DE19941448A1

DE19941448A1 - Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen

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Publication number: DE19941448A1
Application number: DE1999141448
Authority: DE
Inventors: Stefan Bossmann; Michael Niederweis
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-08-31
Filing date: 1999-08-31
Publication date: 2001-03-01
Also published as: AU7901400A; DE10082578D2; WO2001016328A2; WO2001016328A3

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen mit folgenden Schritten: DOLLAR A a) Bereitstellen von kanalbildenden Proteinen aus Gram-positiven Bakterien und DOLLAR A b) Aufbringen der kanalbildenden Proteine auf ein Substrat.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen und die Verwendung von kanalbildenden Proteinen zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen.

Die Verwendung von Strukturen im Nanometer-Maßstab für Materialien und Maschinen ist nicht nur ein Fortschritt in der Miniaturisierung, sondern eröffnet auch grundsätzlich neue Möglichkeiten (Drexler, K.E. Building molecular machine systems. Trends Biotechn 17, 5-7 (1999)).

Allerdings ist deren Synthese bisher sehr aufwendig. Zudem ist die chemische Funktionalisierung von Nanoverbindungen bisher entweder nicht oder nur sehr eingeschränkt und mit aufwendigen Reaktionen möglich (Chen, J., Hamon, M.A., Hu, H., Chen, Y., Rao, A.M., Eklund, P.C. and Haddon, R.C. Solution properties of single-walled carbon nanotubes. Science 282, 95-8 (1998); Wong, S.S., Joselevich, E., Woolley, A. T., Cheung, C.L. and Lieber, C.M. Covalently functionalized nanotubes as nanometre-sized probes in chemistry and biology. Nature 394, 52-5 (1998)).

Zu den bisher am besten charakterisierten Nanostrukturen gehören Kohlenstoff-Nanokanäle (Yakobson, B.I. and Smalley, R.E. Fullerene nanotubes: C_1,000,000 and beyond. Am Sci 85, 324, 1997). Mit Kohlenstoff-Nanokanälen konnte gezeigt werden, daß die elektronischen Eigenschaften durch ihre strukturellen Details kontrolliert werden. Die Synthese von Kohlenstoff-Nanokanälen erfolgt durch verschiedene Varianten von CVD (chemical vapor deposition) (Fan, S., Chapline, M. G., Franklin, N.R., Tombler, T.W., Cassell, A.M. and Dai, H. Self-oriented regular arrays of carbon nanotubes and their field emission properties. Science 283, 512-4, 1999) und ist damit sehr aufwendig.

Metallische Nanokanäle sind bisher synthetisch nicht zugänglich. Aufgrund ihrer metallischen Leitfähigkeit wird erwartet, daß diese als hervorragende Bauteile in Bereich der Quanten-Elektronik dienen können. Die geringe Dicke der metallischen Wandungen läßt erwarten, daß auch im Bereich der Hochfrequenz-Technik ein besonderer Bedarf an derartigen Bauteilen besteht. Nicht zuletzt würde durch die Verwendung von nanoskopischen und Größen-selektiven Elektroden ermöglicht, die neuartige elektrochemische Methoden, z. B. auf zellulärer Ebene, erlauben würden.

Aus Johnson, S.A., Ollivier, P.J. and Mallouk, T.E. Ordered mesoporous polymers of tunable pore size from colloidal silica templates. Science 283, 963-965 (1999) ist ein Verfahren zur Herstellung von organischen Nano-Kanälen auf der Grundlage eines Templates bekannt. Damit können Nano- Kanäle mit einem Durchmesser von 5 bis 35 nm hergestellt werden.

Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach den Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein möglichst Verfahren zur Herstellung regelmäßiger Nanostrukturen angegeben werden.

Diese Aufgabe wird durch die Merkmale der Ansprüche 1 41 bis 43 gelöst. Zweckmäßige Weiterbildungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2-39 sowie 44 und 45.

Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen mit folgenden Schritten vorgesehen:

a) Bereitstellen von kanalbildenden Proteinen aus Gram positiven Bakterien und
b) Aufbringen der kanalbildenden Proteine auf ein Substrat.

Unter den kanalartigen Proteinen werden solche Proteine verstanden, die natürlicherweise insbesondere in der Zellwand der Gram-positiven Bakterien vorkommen.

Kanalbildende Proteine aus Gram-positiven Bakterien zeigen eine ungewöhnliche chemische und thermische Stabilität, die eine Herstellung von Nanostrukturen mit verringertem Aufwand ermöglicht. Kanalbildende Proteine lassen sich z. B. in organischen Lösungsmitteln, wie CHCl₃/MeOH, lösen, ohne zu denaturieren. Außerdem lassen sie sich mit Aceton fällen oder in Detergentien kochen, ohne zu denaturieren. Die Fähigkeit zur Kanalbildung bleibt dabei überraschenderweise erhalten.

Unter Verwendung kanalbildender Proteine aus Gram-positiven Bakterien lassen sich auf relativ einfach Nanostrukturen herstellen. Das Verfahren bzw. die damit hergestellten Nanostrukturen weisen die folgenden Vorteile auf:

a) Jede beliebige Stelle des kanalbildenden Proteins kann durch Mutation des kodierenden Gens modifiziert werden, d. h. seine chemischen und physikalischen Eigenschaften können lokal verändert werden. Neben der Änderung proteinspezifischer Eigenschaften können Veränderungen vorgenommen werden, welche die Selbstassemblierung oder die Assoziation mit anderen Materialien verbessern. Das ermöglicht u. a. die Konstruktion von Komponenten für elektronische oder physikalische Geräte.
b) Die Eindringtiefe des Lichts ist bei kanalbildenden Proteinen besser als bei den meisten anderen Materialien. Das ermöglicht die Durchführung von photochemische Reaktionen im Innern von Proteinen.
c) Kanalbildende Proteine besitzen meistens Ladungen an der Oberfläche, welche eine Selbstassemblierung an Elektroden und dadurch die Durchführung von elektrochemischen Reaktionen wie z. B. die Abscheidung von Metallen ermöglichen.

Nach einer Ausgestaltung kann eine das kanalbildende Protein enthaltende Lösung auf das Substrat gesprüht werden. Anschließend wird zweckmäßigerweise die Oberfläche des Substrats, vorzugsweise im Hochvakuum, und bei einer vorgegebenen Temperatur oder einem vorgegebenen Temperaturgradienten dehydratisiert wird. Das vorgeschlagene Verfahren kann das kanalbildende Protein einfach reproduzierbar auf das Substrat aufgebracht werden.

