WO2002095406A2 - Immobilisierte asymmetrische lipiddoppelschichten - Google Patents

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WO2002095406A2
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    • G01N2446/80—Magnetic particle immunoreagent carriers characterised by the agent used to coat the magnetic particles, e.g. lipids

Definitions

  • the invention relates to a method for producing immobilized lipid bilayers, the lipid bilayers having a defined orientation with regard to the lipid layers on the surface of a solid.
  • the invention further relates to the use of modified solid surfaces for the production of such lipid bilayers and to a kit for the production of immobilized lipid bilayers.
  • membranes are made up of two layers of lipid molecules that form a lipid bilayer.
  • This lipid bilayer is hydrophobic on the inside and hydrophilic on both outer sides.
  • the structural and functional asymmetry of this lipid bilayer is decisive for the different functions of a membrane.
  • this consists in a different distribution of different lipid molecules in the two lipid layers (“inner leaflet” and “outer leaflet”), which form the lipid bilayer.
  • Other components are various membrane proteins that are located in the biomembrane. These can be transmembrane membrane proteins that span the entire lipid bilayer.
  • membrane proteins are embedded in only part of the lipid bilayer, for example in the outer lipid layer.
  • membrane proteins can also be attached to one or both sides of the membrane.
  • membrane proteins can move laterally in the lipid matrix.
  • the proteins can also be more or less fixed at a certain point through specific interactions. In general, however, it is not possible for membrane proteins to migrate from one lipid layer to the other, so that the asymmetry formed by the various lipids and membrane components of the membrane is a long-term structural and thus of course also functional property of the membrane.
  • glycocalix which performs certain recognition and identification functions, is formed by glycoproteins on the outer side of the lipid bilayer and glycolipids in the outer lipid bilayer.
  • phosphate idylserine lipids are typical of the inner lipid layer of an animal cell. During the programmed cell death (apoptosis), these specific lipids are also built into the outer lipid layer and serve there as a recognition pattern for further processes.
  • asymmetry of membranes are the transport proteins, which allow directed transport from outside to inside or from inside to outside.
  • transport proteins which allow directed transport from outside to inside or from inside to outside.
  • the asymmetry of a biomembrane is the crucial prerequisite for a membrane to be able to perform its complex tasks.
  • biomembranes are of great interest, for example, in the field of pharmaceutical screening and biosensor technology.
  • the inner side of the original membrane can also be directed outwards when the vesicles are formed, whereby one then calls "in-side-out” ISO) vesicles speaks.
  • ISO in-side-out
  • the vesicles resulting from such workup are a mixture of RSO and ISO vesicles.
  • Membrane protein properties are only suitable to a limited extent, since the size of the vesicles and morphology can hardly be controlled and the system therefore has no defined and reproducible properties. Furthermore, such vesicular structures are not accessible to automation because of their low stability and poor manageability. A high-throughput screening, as is necessary in the field of functional tests and pharmaceutical screening, is therefore not possible with vesicles.
  • lipid bilayers are fused on a solid surface, whereby a lipid bilayer is spontaneously formed on the surface (Tamm, LK; McConnell, HM Biophysical Journal 47, 105-113 (1985); Salafsky, J .; Groves, JT ; Boxer, S. Biochemistry 35, 14773-14781 (1996)).
  • Solid surface with transmembrane proteins could Orientation of the lipid bilayer can be achieved in which the originally inner side of the lipid bilayer in the immobilized form points outwards (Kalish, DI; Cohen, CM; Jacobson, BS; Branton, D. Biochim. Biophys. Acta 1978 (506), 97- 1 10). Although the asymmetry of the membrane could be preserved here, it was only possible to orient the inner side of the membrane outwards. Orientation of the membrane with the originally outer side to the outside was not possible. In addition, the enzymatic activities decreased due to the electrostatic interactions of the membrane with the solid surface, so that this system is not suitable for functional studies of the membrane.
  • the object of the invention is therefore to provide a lipid bilayer system which has a defined one
  • Orientation of the lipid layers on a surface of a solid body ensured.
