal constructs is made with respect to the particular use, i. the liquid phases to be separated.
  • hydrophobins used according to the invention or the hydrophobins contained in the formulations according to the invention can be prepared chemically by known methods of peptide synthesis, for example by solid-phase synthesis according to Merrifield.
  • Naturally occurring hydrophobins can be isolated from natural sources by suitable methods. As an example, let Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) or WO 96/41882.
  • the production of fusion proteins can preferably be carried out by genetic engineering methods in which a nucleic acid sequence coding for the fusion partner and a hydrophobin part, in particular DNA sequence, are combined in such a way that the desired protein is produced in a host organism by gene expression of the combined nucleic acid sequence , Such a manufacturing method is disclosed for example in the German patent application DE 102005007480.4.
  • Suitable host organisms (production organisms) for said production process may be prokaryotes (including archaea) or eukaryotes, especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacilli, Hansenula polymorpha, Trichoderma reesei, SF9 (or related cells) and others.
  • prokaryotes including archaea
  • eukaryotes especially bacteria including halobacteria and methanococci, fungi, insect cells, plant cells and mammalian cells, more preferably Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Asperg
  • the subject of the work is also the use of expression constructs containing under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide used according to the invention, as well as vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • constructs used include a promoter 5 "upstream from the particular coding sequence and a terminator sequence 3" downstream, and optionally further conventional regulatory elements, each operably linked to the coding sequence.
  • an "operative linkage" is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • operably linked sequences are targeting sequences as well as enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication, and the like. Suitable regulatory sequences are for. In Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and optionally have been genetically modified so that the natural regulation was switched off and the expression of genes was increased.
  • a preferred nucleic acid construct advantageously also contains one or more so-called “enhancer” sequences, functionally linked to the promoter, which allow increased expression of the nucleic acid sequence. Additional advantageous sequences can also be inserted at the 3 "end of the DNA sequences, such as further regulatory elements or terminators.
  • the nucleic acids may be contained in one or more copies in the construct.
  • the construct may also contain further markers, such as antibiotic resistances or genes that complement xanthropy, optionally for selection on the construct.
  • Advantageous regulatory sequences for the preparation are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, trp tet, Ipp, lac, Ipp-lac, Iaclq-T7, T5, T3, gal , trc, ara, rhaP (rhaPBAD) SP6, lambda PR or imlambda P promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria.
  • Further advantageous regulatory sequences are contained, for example, in the gram-positive promoters amy and SP02, in the yeast or fungal promoters ADC1, MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH.
  • the nucleic acid construct, for expression in a host organism is advantageously inserted into a vector, such as a plasmid or a phage, which allows for optimal expression of the genes in the host.
  • a vector such as a plasmid or a phage
  • all other vectors known to the person skilled in the art ie, z.
  • viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposon JS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA, as well as the Agrobacterium system.
  • Suitable plasmids are, for example, in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18, pUC19, pKC30, pRep4, pHS1, pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290, PLN-3-lll lI B1 tgt11 or pBdCI, in Streptomyces pI101, pIJ364, plJ702 or pIJ361, in Bacillus pUB110, pC194 or pBD214, in Corynebacterium pSA77 or pAJ667, in fungi pALS1, pIL12 or pBB116, in yeasts 2alpha, pAG-1, YEp6, YEp13 or pEMBLY
  • nucleic acid construct for expression of the further genes contained additionally 3 'and / or ⁇ '-terminal regulatory sequences for increasing expression, which are selected depending on the selected host organism and gene or genes for optimal expression.
  • genes and protein expression are intended to allow the targeted expression of genes and protein expression. Depending on the host organism, this may mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors may preferably have a positive effect on the gene expression of the introduced genes and thereby increase it.
  • enhancement of the regulatory elements can advantageously be achieved at the transcriptional level by using strong transcription signals such as promoters and / or enhancers.
  • an enhancement of the translation is possible by, for example, the stability of the mRNA is improved.
  • the vector containing the nucleic acid construct or the nucleic acid can also advantageously be introduced into the microorganisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA may consist of a linearized vector such as a plasmid or only of the nucleic acid construct or the nucleic acid.
  • An expression cassette is produced by fusion of a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • Common recombinant and cloning techniques are used, as described, for example, in T. Maniatis, EFFritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989) and TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is inserted for expression in a suitable host organism, advantageously in a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Eds. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • recombinant microorganisms can be produced, which are transformed, for example, with at least one vector and can be used to produce the hydrophobins or derivatives thereof used in the invention.
  • the recombinant constructs described above are introduced into a suitable host system and expressed.
  • Homologously recombined microorganisms can also be produced.
  • a vector is prepared which contains at least a portion of a gene or a coding sequence to be used, wherein optionally at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the sequence, e.g.
  • the introduced sequence may, for example, also be a homologue from a related microorganism or be derived from a mammalian, yeast or insect source
  • the vector used for homologous recombination may alternatively such that the endogenous gene is mutated or otherwise altered upon homologous recombination but still encodes the functional protein (eg, the upstream regulatory region may be altered to alter expression of the endogenous protein)
  • the modified portion of the gene used according to the invention is in the homologous recombination vector
  • suitable vectors for homologous recombination is described, for example, in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • microorganisms such as bacteria, fungi or yeast are used as host organisms.
  • Gram-positive or Gram-negative bacteria preferably bacteria of the families Enterobacteriaceae, Pseudomonodaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae or Nocardiaceae, particularly preferably bacteria of the genera Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium or Rhodococcus, are advantageously used.
  • Microorganisms are generally contained in a liquid medium containing a carbon source mostly in the form of sugars, a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate, trace elements such as iron, manganese and magnesium salts and optionally vitamins, at temperatures between 0 and 100 0 C, preferably between 10 to 60 0 C under oxygen fumigation attracted.
  • a carbon source mostly in the form of sugars
  • a nitrogen source usually in the form of organic nitrogen sources such as yeast extract or salts such as ammonium sulfate
  • trace elements such as iron, manganese and magnesium salts and optionally vitamins
  • the pH of the nutrient fluid can be kept at a fixed value, that is, regulated during cultivation or not.
  • the cultivation can take place batchwise, semi-batchwise or continuously.
  • Nutrients can be presented at the beginning of the fermentation or fed in semi-continuously or continuously.
  • the enzymes may be isolated from the organisms by the method described
  • the hydrophobins or functional, biologically active fragments thereof used according to the invention can be prepared by means of a process for recombinant production in which a polypeptide-producing microorganism is cultured, if appropriate, the expression of the proteins is induced and these are isolated from the culture.
  • the proteins can thus also be produced on an industrial scale, if desired.
  • the recombinant microorganism can be cultured and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Specifically, suitable culturing conditions are described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ColD Spring Harbor Laboratory, ColD Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted, if the proteins are not secreted into the culture medium, and the product is digested by known protein isolation techniques won the lysate.
  • the cells can optionally by high-frequency ultrasound, by high pressure, such as. B. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by combining several of the listed methods réelleelle.
  • Purification of the proteins can be achieved by known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, as well as by other conventional methods, such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, F.G., Biochemische Harvey Methoden, Verlag Water de Gruyer, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • the fusion hydrophobins with special anchor groups to facilitate isolation and purification, which can bind to corresponding complementary groups on solid supports, in particular suitable polymers.
  • Such solid carriers can be used, for example, as a filling for chromatography columns, and in this way the efficiency of the separation can generally be increased significantly.
  • separation methods are also known as affinity chromatography.
  • anchor groups can be used in the production of proteins vector systems or oligonucleotides that extend the cDNA to certain nucleotide sequences and thus encode altered proteins or fusion proteins. Proteins modified for ease of purification include so-called "tags" acting as anchors, such as the modification known as hexa-histidine anchors.
  • Histidine-anchored modified fusion hydrophobins can be purified chromatographically using, for example, nickel-Sepharose as column filling.
  • the fusion hydrophobin can then be eluted from the column by suitable means for elution, such as an imidazole solution.
  • a simplified purification process can be dispensed with the chromatographic purification.
  • the cells are first separated by means of a suitable method from the fermentation broth, for example by microfiltration or by centrifugation. Subsequently, the cells can be disrupted by suitable methods, for example by means of the methods already mentioned above, and the cell debris can be separated from the inclusion bodies. The latter can be done advantageously by centrifuging.
  • the closing body can be unlocked in a manner known in principle in order to prevent the Release fusion hydrophobins. This can be done for example by acids, bases and / or detergents.
  • the inclusion bodies with the fusion hydrophobins used according to the invention can generally be completely dissolved within about 1 h already using 0.1 M NaOH.
  • the purity of the fusion hydrophobins obtained by this simplified process is generally from 60 to 80% by weight relative to the amount of all proteins.
  • the solutions obtained by the described simplified purification process can be used without further purification to carry out this invention.
  • hydrophobins prepared as described can be used as "pure" hydrophobins both directly as fusion proteins and after cleavage and separation of the fusion partner.
  • a potential cleavage site (specific recognition site for proteases) into the fusion protein between the hydrophobin part and the fusion partner part.
  • Suitable cleavage sites are, in particular, those peptide sequences which otherwise do not occur in the hydrophobin part or in the fusion partner part, which can be easily determined with bioinformatic tools.
  • Particularly suitable are, for example, BrCN cleavage on methionine, or protease-mediated cleavage with factor Xa, enterokinase, thrombin, TEV cleavage (Tobacca etch virus protease).
  • the hydrophobins or derivatives thereof can be used to stabilize the already separated phases in compositions containing at least two liquid phases.
  • these may be any desired compositions as long as they have at least two liquid phases.
  • composition may in the context of the present invention in addition to the at least two liquid phases in principle also have further phases.
  • the at least two liquid phases are two liquid phases of different density, preferably an oil and water, two organic solutions of different densities, a fuel and water, a fuel and Water or a solvent and water.
  • an aqueous solution is understood as meaning solutions which comprise water, optionally in combination with another solvent.
  • Each of the liquid phases may contain further substances in the context of the present invention.
  • an oil is preferably a crude oil.
  • Suitable solvents are all liquids which form two-phase mixtures with water, in particular organic solvents, for example ethers, aromatic compounds such as toluene or benzene, alcohols, alkanes, alkenes, cycloalkanes, cycloalkenes, esters, ketones, naphthenes or halogenated hydrocarbons.
  • organic solvents for example ethers, aromatic compounds such as toluene or benzene, alcohols, alkanes, alkenes, cycloalkanes, cycloalkenes, esters, ketones, naphthenes or halogenated hydrocarbons.
  • the present invention therefore relates to a use of at least one hydrophobin or at least one derivative thereof as described above, wherein the composition contains oil, preferably crude oil and water or else fuel or water and water.
  • composition may also contain other phases, for example a solid or liquid phase, in particular a solid phase.
  • hydrophobins or derivatives thereof can be used for all applications known to those skilled in the art.
  • extracted oil is usually present as a relatively stable water-in-oil emulsion, which may contain up to 90 wt .-% water depending on the nature of the deposit.
  • water-in-oil emulsion which may contain up to 90 wt .-% water depending on the nature of the deposit.
  • workup and purification of the crude oil falls after the separation of a major part of the water to a crude oil, which still contains about 2 to 3 wt .-% water. This forms a stable emulsion with the oil, which can not be completely separated by centrifuging and adding conventional demulsifiers.
  • hydrophobins or derivatives thereof can be used to improve the phase separation in these compositions. It is achieved a very fast separation.
  • the demulsifier must be adjusted to the type of emulsified oils and fats as well as any emulsifiers and surfactants that may be present in order to achieve the optimum effect.
  • the breaking of emulsions can be additionally supported by an elevated temperature, for example a temperature of 0 to 100 ° C, for example from 10 to 80 ° C, in particular from 20 to 60 ° C.
