EP2747901A1 - Verfahren zur beschichtung von substraten mit mindestens einer monolage selbstassemblierender proteine - Google Patents

Verfahren zur beschichtung von substraten mit mindestens einer monolage selbstassemblierender proteine

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EP2747901A1
EP2747901A1 EP12753109.3A EP12753109A EP2747901A1 EP 2747901 A1 EP2747901 A1 EP 2747901A1 EP 12753109 A EP12753109 A EP 12753109A EP 2747901 A1 EP2747901 A1 EP 2747901A1
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EP
European Patent Office
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protein
self
assembling
solution
substrate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP12753109.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Kai Ostermann
Leopold GRUNER
Gerhard RÖDEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Dresden
Original Assignee
Technische Universitaet Dresden
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Filing date
Publication date
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Priority claimed from DE201110089241 external-priority patent/DE102011089241B3/de
Application filed by Technische Universitaet Dresden filed Critical Technische Universitaet Dresden
Publication of EP2747901A1 publication Critical patent/EP2747901A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D7/00—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials
    • B05D7/24—Processes, other than flocking, specially adapted for applying liquids or other fluent materials to particular surfaces or for applying particular liquids or other fluent materials for applying particular liquids or other fluent materials
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B05—SPRAYING OR ATOMISING IN GENERAL; APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D—PROCESSES FOR APPLYING FLUENT MATERIALS TO SURFACES, IN GENERAL
    • B05D3/00—Pretreatment of surfaces to which liquids or other fluent materials are to be applied; After-treatment of applied coatings, e.g. intermediate treating of an applied coating preparatory to subsequent applications of liquids or other fluent materials
    • B05D3/007—After-treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09D—COATING COMPOSITIONS, e.g. PAINTS, VARNISHES OR LACQUERS; FILLING PASTES; CHEMICAL PAINT OR INK REMOVERS; INKS; CORRECTING FLUIDS; WOODSTAINS; PASTES OR SOLIDS FOR COLOURING OR PRINTING; USE OF MATERIALS THEREFOR
    • C09D5/00—Coating compositions, e.g. paints, varnishes or lacquers, characterised by their physical nature or the effects produced; Filling pastes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/31504—Composite [nonstructural laminate]
    • Y10T428/31725—Of polyamide

Definitions

  • the invention relates to methods for coating a substrate with at least one monolayer of self-assembling proteins and substrates obtainable thereby.
  • the invention finds application in the chemical industry, biotechnology, sensor technology as well as in medical research.
  • Self-assembling proteins such as hydrophobins or surface layer proteins (S-layer proteins) tend in aqueous solutions to a rapid and uncontrollable aggregate formation (the uncontrolled assembly of protein monomers to multimers of self-assembling proteins), which is the production of homogeneous layers of self-assembling proteins on a Substrate difficult.
  • self-assembling proteins are also simply referred to simply as "proteins.”
  • Self-assembling proteins form a directed folding and association with one another through interactions of the protein molecules (molecular self-assembly) and are the most diverse of applications because of the formation of this highly ordered structure usable in nanotechnologies.
  • the Langmuir-Blodgett method, the Langmuir-Schafer technique, or the "layer-by-layer” method are commonly used to construct homogeneous layers of self-assembling proteins
  • the substrate is immersed in a solution containing protein monomers so that a layer of the protein monomers (monolayer) is deposited on the substrate.
  • the layer-by-layer techniques are based exclusively on exploiting the physisorption of the protein monomers on the substrate surface Since self-assembling proteins have a strong propensity for aggregate formation, long-term storage and use of previously prepared protein solutions is not possible, and the coating of hard-to-reach surfaces of the substrate (eg, pores of a protein) is lim It is difficult, because difficult to reach places on the substrate, such as pores, are caused by uncontamination Roll aggregated protein monomers can be closed, so that other monomers can not penetrate into pores.
  • DE 10 2005 051515 A1 discloses methods for coating surfaces with defined fusion hydrophobins.
  • An aqueous solution having a pH of> 4 is contacted with a surface and the solvent is subsequently removed.
  • the hydrophobin solution can be further additives, such as nonionic Surfactants and / or metal ions are added n.
  • the method does not permit controlled deposition of protein layers.
  • TFA trifluoroacetic acid
  • WO 01/57066 A2 discloses a process in which the disulfide bonds within a hydrophobin are cleaved by addition of a strongly denaturing agent, such as guanidine hydrochloride, so that the folding of the hydrophobin is dissolved.
  • a strongly denaturing agent such as guanidine hydrochloride
  • suitable sulfhydryl protecting agent-forming agents avoids re-formation of disulfide bonds in the hydrophobin solution so that the resulting hydrophobin monomer-containing solutions are stable.
  • the removal of the protective group is required, which is effected by addition of an oxidizing agent.
  • WO 96/41882 A1 discloses hydrophobin assembly on oil-water interphases. Furthermore, EP 1 252 516 A1 and WO 2005/068087 A1 disclose the immobilization of hydrophobins by means of thermal sample preparation or by shifting the pH to an acidic medium. However, both methods give no information about the number and homogeneity of generated hydrophobin deposits, which is why they can not be used for applications in sensor technology or biomedicine.
  • the object of the invention is a method which allows the coating of substrates with at least one monolayer of self-assembling proteins and to provide necessary solutions.
  • the object is achieved by a method for coating a substrate with at least one monolayer of self-assembling proteins with the following steps:
  • Self-assembling proteins in aqueous solutions tend to aggregate and form aggregates with more than 10 protein units. With these aggregates a controlled deposition of defined protein layers is not possible. It is therefore important that these aggregates are separated and preferably remain in the separated solution monomers and oligomers of self-assembling proteins.
  • the separation is advantageously carried out by centrifugation with a centrifugal acceleration of at least 5000 ⁇ g, preferably 10000 to 50,000 ⁇ g over a period of at least 5 minutes, preferably 15-60 minutes, at a temperature of -10 ° C. to 40 ° C., preferably 0. 10 ° C.
  • Monomers are the smallest indivisible protein units of a self-assembling protein. Oligomers according to the invention are assemblies of self-assembling proteins with a maximum size of 10 protein monomers.
  • a protein monolayer is a planar structure of surface-assembled protein units, preferably protein monomers, with the layer thickness of a protein monomer.
  • a solution of ionic surfactants and / or a salt-containing and / or alkaline and / or an acidic solution are added to the solution after separation of the protein aggregates.
  • ionic surfactants are added so that only the surface-active part of each active predominant protein oligomer is enveloped by surfactant particles.
  • the concentration of the self-assembling proteins in the aqueous solution is at least 5 ng / ⁇ , preferably at least 50, particularly preferably at least 90 ng / ⁇ .
  • the aqueous solution of the self-assembling proteins preferably has a pH of 7 to 9.5. This is preferably a buffered solution.
  • self-assembling proteins are hydrophobins and / or surface layer proteins (S-layer proteins) and / or recombinant fusion proteins having at least two domains, wherein at least one domain is a self-assembling protein domain and a domain is a functional domain.
  • S-layer proteins surface layer proteins
  • recombinant fusion proteins having at least two domains, wherein at least one domain is a self-assembling protein domain and a domain is a functional domain.
  • Preferred hydrophobins are class I hydrophobins, preferably Ccg2 from Neurospora crassa, or class II hydrophobins, preferably HFBI or HFBII from Trichoderma reesei.
  • Preferred S-layer proteins are SBSC from Bacillus stearothermophilus, S 13240 from Bacillus stearothermophilus or SslA from Sporosarcina ureae.
  • the invention is particularly advantageously suitable for functionalized self-assembling proteins, since the accessibility of the functionalization can be ensured by the coating according to the invention of the functionalized self-assembling protein. It is advantageously possible to carry out the coating of the substrate so that the functionalization is present on the side of the protein-containing coating remote from the substrate.
  • the self-assembling protein is preferably a chemically modified or a recombinant fusion protein, ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • a recombinant fusion protein ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • a recombinant fusion protein used in the invention comprises at least two domains, wherein at least one domain is a self-assembling protein domain (preferably selected from the above-mentioned self-assembling proteins) and a domain is a functional domain.
  • Preferred functional domains are fluorescent protein domains, catalytic domains or protein domains with enzyme activity.
  • the ionic surfactant used is a solution with anionic or cationic surfactants, preferably selected from the group of hydrocarbon-coupled sulfates, sulfonates or carboxylates or from the group of quaternary ammonium compounds. Particular preference is given to alkyl sulfates or tetraalkylammonium salts, very particular preference to using sodium dodecylsulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • anionic or cationic surfactants preferably selected from the group of hydrocarbon-coupled sulfates, sulfonates or carboxylates or from the group of quaternary ammonium compounds. Particular preference is given to alkyl sulfates or tetraalkylammonium salts, very particular preference to using sodium dodecylsulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • SDS sodium dodecyl
  • surfactants have a single hydrophilic moiety (also referred to herein as a "surfactant moiety”) and a single hydrophobic moiety
  • the surfactant is used in a concentration of at most 30 mmol / l, more preferably at most 15 mmol / l.
  • the surfactant-containing solution is added portionwise to the protein-containing solution. At least two, more preferably at least four, individual portions of the surfactant-containing solution are preferably added.
  • the addition in portions has the advantage that the critical micelle formation concentration of the free surfactants in the solution formed is not exceeded, so that the micelle formation of the surfactants is largely prevented and these are available for the coating of protein monomers and oligomers.
  • the invention offers the advantage of providing monomer or oligomeric compounds of self-assembling proteins in which the uncontrolled aggregation of the proteins is prevented.
  • these coating solutions can be used for position-independent coating of substrate surfaces without their pretreatment.
  • the proteinaceous coating on the substrate may contain one or more different proteins capable of self-assembly within the protein layer.
  • a multiplicity of molecules of a defined self-assembling protein preferably an S-layer protein or hydrophobin or fusion proteins generated therefrom, are used.
  • a mixture of various self-assembling proteins is used, for example, a mixture of a fusion protein containing an S-layer protein with the corresponding S-layer protein.
  • the surfactants In the incubation of the unstabilized protein-containing solution with the surfactant-containing solution added in several portions (in at least two, preferably at least three individual portions), the surfactants enter into a coordinative bond with the proteins contained in the aqueous solution, so that a protein-surfactant complex is formed.
  • the formation of the protein-surfactant complex prevents the uncontrolled formation of protein aggregates and stabilizes the protein-containing solution.
  • stabilization is understood as meaning the prevention of uncontrolled assembly of self-assembled proteins in aqueous solutions.
  • metal ions or anions preferably in the form of an aqueous solution.
  • the formation of protein-ion complexes masks protein charges and promotes the formation of predominant protein oligomers.
  • PSE Periodic Table of the Elements
  • water-soluble salts preferably in the form of chlorides, Nitrates, carbonates, acetates, citrates, gluconates, hydroxides, lactates, sulfates, succinates or tartrates.
  • inorganic anions in particular halides, hydroxides, nitrates, carbonates, sulfates, phosphates, but also organic anions, in particular acetates, citrates, succinates or tartrates, which have alkali metal ions as counterions.
  • the concentration of the metal ions or anions in the aqueous solution is preferably 0.01 mmol / l to 10 mmol / l, preferably 0.1 mmol / l to 5 mmol / l and particularly preferably 0, 5 mmol / l to 2 mmol / l.
  • the pH can be shifted in the direction of the isoelectric point of the proteins used.
  • the invention also provides an aqueous, protein-containing coating solution which contains monomers or oligomers of self-assembling proteins, wherein the surface-active part of the monomers or oligomers of self-assembling proteins is coated with ionic surfactants.
  • the invention also includes a substrate with a coating of at least one monolayer of self-assembling protein layer,
  • a layer containing at least one ionic surfactant is present on the surface of the at least one monolayer of self-assembling proteins, the surfactant being in coordinative association with the self-assembling protein.
  • At least one monolayer is assembled directly on the substrate surface.
  • a applied by pretreatment mediator layer, such. B a polylysine or secondary cell wall polymer layer (glycoprotein layer) is not required.
  • the self-assembling proteins are recombinant fusion proteins comprising at least two domains, wherein at least one domain is a self-assembling protein domain and a domain is a functional domain or self-assembling protein domain, wherein the functional domain is located on the side of the protein-containing coating remote from the substrate ,
  • the substrate is preferably a metallic, silicon-containing, ceramic or polymeric solid.
  • the invention also encompasses the use of a protein-containing coating solution according to the invention for coating substrate surfaces with at least one monolayer of a self-assembling protein.
  • the coating process comprises the steps of:
  • an aqueous solution containing at least one ionic surfactant is added in portions to the protein-containing solution from a), wherein the addition is the final surfactant concentration c Te nsid in mol / 1 in the following range: Cprotei '5.237
  • Ao.protein the surface of a molecule of the self-assembling protein corresponds A T KG corresponding to the cross-sectional area of the head group of the surfactant and c Pro tein the concentration of self-assembling protein in mol / 1 corresponds
  • the coating solution as a stabilized aqueous solution after step a is prepared from an aqueous solution of self-assembling proteins by separating aggregated protein units such that monomers or oligomers of self-assembling proteins preferably remain in the solution.
  • an aqueous solution comprising at least one ionic surfactant is added in portions to the protein-containing solution after separation of the protein aggregates, after which the final surfactant concentration c Te nsid in mol / 1 lies in the following range:
  • a 0 corresponds to the surface protein of a molecule of the self-assembling protein A T KG the cross sectional area of the head group of the surfactant and c corresponds to the concentration of the pro tein self-assembling protein in mol / 1 corresponds.
  • the surfactant portion of each active protein monomer is enveloped by surfactant particles.
  • an ordered monolayer of one or more self-assembling proteins on the surface of a substrate in one process step.
  • a Protein layer with homogeneous layer thickness understood relative standard deviation of the layer thickness preferably not more than 30%.
  • the mean thickness of the layer corresponds to the extent of a molecule of the self-assembling protein.
  • the coating on the substrate may contain one or more different proteins capable of self-assembly within the protein monolayer.
  • a multiplicity of molecules of a defined self-assembling protein preferably an S-layer protein or hydrophobin or fusion proteins generated therefrom, are inserted.
  • a mixture of various self-assembling proteins is used, for example a mixture of a fusion protein containing an S-layer protein with the corresponding S-layer protein.
  • a stabilized aqueous solution containing the at least one self-assembling protein as protein monomer is provided, the stabilization taking place by addition of at least one surfactant.
  • the disulfide bridges of the protein structure are not dissolved.
  • the surfactant serves to coat protein monomers with a surfactant layer. This is done in the absence (at most 0.01% by weight, based on the self-assembling protein, preferably at most 0.0001% by weight) of substances which are suitable for cleaving disulfide bridges (in particular reducing thiols, such as ⁇ -mercaptoethanol) , Dithiothreitol or dithioerythritol).
  • the entire coating process according to the invention is carried out in the absence of these substances.
  • the surfactants In the incubation of the unstabilized protein-containing solution with the surfactant-containing solution added in several portions (in at least two, preferably at least three individual portions), the surfactants enter into a coordinative bond with the proteins contained in the aqueous solution, so that a protein-surfactant complex is formed.
  • the formation of the protein-surfactant complex prevents the uncontrolled formation of multimers of proteins (aggregates) and stabilizes the protein-containing solution.
  • stabilization is to be understood as meaning the invention of an uncontrolled assembly of self-assembled proteins in aqueous solutions. It is possible with the method according to the invention to produce stabilized solutions with protein monomers.
  • the stabilized aqueous solutions obtainable by a process according to the invention are storage-stable and multiply to Coating of substrates usable.
  • a stabilized aqueous protein solution obtainable by a process according to the invention is likewise provided by the invention.
  • the concentration of the at least one self-assembling protein in the unstabilized aqueous solution after separation of the protein aggregates is preferably at least 5 ng / ⁇ , more preferably at least 50 ng / ⁇ , most preferably at least 90 ng / ⁇ .
  • the unstabilized aqueous solution containing the at least one self-assembling protein preferably has a pH of from 7 to 9.5. This is preferably a buffered solution.
  • the respectively added aqueous solution is filtered prior to carrying out the method according to the invention, preferably by a sterile filter, particularly preferably with a pore size of 0.01 ⁇ m - 0.5 ⁇ m.
  • ionic surfactants cationic or anionic surfactants
  • surfactants have a single hydrophilic moiety (also referred to herein as a "surfactant moiety") and at least one hydrophobic moiety
  • the surfactant is used in a concentration of at most 30 mmol / L, more preferably at most 15 mmol / L (Process b).
  • a surfactant solution (in process step b) is used, which is preferably at least 1 mmol / l, more preferably at most 15 mmol / l, more preferably at most 10 mmol / l, of the surfactant.
  • the surfactant-containing solution is added in step b) in portions to the protein-containing solution. At least two, more preferably at least four, individual portions of the surfactant-containing solution are preferably added.
  • the addition in portions has the advantage that the critical micelle formation concentration of the free surfactants in the solution formed is not exceeded, so that the micelle formation of the surfactants is largely prevented and these are available for the coating of the protein monomers.
  • Equation (1) takes into account that the amount of surfactant used to coat the protein monomers depends on the protein surface available and the hydrophilic or hydrophobic properties of the protein.
  • the radii ratio p K of the ideal sphere protein molecule with the radius of gyration R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 0.774.
  • a threshold range takes into account that at least as much surfactant must be added as is necessary from the transition of an ideal sphere protein to completely unfolded protein, if only hydrophobic interactions of the surfactant with the protein predominate (left limit of formula 1).
  • the radii ratio p up from the radius of gyration of the unfolded protein molecule R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 1.5.
  • the other limit area takes into account that maximally as much surfactant is added as is necessary to break up "random coil” protein aggregates until the monomeric form of the protein is present as an ideal sphere, if only hydrophilic interactions of the surfactant with the protein prevail (right In this case, the radii ratio p rc from the radius of gyration of the random coil present aggregated protein molecule R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 2.05.
  • the surfactant concentration in the stabilized material set in the coating process according to the invention for coating with a monolayer of self-assembling proteins protein solution as a coating solution (after addition of the surfactant-containing solution to the protein-containing solution) in mol / l is in the range given in equation (3).
  • the protein- and surfactant-containing solution formed according to an advantageous embodiment of the method for coating with a monolayer of self-assembling proteins are preferably added positively charged metal ions or anions, preferably in the form of an aqueous solution.
  • metal ions or anions preferably in the form of an aqueous solution.
  • divalent metal ions especially alkaline earth metal ions, which are used in the form of water-soluble salts, preferably in the form of chlorides, nitrates, carbonates, acetates, citrates, gluconates, hydroxides, lactates, sulfates, succinates or tartrates.
  • inorganic anions in particular halides, hydroxides, nitrates, carbonates, sulfates, phosphates, but also organic anions, in particular acetates, citrates, succinates or tartrates, which have alkali metals as counterions.
  • the concentration of the metal ions or anions in the aqueous solution is preferably 0.01 mmol / l to 10 mmol / l, preferably 0, 1 mmol / l to 5 mmol / l and particularly preferably 0.5 mmol / l to 2 mmol / l ,
  • the contacting of the stabilized protein-containing solution with the surface of the substrate in the coating method according to the invention is preferably carried out for at least 15 minutes, preferably for a maximum of 48 hours.
  • This process step is preferably carried out at a temperature of 15 to 70 ° C, more preferably above the Krafft point (Krafft temperature) of the surfactant used.
  • the self-assembling protein molecules deposit in the form of a monolayer on the surface of the substrate.
  • the supernatant proteinaceous solution is removed from the substrate by preferably either stripping the solution or drying the coated substrate (removal of the solvent).
  • the coated substrate surface is freed from excess and non-localized molecules by repeated rinsing with deionized water.