  • This system should be supported by solid bodies, so that it is stable and easy to handle and is also suitable for automation.
  • the orientation, ie the asymmetry of the lipid bilayer, should be freely selectable, so that either the originally outer side of the lipid bilayer or the membrane points outwards or that this side faces the surface of the solid.
  • the functional and structural properties of the lipid bilayer should also be retained in the immobilized form in order to be able to investigate the natural properties of the lipid bilayer or the proteins contained therein or the like in vitro.
  • the method according to the invention serves to produce a lipid bilayer which is immobilized on a solid.
  • the lipid bilayer covers the solid as an essentially continuous membrane film.
  • the lipid bilayer consists of an inner and outer lipid layer (“inner leaflet” or “outer leaflet”), these two lipid layers being oriented in a certain way, so that the immobilized lipid bilayer has a defined orientation or asymmetry with respect to the solid surface.
  • the lipid bilayer is essentially stable and dynamically immobilized on the surface of the solid, so that the structural and functional properties of a natural lipid bilayer, in particular a membrane, are reflected.
  • the surface of the solid is first modified in such a way that a surface is formed which can preferably interact with one of the two lipid layers, that is to say with the inner or the outer lipid layer.
  • the lipid bilayer is deposited on this modified solid surface.
  • the modification of the solid surface according to the invention enables the lipid bilayer to align itself on the solid surface in such a way that a certain orientation of the lipid bilayer is achieved. According to the invention, this is mainly due to electrostatic interactions between the modified solid surface and the two layers of the Lipid bilayer, whereby the interactions can be both attractive and repulsive in nature.
  • the electrostatic interactions in particular in combination with the “ultra-soft” surface explained in more detail below, lead to the desired orientation of the lipid bilayer on the solid. Further details can be found in the description below and in particular in the examples.
  • the asymmetry of the lipid bilayer can be caused on the one hand by different lipids or lipid-analogous molecules in the two lipid layers of the lipid bilayer. Furthermore, the asymmetry can also be based on further components in the lipid layers, which are distributed differently in the two lipid layers. These further components are advantageously proteins, in particular membrane proteins. These can be so-called transmembrane membrane proteins that span the entire lipid bilayer in a certain orientation. Examples of this are various transport proteins that allow directed transport through a membrane or a lipid bilayer. An example of such transmembrane proteins are G-protein coupled receptors (GPCR), which are very interesting targets for potential drugs. The binding sites of these receptors are on the outside of membranes. The method according to the invention is therefore particularly suitable for investigating the interaction of these receptors with potential active substances, since the orientation of the lipid bilayers containing such receptors can be controlled in such a way that these binding sites in the immobilized membrane system are accessible from the outside.
  • GPCR G-protein coupled
  • a solid-supported lipid bilayer can be produced with the aid of the method according to the invention has a certain orientation, this can of course also be used to control the orientation of the components integrated in the lipid bilayer, for example the transport proteins.
  • the method according to the invention therefore provides a membrane model system which is outstandingly suitable for the investigation and characterization of the membrane properties and / or the properties of individual membrane components.
  • the lipid double layer can also have so-called peripheral components, in particular proteins, which are only in one of the two lipid layers or on one of the two surfaces of the lipid double layer.
  • peripheral proteins are G-protein coupled receptors (GPR), which are also very interesting targets for potential drugs. They are located on the inside of the cell membrane and are therefore only accessible after inversion of the original orientation.
  • the lipid structures to be immobilized are first converted into the form of vesicles which, by fusion with the modified solid surface, form the lipid bilayer according to the invention supported by the solid.
  • the vesicles are advantageously provided in an aqueous dispersion.
  • vesicles made of natural material represents a model of the natural membrane in which either the originally inner or the originally outer membrane surface ultimately points outwards.
  • Membrane vesicles for example, which are obtained from erythrocytes or culturable cells, for example CACO-2 cells, are particularly suitable for this.
  • the lipid bilayer can be at least partially constructed from membrane fragments of natural cells.