Nach einer weiteren. Ausgestaltung kann das mit dem kanalbildenen Protein versehene Substrat in eine metall ionenhaltige Lösung getaucht und einer Elektrolyse ausgesetzt werden. Dabei sind in der Lösung zweckmäßigerweise die aus der folgenden Gruppe ausgewählten Ionen enthalten sind:
Cu²⁺, Ag¹⁺, Au³⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, CO²⁺, CO³⁺, Ni³⁺, Ru²⁺, Ru³⁺, Rh³⁺, Pt²⁺, Pd²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Cr³⁺, Re²⁺.

Die Dauer der Elektrolyse beträgt zweckmäßigerweise 10-20 Stunden, vorzugsweise 13-17 Stunden. Die vorgenannten Merkmale ermöglichen auf einfache Weise eine Metallisierung der kanalbildenden Proteine und/oder die Herstellung von metallischen Nanokanälen.

Insbesondere für elektronische Anwendungen kann es vorteilhaft sein, daß auf der aus kanalbildenden Proteinen gebildeten Schicht mindestens eine weitere aus Kunststoff, halbleitendem oder metallischem Material gebildete Schicht elektrochemisch abgeschieden wird. Es kann zur Abscheidung der weiteren Schicht der Elektrolytlösung mindestens eine der folgenden Verbindungen zugesetzt werden: Fe₂(CO)₁₀, (Ru(bpy)₃)²⁺-Diacetat oder TiCl₃. Damit können im Nanomaßstab elektrotechnische Bauelemente hergestellt werden; die Eigenschaft der weiteren Schicht kann durch geeignete Zusätze gezielt eingestellt werden.

Insbesondere zur Herstellung von Sensoren können an der Innenseite des kanalbildenden Proteins zweckmäßigerweise fluorophore Moleküle angelagert oder chemisch gebunden werden. Die fluorophoren Moleküle können aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: Substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Naphtalin, Anthracen, Pyren, heterocyclische Verbindungen, vorzugsweise Fluorescein, Ruthenium(II)-polypyridylkomplexe.

Zweckmäßig ist es, daß das Substrat aus einem der folgenden Materialien gebildet ist: Graphit, Kunststoff, Metall, Glas, Keramik.

Nach einem weiteren verfahrensgemäßen Ausgestaltungsmerkmal werden die kanalbildenden Proteine gelöst in einem Puffergemisch auf das Substrat aufgebracht. Dabei kann dem Puffergemisch ein Monomer zugesetzt sein. Dem Puffergemisch kann ferner ein Dien, vorzugsweise Divinylbenzol, 2,3- Diphenyl-butadien und/oder ein Präpolymerisat oder ein Polymer zugesetzt sein.

Zur Herstellung insbesondere von Nanopartikeln und Nanostrukturen ist es zweckmäßig, daß das kanalbildende Protein in Liposomen, Micellen oder in den Tröpfchen einer Emulsion, vorzugsweise einer Mikroemulsion, aufgenommen ist.

Das mit kanalbildenden Proteinen beschichtete Substrat kann einer Bestahlung mit elektromagnetischen Wellen ausgesetzt werden und/oder mit Elektronen bestrahlt werden. Dadurch können die Eigenschaften des kanalbildenden Proteins gezielt beeinflußt werden.

Als besonders vorteilhaft wird es angesehen, das kanalbildende Protein durch heterologe Expression oder durch Aufreinigung aus Mykobakterien zu gewinnen.

Ein solche Gewinnung ist besonders effizient. Sie bietet die Möglichkeit einer weitgehenden Automatisierung der chromatographischen Aufreinigung und ermöglicht eine drastisch erhöhte Ausbeute.

Das Gram-positive Bakterium kann ein mindestens eine Mycolsäure enthaltendes Bakterium sein. Nach einer Ausgestaltung ist das Bakterium ein Mykobakterium, vorzugsweise Mycobacterium smegmatis.

Das kanalbildende Protein kann ein Porin sein. Bevorzugt wird ein Porin, das gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil und/oder bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugsweise 100°C thermisch stabil ist.

Das Porin ist vorzugsweise MspA. Dieses Protein eignet sich wegen seinen überraschenden chemischen und thermischen Stabilität besonders gut zur Herstellung von Nanostrukturen.

Eine gute Ausbeute wird erzielt, wenn die heterologe Expression in E. coli durchgeführt wird. Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute kann das kanalbildende Protein durch Überexpression, vorzugsweise aus E. coli oder Mycobakterien, gewonnen werden. Zweckmäßigerweise wird zur Expression ein für ein kanalbildendes Protein, vorzugsweise ein Porin, codierendes Gen benutzt. Vorteilhaft ist es weiter, daß zur Überexpression ein mspA-Gen gemäß Sequenz 1 (siehe unten) benutzt wird. Zur Expression kann insbesondere aber auch ein von der Sequenz 1 abgeleitetes mutiertes Gen benutzt werden, wobei die Mutation so ausgebildet ist, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen denen von MspA entspricht. Die Mutation kann auch im wesentlichen in einer Angleichung der Codons von mspA an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene bestehen. Zur Überexpression kann auch ein mutiertes mspA-Gen benutzt werden, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist. - Die Anpassung der Codon-Benutzung verbessert die Überexpression von MspA in E. coli erheblich.

Durch Herstellung des kanalbildenden Proteins MspA aus E. coli kann die Ausbeute gegenüber dem oben beschriebenen Verfahren zur Präparation des nativen Proteins noch einmal um den Faktor 10 bis 20 gesteigert werden.

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, zur Überexpression das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 zu benutzen. Dazu kann ein zur Überexpression in E. coli geeigneter Vektor verwendet werden, in den das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 eingesetzt ist. Solche geeigneten Vektoren sind z. B. von Hannig, G. und Makrides, S.C. in Trends in Biotechnology, 1998, Vol. 16, pp54 beschrieben. Der Offenbarungsgehalt dieses Dokuments wird hiermit einbezogen.