  • phase stabilization in oil-in-water or water-in-oil mixtures, for example 2-phase systems which have been used as cooling lubricants and are to be recycled.
  • water / oil mixtures also occur on board seagoing vessels as bilgewater.
  • the separation of emulsions and maintenance of the separate phases is necessary in order to be able to reliably separate the water.
  • the amount of hydrophobin or derivative thereof used can vary within wide limits, the amount advantageously being matched to the composition per se and optionally to other components contained in the composition.
  • the composition contains substances which retard or worsen a phase separation of the at least two liquid phases, for example surfactants or emulsifiers, it is advantageous to use a larger amount of a hydrophobin or a derivative thereof.
  • oils in particular crude oils, consist of a mixture of many chemical compounds, it is necessary, due to the different chemical composition of the oil, the water and salt fractions and the concrete conditions of emulsion splitting, such as temperature, duration of emulsion splitting, type of metered addition and interactions with other components of the mixture to match the demulsifier on the concrete conditions.
  • the hydrophobin or derivative thereof can be used according to the invention in any suitable amount.
  • the at least one hydrophobin or derivative thereof is added in an amount of 0.001 to 100 ppm, based on the total composition. composition, used; preferably in an amount of 0.001 to 80 ppm, more preferably from 0.001 to 20 ppm, and most preferably from 0.01 to 10 ppm.
  • the present invention relates to a use as described above, wherein the hydrophobin or the at least one derivative thereof is used in an amount of 0.001 to 100 ppm, based on the total composition.
  • concentration used will be determined by the expert depending on the type of phase composition to be stabilized.
  • the hydrophobin or derivative thereof is usually added in an amount of 0.001 to 20 ppm, preferably 0.005 to 2 ppm, more preferably 0.01 to 1 ppm, more preferably 0.05 to 1 ppm used.
  • the hydrophobin or derivative thereof is usually added in an amount of 0.01 to 100 ppm, preferably 0.1 to 80 ppm, especially 0.1 to 50 ppm, particularly preferably used 0.1 to 20 ppm.
  • the composition contains, in addition to the at least one hydrophobin or derivative thereof, further compounds which improve the phase stabilization.
  • further compounds which improve the phase stabilization.
  • suitable as a further compound for improving the phase stabilization are oxyalkylated phenol-formaldehyde resins, EO / PO block copolymers, crosslinked diepoxides, polyamides or their alkoxylates, salts of the sulfonic acids, ethoxylated fatty amines, succinates and those disclosed in DE, in particular for use as emulsion breakers in crude oil production 10 2005 006 030.7 for compounds mentioned for such applications.
  • the present invention relates to a use as described above, wherein in addition to at least one hydrophobin or the at least one derivative thereof, at least one further compound is used which improves the phase stabilization.
  • the present invention also relates to a process for the stabilization of liquid phases in a composition containing at least at least two liquid phases, comprising the addition of at least one hydrophobin or at least one derivative thereof to the composition.
  • the composition may be a composition as described above comprising at least two liquid phases, for example compositions comprising oil, preferably crude oil, and water or also compositions containing fuel or water and water.
  • the process according to the invention may comprise further steps, for example initially carrying out a phase separation or breaking emulsions and then adding hydrophobins to the aqueous phase.
  • hydrophobins or derivatives thereof can be added to the aqueous phase of a 2-phase system, but also formulations containing fuels or fuels. This allows for contact of the formulation with water to stabilize the phases or prevents re-emulsification.
  • the formulation comprising fuels or fuels may contain further additives which are customarily contained in such formulations. Suitable additives are mentioned, for example, in WO 2004/087808.
  • fuels are understood as meaning, for example, light, medium or heavy fuel oils.
  • fuels are understood as meaning, for example, gasoline fuels, diesel fuels or turbine fuels. Particularly preferred are gasoline fuels.
  • Suitable mineral carrier oils are fractions obtained in petroleum processing, such as bright stock or base oils with viscosities such as from class SN 500-2000; but also aromatic hydrocarbons, paraffinic hydrocarbons and alkoxyalkanols.
  • a fraction known as "hydrocracking oil” is a fraction known as "hydrocracking oil” and obtained in the refining of mineral oil (vacuum distillate section having a boiling range of about 360 to 500 ° C., obtainable from high pressure, catalytically hydrogenated and isomerized and dewaxed natural mineral oil).
  • mineral oil vacuum distillate section having a boiling range of about 360 to 500 ° C., obtainable from high pressure, catalytically hydrogenated and isomerized and dewaxed natural mineral oil.
  • mixtures of the abovementioned mineral carrier oils are also suitable.
  • Examples of synthetic carrier oils which can be used according to the invention are selected from: polyolefins (polyalphaolefins or polyethylenemolefins), (poly) esters, (poly) alkoxylates, polyethers, aliphatic polyetheramines, alkylphenol-initiated polyethers, alkylphenol-initiated polyetheramines and carboxylic esters of long-chain alkanols.
  • suitable synthetic carrier oils are alkoxylated alkylphenols, as described in DE-A 10 102 913.6.
  • corrosion inhibitors for example based on film-forming ammonium salts of organic carboxylic acids or of heterocyclic aromatics in the case of non-ferrous metal corrosion protection
  • Antioxidants or stabilizers for example based on amines such as p-phenylenediamine, dicyclohexylamine or derivatives thereof or of phenols such as 2,4-di-tert-butylphenol or 3, 5-di-tert-butyl-4-hydroxyphenylpropionic acid; other conventional demulsifiers; Antistatic agents; Metallocenes such as ferrocene; methylcyclopentadienyl; Lubricity additives such as certain fatty acids, alkenyl succinic acid esters, bis (hydroxyalkyl) fatty amines, hydroxyacetamides or castor oil; as well as dyes (markers).
  • amines are added to lower the pH of the fuel.
  • the said detergent additives with the polar groups (a) to (i) are added to the fuel usually in an amount of 10 to 5000 ppm by weight, in particular 50 to 1000 ppm by weight.
  • the other components and additives mentioned are added, if desired, in customary amounts.
  • fuels and fuels which are suitable according to the invention are all fuels and fuels known to the person skilled in the art, for example gasolines, as described, for example, in LJII-Mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th ed. 1990, Volume A16, p. 719ff. are described.
  • suitable fuels are also diesel fuel, kerosene and jet fuel.
  • a gasoline with an aromatics content of 60, such. B. maximum 42 vol .-% and a maximum sulfur content of 2000, such as. B. maximum 150 ppm by weight is suitable.
  • the aromatic content of the gasoline is for example 10 to 50, such as. B. 30 to 42 vol .-%, in particular 32 to 40 vol .-%.
  • the sulfur content of the gasoline is for example 2 to 500, such as. B. 5 to 150 ppm by weight, or 10 to 100 ppm by weight.
  • a suitable gasoline fuel for example, an olefin content up to 50 vol .-%, such as. B. from 6 to 21 vol .-%, in particular 7 to 18 vol .-%; a benzene content of up to 5 vol .-%, such as. B. 0.5 to 1.0 vol .-%, in particular 0.6 to 0.9 vol .-% and / or an oxygen content of up to 25 wt .-%, such as. B. up to 10 wt .-% or 1.0 to 2.7 wt .-%, in particular from 1.2 to 2.0 wt .-%, have.
  • an olefin content up to 50 vol .-% such as. B. from 6 to 21 vol .-%, in particular 7 to 18 vol .-%
  • a benzene content of up to 5 vol .-% such as. B. 0.5 to 1.0 vol .-%, in particular 0.6 to 0.9 vol .-% and / or an oxygen
  • gasoline fuels may be mentioned by way of example, which at the same time have an aromatic content of at most 38% by volume, an olefin content of not more than 21% by volume, a sulfur content of not more than 50% by weight, a benzene content of not more than 1.0% by volume. % and have an oxygen content of 1, 0 to 2.7 wt .-%.
  • the content of alcohols and ethers in gasoline can vary over a wide range. Examples of typical maximum contents are 15% by volume for methanol, 65% by volume for ethanol, 20% by volume for isopropanol, 15% by volume for tert-butanol, 20% by volume for isobutanol and 20% by weight for isobutanol for ethers with 5 or more C atoms in the molecule 30 vol .-%.
  • the summer vapor pressure of a gasoline suitable according to the invention is usually not more than 70 kPa, in particular 60 kPa (each at 37 ° C).
  • the ROZ of the gasoline is usually 75 to 105.
  • a common range for the corresponding MOZ is 65 to 95.
  • the specified specifications are determined by conventional methods (DIN EN 228).
  • oligonucleotides Hal570 and Hal571 (HaI 572 / HaI 573) a polymerase chain reaction was carried out.
  • the PCR fragment obtained contained the coding sequence of the gene yaaD / yaaE from Bacillus subtilis, and at the ends in each case an NcoI or BglII restriction cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and cut with the restriction endonucleases NcoI and BglII.
  • This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60 from Qiagen, previously linearized with the restriction endonucleases NcoI and BglI.
  • the resulting vectors pQE60YAAD # 2 / pQE60YaaE # 5 can be used to express proteins consisting of, YAAD :: HIS 6 and YAAE :: HIS 6
  • Hal570 gcgcgcccatggctcaaacaggtactga
  • Hal571 gcagatctccagccgcgttcttgcatac
  • Hal572 ggccatgggattaacaataggtgtactagg
  • Hal573 gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
  • the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417 Using the oligonucleotides KaM 416 and KaM 417, a polymerase chain reaction was carried out.
  • the template DNA used was genomic DNA of the mold Aspergillus nidulans.
  • the resulting PCR fragment contained the coding sequence of the hydrophobin gene dewA and an N-terminal factor Xa proteinase cleavage site.
  • the PCR fragment was purified and digested with the restriction endonuclease se BamHI cut. This DNA fragment was used as an insert and cloned into the vector pQE60YAAD # 2 previously linearized with the restriction endonuclease BgIII.
  • the resulting vector # 508 can be used to express a fusion protein consisting of, YAAD :: Xa :: dewA :: HIS 6 .
  • KaM416 GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCGC
  • plasmid # 513 The cloning of plasmid # 513 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 434 and KaM 435.
  • KaM434 GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
  • plasmid # 507 The cloning of plasmid # 507 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • the template DNA used was an artificially synthesized DNA sequence-hydrophobin BASF1 (see Appendix, SEQ ID NOS 11 and 12).
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
  • Plasmid # 506 The cloning of plasmid # 506 was carried out analogously to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM 417 and KaM 418.
  • KaM417 CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
  • Plasmid # 526 was analogous to plasmid # 508 using the oligonucleotides KaM464 and KaM465.
  • Schyzophyllum commune cDNA was used as template DNA (see Appendix, SEQ ID NOS: 9 and 10).
  • KaM464 CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC
  • KaM465 GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
  • 100 g cell pellet (100-500 mg hydrophobin) are made up to 200 ml total volume with 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.5 and resuspended.
  • the suspension is treated with an Ultraturrax type T25 (Janke and Kunkel, IKA-Labortechnik) for 10 minutes and then for 1 hour at room temperature with 500 units of benzonase (Merck, Darmstadt, Order No. 1.01697.0001) to break down the nucleic acids incubated.
  • filter with a glass cartridge P1.
  • two homogenizer runs are carried out at 1500 bar (Microfluidizer M-110EH, Microfluidics Corp.).
  • the homogenate is centrifuged (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C., 12,000 rpm, 23,000 g), the supernatant is placed on ice and the pellet in 100 ml sodium phosphate buffer, pH 7, 5 resuspended.