  • the vesicles are prepared using conventional methods. According to the invention, the vesicles are brought into contact with the modified solid surface, as a result of which the vesicles fuse spontaneously with one another and form the lipid bilayer or the membrane layer. By choosing an appropriately modified surface, the final orientation of the lipid bilayer or membrane layer can be determined in advance.
  • intracellular membranes that can originate, for example, from liver or kidney cells are of course also suitable as natural membranes.
  • cell organelles can be used for the preparation of intracellular membranes.
  • artificial lipid layers or membranes are also suitable for the process according to the invention.
  • Such artificial structures can be assembled (reconstituted) from various components in vitro, so that this provides a corresponding membrane vesicle which can be used in the method according to the invention for producing an immobilized lipid bilayer.
  • Artificial lipid layers as well as natural lipid layers can be made from various lipids, lipid derivatives, lipid-like and / or lipid-analogous Be composed of substances.
  • the lipid layers can have peptides, proteins, nucleic acids, ionic or nonionic surfactants and / or polymers.
  • These additional components of the lipid layers can advantageously be enzymes, receptors and / or ligands which more or less span the lipid layer or the lipid bilayer, are embedded therein and / or are superficially attached to the lipid bilayer.
  • the surface of the solid is first modified in such a way that the orientation of the subsequent formation of a lipid bilayer as a result of the fusion of vesicles is controlled.
  • the modification of the solid surface according to the invention offers optimal conditions for the gentle immobilization of a lipid bilayer or a membrane. These optimal conditions relate to a combination of different intermolecular interactions, the superposition of which results in an attractive force between the lipid bilayer to be applied and the solid. This simultaneously prevents direct contact of the lipid bilayer with the solid. In this way, the characteristic dynamic movement properties of the lipid bilayer, in particular the lateral diffusion of the various lipid components, are largely left unchanged.
  • the modification forms an “ultra-soft” surface which, on the one hand, largely leaves the immobilized lipid bilayer unaffected and, on the other hand, ensures a sufficient distance between the solid surface and the lipid bilayer.
  • Modification of the solid surface according to the invention has the advantage that interactions of components of the lipid bilayer, in particular proteins, with the solid surface are largely minimized or eliminated, so that the membrane proteins, for example, retain their activity, for example their enzyme activity, even in the new environment.
  • the immobilization according to the invention also maintains the lipid properties of the lipid bilayer, as a result of which the natural properties of a membrane are perfectly imitated. Overall, the surface modification thus inter alia decouples the lipid bilayer from the solid surface.
  • This is a very decisive advantage, for example, for an application in the field of biosensor technology, since here immobilized lipid bilayers, in particular membranes, which retain their native properties, for example enzymatic activities and / or channel activities, are required.
  • This advantage of the invention can be used particularly advantageously, for example, in an application with biochips.
  • the final orientation of the lipid layers immobilized thereon is determined by the choice of a specific modification of the solid surface.
  • membrane vesicles of random orientation that is to say so-called ISO and RSO vesicles, can advantageously be produced and brought into contact with the modified solid. Due to the surface properties of the modified solid, essentially only the fusion of the vesicles of a certain orientation takes place. This results in a solid-supported lipid bilayer which has a defined orientation is obtained by the method according to the invention.
  • the modified solid is offered a vesicle preparation with only one orientation. In this way, greater yields of immobilized lipid bilayer of a certain orientation can be obtained if necessary.
  • lipid layers immobilized by the process according to the invention can be checked, which are known to be on the originally inner side, that is to say in particular on the cytoplasmic side, or on the outer side of the membrane or the lipid bilayer.
  • the N-acetylsialic acid released by neuramidase can be examined.
  • the glycocalyx on the outside of the original membrane layer can also be marked using fluorescence-labeled lectins. Details of these analysis methods can be found in the examples.
  • the solid surface is modified according to the invention, an essentially hydrophilic surface is advantageously achieved.
  • the surface is first functionalized. For example, amino functions, epoxy functions,
  • Haloalkyl functions and / or thio functions are applied to the surface.
  • Silanes can advantageously be used for the functionalization.
  • Mercaptans and / or disulfides, in particular alkyl disulfides are also preferred.