  • the drying of the coated substrate is preferably carried out by treatment with compressed air.
  • substrates are metallic substrates, silicon-containing solids (in particular glass or silicon wafers), ceramic or polymeric solids (in particular polytetrafluoroethylene).
  • the coating method according to the invention produces a substrate which has a layer above the monolayer protein-containing coating which contains the surfactant (s).
  • the surfactant-containing layer present on the surface of the protein-containing coating protects the surface of the protein-containing coating and the self-assembling protein from thermal and chemical stress (and therefore acts as a protective layer).
  • the surfactant-containing layer is preferably bound by coordinate binding to the protein layer.
  • the surfactant-containing protective layer arranged on the surface of the proteinaceous coating on the substrate is preferably removed, with preference being given subsequently to method step iii):
  • the coated substrate is washed several times under mechanical action and / or
  • the surfactant layer is removed by buffer treatment in a precipitation reaction.
  • the surfactant or surfactants used can either be recovered from the aqueous solution withdrawn from the coated substrate in step iii) by known methods (for example by precipitation) and can thus be reused after a purification step.
  • the invention also encompasses a substrate having a protein-containing coating with a monolayer of a self-assembling protein.
  • the substrate according to the invention has
  • a substrate according to the invention is obtainable by a coating method according to the invention.
  • the monolayer of the at least one self-assembling protein is thus initially arranged on the substrate surface, and there is a further, surfactant-containing layer thereon.
  • the method is carried out with the following steps: i. Providing a protein-containing coating solution
  • a solution containing at least one ionic surfactant is added in portions to the protein-containing solution, after addition the surfactant concentration c Te nsid in mol / l in the following range:
  • a 0, Prot where AO.FI corresponds to the surface area of the liquid sintering phase, A 0 , p ra tein the cross-sectional area of the protein (circular area), V F i corresponds to the total volume of liquid used, and N A is the Avogadro constant.
  • a 0, p ra teinoiigomere corresponds to corresponds to the cross sectional area of the Tensidkopf administrat (circular surface) of the surface lessnessdominanter AD.TKG protein oligomers, and Cp ro tein of the protein concentration employed.
  • the one limit range takes into account that maximally as much surfactant is added as is necessary for the stabilization of predominant protein oligomers.
  • a calculable surfactant concentration (right limit of formula 5)
  • protein assemblies (spherical or undefined structure) are decomposed by direct interaction with surfactant particles with cleavage of spherical protein particles.
  • the relationship given in equation (5) takes into account that the amount of surfactant used to coat the hydrophobin multimers depends on the multimeric surface area.
  • the radii ratio p K of the ideal sphere of the protein particle with the radius of gyration R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 0.774.
  • the radii ratio p rc from the radius of gyration of the aggregated hydrophobin multimer R G present in undefined form to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 2.05.
  • AOJKG is determined by scattering experiments with electromagnetic waves or is taken from the literature.
  • the formed protein bilayer on the substrate is covered by a layer of surfactant and a further attachment of self-assembling proteins to the interphase is prevented.
  • each protein particle has a defined space on the substrate.
  • contact sites for other protein particles on the protein image coated substrate must be blocked by surfactant particles.
  • a minimum concentration of surfactant left border region of formula 5
  • a partial surfactant layer is formed on the fully formed protein image and a direct interaction with other protein assemblies prevented.
  • the area Ao, p ro tein corresponds to the space required by a Proteinteilchens on the substrate, which must be blocked by at least one surfactant particles to prevent further uncontrolled growth of the Proteinbilage.
  • Ao, p r otein can be calculated according to Equation 6.
  • R is H, p ra tein ⁇ hydrodynamic radius of the protein, which can be determined by scattering experiments with electromagnetic waves or can be found in the literature.
  • Equation (5) takes into account that the additive surfactant used to promote significant layer growth is taken from the total interphase available depends on the use of coming liquid volume.
  • a correction term x is inserted in equation (5), which can preferably assume the values 1 and 2.
  • the contacting of the stabilized protein-containing coating solution with the surface of the substrate in the coating method according to the invention is preferably carried out for at least 15 minutes, preferably for a maximum of 48 hours.
  • This process step is preferably carried out at a temperature of 15 to 70 ° C, more preferably above the Krafft point (Krafft temperature) of the surfactant used.
  • the protein oligomers are deposited in the form of a protein bilayer on the surface of the substrate.
  • the supernatant proteinaceous solution is removed from the substrate by preferably stripping off the solution.
  • the coated substrate surface is freed from excess, non-bound protein molecules by repeated rinsing with deionized water.
  • the drying of the coated substrate can take place; preferably by treatment with compressed air.
  • the process is advantageously carried out with the following steps: i.
  • Providing a stabilized aqueous solution containing hydrophobins of at least one hydrophobin type by a) providing the hydrophobins in an aqueous solution, and b) depending on the charge of the hydrophobins, a saline and / or alkaline or acid solution, for masking the hydrophobin charges or Adjusting a net neutral charge of the hydrophobins in portions and over a period of 1 to 60 minutes to form predominant hydrophobin multimers, ii.
  • a 0, Prot a where AO.FI corresponds to the total area of the liquid interphase, A 0 , p ra tein the cross-sectional area of the protein (circular area), V F i corresponds to the total volume of liquid used and N A is the Avogadro constant.
  • Ao, p ra teinmuitimer corresponds to the surface venezdominanter Hydrophobinmultimere, AD.TKG corresponds to the cross sectional area of the Tensidkopf distr (circular surface) and c per ton of Hydrophobinkonzentration used.
  • iii Removing the supernatant solution from the coated substrate and / or drying the coated substrate.
  • Predominant multimers refer to oligomers with a maximum of 10 protein units.
  • an hydrophobic layer having a homogeneous hydrophobin layer is thereby referred to as an ordered layer or (ordered) bilage Layer thickness understood (relative standard deviation of the layer thickness preferably not more than 30%).
  • the average thickness of the layer corresponds to the extent of two molecules of the hydrophobin.
  • hydrophobin monomers In order to be able to ensure the construction of a homogeneous hydrophobic insert, two opposing protein properties must be balanced out.
  • the assembly of hydrophobin monomers is based on the interaction of two different physical quantities.
  • the assembly of the same hydrophobin monomers strongly depends on the accessibility of two separated hydrophobin areas, which differ in their polarizability (hydrophilicity or hydrophobicity).
  • the interaction of two identically polarizable regions of hydrophobin particles leads to an attraction between the hydrophobin particles, which leads to repulsion of oppositely polarizable regions.
  • the net electrical charge of the hydrophobins must be taken into account.
  • the hydrophobins used To prevent repulsion of like-loaded hydrophobin particles, the hydrophobins used must have a net neutral charge.
  • the method according to the invention makes it possible to specifically intervene in these interactions and to enable a substrate coating with a defined hydrophobin bilayer.
  • a stabilized aqueous solution containing at least one hydrophobinic species is initially provided, the stabilization being effected by addition of at least one salt, one alkali or acid.
  • the addition of salts, lyes or acids promotes the formation of predominant hydrophobin multimers with the compensation of protein charges.
  • hydrophobin within hydrophobin bilayers.
  • a multitude of molecules of a defined hydrophobin or fusion proteins generated therefrom are used.
  • a mixture of different self-assembling hydrophobins is used, for example a mixture of a fusion protein containing at least one hydrophobin.
  • These molecules of the hydrophobins are first stabilized in aqueous solution, then an ordered formation of predominant assembly structures is induced and finally used to coat the substrate.
  • the counterions go with those contained in the aqueous solution Hydrophobins coordinate so as to form a hydrophobin counterion complex.
  • the formation of the hydrophobin-counterion complex initiates the controlled formation of multimers of the hydrophobins (assemblies) and stabilizes the protein-containing solution.
  • stabilization is thus understood as the prevention of an uncontrolled aggregation of hydrophobins in aqueous solutions. It is possible with the method according to the invention to produce stabilized solutions with hydrophobin multimers (preferably dimers or tetramers).
  • the stabilized aqueous solutions obtainable by a process of the invention are useful for coating substrates.
  • the concentration of the at least one hydrophobin type in the unstabilized aqueous solution is preferably at least 50 ng / ⁇ , particularly preferably at least 90 ng / ⁇ .
  • the unstabilized aqueous solution containing the at least one self-assembling hydrophobin type preferably has a pH of from 7 to 9.5. This is preferably a buffered solution.
  • hydrophobins In order to establish a neutral net charge of the hydrophobins, preferably positively charged metal ions or anions, preferably in the form of an aqueous solution, are added in the coating process according to the invention to provide the stabilized protein solution.
  • the formation of hydrophobin-ion complexes mask hydrophobin charges and promote the formation of predominant hydrophobin multimers.
  • Particularly preferred are solutions with divalent metal ions having a high ionic strength, in particular alkaline earth metal ions which are used in the form of water-soluble salts, preferably in the form of chlorides, nitrates, carbonates, acetates, citrates, gluconates, hydroxides, lactates, sulfates, succinates or tartrates.
  • inorganic anions in particular halides, hydroxides, nitrates, carbonates, sulfates, phosphates, but also organic anions, in particular acetates, citrates, succinates or tartrates, which have alkali metals as counterions.
  • the concentration of the metal ions or anions in the aqueous solution is preferably 0.01 mmol / l to 10 mmol / l, preferably 0.1 mmol / l to 5 mmol / l and particularly preferably 0.5 mmol / l to 2 mmol / l ,
  • the pH can be shifted in the direction of the isoelectric point of the hydrophobins used.
  • solutions of ionic surfactants preferably cationic and / or anionic surfactants, are added to the protein- and saline-containing solution.
  • surfactants have a hydrophilic part of the molecule (also referred to herein as a "surfactant head group") and a hydrophobic part of the moiety - containing solution containing a surfactant concentration, which preferably at least 1 ⁇ / ⁇ and at most 500 ⁇ / ⁇ , more preferably at most 100 ⁇ / ⁇ corresponds.
  • the coating method according to the invention only a maximum of surfactant is added, as necessary, to envelop the interphase of the solution containing protein molecules with a bilayer.
  • enough surfactant is added to the solution from b) that the final concentration of the surfactant in mol / l after addition to the protein and saline solution is in the following range:
  • the one boundary area takes account of the fact that maximally as much surfactant is added as is necessary for the departure of predomi- nant hydrophobin mu ltimers.
  • hydrophobinassemblates (spherical or undefined structure) are decomposed by direct interaction with surfactant particles with elimination of spherical hydrophobin particles.
  • the relationship given in equation (5) takes account of the fact that the amount of surfactant used to charge the hydrophobin polymers depends on the available multimer surface.
  • the radii ratio p K of the hydrophobin particle having the ideal radius and the radius of gyration R G to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 0.774.
  • the radii ratio p rc from the radius of gyration of the aggregated hydrophobin multimer R G present in undefined form relative to the hydrodynamic radius of the protein molecule R H is 2.05.
  • AOJKG is determined by scattering experiments with electromagnetic waves or is taken from the literature.
  • the formed protein bilayer on the substrate is covered by a layer of surfactant and prevents any further attachment of hydrophobins to the interphase.
  • each hydrophobin particle has a defined space on the substrate.
  • contact sites for further hydrophobin particles on the hydrophobin bilayer coated substrate must be blocked by surfactant particles.
  • a minimum concentration of surfactant left boundary region of formula 5
  • a partial surfactant layer is formed on the fully formed hydrophobin bilayers and a direct interaction with other hydrophobinassemblates is prevented.
  • the area Ao, p ro tein corresponds to the space required by a Hydrophobinteilchens on the substrate, which must be blocked by at least one surfactant particles to prevent further uncontrolled growth of the Hydrophobinbilage.
  • Ao, p ro ton can be calculated using equation. 6
  • R is H, p ra tein ⁇ hydrodynamic radius of the hydrophobin, which can be determined by scattering experiments with electromagnetic waves or can be found in the literature.
  • Equation (5) takes account of the fact that the surfactant concentration to be added, which is used to prevent further layer growth, depends on the total, available interphase of the liquid volume used.
  • a correction term x is inserted in equation (5), which can preferably assume the values 1 and 2.
  • the contacting of the stabilized hydrophobin-containing solution with the surface of the substrate in the coating method according to the invention is preferably carried out for at least 15 minutes, preferably for a maximum of 48 hours.
  • This process step is preferred at a temperature of 15 to 70 ° C, more preferably above the Krafft point (Krafft-Te mpe rat ur) d introduced n surfactant carried out.
  • the hydrophobinassemblates are deposited in the form of a protein bilayer on the surface of the substrate.
  • the supernatant proteinaceous solution is removed from the substrate by preferably stripping off the solution.
  • the coated substrate surface is freed from excess, non-bound protein molecules by repeated rinsing with deionized water.
  • the drying of the coated substrate can take place; preferably by treatment with compressed air.
  • Substrates of various structures are suitable for the coating method according to the invention.
  • the coating method of the invention is also suitable for porous substrates and allows a homogeneous ordered layer structure even within the difficult to access pore system.
  • Preferred substrates are metallic substrates, silicon-containing solids (in particular glass or silicon wafers), ceramic or polymeric solids (in particular polytetrafluoroethylene).
  • the coating process according to the invention produces a substrate which, above the bilayered protein-containing coating, has a layer which contains the surfactant (s).
  • the surfactant-containing layer present on the surface of the protein-containing coating protects the surface of the protein-containing coating and the hydrophobin from thermal and chemical stress (and therefore acts as a protective layer).
  • the surfactant-containing layer is preferably bound by coordinate binding to the protein layer.
  • the surfactant-containing protective layer disposed on the surface of the hydrophobin-containing coating on the substrate is preferably removed, the preferred substrate subsequently being after step ii): the coated substrate being washed several times under mechanical action and / or
  • the surfactant layer is removed by buffer treatment in a precipitation reaction.
  • the surfactant (s) used can either be obtained from the aqueous solution withdrawn from the coated substrate in step iii) (for example, by precipitation) and can be reused after a cleaning step.
  • hydrophobins used are class I hydrophobins, preferably Ccg2 from Neurospora crassa, or class II hydrophobins, preferably HFBI or HFBII from Trichoderma reesei.
  • the invention is particularly advantageously suitable for functionalized hydrophobins, since the accessibility of the functionalization can be ensured by the ordered layer structure of bilayers of the functionalized hydrophobin. It is advantageously possible to carry out the coating of the substrate so that the functionalization is present on the side of the protein-containing coating remote from the substrate.
  • the hydrophobin used is a recombinant fusion protein comprising at least two domains, one domain being a self-assembling protein domain and one domain being a functional domain or self-assembling protein domain.
  • the hydrophobin is therefore preferably a recombinant fusion protein, ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • a recombinant fusion protein ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • the recombinant fusion protein can be obtained by expression of the fused gene.
  • the artificially generated reading frame of the DNA construct is flanked at the 5 ' position by a host-specific promoter and at the 3 ' position by a terminator.
  • a recombinant fusion protein employed in the invention comprises at least two domains, one domain being a self-assembling protein domain (preferably selected from the above hydrophobins) and one domain being a functional domain.
  • Preferred functional domains are fluorescent protein domains, catalytic domains or protein domains with enzyme activity.
  • other hydrophobins may also act as a fusion domain.
  • the choice of suitable fusion partner parts is not limited to proteins of certain organisms.
  • the amino acid sequence in the N- and / or C-terminal region may also have an affinity domain comprising 1-20 amino acids, which may interact as a specific anchor group with complementary groups on solid supports.
  • the aqueous solution containing at least one hydrophobin type, to which the salt-containing, basic and / or acidic and surfactant-containing solutions are added in one variant contains mixtures of different hydrophobin types, preferably at least one functionalized hydrophobin type in combination with at least one non-functionalized hydrophobin type. This improves the stability of the proteinaceous coating. This embodiment is particularly advantageous for functionalized hydrophobins with large functional domains to allow interaction between assembling domains of different protein molecules.
  • the functional domain of the recombinant fusion protein is preferably arranged on the side of the protein-containing coating remote from the substrate.
  • the hydrophobin domain of the recombinant fusion protein is arranged on the substrate-facing side of the proteinaceous coating.
  • the coating containing at least one surfactant is thus arranged in this case above the functional domain of the recombinant fusion protein.
  • the surfactant used is an anionic or cationic surfactant, preferably selected from sodium dodecyl sulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • the invention also encompasses a method for stabilizing monomers of at least one self-assembling protein in an aqueous solution (also referred to herein as "stabilization method")
  • a) at least one self-assembling protein is admixed with an aqueous solution, preferably an aqueous buffer solution , and subsequently
  • a 0 protein corresponds to the surface of a molecule of the self-assembling protein
  • a T KG corresponds to the cross-sectional area of the head group of the surfactant
  • Cp ro tein corresponds to the concentration of the self-assembling protein in mol / l.
  • a stabilized aqueous proteinaceous solution which is preferably obtainable by a process according to the invention and which contains at least one self-assembling protein and at least one surfactant, is likewise provided by the invention (the terms “stabilized aqueous solution” and “stabilized monomers in aqueous solution” are used synonymously herein ). Preference is given to stabilized protein monomer solutions.
  • the stabilized aqueous solution according to the invention contains at least one self-assembling protein, at least one ionic surfactant and contains no substances which are suitable for cleaving disulfide bridges (maximum 0.01% by weight based on the self-assembling protein, preferably not more than 0.0001% by weight). ).
  • monomers of the self-assembling protein are in coordinative binding with the ionic surfactant (protein-surfactant complex).
  • the surfactant concentration c Te nsid in mol / l in the aqueous solution is in the following range:
  • A corresponds to 0, p ra tein the surface of a molecule of the self-assembling protein A T KG the cross sectional area of the head group of the surfactant and Cp ro tein the concentration of self-assembling protein in mol / l.
  • the invention also includes a substrate having a coating of a hydrophobin bilayer, on the substrate surface is a bilayer of at least one Hydrophobinart, wherein on the surface of the hydrophobin bilayer is a layer containing at least one ionic surfactant, wherein the surfactant with the hydrophobin of the surface of Bilage is present in coordinate binding.
  • the hydrophobins of the at least one hydrophobin species are preferably recombinant fusion proteins which comprise at least two domains, one domain being a self-assembling protein domain and one domain being a functional domain or self-assembling protein domain, the functional domain being on the hydrophobin-containing side remote from the substrate Coating is arranged.
  • the substrate is preferably a metallic, silicon-containing, ceramic or polymeric solid.
  • the invention also encompasses the use of a stabilized protein-containing solution according to the invention for coating substrate surfaces with a monolayer of a self-assembling protein. Subsequent embodiments are preferred for the invention:
  • the self-assembling protein is preferably selected from hydrophobins and surface layer proteins (S-layer proteins).
  • Preferred hydrophobins are class I hydrophobins, preferably Ccg2 from Neurospora crassa, or class II hydrophobins, preferably HFBI or HFBII from Trichoderma reesei.
  • Preferred S-layer proteins are SBSC from Bacillus stearothermophilus, S13240 from Bacillus stearothermophilus or SslA from Sporosarcina ureae.
  • the invention is suitable for functionalized self-assembling proteins, since the accessibility of the functionalization can be ensured by the ordered layer structure of monolayers of the functionalized self-assembling protein. It is advantageously possible to carry out the coating of the substrate so that the functionalization is present on the side of the protein-containing coating remote from the substrate.
  • the self-assembling protein is therefore preferably a recombinant fusion protein, ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • a recombinant fusion protein ie a protein which is produced by genetically modified organisms.
  • the recombinant fusion protein can be obtained by expression of the fused gene.
  • a recombinant fusion protein employed in the invention comprises at least two domains, one domain being a self-assembling protein domain (preferably selected from the above-mentioned self-assembling proteins) and one domain being a functional domain.