  • Centrifugation and resuspension are repeated 3 times with the sodium phosphate buffer containing 1% SDS at the third repetition. After resuspension, stir for one hour and perform a final centrifugation (Sorvall RC-5B, GSA rotor, 250 ml centrifuge beaker, 60 minutes, 4 ° C, 12,000 rpm, 23,000 g).
  • the hydrophobin is contained in the supernatant after final centrifugation ( Figure 1).
  • the experiments show that the hydrophobin is probably contained in the form of inclusion bodies in the corresponding E. coli cells.
  • 50 ml of the hydrophobin-containing supernatant are applied to a 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 column (Amersham) equilibrated with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • the column is washed with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer and the hydrophobin subsequently eluted with 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer containing 200 mM imidazole.
  • the solution is dialyzed against 50 mM Tris-Cl pH 8.0 buffer.
  • Figure 1 shows the purification of the prepared hydrophobin: Lane A: Nickel Sepharose column (1:10 dilution)
  • Lanes C - E OD 280 Maxima of elution fractions (WP1, WP2, WP3)
  • Lane F shows the applied marker
  • the hydrophobin of Figure 1 has a molecular weight of about 53 kD.
  • the smaller bands partially represent degradation products of hydrophobin.
  • the samples are air dried and the contact angle (in degrees) of a drop of 5 ⁇ l of water with the coated glass surface determined at room temperature.
  • the contact angle measurement was performed on a device Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002). The measurement was carried out according to the manufacturer's instructions.
  • Untreated glass gave a contact angle of 30 ⁇ 5 °;
  • the glass plate coated with the hydrophobin according to Example 8 (yaad-dewA-his 6 ) gave a contact angle of 75 ⁇ 5 °.
  • an emulsion of crude oil (homogeneous crude oil, Wintershall AG, Emiichheim, probe 60, 64, 83, 87, 301 and 507) and water were added to snap-cap vials.
  • the preparation of the emulsion was carried out by emulsification of 1000 ppm crude oil in about 50 ml of water by means of an Ultraturrax stirrer (stirring time of 4 minutes at 24000 U / min).
  • the hydrophobin can also be added after splitting the emulsion of the aqueous phase.
  • the hydrophobin from Example 8 was prepared 1 h before addition as a 1% solution (0.25% active ingredient) in distilled water.
  • Exemplary demulsifiers are:
  • Pluronic ® PE 6800 (ethylene oxide / propylene oxide copolymer)
  • Basorol ® P380 (triol polyol polyether)
  • Basorol ® HP tetrol-ethylene oxide / propylene oxide copolymer
  • a crude oil emulsion (Wintershall AG, Emiichheim, Probes 60, 64, 83, 87, 301 and 507 with a water content of 62% by volume, determined by distillation method DIN ISO
  • the crude oil emulsion was homogenized by shaking for about 30 seconds, and 100 ml each of the crude oil emulsion was filled into 100 ml shaker cylinders.
  • Shaking cylinders were inserted into the water bath.

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Abstract

Hydrophobine sind in besonderer Weise geeignet, zweiphasige flüssige Systeme zu stabilisieren.

Description

Verwendung von Hydrophobin als Phasen-Stabilisator
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Hydrophobin und/oder einem seiner Derivate zur Stabilisierung von Phasen in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, insbesondere öl und Wasser.
Hydrophobine sind kleine Proteine von etwa 100 bis 150 Aminosäuren, die charakteristisch für filamentöse Pilze, beispielsweise Schizophyllum commune, sind. Sie weisen in aller Regel 8 Cystein-Einheiten auf.
Hydrophobine weisen eine ausgeprägte Affinität zu Grenzflächen auf und eignen sich daher zur Beschichtung von Oberflächen, um die Eigenschaften der Grenzflächen durch Bildung von amphiphatischen Membranen zu verändern. So lässt sich beispielsweise Teflon mittels Hydrophobinen unter Erhalt einer hydrophilen Oberfläche beschichten.
Hydrophobine können aus natürlichen Quellen isoliert werden. Ebenso sind Herstellverfahren für Hydrophobine und Derivate davon bekannt. Beispielsweise offenbart die deutsche Patentanmeldung DE 10 2005 007 480 ein Herstellverfahren für Hydrophobine und Derivate davon.
Im Stand der Technik ist die Verwendung von Hydrophobinen für verschiedene Anwendungen bereits vorgeschlagen worden.
WO 96/41882 schlägt die Verwendung von Hydrophobinen als Emulgatoren, Verdicker, oberflächenaktive Substanzen, zum Hydrophilieren hydrophober Oberflächen, zur Verbesserung der Wasserbeständigkeit hydrophiler Substrate, zur Herstellung von Öl-inWasser-Emulsionen oder von Wasser-in-öl-Emulsionen vor. Weiterhin werden pharmazeutische Anwendungen wie die Herstellung von Salben oder Cremes sowie kosmetische Anwendungen wie Hautschutz oder die Herstellung von Haarshampoos oder Haarspülungen vorgeschlagen. WO 96/41882 beschreibt darüber hinaus Zusammensetzungen, insbesondere Zusammensetzungen für pharmazeutische Anwendungen, enthaltend Hydrophobine. EP-A 1 252 516 offenbart die Beschichtung von Fenstern, Kontaktlinsen, Biosensoren, medizinischen Vorrichtungen, Behältern zur Durchführung von Versuchen oder zur Lagerung, Schiff rümpfen, festen Teilchen oder Rahmen oder Karosserie von Personenkraftwagen mit einer Hydrophobine enthaltenden Lösung bei einer Temperatur von 30 bis 800C.
WO 03/53383 beschreibt die Verwendung von Hydrophobin zum Behandeln von Kera- tin-Materialien in kosmetischen Anwendungen.
WO 03/10331 offenbart, dass Hydrophobine oberflächenaktive Eigenschaften aufweisen. So wird ein mit Hydrophobin beschichteter Sensor vorgestellt, beispielsweise eine Messelektrode, an den nicht kovalent weitere Substanzen, z.B. elektroaktive Substanzen, Antikörper oder Enzyme gebunden sind.
WO 2004/000880 betrifft ebenfalls die Beschichtung von Oberflächen mit Hydrophobin oder Hydrophobin-ähnlichen Substanzen.
Auch WO 01/74864, die Hydrophobin-ähnliche Proteine betrifft, offenbart, dass diese zur Stabilisierung von Dispersionen und Emulsionen eingesetzt werden können.
Die Verwendung von Proteinen zur Phasentrennung ist prinzipiell bekannt.
So wird in EP-A 05 016 962 die Verwendung von Proteinen zur Verbesserung der Phasentrennung von z.B. Öl/Wasser- oder Kraftstoff/Wassergemischen beschrieben. Dem Fachmann ist bekannt, dass amphiphile Moleküle je nach Anwendungskonzentration und umgebendem Medium sowohl stabilisierend als auch destabilisierend auf Phasengrenzen wirken können.
GB 195,876 offenbart ein Verfahren zum Brechen von Wasser-in-öl-Emulsionen unter Verwendung von Kolloiden. Als Kolloide werden beispielhaft Proteine wie Gelatine, Casein, Albumin oder Polysaccharide wie Gummi Arabicum oder Gummi Tragacanth genannt.
JP-A 11-169177 beschreibt die Verwendung von Proteinen mit Lipase-Aktivität zum Brechen von Emulsionen.
WO 01/60916 offenbart die Verwendung von tensidfreien Mischungen aus mindestens einem wasserlöslichen Protein, mindestens einem wasserlöslichen Polysaccharid sowie mindestens einem wasserlöslichen Polymer wie beispielsweise Polyethylenoxid für verschiedene Anwendungen, darunter auch zum Demulgieren von Rohöl. Keine der zitierten Schriften offenbart die Verwendung von Hydrophobinen zur Verhinderung einer Re-Emulgierung.
Die Verwendung von Proteinen hat den allgemeinen Vorteil, dass es sich um natürlich vorkommende Substanzen handelt, die biologisch abbaubar sind und damit nicht zu einer dauerhaften Belastung der Umwelt führen.
Bei vielen großtechnischen Anwendungen, beispielsweise bei der Trennung von Roh- öl-Wasser-Emulsionen, kommt es einerseits auf eine möglichst schnelle Phasentrennung und andererseits auf eine Vermeidung beziehungsweise Verhinderung einer Re- Emulgierung der Phasen an. Aufgabe der Erfindung war es, ein verbessertes Verfahren zur Stabilisierung der Phasen durch Einsatz von Proteinen bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe gelöst durch die Verwendung mindestens eines Hydrophobins in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, insbesondere öl und Wasser.
Dabei kann das Hydrophobin erfindungsgemäß grundsätzlich in beliebiger Menge ein- gesetzt werden, solange gewährleistet ist, dass die Phasenstabilisierung in den Zusammensetzungen, enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, verbessert wird.
Unter „Verbesserung der Phasenstabilisierung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung verstanden, dass die Re-Emulgierung von zwei flüssigen Phasen bei Zusatz einer Substanz zu einem Gemisch langsamer erfolgt, als in demselben Gemisch ohne den Zusatz der Substanz, beziehungsweise dass durch den Zusatz der Substanz die Re-Emulgierung von zwei flüssigen Phasen vermieden wird.
Unter einem Hydrophobin werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch Deriva- te davon beziehungsweise modifizierte Hydrophobine verstanden. Bei modifizierten beziehungsweise derivatisierten Hydrophobinen kann es sich beispielsweise um Hydrophobin-Fusionsproteine handeln oder um Proteine, die eine Aminosäurensequenz aufweisen, die mindestens 60 %, beispielsweise mindestens 70 %, insbesondere mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, insbesondere bevorzugt mindestens 95 % Identität mit der Sequenz eines Hydrophobins aufweisen, und die noch zu 50 %, beispielsweise zu 60 %, insbesondere zu 70 %, besonders bevorzugt zu 80 % die biologischen Eigenschaften eines Hydrophobins erfüllen, insbesondere die Eigenschaft, dass die Oberflächeneigenschaften durch Beschichten mit diesen Proteinen derart geändert werden, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung einer Glasoberfläche mit dem Protein eine Vergrößerung um mindestens 20°, bevorzugt um mindestens 25°, insbesondere um mindestens 30° aufweist.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon die Neubildung von Emulsionen nach erfolgter Phasentrennung vermindern beziehungsweise vermeiden. Dies ist insbesondere vorteilhaft, wenn eine längere Koexistenz von zwei Phasen nebeneinander gegeben ist oder das Auftreten von erneuten Emulsionen verhindert werden soll. Hierbei sind schon geringe Mengen des Peptids äußerst wirksam.
Für die Definition von Hydrophobinen ist dabei die Struktur- und nicht die Sequenzspe- zifität der Hydrophobine entscheidend. Die Aminosäuresequenz der natürlichen Hydrophobine ist sehr divers, sie haben jedoch alle ein hochcharakteristisches Muster von 8 konservierten Cysteinresten. Diese Reste bilden vier intramolekulare Disulfid- brücken.
Der N- und C-Terminus ist über einen größeren Bereich variabel. Hier können mittels dem Fachmann bekannten molekularbiologischen Techniken Fusionspartnerproteine mit einer Länge von 10 bis 500 Aminosäuren angefügt werden.
Darüber hinaus sind im Sinne der vorliegenden Erfindung unter Hydrophobinen und Derivaten davon Proteine mit einer ähnlichen Struktur und funktioneller Äquivalenz zu verstehen.