Es hat sich weiter als vorteilhaft erwiesen, das kanalbildende Protein mittels nicht-ionischer oder zwitterionischer Detergentien aus der Zellwand von Gram positiven Bakterien zu gewinnen. Die Detergentien können aus der folgenden Gruppe ausgewählt sein: Isotridecylpoly(ethyleneglycolether)_n, Alkylglucoside, besonders Octylglucosid, Alkylmaltoside, besonders Dodecylmaltosid, Alkylthioglucoside, besonders Octylthioglucosid, Octyl-Polyethylenoxide und Lauyldiamminoxid. Es kann dabei zweckmäßigerweise eine zweifache kritische micellare Konzentration (CMC) in einem Phosphatpuffer (100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl) eingestellt werden. - Die zwitterionischen und nicht- ionischen Detergentien lösen insbesondere das kanalbildende Protein MspA sehr selektiv und mit guter Ausbeute aus der Zellwand von M. smegmatis.

Es hat sich weiter als zweckmäßig erwiesen, daß die Temperatur bei der Extraktion zwischen 80 und 110°C, vorzugsweise zwischen 90 und 100°C, und/oder die Extraktionszeit 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 25-35 Minuten, beträgt. Vorteilhaft ist weiter die Benutzung eines Puffers mit einer Ionenstärke von mehr als 50 mM NaCl oder Na-Phosphat.

Insbesondere eine Durchführung der Extraktion bei 100°C die Verwendung eines Puffers mit hoher Ionenstärke sowie zwitterionischer und nicht-ionischer Detergentien verbessern das Extraktionsverfahren für Porine aus Mycobacterium smegmatis. Dieses Extraktionsverfahren bietet Vorteile gegenüber den bisherigen Verfahren zur Aufreinigung solcher Proteine, nämlich:

a) Verzicht auf organische Lösungsmittel
b) geringe Verunreinigungen mit anderen Proteinen
c) effiziente Extraktion

Von besonderem Vorteil ist es, MspA zur Aufreinigung in Dimethylsulfoxid bei einer Temperatur im Bereich von 50-110°C zu lösen; danach kann die Lösung vom Rückstand getrennt und MspA durch Abkühlen ausgefällt werden.

Durch heterologe Expression gewonnenes MspA kann durch Anlegen einer Gleichspannung renaturiert werden. Zweckmäßig ist das Anlegen einer Gleichspannung im Bereich von 50 V für eine Zeit von etwa 30 Minuten.

Gegenstand der Erfindung ist ferner eine Nanostruktur hergestellt nach dem erfindungsgemäßen Verfahren.

Ferner wird als erfindungsgemäß die Verwendung kanalbildender Proteine aus Gram-positiven Bakterien zur Herstellung von Nanopartikeln oder von regelmäßigen Nanostrukturen auf Substraten und/oder eines für kanalbildende Proteine aus Gram-positiven Bakterien codierenden Gens zur Herstellung von Nanopartikeln oder regelmäßigen Nanostukturen auf Substraten beansprucht. Bei den kanalbildenden Proteinen kann es sich um Porine, vorzugsweise MspA, handeln.

Nachfolgend werden anhand der Figuren Beispiele der Erfindung erläutert. Es zeigen:

Fig. 1 die Reinigung von MspA aus M. smegmatis in chromatographischer Darstellung,

Fig. 2 die Reinigung von MspA aus E. coli in chromatographischer Darstellung,

Fig. 3 die Konstruktion des Plasmidvektors pMN501,

Fig. 4 eine schematische Ansicht eine Vorrichtung zur Renaturierung,

Fig. 5 ein renaturiertes MspA in chromatographischer Darstellung,

Fig. 6a-c elektronenmikroskopische Aufnahmen von aus MspA hergestellten Nanostrukturen und

Fig. 7a-d die Herstellung von Nanostrukturen und Nanopartikeln aus Polymethylmethacrylat.

Fig. 1 zeigt die Reinigung des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis. Die Proteine wurden mit einem 10%igen SDS- Polyacrylamidgel nach getrennt. Das Gel wurde mit Coomassie Blue gefärbt. Spuren: (M) Massenstandard: 200, 116, 97, 66, 55, 36.5, 31, 21.5, 14.4 kDa; (1) Extrakt von M. smegmatis mit PLD12-Puffer PLD012-Puffer (100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.12% LDAO). (2) 33 µg aufgereinigtes MspA. Die Proben wurden 30 min bei 37°C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden. Die Sequenz von MspA, MspA + Promotor sowie MspA mit vermuteter Signalsequenz ist in den Sequenzprotokollen 1-3 wiedergeben.

Fig. 2 zeigt die Reinigung des Kanalproteins MspA aus E. coli. Die Proteine wurden mit einem 10%igen SDS-Poly acrylamidgel. Das Gel wurde mit Coomassie Blue gefärbt. Spuren: (I) Lysat von E. coli BL21(DE3)/pMN501 vor der Induktion durch IPTG. (2) Lysat von E. coli BL21(DE3)/pMN501 nach der Induktion durch IPTG. (3) Massenstandard: 200, 116, 97, 66, 55, 36.5, 31, 21.5, 14.4 kDa. Die Proben wurden 30' min bei 37°C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden.

In Fig. 3 ist schematisch die Konstruktion des Plasmids pMN501 zur Überexpression von MspA in E. coli BL21(DE3) dargestellt. Die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
lacI: Gen codierend für den Laktose-Repressor
nptI: Gen codierend für die Neomycinphosphotransferase; sie vermittelt Kanamycinresistenz
Ori: Replikationsursprung
RBS: Ribosomenbindestelle

Fig. 4 zeigt schematischen eine Vorrichtung zur Renaturierung von monomerem MspA. Eine Pipettenspitze aus Polyethylen von 5 cm Länge, dessen unteres Ende nach ca. 2 mm abgeschnitten wurde, wurde mit einer 1.7%igen Agarose-Lösung (in TAE- Puffer) gefüllt. Eine Bleistiftmine (Typ: Eberhard Faber, 3H) wurde auf eine Länge von 5 cm gekürzt. Ein Polypropylengefäß ohne Deckel wurde mit 60 µl einer Lösung mit 5 µg denaturiertem MspA gefüllt und die Pipettenspitze und die Bleistiftmine in die Lösung gestellt. Dann wurde die Pipettenspitze als Kathode und die Bleistiftmine als Anode angeschlossen.

Fig. 5 zeigt die Renaturierung von denaturiertem MspA. Die Proteine wurden mit einem 10%igen SDS-Polyacrylamidgel nach (Schägger, H. and von Jagow, G. Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the Separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem 166, 368-79 (1987)) getrennt. Das Gel wurde mit Silber gefärbt. Spuren: (M) Massenstandard: 116, 97, 66, 55, 36.5, 31, 21.5, 14.4 kDa; (I) 800 ng denaturiertes MspA (2) 800 ng MspA nach der Renaturierungsreaktion. Die Proben wurden 30 min bei 37°C inkubiert, bevor sie auf das Gel aufgetragen wurden.