  • N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA), polyethyleneimine (PEI) and / or cysteamine, in particular cysteamine hydrochloride are very particularly preferred for the functionalization.
  • interacting molecules with these functions are adsorbed and / or chemisorbed.
  • a previous functionalization of the surface can also be omitted if an interaction of other molecules is readily possible due to the material properties of the solid.
  • polystyrene sulfonate PSS
  • PSPMA poly (styrene-co-maleic anhydride)
  • a particularly preferred substance that is chemisorbed is polyoxyethylene bis (glycidyl ether).
  • further interacting molecules are used to modify the surface, which interact with the initially applied interacting molecules.
  • functional substances are used as interacting molecules which can be used for an analysis of the properties of the lipid bilayer or of the components contained in the lipid bilayer.
  • These are advantageously dyes, in particular fluorescent dyes, and / or enzymatically, chemically and / or photochemically reactive molecules.
  • the modification of the surface is chosen such that the modified surface essentially only interacts with one of the two lipid layers of the lipid bilayer, the interaction being essentially electrostatic in nature, which can be both repulsive and attractive. This ensures that the lipid bilayer aligns itself in a certain orientation during the fusion of the vesicles as the lipid bilayer is deposited on the solid.
  • the modified surface preferably interacts with the originally inner lipid layer (inner leaflet) of the lipid bilayer.
  • the modified surface preferably has a negative net charge.
  • the modification of the solid surface is advantageously carried out by producing “ultra-soft” polymer surfaces with a negative net charge.
  • oriented vesicle systems For depositing the lipid double layer on this modified solid surface, for example, oriented vesicle systems are used that carry a negative net charge on the outside provided essentially hydrophilic surface which reacts so repulsively with the outer lipid layer that the lipid bilayer aligns itself in a fusion of a vesicle preparation essentially so that the originally outer side of the lipid bilayer points outwards, i.e. faces away from the solid, and so is accessible for various examinations.
  • the solid surface is modified such that it preferably interacts with the originally outer lipid layer of the lipid bilayer to be immobilized.
  • the modified surface preferably has a positive net charge.
  • the modification of the surface is preferably carried out by producing soft polymer surfaces with a positive net charge.
  • Oriented vesicle systems which carry a negative net charge on the outside are advantageously used for depositing the lipid bilayers on this modified solid surface.
  • the vesicles align so that the originally outer lipid layer faces the solid.
  • the components that were originally in or on the inner side of the lipid bilayer, for example on the cytoplasmic side are accessible for examination.
  • the solid surfaces modified in this way are preferably brought into contact with the vesicular structures of the lipid bilayer to be immobilized within a medium, preferably an aqueous medium, as a result of which the vesicles spontaneously fuse with one another and with the modified surface and thus form an immobilized lipid bilayer due to the properties of the modified surface , which has a defined asymmetry.
  • the method according to the invention is an extremely easy-to-use system, which requires only little preparative effort.
  • an essentially planar carrier is used as the solid.
  • This can consist of different materials.
  • the surface can advantageously also be made of a different material than the rest of the carrier.
  • the solid surface preferably consists of silicate, a semiconductor, in particular silicon, a noble metal, for example gold, and / or a polymer, for example polystyrene. Other surfaces are of course also possible.
  • films made of powdery metals, semiconductors, noble metals and / or polymers can be used as surface materials, which are applied to largely planar carrier materials or can be applied thereon.
  • These carrier materials can be, for example, documents made of paper, glass, plastic or the like, with which the solid bodies are connected in a suitable manner, in particular by gluing or fusing.
  • dispersible solids which advantageously consist of particles of, for example, microscopic dimensions.
  • Preferred materials for such solids are aluminates, borates and / or zeolites. Colloidal solutions of precious metals, metals etc. are also suitable.
  • silicate particles is very particularly preferred. These particles can be conventional silicate balls, for example.
  • porous particles are used, which increases the surface area available for the immobilization.
  • the particles used are magnetic particles, as a result of which the handling in various applications can be made considerably easier. This plays in particular when using the lipid bilayers immobilized according to the invention
  • the solids used are preferably used in the form of a dispersion.