Unter dem Begriff „Hydrophobin" im Sinne der vorliegenden Erfindung sollen im Folgenden Polypeptide der allgemeinen Strukturformel (I)
Xn-C -Xi_5o-C -Xo-5-C -Xi-ioo-C -Xi_ioo-C -Xi_5o-C -X0-S-C -Xi-S0-C -Xm (I)
verstanden werden, wobei X für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren (Phe, Leu, Ser, Tyr, Cys, Trp, Pro, His, GIn, Arg, Ne Met, Thr, Asn, Lys, VaI, AIa, Asp, GIu, GIy) stehen kann. Dabei können X jeweils gleich oder verschieden sein. Hierbei stellen die bei X stehenden Indizes jeweils die Anzahl der Aminosäuren dar, C steht für Cystein, Alanin, Serin, Glycin, Methionin oder Threonin, wobei mindestens vier der mit C benannten Reste für Cystein stehen, und die Indizes n und m stehen unabhängig voneinander für natürliche Zahlen zwischen 0 und 500, bevorzugt zwischen 15 und 300.
Die Polypeptide gemäß Formel (I) sind weiterhin durch die Eigenschaft charakterisiert, dass sie bei Raumtemperatur nach Beschichten einer Glasoberfläche eine Vergröße- rung des Kontaktwinkels eines Wassertropfens von mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25° und besonders bevorzugt 30° bewirken, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Die mit C1 bis C8 benannten Aminosäuren sind bevorzugt Cysteine; sie können aber auch durch andere Aminosäuren ähnlicher Raumerfüllung, bevorzugt durch Alanin, Serin, Threonin, Methionin oder Glycin ersetzt werden. Allerdings sollen mindestens vier, bevorzugt mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 6 und insbesondere mindestens 7 der Positionen C1 bis C8 aus Cysteinen bestehen. Cysteine können in den erfindungsgemäßen Proteinen entweder reduziert vorliegen oder miteinander Di- sulfidbrücken ausbilden. Besonders bevorzugt ist die intramolekulare Ausbildung von C-C-Brücken, insbesondere die mit mindestens einer, bevorzugt 2, besonders bevorzugt 3 und ganz besonders bevorzugt 4 intramolekularen Disulfidbrücken. Bei dem oben beschriebenen Austausch von Cysteinen durch Aminosäuren ähnlicher Raumer- füllung werden vorteilhaft solche C-Positionen paarweise ausgetauscht, die intramolekulare Disulfidbrücken untereinander ausbilden können.
Falls in den mit X bezeichneten Positionen auch Cysteine, Serine, Alanine, Glycine, Methionine oder Threonine verwendet werden, kann sich die Nummerierung der ein- zelnen C-Positionen in den allgemeinen Formeln entsprechend verändern.
Bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (II)
Xn-C -X3-25-C -Xθ-2"C -X5-50-C -X2-35"C -X2-15"C -Xθ-2"C -X3-35"C -Xm (H)
zur Ausführung der vorliegenden Erfindung eingesetzt, wobei X, C und die bei X und C stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 300 stehen, und sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich weiterhin bei mindestens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Besonders bevorzugt werden Hydrophobine der allgemeinen Formel (IM)
Xn"C -Xö-g-C -C -Xn-39-C -X2-23"C -Xδ-g-C -C -Xß-Iδ-C -Xm (Hl)
eingesetzt, wobei X, C und die bei X stehenden Indizes die obige Bedeutung haben, die Indizes n und m für Zahlen zwischen 0 und 200 stehen, sich die Proteine weiterhin durch die oben erwähnte Kontaktwinkeländerung auszeichnen, und es sich bei mindes- tens 6 der mit C benannten Reste um Cystein handelt. Besonders bevorzugt handelt es sich bei allen Resten C um Cystein.
Bei den Resten Xn und Xm kann es sich um Peptidsequenzen handeln, die natürlicher- weise auch mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Es kann sich aber auch bei einem oder beiden Resten um Peptidsequenzen handeln, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpft sind. Darunter sind auch solche Reste Xn und/oder Xm zu verstehen, bei denen eine natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Peptid- sequenz durch eine nicht natürlicherweise in einem Hydrophobin vorkommende Pep- tidsequenz verlängert ist.
Falls es sich bei Xn und/oder Xn, um natürlicherweise nicht in Hydrophobinen verknüpfte Peptidsequenzen handelt, sind derartige Sequenzen in der Regel mindestens 20, bevorzugt mindestens 35, besonders bevorzugt mindestens 50 und ganz besonders be- vorzugt mindestens 100 Aminosäuren lang. Ein derartiger, natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verknüpfter Rest soll im Folgenden auch als Fusionspartner bezeichnet werden. Damit soll ausgedrückt werden, dass die Proteine aus mindestens einem Hydrophobinteil und einem Fusionspartnerteil bestehen können, die in der Natur nicht zusammen in dieser Form vorkommen.
Der Fusionspartnerteil kann aus einer Vielzahl von Proteinen ausgewählt werden. Es können auch mehrere Fusionspartner mit einem Hydrophobinteil verknüpft werden, beispielsweise am Aminoterminus (Xn) und am Carboxyterminus (Xn,) des Hydropho- binteils. Es können aber auch beispielsweise zwei Fusionspartner mit einer Position (Xn oder Xn,) des erfindungsgemäßen Proteins verknüpft werden.
Besonders geeignete Fusionspartner sind Proteine, die natürlicherweise in Mikroorganismen, insbesondere in E. coli oder Bacillus subtilis vorkommen. Beispiele für solche Fusionspartner sind die Sequenzen yaad (SEQ ID NO: 15 und 16), yaae (SEQ ID NO: 17 und 18), und Thioredoxin. Gut geeignet sind auch Fragmente oder Derivate dieser genannten Sequenzen, die nur einen Teil, beispielsweise 70 bis 99 %, bevorzugt 5 bis 50 %, und besonders bevorzugt 10 bis 40 % der genannten Sequenzen umfassen, oder bei denen einzelne Aminosäuren beziehungsweise Nukleotide gegenüber der genannten Sequenz verändert sind, wobei sich die Prozentangaben jeweils auf die Anzahl der Aminosäuren bezieht.
In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform weist das Fusion-Hydrophobin neben dem Fusionspartner als eine Gruppe Xn oder Xn, noch eine sogenannte Affinitätsdomäne (affin ity tag / affin ity tail) auf. Hierbei handelt es sich in prinzipiell bekannter Art und Weise um Ankergruppen, welche mit bestimmten komplementären Gruppen Wechsel- wirken können und der leichteren Aufarbeitung und Reinigung der Proteine dienen können. Beispiele derartiger Affinitätsdomänen umfassen (His)k- , (Arg)k-, (Asp)k-, (Phe)k- oder (Cys)k-Gruppen, wobei k im Allgemeinen für eine natürliche Zahl von 1 bis 10 steht. Bevorzugt kann es sich um eine (His)k-Gruppe handeln, wobei k für 4 bis 6 steht.
Die erfindungsgemäß als Hydrophobine oder Derivate davon verwendeten Proteine können auch noch in ihrer Polypeptidsequenz modifiziert sein, beispielsweise durch Glycosilierung, Acetylierung oder auch durch chemische Quervernetzung beispielswei- se mit Glutardialdehyd.
Eine Eigenschaft der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine beziehungsweise deren Derivate ist die Änderung von Oberflächeneigenschaften, wenn die Oberflächen mit den Proteinen beschichtet werden. Die Änderung der Oberflächeneigenschaften lässt sich experimentell beispielsweise dadurch bestimmen, dass der Kontaktwinkel eines Wassertropfens vor und nach der Beschichtung der Oberfläche mit dem Protein gemessen wird und die Differenz der beiden Messungen ermittelt wird.
Die Durchführung von Kontaktwinkelmessungen ist dem Fachmann prinzipiell bekannt. Die Messungen beziehen sich auf Raumtemperatur sowie Wassertropfen von 5 μl und die Verwendung von Glasplättchen als Substrat. Die genauen experimentellen Bedingungen für eine beispielhaft geeignete Methode zur Messung des Kontaktwinkels sind im experimentellen Teil dargestellt. Unter den dort genannten Bedingungen besitzen die erfindungsgemäß verwendeten Fusionsproteine die Eigenschaft, den Kontaktwinkel um mindestens 20°, bevorzugt mindestens 25°, besonders bevorzugt mindestens 30° zu vergrößern, jeweils verglichen mit dem Kontaktwinkel eines gleich großen Wassertropfens mit der unbeschichteten Glasoberfläche.
Besonders bevorzugte Hydrophobine zur Ausführung der vorliegenden Erfindung sind die Hydrophobine des Typs dewA, rodA, hypA, hypB, sc3, basfi , basf2, die im nachfolgenden Sequenzprotokoll strukturell charakterisiert sind. Es kann sich auch nur um Teile oder Derivate davon handeln. Es können auch mehrere Hydrophobinteile, bevorzugt 2 oder 3, gleicher oder unterschiedlicher Struktur miteinander verknüpft und mit einer entsprechenden geeigneten Polypeptidsequenz, die natürlicherweise nicht mit einem Hydrophobin verbunden ist, verknüpft werden.
Erfindungsgemäß besonders geeignet sind weiterhin die Fusionsproteine yaad-Xa- dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 - his (SEQ ID NO: 24) mit den in Klammern angegebenen Polypeptidsequenzen sowie den dafür codierenden Nukleinsäuresequenzen, insbesondere den Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 19, 21 , 23. Auch Proteine, die sich ausgehend von den in SEQ ID NO. 20, 22 oder 24 dargestellten Polypeptidsequenzen durch Austausch, Insertion oder Deleti- on von mindestens einer, bis hin zu 10, bevorzugt 5, besonders bevorzugt 5% aller Aminosäuren ergeben, und die die biologische Eigenschaft der Ausgangsproteine noch zu mindestens 50% besitzen, sind besonders bevorzugte Ausführungsformen. Unter biologischer Eigenschaft der Proteine wird hierbei die bereits beschriebene Änderung des Kontaktwinkels um mindestens 20° verstanden.
Besonders zur Ausführung der Erfindung geeignete Derivate sind von yaad-Xa-dewA- his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf 1 -his (SEQ
ID NO: 24) durch Verkürzung des yaad-Fusionspartners abgeleitete Reste. Anstelle des vollständigen yaad-Fusionspartners (SEQ ID NO: 16) mit 294 Aminosäuren kann vorteilhaft ein verkürzter yaad-Rest eingesetzt werden. Der verkürzte Rest sollte aber zumindest 20, bevorzugt mindestens 35 Aminosäuren umfassen. Beispielsweise kann ein verkürzter Rest mit 20 bis 293, bevorzugt 25 bis 250, besonders bevorzugt 35 bis
150 und beispielsweise 35 bis 100 Aminosäuren eingesetzt werden.
Eine Spaltstelle zwischen dem Hydrophobin und dem Fusionspartner beziehungsweise den Fusionspartnern kann dazu genutzt, das reine Hydrophobin in underivatisierter Form freizusetzen (beispielsweise durch BrCN-Spaltung an Methionin, Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin-, TEV-Spaltung etc.).
Es ist weiterhin möglich, Fusionsproteine aus einem Fusionspartner, beispielsweise yaad oder yaae, und mehreren Hydrophobinen, auch unterschiedlicher Sequenz, bei- spielsweise DewA-RodA oder Sc3-DewA, Sc3-RodA), hintereinander zu generieren. Ebenso können Hydrophobinfragmente (beispielsweise N- oder C-terminale Verkürzungen) oder Mutein, die bis zu 70% Homologie aufweisen, eingesetzt werden. Die Auswahl der optimalen Konstrukte erfolgt jeweils in Bezug auf die jeweilige Verwendung, d.h. die zu trennenden flüssigen Phasen.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine beziehungsweise die in den erfindungsgemäßen Formulierungen enthaltenen Hydrophobine lassen sich chemisch durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese, beispielsweise durch Festphasensynthese nach Merrifield herstellen.
