AT502713B1 - Verfahren zur herstellung von lipid-membranen - Google Patents

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von unterstützten Lipidmembranen.

Membranproteine wurden als Schlüsselziele für die biomedizinische Forschung identifiziert. Um die zahlreichen durch Membranproteine vermittelten zellulären Prozesse zu verstehen, sind Informationen über ihre Struktur, Funktion und Beteiligung an verschiedenen Krankheiten eine wesentliche Voraussetzung. Kombinatorische Genetik und Chemie stellt eine große Anzahl von zu testenden pharmazeutischen Molekülen und gentechnisch erzeugten Proteinen zur Verfügung. Somit besteht ein großer Bedarf an wirksamen und verlässlichen automatischen Hochleistungsgeräten zum Screenen - insbesondere der Einzel-Ionenkanal- und Rezeptoraktivität -nicht nur zur Wirkstoffentdeckung, für Sicherheitsscreening und zur Qualitätssicherung, sondern auch in der Grundlagenforschung (Proteomics).

Zur Untersuchung der Funktion von Membran-assoziierten Proteinen, die an Lipidmembranen verankert sind oder diese Membranen unter reproduzierbaren Bedingungen überspannen, muss eine natürlich vorkommende biologische Membranen simulierende Lipidschicht vorgesehen werden. Da Patch-Clamp- und frei stehende Lipidmembrantechiken zu Stabilitätsproblemen führen, wurden verschiedene Arten von stabilisierten und unterstützten Lipidmembranen und Verfahren zur Herstellung solcher Membranen entwickelt (Sackmann, 1996; Cornellet al., 1997; Schiller et al., 2003). Eine der am weitesten verbreiteten Techniken auf dem Gebiet zur Herstellung von Lipidmembranen ist die Langmuir-Blodgett-(LB)-Technik (siehe z.B. Zasadzinski JA et al., Science (1994) 263:1726-1733). Mit dieser Methode ist es möglich, Langmuir-Blodgett-Filme (vorwiegend Lipid-Monoschichten) als mechanisch aneinandergefügte Anordnung amphiphilischer Moleküle auf einer Wasseroberfläche zu erhalten. Sobald die Moleküle zur gewünschten Organisation komprimiert worden sind, kann der Film auf einen festen Träger, der auch Öffnungen aufweisen kann, transferiert werden, indem der zuvor in die Tauchvertiefung eines Langmuir-Blodgett-Apparats eingebrachte feste Träger aus der Vertiefung entfernt wird. Auf Basis der Tauchtechnik können Festkörper-unterstützte Lipidfilme mit verschiedenen physikalischen Eigenschaften erhalten werden. Ein alternativer Ansatz zur Herstellung von Festkör-per-unterstützten Lipidmembranen ist der Einsatz von Liposomen. Durch allgemein bekannte Verfahren erhaltene Liposomen können auf der Oberfläche eines festen Trägers verschmelzen (Keller et al., 1998). Die Bildung von planaren Lipidmembranen auf einem festen Träger mit Liposomen ist ein zweistufiges Verfahren. Zuerst müssen die Liposomen auf dem Substrate adsorbieren, und in einem zweiten Schritt muss die Bildung der Doppelschicht durch Verschmelzen der Liposomen erfolgen. Das oben beschriebene Verfahren leidet jedoch häufig daran, dass es zu keiner Bildung von reproduzierbaren Doppelschichten kommt, da die adsorbierten Liposomen intakt bleiben und die Oberfläche des Substrats bedecken. Diese Lipidstruktur eignet sich nicht für elektrophysiologische Untersuchungen von einzelnen Membranproteinen.

Die WO 01/814525 betrifft die Verwendung von sekundärem Zellwandpolymer zur ausgerichteten Anlagerung von Molekülen, insbesondere von S-Schicht-Proteinen, an einer Oberfläche. Die daraus hergestellten S-Schicht-beschichteten Oberflächen können schließlich dazu verwendet werden, aktualisierte Lipidfilme herzustellen.

Pum D et al. (Trends in Biotechnology 17 (1999):8-12) beschreiben in ihrem Übersichtsartikel potenzielle Anwendungsmöglichkeiten von S-Schicht-Proteinen, die unter anderem auch zur Herstellung von S-Schicht-stabilisierten Lipidmembranen verwendet werden können.

Die WO 02/095406 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Lipid-Doppelschichten mit einer definierten Orientierung auf der Oberfläche eines festen Körpers. Dabei wird die Oberfläche des festen Trägers vor dem Aufbringen der Lipidschicht mit chemischen Substanzen funktionalisiert, die weder Proteine, Glykoproteine, Polypeptide und Peptide sind.

In der US 4,921,706 werden unilamellare Lipidvesikel, die kurzkettige und langkettige 3 AT502 713 B1

Phosphorlipide aufweisen, beschrieben.

Da alle oben angeführten Verfahren zur Herstellung von Festkörper-unterstützten Lipidmembranen arbeitsintensiv sind und keine Lipidmembranen mit der für die Durchführung von Studien z.B. über Membran-bezogene Proteine befriedigenden Qualität liefern, besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Schaffung eines neuen Verfahrens zur Herstellung von Lipidmembranen, insbesondere Festkörper-unterstützten Lipidmembranen, mit dem die Nachteile der Verfahren des Standes der Technik überwunden werden können.

Daher sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer unterstützten Lipidmembran vor, welches die folgenden Schritte umfasst: - Vorsehen eines Substrats, das zumindest teilweise mit einer Schicht umfassend Proteine, Glycoproteine, Polypeptide und/oder Peptide beschichtet ist, - Kontaktieren und Inkubieren des Substrats mit einer Lösung umfassend Bicellen, die mindestens ein kurzkettiges und mindestens ein langkettiges Phospholipid und/oder mindestens ein Detergens enthalten, wodurch eine unterstützte Lipidmembran erzeugt wird, und - gegebenenfalls Entfernen der auf dem Substrat gebildeten Lipidmembran vom Substrat.

Zur Herstellung von Lipidmembranen, bei denen gegebenenfalls Proteine (z.B. Enzyme, lonen-kanäle) in den Membranen verankert sind oder diese überspannen, muss ein entsprechendes Substrat zur Verfügung gestellt werden, das die Bildung einer im Wesentlichen regelmäßigen Lipidmembran gestattet. Es zeigte sich überraschend, dass nicht nur die Wahl eines geeigneten Substrats wichtig ist, sondern dass insbesondere die Wahl einer geeigneten Lipidmembranstruktur zum Aufschmelzen auf einen festen Träger zur Erzielung einer Lipidmembran von vorrangiger Bedeutung ist. Erfindungsgemäß geeignete Lipidmembranstrukturen sind Bicellen. In Erb E.-M. et al. (Anal Biochem 280:29-35 (2000)) ist beispielsweise die Verwendung von Bicellen und Liposomen für die Herstellung von Lipidmembranen auf einem Träger umfassend eine Dextran-Matrix mit hydrophoben Resten auf der Oberfläche beschrieben. Dabei wird nach der Inkubation mit Liposomen oder Bicellen eine signifikante Abnahme der Bindung von BSA auf der hydrophoben Dextran-Matrix beobachtet. Die Autoren sind der Meinung, dass sich sowohl Liposomen als auch Bicellen gleichermaßen gut zur Gewinnung von Lipidmembranen auf solchen Trägern eignen. Es ist jedoch einschlägig bekannt, dass bei Verwendung von Liposomen auf Trägern, die mit Proteinen, z.B. S-Schicht-Proteinen (Wetzer, 1997), Glycoproteinen, Polypeptiden und/oder Peptiden (Naumann et al., 1999, 2002), beschichtet sind, keine Lipidmembran mit ausreichender elektrochemischer Funktionalität, Stabilität und Qualität erzielbar sind. Es war daher überraschend, dass Bicellen zur Herstellung von Lipidmembranen mit ausreichender elektrochemischer Funktionalität, Stabilität und Qualität auf solchen Trägern verwendet werden können.

Gemäß der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei „Bicellen“ um scheibenförmige Lipidaggregate, die aus einer binären Mischung von langkettigen Phospholipiden und mindestens einem kurzkettigen Phospholipid und/oder mindestens einem Detergens gebildet sind (Whiles et al., 2002; Raffard et al., 2000; Glover et al., 2001). Der planare Bereich ist durch langkettige Phospholipide gebildet, die mit Phospholipiden mit unterschiedlichen Kopfgruppen dotiert werden können, um die Ladungscharakteristika der Membran zu verändern (Struppe et al., 2000). Der Bicellenrand wird durch einen oberflächenaktiven Stoff stabilisiert. Ursprünglich wurden Bicellen von Prestegard und Mitarbeitern als Membranmodell für Festkör-per-NMR-Studien von Membran-assoziierten Biomolekülen eingeführt (Ram und Prestegard, 1988; Sanders und Prestegard, 1990). In jüngerer Zeit wurden Bicellen zur Untersuchung der Funktionalität von komplexen Membranproteinen verwendet, die in Bicellen (Sanders und Lan-dis, 1995; Sasaki et al., 2003) und bei der Proteinkristallisation (Faham und Bowie, 2002; Fa-ham et al., 2005) rekonstituiert wurden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind „Detergenzien“ amphipathische, oberflächenaktive 4 AT 502 713 B1

Moleküle mit polaren (wasserlöslichen) und nicht polaren (hydrophoben) Domänen. Sie binden stark an hydrophobe Moleküle oder molekulare Domänen, um Wasserlöslichkeit zu verleihen.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird unter „Lipidmembran“ eine Lipidstruktur verstanden, die durch einen hydrophoben Kern (Alkylketten) und zwei hydrophile Außenteile (Kopfgruppenbereiche) gekennzeichnet ist. Lipidmembranen sind so zu verstehen, dass sie aus einer Lipid-Doppelschicht (Bilayer) bestehend aus Phospholipiden und/oder Etherlipiden oder aus einer Tetraetherlipid-Monoschicht (Monolayer) aufgebaut sind. Erfindungsgemäß stellen jedoch auch mehrfach übereinander gestapelte Lipidschichten Lipidmembranen wie hierin definiert dar.

Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck „Substrat“ auf jedes Material, das zur Unterstützung von Lipidmembranen geeignet ist und in der Folge „unterstützte Lipidmembranen“ liefert. „Substrat“ ist nicht nur auf feste Träger beschränkt, sondern schließt auch Material ein, das Lipidmembranen oder Proteinschichten umfassen kann.

Gegebenenfalls kann die auf dem Substrat gebildete Lipidmembran auf einen anderen festen Träger transferiert oder zumindest teilweise ohne festen Träger verwendet werden (z.B. als Barriere zwischen zwei über eine Öffnung verbundenen Abteilen eines Behälters) (Gufler et al., 2004, Schusteret al., 2001, Schusteret al., 2003).