  • This dispersion is advantageously produced in aqueous solutions.
  • the invention comprises the use of a modified surface of a solid to produce an immobilized lipid bilayer with a defined orientation with regard to the lipid layers on the surface of the solid.
  • the modified surface is suitable for essentially stable and dynamic immobilization of the lipid bilayer. With regard to the further properties of the use of the modified surface, reference is made to the above description.
  • the invention further comprises an immobilized lipid bilayer which can be produced by a method as described above.
  • This immobilized lipid bilayer has a defined orientation and is essentially stable and dynamically immobilized on a solid.
  • the invention further comprises immobilized proteins which can be produced by a method described above.
  • proteins that are associated with a lipid bilayer, which in turn is immobilized on a solid.
  • the proteins are in particular membrane proteins that span the lipid bilayer in whole or in part, that span only one of the lipid layers forming the lipid bilayer or are embedded here, or that are embedded or attached to one or both sides of the lipid bilayer.
  • the invention also includes a kit for producing immobilized lipid bilayers.
  • This kit is intended to immobilize lipid bilayers, so that these lipid bilayers with their inner and outer lipid layers have a defined orientation on the surface of a solid. The orientation can be determined in advance.
  • the immobilized in this way Lipid bilayers are essentially stable and dynamically fixed on the solid, so that they are particularly suitable for functional and structural investigations of the lipid bilayer, for example a membrane.
  • This kit comprises at least one solid with a modified surface which is suitable for the immobilization of the lipid bilayer in the sense of the invention. With regard to the properties of this modified solid surface, reference is made to the above description.
  • the kit does not contain the finished modified surface, but rather the various components that are necessary for producing such a modified surface. This can be advantageous for storage and / or stability reasons, for example.
  • lipid vesicles are also present in this kit, the lipid vesicles preferably having additional components, in particular proteins. These lipid vesicles are intended for fusion on the modified solid surface and thus form the material for the immobilized lipid bilayer. In this case, it may be preferred that further components for the lipid bilayer are provided by the user himself and introduced into the lipid vesicles.
  • the lipid vesicles are advantageously in the form of a dispersion.
  • lipids can also be provided in a form other than vesicles, for example in a dry form.
  • the invention further comprises a kit for the production of immobilized proteins which are immobilized in or on their part
  • Lipid bilayers with a defined orientation comprises at least one solid with a modified surface and preferably lipids, in particular in the form of vesicles, which have the proteins to be immobilized.
  • These proteins are preferably membrane proteins which find their natural environment through immobilization in lipid bilayers and can thus be analyzed under almost native conditions.
  • the invention comprises a method for the investigation of proteins, in particular membrane proteins, these proteins being used as immobilized proteins in their immobilized lipid bilayers.
  • proteins in particular membrane proteins, these proteins being used as immobilized proteins in their immobilized lipid bilayers.
  • immobilized proteins used in lipid bilayers reference is also made to the above description.
  • the further implementation of the method is carried out using customary methods known to a person skilled in the art.
  • Plasma membranes in different orientations on the Solid surface based on the hydrolysis activity of the P-glycoprotein in the presence of a modulator (Verapamil),
  • a freshly prepared silane solution consisting of 9.2 mL N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane (EDA) and 243 ⁇ L concentrated acetic acid in 450 mL deionized water.
  • EDA N- (2-aminoethyl) -3-aminopropyltrimethoxysilane
  • 2 g of a porous silicate material (Nucleosil 50-10 from Macherey-Nagel, Duren) was added to the silane solution and slurried with shaking. This dispersion was slowly rotated for three hours, after which the silicate material is sedimented and three times washed with deionized water.
  • the success of the silanization is documented by means of infrared spectroscopy in diffuse reflection (DRIFT) on the dried silicate material.
  • DRIFT diffuse reflection
  • a porous silicate material (Nucleosil 4000-10) from Macherey-Nagel, Duren) were added to a polyethyleneimine (PEI) solution consisting of 250 mg PEI (50% solution in water, Aldrich, Steinheim) in 50 ml deionized water and rotated slowly for three hours. The silicate material was then sedimented and washed three times with deionized water. The success of the implementation was documented using infrared spectroscopy in diffuse reflection (DRIFT) on the dried silicate material. In a similar way, further carrier materials with pore sizes between 5 and 400 nm were functionalized.