  • Preferred functional domains are fluorescent protein domains, catalytic domains or protein domains with enzyme activity.
  • the at least one self-assembling protein-containing aqueous solution, to which the surfactant-containing solution is added in one embodiment contains mixtures of blast-free bleaching proteins, preferably at least one structurally self-assembling protein in combination with at least one non-functionalized self-assembling protein. This improves the stability of the proteinaceous coating.
  • This embodiment variant is particularly advantageous for functionalized self-assembling proteins with large functional domains in order to enable the interaction between assembling domains of different protein molecules.
  • the functional domain of the recombinant fusion protein preferably arranged on the side facing away from the substrate side of the proteinaceous coating.
  • the self-assembling protein domain of the recombinant fusion protein was placed on the substrate in order to obtain the protein-containing coating.
  • the coating containing at least one surfactant is thus in this case located above the functional domain of the recombinant fusion protein.
  • the surfactant is an anionic or cationic surfactant, preferably selected from sodium dodecyl sulfate (SDS) and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • CTAB cetyltrimethylammonium bromide
  • the invention offers the advantage of providing stabilized monomer solutions of self-assembled proteins in which the uncontrolled aggregation of the proteins is prevented. Through targeted monomerization and stabilization of the solution, these can be used for position-independent coating of substrate surfaces.
  • FIG. 1 SEM image of a silicon wafer coated with a monolayer of the S-layer protein SbsC- (R5P) 2 from Bacillus stearothermophilus with a layered SDS layer.
  • FIG. The homogeneous areas on the left and right show the protein monolayer from which the SDS layer (seen in the center) was removed.
  • FIG. 2 AFM image of a silicon wafer coated with a monolayer of Class 1 hydrophobin Ccg-2 from Aspergillus nidulans after removal of the SDS layer with exposed protein monolayer.
  • Fig. 3 height profile of a coated with a monolayer of Class 1 hydrophobin Ccg-2 from Aspergillus nidulans silicon wafer, determined by AFM.
  • Embodiment 1 Expression of Recombinant Compounding Fusion Proteins in E. coli and Purification
  • HFBI Trichoderma reesei
  • the DNA sequences coding for the respective domain were amplified by means of polymerase chain reaction (PCR) and a fusion gene was assembled by overlap PCR.
  • the flanking primers used contained recognition sequences for the restriction endonucleases Nde ⁇ and Xho ⁇ . After vector and fragment restriction via the corresponding endonucleases, ligation and transformation into Escherichia coli (E. coli) as the host organism, the presence of the fusion gene in the generated plasmids was checked.
  • the self-assembling protein fusion protein containing the plasmids containing the generated fusion correctly, were transformed into £ coli strain shuffle ® T7 Express.
  • the fusion protein is accumulated intracellularly in the bacterial cells.
  • the transformed E. coli cells were cultured at 30 ° C.
  • the expression of the fusion gene was induced by the addition of 0.4 mM (mmol / l) I PTG.
  • the cells were pelleted by centrifugation (at 4000 xg, 4 ° C, 10 min).
  • 50 mM Tris buffer (pH 7.5) After washing the cell pellet twice with 50 mM Tris buffer (pH 7.5), the cells were again pelleted by centrifugation.
  • the £. coli cells were subjected to a triple ultrasound treatment (9-eye, 70%, 4 ° C, 2 min) followed by a three-time French press treatment (20 ⁇ 00 psi).
  • the digested bacterial cells were washed twice with 50 mM Tris buffer (pH 7.5).
  • the purification of the fusion protein was carried out by means of nickel affinity chromatography.
  • the elution of the fusion protein was carried out in an isotype phosphate buffer (pH 4.5) with 250 mM imidazole.
  • the resulting eluate was dialyzed against 4000 times the volume of a dialysis buffer at 4 ° C for a maximum of 48 hours.
  • a Tris buffer 50 mM, pH 8.5 with 1 mM glutathione reduced and 0.2 mM glutathione oxidized
  • 10 mM Tris buffer pH 9.0 was used as the dialysis buffer.
  • fusion protein HFBI- (XSR5P) 3 was used, which contains as self-assembling domain a class I hydrophobin (HFBI from Trichoderma reesei) and contains as a functional domain a human influenza hemaglutinin tag.
  • centrifugation was carried out for sedimentation of larger protein aggregates (15 min. At 18,000 x g, 4 ° C.) and the protein concentration was determined (according to Lowry). The sediment was taken up in 50 mM Tris buffer pH 8.5. A protein concentration of 100 ng / ⁇ was set.
  • a surfactant concentration to be set for a 100 ng / ⁇ protein solution is between 0.5 mmol / l and 5.6 mmol / l.
  • the self-assembling fusion protein HFBI- (XSR5P) 3 has a molecular weight of about 14000 g / mol.
  • the concentration at a protein concentration of 100 ng / ⁇ in the solution is in mol / l, corresponding to 7.14 * 10 "6 mol / l.
  • the Tensidkopfen of the employed SDS molecule has an effective area of A T KG of 0.62 nm 2.
  • the stabilized solution thus obtained was clear and stable for at least five days when stored at 20 ° C.
  • the stabilized solution containing monomers of the self-assembling protein was used to coat a silicon wafer with the edge lengths 1 x 1 cm.
  • 100 ⁇ of the stabilized protein-containing solution were applied to the silicon wafer and incubated for at least 30 min.
  • the supernatant was then stripped off and the HFBI (XSR5P) 3 coated silicon wafer was washed in filtered bidistilled water.
  • the storage of the coated silicon wafer took place in the dialysis buffer mentioned in Example 1.
  • the stripped stabilized protein solution could then be used for further coating processes.
  • Embodiment 3 Characterization of the Coating Using HFBI- (XSR5P) 3 Produced in Embodiment 2 on a Silicon Wafer by Ellipsometry
  • the coated silicon wafer obtained in Example 2 was examined ellipsometrically (Multiskop from OPTREL (Berlin)).
  • the change in the polarization plane of a monochromatic laser beam (wavelength 632.8 nm) was determined by reflection at an angle of 136 °.
  • the intensity ratio (p) was determined.
  • the ellipsometric angles ⁇ and ⁇ are derived via FRENSEL's formulas.
  • ⁇ ⁇ and 5 S indicate the phase shift to the zero point of parallel and perpendicularly polarized light.
  • the optical constants known from the literature for silicon were used as substrate and silicon dioxide.
  • the refractive index of the protein film was 1, 375.
  • the determined layer thickness of HFBI- (XSR5P) 3 on the silicon wafer was 13.2 ⁇ 0.2 A. This corresponds to the literature values for a monolayer of the self-assembling protein.
  • Table 2 shows the ellipsometric data of an analysis of four different samples (1 to 4, the different values in the individual rows were recorded at different measuring points on the respective sample): Table 2:
  • EMBODIMENT 4 Scanning Electron Microscopy (SEM) of a Sbsc (R5P) 2 Coated Silicon Wafer
  • a silicon wafer analogously to Example 2 was coated with the self-assembling protein SbsC- (R5P) 2 (Table 1).
  • the obtained coated silicon wafer was examined by means of SEM (Zeiss DSM 982 Gemini).
  • SEM Zeiss DSM 982 Gemini
  • the coated silicon wafer was dried and then vapor-deposited with an atomic gold layer.
  • the results of the SEM analysis are shown in FIG. Bright areas show therein the protein layer with a layered SDS layer.
  • the dark areas show the protein as a monolayer from which the SDS layer has been removed.
  • a silicon wafer coated with Ccg2-HA analogously to Example 2 was investigated in an aqueous medium by means of AFM.
  • the results of the AFM analysis are shown in FIG. It can be seen a uniform protein monolayer.
  • the Ccg2 tube structures have a length of about 100 nm ( Figure 2, bright areas). From the height profile ( Figure 3), it can be seen that the self-assembled structures of the Ccg2 HA have a width of about 25 nm and a height of about 2.5 nm.
  • Example 2 With the self-assembling fusion protein HFBI- (R5P) 2 produced in Example 1, analogously to Example 2 , a silicon wafer with a monolayer of Proteins coated. The layer thickness, which was determined ellipsometrically analogously to Example 3, was 1 3.8 ⁇ 0.4 ⁇ . In the fusion protein is the functional domain, the R5P subunit of the silaffin fused with the hydrophilic part of the hydrophobin.
  • the contact angle in air was determined by the sessile drop method (Drop Shape Analysis System DSA10, Kruss GmbH, Germany). The contact angle in degrees of a drop of 2 ⁇ deionized water was determined.
  • Example 2 An ordered protein image of a hydrophobin, as obtained in Example 1, was generated on a silicon wafer.
  • the fusion protein HFBI- (R5P) 2 was used, which contains a class I hydrophobin (HFBI from Trichoderma reesei) as a self-assembling domain and contains a mineralization tag as the functional domain.
  • Centrifugation was first carried out for sedimentation of larger protein aggregates (15 min at 18,000 ⁇ g, 4 ° C.) and the protein concentration was determined (according to Lowry). The sediment was discarded. A protein concentration of 100 ng / ⁇ was set.
  • the stabilized solution containing multimers of hydrophobin was used to coat a silicon wafer with edge lengths of 1 x 1 cm.
  • 200 .mu. ⁇ of the stabilized protein-containing solution were applied to the silicon wafer and for at least Incubated for 30 min.
  • the supernatant was then stripped off and the HFBI (R5P) 2 coated silicon wafer was washed in filtered bidistilled water.
  • the storage of the coated silicon wafer took place in the dialysis buffer mentioned in Example 1.
  • the stripped stabilized protein solution could then be used for further coating processes.
  • Exemplary Embodiment 8 Characterization of the Coating Using HFBI- (R5P) 2 and HFBI- (XSR5P) 3 Produced in Embodiment 6 on a Silicon Wafer by Ellipsometry
  • the coated silicon wafer obtained in Example 2 was examined ellipsometrically (Multiskop from OPTREL (Berlin)).
  • the change in the polarization plane of a monochromatic laser beam (wavelength 632.8 nm) was determined by reflection at an angle of 136 °.
  • the intensity ratio (p) was determined.
  • the ellipsometric angles ⁇ and ⁇ are derived via FRENSEL's formulas.
  • the layer thickness of the uppermost layer was calculated.
  • ⁇ ⁇ and 5 S indicate the phase shift to the zero point of parallel and perpendicularly polarized light.
  • the optical constants known from the literature for silicon were used as substrate and silicon dioxide.
  • the refractive index of the protein film was 1, 375.
  • the determined layer thickness of HFBI- (R5P) 2 on the silicon wafer was 25.7 ⁇ 1.8 ⁇ , or 25.8 ⁇ 0.8 ⁇ for the construct HFBI- (XSR5P) 3 . These layer thicknesses correspond to the literature values for a bilayer of hydrophobin.
  • Table 3 shows the ellipsometric data of an analysis of seven different samples (1 to Z), the different values in the individual rows were recorded at different measuring points on the respective sample):
  • Table 3 Ellipsometric data for substrates coated with HFBI (R5P) 2
  • Example 2 With the self-assembling fusion protein HFBI- (R5P) 2 prepared in Example 1, a silicon wafer was coated with a bilage of the protein analogously to Example 7. The layer thickness, which was determined ellipsometrically analogously to Example 8, was 25.7 ⁇ 1.8 ⁇ . In the fusion protein, the funcional domain, the R5P subunit of the silaffin, is fused to the hydrophilic part of the hydrophobin.
  • the contact angle in air was determined by the sessile drop method (Drop Shape Analysis System DSA10, Kruss GmbH, Germany). The contact angle in degrees of a drop of 2 ⁇ deionized water was determined.
  • Exemplary Embodiment 10 Checking the Accessibility of the Fused HA Tag of a Ccg2-HA Coated Silicon Wafer.
  • Fluorescence microscopic images were taken with a Zeiss Axio Observer.ZI (CARL ZEISS MICROIMAGING GMBH, Jena, Germany) in combination with the associated filter set 38 GFP.
  • a green fluorescent substrate surface confirms the accessibility of the fused HA tag.
  • a substrate according to Example 2 was treated by analogy with BSA. After incubation with the antibody anti-HA ® AlexaFluor 488 conjugate no green fluorescent signals on the substrate surface could be detected ..
  • Exemplary embodiment 11 Checking the accessibility of a fused luciferase tag of a HFBI-GLuc coated plastic surface.
  • the bifunctional hydrophin chimera (HFB1-Gluc) and the subunit displayed a luminescent signal as expected.
  • the catalytically inactive HFB1 subunit shows no luminescence signal.
  • the proteins were deposited on a polystyrene surface as in Embodiment 2.
  • the substrates were overlaid with reaction buffer and the reaction was initiated by the addition of luciferol. Only the immobilized bifunctional hydrophobin chimera showed a significant luminescence signal.
  • Embodiment 12 Examination of the long-term stability of a protein-containing coating solution containing Ccg2-tRFP or HFBI-tRFP
  • the fluorescent fusion proteins consist of a hydrophobin (Ccg2 or HFBI), which represents the self-assembling domain and a red fluorescent peptide domain (tRFP).
  • Ccg2 or HFBI hydrophobin
  • tRFP red fluorescent peptide domain
  • the red-fluorescent peptide domain allows the influence of ionic surfactants on the structure of the fusion protein to be determined by fluorescence measurements. A change in the fluorescence intensity allows direct conclusions about conformational changes of the protein scaffold, which are caused by interactions with the ionic surfactant.
  • a proteinaceous solution containing a fusion protein (Ccg2-tRFP or H FB I-tRFP) or an unfused tRFP peptide sequence of concentration 200 ng / ml was optionally added in four portions with a solution of ionic surfactants including CTAB a final concentration of ionic surfactant of 1 mM added. All solutions were then filtered through a 0.22 ⁇ ". Filter and the effect of filtration and the influence of added ionic surfactants was subsequently examined over a period of one week.
  • the filtration of the protein-containing solutions containing only the fusion protein (Ccg2-tRFP or HFBI-tRFP) without the addition of ionic surfactant resulted in a 37% and 46% reduction in fluorescence intensity, respectively.
  • the proteinaceous solution containing only the unfused tRFP without the addition of ionic surfactant did not show a decrease in fluorescence intensity.
  • the fluorescence intensity was subsequently monitored every 24 hours for a period of one week. All samples showed a continuous decrease in fluorescence intensity. After one week, a fluorescence which was reduced by about 95% to the baseline was detectable in all samples.
  • the protein-containing solutions containing a fusion protein (Ccg2-tRFP or HFBI-tRFP) and an ionic surfactant showed no drop in fluorescence intensity over the entire experimental period.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine unter Einsatz stabilisierter wässriger Lösungen mit selbstassemblierenden Proteinen sowie dadurch erhältliche Substrate. Verfahren zur Stabilisierung von Lösungen mit selbstassemblierenden Proteinen und die daraus erhältlichen stabilisierten Lösungen sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung. Nach dem Beschichtungsverfahren wird mindestens eine Monolage eines selbstassemblierenden Proteins auf einem Substrat erzeugt, indem zunächst eine stabilisierte wässrige Lösung, die mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthält, bereitgestellt wird. Zur Bereitstellung der Beschichtungslösung werden aus einer wässrigen Lösung selbstassemblierender Proteine aggregierte Proteineinheiten abgetrennt werden und Zugabe einer Lösung ionischer Tenside und/oder einer salzhaltigen und/oder alkalischen und/oder sauren Lösung in der proteinhaltigen Beschichtungslösung Monomere oder Oligomere der selbstassemblierenden Proteine erzeugt und stabilisiert werden, wobei so viel ionisches Tensid zugesetzt wird, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven Proteinmonomers oder prädominanten Proteinoligomers von Tensidteilchen umhüllt wird. Anschließend wird eine Substratoberfläche mit der stabilisierten proteinhaltigen Lösung in Kontakt gebracht, wodurch eine proteinhaltige Beschichtung auf dem Substrat erzeugt wird. Die überstehende Lösung wird von dem beschichteten Substrat entfernt und/oder das beschichtete Substrat wird getrocknet.

Description

Verfahren zur Beschichtung von Substraten mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine sowie dadurch erhältliche S u bstrate. Die Erfindung findet Anwendung in der chemischen Industrie, der Biotechnologie, der Sensorik sowie in der medizinischen Forschung.
Selbstassemblierende Proteine, wie Hydrophobine oder Surface Layer Proteine (S-Layer Proteine), neigen in wässrigen Lösungen zu einer raschen und un kontrollierbaren Aggregatbildung (der unkontrollierten Zusammenlagerung von Proteinmonomeren zu Multimeren der selbstassemblierenden Proteine), was die Herstellung homogener Schichten der selbstassemblierenden Proteine auf einem Substrat erschwert. In Bezug auf die Erfindung werden im Folgenden selbstassemblierende Proteine auch vereinfacht lediglich als „Proteine" bezeichnet. Selbstassemblierende Proteine bilden durch I nteraktionen der Proteinmoleküle untereinander eine gerichtete Faltung und Assoziation aus (molekulare Selbstassemblierung) und sind durch die Bildung dieser hochgradig geordneten Struktur für verschiedenste Anwendungen in Nanotechnologien nutzbar.
Zum Aufbau homogener Schichten selbstassemblierender Proteine werden gemeinhin die Langmuir-Blodgett-Methode, die Langmu ir-Schäfer Tech n i k od er d as„layer-by-layer" Verfa h ren g en utzt. I n d i esen Ve rfa h ren wi rd d as S u bstrat i n ei n e Lös u n g m it Proteinmonomeren getaucht, so dass eine Schicht der Proteinmonomere (Monolage) auf dem Substrat abgelagert wird. Die layer-by-layer Techniken basieren ausschließlich auf der Ausnutzung der Physisorption der Proteinmonomere auf der Substratoberfläche. Es ist daher notwendig, hochreine Proteinmonomere einzusetzen. Da selbstassemblierende Proteine eine starke Neigung zur Aggregatbildung haben , ist eine langfristige Lagerung und Benutzung von bereits hergestellten Proteinlösungen nicht möglich. Ferner ist die Beschichtung von schwer zugänglichen Oberflächen des Substrats (beispielsweise Poren ei n es Su bstrats) l i m itiert, da schwer zugä ngl iche Stel len a uf dem Su bstrat, wie beispielsweise Poren, durch unkontrolliert aggregierende Proteinmonomere verschlossen werden können, so dass weitere Monomere nicht mehr in Poren eindringen können.
DE 10 2005 051515 A1 offenbart Verfahren zur Beschichtung von Oberflächen mit definierten Fusionshydrophobinen. Dabei wird eine wässrige Lösung, die einen pH-Wert von > 4 aufweist, mit einer Oberfläche kontaktiert und das Lösungsmittel anschließend entfernt. Der Hydrophobin-Lösung können dabei weitere Additive, wie beispielsweise nichtionische Tenside und/oder Metallionen zugesetzt sei n . Das Verfah ren erlaubt jedoch keine kontrollierte Abscheidung von Proteinlagen.
Es sind ferner Verfahren bekannt, um Lösungen von Monomeren selbstassemblierender Proteine zu stabilisieren. So ist ein Verfahren bekannt, Proteinaggregate durch Zugabe von Trifluoressigsäure (TFA) aufzulösen, ohne die Proteine zu schädigen. Im Hinblick auf Umweltauflagen und die stark ätzenden Eigenschaften von TFA ist diese Methode für industrielle Anwendungen nur sehr bedingt geeignet.