Die Bindung von Bicellen an ein Substrat wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Substrats beeinflusst. Aufgrund der Anwesenheit von geladenen Phospholipiden in Bicellen neigen Bicellen dazu, sich elektrostatisch an Substrate zu binden, die eine hohe Ladungsdichte aufweisen. Die Verschmelzung von einzelnen Bicellen auf einem Substrat zu einer Lipidmembran wird durch die Anwesenheit von hydrophoben Bereichen auf diesem Substrat beeinflusst. Diese hydrophoben Bereiche gestatten die Bildung von Lipid-Monoschichten aus Bicellen auf dem Substrat, die in der Folge das Wachstum der Lipidmembran auf dem Substrat katalysieren. Da Proteine, Glycoproteine, Polypeptide und Peptide diese Merkmale aufweisen und hydrophobe sowie elektrostatische Wechselwirkungen mit anderen Molekülen katalysieren können, ist das Substrat zumindest teilweise mit diesen Molekülen beschichtet.

Die Immobilisierung von Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden und/oder Peptiden auf Substraten schafft eine Art Spacer zwischen dem Substrat und der Lipidmembran. Das Vorsehen eines Spalts zwischen dem Substrat und der Lipidmembran ist wichtig für die Durchführung von Versuchen wie elektrophysiologischen Messungen. Auf dem Gebiet sind mehrere Verfahren offenbart, die die Bildung dieses Spalts ermöglichen. Zu diesen Verfahren gehört beispielsweise das Vorsehen eines Hydrogels (z.B. Dextran) auf einem festen Träger, wobei die Lipidmembran auf dieses Hydrogel aufgebracht wird (Erb E.-M. et al. (2000) Anal Biochem 280:29-35). Das am meisten ausgeklügelte Konzept ist die Applikation von bifunktionellen Molekülen anstelle eines Polymerpolsters, wodurch eine lipophile Domäne und ein hydrophiler Spacer vorgesehen werden. Der lipophile Teil inseriert sich in ein oder beide Blättchen der Lipidmembran und kann aus Phospholipiden (Naumann et al., 2002; Peggion et al., 2001), Cholesterinen (Lang et al., 1994), Alkylketten (Cornell et al., 1997) oder Phytanoylgruppen (Schiller et al., 2003) bestehen. Der hydrophile Spacer verankert das anzubindende Molekül am Träger und bestimmt die hydrophile Umgebung sowie das Volumen des submembranen Raums. Die meisten angebundenen Moleküle werden durch die Thiolchemie an Goldoberflächen gebunden oder mit einem Vernetzungsmittel an Oxidoberflächen gekoppelt. Ein breites Spektrum von Molekülen wie Lipide (Thio-, Histidin- und Succinimidyllipide), Peptide, Oligomere, Polymere oder Kohlenhydrate werden zur Erzeugung der anbindenden Schicht eingesetzt. Der anbindende Teil erfordert jedoch einige Spacer-Moleküle zur Steuerung des seitlichen Abstands zwischen den angebundenen Molekülen, um ein funktionelles, gut definiertes lonenreservoir zu erhalten, auf dem die Membran ruht (Raguse et al, 1998). Angebundene Doppelschicht-Lipidmembranen (tBLMs) zeigen die Notwendigkeit eines submembranen Raums auf, der sowohl als lonenreservoir dient als auch einen entsprechenden Raum für inkorporierte Membranproteine bietet (Krishna et al., 2003). Das vordringlichste Problem bei tBLMs ist die Erzielung von elektrischen Eigenschaften, 5 AT 502 713 B1 die mit frei stehenden Lipidmembranen mithalten können. Außerdem ist zu sagen, dass insbesondere die weniger undichten Systeme oft nicht durch Membranproteine funktionalisiert werden können, höchstwahrscheinlich aufgrund der beschränkten Fluidität dieser tBLMs. 5 Gemäß der vorliegenden Erfindung inkludiert „Schicht umfassend Proteine, Glycoproteine, Polypeptide und/oder Peptide“ alle Arten von Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden und/oder Peptiden, die auf der Oberfläche eines Substrats immobilisiert werden können. Weiters bezieht sich diese Definition nicht nur auf Monoschichten, sondern schließt auch Protein-Multischichten (Multilayers) mit ein. Protein-Multischichten sind übereinander gestapelte Monoschichten (z.B. io bilden zwei, drei, fünf oder mehr Protein-Monoschichten eine Protein-Multischicht). Weiters kann das Protein, Glycoprotein, Polypeptid und/oder Peptid homogen sein und daher Moleküle ein- und desselben Typs umfassen oder heterolog sein und Mischungen von Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden und/oder Peptiden unterschiedlicher Art umfassen. 15 Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Protein-, Glycoprotein-, Polypeptid- und/oder Peptidschicht mit mindestens einer funktionellen Gruppe modifiziert, wobei die mindestens eine funktionelle Gruppe vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Glycanen und Mischungen davon. 20 Die Verwendung einer modifizierten und/oder rekombinanten Proteinschicht auf dem Substrat liefert Funktionalitäten, an die Bicellen entweder über chemische Kopplungsreaktionen (z.B. Ester-Bindung) oder spezifische Wechselwirkungen (z.B. S-Schicht/ Streptavidin-Fusionsproteinschichten in Kombination mit biotinylierten Bicellen) gebunden werden können. Andere mögliche spezifische Wechselwirkungen sind Lectinbindungen (Dextran-ConA, Asia-25 loglycoprotein-Rezeptor-Glucose), Affinitätsbindungen (z.B. his-tag/Ni2+-lonen/Chelator), Ligan-den-Rezeptor-Wechselwirkungen und S-Schicht-SCWP-Wechselwirkungen (AU 5,201,001). Selbstverständlich ist es auch möglich, Proteine und Polypeptide mit Aminosäuremodifikationen als Ergebnis eines rekombinanten Aminosäureaustausches (z.B. basische gegen saure Aminosäuren) oder von chemischen Modifikationen (z.B. Vernetzung, Derivatisierung) zu verwenden. 30 Solche Proteine können andere physikochemische Eigenschaften (z.B. Oberflächenladung) aufweisen als das korrespondierende Protein und können zur Bindung von Bicellen an das Substrat und zur „Katalysierung“ der Bildung von Lipidmembranen mehr oder weniger effizient eingesetzt werden. 35 Die Protein/Glycoprotein-Schicht besteht vorzugsweise aus S-Schicht-Proteinen („S-layer prote-ins“) oder Fragmenten davon, die nach wie vor eine mit nativen S-Schicht-Proteinen vergleichbare, regelmäßige Proteinschicht bilden können. Das S-Schicht-Proteingitter mit seinen reproduzierbaren physikochemischen Eigenschaften hinunter bis zum Subnanometer-Bereich bildet Verankerungsstellen für die Lipidmembranen (Stabilisierungseffekt), aber unter Beibehaltung 4o einer seitlichen Diffusion der Lipidmoleküle (Fluidität), die die Inkorporation auch von großen Membranproteinen nicht beeinträchtigt. Darüber hinaus können Membranproteine auch am S-Schicht-Gitter verankert werden, insbesondere an S-Schicht-Fusionsproteinen (z.B. Wechselwirken S-Schicht/Streptavidin-Fusionsproteine mit einem biotinylierten Lipidmembranprotein). Dadurch ist eine kontrollierte Orientierung des Membranproteins in der Lipidmembran möglich. 45 S-Schicht-Proteine als Substrate oder Substratbeschichtung eignen sich sehr gut zur Herstellung von Lipidmembranen, weil ihre Fähigkeit, regelmäßig geformte Strukturen zu bilden, die Bereitstellung entsprechender Oberflächen gestattet, auf denen Lipidmembranen mit Bicellen gebildet werden können. Insbesondere die Sanftheit des S-Schicht-Gitters mit Stufen, die nicht so höher als die Dicke einer Protein-Monoschicht (z.B. ~ 5 nm bis 8 nm) sind, ermöglicht die Herstellung von höchst flachen Lipidmembranen. Darüber hinaus liefert die kristalline S-Schicht reproduzierbare funktionelle Gruppen in gut definierten Positionen. Somit ermöglicht die S-Schicht eine gut definierte und stark orientierte Bindung von Membran-bezogenen Molekülen (Membranproteinen, Lipiden). Im Gegesatz dazu sind Stufen von bis zu 100 nm und mehr sogar 55 bei ultradünnen Polymerkissen zu erwarten. Dextran-Matrizen sind sehr raue und amorphe 6 AT502 713B1

Strukturen, und chemisch eingeführte funktionelle Gruppen wie hydrophobe Reste werden willkürlich zugeordnet. Daraus folgt, dass die Sanftheit der S-Schicht-Gitter eine starke positive Wirkung auf die Stabilität und Fluidität von unterstützten Lipidmembranen ausübt. Am wichtigsten ist, dass die Verschmelzung aufgrund einer besseren Zugänglichkeit der Bicellen zueinander leichter zu sein scheint. „S-Schicht“-Proteine sind der äußerste Zellhüllenbestandteil eines breiten Spektrums von Bakterien und Archaea. S-Schichten sind durch eine einzige Protein- oder Glycoproteinart (MG 40-200 kDa) gebildet und weisen eine schräge (p1, p2), quadratische (p4) oder hexagonale (p3, p6) Gittersymmetrie mit Zeileinheitsdimensionen im Bereich von 3 bis 30 nm auf. S-Schichten sind im Allgemeinen 5 bis 10 nm dick und haben Poren identischer Größe (Durchmesser 2 bis 8 nm) und Morphologie. S-Schicht-Proteine werden routinemäßig in mehreren technischen Anwendungen verwendet. Die EP 0 306 473 B1 offenbart z.B. die Verwendung von S-Schicht-Proteinen als Träger für Haptene, immunogene oder immunstimulierende Substanzen. Die Immobilisierung von Molekülen, insbesondere Proteinen, auf S-Schicht-Proteinen ist in der EP 0 362 339 B1 beschrieben. In der WO 02/097118 A1 ist die Herstellung einer Schicht aus funktionellen Molekülen auf einem Substrat unter Verwendung von S-Schicht-Proteinen offenbart. Dabei wird die Proteinschicht auf der Oberfläche eines Trägers gebildet, indem eine elektrochemische Spannungsdifferenz zwischen der Lösung und der Oberfläche erzeugt wird. Die EP 0 189 019 B1 offenbart die Herstellung und Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran unter Einsatz von S-Schicht-Proteinen.

Auch wurde die Anwendung von zweidimensionalen kristallinen Bakterienoberflächenschichten (S-Schichten) als molekulare Baublöcke im Rahmen von Festkörper-unterstützten funktionellen Phospholipid- und Tetraether-Lipidmembranen eingeführt (Schuster et al., 1998, 2001, 2003; Gufler et al., 2004). Im Stand der Technik werden S-Schichten als viel versprechende Strukturen für neue „intelligente“ Membran-basierende Biosensoren mit verbesserter mechanischer Langzeit-Robustheit, einfacher Herstellung und niedrigen Produktionskosten empfohlen.