Natürlich vorkommende Hydrophobine lassen sich aus natürlichen Quellen mittels geeigneter Methoden isolieren. Beispielhaft sei auf Wösten et. al., Eur. J Cell Bio. 63, 122-129 (1994) oder WO 96/41882 verwiesen. Die Herstellung von Fusionsproteinen kann bevorzugt durch gentechnische Verfahren erfolgen, bei denen eine für den Fusionspartner und eine für den Hydrophobinteil codierende Nukleinsäuresequenz, insbesondere DNA-Sequenz, so kombiniert werden, dass in einem Wirtsorganismus durch Genexpression der kombinierten Nukleinsäure- sequenz das gewünschte Protein erzeugt wird. Ein derartiges Herstellverfahren ist beispielsweise in der deutschen Patentanmeldung DE 102005007480.4 offenbart.
Geeignete Wirtsorganismen (Produktionsorganismen) für das genannte Herstellverfahren können dabei Prokaryonten (einschließlich der Archaea) oder Eukaryonten sein, besonders Bakterien einschließlich Halobacterien und Methanococcen, Pilze, Insektenzellen, Pflanzenzellen und Säugerzellen, besonders bevorzugt Escherichia coli, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Aspergillus oryzea, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Pichia pastoris, Pseudomonas spec, Lactobacillen, Hansenula poly- morpha, Trichoderma reesei, SF9 (bzw. verwandte Zellen) u.a..
Gegenstand der Arbeiten ist außerdem die Verwendung von Expressionskonstrukten, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen, eine für ein erfindungsgemäß verwendetes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz, sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte.
Vorzugsweise umfassen eingesetzte Konstrukte 5"-stromaufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3"-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz.
Unter einer "operativen Verknüpfung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann, verstanden.
Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie En- hancer, Polyadenylierungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und derglei- chen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z. B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu diesen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulation dieser Se- quenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch verändert worden sein, so dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht wurde.
Ein bevorzugtes Nukleinsäurekonstrukt enthält vorteilhaft auch eine oder mehrere so- genannte "Enhancer"-Sequenzen, funktionell verknüpft mit dem Promotor, die eine erhöhte Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3"-Ende der DNA- Sequenzen können zusätzliche vorteilhafte Sequenzen inseriert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren.
Die Nukleinsäuren können in einer oder mehreren Kopien im Konstrukt enthalten sein. Im Konstrukt können noch weitere Marker, wie Antibiotikaresistenzen oder Au- xotrophien komplementierende Gene, gegebenenfalls zur Selektion auf das Konstrukt enthalten sein.
Vorteilhafte Regulationssequenzen für die Herstellung sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, Iaclq-T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, rhaP(rhaPBAD) SP6-, lambda-PR-oder imlambda-P-Promotor enthalten, die vorteilhaft in gram-negativen Bakterien Anwendung finden. Weitere vorteilhafte Regulationssequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilzpromotoren ADC1 , MFalpha, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH enthalten.
Es können auch künstliche Promotoren für die Regulation verwendet werden.
Das Nukleinsäurekonstrukt wird zur Expression in einem Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen Vektor, wie beispielsweise einem Plasmid oder einem Phagen inseriert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Unter Vektoren sind außer Plasmiden und Phagen auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, also z. B. Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, TransposonsJS- EIe- mente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA, sowie das Agrobacterium- System zu verstehen.
Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden. Geeignete Plasmide sind beispielsweise in E. coli pLG338, pACYC184, pBR322, pUC18,pUC19, pKC30, pRep4, pHS1 , pKK223-3, pDHE19.2, pHS2, pPLc236, pMBL24, pLG200, pUR290,plN-llllI3-B1, tgt11 oder pBdCI, in Streptomyces plJ101 , plJ364, plJ702 oder plJ361, in Bacillus pUB110, pC194 oder pBD214, in Cory- nebacterium pSA77 oder pAJ667, in Pilzen pALS1 , plL2 oder pBB116, in Hefen 2alpha, pAG-1 , YEp6, YEp13 oder pEMBLYe23 oder in Pflanzen pLGV23,pGHIac+, pBIN19, pAK2004 oder pDH51. Die genannten Plasmide stellen eine kleine Auswahl der möglichen Plasmide dar. Weitere Plasmide sind dem Fachmann bekannt und können beispielsweise aus dem Buch Cloning Vectors (Eds. Pouwels P. H. et al. Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985, ISBN 0 444 904018) entnommen werden. Vorteilhaft enthält das Nukleinsäurekonstrukt zur Expression der weiteren enthaltenen Gene zusätzlich noch 3"-und/oder δ'-terminale regulatorische Sequenzen zur Steigerung der Expression, die je nach ausgewähltem Wirtorganismus und Gen oder Gene für eine optimale Expression ausgewählt werden.
Diese regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Gene und der Proteinexpression ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Gen- expression der eingeführten Gene positiv beeinflussen und dadurch erhöhen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "En- hancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann der das Nukleinsäurekonstrukt oder die Nukleinsäure enthaltende Vektor auch vorteilhaft in Form einer linearen DNA in die Mikroorganismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Vektor wie einem Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt oder der Nukleinsäure bestehen.
Für eine optimale Expression heterologer Gene in Organismen ist es vorteilhaft, die Nukleinsäuresequenzen entsprechend des im Organismus verwendeten spezifischen "codon usage" zu verändern. Der "codon usage" lässt sich anhand von Computerauswertungen anderer, bekannter Gene des betreffenden Organismus leicht ermitteln.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F.Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt beziehungsweise Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus, vorteilhaft in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, der eine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden.
Mit Hilfe der Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder Derivate davon eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfek- tion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Ex- pressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning : A Laboratory Manual. 2. Aufl., CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Es sind auch homolog rekombinierte Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines zu verwendenden Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure- Deletion, -Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die Sequenz zu ver- ändern, z. B. funktionell zu disruptieren ("Knockouf'-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z. B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein kodiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des erfindungsgemäß verwendeten Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z. B. beschrieben in Thomas, K. R. und Capecchi, M. R. (1987) Cell 51 : 503. Als rekombinante Wirtsorganismen für derartige Nukleinsäuren oder derartige Nuklein- säurekonstrukte kommen prinzipiell alle prokaryontischen oder eukaryontischen Organismen in Frage. Vorteilhafterweise werden als Wirtsorganismen Mikroorganismen wie Bakterien, Pilze oder Hefen verwendet. Vorteilhaft werden gram-positive oder gramnegative Bakterien, bevorzugt Bakterien der Familien Enterobacteriaceae, Pseudomo- nadaceae, Rhizobiaceae, Streptomycetaceae oder Nocardiaceae, besonders bevorzugt Bakterien der Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Streptomyces, Nocardia, Burkholderia, Salmonella, Agrobacterium oder Rhodococcus verwendet.
Die im oben beschriebenen Herstellverfahren für Fusionsproteine verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen beziehungsweise gezüchtet. Mikroorganismen werden in der Regel in einem flüssigen Medium, das eine Kohlenstoffquelle meist in Form von Zuckern, eine Stickstoff- quelle meist in Form von organischen Stickstoffquellen wie Hefeextrakt oder Salzen wie Ammoniumsulfat, Spurenelemente wie Eisen-, Mangan- und Magnesiumsalze sowie gegebenenfalls Vitamine enthält, bei Temperaturen zwischen 0 und 100 0C, bevorzugt zwischen 10 bis 60 0C unter Sauerstoff begasung angezogen. Dabei kann der pH- Wert der Nährflüssigkeit auf einem festen Wert gehalten werden, das heißt während der Anzucht reguliert werden oder nicht. Die Anzucht kann "batch "-weise, "semi- batch"-weise oder kontinuierlich erfolgen. Nährstoffe können zu Beginn der Fermentation vorgelegt oder semikontinuierlich oder kontinuierlich nachgefüttert werden. Die Enzyme können nach dem in den Beispielen beschriebenen Verfahren aus den Organismen isoliert werden oder als Rohextrakt für die Reaktion verwendet werden.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrophobine oder funktionelle, biologisch aktive Fragmente davon können mittels eines Verfahrens zur rekombinanten Herstellung hergestellt werden, wobei man einen Polypeptide produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Proteine induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Proteine können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist. Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40 °C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen bei- spielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning : A Labo- ratory Manual, CoId Spring Harbor Laboratory, CoId Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Proteine nicht in das Kulturmedium sezerniert wer- den, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z. B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lytischen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren auf- geschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Proteine kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose- Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chroma- tographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, F. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Water de Gruy- ter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.
Besonders vorteilhaft kann es sein, die Fusions-Hydrophobine zur Erleichterung der Isolierung und Reinigung mit speziellen Ankergruppen zu versehen, die an entsprechende komplementäre Gruppen an festen Trägern, insbesondere geeigneten Polymeren anbinden können. Derartige feste Träger können beispielsweise als Füllung für Chromatographiesäulen verwendet werden, und auf diese Art und Weise kann die Effizienz der Trennung in der Regel deutlich gesteigert werden. Solche Trennverfahren sind auch als Affinitätschromatographie bekannt. Zum Einbau der Ankergruppen kann man bei der Herstellung der Proteine Vektorsysteme oder Oligonukleotide verwenden, die die cDNA um bestimmte Nukleotidsequenzen verlängern und damit veränderte Proteine oder Fusionsproteine kodieren. Zur leichteren Reinigung modifizierte Proteine umfassen als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie beispielsweise die als Hexa- Histidin-Anker bekannte Modifikation. Mit Histidin-Ankem modifizierte Fusions-Hydrophobine lassen sich beispielsweise unter Verwendung von Nickel-Sepharose als Säulenfüllung chromatographisch reinigen. Das Fusions-Hydrophobin kann anschließend mittels geeigneten Mitteln zum Eluieren, wie beispielsweise einer Imidazol-Lösung, wieder von der Säule eluiert werden.
In einem vereinfachten Reinigungsverfahren kann auf die chromatographische Reinigung verzichtet werden. Hierzu werden die Zellen zunächst mittels einer geeigneten Methode aus der Fermentationsbrühe abgetrennt, beispielsweise durch Mikrofiltration oder durch Zentrifugieren. Anschließend können die Zellen mittels geeigneter Methoden, beispielsweise mittels der bereits oben genannten Methoden, aufgeschlossen, und die Zelltrümmer von den Einschlusskörpern (inclusion bodies) getrennt werden. Letzteres kann vorteilhaft durch Zentrifugieren erfolgen. Schließlich können die Ein- Schlusskörper in prinzipiell bekannter Art und Weise aufgeschlossen werden, um die Fusions-Hydrophobine freizusetzen. Dies kann beispielsweise durch Säuren, Basen und/oder Detergenzien erfolgen. Die Einschlusskörper mit den erfindungsgemäß verwendeten Fusion-Hydrophobinen können in der Regel schon unter Verwendung von 0,1 m NaOH innerhalb von ca. 1 h vollständig gelöst werden. Die Reinheit der nach diesem vereinfachten Verfahren erhaltenen Fusions-Hydrophobine liegt in der Regel bei 60 bis 80 Gew.-% bezüglich der Menge aller Proteine. Die nach dem beschriebenen, vereinfachten Reinigungsverfahren erhaltenen Lösungen können ohne weitere Reinigung zur Ausführung dieser Erfindung eingesetzt werden.
Die wie beschrieben hergestellten Hydrophobine können sowohl direkt als Fusionsproteine als auch nach Abspaltung und Abtrennung des Fusionspartners als „reine" Hydrophobine verwendet werden.