Weiterhin ist aus WO 01/57066 A2 ein Verfahren bekannt, wobei die Disulfidbindungen innerhalb eines Hydrophobins durch Zusatz eines stark denaturierenden Agens, wie Guanidinhydrochlorid, gespalten werden, so dass die Faltung des Hydrophobins aufgelöst wird. Durch Zusatz von geeigneten Agentien zur Bildung von Sulfhydryl-Schutzgruppen wird die erneute Bildung von Disulfidbindungen in der Hydrophobinlösung vermieden, so dass die dabei hergestellten hydrophobinmonomerhaltigen Lösungen stabil sind. Zur Beschichtung einer Substratoberfläche mit selbstassemblierenden Proteinmonomeren ist dann die Entfernung der Schutzgruppe erforderlich, was durch Zusatz eines Oxidationsmittels bewirkt wird.
WO 96/41882 A1 offenbart die Hydrophobin-Assemblierung an Öl-Wasser-Interphasen. Ferner offenbaren EP 1 252 516 A1 und WO 2005/068087 A1 die Immobilisierung von Hydrophobinen mittels thermischer Probenpräparation bzw. durch Verschiebung des pH- Wertes ins saure Milieu. Beide Verfahren geben jedoch keine Auskunft über die Anzahl und Homogenität generierter Hydrophobinlagen, weshalb sie nicht für eine Anwendung in der Sensorik oder der Biomedizin dienen können.
Aufgabe der Erfindung ist es ein Verfahren , das die Beschichtung von Substraten mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine erlaubt sowie dazu erforderliche Lösungen, bereitzustellen.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine mit folgenden Schritten gelöst:
i. Bereitstellung einer proteinhaltigen Beschichtungslösung,
ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der proteinhaltigen Lösung, iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats. Zur Breitstellung der proteinhaltigen Beschichtungslösung werden aus einer wässrigen Lösung selbstassemblierender Proteine aggregierte Proteineinheiten so abgetrennt, dass in der Lösung bevorzugt Monomere oder Oligomere selbstassemblierender Proteine verbleiben.
Durch anschließende Zugabe einer Lösung ionischer Tenside und/oder einer salzhaltigen und/oder alkalischen und/oder sauren Lösung werden in der proteinhaltigen Beschichtungslösung Monomere oder Oligomere der selbstassemblierenden Proteine erzeugt und stabilisiert. Dabei wird so viel ionisches Tensid zugesetzt, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven Proteinmonomers oder prädominanten Proteinoligomers von Tensidteilchen umhüllt wird.
Selbstassemblierende Proteine neigen in wässrigen Lösungen zu r Aggregation und Ausbildung von Aggregaten mit mehr als 10 Proteineinheiten. Mit diesen Aggregaten ist eine kontrollierte Abscheidung definierter Proteinlagen nicht möglich. Es ist deshalb wichtig, dass diese Aggregate abgetrennt werden und in der abgetrennten Lösung bevorzugt Monomere und Oligomere der selbstassemblierenden Proteine verbleiben.
Die Abtrennung erfolgt vorteilhaft durch Zentrifugation mit einer Zentrifugalbeschleunigung von mindestens 5000 x g, bevorzugt 10000 bis 50000 x g über einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten, bevorzugt 15 - 60 min, bei einer Temperatur von - 10°C bis 40°C, bevorzugt bei 0 - 10°C.
Monomere sind die kleinsten unteilbaren Proteineinheiten eines selbstassemblierenden Proteins. Oligomere sind gemäß der Erfindung Assemblate selbstassemblierender Proteine mit einer Größe von maximal 10 Proteinmonomeren.
Zur Ausbildung und Stabilisierung von Monomeren der assemblierenden Proteine werden der Lösung nach Abtrennung der Proteinaggregate ionische Tenside so zugesetzt, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven Proteinmonomers von Tensidteilchen umhüllt wird. Mit einer derartigen Beschichtungslösung wird die Abscheidung von Proteinmonolagen auf Substraten ohne Vorbehandlung möglich. Eine Proteinmonolage ist ein flächiges Gebilde aus Oberflächen-assemblierten Proteineinheiten, bevorzugt Proteinmonomeren, mit der Schichtdicke eines Proteinmonomers.
Zur Ausbildung und Stabilisierung von Oligomeren der assemblierenden Proteine werden der Lösung nach Abtrennung der Proteinaggregate eine Lösung ionischer Tenside und/oder eine salzhaltige und/oder alkalische und/oder eine saure Lösung zugesetzt. Dabei werden so viel ionische Tenside zugesetzt, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven prädominanten Proteinoligomers von Tensidteilchen umhüllt wird.
Durch die Zugabe von Salzen, Laugen oder Säuren wird die Ausbildung von prädominanten Proteinoligomeren unter der Kompensation von Proteinladungen gefördert. Bei der Inkubation der proteinhaltigen Lösung mit der zugegebenen Lösung gehen die Gegenionen mit den in der wässrigen Lösung enthaltenen Proteinen eine koordinative Bindung ein, so dass ein Protein-Gegenion-Komplex gebildet wird. Durch die Bildung des Protein-Gegenion- Komplexes wird die kontrollierte Bildung von Oligomeren der Proteine (Assemblate) ausgelöst und stabilisiert.
Nach Abtrennung der Proteinaggregate beträgt die Konzentration der selbstassemblierenden Proteine in der wässrigen Lösung mindestens 5 ng/μΙ, bevorzugt mindestens 50, besonders bevorzugt mindestens 90 ng/μΙ. Die wässrige Lösung der selbstassemblierenden Proteine weist vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9,5 auf. Bevorzugt handelt es sich dabei um eine gepufferte Lösung.
Als selbstassemblierende Proteine werden Hydrophobine und/oder Surface Layer Proteine (S-Layer-Proteine) und/oder rekombinante Fusionsproteine mit mindestens zwei Domänen, wobei mindestens eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist, eingesetzt.
Bevorzugte Hydrophobine sind Hydrophobine der Klasse I, vorzugsweise Ccg2 aus Neurospora crassa, oder Hydrophobine der Klasse II, vorzugsweise HFBI oder HFBII aus Trichoderma reesei. Bevorzugte S-Layer-Proteine sind SbsC aus Bacillus stearothermophilus, S 13240 aus Bacillus stearothermophilus oder SslA aus Sporosarcina ureae.
Besonders vorteilhaft ist die Erfindung für funktionalisierte selbstassemblierende Proteine geeignet, da durch die erfindungsgemäße Beschichtung des funktionalisierten selbstassemblierenden Proteins die Zugänglichkeit der Funktionalisierung sichergestellt werden kann. Es ist vorteilhaft möglich, die Beschichtung des Substrats so durchzuführen, dass die Funktionalisierung auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung vorliegt.
Bevorzugt ist das selbstassemblierende Protein ein chemisch modifiziertes oder ein rekombinantes Fusionsprotein, also ein Protein, welches von gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wird. Durch Fusion der Gene zweier oder mehr natürlicherweise nicht in dieser Kombination vorliegender Proteindomänen, die üblicherweise über flexible Linkerstrukturen (Linkerpeptide) miteinander verbunden sind, ist durch Expression des fusionierten Gens das rekombinante Fusionsprotein erhältlich. Ein in der Erfindung eingesetztes rekombinantes Fusionsprotein umfasst mindestens zwei Domänen, wobei mindestens eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist (bevorzugt ausgewählt aus den oben genannten selbstassemblierenden Proteinen) und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist. Bevorzugte funktionelle Domänen sind fluoreszierende Proteindomänen, katalytische Domänen oder Proteindomänen mit Enzymaktivität.
Als ionisches Tensid wird eine Lösung mit anionischen oder kationischen Tensiden, vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe kohlenwasserstoffgekoppelter Sulfate, Sulfonate oder Carboxylate bzw. aus der Gruppe quartärer Ammoniumverbindungen eingesetzt. Besonders bevorzugt sind Alkylsulfate oder Tetraalkylammoniumsalze, ganz besonders bevorzugt werden Natriumdodecylsulfat (SDS) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) eingesetzt. Diese Tenside weisen einen einzigen hydrophilen Molekülteil (hierin auch als „Tensidkopfgruppe" bezeichnet) und einen einzigen hydrophoben Molekülteil auf. Bevorzugt wird das Tensid in einer Konzentration von maximal 30 mmol/1, besonders bevorzugt maximal 15 mmol/l eingesetzt.
Die tensidhaltige Lösung wird portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben. Bevorzugt werden mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens vier Einzelportionen der tensidhaltigen Lösung zugegeben. Die portionsweise Zugabe hat den Vorteil, dass die kritische Mizellbildungskonzentration der freien Tenside in der gebildeten Lösung nicht überschritten wird, so dass die Mizellenbildung der Tenside weitgehend unterbunden ist und diese für die Umhüllung der Proteinmonomeren und -oligomeren bereitstehen.
Die Erfindung bietet den Vorteil, Monomer- od er O l i gomerl ös u n gen von selbstassemblierenden Proteinen bereitzustellen, in denen die unkontrollierte Aggregation der Proteine unterbunden ist. Durch gezielte Erzeugung von Monomeren oder Oligomeren und deren Stabilisierung können diese Beschichtungslösungen zur positionsunabhängigen Beschichtung von Substratoberflächen ohne deren Vorbehandlung eingesetzt werden.
Die proteinhaltige Beschichtung auf dem Substrat kann eines oder mehrere unterschiedliche, zur Selbstassemblierung befähigte, Proteine innerhalb der Proteinlage enthalten. Es wird dazu eine Vielzahl von Molekülen eines definierten selbstassemblierenden Proteins, vorzugsweise eines S-Layer-Proteins oder Hyd rophobi ns oder daraus generierten Fusionsprotei nen , ei ngesetzt. Alternativ dazu wird ei ne Misch u ng versch iedener selbstassemblierender Proteine eingesetzt, beispielsweise eine Mischung eines Fusionsproteins, welches ein S-Layer-Protein enthält, mit dem entsprechenden S-Layer- Protein. Diese Moleküle der selbstassemblierenden Proteine werden zunächst in wässriger Lösung in monomerer oder oligomerer Form stabilisiert und anschließend zur Beschichtung des Substrats eingesetzt.
Bei der Inkubation der unstabilisierten proteinhaltigen Lösung mit der in mehreren Portionen (in mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei Einzelportionen) dazu gegebenen tensidhaltigen Lösung gehen die Tenside mit den in der wässrigen Lösung enthaltenen Proteinen eine koordinative Bindung ein, so dass ein Protein-Tensid-Komplex gebildet wird. Durch die Bildung des Protei n-Tensid-Komplexes wird die unkontrollierte Bildung von Proteinaggregaten unterbunden und die proteinhaltige Lösu ng stabilisiert. Unter der Stabilisierung ist somit im Sinne der Erfindung die Verhinderung einer unkontrollierten Zusammenlagerung von selbstassemblierenden Proteinen in wässrigen Lösungen zu verstehen.
Um eine neutrale Nettoladung der Proteinoligomere einzustellen, werden vorzugsweise positiv geladene Metallionen oder Anionen, bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt. Durch die Bildung von Protein-Ion-Komplexen werden Proteinladungen maskiert und die Ausbildung von prädominanten Proteinoligomeren begünstigt. Besonders bevorzugt sind Lösu ngen mit zweiwertigen Metallionen , d ie eine hohe lonenstärke aufweisen , insbesondere Erdalkalimetallionen oder Metallionen der I. oder II. Nebengruppe des PSE (Periodensystem der Elemente), die in der Form wasserlöslicher Salze eingesetzt werden, vorzugsweise in Form von Chloriden, Nitraten, Carbonaten, Acetaten, Citraten, Gluconaten, Hydroxiden, Lactaten , Sulfaten , Succinaten oder Tartraten. Besonders bevorzugt sind anorganische Anionen, insbesondere Halogenide, Hydroxide, Nitrate, Carbonate, Sulfate, Phosphate aber auch organische Anionen, insbesondere Acetate, Citrate, Succinate oder Tartrate, die als Gegenionen Alkalimetallionen aufweisen. Die Konzentration der Metallionen oder Anionen in der wässrigen Lösung beträgt in Abhängigkeit zur Konzentration der selbstassemblierenden Proteine vorzugsweise 0,01 mmo l/1 b i s 1 0 mmol/1, bevorzugt 0,1 mmol/l bis 5 mmol/l und besonders bevorzugt 0,5 mmol/l bis 2 mmol/l. Alternativ kann durch den Zusatz von Laugen oder Säuren der pH-Wert in Richtung des isoelektrischen Punktes der eingesetzten Proteine verschoben werden. Durch beide Behandlungsschritte kann vorteilhaft beim Einsatz von Fusionsproteinen, die mindestens eine selbstassemblierende und mindestens eine funktionelle Domäne enthalten, im anschließenden Beschichtungsschritt eine Orientierung der funktionellen Domäne auf die vom Substrat abgewandte Seite unterstützt werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine wässrige, proteinhaltige Beschichtungslösung, die Monomere oder Oligomere selbstassemblierender Proteine enthält, wobei der oberflächenaktive Teil der Monomere oder Oligomere der selbstassemblierenden Proteine von ionischen Tensiden umhüllt ist.
Zur Erfindung gehört auch ein Substrat mit einer Beschichtung mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteinlage,
bei dem sich auf der Substratoberfläche mindestens eine Monolage selbstassemblierender Proteine befindet,
und bei der sich auf der Oberfläche der mindestens einen Monolage selbstassemblierender Proteine eine Schicht befindet, die mindestens ein ionisches Tensid enthält, wobei das Tensid mit dem selbstassemblierenden Protein in koordinativer Bindung vorliegt.
Dabei ist mindestens eine Monolage direkt auf der Substratoberfläche assembliert. Eine durch Vorbehandlung aufgebrachte Mediatorschicht, wie z. B eine Polylysin oder sekundäre Zellwandpolymerschicht (Glykoproteinschicht) ist nicht erforderlich.
Bevorzugt sind die selbstassemblierenden Proteine rekombinante Fusionsproteine, die mindestens zwei Domänen umfassen, wobei mindestens eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist und eine Domäne eine funktionelle Domäne oder selbstassemblierende Proteindomäne ist, wobei die funktionelle Domäne auf der vom Substrat abgewandten Seite der Protein-haltigen Beschichtung angeordnet ist.
Das Substrat ist bevorzugt ein metallischer, siliziumhaltiger, keramischer oder ein polymerer Feststoff.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen proteinhaltigen Beschichtungslösung zur Beschichtung von Substratoberflächen mit mindestens einer Monolage eines selbstassemblierenden Proteins.
Z u r B e s c h i c h t u n g e i n e s S u b st ra ts m i t e i n e r M o n o l a g e m i n d e ste n s e i n e s selbstassemblierenden Proteins umfasst das Beschichtungsverfahren die Schritte:
i. Bereitstellung einer stabilisierten wässrigen Lösung, welche mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthält, indem
a) mindestens ein selbstassemblierendes Protein in einer wässrigen Lösung bereitgestellt wird, und anschließend
b) in Abwesenheit von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind, eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung aus a) zugegeben wird, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in Mol/1 in folgendem Bereich liegt: Cprotei ' 5,237
wobei Ao.protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in Mol/1 entspricht,
Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der stabilisierten proteinhaltigen Lösung, wodurch eine proteinhaltige Beschichtung auf der Oberfläche des Substrats erzeugt wird,
iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats.
Die Beschichtungslosung als stabilisierte wässrige Lösung nach Schritt a wird aus einer wässrigen Lösung selbstassemblierender Proteine hergestellt, indem aggregierte Proteineinheiten so abgetrennt werden, dass in der Lösung bevorzugt Monomere oder Oligomere selbstassemblierender Proteine verbleiben.
Zur Ausbildung und Stabilisierung von Monomeren der selbstassemblierenden Proteine wird der Lösung nach Abtrennung der Proteinaggregate eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in Mol/1 in folgendem Bereich liegt:
wobei A0,protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und cProtein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in Mol/1 entspricht. Mit einer derartigen Zugabe wird vorzugsweise der oberflächenaktive Teil jedes aktiven Proteinmonomers von Tensidteilchen umhüllt.
Mit einer derartigen Beschichtungslosung und dem Beschichtungsverfahren ist es möglich, eine geordnete Monolage eines oder meh rerer selbstassemblierender Proteine auf der Oberfläche eines Substrates in einem Verfahrensschritt gezielt zu erzeugen . Unter einer geordneten Schicht oder (geordneten) Monolage wird dabei im Sinne der Erfindung eine Proteinschicht mit homogener Schichtdicke verstanden (relative Standardabweichung der Schichtdicke vorzugsweise maximal 30 %). Dabei entspricht die mittlere Dicke der Schicht der Ausdehnung eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins.
Die Beschichtung auf dem Substrat kann eines oder mehrere unterschiedliche, zur Selbstassemblierung befähigte, Proteine innerhalb der Protein-Monolage enthalten. Es wird dazu eine Vielzahl von Molekülen eines definierten selbstassemblierenden Proteins, vorzugsweise ei nes S-Layer-Proteins oder Hydrophobins oder daraus generierten Fusionsprotei nen , ei ngesetzt. Alternativ dazu wi rd eine Mischung verschiedener selbstassemblierender Proteine eingesetzt, beispielsweise eine Mischung eines Fusionsproteins, welches ein S-Layer-Protein enthält, mit dem entsprechenden S-Layer- Protein. Diese Moleküle der selbstassemblierenden Proteine werden zunächst in wässriger Lösung in monomerer Form stabilisiert und anschließend zur Beschichtung des Substrats eingesetzt.
Nach dem Verfahren zur Beschichtung mit einer Monolage selbstassemblierender Proteine wird zunächst eine stabilisierte wässrige Lösung, die das mindestens eine selbstassemblierende Protein als Proteinmonomer enthält, bereitgestellt, wobei die Stabilisierung durch Zugabe zumindest eines Tensids erfolgt. Die Disulfidbrücken der Proteinstruktur werden dabei nicht aufgelöst. Das Tensid dient dazu, Proteinmonomere mit einer Tensidschicht zu umhüllen . Dies erfolgt in Abwesenheit (maximal 0,01 Gew.-% bezogen auf das selbstassemblierende Protein, bevorzugt maximal 0,0001 Gew.-%) von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind (insbesondere reduzierende Th iol e, wie ß-Mercaptoethanol, Dithiothreitol oder Dithioerythrit). Das gesamte erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren wird in Abwesenheit dieser Substanzen durchgeführt.
Bei der Inkubation der unstabilisierten proteinhaltigen Lösung mit der in mehreren Portionen (in mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei Einzelportionen) dazu gegebenen tensidhaltigen Lösung gehen die Tenside mit den in der wässrigen Lösung enthaltenen Proteinen eine koordinative Bindung ein, so dass ein Protein-Tensid-Komplex gebildet wird. Durch die Bildung des Protein-Tensid-Komplexes wird die unkontrollierte Bildung von Multimeren der Proteine (Aggregate) unterbunden und die proteinhaltige Lösung stabilisiert. U nter der Stabi lisieru ng ist somit i m Sin ne der Erfind u ng d ie Verh i nderu ng ei ner unkontrollierten Zusammenlagerung von selbstassemblierenden Proteinen in wässrigen Lösungen zu verstehen. Es ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, stabilisierte Lösungen mit Proteinmonomeren herzustellen. Die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen stabilisierten wässrigen Lösungen sind lagerstabil und mehrfach zur Beschichtung von Substraten verwendbar. Eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche stabilisierte wässrige Proteinlösung ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Vor Zugabe des Tensids beträgt die Konzentration des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins in der unstabilisierten wässrigen Lösung nach der Abtrennung der Proteinaggregate bevorzugt mindestens 5 ng/μΙ, besonders bevorzugt mindestens 50 ng/μΙ, ganz besonders bevorzugt mindestens 90 ng/μΙ. Die unstabilisierte wässrige Lösung, die das mindestens eine selbstassemblierende Protein enthält, weist vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9,5 auf. Bevorzugt handelt es sich dabei um eine gepufferte Lösung.