Insbesondere erwiesen sich zumindest teilweise mit S-Schicht-Proteinen beschichtete Substrate als besonders geeignet zur Herstellung von Lipidmembranen. Mit S-Schichtproteinen beschichtete Substrate weisen Spalte, Stufen, Fehler und Kristallitränder auf, wo zwei Lagen des oberen S-Schicht-Gitters Zusammentreffen. Solche Unregelmäßigkeiten in der Topographie der Substratoberfläche wirken als Lipid-Bindungsstellen und werden von Bicellen erkannt. In einem ersten Selbstanordnungsprozess (SA1) bleiben die Bicellen an den Lipid-Bindungsstellen haften. In einem zweiten Selbstanordnungsprozess (SA2) agieren gebundene Bicellen als Ausgangspunkte für ein anschließendes seitliches Doppelschichtwachstum durch Verschmelzung von Bicellen mit der bereits bestehenden Doppelschicht. Es wird angenommen, dass SA1 eine Bicellen-S-Schicht-Wechselwirkung ist, wohingegen SA2 in erster Linie hauptsächlich eine Bicellen-Bicellen-Wechselwirkung darstellt. Während Wechselwirkungen zwischen Lipidaggregaten (z.B. Liposomen, Bicellen, Doppelschichten) gut charakterisiert sind (Stryer, 1995), sind Lipidaggregat-S-Schicht-Wechselwirkungen noch wenig verstanden. Wenig ist über die dreidimensionale Molekularkonfiguration von S-Schicht-Proteinen und die Anordnung ihrer funktionellen Gruppen bekannt. Sowohl bei ein- als auch bei zweilagigen S-Schicht-Proteinen (z.B. SbpA: NCBI-Zugangsnr. AAF22978) ist die äußere Proteinoberfläche der wässerigen Bulklösung ausgesetzt. Bicellen-Bindung und Bicellen-Wachstum finden nicht nur bei einlagigen S-Schicht-Gittern, sondern auch bei zwei- oder mehrlagigen S-Schicht-Gittern (z.B. doppellagigen S-Schicht-Gittern) statt. Die Lipid-Bindungsstellen werden durch funktionelle Gruppen gebildet, die sich entweder am obersten oder am untersten Gitter befinden.

Es gibt mehrere mögliche Mechanismen für die Haftung von Bicellen an „S-Schicht Lipid-Bindungsstellen“. (i) Ein allgemeines Merkmal von S-Schichten vieler Bacillaceae ist ihre glatte, ladungsneutrale Außenfläche und eine welligere Innenfläche mit hoher Ladungsdichte (Pum und Sleytr, 1996). 7 AT 502 713 B1

Die Innenfläche von mehreren S-Schicht-Proteinen ist netto-positiv geladen (Györvary et al., 2003). Phosphatidylcholin-Kopfgruppen binden an Oberflächen mit hoher Ladungsdichte. Die Vernetzung der Protein-Aminogruppen mit dem starken Vernetzer Glutaraldehyd führte zu einer weiteren Abnahme der Bicellen-Bindung. Die Inkubation des kristallinen S-Schicht-Proteins mit dem homobifunktionellen Vernetzer BS3 (Bis-(Sulfosuccinimidyl)-Suberat) trug ebenfalls zur Bildung der Doppelschicht bei, insbesondere bei längeren Inkubationszeiten. BS3 besteht aus zwei reaktiven Sulfo-NHS-Esterguppen, die mit Aminogruppen auf der Oberfläche der Proteine reaktionsfähig sind. Der Spacer-Arm, der die beiden Esterguppen trennt, hat eine Länge von 1,14 nm. Daher tragen elektrostatische Wechselwirkungen zur Bicellenhaftung bei. (ii) Alternativ können Protein-Epitope vorhanden sein, zu denen die Lipid-Kopfgruppen passen. Solche Epitope können durch mehrere Aminosäurereste gebildet werden. Durch die kristallinen Eigenschaften von S-Schichten und die Ausrichtung von funktionellen Gruppen in klar definierten Positionen wird eine dichte und reproduzierbare Anordnung solcher Epitope bewahrt. (iii) Auch Überreste von sekundärem Zellwandpolymer (SCWP) auf nativen S-Schicht-Proteinen können die Bicellenhaftung auslösen. (iv) Hydrophobe Wechselwirkungen können eine entscheidende Rolle bei der Faltung und Anordnung von Proteinen sowie bei der Bildung von Lipid-Doppelschichten spielen (Stryer, 1995). Isolierte S-Schicht-Proteine assemblieren sich spontan neu in einer zweidimensionalen Kristallanordnung auf einer großen Vielfalt von Oberflächen und Grenzflächen. Die Antriebskraft bei diesem Selbstanordnungsprozess sind nichtkovalente Wechselwirkungen, vorwiegend hydrophobe Wechselwirkungen. Hydrophobe Domänen entlang der defekten Ränder, Stufen und Kristallitgrenzen von rekristallisierten mehrlagigen S-Schicht-Gittern könnten zugänglich sein und mit dem hydrophoben Bicellenkern wechselwirken. Aufgrund der reproduzierbaren Eigenschaften von S-Schichten bilden die hydrophoben Domänen eine „reproduzierbare hydrophobe Perlenkette“ entlang der defekten Zonen. Nähert sich eine Bicelle, könnte diese eine teilweise Lipid-Monoschicht auf den hydrophoben Flächen der S-Schicht bilden, wohingegen die Bicelle auf hydrophilen Flächen doppelschichtig bleibt. (v) Von einem geometrischen Gesichtspunkt aus betrachtet, können strukturelle und randbezogene Wirkungen, die Gitterfehlern und -Unregelmäßigkeiten, Spalten, Stufen und Kristallitgrenzen in einem S-Schicht-Gitter zugeschrieben werden, auch zur Bicellen-Bindung beitragen. Gitterunregelmäßigkeiten sowie die Kristallitgröße einer S-Schicht werden durch die verwendeten S-Schicht-Proteine und die Oberflächeneigenschaften des Substrats beeinflusst. Die Randgeometrie und das Niveau bestimmen die Dimension, die Rauheit und die Schärfe der Spalte und Stufen sowie die Dichte und Regelmäßigkeit der Lipid-Bindungsstellen.

Die Mechanismen der Bicellen-Bindung stellen in erster Linie ein Wechselspiel zwischen elektrostatischen und hydrophoben Wechselwirkungen dar, die durch die intrinsischen Eigenschaften des Proteins, Glycoproteins, Polypeptids und der Peptidschicht, insbesondere der S-Schicht, bestimmt und quantifiziert werden.

Auch wenn sowohl Bicellen als auch Liposomen Lipid-Bindungsstellen auf einem mehrschichtigen Protein, Glycoprotein, Polypeptid und Peptidgitter zu erkennen scheinen, eignet sich die Verwendung von Liposomen zur Herstellung von (Festkörper-unterstützten) Lipidmembranen nicht so sehr wie die Verwendung von Bicellen. Liposomenverschmelzung ist ein häufig eingesetztes Verfahren zur Herstellung von Membranen auf festen Trägern. Vesikel in Lösung zeigen eine Tendenz, sich auf Oberflächen abzuscheiden (Seifert und Lipowsky, 1991). Treffen Liposomen auf eine feste Oberfläche, können sie adsorbieren und entweder intakt bleiben (Adsorption) oder bersten und sich ausbreiten, um eine Lipid-Doppelschicht zu bilden (Verschmelzung) (Jass et al., 2000). Im Vergleich zu Bicellen adsorbieren Liposomen nur und bleiben intakt.

Die Größen der verschiedenen Parameter, die zu Vesikel-Protein-Wechselwirkungen und Vesi- 8 AT 502 713 B1 kelverschmelzung beitragen, sind nach wie vor unbekannt. Das Bersten von Vesikeln und ihre Verschmelzung auf festen Trägern ist sehr komplex und stark abhängig von den Oberflächeneigenschaften, der Oberflächen-Liposomen-Wechselwirkung, der Zusammensetzung, der Größe, der Ladung, den Lösungseigenschaften der Liposomen, der Temperatur und dem osmoti-5 sehen Druck (Jass et al., 2000; Reimhult et al., 2003; Seitz et al., 2000). Es zeigte sich, dass die Bicellen-Morphologie selbst einen bedeutenden Faktor bei der erfolgreichen Bildung von Fest-körper-unterstützten Lipidmembranen darstellt. Das Kombinieren von Bicellen mit einem zumindest teilweise mit Proteinen, Glycoproteinen, Polypeptiden und Peptiden, insbesondere S-Schicht-Proteinen, beschichteten Substrat stellt ein vollkommen neues Verfahren dar. Kein io anderes Lipidaggregat (z.B. Liposomen, Micellen) hat bis heute das gleiche Resultat geliefert. Die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhaltenen Lipidmembranen sind bei 4°C für mehr als zwei, vorzugsweise mehr als drei, insbesondere mehr als vier Wochen stabil. Die Anwendung der Bicellenfusion scheint ein einfaches und praktikables Verfahren zur Herstellung von unterstützten Membranen zu sein, die zur Erzeugung von mit Protein, Glycoprotein, Polypeptid 15 und Peptid sowie S-Schichten beschichteten Mikroanordnungen in Zusammenhang mit Memb-ran/Protein-basierenden Biosensoren für Hochleistungs-Screening und Lab-on-a-Chip-Diagnosen verwendet werden können. Ein rasches und verlässliches Screenen von Membranproteinfunktionen liefert biologisch relevante Informationen von äußerster Wichtigkeit für Menschen, die auf den Gebieten z.B. der pharmazeutischen Forschung, Qualitätskontrolle und 20 Proteomics arbeiten. Was Einzel-Ionenkanal-Messungen anlangt, so sind hierfür stark isolierende Membranen erforderlich.

Protein-, Glycoprotein-, Polypeptid- und Peptid- unter stützte Membranchips finden bei einer großen Vielzahl von Techniken wie elektrochemischen Techniken (z.B. Impedanzspektrosko-25 pie), piezoelektrischen Kristallen und oberflächenakustischen Geräten (z.B. QCM-D), Oberflächenplasmon- und Wellenführungseinrichtungen (z.B. SPR, SPR-Abbildung), Fluoreszenztechniken (z.B. TIRF, FRET und Fluoreszenzmikroskopie), immunanalytischen Techniken und Techniken unter Verwendung von Thermistoren (z.B. Nachweis von exothermen Membranbezogenen Reaktionen) Verwendung. Das breite Spektrum von Verfahren gestattet verschie-30 denartige Anwendungsbereiche wie Screenen von pharmazeutischen Molekülen, Untersuchung von Struktur-Funktions-Beziehungen von Membranproteinen, Ligand-Rezeptor-Wechsel-wirkungen (z.B. Ligand-Fishing, Untersuchung von hormonellen Signalübermittlungen, Affinitätskonstanten, Bindungsspezifitäten), Überwachung des aktiven und passiven Ionen- und Molekültransports durch die Membran und Screenen von toxischen Verbindungen bei der Quali-35 tätskontrolle und beim Sicherheits-Screening.