Wenn eine Abtrennung des Fusionspartners vorgesehen ist, empfiehlt es sich, eine potentielle Spaltstelle (spezifische Erkennungsstelle für Proteasen) in das Fusionsprotein zwischen Hydrophobinteil und Fusionspartnerteil einzubauen. Als Spaltstelle geeignet sind insbesondere solche Peptidsequenzen, die ansonsten weder im Hydrophobinteil noch im Fusionspartnerteil vorkommen, was sich mit bioinformatischen Tools leicht ermitteln lässt. Besonders geeignet sind beispielsweise BrCN-Spaltung an Methionin, oder durch Protease vermittelte Spaltung mit Faktor Xa-, Enterokinase-, Thrombin, TEV-Spaltung (Tobacca etch virus Protease).
Erfindungsgemäß können die Hydrophobine oder Derivate davon, zur Stabilisierung der bereits getrennten Phasen in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eingesetzt werden. Dabei kann es sich im Prinzip um beliebige Zusammensetzungen handeln, solange diese mindestens zwei flüssige Phasen aufweisen.
Insbesondere kann es sich auch um Zusammensetzungen handeln, die vor der Zuga- be des mindestens einen Hydrophobins oder Derivats davon, in Form einer Emulsion vorlagen, dann in einem längeren Prozess (vorzugsweise mehr als 1 Minute, insbesondere mehr als 5 Minuten) in zwei Phasen getrennt wurden und erst dann mit Hydrophobin versetzt werden.
Die Zusammensetzung kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung neben den mindestens zwei flüssigen Phasen im Prinzip auch weitere Phasen aufweisen.
Bei den mindestens zwei flüssigen Phasen handelt es sich um zwei flüssige Phasen unterschiedlicher Dichte, bevorzugterweise um ein öl und Wasser, zwei organische Lösungen unterschiedlicher Dichte, einen Kraftstoff und Wasser, einen Brennstoff und Wasser oder ein Lösungsmittel und Wasser. Dabei werden unter einer wässrigen Lösung im Rahmen der vorliegenden Erfindung Lösungen verstanden, die Wasser, gegebenenfalls in Kombination mit einem weiteren Lösungsmittel enthalten. Jede der flüssigen Phasen kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Stoffe enthal- ten.
Erfindungsgemäß handelt es sich bei einem öl vorzugsweise um ein Rohöl.
Geeignete Lösungsmittel sind alle Flüssigkeiten, die mit Wasser zweiphasige Gemi- sehe ausbilden, insbesondere organische Lösungsmittel, beispielsweise Ether, aromatische Verbindungen wie Toluol oder Benzol, Alkohole, Alkane, Alkene, Cycloalkane, Cycloalkene, Ester, Ketone, Naphtene oder halogenierte Kohlenwasserstoffe.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher eine wie zuvor beschriebene Verwendung mindestens eines Hydrophobins oder mindestens eines Derivats davon, wobei die Zusammensetzung öl, bevorzugt Rohöl und Wasser enthält oder aber Kraft- oder Brennstoff und Wasser.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann die Zusammensetzung auch weitere Phasen enthalten, beispielsweise eine feste oder flüssige Phase, insbesondere eine feste Phase.
Die Hydrophobine oder Derivate davon können für alle dem Fachmann bekannten Anwendungen eingesetzt werden. Insbesondere sind im Rahmen der vorliegenden Erfin- düng die Verwendung als Phasen-Stabilisator in Ottokraftstoff/Wasser-Mischungen, in anderen Kraftstoff- oder Brennstoff/Wasser-Mischungen, Rohöl und Wasser-Phasen bei der Rohölförderung beziehungsweise Rohöltransport sowie die Entsalzung von Rohöl durch Extraktion von Rohöl mit Wasser sowie anschließende Weiterleitung der resultierenden Phasen zu nennen.
Durch Zugabe von Demulgatoren können Emulsionen gebrochen werden. So liegt beispielsweise gefördertes Erdöl in der Regel als relativ stabile Wasser-in-öl-Emulsion vor, welche je nach Art der Lagerstätte bis zu 90 Gew.-% Wasser enthalten kann. Bei der Aufarbeitung und Reinigung des Rohöls fällt nach dem Abtrennen eines Großteils des Wassers ein Rohöl an, das immer noch ca. 2 bis 3 Gew.-% Wasser enthält. Dieses bildet mit dem öl eine stabile Emulsion, die auch durch Zentrifugierung und Zugabe herkömmlicher Demulgatoren nicht vollständig abzutrennen ist. Dies ist insofern problematisch, als das Wasser einerseits stark salzhaltig ist und damit korrodierend wirkt, zum anderen wird durch das Restwasser das zu transportierende und zu lagernde Vo- lumen erhöht, was zu erhöhten Kosten führt. Es wurde gefunden, dass Hydrophobine oder Derivate davon eingesetzt werden können, um die Phasentrennung in diesen Zusammensetzungen zu verbessern. Es wird eine sehr schnelle Trennung erreicht.
Dabei muss der Demulgator auf die Art der emulgierten öle und Fette sowie auf gege- benenfalls enthaltene Emulgatoren und Tenside eingestellt werden, um eine optimale Wirkung zu erzielen. Das Brechen von Emulsionen kann durch eine erhöhte Temperatur zusätzlich unterstützt werden, beispielsweise eine Temperatur von 0 bis 100°C, beispielsweise von 10 bis 80 °C, insbesondere von 20 bis 60°C.
Eine weitere erfindungsgemäße Anwendung ist die Phasen-Stabilisierung in Öl-inWasser- oder Wasser-in-öl-Gemischen, beispielsweise 2-Phasen-Systeme, die als Kühlschmierstoffe eingesetzt wurden und recycelt werden sollen. Wasser/Öl-Gemische fallen beispielsweise auch an Bord von Seeschiffen als Bilgewasser an. Dabei ist die Trennung von Emulsionen und Aufrechterhaltung der getrennten Phasen nötig, um das Wasser zuverlässig abtrennen zu können.
Die Menge des eingesetzten Hydrophobins oder Derivats davon kann in weiten Bereichen variieren, wobei die Menge vorteilhafterweise auf die Zusammensetzung an sich und gegebenenfalls in der Zusammensetzung enthaltene weitere Komponenten abge- stimmt wird.
Sofern beispielsweise die Zusammensetzung Stoffe enthält, die eine Phasentrennung der mindestens zwei flüssigen Phasen verzögern oder verschlechtern, beispielsweise Tenside oder Emulgatoren, wird vorteilhaft eine größere Menge eines Hydrophobins oder eines Derivats davon eingesetzt.
Da öle, insbesondere Rohöle, aus einem Gemisch vieler chemischer Verbindungen bestehen, ist es erforderlich, aufgrund der unterschiedlichen chemischen Zusammensetzung des Öls, der Wasser- und Salzanteile sowie der konkreten Bedingungen der Emulsionsspaltung, wie Temperatur, Dauer der Emulsionsspaltung, Art der Zudosie- rung und Wechselwirkungen mit weiteren Komponenten des Gemischs, den Demulgator auf die konkreten Bedingungen abzustimmen.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass bereits geringe Mengen eines Hydropho- bins oder Derivats davon zu einer Verbesserung der Phasenstabilisierung führen.
Das Hydrophobin oder Derivat davon kann erfindungsgemäß in jeder geeigneten Menge eingesetzt werden. In der Regel wird das mindestens eine Hydrophobin oder Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 100 ppm, bezogen auf die gesamte Zusam- mensetzung, eingesetzt; bevorzugt in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, besonders bevorzugt von 0,001 bis 20 ppm und ganz besonders bevorzugt 0,01 bis 10 ppm.
Im Rahmen der vorliegenden Anmeldung bezeichnet die Angabe ppm mg pro kg.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei das Hydrophobin oder das mindestens eine Derivat davon in einer Menge von 0,001 bis 100 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird. Die eingesetzte Konzentration wird vom Fach- mann je nach Art der zu stabilisierenden Phasen-Zusammensetzung festgelegt.
Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge vom 0,001 bis 20 ppm, bevorzugt von 0,005 bis 2 ppm, insbesondere von 0,01 bis 1 ppm, besonders bevorzugt 0,05 bis 1 ppm eingesetzt.
Sofern es sich bei der Zusammensetzung um eine Zusammensetzung enthaltend Rohöl und Wasser handelt, wird das Hydrophobin oder Derivat davon in der Regel in einer Menge von 0,01 bis 100 ppm, bevorzugt von 0,1 bis 80 ppm, insbesondere von 0,1 bis 50 ppm, besonders bevorzugt 0,1 bis 20 ppm eingesetzt.
Erfindungsgemäß ist es auch möglich, dass die Zusammensetzung neben dem mindestens einen Hydrophobin oder Derivat davon weitere Verbindungen enthält, die die Phasenstabilisierung verbessern. Dabei kann es sich um alle Verbindungen handeln, die dem Fachmann für derartige Anwendungen bekannt sind. Beispielsweise geeignet als weitere Verbindung zur Verbesserung der Phasenstabilisierung sind insbesondere für die Anwendung als Emulsionsspalter bei der Rohölproduktion oxyalkylierte Phenolformaldehydharze, EO/PO-Blockcopolymere, vernetzte Diepoxide, Polyamide beziehungsweise deren Alkoxylate, Salze der Sulfonsäuren, ethoxylierte Fettamine, Succi- nate sowie die in DE 10 2005 006 030.7 für derartige Anwendungen genannten Verbindungen.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer weiteren Ausführungsform eine wie zuvor beschriebene Verwendung, wobei neben mindestens einem Hydrophobin oder dem mindestens einen Derivat davon mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasenstabilisierung verbessert.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Stabilisierung von flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindes- tens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin beziehungsweise mindestens einem Derivat davon zu der Zusammensetzung.
Dabei kann es sich bei der Zusammensetzung um eine wie zuvor beschriebene Zu- sammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen handeln, beispielsweise Zusammensetzungen enthaltend öl, bevorzugt Rohöl, und Wasser oder auch Zusammensetzungen enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann weitere Schritte umfassen, beispielsweise zu- nächst die Durchführung einer Phasentrennung beziehungsweise das Brechen von Emulsionen und daran anschließendes Hinzufügen von Hydrophobinen zur wässrigen Phase.
Erfindungsgemäß können Hydrophobine oder Derivate davon der wässrigen Phase eines 2-Phasen-Systems zugesetzt werden aber auch Formulierungen enthaltend Kraft- oder Brennstoffe. Dies ermöglicht bei Kontakt der Formulierung mit Wasser eine Stabilisierung der Phasen beziehungsweise verhindert die Re-Emulgierung.
Ebenso ist es vorteilhaft, Rohöl-Wasser-Phasen Hydrophobine oder Derivate davon zuzusetzen, um beispielsweise die erneute Bildung von Emulsionen beim Transport zu verhindern.
Die Formulierung enthaltend Kraft- oder Brennstoffe kann dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung weitere Additive enthalten, die üblicherweise in derartigen Formulie- rungen enthalten sind. Geeignete Zusatzstoffe sind beispielsweise in WO 2004/087808 genannt.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Brennstoffen beispielsweise leichte, mittlere oder schwere Heizöle verstanden.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden unter Kraftstoffen beispielsweise Ottokraftstoffe, Dieselkraftstoffe oder Turbinenkraftstoffe verstanden. Besonders bevorzugt handelt es sich um Ottokraftstoffe.
Die genannten Additive werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt.