Die Fig. 6a bis c zeigen elektronenmikroskopische Aufnahmen von Modifikationen des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis. Die Herstellung der Proben erfolgt nach folgendem Protokoll: Ein Milliliter einer Lösung des Kanalproteins MspA (c(MspA) = 17,2 × 10^-9 mol/L, 100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6,5, 150 mM NaCl, 0,10 g/L SDS) werden bei 24,5°C in einem Ultraschallbad dispergiert. Zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der HOPG (Kohlenstoff) - Oberfläche (1,0 mm²) wird ein konstanter Abstand von 5,0 cm eingestellt. Die HOPG-Oberfläche wird für 20 Sekunden den dispergierten Flüssigkeitströpfchen ausgesetzt.

Die Fig. 7a bis d zeigen die Herstellung einer Nanostruktur und von Nanopartiklen aus Polymethylmethacrylat (PMMA). Zur Herstellung der Proben wird zunächst MspA gemäß Beispiel 5 auf die Oberfläche des Substrats aufgebracht. Dann wird die Oberfläche mit einer Lösung in Kontakt gebracht, die ein Gemisch aus einem Puffer, einem Methylmethacrylat und 10% Polymethylmethacrylat (MW = 200.000) und Benzoin enthält. Die Lösung wird einer Elektronenstrahlpolymerisation ausgesetzt. Es ist auch möglich, dem vorgenannten Gemisch MspA zuzusetzen und dieses unmittelbar auf des Substrat aufzusprühen. In den Fig. 7a bis d sind die gebildeten Strukturen in Abhängigkeit der Einwirkungszeit des Elektronenstrahl gezeigt. Insbesondere aus Fig. 7d sind die gebildeten Nanokanäle ersichtlich. Die Nanokanäle sind mit Polymer bzw. Nanopartikeln verfüllt.

Beispiel 1 Aufreinigung von MspA aus M. smegmatis

Zwei Liter 7H9-Medium mit 0.05% Tween 80 und 0.2% Glycerin werden mit M. smegmatis mc²155 beimpft und 2 Tage bei 37°C geschüttelt (Jacobs, W.R., Jr., Kalpana, G.V., Cirillo, J.D., Pascopella, L., Snapper, S.B., Udani, R.A., Jones, W., Barletta, R.G. and Bloom, B.R. Genetic systems for mycobacteria. Methods Enzymol 204, 537-55 (1991)).

7.9 g Zellen (Naßgewicht) werden nach Zentrifugation für 10 min bei 10000 g erhalten und in 28 mL PLD012-Puffer (100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.12% LDAO) resuspendiert und 30 Minuten im Wasserbad gekocht. Dieser Rohextrakt wird mit 28 mL Aceton gefällt, der Niederschlag in 8 mL ALD012-Puffer Puffer (25 mM Hepes, pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.12% LDAO) aufgenommen und über eine G25-Säule mit demselben Puffer entsalzt. Die Protein-enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und an einem Anionenaustauscher (POROS HQ20) mit einem linearen NaCl-Gradienten von 10 mM bis 2 M NaCl getrennt. Natives MspA (100 kDa) eluiert bei 680 mM NaCl. Die Ausbeute beträgt 670 µg MspA mit einer Reinheit von über 90% (s. Fig. 1).

Beispiel 2 Verfahren zur Präparation des Kanalproteins MspA aus E. coli

Zur weiteren Erhöhung der Ausbeute an MspA wird eine Überexpression des entsprechenden Gens vorgeschlagen. Zunächst wird das mspA-Gen kloniert, das für das Kanalprotein MspA aus Mycobacterium smegmatis mc²155 kodiert. Es wird das T7-Expressionssystem für die Überexpression des mspA-Gens gewählt.

Das mspA-Gen wird aus dem Plasmid pPOR6 über PCR amplifiziert. In der nativen mspA-Sequenz werden alle Codons verändert, die in stark exprimierten Genen aus Escherichia coli selten vorkommen. Im Sequenzprotokoll 4 (siehe unten), sind alle eingeführten Mutationen aufgelistet. Diese synmspA genannte DNA wird nach der Methode von Stemmer (Stemmer, W.P., Crameri, A., Ha, K.D., Brennan, T.M. and Heyneker, H. L. Single-step assembly of a gene and entire plasmid from large numbers of oligodeoxyribonucleotides. Gene 164, 49-53 (1995)) durch Assemblierung von Oligonucleotiden synthetisiert und anstelle des mspA-Gens in den Vektor pMN500 eingesetzt. Das resultierende Plasmid pMN501 (Fig. 3) vermittelt in Zellen von E. coli BL21(DE3) eine starke Expression von denaturiertem MspA-Monomer (20 kDa) nach Induktion mit IPTG. Das so exprimierte MspA kann dem Sequenzprotokoll 5 (siehe unten) entnommen werden.

Beispiel 3 Aufreinigung von MspA aus E. coli

Ein Liter LB-Medium mit 30 µg/mL Kanamycin wird mit E. coli BL21(DE3)/pMN500 beimpft und bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0.6 geschüttelt. Dann wird mit 1 mM IPTG induziert und die Zellen noch sechs Stunden bei 37°C bis zu einer OD₆₀₀ von 2.2 geschüttelt. Die Zellen werden in 40 mL A-Puffer (25 mM Hepes, pH 7.5, 10 mM NaCl) resuspendiert und durch zehnminütiges Kochen in Wasser aufgeschlossen. Nach einer zehnminütigen Inkubation auf Eis werden die Zelltrümmer und die ausgefallenen Proteine durch Zentrifugation bei 10000 g für 10 min abgetrennt. Der Überstand wird an einem Anionenaustauscher (POROS HQ20) mit einem linearen NaCl- Gradienten von 10 mM bis 2 M NaCl getrennt. Denaturiertes MspA eluiert bei 350 mM NaCl. Um höhermolekulare Proteine abzutrennen, werden die Fraktionen mit MspA vereinigt und eine Gelfiltration durchgeführt. Die Ausbeute beträgt 10 mg MspA mit einer Reinheit von über 95% (Daten nicht gezeigt).