  • PEI polyethyleneimine
  • PSS polystyrene sulfonate
  • Oriented RSO and ISO plasma membrane vesicles were produced by a method by Steck and Kant (Methods in Enzym. 1974, 31, 172-180). This dispersion was then converted into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by extrusion. 50 mg of a porous silicate carrier (Mache-Rey-Nagel, Düren) were added to each 900 ⁇ L of these solutions (approx. 0.5 mg total protein) and incubated for 18 hours at 4 ° C., 100 mM triethanolamine (pH 7, 4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) was used. After that it was The carrier material sedimented and washed three times with incubation buffer.
  • a porous silicate carrier Mache-Rey-Nagel, Düren
  • the success of the coating was documented using DRIFT on the dried material.
  • the activity of the acetylcholinesterase occurring in the outer layer was determined by a method by Ellman et. al. (Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88) on the support material after washing in the incubation buffer. It is important to make holes in the lipid bilayer in a control by means of detergent and thus to measure enzyme molecules possibly facing away from the surface (FIG. 1). These functional tests demonstrated an inversion in the fusion with the solid surface offered, as well as the uniformity (> 90%) of the surface obtained.
  • ISO-oriented plasma membrane vesicles from CACO-2 cells were produced by a method by Schlemmer and Sirotnak (Anal. Biochem. 1995, 228, 226-231). This dispersion was then converted into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by extrusion.
  • 900 ⁇ L of this solution about 0.5 mg of total protein
  • Modified porous silicate carrier added and incubated for 18 hours at 4 ° C, using 100 mM triethanolamine (pH 7.4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) as the buffer solution. The carrier materials were then sedimented and washed three times with incubation buffer.
  • the success of the coating was documented using DRIFT on the dried material.
  • the activity of the P-glycoprotein on the carrier materials was determined after washing in the incubation buffer by determining the ATP hydrolysis activity as a function of known modulator (Verapamil).
  • Verapamil known modulator
  • an RSO-oriented surface is obtained after immobilization, which, however, has no appreciable enzyme activity due to the incorrect orientation of the protein to be examined. Not so with the help of the carrier from example 1.2.1. manufactured ISO surface. It has a hydrolysis activity (FIG. 2) on the carrier material that is comparable to that of the isolated vesicles.
  • RSO-oriented plasma membrane vesicles from HEK293 cells were produced by a method by DePierre and Karnovsky (Journal of Cell Biology 1973, 56, 275-303). This dispersion was then converted into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by extrusion.
  • 900 ⁇ L of this solution about 0.5 mg of total protein
  • Modified porous silicate carrier added and incubated for 18 hours at 4 ° C, using 100 mM triethanolamine (pH 7.4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) as the buffer solution. The carrier materials were then sedimented and washed three times with incubation buffer.
  • Oriented RSO and ISO plasma membrane vesicles were produced by a method by Steck and Kant (Methods in Enzym. 1974, 31, 172-180). These dispersions were then converted into small, single-shell vesicles with a diameter of 20-90 nm by extrusion.
  • a 1: 1 (v / v) mixture of these solutions (a total of about 0.5 mg of total protein) was 50 mg of one according to Example 1.2.2.
  • Modified porous silicate carrier added and incubated for 18 hours at 4 ° C, using 100 mM triethanolamine (pH 7.4) and 100 mM NaCl (incubation buffer) as the buffer solution.
  • the carrier material was then sedimented and washed three times with incubation buffer. The success of the coating was documented using DRIFT on the dried material.
  • the glycocalix (outside of the RSO vesicles) was labeled with the help of peanut lectin (FITC-coupled, Sigma-Aldrich GmbH, Kunststoff) on the support material after washing in the incubation buffer and documented in the fluorescence microscope. This marking shows that only an RSO surface with a uniformity of at least 90% was produced (FIG. 4).