Erfindungsgemäß können S-Schicht-Protein-Arten aus verschiedenen Organismen verwendet werden. Eine Proteinart wird als natives, rekombinantes oder rekombinantes Protein mit gegebenenfalls unterschiedlichen funktionellen Domäne(n), z.B. Streptavidin, Ligand, Affinitäts-Tag, 40 verwendet. Die S-Schicht ist durch gleichartige S-Schicht-Proteine, eine Mischung von mindestens zwei Arten oder durch unterschiedliche Proteinarten gebildet, von denen jede ein oder mehr spezifische Funktionalitäten aufweist. Das Verhältnis der einzelnen Proteine kann variiert werden. Die S-Schicht kann nativ oder chemisch modifiziert sein. Weiters können S-Schichten als Mono-, Doppel- oder Multi-Schichten umkristallisiert werden. 45

Je nach den verwendeten S-Schicht-Proteinarten werden unterschiedliche Oberflächeneigenschaften nach der Umkristallisierung erhalten; *) Intrinsische Funktionalitäten von nativen isolierten S-Schicht-Proteinen und rekombinanten so S-Schicht-Proteinen mit keiner verschmolzenen funktionellen Domäne: z.B. Ladungsdichte und -Verteilung. In vielen Fällen zeigen die rekombinanten S-Schicht-Proteine, die vorwiegend in E. coli exprimiert werden, eine andere Ladungsverteilung als das aus der Bakterienzellwand isolierte native Protein.

Hinsichtlich ihrer Orientierung in vivo liegt ein allgemeines Merkmal von S-Schichten in 55 ihrer glatteren, ladungsneutralen Außenfläche und einer gewellteren, netto-negativ- 9 AT 502 713 B1 geladenen Innenfläche. Somit legt die Orientierung der S-Schicht-Proteine auf dem Substrat die physikochemischen Eigenschaften fest. *) Funktionalitäten nach der chemischen Oberflächen-modifikation von nativen S-Schichten, z.B. Ladungsänderung und Ladungsdichteänderung, Einführung von chemisch reaktiven Gruppen. *) Künstlich inserierte funktionelle Domänen: gentechnisch hergestellte S-Schicht-Fusionsproteine, chemisch verschmolzene funktionelle Domänen. *) Inerter Oberflächencharakter: neutral geladene Oberflächen. Diese Arten von S-Schichten zeigen keine Bindungsaffinität oder unspezifische Bindung.

Funktionelle Gruppen der mindestens einen Funktionalität auf S-Schichten interagieren mit dem Lipid-Kopfgruppenbereich von Phospholipiden und führen so zu einer Stabilisierung von Lipidmembranen. Die Stabilisierung wurde an Lipidmembranen (Wetzer et al., 1997, 1998; Gufler et al., 2004) und an Liposomen (Küpcü et al., 1995; Mader et al., 1999) nachgewiesen. S-Schichten durchdringen den hydrophoben Bereich von Mono- (z.B. Tetraetherlipid-) oder Doppelschicht-Membranen nicht; daher haben sie keinerlei Auswirkung auf die Integrität der Lipidaggregate, Zellen oder Zellmembranen. S-Schichten schaffen eine natürliche Umgebung für Lipidmembranen und biologische Materialien: z.B. ist die S-Schicht in vielen archaealen Organismen der einzige Bestandteil außerhalb der zytoplasmatischen Membran. Es steht eine große Bandbreite von S-Schicht-Proteinen mit verschiedenen physikochemischen Oberflächeneigenschaften und Funktionalitäten zur Verfügung. Die Implementierung von rekombinanten S-Schicht-Proteinen (US 2002/0168728 A1) und S-Schicht-Fusionsproteinen, welche funktionelle Domänen aufweisen, ermöglicht die Anwendung von spezifischen Bindungsmechanismen (Moll et al., 2002). Aufgrund der hohen Regelmäßigkeit des Kristallgitters können Funktionalitäten erhalten werden, die reproduzierbar in klar definierten Positionen und Orientierungen angeordnet sind. Weiters ist eine signifikante Verringerung der Oberflächenrauheit des Substrats nach der Umkristallisierung zu beobachten (Gufler et al., 2004, Schuster et al., 2003).

Das Substrat ist vorzugsweise im Wesentlichen planar.

Auch wenn eine im Wesentlichen planare Form des Substrats bevorzugt wird, ist es natürlich auch möglich, Substrate zu verwenden, die irgendeine dreidimensionale Struktur haben können. Zu solchen Substraten gehören auch Substrate mit z.B. kugelförmiger Gestalt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das Substrat ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silicium, Halbleitermaterialien, insbesondere Halbleiter-Silicium, Galliumarsenid und Aluminiumgalliumarsenid, organischen und anorganischen Polymeren, Festkörperpolymeren und Mischungen davon.

Die Oberfläche des Substrats ist vorzugsweise mit einem Metall und/oder Metalloxid beschichtet.

Es ist vorteilhaft, wenn das Substrat, auf dem die Proteinschicht immobilisiert ist, mit einem Metall und/oder Metalloxid beschichtet ist. Die Metallisierung des Substrats kann durch Sputtern von Metall auf die Oberfläche oder mittels elektrochemischer Verfahren erfolgen. Weiters gewährleistet eine homogene Metallisierung der Oberfläche, dass die physikalischen Eigenschaften wie Leitfähigkeit der Oberfläche über die gesamte Oberfläche des Substrats im Wesentlichen gleich sind.

Das auf die Substratoberfläche aufgebrachte Metall ist vorzugsweise Gold oder Aluminium, und das Metalloxid ist vorzugsweise Indiumzinnoxid (ITO).

Auf dem Gebiet ist es bekannt, dass insbesondere Gold aufgrund seiner physikochemischen Eigenschaften die Immobilisierung von Proteinen (z.B. S-Schicht-Proteinen) und anderen chemischen Gruppen auf Oberflächen gestattet. Besonders mit Gold beschichtete Oberflächen 1 0 AT 502 713 B1 werden bevorzugt, weil solche Substrate mit daran gebundenen Lipidschichten für verschiedene oberflächenempfindliche Techniken wie Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) verwendet werden können. Zur Verbesserung der Haftung von Gold auf der Substratoberfläche kann diese Oberfläche vor der Aufbringung von Gold zusätzlich mit Chrom beschichtet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die Oberfläche des Substrats chemisch oder physikalisch modifiziert.

Aufgrund der Einführung von Modifikationen auf der Oberfläche des Substrats ist es möglich, die chemischen und/oder physikalischen Eigenschaften dieser Oberfläche zu verändern. Es ist weiters möglich, die Oberfläche zu funktionalisieren, um z.B. eine Oberfläche mit unterschiedlichen funktionellen Gruppen zu erhalten. Die Oberfläche kann dann im Vergleich zu einer unbehandelten Oberfläche hydrophober oder hydrophiler werden oder Moleküle (z.B. Antikörper) spezifisch an die Oberfläche binden.

Die Modifikation ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ionisierender Strahlung, atomaren Radikalen, Coronabehandlung, Silangruppen, funktionellen Gruppen und Mischungen davon.

Die funktionelle Gruppe ist vorzugsweise eine Glycankette, insbesondere ein sekundäres Zellwandpolymer.

Zur Immobilisierung der Proteinschicht oder von Teilen dieser Schicht auf einer Oberfläche können Glycanketten verwendet werden, mit der Maßgabe, dass die Proteine an diese Glycan-ketten (z.B. Lectine) binden können. S-Schicht-Proteine können beispielsweise an Glycanketten wie sekundäre Zellwandpolymere binden. In der WO 01/81425 A1 ist der Einsatz einer Kohlenhydrate (sekundäre Zellwandpolymere) umfassenden Struktur als Verankerungsmittel für S-Schicht-Proteine zur Bindung derselben an einen festen Träger offenbart. Daher ist es von Vorteil, wenn beabsichtigt ist, das Substrat z.B. mit S-Schicht-Proteinen zu beschichten, die Oberfläche des Substrats mit sekundären Zellwandpolymeren zu funktionalisieren.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das mindestens eine langkettige Phospholipid Fettsäurereste mit 10 bis 24, vorzugsweise 12 bis 20, noch bevorzugter 14 bis 18 Kohlenstoffatomen, worin das mindestens eine langkettige Phospholipid vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimyristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristelaidoylphosphatidylcholin, Myristoylpalmitoylphosphatidylcholin, Dipalmi-toylphosphatidylcholin (DPPC), 1,2-Bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin, Di-O-tetradecylphosphatidylcholin, Ei-PC, Di-O-Hexadecylphosphatidylcholin und Mischungen davon. Das langkettige Phospholipid kann mit Tetraetherlipiden gemischt oder durch diese substituiert sein, welche vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Cadi-tocalarchaeintetraetherlipiden, insbesondere Glycerindialkylnonittetraetherlipid (GDNT) und Glycerindialkylglyerintetraetherlipid (GDGT), Calarchaeintetraetherlipiden und Mischungen davon. Tetraetherlipide können vorzugsweise zur Bildung von stabilen Lipidmembranen verwendet werden.

Tetraetherlipide befinden sich in der Zellmembran von Archaebakterien wie dem Archaeon Thermoplasma Acidophilum. Diese Archaebakterien-Lipide können in relativ großen Mengen isoliert und mittels Chromatographie gereinigt werden. Die Kopfgruppen können selektiv modifiziert werden, um eine kovalente Bindung an das Substrat zu erzielen sowie verschiedene Oberflächeneigenschaften hinsichtlich physikochemischen Charakter (Hyrophobizität, Oberflächenladung, Oberflächenenergie), biometrischen Charakter (z.B. Phosphorylcholin) herzustellen und/oder die spezifische Oberflächenzusammensetzung (z.B. Kopplung von spezifischen Signalmolekülen, Peptiden, etc.) zu beeinflussen. Mit Tetraetherlipiden beschichtete Oberflächen sind sehr stabil gegen oxidativen, enzymatischen und hydrolytischen Abbau. Weiters sind Dampf- und Gamma-Sterilisation möglich. Tetraetherlipide umfassende Lipidmembranen kön- 1 1 AT 502 713 B1 nen für Antihaftbeschichtungen, Schutzoberflächen oder Fäulnis hemmende Oberflächen für Biofilme, biokompatible Oberflächen, spezielle Sensor- oder biologische Sensorbeschichtungen sowie Molekularfilme (z.B. für elektrophysiologische Studien) aufgebracht werden.

Gemäß einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst das mindestens eine kurzkettige Phospholipid Fettsäurereste mit 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, Kohlenstoffatomen, worin das mindestens eine kurzkettige Phospholipid vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dicaproylphosphatidylcholin (DHPC), Dicapry-loylphosphatidylcholin (DCPC), Dicaprylphosphatidylcholin, 1-2-Di-O-hexylphosphatidylcholin und Mischungen davon.

Anstelle von kurzkettigen Phospholipiden oder zusätzlich zu diesen können die Bicellen mindestens ein Detergens umfassen, welches vorzugsweise ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-[(3-Chloramidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfat (CHAPS), Dicaproylphosphatidylcholin (DHPC), Dicapryloylphosphatidylcholin (DCPC), Dicaprylphosphatidylcholin, 1,2-Di-O-hexylphosphatidylcholin und Mischungen davon.

Das verwendete Detergens darf die Eigenschaften des in die Lipidmembran zu inkorporierenden Proteins nicht beeinflussen und die Bildung von Bicellen natürlich nicht hemmen.

Ein wichtiger Aspekt hinsichtlich der Verwendung von Detergenzien bei Bicellen zur Verwendung für die Herstellung von Lipidmembranen ist die Fähigkeit des Detergens, die nativen Eigenschaften eines Enzyms oder Proteins, das mit diesen Lipidmembranen in Kontakt gelangt, nicht zu beeinflussen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set zur Herstellung einer unterstützten Lipidmembran, umfassend: - Bicellen und/oder an der Bildung von Bicellen beteiligte Bestandteile, - S-Schicht-Proteine und - gegebenenfalls ein Substrat.