Optional wird die jeweils zugegebene wässrige Lösung vor der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens filtriert, bevorzugt durch einen Sterilfilter, besonders bevorzugt mit einer Porengröße von 0,01 μηη - 0,5 μηη.
Es werden im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren zur Bereitstellung der stabilisierten Proteinlösung ionische Tenside eingesetzt (kationische oder anionische Tenside). Diese Tenside weisen einen einzigen hydrophilen Molekülteil (hierin auch als „Tensidkopfgruppe" bezeichnet) und mindestens einen hydrophoben Molekülteil auf. Bevorzugt wird das Tensid in einer Konzentration von maximal 30 mmol/l, besonders bevorzugt maximal 15 mmol/l eingesetzt (Verfahrensschritt b). Für die Erzeugung von einer oberflächlichen Proteinmonolage auf dem Substrat wi rd ei n e Ten si d l ösu n g (i n Verfahrensschritt b) eingesetzt, die bevorzugt mindestens 1 mmol/l, weiter bevorzugt maximal 15 mmol/l, weiter bevorzugt maximal 10 mmol/l, des Tensids enthält.
Die tensidhaltige Lösung wird im Verfahrensschritt b) portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben. Bevorzugt werden mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens vier Einzelportionen der tensidhaltigen Lösung zugegeben. Die portionsweise Zugabe hat den Vorteil, dass die kritische Mizellbildungskonzentration der freien Tenside in der gebildeten Lösung nicht überschritten wird, so dass die Mizellenbildung der Tenside weitgehend unterbunden ist und diese für die Umhüllung der Proteinmonomere bereitstehen.
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird nur maximal so viel Tensid zugegeben, wie nötig ist, um die in der Lösung enthaltenen Proteinmoleküle mit einer Bilage des Tensids zu umhüllen. Dafür wird so viel Tensid zu der Lösung aus a) zugegeben, dass die finale Konzentration des Tensids in mol/l nach der Zugabe zur proteinhaltigen Lösung in folgendem Bereich liegt: D a b e i s i n d : Ao,pratein ■■■ O berfläche des sel bstassem bl i eren den P rotei n molekü l s (Kugeloberfläche), ATKG■■■ Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), NProtein ■■■ Anzahl der Monomere des selbstassemblierenden Proteins je Liter, NA ... Avogad ro- Konstante (NA = 6,022x1023 Teilchen/mol), prc = 2,05, pK = 0,774, pup = 1 ,5.
Mit dem in Gleich ung (1 ) angegebenen Zusammen hang wird berücksichtigt, dass d ie Tensidmenge, die zur Umhüllung der Proteinmonomere eingesetzt wird, von der verfügbaren Proteinoberfläche und der hydrophilen bzw. hydrophoben Eigenschaften des Proteins abhängt. Das Radienverhältnis pK des als ideale Kugel vorliegenden Proteinmoleküls mit dem Trägheitsradius RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 0,774.
Ein Grenzbereich berücksichtigt, dass mindestens so viel Tensid zugegeben werden muss, wie vom Übergang eines als ideale Kugel vorliegenden Proteins bis zum vollkommen ungefalteten Protein notwendig ist, wenn ausschließlich hydrophobe Wechselwirkungen des Tensids mit dem Protein vorherrschen (linker Grenzbereich von Formel 1 ). In diesem Fall beträgt das Radienverhältnis pup aus dem Trägheitsradius des ungefalteten Proteinmoleküls RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH 1 ,5.
Der andere Grenzbereich berücksichtigt, dass maximal so viel Tensid zugegeben wird, wie zum Aufbruch von als„random coil" vorliegenden Proteinaggregaten notwendig ist, bis die monomere Form des Proteins als ideale Kugel vorliegt, wenn ausschließlich hydrophile Wechselwirkungen des Tensids mit dem Protein vorherrschen (rechter Grenzbereich von Formel 1 ). In diesem Fall beträgt das Radienverhältnis prc aus dem Trägheitsradius des als random coil vorliegenden aggregierten Proteinmoleküls RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH 2,05.
Unter Kenntnis der Proteinkonzentration in mol/l in der proteinhaltigen Lösung aus a)
und mit den festen Parametern prc, pK und pup ergibt sich damit allein in Abhängigkeit des selbstassem blierenden Proteins u nd dessen Oberfläche, der Quersch n ittsfläche des eingesetzten Tensids sowie der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in der proteinhaltigen Lösung aus Formel (1 ) folgender Zusammenhang: i C Protein " Vi XO S. CjgnSig S i ^Protein "
ATKG A-TEG ( )
Die im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren zur Beschichtung mit einer Monolage selbstassemblierender Proteine eingestellte Tensidkonzentration in der stabilisierten proteinhaltigen Lösung als Beschichtungslösung (nach Zugabe der tensidhaltigen Lösung zur proteinhaltigen Lösung) in mol/l liegt in dem in Gleichung (3) angegebenen Bereich.
Die Oberfläche des selbstassemblierenden Proteinmoleküls ergibt sich dabei unter einer Betrachtung als Kugel aus der folgenden Gleichung (4), wobei RH,pratein der hydrodynamische Radius des selbstassemblierenden Proteinmoleküls ist:
Im Anschluss an den Verfahrensschritt b) werden der dabei gebildeten protein- und tensidhaltigen Lösung nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens zur Beschichtung mit einer Monolage selbstassemblierender Proteine vorzugsweise positiv geladene Metallionen oder Anionen, bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt. Besonders bevorzugt sind zweiwertige Metallionen, insbesondere Erdalkalimetallionen, die in der Form wasserlöslicher Salze eingesetzt werden, vorzugsweise in Form von Chloriden, Nitraten, Carbonaten, Acetaten, Citraten, Gluconaten , Hydroxiden , Lactaten, Sulfaten, Succinaten oder Tartraten. Besonders bevorzugt sind anorganische Anionen, insbesondere Halogenide, Hydroxide, Nitrate, Carbonate, Sulfate, Phosphate aber auch organische Anionen, insbesondere Acetate, Citrate, Succinate oder Tartrate, die als Gegenionen Alkalimetalle aufweisen. Die Konzentration der Metallionen oder Anionen in der wässrigen Lösung beträgt vorzugsweise 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l, bevorzugt 0, 1 mmol/l bis 5 mmol/l und besonders bevorzugt 0,5 mmol/l bis 2 mmol/l. Dadurch kann vorteilhaft beim Einsatz von Fusionsproteinen, die mindestens eine selbstassemblierende und mindestens eine funktionelle Domäne enthalten, im anschließenden Beschichtungsschritt eine Orientierung der funktionellen Domäne auf die vom Substrat abgewandte Seite unterstützt werden.
Das Inkontaktbringen der stabilisierten proteinhaltigen Lösung mit der Oberfläche des Substrats im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren erfolgt bevorzugt für mindestens 15 min, vorzugsweise für maximal 48 Stunden. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C, besonders bevorzugt oberhalb des Krafft-Punktes (Krafft-Temperatur) des eingesetzten Tensids durchgeführt. Während dieses Verfahrensschritts lagern sich die selbstassemblierenden Proteinmoleküle geordnet in Form einer Monolage auf der Oberfläche des Substrats ab. Anschließend wird die überstehende proteinhaltige Lösung vom Substrat entfernt, indem die Lösung vorzugsweise entweder abgezogen wird oder das beschichtete Substrat getrocknet wird (Entfernung des Lösungsmittels). Wird die proteinhaltige Lösung vom Substrat abgezogen, so wird die beschichtete Substratoberfläche durch mehrmaliges Spülen mit deionisiertem Wasser von ü bersteh end en , n ichtgebu nd en en P rotei n molekü len befreit. Die Trockn u n g des beschichteten Substrats erfolgt vorzugsweise durch Behandlung mit Kompressionsluft. Für erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren sind Substrate verschiedener Struktur geeignet. Besonders vorteilhaft eignet sich das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren auch für poröse Substrate und ermöglicht einen homogenen geordneten Schichtaufbau auch innerhalb des schwer zugänglichen Porensystems. Bevorzugte Substrate sind metallische Substrate, siliziumhaltige Feststoffe (insbesondere Glas oder Siliziumwafer), keramische oder polymere Feststoffe (insbesondere Polytetrafluorethylen).
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird ein Substrat erzeugt, welches oberhalb der monolagigen proteinhaltigen Beschichtung eine Schicht aufweist, die das oder die Tenside enthält. Die auf der Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung vorliegende tensidhaltige Schicht schützt die Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung und das selbstassemblierende Protein vor thermischer und chemischer Beanspruchung (und wirkt daher als Schutzschicht). Die tensidhaltige Schicht ist bevorzugt durch koordinative Bindung an die Proteinschicht gebunden.
Für einige Anwendungen ist es erforderlich, die tensidhaltige Schutzschicht zu entfernen um die Zugänglichkeit der Proteine zu gewährleisten. Es wird in einem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren dafür vorzugsweise die auf der Oberfläche der auf dem Substrat befindlichen proteinhaltigen Beschichtung angeordnete tensidhaltige Schicht entfernt, wobei dafür bevorzugt im Anschluss an den Verfahrensschritt iii):
das beschichtete Substrat mehrmals unter mechanischer Einwirkung gewaschen wird und/oder
die Tensid-Schicht durch Pufferbehandlung in einer Fällungsreaktion entfernt wird.
Das oder die eingesetzten Tenside können entweder aus der im Schritt iii) vom beschichteten Substrat abgezogenen wässrigen Lösung durch bekannte Methoden (beispielsweise durch Fällung) wiedergewonnen werden und können dadurch nach einem Reinigungsschritt erneut verwendet werden.
Von der Erfindung ist auch ein Substrat mit einer proteinhaltigen Beschichtung mit einer Monolage m i n d e s t e n s e i n e s selbstassemblierenden Proteins umfasst. Das erfindungsgemäße Substrat weist
auf der Substratoberfläche eine Monolage mindestens eines selbstassemblierenden Proteins auf und
auf der Oberfläche der Monolage des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins befindet eine weitere Schicht, die mindestens ein ionisches Tensid enthält. Dabei liegt das Tensid mit dem selbstassemblierenden Protein in koordinativer Bindung vor. Vorzugsweise ist ein erfindungsgemäßes Substrat durch ein erfindungsgemäßes Beschichtungsverfahren erhältlich . Auf der Substratoberfläche ist somit zunächst die Monolage des mindestens einen selbstassemblierenden Proteins angeordnet und darauf befindet sich eine weitere, tensidhaltige Schicht.
Zur Beschichtung eines Substrats mit einer Bilage selbstassemblierender Proteine erfolgt das Verfahren mit folgenden Schritten: i. Bereitstellung einer proteinhaltigen Beschichtungslösung
ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der proteinhaltigen Lösung, iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats.
wobei zur Bereitstellung der Beschichtungslösung
a) aus einer wässrigen Lösung selbstassemblierender Proteine aggregierte Proteineinheiten so abgetrennt werden, dass in der Lösung bevorzugt Monomere oder Oligomere selbstassemblierender Proteine verbleiben b) durch Zugabe einer Lösung ionischer Tenside und/oder einer salzhaltigen und/oder alkalischen und/oder sauren Lösung
in der proteinhaltigen Beschichtungslösung Oligomere der selbstassemblierenden Proteine erzeugt und stabilisiert werden
wobei so viel ionisches Tensid zugesetzt wird, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven prädominanten Proteinoligomers von Tensidteilchen umhüllt wird.
Während des Inkontaktbringens oder davor wird eine mindestens ein ionisches Tensid enthaltende Lösung portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben, wobei nach der Zugabe die Tensidkonzentration cTensid in mol/l in folgendem Bereich liegt:
A 0, Prot ein wobei AO.FI d er G esa mtfläch e d er F l ü ssi g keitsinterphase entspricht, A0,pratein der Querschnittsfläche des Proteins (Kreisfläche), , VFi dem Gesamtvolumen der eingesetzten Flüssigkeit entspricht und NA die Avogadro-Konstante ist. A0,prateinoiigomere entspricht der Oberfläche prädominanter Proteinoligomere AD.TKG entspricht der Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), und Cprotein der eingesetzten Proteinkonzentration. Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird nur maximal so viel Tensid zugegeben, wie nötig ist, um die Interphasen der Lösung mit enthaltenen Proteinmolekülen mit einer Bilage zu umhüllen . Dafür wird so viel Tensid zu der Lösung aus a) zugegeben, dass d ie finale Konzentration des Tensids in mol/l nach der Zugabe zu r protein- und salzhaltigen Lösung in folgendem Bereich liegt:
(Z'ACJCF+X'AQl ^ JiO Protsi-Rmiiitims-r "V -rotsin PS
A0.PrO tsin ' ^ .^ - ™ifi - AO.TKC ' *Λ ' Prc ' >
Dabei sind: ■■■ Kontaktfläche der Flüssigkeit mit Substrat, AO,LI ■■■ verbleibende Interphase der Flüssigkeit, VFL ■■■ Volumen der Flüssigkeit, Ao,proteinmuitimer die Oberfläche prädominanter Proteinoligomere, AOJKG ■■■ Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), NProtein■■■ Anzahl an Proteinteilchen in Lösung, NA ... Avogadro-Konstante (NA = 6,022x1023 Teilchen/mol), x ... Multiplikationsfaktor. pK = 0,774, prc = 2,05.
Der eine Grenzbereich berücksichtigt, dass maximal so viel Tensid zugegeben wird, wie zur Stabilisierung von prädominanten Proteinoligomeren n otwen d ig ist. O berha l b ei n er kalkulierbaren Tensidkonzentration (rechter Grenzbereich von Formel 5) werden Proteinassemblate (sphärische oder Undefinierte Struktur) durch eine direkte Interaktion mit Tensidteilchen unter Abspaltung sphärischer Proteinteilchen zersetzt. Mit dem in Gleichung (5) angegebenen Zusammenhang wird berücksichtigt, dass die Tensidmenge, die zur Umhüllung der Hydrophobinmultimere e i n g e s e t zt w i rd , v o n d e r v e rf ü g b a re n Multimeroberfläche abhängt. Das Radienverhältnis pK des als ideale Kugel vorliegenden Proteinteilchens mit dem Trägheitsradius RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 0,774. Das Radienverhältnis prc aus dem Trägheitsradius des als Undefiniert strukturiert vorliegenden, aggregierten Hydrophobinmultimers RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 2,05. AOJKG wird durch Streuungsexperimente mit elektromagnetischen Wellen ermittelt oder wird der Literatur entnommen.
Im zweiten Grenzfall wird die ausgebildete Proteinbilage auf dem Substrat durch eine sich auflagernde Tensidschicht bedeckt und ein weiteres Anlagern von selbstassemblierenden Proteinen an der Interphase verhindert. Um eine geordnete Proteinbilage aufzubauen, steht jedem Proteinteilchen ein definierter Platz auf dem Substrat zur Verfügung. Um einem ungeordneten Aufwachsen der Proteinschicht entgegenzuwirken, müssen Kontaktstellen für weitere Proteintei lchen auf dem du rch eine Proteinbilage beschichteten Substrat durch Tensidteilchen blockiert werden . Durch den Zusatz einer Mindestkonzentration an Tensid (linker Grenzbereich von Formel 5) wird eine partielle Tensidschicht auf der vollständig ausgebildeten Proteinbilage ausgebildet und eine direkte Interaktion mit weiteren Proteinassemblaten unterbunden. Die Fläche Ao,protein entspricht dem Platzbedarf eines Proteinteilchens auf dem Substrat, die durch mindestens ein Tensidteilchen blockiert werden muss, um ein weiteres unkontrolliertes Aufwachsen der Proteinbilage zu verhindern. Ao,protein kann nach Gleichung 6 berechnet werden. Dabei ist RH,pratein■■■ Hydrodynamischer Radius des Proteins, der durch Streuungsexperimente mit elektromagnetischen Wellen ermittelt werden kann oder der Literatur zu entnehmen ist.
A 0,p ro TKG = π■ Ά Pro fein (6 )
Mit dem in Gleichung (5) angegebenen Zusammenhang wird berücksichtigt, dass die z u z u s etze n d e Te n s i d ko n ze n t ra ti o n , d i e z u r U n te rb i n d u n g e i n es we i te re n Schichtaufwachsens eingesetzt wird, von der gesamten, verfügbaren Interphase des zum Einsatz kommenden Flüssigkeitsvolumens abhängt. Die Kontaktfläche der Flüssigkeit mit dem Substrat und den restlichen angrenzenden Interphasen (AO,LI), berechnet sich hierbei aus deren geometrischen Parametern.
Unter Berücksichtigung, dass die Vorzugsorientierung der Tensidteilchen an Interphasen von deren Benetzbarkeit (hydrophil oder hydrophob) abhängig ist, wird in Gleichung (5) ein Korrekturterm x eingefügt, der vorzugsweise die Werte 1 und 2 annehmen kann. An hydrophil-hydrophilen Grenzflächen lagern sich Tensidteilchen vorzugsweise in einer Bilage auf dem Substrat an (x = 2). Hingegen dominiert an hydrophil-hydrophoben Grenzflächen vorzugsweise die Ausbildung einer Tensidmonolage (x = 1 ).
Das Inkontaktbringen der stabilisierten proteinhaltigen Beschichtungslösung mit der Oberfläche des Substrats im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren erfolgt bevorzugt für mindestens 15 min, vorzugsweise für maximal 48 Stunden. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C, besonders bevorzugt oberhalb des Krafft-Punktes (Krafft-Temperatur) des eingesetzten Tensids durchgeführt. Während dieses Verfahrensschritts lagern sich die Proteinoligomere geordnet in Form einer Proteinbilage auf der Oberfläche des Substrats ab. Anschließend wird die überstehende proteinhaltige Lösung vom Substrat entfernt, indem die Lösung vorzugsweise abgezogen wird. Anschließend wird die beschichtete Substratoberfläche durch mehrmaliges Spülen mit deionisiertem Wasser von überstehenden, nichtgebundenen Proteinmolekülen befreit. Alternativ zur Lagerung in wässrigen Lösungen, kann die Trocknung des beschichteten Substrats (Entfernung des Lösungsmittels) erfolgen; vorzugsweise durch Behandlung mit Kompressionsluft. Zur Besch ichtung eines Su bstrats m it einer Hyd rophobin-Bilage mindestens einer Hydrophobinart wird das Verfahren vorteilhaft mit folgenden Schritten geführt: i. Bereitstellung einer stabilisierten wässrigen Lösung, welche Hydrophobine mindestens einer Hydrophobinart enthält, indem a) die Hydrophobine in einer wässrigen Lösung bereitgestellt werden, und b) in Abhängigkeit der Ladung der Hydrophobine eine salzhaltige und/oder alkalische oder saure Lösung, zur Maskierung der Hydrophobinladungen oder zur Einstellung einer neutralen Nettoladung der Hydrophobine portionsweise und über einen Zeitraum von 1 bis 60 min zur Ausbildung von prädominanten Hydrophobinmultimeren zugegeben wird, ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der stabilisierten hydrophobinhaltigen Lösung, wodurch eine proteinhaltige Beschichtung auf dem Substrat erzeugt wird, wobei entweder während des Inkontaktbringens oder davor eine mindestens ein ionisches Tensid enthaltende Lösung portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung zugegeben wird, wobei nach der Zugabe die Tensidkonzentration cTensid in mol/l in folgendem Bereich liegt:
A 0, Prot ein wobei AO.FI der Gesamtfläche der Flüssigkeitsinterphase entspricht, A0,pratein der Querschnittsfläche des Proteins (Kreisfläche), , VFi dem Gesamtvolumen der eingesetzten Flüssigkeit entspricht und NA die Avogadro-Konstante ist. Ao,prateinmuitimer entspricht der Oberfläche prädominanter Hydrophobinmultimere, AD.TKG entspricht der Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), und cProtein der eingesetzten Hydrophobinkonzentration. iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats.