Beispiel 4 Elektrochemische Assemblierung des Kanalproteins MspA

Durch die Überexpression von MspA in E. coli ist es zwar leicht möglich, das Kanalprotein mit einer guten Ausbeute zu isolieren. Das gewonnene Protein liegt zum großen Teil in inaktiver Form vor. Die Überführung in die aktive Form bzw. Renaturierung von monomerem MspA kann nach folgendem Protokoll erfolgen:
Die Renaturierung findet in einer speziell für diesen Zweck entwickelten Apparatur statt (Fig. 4). Die Renaturierungsreaktion wird mit 5 µg MspA in monomerer Form in dieser Reaktionsapparatur durch Anlegen einer Spannung von 50 V für 30 min durchgeführt. Zum Schluß wird die Spannung für fünf Sekunden umgepolt, um an der Bleistiftmine adsorbiertes Porin wieder zu lösen.

Das Protein wird nach der oben beschriebenen Renaturierungsreaktion in einem Proteingel untersucht (s. Fig. 5). Dabei stellt sich heraus, daß ein großer Teil des Proteins zu oligomeren Einheiten assembliert ist. Durch Rekonstitutionsexperimente kann gezeigt werden, daß das MspA in dieser Form wieder hohe Kanalaktivität besitzt. Das beweist, daß die Renaturierung von MspA durch geringe Gleichspannungen möglich ist.

Diese Renaturierungsreaktion ist sehr einfach durchzuführen und ist damit ein wichtiger Bestandteil der Präparation von funktionalem Kanalprotein MspA aus überproduzierenden E. coli.

Beispiel 5 Herstellung von Nano-Kanälen

Zur Konstituierung von lateralen Nanostrukturen auf Oberflächen durch das Aufbringen sehr geringer Mengen (≈ 10.g cm^-3) des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis wird folgendes Protokoll vorgeschlagen:
Das Kanalprotein MspA wird in einem geeigneten Puffer gelöst (c(MspA) = 17,2 × 10^-9 mol L^-1, 100 mM. Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.10 g L^-1 SDS) und 1 mL bei 24.5°C in einem Ultraschallbad (elektrische Leistung: 10 W). Zwischen der Flüssigkeitsoberfläche und der HOPG (Kohlenstoff)- Oberfläche (1.0 mm²) wird ein konstanter Abstand von 5.0 cm eingestellt. Die HOPG-Oberfläche wird für 20 Sekunden den dispergierten Flüssigkeitströpfchen ausgesetzt. Danach werden drei verschiedene Temperaturen zur Nachbehandlung gewählt: I: 24,5°C, II: 28°C, III: 35°C. Die Nachbehandlungszeit beträgt in allen Fällen 15 min. Danach wird ein Hochvakuum angelegt (1 × 10^-6 bar) und für 3 h dehydratisiert. Die entstandenen Strukturen wurden mit Hilfe der durchstrahlenden Elektronenmikroskopie untersucht. Es sind die in den Fig. 6a bis c gezeigten drei unterschiedlichen Modifikationen des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis erkennbar.

In Fig. 6a liegen isolierte Kanalproteine vor. In Fig. 6b ist eine Bänderstruktur erkennbar, die große Poren mit einem Durchmesser von 12 nm aufweist. Aus Fig. 6c ist ersichtlich, daß die Bänderstruktur zwei Typen von Kanälen besitzt, nämlich erste Kanäle mit einem kleinen Durchmesser von etwa 2.4 nm und zweite Kanäle mit größeren Durchmesser von etwa 9.0 bis 10,0 nm.

Beispiel 6 Herstellung von Molekularsieben

Die Herstellung von Molekularsieben kann durch Integration der Porine in durch S-Layer unterstützte biomimetische Membranen erfolgen. (Sleytr, U.B., Pum, D. and Sara, M. Advances in S-layer nanotechnology and biomimetics. Adv Biophys 34, 71-9 (1997)). Eine Alternative ist die Verwendung von porösen Filmen aus Cadmiumsulfid oder -tellurid mit hydrophoben Löchern im Nanometerbereich (Service, R.F. Making devices smaller, brighter and more bendy. Science 282, 2179-2180 (1998)).

Beispiel 7 Herstellung von metallischen Nano-Kanälen

Porine mit einem Kanaldurchmesser von 2-10 nm eignen sich zur Synthese von metallischen Nanokanälen. Die Abscheidung von Kupfer-, Silber- und Golddrähten gelingt an den o. g. Substraten in Gegenwart des Kanalproteins aus M. smegmatis unter Verwendung von 0.010 molaren Lösungen von Cu(II)- Diacetat, Ag(I)-Acetat und Au(III)-Acetat in Anwesenheit von 1.0 mol L^-1 Triethylammoniumperchlorat, gelöst in n-Hexan. Das kanalbildende Proteins wird auf der Oberfläche eines Substrats nach in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren abgeschieden. Dann wird die lateral-strukturierte Oberfläche in den Elektrolyt getaucht und für 15 h bei einer negativen Spannung von -2.0 V galvanisiert. Nach dem Ende der Abscheidung wird die erhaltene zweidimensionale Nanostruktur viermal unter Verwendung von n-Hexan (4 × 5.0 mL) gewaschen und danach im Hochvakuum (1 × 10^-6 bar) getrocknet.

Beispiel 8 Herstellung von Nano-Partikeln

Zur Synthese von Nanopartikeln wurden folgende Verfahren vorgeschlagen:

Verfahren A Adsorption, Hydrolyse und nachfolgende Oxidation von Halbleiter-Vorstufen

TiF₃ und Ti(III)-ethylenglykolat adsorbieren in leicht saurer Lösung (pH = 6.4-6.2) im Inneren der Kanäle von MspA. Beim vorliegenden pH-Wert erfolgt in einer Argonatmosphäre bei einer Temperatur von 30°C die Oxidation von Ti(III) zu Ti(IV) nur sehr langsam (t_1/2≈ 30 min). Unter Verwendung einer Osmose-Membran kann ein konstanter pH-Wert während der Abscheidereaktion realisiert werden.

Nach diesen Prinzipien (Verwendung des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis als Template, wasserlöslicher Precursor, schnelle Abscheidereaktion, langsame Oxidation zur gewünschten Oxidationsstufe, gefolgt von Wiederauflösen des Templates in DMSO und nachfolgende Wiedergewinnung durch Kristallisation) können sehr wahrscheinlich auch andere Halbleiter-Nanopartikel synthetisiert werden.