Die erfindungsgemäßen Formulierungen können darüber hinaus mit noch weiteren üblichen Komponenten und Additiven kombiniert werden. Hier sind in beispielsweise Trägeröle ohne ausgeprägte Detergenswirkung zu nennen. Geeignete mineralische Trägeröle sind bei der Erdölverarbeitung anfallende Fraktionen, wie Brightstock oder Grundöle mit Viskositäten wie beispielsweise aus der Klasse SN 500-2000; aber auch aromatische Kohlenwasserstoffe, paraffinische Kohlenwas- serstoffe und Alkoxyalkanole. Erfindungsgemäß geeignet ist ebenfalls eine als "hydro- crack oil" bekannte und bei der Raffination von Mineralöl anfallende Fraktion (Vakuumdestillatschnitt mit einem Siedebereich von etwa 360 bis 500 °C, erhältlich aus unter Hochdruck katalytisch hydriertem und isomerisiertem sowie entparaffiniertem natürlichen Mineralöl). Ebenfalls geeignet sind Mischungen oben genannter mineralischer Trägeröle.
Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare synthetische Trägeröle sind ausgewählt unter: Polyolefinen (Polyalphaolefine oder Polyintemalolefine), (Poly)estern, (Poly)al- koxylaten, Polyethem, aliphatischen Polyetheraminen, alkylphenolgestarteten PoIy- ethern, alkylphenolgestarteten Polyetheraminen und Carbonsäureester langkettiger Alkanole.
Weitere geeignete Trägerölsysteme sind beispielsweise beschrieben in DE-A 38 26 608, DE-A 41 42 241, DE-A 43 09 074, EP-A 0 452 328 und EP-A 0 548 617, worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird.
Weitere geeignete synthetische Trägeröle sind alkoxylierte Alkylphenole, wie sie in der DE-A 10 102 913.6 beschrieben sind.
Die genannten Trägeröle werden dabei in dem Fachmann für die jeweilige Anwendung geeignet erscheinenden Mengen eingesetzt.
Weitere übliche Additive sind Korrosionsinhibitoren, beispielsweise auf Basis von zur Filmbildung neigenden Ammoniumsalzen organischer Carbonsäuren oder von hetero- cyclischen Aromaten im Falle von Buntmetallkorrosionsschutz; Antioxidantien oder Stabilisatoren, beispielsweise auf Basis von Aminen wie p-Phenylendiamin, Dicyclohe- xylamin oder Derivaten hiervon oder von Phenolen wie 2,4-Di-tert.-butylphenol oder 3, 5-Di-tert.-butyl-4-hydroxyphenylpropionsäure; weitere herkömmliche Demulgatoren; Antistatikmittel; Metallocene wie Ferrocen; Methylcyclopentadienylmangantricarbonyl; Schmierfähigkeitsverbesserer (Lubricity-Additive) wie bestimmte Fettsäuren, Alkenyl- bemsteinsäureester, Bis(hydroxyalkyl)fettamine, Hydroxyacetamide oder Ricinusöl; sowie Farbstoffe (Marker). Gegebenenfalls werden auch Amine zur Absenkung des pH-Wertes des Kraftstoffes zugesetzt. Die genannten Detergensadditive mit den polaren Gruppierungen (a) bis (i) werden dem Kraftstoff üblicherweise in einer Menge von 10 bis 5000 Gew.-ppm, insbesondere 50 bis 1000 Gew.-ppm, zugegeben. Die sonstigen erwähnten Komponenten und Additive werden, wenn gewünscht, in hierfür üblichen Mengen zugesetzt.
Als Kraft- und Brennstoffe sind erfindungsgemäß alle dem Fachmann bekannten Kraft- und Brennstoffe geeignet, beispielsweise Ottokraftstoffe, wie sie beispielsweise in LJII- mann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5.Aufl. 1990, Band A16, S. 719ff. beschrieben sind. Geeignete Kraftstoffe sind erfindungsgemäß auch Dieselkraftstoff, Ke- rosin und Jet-Treibstoff.
Insbesondere ein Ottokraftstoff mit einem Aromatengehalt von maximal 60, wie z. B. maximal 42 Vol.-% und einem Schwefelgehalt von maximal 2000, wie z. B. maximal 150 Gew.-ppm ist geeignet.
Der Aromatengehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 10 bis 50, wie z. B. 30 bis 42 Vol.-%, insbesondere 32 bis 40 Vol.-%. Der Schwefelgehalt des Ottokraftstoffes beträgt beispielsweise 2 bis 500, wie z. B. 5 bis 150 Gew.-ppm, oder 10 bis 100 Gew.- ppm.
Weiterhin kann ein geeigneter Ottokraftstoff beispielsweise einen Olefingehalt bis zu 50 Vol.-%, wie z. B. von 6 bis 21 Vol.-%, insbesondere 7 bis 18 Vol.-%; einen Benzolgehalt von bis zu 5 Vol.-%, wie z. B. 0,5 bis 1,0 Vol.-%, insbesondere 0,6 bis 0,9 Vol.-% und/oder einen Sauerstoffgehalt von bis zu 25 Gew.-%, wie z. B. bis zu 10 Gew.-% oder 1,0 bis 2,7 Gew.-%, insbesondere von 1,2 bis 2,0 Gew.-%, aufweisen.
Insbesondere können solche Ottokraftstoffe beispielhaft genannt werden, welche gleichzeitig einen Aromatengehalt von maximal 38 Vol.-%, einen Olefingehalt von maximal 21 Vol.-%, einen Schwefelgehalt von maximal 50 Gew. -ppm, eine Benzolgehalt von maximal 1 ,0 Vol.-% und eine Sauerstoffgehalt von 1 ,0 bis 2,7 Gew.-% aufweisen.
Der Gehalt an Alkoholen und Ethern im Ottokraftstoff kann über einem weiten Bereich variieren. Beispiele typischer maximaler Gehalte sind für Methanol 15 Vol.-%, für Etha- nol 65 Vol.-%, für Isopropanol 20 Vol.-%, für tert.-Butanol 15 Vol.-%, für Isobutanol 20 Vol.-% und für Ether mit 5 oder mehr C-Atomen im Molekül 30 Vol.-%.
Der Sommer-Dampfdruck eines erfindungsgemäß geeigneten Ottokraftstoffes beträgt üblicherweise maximal 70 kPa, insbesondere 60 kPa (jeweils bei 37°C). Die ROZ des Ottokraftstoffes beträgt in der Regel 75 bis 105. Ein üblicher Bereich für die entsprechende MOZ liegt bei 65 bis 95.
Die genannten Spezifikationen werden nach üblichen Methoden bestimmt (DIN EN 228).
Die Erfindung wird im Folgenden durch Beispiele näher erläutert.
Beispiele
Beispiel 1
Vorarbeiten für die Klonierung von yaad-HisJ vaaE-HiSg
Mit Hilfe der Oligonukleotide Hal570 und Hal571 (HaI 572/ HaI 573) wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Bakteriums Bacillus subtilis verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Gens yaaD / yaaE aus Bacillus subtilis, und an den Enden je eine Ncol bzw. BgIII Restriktionsschnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit den Restriktionsendonukleasen Ncol und BgIII linearisierten Vektor pQE60 der Firma Qiagen kloniert. Die so entstandenen Vektoren pQE60YAAD#2 / pQE60YaaE#5 können zur Expression von Proteinen bestehend aus, YAAD::HIS6 bzw. YAAE::HIS6 verwendet werden.
Hal570: gcgcgcccatggctcaaacaggtactga Hal571 : gcagatctccagccgcgttcttgcatac Hal572: ggccatgggattaacaataggtgtactagg Hal573: gcagatcttacaagtgccttttgcttatattcc
Beispiel 2
Klonierung von vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg
Mit Hilfe der Oligonukleotide KaM 416 und KaM 417 wurde eine Polymerase Kettenreaktion durchgeführt. Als Template DNA wurde genomische DNA des Schimmelpilzes Aspergillus nidulans verwendet. Das erhaltene PCR Fragment enthielt die codierende Sequenz des Hydrophobin Gens dewA und einer N-Terminalen FaktorXa Proteinase Schnittstelle. Das PCR Fragment wurde gereinigt und mit der Restriktionsendonuklea- se BamHI geschnitten. Dieses DNA Fragment wurde als Insert verwendet, und in den zuvor mit der Restriktionsendonuklease BgIII linearisierten Vektor pQE60YAAD#2 klo- niert.
Der so entstandene Vektor #508 kann zur Expression eines Fusionsproteins bestehend aus, YAAD::Xa::dewA::HIS6 verwendet werden.
KaM416: GCAGCCCATCAGGGATCCCTCAGCCTTGGTACCAGCGC KaM417: CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCAT- GAAGTTCTCCGTCTCCGC
Beispiel 3
Klonierung von vaad-Hvdrophobin RodA-HiSg
Die Klonierung des Plasmids #513 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 434 und KaM 435.
KaM434: GCTAAGCGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCATTGCTGC KaM435: CCAATGGGGATCCGAGGATGGAGCCAAGGG
Beispiel 4
Klonierung von vaad-Hvdrophobin BASFI-HiSg
Die Klonierung des Plasmids #507 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF1 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 11 und 12).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 5 Klonierung von vaad-Hydrophobin BASF2-HiSfi
Die Klonierung des Plasmids #506 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM 417 und KaM 418.
Als Template DNA wurde ein künstlich synthetisierte DNA Sequenz - Hydrophobin BASF2 -eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 13 und 14).
KaM417:CCCGTAGCTAGTGGATCCATTGAAGGCCGCATGAAGTTCTCCGTCTCCG C
KaM418: CTGCCATTCAGGGGATCCCATATGGAGGAGGGAGACAG
Beispiel 6
Klonierung von vaad-Hvdrophobin SC3-HiSfi
Die Klonierung des Plasmids #526 erfolgte analog zu Plasmid #508 unter Verwendung der Oligonukleotide KaM464 und KaM465.
Als Template DNA wurde cDNA von Schyzophyllum commune eingesetzt (siehe Anhang, SEQ ID NO. 9 und 10).
KaM464: CGTTAAGGATCCGAGGATGTTGATGGGGGTGC KaM465: GCTAACAGATCTATGTTCGCCCGTCTCCCCGTCGT
Beispiel 7
Fermentation des rekombinanten E.coli Stammes vaad-Hvdrophobin DewA-HiSg
Inokulation von 3ml LB Flüssigmedium mit einem yaad-Hydrophobin DewA-His6 expri- mierenden E.coli Stamm in 15ml Greiner Röhrchen. Inkubation für 8h bei 37°C auf einem Schüttler mit 200 UpM. Je 2 11 Erlenmeyer Kolben mit Schikanen und 250ml LB Medium (+ 100μg/ml Ampicillin) werden mit jeweils 1ml der Vorkultur angeimpft und 9h bei 37°C auf einem Schüttler mit 180 UpM inkubiert.
13,51 LB-Medium (+100μg/ml Ampicillin) in einem 2Ol Fermenter mit 0,51 Vorkultur (OD6oonm 1 :10 gegen H2O gemessen) animpfen. Bei einer OD60nm von -3.5 Zugabe von 140ml 10OmM IPTG. Nach 3h Fermenter auf 10°C abkühlen und Fermentationsbrühe abzentrifugieren. Zellpellet zur weiteren Aufreinigung verwenden.
Beispiel 8
Reinigung des rekombinanten Hydrohobin-Fusionsproteins
100 g Zellpellet (100 - 500 mg Hydrophobin) werden mit 50 rtiM Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 auf 200 ml Gesamtvolumen aufgefüllt und resuspendiert. Die Suspension wird mit einem Ultraturrax Typ T25 (Janke und Kunkel; IKA-Labortechnik) für 10 Minuten behandelt und anschließend für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 500 Einheiten Benzonase (Merck, Darmstadt; Best.-Nr. 1.01697.0001) zum Abbau der Nukleinsäuren inkubiert. Vor dem Zellaufschluss wird mit einer Glaskartusche (P1) filtriert. Zum Zellaufschluß und für das Scheren der restlichen genomischen DNA werden zwei Homogenisatorläufe bei 1.500 bar durchgeführt (Microfluidizer M-110EH; Microfluidics Corp.). Das Homogenisat wird zentrifugiert (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentri- fugenbecher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g), der Überstand auf Eis gestellt und das Pellet in 100 ml Natriumphosphatpuffer, pH 7,5 resuspendiert.