Prädominante Multimere bezeichnen Oligomere mit maximal 10 Proteineinheiten.
Mit diesem Beschichtungsverfahren ist es möglich, eine geordnete Bilage eines oder mehrerer "Fusions-Hyd rophobi n e" a uf der Oberfläche ei nes Su bstrates i n ei n em Verfahrensschritt gezielt zu erzeugen. Unter einer geordneten Schicht oder (geordneten) Bilage wird dabei im Sinne der Erfindu ng eine Hydrophobinschicht mit homogener Schichtdicke verstanden (relative Standardabweichung der Schichtdicke vorzugsweise maximal 30 %). Dabei entspricht die mittlere Dicke der Schicht der Ausdehnung zweier Moleküle des Hydrophobins.
Um den Aufbau einer homogenen Hydrophobinlage gewährleisten zu können müssen zwei gegenläufige Proteineigenschaften ausbalanciert werden. Die Assemblierung von Hydrophobinmonomeren basiert auf dem Zusammenspiel zweier unterschiedlicher physikalischer Größen. Zum Einen hängt die Assemblierung gleicher Hydrophobinmonomere stark von der Zugänglichkeit zweier separierter Hydrophobinbereiche ab, die sich in ihrer Polarisierbarkeit (Hydrophilie bzw. Hydrophobie) unterscheiden. Die Wechselwirkung zweier gleichartig polarisierbarer Bereiche von Hydrophobinteilchen führt dabei zu einer Anziehung zwischen den Hydrophobinteilchen, die von entgegengesetzt polarisierbaren Bereichen führt zu einer Abstoßung. Zum Anderen muss die elektrische Nettoladung der Hydrophobine berücksichtigt werden. Um eine Abstoßung gleichgeladener Hydrophobinteilchen zu verhindern, müssen die eingesetzten Hydrophobine eine neutrale Nettoladung aufweisen. Das erfi nd u ngsgemäßen Verfah ren erlau bt es, gezielt in d iese Wechselwirkungen einzugreifen und eine Substratbeschichtung mit einer definierten Hydrophobinbilage zu ermöglichen.
Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird zunächst eine stabilisierte wässrige Lösung, die mindestens eine Hydrophobinart enthält, bereitgestellt, wobei die Stabilisierung durch Zugabe zumindest eines Salzes, einer Lauge bzw. Säure erfolgt. Durch die Zugabe von Salzen, Laugen oder Säuren wird die Ausbildung von prädominanten Hydrophobinmultimeren unter der Kompensation von Proteinladungen gefördert.
D i e B e sc h i c h t u n g a uf d e m S u b st rat ka n n e i n e od e r m ehrere unterschiedliche Hydrophobinarten, innerhalb der Hydrophobin-Bilage enthalten. Es werden dazu eine Vielzah l von Molekü len ei nes defi n ierten Hyd rophobins oder daraus generierten Fusionsproteinen, eingesetzt. Alternativ dazu wird eine Mischung verschiedener selbstassemblierender Hydrophobine eingesetzt, beispielsweise eine Mischung eines Fusionsproteins, welches mindestens ein Hydrophobin enthält. Diese Moleküle der Hydrophobine werden zunächst in wässriger Lösung stabilisiert, anschließend wird eine geordnete Ausbildung prädominanter Assemblatstrukturen induziert und letztlich zur Beschichtung des Substrats eingesetzt.
Bei der Inkubation der hydrophobinhaltigen Lösung mit der in mehreren Portionen (in mindestens zwei, vorzugsweise mindestens drei Einzelportionen) dazu zugegebenen salzhaltigen Lösung gehen die Gegenionen mit den in der wässrigen Lösung enthaltenen Hydrophobine eine koordinative Bindung ein, so dass ein Hydrophobin-Gegenion-Komplex gebildet wird. Durch die Bildung des Hydrophobin-Gegenion-Komplexes wird die kontrollierte Bildung von Multimeren der Hydrophobine (Assemblate) ausgelöst und die proteinhaltige Lösung stabilisiert. Unter der Stabilisierung ist somit im Sinne der Erfindung die Verhinderung einer unkontrollierten Zusammenlagerung von Hydrophobinen in wässrigen Lösungen zu verstehen. Es ist mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, stabilisierte Lösungen mit Hydrophobinmultimeren (vorzugsweise Dimere oder Tetramere) herzustellen. Die mit einem erfindungsgemäßen Verfahren erhältlichen stabilisierten wässrigen Lösungen sind zur Beschichtung von Substraten verwendbar.
Vor Zugabe des Salzes, der Lauge oder Säure beträgt die Konzentration der mindestens einen Hydrophobinart in der unstabilisierten wässrigen Lösung bevorzugt mindestens 50 ng/μΙ, besonders bevorzugt mindestens 90 ng/μΙ. Die unstabilisierte wässrige Lösung, die die mindestens eine selbstassemblierende Hydrophobinart enthält, weist vorzugsweise einen pH-Wert von 7 bis 9,5 auf. Bevorzugt handelt es sich dabei um eine gepufferte Lösung.
Um eine neutrale Nettoladung der Hydrophobine einzustellen, werden im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren zur Bereitstellung der stabilisierten Proteinlösung vorzugsweise positiv geladene Metallionen oder Anionen, bevorzugt in Form einer wässrigen Lösung zugesetzt. Durch die Bildung von Hydrophobin-Ion-Komplexen werden Hydrophobinladungen maskiert und die Ausbildung von prädominanten Hydrophobinmultimeren begünstigt. Besonders bevorzugt sind Lösungen mit zweiwertigen Metallionen, die eine hohe lonenstärke aufweisen, insbesondere Erdalkalimetallionen, die in der Form wasserlöslicher Salze eingesetzt werden, vorzugsweise in Form von Chloriden, Nitraten, Carbonaten, Acetaten, Citraten, Gluconaten , Hydroxiden , Lactaten, Sulfaten, Succinaten oder Tartraten. Besonders bevorzugt sind anorganische Anionen, insbesondere Halogenide, Hydroxide, Nitrate, Carbonate, Sulfate, Phosphate aber auch organische Anionen, insbesondere Acetate, Citrate, Succinate oder Tartrate, die als Gegenionen Alkalimetalle aufweisen. Die Konzentration der Metallionen oder Anionen in der wässrigen Lösung beträgt vorzugsweise 0,01 mmol/l bis 10 mmol/l, bevorzugt 0,1 mmol/l bis 5 mmol/l und besonders bevorzugt 0,5 mmol/l bis 2 mmol/l. Alternativ kann durch den Zusatz von Laugen oder Säuren der pH-Wert in Richtung des isoelektrischen Punktes der eingesetzten Hydrophobine verschoben werden. Durch beide Behandlungsschritte kann vorteilhaft beim Einsatz von Fusionsproteinen, die mindestens eine selbstassemblierende und mindestens eine funktionelle Domäne enthalten, im anschließenden Beschichtungsschritt eine Orientierung der funktionellen Domäne auf die vom Substrat abgewandte Seite unterstützt werden. Die Zugabe erfolgt portionsweise, vorzugsweise in gleichen Portionen und vorzugsweise in mindestens zwei Teilen, besonders bevorzugt in 3 Portionen und über einen Zeitraum von 1 bis 60 min, um eine unkontrollierte Hydrophobinaggregation zu unterbinden.
Während des Inkontaktbringens des Substrates oder davor werden der protein- und salzhaltigen Lösung Lösungen ionischer Tenside, vorzugsweise kationische und/oder anionische Tenside, zugesetzt. Diese Tenside weisen einen hydrophilen Molekülteil (hierin auch als„Tensidkopfgruppe" bezeichnet) und einen hydrophoben Molekülteil auf. Für die Erzeu g u n g ei n er P rotei n bi lage a uf d em Su bstrat wi rd d u rch Zu ga be ei ner Ten sid- enthaltenden Lösung eine Tensidkonzentration eingestellt, die bevorzugt mindestens 1 μηηοΙ/Ι und maximal 500 μηηοΙ/Ι, besonders bevorzugt maximal 100 μηηοΙ/Ι entspricht.
Mit dem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren wird nur maximal so viel Tensid zugegeben, wie nötig ist, um die Interphasen der Lösung mit enthaltenen Proteinmolekülen mit einer Bilage zu umhüllen . Dafür wird so viel Tensid zu der Lösung aus b) zugegeben, dass d ie fi nale Konzentration des Tensids in mol/l nach der Zugabe zur protein- und salzhaltigen Lösung in folgendem Bereich liegt:
Dabei sind: ■■■ Kontaktfläche der Flüssigkeit mit Substrat, AO,LI ■■■ verbleibende Interphase der Flüssigkeit, VFL ■■■ Volumen der Flüssigkeit, Ao,proteinmuitimer die Oberfläche prädominanter Hydrophobinmultimere, Ao, TKG ■■■ Querschnittsfläche der Tensidkopfgruppe (Kreisfläche), NProtein■■■ Anzahl an Proteinteilchen in Lösung, NA ... Avogadro-Konstante (NA = 6,022x1023 Teilchen/mol), x ... Multiplikationsfaktor. pK = 0,774, prc = 2,05,
Der eine Grenzbereich berücksichtigt, dass maximal so viel Tensid zugegeben wird, wie zum Aufbruch von prädomi nanten Hyd rophobin m u ltimeren notwend ig ist. Oberhal b ei ner kalkulierbaren Ten si d konzentration (rechter G renzbereich von Formel 5) werden Hydrophobinassemblate (sphärische oder Undefinierte Struktur) durch eine direkte Interaktion mit Tensidteilchen unter Abspaltung sphärischer Hydrophobinteilchen zersetzt. Mit dem in Gleichung (5) angegebenen Zusammenhang wird berücksichtigt, dass die Tensidmenge, d ie zur U mh üll ung der Hydrophobinm ulti mere eingesetzt wird , von der verfügbaren Multimeroberfläche abhängt. Das Radienverhältnis pK des als ideale Kugel vorliegenden Hydrophobinteilchens mit dem Trägheitsradius RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 0,774. Das Radienverhältnis prc aus dem Trägheitsradius des als Undefiniert strukturiert vorliegenden, aggregierten Hydrophobinmultimers RG zum hydrodynamischen Radius des Proteinmoleküls RH beträgt 2,05. AOJKG wird durch Streuungsexperimente mit elektromagnetischen Wellen ermittelt oder wird der Literatur entnommen.
Im zweiten Grenzfall wird die ausgebildete Proteinbilage auf dem Substrat durch eine sich auflagernde Tensidschicht bedeckt und ein weiteres Anlagern von Hydrophobinen an der Interphase verhindert. Um eine geordnete Hydrophobinbilage aufzubauen, steht jedem Hydrophobinteilchen ein definierter Platz auf dem Substrat zur Verfügung. Um einem ungeordneten Aufwachsen der Hydrophobinschicht entgegenzuwirken, müssen Kontaktstellen für weitere Hydrophobinteilchen auf dem, durch eine Hydrophobinbilage beschichteten Substrat durch Tensidteilchen blockiert werden. Durch den Zusatz einer Mindestkonzentration an Tensid (linker Grenzbereich von Formel 5) wird eine partielle Tensidschicht auf der vollständig ausgebildeten Hydrophobinbilage ausgebildet und eine direkte Interaktion mit weiteren Hydrophobinassemblaten unterbunden. Die Fläche Ao,protein entspricht dem Platzbedarf eines Hydrophobinteilchens auf dem Substrat, die durch mindestens ein Tensidteilchen blockiert werden muss, um ein weiteres unkontrolliertes Aufwachsen der Hydrophobinbilage zu verhindern . Ao,protein kann nach Gleichung 6 berechnet werden. Dabei ist RH,pratein ■■■ Hydrodynamischer Radius des Hydrophobins, der durch Streuungsexperimente mit elektromagnetischen Wellen ermittelt werden kann oder der Literatur zu entnehmen ist.
A 0,p ro TKG = π■ Ά Pro fein (6 )
Mit dem in Gleichung (5) angegebenen Zusammenhang wird berücksichtigt, dass die zuzusetzende Tensidkonzentration, die zur Unterbindung eines weiteren Schichtaufwachsens eingesetzt wird, von der gesamten, verfügbaren Interphase des zum Einsatz kommenden Flüssigkeitsvolumens abhängt. Die Kontaktfläche der Flüssigkeit mit dem Substrat und den restlichen angrenzenden Interphasen (AO,LI), berechnet sich hierbei aus deren geometrischen Parametern.
Unter Berücksichtigung, dass die Vorzugsorientierung der Tensidteilchen an Interphasen von deren Benetzbarkeit (hydrophil oder hydrophob) abhängig ist, wird in Gleichung (5) ein Korrekturterm x eingefügt, der vorzugsweise die Werte 1 und 2 annehmen kann. An hydrophil-hydrophilen Grenzflächen lagern sich Tensidteilchen vorzugsweise in einer Bilage auf dem Substrat an (x = 2). Hingegen dominiert an hydrophil-hydrophoben Grenzflächen vorzugsweise die Ausbildung einer Tensidmonolage (x = 1 ).
Das Inkontaktbringen der stabilisierten hydrophobinhaltigen Lösung mit der Oberfläche des Substrats im erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren erfolgt bevorzugt für mindestens 15 min, vorzugsweise für maximal 48 Stunden. Dieser Verfahrensschritt wird vorzugsweise bei einer Temperatur von 15 bis 70 °C, besonders bevorzugt oberhalb des Krafft-Punktes (Krafft-Te m p e rat u r) d es e i n g e setzte n Tensids durchgeführt. Während dieses Verfahrensschritts lagern sich die Hydrophobinassemblate geordnet in Form einer Proteinbilage auf der Oberfläche des Substrats ab. Anschließend wird die überstehende proteinhaltige Lösung vom Substrat entfernt, indem die Lösung vorzugsweise abgezogen wird. Anschließend wird die beschichtete Substratoberfläche durch mehrmaliges Spülen mit deionisiertem Wasser von überstehenden , nichtgebundenen Proteinmolekülen befreit. Alternativ zur Lagerung in wässrigen Lösungen, kann die Trocknung des beschichteten Substrats (Entfernung des Lösungsmittels) erfolgen; vorzugsweise durch Behandlung mit Kompressionsluft.
Für das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren sind Substrate verschiedener Struktur geeignet. Besonders vorteilhaft eignet sich das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren auch für poröse Substrate und ermöglicht einen homogenen geordneten Schichtaufbau auch innerhalb des schwer zugänglichen Porensystems. Bevorzugte Substrate sind metallische Substrate, siliziumhaltige Feststoffe (insbesondere Glas oder Siliziumwafer), keramische oder polymere Feststoffe (insbesondere Polytetrafluorethylen).
Durch das erfindungsgemäße Beschichtungsverfahren wird ein Substrat erzeugt, welches oberhalb der bilagigen proteinhaltigen Beschichtung eine Schicht aufweist, die das oder die Tenside enthält. Die auf der Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung vorliegende tensidhaltige Schicht schützt die Oberfläche der proteinhaltigen Beschichtung und das Hydrophobin vor thermischer und chemischer Beanspruchu ng (und wirkt daher als Schutzschicht). Die tensidhaltige Schicht ist bevorzugt durch koordinative Bindung an die Proteinschicht gebunden.
Für einige Anwendungen ist es erforderlich, die tensidhaltige Schutzschicht zu entfernen, um die Zugänglichkeit der Proteine zu gewährleisten. Es wird in einem erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahren dafür vorzugsweise die auf der Oberfläche der auf dem Substrat befindlichen hydrophobinhaltigen Beschichtung angeordnete tensidhaltige Schicht entfernt, wobei dafür bevorzugt im Anschluss an den Verfahrensschritt ii): das beschichtete Substrat mehrmals unter mechanischer Einwirkung gewaschen wird und/oder
die Tensid-Schicht durch Pufferbehandlung in einer Fällungsreaktion entfernt wird.
Das oder die eingesetzten Tenside können entweder aus der im Schritt iii) vom beschichteten Substrat abgezogenen wässrigen Lösung du rch bekannte Methoden (beispielsweise durch Fällung) wiedergewonnen werden und können dadurch nach einem Reinigungsschritt erneut verwendet werden.
Als Hydrophobine werden Hydrophobine der Klasse I, vorzugsweise Ccg2 aus Neurospora crassa, oder Hydrophobine der Klasse II, vorzugsweise HFBI oder HFBII aus Trichoderma reesei eingesetzt.
Besonders vorteilhaft ist die Erfindung für funktionalisierte Hydrophobine geeignet, da durch den geordneten Schichtaufbau von Bilagen des funktionalisierten Hydrophobins die Zugänglichkeit der Funktionalisierung sichergestellt werden kann. Es ist vorteilhaft möglich, die Beschichtung des Substrats so durchzuführen, dass die Funktionalisierung auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung vorliegt.
Vorzugsweise wird als Hydrophobin ein rekombinantes Fusionsprotein eingesetzt, das mindestens zwei Domänen umfasst, wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist und eine Domäne eine funktionelle Domäne oder selbstassemblierende Proteindomäne ist.
Bevorzugt ist das Hydrophobin daher ein rekombinantes Fusionsprotein, also ein Protein, welches von gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wird. Durch Fusion der Gene zweier oder mehr natürlicherweise nicht in dieser Kombination vorliegender Proteindomänen, die üblicherweise über flexible Linkerstrukturen (Linkerpeptide) miteinander verbunden sind, ist durch Expression des fusionierten Gens das rekombinante Fusionsprotein erhältlich. Für die heterologe Genexpression ist der künstlich generierte Leserahmen des DNA-Konstrukts in 5'-Position durch einen wirtsspezifischen Promotor und in 3 '-Position durch einen Terminator flankiert. Ein in der Erfindung eingesetztes rekombinantes Fusionsprotein umfasst mindestens zwei Domänen, wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist (bevorzugt ausgewählt aus den oben genannten Hydrophobinen) und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist. Bevorzugte funktionelle Domänen sind fluoreszierende Proteindomänen, katalytische Domänen oder Proteindomänen mit Enzymaktivität. Zur Generierung eines Doppelhydrophobins können auch andere Hydrophobine als Fusionsdomäne fungieren. Die Wahl geeigneter Fusionspartnerteile ist hierbei nicht auf Proteine bestimmter Organismen beschränkt. Für eine selektive Isolierung der Fusionsproteine aus dem Zelllysat kann die Aminosäuresequenz im N- und/oder C- terminalen Bereich zudem eine 1 -20 Aminosäure umfassende Affinitätsdomäne aufweisen, diese können als spezifische Ankergruppe mit komplementären Gruppen an festen Trägern interagieren. Die mindestens eine Hydrophobinart enthaltende wässrige Lösung, zu der die salzhaltigen, basischen und/oder sauren sowie tensidhaltigen Lösungen zugegeben werden, enthält in einer Ausführungsvariante Mischungen unterschiedlicher Hydrophobinarten, vorzugsweise mindestens eine funktionalisierte Hydrophobinart in Kombination mit mindestens einer nicht- funktionalisierten Hydrophobinart. Dadurch wird die Stabilität der proteinhaltigen Beschichtung verbessert. Diese Ausführungsvariante ist besonders für funktionalisierte Hydrophobine mit großen funktionellen Domänen vorteilhaft, um die Wechselwirkung zwischen assemblierenden Domänen unterschiedlicher Proteinmoleküle zu ermöglichen.