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Abstract

Es wird ein Verfahren bereitgestellt, welches zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten mit jeweils einer inneren und einer äußeren Lipidschicht geeignet ist. Diese Lipiddoppelschichten weisen bezüglich der inneren und der äußeren Lipidschicht eine definierte Orientierung auf der Oberfläche eines Festkörpers auf und sind auf der Oberfläche des Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert. Zur Durchführung des Verfahrens wird zünachst eine Oberfläche eines Festkörpers derart modifiziert, dass eine Fläche ausgebildet wird, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt. In einem zweiten Schritt wird auf dieser modifizierten Oberfläche eine Lipiddoppelschicht deponiert. Bevorzugterweise werden in die Lipiddoppelschicht weitere Komponenten, insbesondere Proteine, eingefügt.

Description

Beschreibung
Immobilisierte asymmetrische Lipiddoppelschichten
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orien-tierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche eines Festkörpers aufweisen. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung von modifizierten Festkörperoberflächen zur Herstellung derartiger Lipiddoppelschichten sowie einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten.
Natürliche Membranen, die sogenannten Biomembranen, sind als wichtiger Bestandteil aller Organismen schon lange Gegenstand intensiver Forschung. Membranen sind im Prinzip aus zwei Schichten von Lipidmolekülen aufgebaut, die eine Lipiddoppelschicht bilden. Diese Lipiddoppelschicht ist im Inneren hydrophob und zu beiden Außenseiten hin hydrophil. Entscheidend für die verschiedenen Funktionen einer Membran ist die strukturelle und funktionelle Asymmetrie dieser Lipiddoppelschicht. Diese besteht zum einen in einer unterschiedlichen Verteilung verschiedener Lipidmoleküle in den beiden Lipidschichten („inner leaflet" und „outer leaflet"), welche die Lipiddoppelschicht bilden. Weitere Komponenten sind verschiedene Membranproteine, die sich in der Biomembran befinden. Hierbei kann es sich um transmembrane Membranproteine handeln, die die gesamte Lipiddoppelschicht durchspannen. Andere Membranproteine sind in nur einem Teil der Lipiddoppelschicht eingebettet, beispielsweise in der äußeren Lipidschicht. Weiterhin können Membranproteine auch auf einer oder beiden Seiten der Membran angelagert sein. Prinzipiell können sich Membranproteine lateral in der Lipidmatrix bewegen. Allerdings können die Proteine auch durch spezifische Wechselwirkungen mehr oder weniger an einer bestimmten Stelle fixiert sein. Im allgemeinen ist es jedoch nicht möglich, daß Membranproteine von einer Lipidschicht zur anderen wandern, so daß es sich bei der durch die verschiedenen Lipide und Membrankomponenten der Membran gebildeten Asymmetrie um eine langfristige strukturelle und damit natürlich auch funktionelle Eigenschaft der Membran handelt.
Ein Beispiel für die Asymmetrie von Biomembranen ist die sogenannte Glykokalix auf der äußeren Seite von Membranen. Diese Glykokalix, die bestimmte Erkennungs- und Identifizierungsfunktionen ausübt, wird durch Glykoproteine auf der äußeren Seite der Lipiddoppelschicht und Glykolipide in der äußeren Lipiddoppelschicht gebildet.
Für die innere Lipidschicht einer tierischen Zelle sind beispielsweise Phosphat-idylserinlipide typisch. Während des programmierten Zelltodes (Apoptose) werden diese bestimmten Lipide auch in die äußere Lipidschicht eingebaut und dienen dort als Erkennungsmuster für weitere Prozesse.
Ein weiteres sehr wichtiges Beispiel für die Asymmetrie von Membranen sind die Transportproteine, die einen gerichteten Transport von außen nach innen oder von innen nach außen ermöglichen. Zusammengefaßt stellt die Asymmetrie einer Biomembran die entscheidende Voraussetzung dafür dar, daß eine Membran ihre komplexen Aufgaben erfüllen kann.
Die Eigenschaften von Biomembranen sind beispielsweise im Bereich des Pharmascreenings und der Biosensorik von sehr großem Interesse.