Die S-Schicht-Proteine dieses Sets werden vorzugsweise in stabilisierter Form, vorzugsweise in lyophilisierter Form, zur Verfügung gestellt. Die an der Bildung von Bicellen beteiligten Bestandteile können mindestens ein kurzkettiges und mindestens ein langkettiges Phospholipid und/oder mindestens ein Detergens wie oben definiert umfassen. Selbstverständlich können auch Tetraetherlipide verwendet werden.

Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft eine Lipidmembran oder Festkörperunterstützte Lipidmembran, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältlich ist.

Es stellte sich überraschend heraus, dass eine durch ein erfindungsgemäßes Verfahren erhältliche Lipidmembran verbesserte Merkmale gegenüber ähnliche Membranen zeigt, die durch herkömmliche Verfahren wie die Langmuir-Blodgett- oder Liposomenverschmelzungstechnik erhalten werden können.

Auf einem mit Peptiden, Polypeptiden, Proteinen od. dgl. beschichteten Substrat aufgebrachte Bicellen führten zur Bildung einer Lipidmembran mit einer im Wesentlichen durchgehenden Dicke und im Wesentlichen ohne Anwesenheit von Lipidaggregaten oder unspezifischer Bindung überschüssiger Bicellen. Weiters bedeckte die erhaltene Lipidmembran mindestens 90%, vorzugsweise mindestens 95%, noch bevorzugter mindestens 99%, am meisten bevorzugt 100%, der Peptide, Polypeptide, Proteine od. dgl. umfassenden Oberfläche des Substrats. Die Gesamtbedeckung des Substrats mit Lipidmembranen kann beispielsweise mittels AFM beobachtet werden. 1 2 AT 502 713 B1

Im Gegensatz dazu bedecken Lipidmembranen auf Peptide, Polypeptide, Proteine od. dgl. umfassenden Substraten, die mittels Langmuir-Blodgett-Techniken erhältlich sind, nur etwa 75% der Oberfläche dieser Substrate. Außerdem weisen solche Lipidmembranen Flächen mit Lipid-Multischichten und Lipidaggregaten (aufgrund von kollabierten Lipid-Doppelschichten, 5 Reorganisations- und Desorptionsprozessen) auf und zeigen keinerlei isolierende Wirkung bei Anwendung elektrochemischer Messungen (z.B. Impedanzspektroskopie, zyklische Voltam-metrie). AFM-Aufnahme, elektrochemische und Oberflächenplasmonresonanzmessungen zeigten, dass io die Hinzufügung von Liposomen auf mit Peptiden, Polypeptiden, Proteinen od. dgl. beschichteten Substraten hauptsächlich zu Adsorptions- und weniger zu Verschmelzungsprozessen führen. Verschmelzungsprozesse, die zur Bildung von Lipid-Doppelschichtstrukturen führen, konnten nur auf sehr kleinen Flächen des Substrats mittels elektrochemischer Messungen nachgewiesen werden (siehe auch Naumann et al., 1999, 2002). Die Liposomen adsorbieren vorzugs-15 weise, bleiben intakt und bilden Aggregate. In der Folge ist die Oberfläche des Substrats sehr unregelmäßig.

Die Lipide der erfindungsgemäßen Membran können mit funktionellen Gruppen modifiziert werden, die vorzugsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Biotinyl, Maleimid, 20 Succinyl, Glutaryl, Garboxacyl und Metall-chelatierenden Gruppen und Kombinationen davon, wodurch Biotinyl-, Maleimid-, Succinyl-, Glutaryl-, Carboxacyl- und Metallchelatierungslipide gebildet werden.

Ein noch anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung von Bicellen wie 25 oben definiert zur Herstellung einer Lipidmembran oder Festkörper-unterstützten Lipidmembran auf einem zumindest teilweise mit einer Proteinschicht beschichteten Substrat.

Es zeigte sich überraschend, dass insbesondere Bicellen zweckmäßig zur Herstellung von Festkörper-unterstützten Lipidmembranen auf einem zumindest teilweise mit einer Protein-30 Schicht beschichteten Substrat eingesetzt werden können.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Figuren und Beispiele näher beschrieben, ohne auf diese eingeschränkt zu sein. 35 Fig. 1: Schematische Zeichnung einer Bicellen-Morphologie. Der planare Mittelbereich ist durch langkettige Phospholipide gebildet. Der Rand ist durch kurzkettige Phospholipide stabilisiert.

Fig. 2: Bildung einer DMPC/DCPC-Doppelschicht auf einer SbpA-beschichteten Siliciumscheibe durch Verschmelzung von Bicellen. (A) Rekristallisiertes SbpA auf hydrophilem Silicium vor 40 Zugabe von DMPC/DCPC-Bicellen. Der Prozentsatz der SbpA-Bedeckung betrug 95-98%. Die schwarzen Punkte waren Löcher in der S-Schicht. (B) SbpA/Silicium-Chip nach 45 min Inkubation mit DMPC/DCPC-Bicellen, das Membranstellen entlang des Randes der Fehler und Kristal-litgrenzen der S-Schicht zeigt. (C) SbpA/Silicium-Chip nach 3 Stunden Inkubation mit DMPC/DCPC-Bicellen. Fast das gesamte Chip war mit einer Doppelschicht überzogen. (A, B, 45 C) Linke Bilder: hoher Modus (Z-Bereich = 20 nm). Rechte Bilder: Ablenkungsmodus (Z-Bereich = 8 nm). Scangröße: 30 x 30 pm2. (D) Die Schnittanalyse zeigte eine Doppelschichtdicke von - 5 nm. Scangröße: 5x5 pm2.

Fig. 3: SbpA/Silicium-unterstützte Ei-PC-Doppelschichten. Linke Bilder: hoher Modus. Rechte so Bilder: Ablenkungsmodus. Scangröße: 20 x 20 pm2. Doppelschichtstellen bildeten sich nach 5 Stunden Inkubation mit Ei-PC-Bicellen (A) vor und (B) nach der Inkubation (10 min) mit Bienen-gift-PLA2. PLA2 hydrolysierte die Doppelschicht zur Gänze. Z-Bereich (Höhe) = 20 nm; Z-Bereich (Ablenkung) = 10 nm. (C) Ei-PC-Doppelschicht nach CHAPS-Behandlung (erster Waschschritt): die Doppelschicht konnte nach mehreren Waschungen mit 20 mM CHAPS-55 Lösung vollständig entfernt werden. Z-Bereich (Höhe) = 15 nm; Z-Bereich (Ablenkung) = 8 nm. 13 AT 502 713 B1 (D) Eine Ei-PC-Doppelschicht bildete sich auf mit Glutaraldehyd behandeltem SpbA. Die Bicel-len wurden 5 Stunden lang inkubiert, Z-Bereich (Höhe) = 15 nm; Z-Bereich (Ablenkung) = 7 nm.

Fig. 4: Adsorption von Ei-PC-Liposomen auf einem SbpA/Silicium-Chip nach (A) 5 min und (B) 55 min Inkubation. Scangröße = 30 x 30 pm2. Z-Bereich (Höhe) = 20 nm; Z-Bereich (Ablenkung) - 12 nm.

Fig. 5: Schematische Ansichten des Doppelschicht-Bildungsprozesses durch Bicellen-verschmelzung (SA = Selbstanordnung).

Fig. 6: (A) Schematische Zeichnung der SCWP-Reste auf umkristallisiertem SbpA. (B) Schematische Zeichnung der "reproduzierbaren hydrophoben Perlenkette" entlang der defekten Ränder und Kristallitgrenzen.

Fig. 7: Schematische Zeichnung von Spalten und Stufen innerhalb einer umkristallisierten S-Schicht.

Fig. 8: zeigt eine Oberflächendruck-Flächen-Isotherme (π-A-Isotherme). Der Oberflächendruck [mN/m] ist gegen die Fläche pro Molekül [nm2] aufgetragen.

Fig. 9: zeigt schematisch die Bildung von S-Schicht-Lipidstruktur-Verbundstrukturen auf festen Trägern durch Anwendung der Langmuir-Blodgett-Technik. Methode (A) umfasst die Bildung einer Proteinschicht auf einem festen Träger, gefolgt von einem vertikalen Langmuir-Blodgett-Transfer auf eine an einer Luft/-Wasser-Grenzfläche gebildete Lipidmembran. Bei Verfahren (B) erfolgt die Bildung einer Lipid-Monoschicht an einer Luft/Wasser-Grenzfläche, gefolgt von der Bildung einer Proteinschicht auf dieser Monoschicht und Übertragung der Protein/Lipid-Struktur auf einen festen Träger.

Fig. 10: SbpA-unterstützte DPPC-Doppelschicht gebildet durch die Languir-Blodgett- und Lang-muir-Schaefer-Technik (LB-LS-Technik).

Fig. 11: AFM-Bild einer S-Schicht/Tetraetherlipid-Verbundstruktur (SbpA/Haupttetraetherlipid (MPL) des archealen Organismus Thermoplasma acidophilum) nach Übertragung auf eine Siliciumscheibe mittels LS-Technik.

Fig. 12: Schematische Zeichnung der Adsorption und Teilfusion von Liposomen auf einem mit einer Proteinschicht beschichteten festen Träger.

Beispiele:

Die folgenden Beispiele implementieren die Bicellen-Verschmelzung auf umkristallisierten S-Schichten als grundlegende Alternative zur Liposomenverschmelzung.

In diesen Beispielen wurden Bicellen entweder mit Ei-PC, einer natürlichen Lipidmischung bestehend aus langkettigen und kurzkettigen Phosphatidylcholinen, oder mit einer binären Mischung von DMPC (C14) und DCPC (C8) hergestellt. Als feste Träger wurden Siliciumscheiben verwendet, die mit einer ultradünnen Protein-Doppelschicht (und in einigen Versuchen Protein-Monoschicht) des gut charakterisierten S-Schicht-Proteins SbpA aus dem grampositiven Organismus Bacillus sphaericus COM 2177 beschichtet waren. SbpA (Mr = 120 kDa) bildet ein Gitter mit einer quadratischen Gittersymmetrie und einer Gitterkonstante von 13,1 nm (llk et al., 2002). Eine morphologische Einheit (A ~ 170 nm2) besteht aus vier Untereinheiten. Die Porengröße beträgt ~ 3,5 nm. SbpA ist nicht glycosyliert. Wie für S-Schicht-Proteine typisch, weist SbpA eine wellenförmige nettopositiv geladene Innenfläche und eine glatte ladungsneutrale Außenfläche auf. SbpA rekristallisiert auf einer großen Vielzahl von Oberflächen wie Silicium, Gold, planaren Lipidfilmen, Liposomen und Schichten aus sekundärem Zellwand- 14 AT 502 713 B1 polymer (SCWP). Für die Kristallisation sind Calciumionen erforderlich. SbpA rekristallisiert in Doppelschichten auf hydrophilen Siliciumscheiben und Glas. Auf hydrophoben Siliciumscheiben, Gold und SCPW-Schichten bildet SbpA Monoschichten (Györvary et al., 2003). In Doppelschichten haften die inneren, geladenen Oberflächen aneinander. In Monoschichten sind die Proteine mit ihrer Innenfläche zum Silicium hin orientiert. Die Dicke einer SbpA-Monoschicht (~ 9 nm) wurde mittels Rasterkraftmikroskopie (AFM) (Györvary et al., 2003) und Röntgen-strahlen-Reflektivität (Weygand et al., 1999) bestimmt. Für auf feste Träger umkristallisierte SbpA-Doppelschichten wurde eine Dicke von ~ 15 nm beobachtet (AFM) (Györvary et al., 2003). Auf festen Trägern ist die glattere Außenfläche immer der wässerigen Bulklösung ausgesetzt. Die starre Zellwand von grampositiven Bakterien ist aus Peptidoglycan und zusätzlichen SCWPs gebildet. Es zeigte sich, dass S-Schicht-homologe (SLH) Einheiten, die sich am N-terminalen Teil der Polypeptidkette befinden, die Proteine über SCWPs an der darunter liegenden Zellwand verankern (Ries et al., 1997). SbpA enthält mindestens eine SLH-Einheit. SCWP aus B. sphaericus CCM 2177 ist eine Teichuronsäure, die aus Disaccharid-Grundeinheiten besteht (llk et al., 1999).