Lösungen von TiF₃ und Ti(III)-ethylenglykolat werden in einer NaCl-Lösung (2.0 mol L^-1) bei T = 0°C unter Argon als Schutzgas gelöst (c = 5 × 10^-3 mol L^-1). Danach wird das Kanalprotein (c = 1 × 10^-5 mol, gelöst in 100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.10 g L^-1 SDS) hinzugegeben. Die Volumen betragen V = 1.0 mL für die Ti(III)-Lösungen und 0.05 mL für das gelöste Kanalprotein. Danach wird die Temperatur der Lösung innerhalb von 10 min. auf T = 30°C linear gesteigert. Innerhalb von 2 h wird die Abscheidereaktion in einer O₂-gesättigten Lösung durchgeführt. Der pH-Wert der Lösung wird innerhalb dieser Zeit unter Verwendung einer Osmose-Membran bei 6.2-6.4 gehalten. Danach werden die TiO₂-dotierten Kanalproteine unter Verwendung einer Ultrazentrifuge abgetrennt (30 min.) und danach in V = 1.0 mL des hier beschriebenen Puffers gelöst. Der Reinigungsprozeß wird zweimal wiederholt. Die Befreiung der Titandioxid-Nanopartikel vom Kanalprotein- Templat wird durch zwei unterschiedliche Methoden erreicht:

a) Durch Eintrag in DMSO (V = 1.0 mL) wird das Kanalprotein- Templat aufgelöst.
b) Durch Verwendung von Proteinase K wird das Kanalprotein- Templat aufgelöst.

Verfahren B Photochemische Reduktion

Auch dieses Verfahren kann im wäßrigen Medium erfolgen. Dazu wird Phenothiazin als irreversibler photochemischer Elektronendonor verwendet (Turro et al., 1995). Da Phenothiazin ein positiver, hydrophober Heterozyklus ist, wird dieser in den Kanalstrukturen des Porins aus M. smegmatis coadsorbiert. Nach Bestrahlung mit UVB+UVA-Photonen erfolgt in den Kanälen ein irreversibler Elektronentransfer, wobei reduktive Abscheidungsreaktionen stattfinden können. Hierdurch ist die photoelektrochemische Reduktion von Silber(I), Gold(III), Kupfer(II) und Platin(II)-Salzen möglich. Ein Vorteil dieses Verfahrens ist es, daß kein Elektrolyt zugesetzt werden muß.

Die photochemische Abscheidung von Kupfer-, Silber- und Goldpartikeln gelingt unter Verwendung von Phenothiazin (c = 5 × 10^-3 mol L^-1), das in n-Hexan gelöst ist. Die experi mentellen Bedingungen entsprechen denen im Beispiel 1, mit der Ausnahme, daß kein Elektrolyt zugesetzt werden muß. Unter Verwendung einer Quecksilber-Mitteldrucklampe (z. B. TQ 150, Heraeus Noblelight) wurde die Oberfläche unter Verwendung eines Pyrex-Filters für 30 min belichtet. Der Abstand zwischen der Lampenoberfläche und der bestrahlten Struktur betrug 20 cm.

Verfahren C Elektrochemische Abscheidung von Nanopartikeln

Nach der Konstituierung von lateralen Nanostrukturen an leitenden Oberflächen (z. B. ITO oder Graphit) gemäß Beispiel 5 kann eine elektrochemische Erzeugung von Nanopartikeln unter Verwendung des Kanalproteins aus M. smegmatis erfolgen. Hierzu wird eine geeignete Precursorverbindung (z. B. TiF₃, Ti(III)-ethylenglykolat, Kupfer(I) acac oder d-Block- Carbonylverbindungen) in Hexan gelöst und ein geeignetes anodisches Potential der verwendeten Elektrode eingestellt. Um eine ausreichende elektrische Leitfähigkeit des Lösungsmittels zu gewährleisten, wird ein in Tetrabutylammoniumperchlorat löslicher Elektrolyt zugesetzt. Durch dieses Verfahren können anorganische Nanopartikel abgeschieden werden. Nach dem Entfernen des organischen Lösungsmittels kann eine Hydratisierung der gebildeten Strukturen erfolgen, auch wenn weiterhin ein anodisches Potential der Elektrode eingestellt wird. Dadurch wird ein Anhaften des negativ geladenen Kanalproteins an der Oberfläche sichergestellt. Organische Nanopartikel sind analog durch Elektropolymerisation von aromatischen Aminen, wie z. B. Anilin, Diaminobenzol oder Diphenylamin erhältlich. Das verwendete Kanalprotein-Templat läßt sich nach beendeter Reaktion wieder weitestgehend ablösen, indem Detergens- haltige Puffer oder DMSO verwendet werden.

Die Abscheidung von TiO₂, CuO, Fe₂O₃ und organisch leitenden Nanopartikeln gelingt an den o. g. Substraten in Gegenwart des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis unter Verwendung von 0.010 molaren Lösungen von TiF₃ und Ti(III)-ethylenglykolat, Cu(II)-Diacetat, Fe₂(CO)₁₀, Anilin, Diaminobenzol oder Diphenylamin in Anwesenheit von 1.0 mol L^-1 Triethylammonium perchlorat, gelöst in n-Hexan. Nach der Abscheidung des Kanalproteins auf der Oberfläche der Substrate gemäß Beispiel 1, wird die lateral-strukturierte Oberfläche in die Abschei delösung eingetaucht und für 15 h bei einer positiven Abscheidespannung von +2,3 V elektrolysiert. Nach dem Ende der Abscheidung wird die erhaltene zweidimensionale Nanostruktur viermal unter Verwendung von n-Hexan (4 × 5.0 mL) gewaschen und danach im Hochvakuum (1 × 10^-6 bar) getrocknet.

Beispiel 9 Herstellung von Nano-Drähten

Gemäß dem Verfahren C in Beispiel 3 können durch elektro chemische Reduktion von Silber(I)-, Gold(III)- und Kupfer(II)-Salzen auch Nanodrähte hergestellt werden. Dazu muß ein genügend negatives Potential der Trägerelektrode eingestellt werden. Vorteilhaft ist die Verwendung von Acetaten der vorgenannten Metalle.

Das Verfahren C besitzt den Vorteil, daß die auf Oberflächen gezielt erzeugten Kanäle - in Abhängigkeit der ausgewählten Oberflächenmodifikation und/oder Kanalstruktur - in jedem Falle länger als 2 nm sind. Somit ist die Synthese von echten Nano-Drähten durch elektrochemische Abscheidung von Ionen und anderen elektrochemischen Precursorverbindungen (z. B. Metallchloride, Metallfluoride oder Acetate) möglich.