In einem erfindungsgemäßen beschichteten Substrat, welches als Hydrophobin rekombinantes Fusionsprotein enthält, ist die funktionelle Domäne des rekombinanten Fusionsproteins bevorzugt auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die Hydrophobindomäne des rekombinanten Fusionsproteins ist auf der dem Substrat zugewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die Beschichtung, die mindestens ein Tensid enthält ist somit in diesem Fall oberhalb der funktionellen Domäne des rekombinanten Fusionsproteins angeordnet.
Als Tensid wird ein anionisches oder kationisches Tensid eingesetzt, vorzugsweise ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB).
Von der Erfindung ist auch ein Verfahren zur Stabilisierung von Monomeren mindestens eines selbstassemblierenden Proteins in einer wässrigen Lösung umfasst (hierin auch „Stabilisierungsverfahren"). Bei dem erfindungsgemäßen Stabilisierungsverfahren wird a) mindestens ein selbstassemblierendes Protein mit einer wässrigen Lösung, vorzugsweise einer wässrigen Pufferlösung, versetzt, und anschließend
b) in Abwesenheit von Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind, eine wässrige Lösung enthaltend mindestens ein ionisches Tensid portionsweise zu der proteinhaltigen Lösung aus a) zugegeben, wobei nach der Zugabe die finale Tensidkonzentration cTensid in mol/l in folgendem Bereich liegt: 5,297,
wobei A0,Protein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins entspricht, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids entspricht und Cprotein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in mol/l entspricht.
Weitere Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Stabilisierungsverfahrens sind analog zu den Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Beschichtungsverfahrens. Eine, vorzugsweise durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche, stabilisierte wässrige proteinhaltige Lösung, welche mindestens ein selbstassemblierendes Protein und mindestens ein Tensid enthält, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung (die Bezeichnungen „stabilisierte wässrige Lösung" und „stabilisierte Monomere in wässriger Lösung" werden hierin synonym verwendet). Bevorzugt sind stabilisierte Proteinmonomerlösungen.
Die erfindungsgemäße stabilisierte wässrige Lösung enthält mindestens ein selbstassemblierendes Protein, mindestens ein ionisches Tensid und enthält keine Substanzen, die zur Spaltung von Disulfidbrücken geeignet sind (maximal 0,01 Gew.-% bezogen auf das selbstassemblierende Protein, vorzugsweise maximal 0,0001 Gew.%). In der erfindungsgemäßen wässrigen Lösung liegen Monomere des selbstassemblierenden Proteins in koordinativer Bindung mit dem ionischen Tensid vor (Protein-Tensid-Komplex). Die Tensidkonzentration cTensid in mol/l in der wässrigen Lösung liegt in folgendem Bereich:
■ 0,516 < cTensid < ■ 5,297
Dabei entspricht A0,pratein der Oberfläche eines Moleküls des selbstassemblierenden Proteins, ATKG der Querschnittsfläche der Kopfgruppe des Tensids und Cprotein der Konzentration des selbstassemblierenden Proteins in mol/l.
Zur Erfindung gehört auch ein Substrat mit einer Beschichtung einer Hydrophobinbilage , auf dessen Substratoberfläche sich eine Bilage mindestens einer Hydrophobinart befindet, wobei auf der Oberfläche der Hydrophobinbilage sich eine Schicht befindet, die mindestens ein ionisches Tensid enthält, wobei das Tensid mit dem Hydrophobin der Oberfläche der Bilage in koordinativer Bindung vorliegt. Dabei sind die Hydrophobine der mindestens einen Hydrophobinart bevorzugt rekombinante Fusionsproteine, die mindestens zwei Domänen umfassen, wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist und eine Domäne eine funktionelle Domäne oder selbstassemblierende Proteindomäne ist, wobei die funktionelle Domäne auf der vom Substrat abgewandten Seite der Hydrophobin-haltigen Beschichtung angeordnet ist.
Das Substrat ist bevorzugt ein metallischer, siliziumhaltiger, keramischer oder ein polymerer Feststoff.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen stabilisierten proteinhaltigen Lösung zur Beschichtung von Substratoberflächen mit einer Monolage eines selbstassemblierenden Proteins. Nachfolgende Ausgestaltungen sind für die Erfindung bevorzugt:
Das selbstassemblierende Protein ist bevorzugt ausgewählt aus Hydrophobinen und Surface Layer Proteinen (S-Layer-Proteinen). Bevorzugte Hydrophobine sind Hydrophobine der Klasse I, vorzugsweise Ccg2 aus Neurospora crassa, oder Hydrophobine der Klasse II, vorzugsweise HFBI oder HFBII aus Trichoderma reesei. Bevorzugte S-Layer-Proteine sind SbsC aus Bacillus stearothermophilus, S13240 aus Bacillus stearothermophilus oder SslA aus Sporosarcina ureae.
Besonders vorteilhaft ist die Erfindung für funktionalisierte selbstassemblierende Proteine geeignet, da durch den geordneten Schichtaufbau von Monolagen des funktionalisierten selbstassemblierenden Proteins die Zugänglichkeit der Funktionalisierung sichergestellt werden kann. Es ist vorteilhaft möglich, die Beschichtung des Substrats so durchzuführen, dass die Funktionalisierung auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung vorliegt.
Bevorzugt ist das selbstassemblierende Protein daher ein rekombinantes Fusionsprotein, also ein Protein, welches von gentechnisch veränderten Organismen hergestellt wird. Durch Fusion der Gene zweier oder mehr natürlicherweise nicht in dieser Kombination vorliegender Proteindomänen, die üblicherweise über flexible Linkerstrukturen (Linkerpeptide) miteinander verbu n d en s i n d , i st d u rch Expression des fusionierten Gens das rekombinante Fusionsprotein erhältlich. Ein in der Erfindung eingesetztes rekombinantes Fusionsprotein umfasst mindestens zwei Domänen , wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist (bevorzugt ausgewählt aus den oben genannten selbstassemblierenden Proteinen) und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist. Bevorzugte funktionelle Domänen sind fluoreszierende Proteindomänen, katalytische Domänen oder Proteindomänen mit Enzymaktivität.
Die mindestens ein selbstassemblierendes Protein enthaltende wässrige Lösung, zu der die tensidhaltige Lösung zugegeben wird, enthält in einer Ausführungsvariante Mischungen sel bstassem blierender Protei ne, vorzugsweise m indestens ei n fu n ktional isiertes selbstassemblierendes Protein in Kombination mit mindestens einem nicht-funktionalisierten selbstassemblierenden Protein. Dadurch wird die Stabilität der proteinhaltigen Beschichtung verbessert. Diese Ausführungsvariante ist besonders für funktionalisierte selbstassemblierende Proteine mit großen fu nktionellen Domänen vorteilhaft, um die Wechselwirkung zwischen assemblierenden Domänen unterschiedlicher Proteinmoleküle zu ermöglichen.
In einem erfindungsgemäßen beschichteten Substrat, welches als selbstassemblierendes Protein rekombinantes Fusionsprotein enthält, ist die funktionelle Domäne des rekombinanten Fusionsproteins bevorzugt auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die selbstassemblierende Proteindomäne des rekombinanten Fusionsproteins i st a uf d er d em S u bstrat zu gewa n dten S ei te d er proteinhaltigen Beschichtung angeordnet. Die Beschichtung, die mindestens ein Tensid enthält, ist somit in diesem Fall oberhalb der funktionellen Domäne des rekombinanten Fusionsproteins angeordnet.
Das Tensid ist ein anionisches oder kationisches Tensid, vorzugsweise ausgewählt aus Natriumdodecylsulfat (SDS) und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB).
Die Erfindung bietet den Vorteil, stabilisierte Monomerlösungen von selbstassemblierenden Proteinen bereitzustellen, in denen die unkontrollierte Aggregation der Proteine unterbunden ist. Durch gezielte Monomerisierung und Stabilisierung der Lösung können diese zur positionsunabhängigen Beschichtung von Substratoberflächen eingesetzt werden.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Fig. 1 REM-Aufnahme eines mit einer Monolage des S-Layer Proteins SbsC-(R5P)2 aus Bacillus stearothermophilus beschichteten Siliziumwafers mit aufgelagerter SDS- Schicht. Die homogenen Bereiche links und rechts zeigen die Protein-Monolage, von der die SDS-Schicht (in der Mitte zu sehen) entfernt wurde.
Fig. 2 AFM-Aufnahme eines mit einer Monolage des Klasse 1 Hydrophobins Ccg-2 aus Aspergillus nidulans beschichteten Siliziumwafers nach Entfernung der SDS-Schicht mit frei liegender Protein-Monolage.
Fig. 3 Höhenprofil eines mit einer Monolage des Klasse 1 Hydrophobins Ccg-2 aus Aspergillus nidulans beschichteten Siliziumwafers, ermittelt durch AFM.
Ausfü h ru ngs beis piel 1 : Expressi on rekom bi nanter sel bstassemb l ierender Fusionsproteine in E. coli und Aufreinigung
Es wurden die in Tabelle 1 genannten rekombinanten Fusionsproteine generiert, welche jeweils N-terminal die selbstassemblierende Proteindomäne enthalten und C-terminal eine darin bezeichnete funktionelle Domäne enthalten. Tabelle 1 :
Fusionsprotein Selbstassemblierende Domäne Funktionelle Domäne
HFBI-(R5P)2 Klasse II Hydrophobin Untereinheit des Silaffins
HFBI (Trichoderma reesei) (Cylindrotheca fusiformis)
HFBI- Klasse II Hydrophobin Verkürzte Untereinheit des (XSR5P)3 HFBI (Trichoderma reesei) Silaffins (Cylindrotheca fusiformis)
Ccg2-HA Klasse I Hydrophobin Human influenza hemaglutinin- Ccg2 (Neurospora crassa) Tag
S13240-HA S-Layer Protein Human influenza hemaglutinin-
$> ?>2W(Geobacillus Tag
stearothermophilus)
SbsC-HA S-Layer Protein Human influenza hemaglutinin- SbsC {Geobacillus Tag
stearothermophilus)
SbsC-(R5P)2 S-Layer Protein Untereinheit des Silaffins
SbsC {Geobacillus (Cylindrotheca fusiformis) stearothermophilus)
SbsC- S-Layer Protein Verkürzte Untereinheit des (XSR5P)3 SbsC {Geobacillus Silaffins (Cylindrotheca stearothermophilus) fusiformis)
SslA S-Layer Protein keine funktionelle Domäne
SslA (Sporosacina ureae)
Dazu wurden die für die jeweilige Domäne kodierenden DNA Sequenzen mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) amplifiziert und über eine overlap PCR wurde ein Fusionsgen zusammengefügt. Die verwendeten flankierenden Primer enthielten Erkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen Nde\ und Xho\. Nach Vektor- und Fragmentrestriktion über die entsprechenden Endonukleasen, Ligation und Transformation in Escherichia coli (£. coli) als Wirtsorganismus, wurde die Anwesenheit des Fusionsgens in den generierten Plasmiden überprüft.
Für die Produktion des das selbstassemblierende Protein enthaltenden Fusionsproteins, wurden die Plasmide, die das generierte Fusionsgen korrekt enthielten, in den £ coli Stamm SHuffle® T7 Express transformiert. Das Fusionsprotein wird in den Bakterienzellen intrazellulär angereichert.
Die transformierten £ coli Zellen wu rden bei 30 °C ku ltiviert. Die Expression des Fusionsgens wurde durch Zugabe von 0,4 mM (mmol/l) I PTG induziert. Nach 4-6 h wurden die Zellen mittels Zentrifugation (bei 4000 x g, 4°C, 1 0 min) pelletiert. Nach zweimaligem Waschen des Zellpellets mit 50 mM Trispuffer (pH 7,5) wurden die Zellen erneut durch Zentrifugation pelletiert. Zum Zellaufschluss wurden die £. coli Zellen einer dreifachen Ultraschallbehandlung (9 eye , 70 %, 4°C, 2 min) und einer anschließenden dreimaligen French Press-Behandlung (20Ό00 psi) unterzogen. Die aufgeschlossenen Bakterienzellen wurden zweimal mit 50 mM Trispuffer (pH 7,5) gewaschen. Zur Proteinextraktion wurden die aufgeschlossenen Zellen in 1 ml Lysepuffer aufgenommen und bei 23 °C für 30 min inkubiert. Die Reinigung des Fusionsproteins erfolgte mittels Nickelaffinitätschromatographie. Die Elution des Fusionsproteins erfolgte in einem isotyp zusammengesetzten Phosphatpuffer (pH 4,5) mit 250 mM Imidazol.
Um das Protein in einen aktiven Zustand zu überführen, wurde das erhaltene Eluat gegen das 4000fache Volumen eines Dialysepuffers bei 4 °C für maximal 48 h dialysiert. Zur Dialyse von Hydrophobinen wurde ein Tris-Puffer (50 m M, pH 8,5 mit 1 mM Glutathion reduziert und 0,2 mM Glutathion oxidiert) verwendet. Zur Dialyse von Surface-Layer- Proteinen wurde 10 mM Tris-Puffer (pH 9,0) als Dialysepuffer eingesetzt.
Ausführungsbeispiel 2: Erzeugung einer Proteinmonolage auf einem Siliziumwafer
Es wurde eine geordnete Proteinmonolage eines selbstassemblierenden Proteins, wie in Ausführungsbeispiel 1 erhalten, auf einem Siliziumwafer generiert. Dazu wurde das Fusionsprotein HFBI-(XSR5P)3 eingesetzt, welches als selbstassemblierende Domäne ein Klasse I Hydrophobin (HFBI aus Trichoderma reesei) enthält und als funktionelle Domäne ein Human influenza hemaglutinin-Tag enthält.
Es wurde zunächst zur Sedimentierung größerer Proteinaggregate eine Zentrifugation durchgeführt (1 5 min bei 1 8000 x g, 4°C) und die Proteinkonzentration bestimmt (nach Lowry). Das Sediment wurde in 50 mM Trispuffer pH 8,5 aufgenommen. Es wurde eine Proteinkonzentration von 100 ng/μΙ eingestellt.
Zu dieser proteinhaltigen Lösung wurde eine filtrierte 8 mM Natriumdodecylsulfat (SDS) in vier Einzelportionen über einen Zeitraum von 10 min zugegeben. Für HFBI-(XSR5P)3 betrug die zugegebene Tensidstoffmenge je Liter der auf eine Proteinkonzentration von 100 ng/μΙ eingestellten Lösung 2 mmol, so dass eine finale Tensidkonzentration von 2 mmol/l in der Lösung eingestellt wurde.
Aus Gleichung (3) ergibt sich eine einzustellende Tensidstoffkonzentration bei einer 100 ng/μΙ Proteinlösung zwischen 0,5 mmol/l und 5,6 mmol/l. Das selbstassemblierende Fusionsprotein HFBI-(XSR5P)3 hat ein Molekulargewicht von etwa 14000 g/mol. Bei einer Proteinkonzentration von 100 ng/μΙ in der Lösung beträgt die Konzentration in mol/l entsprechend 7,14 *10"6 mol/l. Die Tensidkopfgruppe des eingesetzten SDS-Moleküls weist eine effektive Fläche von ATKG von 0,62 nm2 auf. Das Proteinmolekül weist einen hydrodynamischen Radius RH von 2,7 nm auf. Daraus ergibt sich aus Gleichung (4) eine Proteinoberfläche Ao,pratein = 91 ,6 nm2.
Die auf diese Weise erhaltene stabilisierte Lösung war klar und für mindestens fünf Tage bei Lagerung bei 20 °C stabil. Die stabilisierte Lösung, die Monomere des selbstassemblierenden Proteins enthält, wurde zur Beschichtung eines Siliziumwafers mit den Kantenlängen 1 x 1 cm eingesetzt. Dazu wurden 100 μΙ der stabilisierten proteinhaltigen Lösung auf den Siliziumwafer aufgebracht und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde die überstehende Lösung abgezogen und der mit HFBI-(XSR5P)3 beschichtete Siliziumwafer in filtriertem bidestillierten Wasser gewaschen. Die Lagerung des beschichteten Siliziumwafers erfolgte in dem in Ausführungsbeispiel 1 genannten Dialysepuffer.
Die abgezogene stabilisierte Proteinlösung konnte anschließend für weitere Beschichtungsverfahren eingesetzt werden.
Um die funktionelle Domäne des selbstassemblierenden Fusionsproteins auf dem Substrat zugänglich zu machen, wurde verbleibendes Tensid vom beschichteten Substrat mittels Fällungsreaktion entfernt.
Ausführungsbeispiel 3: Charakterisierung der in Ausführungsbeispiel 2 hergestellten Beschichtung mit HFBI-(XSR5P)3 auf einem Siliziumwafer mittels Ellipsometrie
Der in Ausführungsbeispiel 2 erhaltene beschichtete Siliziumwafer wurde ellipsometrisch untersucht (Multiskop von Firma OPTREL (Berlin)). Es wurde die Änderung der Polarisationsebene eines monochromatischen Laserstrahls (Wellenlänge 632,8 nm) durch Reflexion in einem Winkel von 136° ermittelt. Durch Intensitätsmessung der senkrecht (Rs) und parallel (Rp) reflektierten Einfallsebenen des polarisierten Lichtstrahls wurde das Intensitätsverhältnis (p) bestimmt. Die ellipsometrischen Winkel Δ und Ψ werden über die FRENSELschen Formeln abgeleitet. U nter Ein berech nu ng der Brechu ngsindizes der einzelnen Lagen wurde die Schichtdicke der obersten Lage kalkuliert.
IL
R, I Rs \
Dabei geben δρ und 5S die Phasenverschiebung zum Nullpunkt von parallel und senkrecht polarisiertem Licht an. Es wurden die aus der Literatur bekannten optischen Konstanten für Silizium als Substrat und Siliziumdioxid eingesetzt. Als Brechungsindex des Proteinfilms wurde 1 ,375 eingesetzt.
Die ermittelte Schichtdicke von HFBI-(XSR5P)3auf dem Siliziumwafer betrug 13,2 ± 0,2 A. Dies entspricht den Literaturwerten für eine Monolage des selbstassemblierenden Proteins.
Die folgende Tabel le 2 zeigt d ie el l ipsometrischen Daten einer Analyse von vier unterschiedlichen Proben (1 bis 4, die unterschiedlichen Werte in den einzelnen Zeilen wurden an unterschiedlichen Messpunkten auf der jeweiligen Probe aufgenommen): Tabelle 2:
1 2 3 4
□Si02 [°] 175,87 175,772 175,761 175,879
dSi02 [Ä] 16,5 17,0 17,0 16,5
173,216 173,172 173,138 173,168
173,26 173,297 173,138 173,509
173,324 173,09 173,362 173,166
173,334 173,21 1 173,45
173,37 173,096 173,436
173,06
Π Protein [°] 173,301 173,154 173,213 173,346
0,062 0,090 0,129 0,166 Mittelwert Standardabweichung d Protein [A] 13,2 13,4 13,1 13 13,2 0,2
Ausführungsbeispiel 4: Rasterelektronenmikroskopie (REM) eines mit SbsC-(R5P)2 beschichteten Siliziumwafers
Es wurde ein Siliziumwafer analog zu Ausführungsbeispiel 2 mit dem selbstassemblierenden Protein SbsC-(R5P)2 (Tabelle 1 ) beschichtet. Der erhaltene beschichtete Siliziumwafer wurde mittels REM (Zeiss DSM 982 Gemini) untersucht. Für die Analyse wurde der beschichtete Siliziumwafer getrocknet und anschließend mit einer atomaren Goldschicht bedampft. Die Ergebnisse der REM-Analyse sind in Fig. 1 dargestellt. Helle Bereiche zeigen darin die Proteinschicht mit einer aufgelagerten SDS-Schicht. Die dunklen Bereiche zeigen das Protein als Monolage, von der die SDS-Schicht entfernt worden ist.