Materialien:

Die Phospholipide Ei-Phosphatidylcholin (Ei-PC; Pulver), 1,2-Dioctanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DCPC; C8:0; Chloroform-haltige Lösung) und 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DMPC; C14:0; Pulver) wurden bei der Firma Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA) bezogen. Alle Chemikalien wurden bei der Firma Sigma Aldrich (Wien, Österreich) bezogen. Pufferlösungen wurden in MilliQ-Wasser (Millipore, Mindestwiderstand >18 MOhm cm) zubereitet. Alle Pufferlösungen wurden gründlich entgast und vor Gebrauch durch ein 0,2 pm Celluloseacetatfilter (Sartorius AG, Göttingen, Deutschland) filtriert. Phospholipase A2 aus Bienengift wurde bei der Firma Sigma erworben (3,5 E/ml in 0,5 mM Tris (pH 8,5) enthaltend 10 mM CaCI2).

Beispiel 1: Isolierung und Umkristallisierung von S-Schicht-Proteinen

Wachstum, Zellwandzubereitungen und Extraktionen des aus B-Sphaericus CCM 2177 (Czech Collectio of Microorganisms) isolierten S-Schicht-Proteins SbpA erfolgten wie in Sleytr et al., 1986, beschrieben. Die SbpA-Stammlösung wurde mit 0,5 mM Tris (pH 9) enthaltend 10 mM CaCI2 auf eine Endkonzentration von 0,1 mg/ml verdünnt. Siliciumscheiben (7x7 mm) wurden bei der Firma NMRC (Cork, Irland) erworben. Die Substrate wurden durch zweimaliges Spülen mit absolutem Ethanol und MilliQ-Wasser gereinigt. Anschließend wurden die Substrate in einem Sticktoffstrom getrocknet. Nach Behandeln der Chips mit UV/Ozon in einem Plasmareiniger (PlasmaPrep2; Gala, Gabler Labor Instruments GmbH, Deutschland) wurde sofort die S-Schicht-Proteinlösung für die Umkristallisierung zugesetzt. Die Umkristallisierung dauerte 4 bis 6 Stunden. Untersuchungen mit dem Atomkraftmikroskop (AFM) (Nanoscope III, Digital Instruments Inc., Santa Barbara, CA) wurden durchgeführt, um die vollständige Bedeckung der Goldoberfläche mit einem kristallinen SbpA-Gitter zu bestätigen. Bei einigen Versuchen wurde das SbpA-Gitter mit Glutaraldehyd (20 min; 0,5 % Glutaraldehyd in 100 mM Phosphatpuffer, pH 7,5) oder BS3 (1 mg/ml in MilliQ-Wasser) vernetzt.

Beispiel 2: Herstellung von Bicellen und Liposomen a) Ei-PC-Bicellen: 3 mg/ml Ei-PC (Pulver) und 6 mg/ml CHAPS wurden in einem 10 mM Tris-Puffer (pH 7,4) enthaltend 50 mM KCl hydratisiert. 100 mg Bio-Beads SM-2 (Sigma Aldrich, Wien, Österreich) wurden pro ml Lipid/Detergens-Lösung zugesetzt. Die Lösung wurde gerührt und die OD6oo photometrisch gemessen. Die Lösung wurde von den Beads getrennt, sobald die OD6oo ~ 0,9-1 erreicht hatte (nach ~ 35-40 min Rühren). Die Bicellen wurden vor Gebrauch durch ein Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 200 nm filtriert. Die Bicellenlösung wurde bei 4°C aufbewahrt und innerhalb von 2 Wochen verwendet. Der Durchmesser der Ei-PC-Bicellen betrug 40-50 nm (Transmissions-Elektronenmikroskopie von negativ gefärbten Pro- 1 5 AT 502 713B1 ben). b) DMPCIDCPC-Bicellen: DCPC (Chloroform-haltige Lösung) wurde in Glasflaschen gefüllt. Das Lösungsmittel wurde unter einem Stickstoffstrom abgedampft und die Glasflaschen in einer Vakuumkammer mindestens 2 Stunden lang stehen gelassen, um das gesamte Lösungsmittel zu entfernen. Der Lipidkuchen wurde in 10 mM Tris (pH 7,4) enthaltend 50 mM KCl auf eine Endkonzentration von 50 mg/ml suspendiert. Zur DCPC-Suspension wurde eine entsprechende Menge DMPC (Pulver) gegeben, so dass das Molverhältnis von DMPC/DCPC 3,5 betrug (das Molverhältnis ist als q-Wert bekannt). Die Konzentration betrug 150 mg Gesamtlipid/ml. Die DMPC/DCPC-Mischung quoll 24 Stunden lang. Die Probe wurde durch folgenden Zyklus equi-libriert: heftiges Wirbeln; Kühlen auf 0°C (Eis); Erwärmen auf 40°C im Wasserbad. Der Zyklus wurde wiederholt, bis eine gelartige homogene Lösung erhalten war. Die Lösung wurde auf eine Endkonzentration von 15 mg/ml verdünnt, aliquotiert und bei -70°C bis zur Verwendung aufbewahrt. Die Bicellenlösung wurde vor Gebrauch durch ein Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 200 nm filtriert. Der Durchmesser der DMPC/DCPC-Bicellen betrug 60-80 nm (Transmissions-Elektronenmikroskopie von negativ gefärbten Proben). Für Vergleichszwecke wurden Ei-PC-Liposomen mit Hilfe des Extrusionsverfahrens und anschließenden fünf Einfrier-Auftau-Zyklen hergestellt. Für die Extrusion wurden ein Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Alabama, USA) und Polycarbonatfilter mit einer Porengröße von 100 nm verwendet (Nuclepore, What-man, Kent, UK).

Silicium- und S-Schicht-Substrate wurde mit einer der beiden Bicellenlösungen beschichtet und bei Raumtemperatur in einer Feuchtigkeitskammer inkubiert, um zu verhindern, dass die Probe austrocknet. Nach der Inkubationszeit (30 min bis 18 h) wurden die Proben in einen 10 mM HEPES-Puffer (pH 7,4) enthaltend 100 mM NaCI getaucht und mittels AFM abgebildet. Die Chips wurde durch wiederholtes Waschen in 20 mM CHAPS (gelöst) in MilliQ-Wasser und endgültiges Spülen mit 10 mM HEPES, pH 7,4, 100 nM NaCI, regeneriert.

Beispiel 3: Atomkraftmikroskopie (AFM) AFM-Bilder wurde im Kontaktmodus in Flüssigkeit mit einem Nanoskop-Ill-Atomkraftmikroskop (Digital Instruments, Santa Barbara, CA) aufgezeichnet. Es wurden oxidgeschärfte Siliciumnitridspitzen (Nanosonden, Digital Instruments) mit einer normalen Federkonstante von 0,06 N/m verwendet. Die Ergebnisse sind aus den Fig. 2 bis 4 ersichtlich.

Beispiel 4: Bildung von Lipid-Doppelschichten auf SbpA-beschichteten Siliciumscheiben durch Bicellenverschmelzung

Beide Arten von Bicellen (Ei-PC- und DMPC/DCPC-Bicellen) verschmolzen zu Lipid-Doppelschichten auf SbpA. Die Bildung von Lipid-Doppelschichten durch DMPC/DCPC-Bicellen erwies sich als etwas schneller. Fig. 2A zeigt ein Silicium-Chip mit einem umkristallisierten SbpA-Gitter. SbpA rekristallisierte auf hydrophilem Silicium als doppellagiges S-Schicht-Gitter, wobei große und sehr flache Lagen entstanden. Sehr schmale Spalte wurden entlang der Grenzen der oberen S-Schicht-Lagen nachgewiesen. Die deutlich sichtbaren dunklen Punkte im Höhenbild waren Löcher (0,5-1 pm im Durchmesser) innerhalb der SbpA-Doppelschicht. Die Oberflächenbesetzung lag zwischen 95 und 98%. Fig. 2B und C zeigen AFM-Bilder einer Zeitsequenz einer DMPC/DCPC-Doppelschichtbildung. Nach 45 min Inkubation mit DMPC/DCPC-Bicellen (Fig. 2A) konnten kleine Doppelschichtstellen entlang des Randes der S-Schicht-Fehler und Kristallitgrenzen nachgewiesen werden. Die Fehler im SpbA werden als Zonen beginnender Bicellenadhäsion angesehen (Lipid-Bindungstellen). Anfänglich gebundene Bicellen fungierten als Ausgangspunkte für das nachfolgende Bicellenwachstum. Nach 3 Stunden Inkubation mit Bicellen (Fig. 2B) war der Großteil der SbpA-Oberfläche mit einer Membran überzogen. Nur kleine Löcher in der Doppelschicht waren noch sichtbar. Nach 8 bis 10 h Inkubation war das gesamte SbpA-Gitter mit einer Membran überzogen. Die Membran überspannte die S-Schicht-Löcher nicht. Mittels AFM war es unmöglich festzustellen, ob die Membran den Spalt zwischen 16 AT502 713 B1 zwei S-Schicht-Lagen überspannte oder nicht. Aufgrund von Höhenanalysen wurde eine überspannende Doppelschicht über den Spalten als sehr wahrscheinlich angenommen. Die Dicke der DMPC/DCPC-Membran betrug ~ 5 nm (Fig. 2D). Die Proben konnten mindestens zwei Wochen lang in der Pufferlösung (10 mM HEPES-Puffer pH 7,4, 100 mM NaCI) bei 4°C ohne Beeinträchtigung der Membranqualität aufbewahrt werden.