Zentrifugation und Resuspendieren werden dreimal wiederholt, wobei der Natriumphosphatpuffer bei der dritten Wiederholung 1 % SDS enthält. Nach der Resuspension wird für eine Stunde gerührt und eine abschließende Zentrifugation durchgeführt (Sorvall RC-5B, GSA-Rotor, 250 ml Zentrifugen becher, 60 Minuten, 4°C, 12.000 Upm, 23.000 g).
Gemäß SDS-PAGE Analyse ist das Hydrophobin nach der abschließenden Zentrifuga- tion im Überstand enthalten (Abbildung 1). Die Versuche zeigen, dass das Hydrophobin wahrscheinlich in Form von Einschlusskörpern in den entsprechenden E.coli Zellen enthalten ist. 50 ml des Hydrophobin enthaltenden Überstandes werden auf eine 50 ml Nickel-Sepharose High Performance 17-5268-02 Säule aufgetragen (Amersham), die mit 50 rtiM Tris-Cl pH 8,0 Puffer äquilibriert wurde. Die Säule wird mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer gewaschen und das Hydrophobin anschließend mit 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer, der 200 mM Imidazol enthält, eluiert. Zur Entfernung des Imidazols wird die Lösung gegen 50 mM Tris-Cl pH 8,0 Puffer dialysiert.
Abbildung 1 (Figur 1) zeigt die Reinigung des hergestellten Hydrophobins: Spur A: Auftrag Nickel-Sepharose Säule (1 :10 Verdünnung)
Spur B: Durchlauf = Eluat Waschschritt
Spuren C - E: OD 280 Maxima der Elutionsfraktionen (WP1 , WP2, WP3)
Spur F zeigt den aufgetragenen Marker.
Das Hydrophobin der Abbildung 1 besitzt ein Molekulargewicht von ca. 53 kD. Die kleineren Banden repräsentieren zum Teil Abbauprodukte des Hydrophobins.
Beispiel 9
Anwendungstechnische Prüfung: Charakterisierung des Hvdrophobins durch Kontaktwinkeländerung eines Wassertropfens auf Glas
Substrat:
Glas (Fensterglas, Süddeutsche Glas, Mannheim):
Es wurde das gemäß Beispiel 8 gereinigte Hydrophobin eingesetzt.
- Konzentration des Hydrophobins in der Lösung: 100 μg/ml, die Lösung enthielt weiterhin 50 rtiM Na-Acetat-Puffer sowie 0,1% Polyoxyethylen(20)-sorbitan- monolaureat (Tween® 20)), pH-Wert der Lösung: 4 Eintauchen von Glasplättchen in diese Lösung über Nacht (Temperatur 80°C) - Danach wird das mit Hydrophobin beschichtete Glasplättchen der Lösung entnommen und in destilliertem Wasser gewaschen,
Danach Inkubation 10min / 80°C / 1% SDS-Lösung in destilliertem Wasser Erneutes Waschen in destilliertem Wasser
Die Proben werden an der Luft getrocknet und der Kontaktwinkel (in Grad) eines Tropfens von 5 μl Wasser mit der beschichteten Glasoberfläche bei Raumtemperatur bestimmt.
Die Kontaktwinkelmessung wurde auf einem Gerät Dataphysics Contact Angle System OCA 15+, Software SCA 20.2.0. (November 2002) bestimmt. Die Messung erfolgte gemäß den Herstellerangaben.
Unbehandeltes Glas ergab einen Kontaktwinkel von 30 ± 5°; Das mit dem Hydrophobin gemäß Beispiel 8 (yaad-dewA-his6) beschichtete Glasplätt- chen ergab einen Kontaktwinkel von 75 ± 5°.
==> Zunahme des Kontaktwinkels: 45°
Beispiel 10
Experimente zur Phasenstabilisierung durch Hydrophobin
In Schnappdeckelgläschen wurden jeweils 50 ml einer Emulsion aus Roherdöl (homogenes Roherdöl, Wintershall AG, Emiichheim, Sonde 60, 64, 83, 87, 301 und 507) und Wasser gegeben. Die Herstellung der Emulsion erfolgte durch Emulgierung von 1000 ppm Roherdöl in ca. 50 ml Wasser mittels eines Ultraturrax-Rührers (Rührzeit von 4 Minuten bei 24000 U/min).
Zu dieser Emulsion wurden gegeben
im Falle A kein Demulgator gegeben, im Falle B 10 ppm Hydrophobin aus Beispiel 8, im Falle C 10 ppm PoIyDADMAC (Demulgator mit Feststoffgehalt von 28 bis 32% (ISO3251), Viskosität 200 bis 800 mPas (ISO2595)) im Falle D 10 ppm Lupasol SK (mit Polyethylenimin gepfropftes Polyamidoamin, Hersteller Nippon Shokubai, Japan)
Die Proben wurden im Anschluss 3 Tage stehen gelassen, wobei sich die Emulsionen auftrennten (s. Schematische Abbildung in Figur 2, obere Reihe).
Dann wurden die Proben mit der Hand leicht durch ein paar kreisförmige Bewegungen geschüttelt. Hierbei entstanden in den Fällen A, C und D wieder starke Eintrübungen (Emulsionsbildung), im Falle von B (enthaltend Hydrophobin) blieb die Phasentrennung erhalten.
Vereinzelt bildeten sich auch in der 10 ppm Hydrophobin enthaltenden Probe B Flocken, die jedoch sofort zur oberen Öl-Phase aufstiegen (siehe untere Reihe der schematischen Abbildung in Figur 2). Diese Experimente belegen, dass Hydrophobine die bereits erfolgte Auftrennung von Emulsionen in zwei getrennte Phasen besser als handelsübliche Demulgatoren stabilisieren.
Das Hydrophobin kann auch nach Aufspaltung der Emulsion der wässrigen Phase zugesetzt werden.
Beispiel 11
Vergleich der Phasenstabilisierung
Es werden zunächst 5 gew.-%ige Lösungen der in der Tabelle gelisteten Demulgatoren in Xylol/Isopropanol-Gemisch 3 : 1 (bezogen auf Volumen) hergestellt.
Das Hydrophobin aus Beispiel 8 wurde 1 h vor Zugabe als 1 %ige Lösung (0,25 % Wirksubstanz) in destilliertem Wasser angesetzt.
Beispielhaft verwendete Demulgatoren sind dabei:
Pluronic® PE 6800: (Ethylenoxid/Propylenoxid Copolymer)
Basorol® P380: (Triol Polyol Polyether)
Basorol® HP: (Tetrol-Ethylenoxid/Propylenoxid Copolymer)
Eine Rohölemulsion (Wintershall AG, Emiichheim, Sonden 60, 64, 83, 87, 301 und 507 mit einem Wassergehalt von 62 Vol-%, bestimmt nach Destillationsverfahren DIN ISO
3733) wurde für ca. 2 h im Wasserbad in einem verschlossenen Behälter auf eine
Temperatur von 52 0C erwärmt.
Die Rohölemulsion wurde ca. 30 Sek. durch Schütteln homogenisiert und jeweils 100 ml der Rohölemulsion wurden in 100 ml-Schüttelzylinder gefüllt. Die mit öl gefüllten
Schüttelzylinder wurden in das Wasserbad eingesetzt.
Mit einer Eppendorf-Pipette wurden jeweils 50 μl der 5 gew.-%igen Lösung der oben genannten Demulgatoren in einen Schüttelzylinder mit Rohölemulsion dosiert und der Zylinder mit dem Glasstopfen verschlossen. Danach wurde der Schüttelzylinder aus dem Wasserbad herausgenommen, 60 x geschüttelt und entspannt. Der Schüttelzylinder wurde nun wieder in das Wasserbad (52 °C) gestellt und das Volumen des sich nun abscheidenden Wassers nach 30 und 240 Min. abgelesen. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.
Nach 240 Minuten wurden die in der Tabelle angegebenen Mengen Hydrophobin mittels einer Einwegspritze jeweils in das abgesetzte Wasser eingespritzt. Anschließend werden die Mischungen jeweils für 30 Sek. geschüttelt. Im Anschluss daran lässt man die Proben bei 52 °C für 1 Minute ruhen und bestimmt dann die Menge des abgeschiedenen Wassers. Die Ergebnisse sind in der Tabelle zusammengefasst.
Tabelle
Figure imgf000031_0001
Man sieht deutlich, dass durch die Zugabe des Hydrophobins die erneute Auftrennung der Phasen beschleunigt erfolgt. Es scheint demnach die re-Emulgierung der Wasserphase in die ölphase durch das Protein reduziert zu sein.
Erstaunlich ist auch die niedrige Konzentration von 0,5 bis 1 ppm an Hydrophobin, die zur Erzielung des Ergebnisses ausreicht.

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung mindestens eines Hydrophobins zur Phasen-Stabilisierung in Zusammensetzungen enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen.
2. Verwendung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung eine wässrige und eine organische Phase aufweist.
3. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eine Zusammensetzung enthaltend öl und Wasser oder eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens ein Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
7. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydropho- bin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,01 bis 10 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass neben dem mindestens einen Hydrophobin mindestens eine weitere Verbindung eingesetzt wird, die die Phasen-Stabilisierung verbessert.
10. Verfahren zur Stabilisierung von flüssigen Phasen in einer Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen, umfassend die Zugabe von mindestens einem Hydrophobin zu der Zusammensetzung.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 oder 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der
Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zusammensetzung enthaltend mindestens zwei flüssige Phasen eine Zusammensetzung enthaltend öl und Wasser oder eine Zusammensetzung enthaltend Kraft- oder Brennstoff und Wasser ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Rohöl-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Kraft-/Brennstoff-Wasser-Zusammensetzung handelt, und das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 20 ppm, bezogen auf die gesamte Zusammensetzung, eingesetzt wird.
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass zunächst eine Aufspaltung der Phasen erfolgt und danach eine Zugabe des Hydrophobins zu der wässrigen Phase erfolgt.
18. Formulierung, enthaltend mindestens eine organische Phase bestehend aus Kraftstoffen, Brennstoffen und/oder Rohölen sowie eine wässrige Phase enthaltend mindestens ein Hydrophobin.
19. Formulierung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin in einer Menge von 0,001 bis 80 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.
20. Formulierung nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, dass die Formulierung mindestens einen Kraft- oder Brennstoff enthält und das
Hydrophobin oder das Derivat davon in einer Menge von 0,01 bis 1 ppm, bezogen auf die gesamte Formulierung, in der Formulierung enthalten ist.
21. Formulierung gemäß Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Kraft- oder Brennstoff um einen Kraftstoff ausgewählt aus der Gruppe von
Ottokraftstoffen, Dieselkraftstoffen oder Turbinenkraftstoffen handelt.
22. Formulierung nach einem der Ansprüche 18 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass das Hydrophobin ein Fusions-Hydrophobin oder ein Derivat davon ist.
23. Formulierung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Fusions-Hydrophobin um mindestens eines ausgewählt aus der Gruppe von yaad-Xa-dewA-his (SEQ ID NO: 20), yaad-Xa-rodA-his (SEQ ID NO: 22) oder yaad-Xa-basf1-his (SEQ ID NO: 24) handelt, wobei es sich bei yaad auch um einen verkürzten Fusionspartner yaad' mit 20 bis 293 Aminosäuren handeln kann.
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