Ausführungsbeispiel 5: Rasterkraftmikroskopie (AFM) eines mit Ccg2-HA beschichteten Siliziumwafers
Ein analog zu Ausführungsbeispiel 2 mit Ccg2-HA beschichteter Siliziumwafer wurde im wässrigen Milieu mittels AFM untersucht. Die Ergebnisse der AFM-Analyse sind in Fig. 2 dargestellt. Es ist eine gleichmäßige Protein-Monolage zu erkennen. Die Ccg2- Röhrenstrukturen weisen eine Länge von etwa 100 nm auf (Fig. 2, helle Bereiche). Aus dem Höhenprofil (Fig. 3) ist ersichtlich, dass die selbstassemblierten Strukturen des Ccg2-HA eine Breite von etwa 25 nm und eine Höhe von etwa 2,5 nm aufweisen.
Ausführungsbeispiel 6: Exponierung von funktionellen Domänen bei selbstassemblierenden Fusionsproteinen
Mit dem in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten selbstassemblierenden Fusionsprotein HFBI- (R5P)2 wurde analog zu Ausführungsbeispiel 2 ein Siliziumwafer mit einer Monolage des Proteins beschichtet. Die Schichtdicke, die ellipsometrisch analog zu Beispiel 3 ermittelt wurde, betrug 1 3,8 ± 0,4 Ä. I m Fusionsprotein ist die funktionelle Domäne, die R5P- Untereinheit des Silaffins mit dem hydrophilen Teil des Hydrophobins fusioniert.
Es wurde anhand des beschichteten Siliziumwafers mittels Kontaktwinkelmessung überprüft, ob die hydrophile Domäne des selbstassemblierenden Proteins und damit auch die funktionelle Domäne R5P in das Medium, also auf der vom Siliziumwafer abgewandten Seite, orientiert ist. Dazu wurde der Kontaktwinkel in Luft nach der sessile drop Methode bestimmt (Drop Shape Analysis System DSA10, Krüss GmbH, Deutschland). Es wurde der Kontaktwinkel in Grad eines Tropfens von 2 μΙ deionisiertem Wasser bestimmt.
Ein mit Ethanol gereinigter, unbeschichteter Siliziumwafer wies einen Kontaktwinkel von Θ = 35,2 ± 2° auf. Der mit HFBI-(R5P)2 beschichtete Siliziumwafer weist einen Kontaktwinkel von Θ = 56,4 ± 0,7° auf. Dies ist ein deutliches Indiz dafür, dass die hydrophile Domäne in das Medium exponiert ist.
Ausführungsbeispiel 7: Erzeugung einer Hydrophobinbilage auf einem Siliziumwafer
Es wurde eine geordnete Proteinbilage eines Hydrophobins, wie in Ausführungsbeispiel 1 erhalten, auf einem Siliziumwafer generiert. Dazu wurde das Fusionsprotein HFBI-(R5P)2 eingesetzt, welches als selbstassemblierende Domäne ein Klasse I Hydrophobin (HFBI aus Trichoderma reesei) enthält und als funktionelle Domäne ein Mineralisations-Tag enthält.
Es wurde zunächst zur Sedimentierung größerer Proteinaggregate eine Zentrifugation durchgeführt (15 min bei 18000 x g, 4°C) und die Proteinkonzentration bestimmt (nach Lowry). Das Sediment wurde verworfen. Es wurde eine Proteinkonzentration von 100 ng/μΙ eingestellt.
Zu dieser proteinhaltigen Lösung wurde eine filtrierte 10 mM Natriumsulfatlösung (Na2S04) in vier Portionen über einen Zeitraum von 10 min zugegeben. Anschließend wird eine 8 mM Natriumdodecylsulfat-Lösung (SDS) zugesetzt. Für HFBI-(R5P)2 betrug die zugegebene Salzkonzentration 0,05 mM und die Tensidstoffmenge je Liter der auf e i n e Proteinkonzentration von 100 ng/μΙ eingestellten Lösung 20 μηηοΙ, so dass eine finale Tensidkonzentration von 20 μηηοΙ/Ι in der Lösung eingestellt wurde.
Die auf diese Weise erhaltene stabilisierte Lösung war klar.
Die stabilisierte Lösung, die Multimere des Hydrophobins enthält, wurde zur Beschichtung eines Siliziumwafers mit den Kantenlängen 1 x 1 cm eingesetzt. Dazu wurden 200 μΙ der stabilisierten proteinhaltigen Lösung auf den Siliziumwafer aufgebracht und für mindestens 30 min inkubiert. Anschließend wurde die überstehende Lösung abgezogen und der mit HFBI-(R5P)2 beschichtete Siliziumwafer in filtriertem bidestillierten Wasser gewaschen. Die Lagerung des beschichteten Siliziumwafers erfolgte in dem in Ausführungsbeispiel 1 genannten Dialysepuffer.
Die abgezogene stabilisierte Proteinlösung konnte anschließend für weitere Beschichtungsverfahren eingesetzt werden.
Um die funktionelle Domäne des selbstassemblierenden Fusionsproteins auf dem Substrat zugänglich
Ausführungsbeispiel 8: Charakterisierung der in Ausführungsbeispiel 6 hergestellten Beschichtung mit HFBI-(R5P)2 und HFBI-(XSR5P)3 auf einem Siliziumwafer mittels Ellipsometrie
Der in Ausführungsbeispiel 2 erhaltene beschichtete Siliziumwafer wurde ellipsometrisch untersucht (Multiskop von Firma OPTREL (Berlin)). Es wurde die Änderung der Polarisationsebene eines monochromatischen Laserstrahls (Wellenlänge 632,8 nm) durch Reflexion in einem Winkel von 136° ermittelt. Durch Intensitätsmessung der senkrecht (Rs) und parallel (Rp) reflektierten Einfallsebenen des polarisierten Lichtstrahls wurde das Intensitätsverhältnis (p) bestimmt. Die ellipsometrischen Winkel Δ und Ψ werden über die FRENSELschen Formeln abgeleitet. U nter Ein berech nu ng der Brechu ngsindizes der einzelnen Lagen wurde die Schichtdicke der obersten Lage kalkuliert. p = -£= i-£ , ,**p-**> = tan-OF) eiJ
n j R ^ J
Dabei geben δρ und 5S die Phasenverschiebung zum Nullpunkt von parallel und senkrecht polarisiertem Licht an. Es wurden die aus der Literatur bekannten optischen Konstanten für Silizium als Substrat und Siliziumdioxid eingesetzt. Als Brechungsindex des Proteinfilms wurde 1 ,375 eingesetzt.
Die ermittelte Schichtdicke von HFBI-(R5P)2 auf dem Siliziumwafer betrug 25,7 ± 1 ,8 Ä, respektive 25,8 ± 0,8 Ä für das Konstrukt HFBI-(XSR5P)3. Diese Schichtdicken entsprechen den Literaturwerten für eine Bilage des Hydrophobins.
Die folgende Tabelle 3 zeigt die ellipsometrischen Daten einer Analyse von sieben unterschiedlichen Proben (1 bis Z), die unterschiedlichen Werte in den einzelnen Zeilen wurden an unterschiedlichen Messpunkten auf der jeweiligen Probe aufgenommen): Tabelle 3: Ellipsometrische Messdaten für Substrate, die mit HFBI-(R5P)2 beschichtet wurden
Ausführungsbeispiel 9: Bestimmung der Exponierung von funktionellen Domänen bei selbstassemblierenden Fusionsproteinen
Mit dem in Ausführungsbeispiel 1 hergestellten selbstassemblierenden Fusionsprotein HFBI- (R5P)2 wurde analog zu Ausführungsbeispiel 7 ein Siliziu mwafer mit einer Bilage des Proteins beschichtet. Die Schichtdicke, die ellipsometrisch analog zu Beispiel 8 ermittelt wu rde, betrug 25 ,7 ± 1 ,8 Ä. I m Fusionsprotein ist d ie fu n ktionelle Domäne, d ie R5P- Untereinheit des Silaffins mit dem hydrophilen Teil des Hydrophobins fusioniert.
Es wurde anhand des beschichteten Siliziumwafers mittels Kontaktwinkelmessung überprüft, ob die hydrophile Domäne des selbstassemblierenden Proteins und damit auch die funktionelle Domäne R5P in das Medium , also auf der vom Siliziumwafer abgewandten Seite, orientiert ist. Dazu wurde der Kontaktwinkel in Luft nach der sessile drop Methode bestimmt (Drop Shape Analysis System DSA10, Krüss GmbH, Deutschland). Es wurde der Kontaktwinkel in Grad eines Tropfens von 2 μΙ deionisiertem Wasser bestimmt.
Ein mit Ethanol gereinigter, unbeschichteter Siliziumwafer wies einen Kontaktwinkel von Θ = 35,2 ± 2° auf. Der mit HFBI-(R5P)2 beschichtete Siliziumwafer weist einen Kontaktwinkel von 0 = 54, 1 ± 0,9° auf. Dies ist ein deutliches Indiz dafür, dass die hydrophile Domäne in das Medium exponiert ist. zu machen, wurde verbleibendes Tensid vom beschichteten Substrat
Fällungsreaktion entfernt. Ausführungsbeispiel 10: Überprüfung der Zugänglichkeit des fusionierten HA-Tags eines mit Ccg2-HA beschichteten Siliziumwafers.
Zur Bestimmung der Ausrichtung von abgeschiedenen Proteinmonomere auf einem analog zu Ausführungsbeispiel 2 mit Ccg2-HA beschichteten Siliziumwafers, erfolgte die Ankopplung eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers an der fusionierten Proteindomäne eines Hyd rophobin-Fusionsproteins. Zur fluoreszenzmikroskopischen Analyse der Zugänglichkeit des HA-Tags wurde der Antikörper Anti-HA, AlexaFluor® 488 Konjugat (INVITROGEN GMBH; Darmstadt, Deutschland) nach Angaben des Herstellers verdünnt und für 30 min auf dem Substrat inkubiert. Anschließend wurde das Substrat dreimal mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen um Rückstände ungebundenen Antikörpers zu entfernen. Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Zeiss Axio Observer.ZI (CARL ZEISS MICROIMAGING GMBH; Jena, Deutschland) in Kombination mit dem dazu gehöhrenden Filtersatz 38 GFP durchgeführt. Eine grün fluoreszierende Substratoberfläche bestätigt die Zugänglichkeit des fusionierten HA-Tags.
Als Referenz wurde in Analogie ein Substrat nach Ausführungsbeispiel 2 mit BSA behandelt. Nach Inkubation mit dem Antikörper Anti-HA, AlexaFluor® 488 Konjugat waren keine grün fluoreszierenden Signale auf der Substratoberfläche detektierbar..
Ausführungsbeispiel 11 : Überprüfung der Zugänglichkeit eines fusionierten Luciferase-Tags einer mit HFBI-GLuc beschichteten Kunststoffoberfläche.
Zur Bestimmung der Zugänglichkeit von Proteindomänen eines Fusionsproteins erfolgte die Beschichtung eines Siliziumwafers mit HFBI-GLuc in Analogie zum Ausführungsbeispiel 2. Die fusionierte Luciferasedomäne (GLuc) katalysiert die chemische Umsetzung von Luciferin unter der Emission von Licht mit der Wellenlänge 475 nm. Neben einer visuelle Beurteilung erfolgte die quantitative Fluoreszenzanalyse mittels I nfinite M200 Plattenreader (TECAN GROUP LTD.; Männedorf, Deutschland). Als Referenzen dienten die unfusionierten Proteindomänen (HFBI bzw. GLuc).
Nach der zugäbe von luciferol zeigten das bifunktion Hydrophinchimär (HFB1 -Gluc) sowie die U ntereinheit wie erwartet ein Lumineszenzsignal. Die kataytisch inaktive HFB1 - Untereinheit zeigt kein Lumineszenzsignal. In einem zweiten Experiment wurden die Proteine auf einer Polystyrenoberfläche wie in Ausführungsbeispiel 2 abgeschieden. Die Substrate wurden überschichtet mit Reaktionspuffer und die Reaktion wurde eingeleitet durch die Zugabe von Luciferol. Ausschließlich das immobilisierte bifunktionale Hydrophobinchimär zeigte ein signifikantes Lumineszenzsignal. Ausführungsbeispiel 12: Überprüfung der Langzeitstabilität einer proteinhaltigen Beschichtungslösung, beinhaltend Ccg2-tRFP oder HFBI-tRFP
U m d e n E i nfl u s s vo n i o n i sc h e n Te n s i d e n a uf d i e O be rfl ä ch e n a kti v i tä t d e r selbstassemblierenden Proteine zu untersuchen, wurde CTAB zu fluoreszierenden Fusionsproteinen zugesetzt. Die fluoreszierenden Fusionsproteine bestehen aus einem Hydrophobin (Ccg2 bzw. HFBI), welches die selbstassemblierende Domäne darstellt und einer rot fluoreszierenden Peptiddomäne (tRFP). Die rot fluoreszierende Peptiddomäne erlaubt es, den Einfluss ionischer Tenside auf die Struktur des Fusionsproteins mittels Fluoreszenzmessung zu untersuchen. Eine Änderung in der Fluoreszenzintensität erlaubt direkte Rückschlüsse auf Konformationsänderungen des Proteingerüstes, die durch Interaktionen mit dem ionischen Tensid hervorgerufen werden.
Bereitstellung einer proteinhaltigen Lösung, beinhaltend ein Fusionsproteien (Ccg2-tRFP bzw. H FB I-tRFP) oder eine unfusionierte tRFP-Peptidsequenz mit der Konzentration 200 ng//jL, wurde optional in vier Portionen mit einer Lösung ionischer Tenside, beinhaltend CTAB, zu einer finalen Konzentration an ionischen Tensids von 1 mM versetzt. Anschließend wurden alle Lösungen durch einen Filter (0,22μη"ΐ) filtriert. Der Einfluss der Filtration, sowie der Einfluss zugesetzter ionischer Tenside wurde nachfolgend über den Zeitraum von einer Woche untersucht.
Aufgrund der Eigenschaften selbstassemblierender Proteine, führte die Filtration der proteinhaltigen Lösungen, beinhaltend ausschließlich das Fusionsprotein (Ccg2-tRFP bzw. HFBI- tRFP) ohne die Zugabe ionischen Tensids, zu einer Reduktion der Fluoreszenzintensität um 37 % bzw. 46 %. Die proteinhaltige Lösung, beinhaltend ausschließlich das unfusionierte tRFP ohne die Zugabe ionischen Tensids, zeigte hingegen keinen Abfall in der Fluoreszenzintensität. Die Fluoreszenzintensität wurde nachfolgend alle 24 Stunden über einen Zeitraum von einer Woche kontrolliert. Alle Proben zeigten einen kontinuierlichen Abfall in der Fluoreszenzintensität. Nach einer Woche war in allen Proben eine um ca. 95 % zum Ausgangswert reduzierte Fluoreszenz detektierbar.
Ein gegensätzliches Bild zeigte sich im Falle nach Zugabe eines ionischen Tensids. Die Fluoreszenzintensität der proteinhaltigen Lösung, beinhaltend die unfusionierte tRFP Peptidsequenz und CTAB, sank um 25 %. Die Filtration dieser Probe hatte keinen Einfluss auf die Fluoreszenzintensität. Im Falle der proteinhaltigen Lösungen , beinhaltend ein Fusionsprotein (Ccg2-tRFP bzw. HFBI-tRFP) hatte die Zugabe eines ionischen Tensids keinen Einfluss auf die Fluoreszenzintensität. Auch nach Filtration dieser Lösungen blieb die Fluoreszenzintensität unbeeinflusst. Die Fluoreszenzintensität wurde nachfolgend alle 24 Stunden über einen Zeitraum von einer Woche kontrolliert. Die proteinhaltigen Lösungen, beinhaltend ein Fusionsprotein (Ccg2-tRFP bzw. HFBI-tRFP) und ein ionisches Tensid, zeigten keinen Abfall in der Fluoreszenzintensität über den gesamten Versuchszeitraum. Die Fluoreszenzintensität der proteinhaltigen Lösungen, beinhaltend einhaltend die unfusionierte tRFP Peptidsequenz und ein ionisches Tensid, sank kontinuierlich über den gesamten Versuchszeitraum . Nach einer Woche war in dieser Probe eine um 67 % zum Ausgangswert reduzierte Fluoreszenz detektierbar.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Beschichtung eines Substrats mit mindestens einer Monolage selbstassemblierender Proteine mit den Schritten:
i. Bereitstellung einer proteinhaltigen Beschichtungslösung,
ii. Inkontaktbringen der Oberfläche des Substrats mit der proteinhaltigen Lösung, iii. Entfernen der überstehenden Lösung von dem beschichteten Substrat und/oder Trocknung des beschichteten Substrats,
dadurch gekennzeichnet, dass zur Bereitstellung der Beschichtungslösung a) aus einer wässrigen Lösu ng selbstassemblierender Proteine aggregierte Proteineinheiten abgetrennt werden und, b) durch Zugabe einer Lösung ionischer Tenside und/oder einer salzhaltigen und/oder alkalischen und/oder sauren Lösung in der proteinhaltigen Beschichtungslösung M on om e re od e r Oligomere der selbstassemblierenden Proteine erzeugt und stabilisiert werden, wobei so viel ionisches Tensid zugesetzt wird, dass nur der oberflächenaktive Teil jedes aktiven Proteinmonomers oder prädominanten Proteinoligomers von Tensidteilchen umhüllt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als selbstassemblierende Proteine Hydrophobine und/oder Surface Layer Proteine und/oder rekombinante Fusionsproteine mit mindestens zwei Domänen, wobei mindestens eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist, eingesetzt werden.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Tenside ausgewählt sind aus der Gruppe der kohlenwassterstoffgekoppelten Sulfate, S u l fo n a t e o d e r C a rb o xy l a te o d e r a u s der Gruppe der quarternären Ammoniumverbindungen.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die salzhaltige und/oder alkalische und/oder saure Lösung Erdalkalimetallionen oder Metallionen der Nebengruppen I und II in Form von Chloriden, Nitraten, Carbonaten, Acetaten, Citraten, Gluconaten, Hydroxiden, Lactaten, Sulfaten, Succinaten oder Tartraten oder anorganische Anionen, insbesondere Halogenide, Hydroxide, Nitrate, Carbonate, Sulfate, Phosphate aber auch organische Anionen, insbesondere Acetate, Citrate, Succinate oder Tartrate, die als Gegenionen Alkalimetallionen aufweisen, enthält.
5. Proteinhaitigen Beschichtungslösung, enthaltend Monomere oder Oligomere selbstassemblierender Proteine, wobei der oberflächenaktive Teil der Monomere oder Oligomere von ionischen Tensiden umhüllt ist
6. Verwendung einer proteinhaltigen Beschichtungslösung nach Anspruch 5 zur Beschichtung von Substratoberflächen.
7. Substrat mit einer proteinhaltigen Beschichtung mindestens eines selbstassemblierenden Proteins, gekennzeichnet dadurch,
dass sich auf der Substratoberfläche mindestens eine Monolage selbstassemblierender Proteine befindet,
dass sich auf der Oberfläche der mindestens einen Monolage selbstassemblierender Proteine eine Schicht befindet, die mindestens ein ionisches Tensid enthält, wobei das Tensid mit dem selbstassemblierenden Protein in koordinativer Bindung vorliegt.
8. Substrat nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das selbstassemblierende Protein ein Hydrophobin und/oder ein Surface Layer Protein und/oder rekombinantes Fusionsprotein ist, das mindestens zwei Domänen umfasst, wobei eine Domäne eine selbstassemblierende Proteindomäne ist und eine Domäne eine funktionelle Domäne ist, wobei die funktionelle Domäne auf der vom Substrat abgewandten Seite der proteinhaltigen Beschichtung angeordnet ist.
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