Beispiel 5: Regenerierung des Chips

Die SbpA/Silicium-unterstützte Lipid-Doppelschicht wurde durch Phospholipase-A2-Hydrolyse (Fig. 3A und B) oder wiederholtes Waschen mit 20 mM CHAPS-Detergenslösung (Fig. 3C, das Bild wurde nach dem ersten Waschschritt aufgenommen) leicht verschoben. Fig. 3A zeigt ein AFM-Bild einer unterstützten Ei-PC-Doppelschicht (nach 5 Stunden Inkubation). In diesem Beispiel war die Bildung der Doppelschicht nicht vollständig, und die schmalen Spalte zwischen den großen Doppelschicht-Lagen (= Spalte entlang der Grenzen der S-Schicht-Lagen) sind deutlich sichtbar. Die Dicke von Ei-PC-Doppelschichten betrug ~ 5 nm. Fig. 3B zeigt die Probe 10 min nach der Inkubation mit Bienengift-PLA2. PLA2 katalysiert die regio- und stereospezifische Hydrolyse der sn-2-Acylester-Bindung von sn-3-Glycerophospholipiden (Verger, 1997) (Nielsen et al., 1999). 10 min nach der Zugabe von PLA2 wurde ein starker Doppelschicht-Abbau beobachtet. Nach 1 Stunde Inkubation verblieben nur wenige Lipidaggregate auf der S-Schicht. Die Chips konnten zur Bildung von Lipid-Doppelschichten mehrmals wiederverwendet werden, indem eine frische Bicellenlösung zugesetzt wurde.

Beispiel 6: Zugabe von Bicellen zu modifizierten Doppelschicht-SbpA-Gittem

Bei einigen Versuchen wurde rekristallisiertes SbpA mit Glutaraldehyd oder dem Vernetzungsmittel BS3 vor Zugabe der Bicellen vernetzt. Nach der Glutaraldehyd-Vernetzung wurde ein signifikanter Rückgang der Lipidschichtbildung insbesondere entlang der S-Schicht-Fehlerränder beobachtet (Fig. 3D). Die Vernetzung mit BS3 zeigte keinerlei Auswirkung auf die Membranbildung. Es bestand kein sichtbarer Unterschied zu Doppelschichten auf unmodifizier-tem SbpA. Der einzige Unterschied bestand darin, dass die Membranbildung etwas langsamer vor sich ging und eine längere Inkubationszeit erforderte (- 12-15 h).

Beispiel 7: Zugabe von Bicellen zu Monoschicht-SbpA

Die meisten Beispiele in der vorliegenden Patentanmeldung beschäftigen sich mit (auf hydrophilem Silicium umkristallisierten) zweischichtigen SbpA-Gittern. Für Vergleichszwecke wurden Bicellen zu (auf hydrophoben Siliciumscheiben, d.h. Scheiben ohne UV/Ozonbehandlung vor der Umkristallisierung, umkristallisiertem) Monoschicht-SbpA gegeben. Im Gegensatz zu einem Doppelschicht-SbpA-Gitter zeigte ein Monoschicht-SbpA-Gitter keine Löcher oder Fehler (Györvary et al., 2003). Die Kristalllagen befanden sich eng beieinander. Auf Monoschicht-SbpA konnte weder eine Bicellenbindung noch eine Lipid-Doppelschichtbildung nachgewiesen werden.

Beispiel 8: Bindung von modifizierten Bicellen auf S-Schicht-Monoschichten

Zur Erleichterung der Bindung von Bicellen an das S-Schicht-Proteingitter wurde das System von SbpA-Streptavidin-Heterotetrameren und biotinylierten Bicellen untersucht. Streptavidin ist ein tetrameres Protein mit vier Bindungstaschen für Biotin. Die Biotin/Streptavidin-Bindung ist eine der stärksten nichtkovalenten Affinitätswechselwirkungen. Basierend auf SbpA von Bacillus sphaericus CCM 2177 wurde ein rekombinantes S-Schicht-Streptavidin-Fusionsprotein designt, in E. coli exprimiert, isoliert und neuerlich gefaltet, um funktionelle Heterotetramere zu erhalten (einkettiges S-Schicht-Fusionsprotein plus dreikettiges Kernstreptavidin) (Moll et al., 2002). Diese SbpA-Streptavidin-Fusionsproteine wurden auf Substrate umkristallisiert und anschließend mit biotinylierten Bicellen inkubiert. Biotinylierte Bicellen wurden durch Mischen von Ei-PC mit 2 Mol% biotinyliertem Lipid (1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N 1 7 AT 502 713 B1 (Cap-Biotinyl)) und CHAPS hergestellt. Wie mittels AFM festgestellt konnten nach 1 min Inkubation Lipidstellen nachgewiesen werden, was darauf hinwies, dass biotinylierte Bicellen an das S-Schicht-Fusionsprotein gebunden waren.

Beispiel 9: Charakterisierung von durch drei verschiedene Membranbildungstechniken gebildeten Festkörper-unterstützten Lipidmembranen (i) Bicellenverschmelzung:

Die durch die Verschmelzung von Bicellen erhaltenen Membranen waren sehr flach (Oberflächenrauheit 0,2 - 0,7 nm) und wiesen (je nach verwendeter Lipidart) eine durchgehende Dicke von ~ 5 nm auf. Die gesamte S-Schicht war mit einer einzigen Lipid-Doppelschicht (keinen Lipid-Multischichten) überzogen. Kleine Spalten zwischen großen S-Schicht-Lagen wurden von der Membran überspannt. Somit stand die Beschichtung des Trägers mit der Lipid-Doppelschicht in Beziehung zur Umkristallisationsqualität der S-Schicht (aktuelle Oberflächenbedeckung von Doppelschicht-SbpA auf Siliciumchips: 90 - 98%), d.h. ein 100%-iger Überzug eines festen Substrats mit einer S-Schicht bedeutete einen 100 %-igen Überzug einer einzelnen Lipidmembran. Die Membranen waren sehr sauber (keine anhaftenden Lipidaggregate oder unspezifische Bindung von überschüssigen Bicellen). (ii) Langmuir-Blodgettry:

Langmuir-Filme sind aneinandergefügte monomolekulare Anordnungen von amphipathischen Molekülen an der Luft/WasserGrenzfläche (Ulman, 1991). Eine Lipidlösung (gelöst in einem flüchtigen Lösungsmittel, z.B. Chloroform) wird auf die Wasseroberfläche (Subphase) eines Langmuir-Teflontrogs aufgetragen. Nach Abdampfen des Lösungsmittels bleibt eine Monoschicht von Molekülen auf der Wasseroberfläche zurück.

Bei Aufträgen der Moleküle auf die Oberfläche sind diese sehr lose gepackt und bilden einen zweidimensionalen "Gaszustand". Die für jedes Molekül verfügbare Fläche auf dem Wasser ist groß und der Oberflächendruck gering. Der Oberflächendruck kann mit Hilfe von einer oder zwei Gleitbarrieren erhöht werden (die für jedes Molekül verfügbare Oberfläche nimmt ab). Der erste Phasenübergang erfolgt vom "Gaszustand" in den "flüssigen Zustand", auch bekannt als flüssig-expandierter Zustand (LE). Bei einer weiteren Kompression geht die Monoschicht vom flüssigen Zustand in den dicht gepackten festen Zustand (flüssig-kondensierten Zustand, LC) über. Eine weitere Kompression führt zum Kollaps der Monoschicht aufgrund der mechanischen Instabilität. Der Oberflächendruck [mN/m], der üblicherweise mit einem Wilhelmy-Plattensensorsystem gemessen wird, wird als Funktion der Fläche pro Molekül [nm2] aufgetragen. Diese Messkurve wird als Oberflächendruck-Flächen-Isotherme (ττ-A-lsotherme; siehe Fig. 8) bezeichnet.

Die ττ-A-lsotherme liefert wichtige Informationen über Monoschicht-Stabilität, Phasenübergänge, Neuorientierung von Molekülen im zweidimensionalen System und Konformationsumwand-lungen. Das Phasenverhalten der Monoschicht hängt in erster Linie von den physikalischen und chemischen Eigenschaften der amphiphilischen Moleküle und von der Temperatur und Zusammensetzung der Subphase ab. Viele Phospholipide haben eine zusätzliche Übergangsphase (L2-L1) zwischen der LE- und LC-Phase. Die Position (Oberflächendruckwert) dieser Übergangsphase hängt stark von der Temperatur ab. Bei höheren Temperaturen erscheint die Position bei höheren Oberflächendruck werten und umgekehrt (Roberts, 1990).

Sobald die Moleküle zur gewünschten Organisation komprimiert sind, kann der Film durch Tauchen des Substrats durch die Monoschicht (Blodgett, 1938) auf einen festen Träger transferiert werden. Von der Luft/Wasser-Grenzfläche transferierte Mono- oder Multischichten werden als Langmuir-Blodgett-Filme (LB-Filme) bezeichnet. Üblicherweise erfolgt der LB-Transfer im festen Zustand, wo der Oberflächendruck hoch genug ist, um eine ausreichende Kohäsion der 1 8 AT 502 713 B1

Moleküle in der Monoschicht zu gewährleisten. Die Monoschicht wird über den gesamten Tauchprozess mit Hilfe der Barrieren auf einen konstanten Oberflächendruck gehalten. Wichtige Parameter sind der Oberflächendruck während der Abscheidung, die Abscheidungsgeschwindigkeit und die Art und Beschaffenheit des festen Substrats. Das Verhältnis zwischen der Re-5 duktion der Monoschichtfläche an der Luft/Wasser-Grenzfläche während der Abscheidung und der Fläche des mit der transferierten Monoschicht beschichteten Substrats wird als "Transferverhältnis" bezeichnet. Das Transferverhältnis ist eine Dimension für die Menge der abgeschiedenen Monoschicht (Idealwert = 1) (Roberts, 1990; Ullman, 1991). io Das horizontale Abheben einer Monoschicht von der Luft/Wasser-Grenzfläche wird als Langmu-ir-Schaefer-Transfer bezeichnet. In einem Langmuir-Trog wird eine komprimierte Monoschicht hergestellt und das Substrat horizontal auf den Monoschicht-Film angeordnet. Durch Heben des Substrats wird die Monoschicht auf das Substrat transferiert. 15 Die Bildung von S-Schicht/Lipid-Verbundstrukturen auf festen Trägern kann durch verschiedene Strategien erfolgen: durch die Langmuir-Blodgett-Technik in Kombination mit der Langmuir-Schaefer-Technik oder durch Vesikel-(Liposomen-)-Verschmelzung, direkte Liposomen-verschmelzung oder eine modifizierte Langmuir-Blodgett-Technik (Gufler et al., 2004) (siehe Fig. 9). 20