Beispiel 10 Herstellung von Käfigen und Wirtsverbindungen für Katalysatoren

Die ausgezeichnete Langzeitstabilität des Kanalproteins MspA aus M. smegmatis und sein hohes negatives Oberflächenpotential machen es als Käfig für Katalysatoren sehr interessant. Aus wäßriger Lösung lassen mittels Ionen austausch Eisen(III)-Partikel einlagern. Diese Einlagerung erfolgt spontan und kann durch die eingesetzten Konzentra tionen an Eisen(II/III)-Salzen und an Kanalprotein gezielt gesteuert werden. Ein weiterer wichtiger Parameter ist die gewählte Abscheidungstemperatur. Neben anorganischen Salzen können auch Metallkomplexe vom Eisen(II)- bzw. Ruthenium(II)- polypyridyl-Typ erfolgreich in die Kanalstrukturen integriert werden.

Die Verwendung des Kanalproteins ermöglicht außerdem die Synthese von anorganischen und organischen Nanopartikeln. Z. B. können TiO₂-Partikel gemäß L. Kavan, B. O'Reagan, A. Kay, M. Grätzel, J. Electroanal. Chem., Preparation of TiO₂ (anatase) films on electrodes by anodic oxidative hydrolysis of TiCl₃. 291-307 (1993) durch elektrochemische Oxidation von TiCl₃ hergestellt werden. Auch die Herstellung redoxaktiver, organischer Nanopartikel ist gemäß dem von Palys, 1997 vorgeschlagenen Verfahren (B.J. Palys, J. Bukowska, K. Jackowska. SERS of 1,8-diaminonaphthalene on gold, silver and copper electrodes. Polymerisation and complexes formed with the electrode material. Journal of Electroanalytical Chemistry 428, 19-24. (1997)) möglich. Dabei werden die Partikel durch anodische Elektropolymerisation die im Inneren der Kanäle abgeschieden. Das kanalbildende Protein wirkt hier als chemisch resistente Umgebung. Es schützt vor Auflösung und Koagulation der katalytischen Partikel.

Eine weitere Möglichkeit besteht in der Auflösung des Kanalproteins nach der Synthese und der nachfolgenden in-situ Synthese einer einbettenden Schicht. Hierzu können organische Polymere (z. B. PMMA) verwendet werden, die in-situ durch die Methode der (Photo)polymerisation dargestellt werden können (E. Zagladko, Y. Medvedevskikh, A. Turovski, G. Zaikov. The Kinetics of the Three-Dimensional Photopolymerization of Some Dimethacrylates: The Microheterogeneous Model. International Journal of Polymeric Materials 39, 227-236 (1998)).

Zur Trennung der katalytischen Nanopartikel können auch Zwischenschichten synthetisch hergestellt werden. Dazu werden Lösungen (0.01 mol L^-1) von Fe₂(CO)₁₀, (Ru(bpy)₃)²⁺-Diacetat und TiCl₃ verwendet. Danach wird das Kanalprotein (c = 1 × 10^-5 mol, gelöst in 100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.10 g L^-1 SDS) hinzugegeben. Die Volumen betragen V = 1,0 mL für die Lösungen von Fe₂(CO)₁₀, (Ru(bpy)₃)²⁺-Diacetat und TiCl₃ und 0,05 mL für das gelöste Kanalprotein. Nach einer Reaktionszeit von 12 h wird das dotierte Kanalprotein unter Verwendung einer Ultrazentrifuge angetrennt. Alternativ können die dotierten Proine durch Eintauchen eines ITO- Trägers Oberfläche (1.0 mm²) an dessen Oberfläche fixiert werden. Nach dem Zufügen von (1.0 mL³) MMA, welches 0.1 g L^-1 Benzoindeimethylether als Initiator enthält, gelingt eine Photopolymerisation. Die Bedingungen sind hierbei denen in Beispiel 8.

Im Gegensatz zu zeolithischen Wirtsverbindungen stellt das Kanalprotein MspA aus M. smegmatis einen idealen passiven molekularen Reaktor dar. Es weist keine funktionalen Gruppen aufweist, die mit den abzuscheidenden Nanopartikeln chemische Bindungen eingehen. Die wichtigsten Vorteile der beschriebenen Syntheseverfahren für Nanopartikel und Katalysatoren liegen

- im Wachstum von Nanopartikeln zu definierten Größen
- kostensenkenden Recycling des Templates und
- einer erhöhten Langzeitstabilität von Katalysatoren, die Nanopartikel als aktive Komponenten enthalten.

Beispiel 11 Herstellung chemischer Sensoren

Zur Herstellung eines Senior werden die aromatischen Kohlenwasserstoffen Trimethyl-1-Methylpyrenammoniumchlorid und Trimethyl-1-Butylpyren in den Kanalstrukturen von M. smegmatis physisorbiert. Als photophysikalisches Analysenverfahren wird die Excitation mit linear polarisiertem Licht verwendet. Auch die Messung der emittierten Fluoreszenz erfolgte unter Verwendung eines Polarisationsprismas. Am Beispiel von zwei Poly(Amidoamine) Dendrimeren wurde das Funktionsprinzip dieses Sensortyps erprobt: Während die kleinere SBD-Generation 2.0 (d_eff ≈ 0.8 nm) die linear polarisierte Fluoreszenz beider Pyren-Fluoro phore löscht, wird die signifikant größere SBD Generation 6.0 (d_eff ≈ 3.2 nm) vom Porin ausgeschlossen und löscht die Fluoreszenz daher nicht. Die Konzentrationen betrugen in diesem Experiment (T = 298 K): Trimethyl-1-Methylpyren ammoniumchlorid = 1 × 10^-6 mol L^-1, Trimethyl-1-Butylpyren = 1 × 10^-6 mol L^-1, Kanalprotein aus M. smegmatis = 1 × 10^-7 mol L^-1, gelöst in 100 mM Na₂HPO₄/NaH₂PO₄, pH 6.5, 150 mM NaCl, 0.10 g L^-1 SDS, V = 0.10 mL. Während SBD G 2.0 bereits in einer Konzentration von = 1 × 10^-7 mol L^-1, die Lumineszenz beider Luminophore vollständig löscht, wird sogar bei einer Konzentration von SBD G 6.0 von = 1 × 10^-4 mol L^-1 ledglich eine Lumineszenzlöschung von 11% bzw. 17% beobachtet. Um eine vollständige Lumineszenzlöschung durch SBD G 6.0 zu bewirken, muß dessen Konzentration auf = 1,25 × 10^-3mol L^-1 ansteigen.