Die erste Strategie (A) umfasst die Umkristallisierung eines S-Schicht-Gitters direkt auf einen festen Träger (Gold, Silicium). Die S-Schicht sollte die gesamte Oberfläche bedecken, was sorgfältig mittels AFM überwacht wird. Das erste Blättchen der Doppelschicht bildet sich an der Luft/Wasser-Grenzfläche eines Langmuir-Trogs und wird anschließend durch einen vertikalen 25 Langmuir-Blodgett-Transfer auf das mit der S-Schicht bedeckte Substrat abgeschieden. Das zweite Blättchen wird entweder durch die Langmuir-Schaefer-Technik oder durch Vesikelverschmelzung gebildet. Letzteres Verfahren gestattet die gleichzeitige Rekonstitution von funktionellen Molekülen durch Verschmelzung von Proteoliposomen. Beim zweiten Ansatz (B) wird eine Lipid-Monoschicht an der Luft/Wasser-Grenzfläche eines Langmuir-Trogs gebildet. 30 Die S-Schicht-Proteine werden in die Subphase injiziert und rekristallisiert auf dem Lipidfilm. Anschließend wird die S-Schicht/Lipid-Verbundstruktur von der Luft/Wasser-Grenzfläche vertikal auf das Substrat transferiert. Die Doppelschicht wird durch Bilden des zweiten Blättchens mittels der Langmuir-Schaefer- oder Vesikelverschmelzungstechnik vervollständigt. 35 Neben Phospholipiden werden Membranüberspannende Tetraetherlipide verwendet. Bei letzteren ist nur der erste Lipid-Abscheidungsschritt (vertikaler Langmuir-Blodgett-Transfer) notwendig. AFM-Bilder des Transfers des Lipidfilms auf mit S-Schichten überzogene Träger (Strategie A) 40 zeigten runde Löcher im Bereich von 0,3-2 pm Durchmesser innerhalb der Membranen. Es wurde eine Membran-Gesamtbedeckung von etwa 75% bis 80% des mit der S-Schicht überzogenen Substrats beobachtet. Die Membrandicke wurde mit - 6 nm für eine DPPC-Doppelschicht ermittelt. Flächen mit Lipid-Multischichten und Lipidaggregaten (aufgrund von kollabierten Lipid-Doppelschichten, Neuorganisierungs- und Desorptionsprozessen) wurden 45 ebenfalls registriert. Das Hauptproblem bestand im unzureichenden Transfer von geschlossenen Filmen durch die LB-LS-Technik. Der Membranherstellungsprozess war zeitaufwendig und nicht reproduzierbar, die Qualität des Produktes unterlag daher starken Schwankungen. Die Zugabe von Liposomen zum Auffüllen der Löcher in der Membran durch das Liposomen-verschmelzungsverfahren brachte keine Verbesserung der Membranqualität (nur Liposome-50 nadsorption). Die Isolierwirkung der Membranen war mittels elektrochemischer Messungen (Impedanzspektroskopie, zyklische Voltammetrie) (Gufler, 2004; Wetzer, 1997) nicht nachweisbar (siehe Fig. 10).

Versuche mit der Strategie B (Transfer von S-Schicht/Lipid-Strukturen auf einen festen Träger) 55 zeigten deutlich, dass S-Schicht/Lipid-Strukturen nicht ohne Zerstörung der Struktur transferiert 19 AT 502 713 B1 werden konnten. Daher eignet sich die Strategie B nicht für die Herstellung von S-Schicht-unterstützten Lipidmembranen (siehe Fig. 11). (iii) Liposomenverschmelzung:

Liposomen sind kugelförmige Lipid-Doppelschicht-gebundene Vesikel. Sie werden durch Hydra-tisieren von dünnen, getrockneten Lipidfilmen oder Lipidkuchen in wässeriger Lösung gebildet. Zuerst bilden die hydratisierten Lipide große "zwiebelartige" multilamellare Vesikel (MLVs). Sobald diese Teilchen gebildet sind, können große monolamellare Vesikel (LUVs) von reduzierter und einheitlicher Größe durch Extrusion durch ein Polycarbonatfilter mit bestimmtem Durchmesser (50-200 nm und größer) oder durch Verdünnen eines Detergens erzeugt werden. Vorangehende alternierende Einfrier-Auftau-Zyklen von MLVs erleichtern die Extrusion. Durch Ultraschallbehandlung von MLVs werden kleine monolamellare Vesikel (SUVs) erhalten (Durchmesser 15-50 nm). Über die Bildung von Doppelschichten auf hydrophilen Trägern durch Aufstreichen und Verschmelzen von Vesikeln wurde in vielen Studien berichtet (Kalb et al., 1992; Leonenko et al., 2000; Nollert et al., 1995; Reviakine & Brisson, 2000; Jass et al., 2000). Liposomen können auf einer Oberfläche adsorbieren und entweder intakt bleiben (Adsorption => unterstützte Vesikelschicht oder Vesikelaggregate), oder sie können bersten und eine planare unterstützte Doppelschicht bilden (Fusion) (Nollert et al., 1995; Leonenko et al., 2000). Die Adsorptions-, Fusionsund Desorptionskinetik hängt stark von der Beschaffenheit des Lipids bzw. der Lipidmischung, der Zusammensetzung des Puffers und der festen Träger ab (Kalb et al., 1992) (siehe Fig. 12). AFM-Abbildung (siehe Fig. 4), elektrochemische und Oberflächenplasmonresonanz-Messungen zeigten deutlich, dass die Zugabe von Liposomen vorwiegend zu Adsorptionsprozessen auf S-Schichten führten. Dabei wurden verschiedene Arten von Liposomen und S-Schichten verwendet. Fusionsprozesse wurden durch elektrochemische Messungen nachgewiesen, die zeigten, dass nur eine sehr kleine Fläche des Chips mit einer Doppelschicht, wahrscheinlich Membranflecken, überzogen war. Die Liposomen adsorbierten vorzugsweise und blieben intakt und bildeten Aggregate. Nichtsdestotrotz konnte ein selektiver Valinomycinvermittelter Transport von K+-lonen quer durch eine Membran nachgewiesen werden (Gufler, 2004). Mittels QCM-D konnte gezeigt werden, dass Liposomen vorwiegend auf S-Schichten adsorbierten. Die Liposomenverschmelzung wurde ebenfalls mittels AFM untersucht. Nach der Inkubation der mit der S-Schicht bedeckten Substrate mit den Liposomen (über Nacht) wurden veränderliche Mengen von adsorbierten Liposomen und Liposomenaggregate nachgewiesen. Das wurde bereits früher bei gefriergetrockneten Proben in TEM beobachtet (Wetzer, 1997). Selten konnten Flächen mit Doppelschichtflecken nachgewiesen werden (quantitative Informationen mittels AFM nicht möglich). Die Substratoberfläche war sehr unregelmäßig und mit adsorbierten Lipo-somenaggregaten bedeckt.

Die Zugabe von Liposomen zu Peptidträgern (Naumann et al., 1999, 2002) lieferte unzulängliche elektrochemische Eigenschaften ähnlich, wie sie bei S-Schichten erhalten wurden. Adsorptionsprozesse setzten sich durch. Trotz der schlechten Qualität von Peptid-angebundenen Doppelschichten wurden Rinder-Cytochrom-c-Oxidase und H+-T-ATP-Synthase aus Chlo-roplasten in einer funktionell aktiven Form inkorporiert und mittels Impedanzspektroskopie untersucht.

Quellennachweis:

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Claims (23)

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2. 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-, Glycoprotein-, Polypeptid- und/oder Peptidschicht mit mindestens einer funktionellen Gruppe modifiziert wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, Polypeptiden, Peptiden, Glycanen und Mischungen davon.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Protein-und/oder Glycoproteinschicht eine S-Schicht ist.
5. 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat im Wesentlichen planar ist.
6. 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Substrat ein Material ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Silicium, Halbleitermaterialien, insbesondere Halbleiter-Silicium, Galliumarsenid und Aluminiumgalliumarsenid, organischen und anorganischen Polymeren, Festkörperpolymeren und Mischungen davon umfasst.
7. 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats mit einem Metall und/oder Metalloxid beschichtet ist.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Metall Gold oder Aluminium und das Metalloxid Indiumzinnoxid (ITO) ist.
9. 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche des Substrats chemisch oder physikalisch modifiziert wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Modifikation ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus ionisierender Strahlung, atomaren Radikalen, Coronabehandlung, Silangruppen, funktionellen Gruppen und Mischungen davon.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die funktionelle Gruppe eine Glycankette, insbesondere ein sekundäres Zellwandpolymer, ist.
12. 12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine langkettige Phospholipid Fettsäurereste mit 10 bis 24, vorzugsweise 12 bis 20, noch bevorzugter 14 bis 18 Kohlenstoffatomen umfasst.
13. 13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine langkettige Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Dimy-ristoylphosphatidylcholin (DMPC), Dimyristelaidoylphosphatidylcholin, Myristo-ylpalmitoyl-phosphatidylcholin, Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC), 1,2-Bis(10,12-tricosadiynoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin, Di-O-tetradecylphosphatidylcholin, Ei-PC, Di-O-Hexadecyl-phosphatidylcholin und Mischungen davon.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine langkettige Phospholipid zumindest teilweise durch mindestens ein Tetraetherlipid substituiert ist, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Caditocalarchaein-tetraetherlipiden, 2 2 AT502 713 B1 insbesondere Glycerindialkylnonittetraetherlipid (GDNT) und Glycerindialkylglycerin-tetraetherlipid (GDGT), Calarchaeintetraetherlipiden und Mischungen davon.
15. 15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine kurzkettige Phospholipid Fettsäurereste mit 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, Kohlenstoffatomen umfasst.
16. 16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine kurzkettige Phospholipid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Di-caproylphosphatidylcholin (DHPC), Dicapryloylphosphatidylcholin (DCPC), Dicapryl-phos-phatidylcholin, 1-2-Di-O-hexylphosphatidylcholin und Mischungen davon.
17. 17. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine Detergens ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 3-[(3-Chlor-amidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfat (CHAPS), 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethyl-ammonioj-2-hydroxy-1-propansulfat (CHAPSO), Dodecyldimethyl-N-aminoxid (DDAO), Ce-tyltrimethylammoniumbromid (CTAB), Bis(2-ethylhe-xyl)sulfosuccinat-Natriumsalz, N-Lauroylsarcosin-Natriumsalz, n-Octyl-ß-D-glucopyranosid (OG), n-Dodecyl-ß-G-maltosid (DDM), Natriumcholat, Natriumdesoxycholat (DOC) und Mischungen davon.
18. 18. Set zur Herstellung einer unterstützten Lipidmembran, umfassend: • Bicellen und/oder mindestens ein langkettiges Phospholipid und/oder mindestens ein kurzkettiges Phospholipid und/oder mindestens ein Detergens wie in einem der Ansprüche 12 bis 17 definiert, • S-Schicht-Proteine und • gegebenenfalls ein Substrat wie in einem der Ansprüche 5 bis 9 definiert.
19. 19. Set nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die S-Schicht-Proteine in stabilisierter Form, vorzugsweise in lyophilisierter Form, zur Verfügung gestellt werden.
20. 20. Lipidmembran oder Festkörper-unterstützte Lipidmembran erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17.
21. 21. Membran nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass die Lipide mit mindestens einer funktionellen Gruppe modifiziert sind.
22. 22. Membran nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine funktionelle Gruppe ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Biotinyl, Maleimid, Succinyl, Glutaryl, Carboxacyl und Metall-chelatierenden Gruppen und Kombinationen davon.
23. 23. Verwendung von Bicellen wie in einem der Ansprüche 1 bis 16 definiert zur Herstellung einer Lipidmembran oder einer Festkörper-unterstützten Lipidmembran auf einem zumindest teilweise mit einer Proteinschicht beschichteten Substrat. Hiezu 12 Blatt Zeichnungen