Liste der Sequenzprotokolle:
1. mspA-Gen, translatiert
2. mspA-Gen + Promotor, translatiert
3. MspA-Proteins mit vermuteter Signalsequenz
4. synmspA-Gen, translatiert
5. rMspA-Protein

SEQUENZPROTOKOLLE

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von regelmäßigen Nanostrukturen mit folgenden Schritten:

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei eine das kanalbildende Protein enthaltende Lösung auf das Substrat gesprüht wird.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Oberfläche des Substrats, vorzugsweise im Hochvakuum, und bei einer vorgegebenen Temperatur oder einem vorgegebenen Temperaturgradienten dehydratisiert wird.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mit dem kanalbildenen Protein versehene Substrat in eine metallionenhaltige Lösung getaucht und einer Elektrolyse ausgesetzt wird.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in der Lösung aus der folgenden Gruppe ausgewählte Ionen enthalten sind:
Cu²⁺, Ag¹⁺, Au³⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, CO²⁺, CO³⁺, Ni³⁺, Ru²⁺, Ru³⁺, Rh³⁺, Pt²⁺, Pd²⁺, Pb²⁺, Cd²⁺, Cr³⁺, Re²⁺.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Dauer der Elektrolyse 10-20 Stunden, vorzugsweise 13- 17 Stunden, beträgt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei auf der aus kanalbildenen Proteinen gebildeten Schicht mindestens eine weitere aus Kunststoff, halbleitendem oder metallischem Material gebildete Schicht elektrochemisch abgeschieden wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Abscheidung der weiteren Schicht der Elektrolytlösung mindestens eine der folgenden Verbindungen zugesetzt wird: Fe₂(CO)₁₀, (Ru(bpy)₃)²⁺-Diacetat oder TiCl₃.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei an der Innenseite des kanalbildenden Proteins fluorophore Moleküle angelagert oder chemisch gebunden werden.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die fluorophoren Moleküle aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Substituierte aromatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise Naphtalin, Anthracen, Pyren, heterocyclische Verbindungen, vorzugsweise Fluorescein, Ruthenium(II)- polypyridylkomplexe.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Substrat aus einem der folgenden Materialien gebildet ist: Graphit, Kunststoff, Metall, Glas, Keramik.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kanalbildenen Proteine gelöst in einem Puffergemisch auf das Substrat aufgebracht wird.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Puffergemisch ein Monomer zugesetzt ist.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Puffergemisch ein Dien, vorzugsweise Divinylbenzol, 2,3- Diphenyl-butadien zugesetzt ist.

15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei dem Puffergemisch ein Präpolymerisat oder ein Polymer zugesetzt ist.

16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein in Liposomen, Micellen oder in den Tröpfchen einer Emulsion, vorzugsweise einer Mikroemulsion, aufgenommen ist.

17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mit kanalbildenden Proteinen beschichtete Substrat einer Bestahlung mit elektromagnetischen Wellen ausgesetzt wird.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mit kanalbildenden Proteinen beschichtete Substrat mit Elektronen bestrahlt wird.

19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein durch heterologe Expression oder durch Aufreinigung aus Mycobakterien gewonnen wird.

20. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Gram-positive Bakterium ein mindestens eine Mycolsäure enthaltendes Bakterium ist.

21. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Bakterium ein Mykobakterium, vorzugsweise Mycobacterium smegmatis, ist.

22. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein ein Porin ist.

23. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin gegenüber organischen Lösungsmitteln chemisch stabil ist.

24. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin bis zu einer Temperatur von 80°C, vorzugsweise 100°C, thermisch stabil ist.

25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Porin MspA ist.

26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die heterologe Expression in E. coli durchgeführt wird.

27. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das kanalbildende Protein durch Überexpression, vorzugsweise aus E. coli oder Mycobakterien, gewonnen wird.

28. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Expression ein für ein kanalbildendes Protein, vorzugsweise ein Porin, codierendes Gen benutzt wird.

29. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Expression ein mspA-Gen gemäß Sequenz 1 benutzt wird.

30. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Expression ein von der Sequenz 1 abgeleitetes mutiertes Gen benutzt wird, wobei die Mutation so ausgebildet ist, daß die chemische und thermische Stabilität sowie die kanalartige Struktur des exprimierten Proteins im wesentlichen denen von MspA entspricht.

31. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Mutation im wesentlichen in einer Angleichung der Codons von mspA an die Codons der in E. coli hoch exprimierten Gene besteht.

32. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Überexpression ein mutiertes Gen benutzt wird, wobei die Mutation im wesentlichen darin besteht, daß der GC-Gehalt auf weniger als 66% vermindert ist.

33. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zur Überexpression das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 benutzt wird.

34. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein zur Überexpression in E. coli geeigneter Vektor verwendet wird, in den das synmspA-Gen gemäß Sequenz 4 eingesetzt ist.

35. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die kanalbildenden Proteine mittels nicht-ionischer oder zwitterionischer Detergentien aus der Zellwand von Gram positiven Bakterien gewonnen werden.

36. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Detergentien aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind: Isotridecylpoly(ethyleneglycolether)_n, Alkylglucoside, besonders Octylglucosid, Alkylmaltoside, besonders Dodecylmaltosid, Alkylthioglucoside, besonders Octylthioglucosid, Octyl-Polyethylenoxide und Lauyldiamminoxid.

37. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Temperatur bei der Extraktion zwischen 80 und 110°C, vorzugsweise zwischen 90 und 100°C, beträgt.

38. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Extraktionszeit 5 bis 120 Minuten, vorzugsweise 25-35 Minuten, beträgt.

39. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei ein Puffer mit einer Ionenstärke von mehr als 50 mM NaCl oder Na-Phosphat benutzt wird.

40. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei durch heterologe Expression gewonnenes MspA durch Anlegen einer Gleichspannung renaturiert wird.

41. Nanostruktur hergestellt nach dem Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche.

42. Verwendung kanalbildender Proteine zur Herstellung von Nanopartikeln oder von regelmäßigen Nanostrukturen auf Substraten.

43. Verwendung eines für kanalbildende Proteine codierenden Gens zur Herstellung von Nanopartikeln oder regelmäßigen Nanostukturen auf Substraten.

44. Verwendung nach Anspruch 42 oder 43, wobei die kanalbildenen Proteine Porine sind.

45. Verwendung nach Anspruch 45, wobei das Porin MspA ist.