Beispielsweise werden schon lange Versuche unternommen, um die sehr komplexen Transportvorgänge an Membranen zu verstehen. Weiterhin sind natürlich auch die in der Membran befindlichen Rezeptoren von großer Bedeutung. Von daher besteht ein Interesse an geeigneten Modellsystemen für Biomembranen.
Problematisch hierbei war jedoch bisher, daß in der Regel bei der Herstellung von entsprechenden Systemen die für viele Anwendungen entscheidende Asymmetrie der Membran bzw. der Lipiddoppelschicht verloren geht. So werden bei der Isolierung von natürlichen Membranen aus Organismen oft Ultraschallgeräte oder Polytrone eingesetzt. Bei derartigen Aufarbeitungen entstehen vesikuläre Strukturen mit einer im allgemeinen zufälligen Orientierung der Lipiddoppelschicht. So kann hierbei die im natürlichen System nach außen gerichtete Lipidschicht auch bei den Vesikeln nach außen zeigen. In diesem Fall spricht man von sogenannten „right-side-out" (RSO)-Vesikeln. Andererseits kann auch die innere Seite der ursprünglichen Membran bei den entstehenden Vesikeln nach außen gerichtet sein, wobei man dann von „in-side-out" (ISO)-Vesikeln spricht. In der Regel handelt es sich bei den durch derartige Aufarbeitungen entstehenden Vesikeln um ein Gemisch von RSO- und ISO-Vesikeln. Diese Präparationen sind nicht geeignet, um damit zuverlässige Studien über Membraneigenschaften zu betreiben, da es sich hierbei nicht um definierte Vesikel handelt.
Für die Analyse der bei Membranen vorliegenden Asymmetrie bzw. der Orientierung der beiden Lipidschichten sind verschiedene Verfahren bekannt. Beispielsweise kann die Aktivität asymmetrisch angeordneter Enzyme (Ellman, G. L.; Courtney, A.; Valentino, Jr.; Featherstone, R. M. : Biochem. Pharmacol. 1961 (7), 88) oder die Freisetzung von in bestimmter Weise orientierten Membranbestandteilen mittels Enzymen (Warren, L. J. Biol. Chem. 1959 (234), 1971 ) analysiert werden. Eine weitere Möglichkeit ist die Markierung der Glykokalix mit spezifisch markierten Lektinen oder die Markierung von Membranproteinen von außen- oder innenliegenden Proteindomänen mit spezifischen Antikörpern.
Es wurden sehr aufwendige Methoden entwickelt, um Vesikel einer bestimmten Orientierung herzustellen (z. B. Steck, T. L.; Kant, J. A. Methods in Enzymology 1974 (31 ), 172-180; DePierre, J.W.; Karnovsky, M. L. Journal of Cell Biology 1973 (56), 275-303). Damit konnten vesikuläre Strukturen erzielt werden, in denen die Asymmetrie der natürlichen Membran erhalten ist. Allerdings sind solche Vesikel für Untersuchungen der Membraneigenschaften bzw. der
Membranproteineigenschaften nur sehr bedingt geeignet, da die Größe der Vesikel und Morphologie kaum zu kontrollieren ist und das System somit keine definierten und reproduzierbaren Eigenschaften aufweist. Weiterhin sind solche vesikulären Strukturen wegen ihrer geringen Stabilität und schlechten Handhabbarkeit einer Automatisierung nicht zugänglich. Ein hochdurchsatzfähiges Screening, wie es im Bereich funktioneller Tests und beim Pharmascreening notwendig ist, ist daher mit Vesikeln nicht möglich.
Um dem Problem der geringen Stabilität von vesikulären Strukturen und der schlechten Handhabbarkeit insbesondere in automatisierten Prozessen Rechnung zu tragen, wurden festkörperunterstützte Membransysteme entwickelt. Eine Möglichkeit ist hierbei die Immobilisierung von einfachen Lipidschichten, sogenannten Monolayern, auf einer Festkörperoberfläche. Hierfür kann die Oberfläche zunächst beispielsweise mit Alkylsilanen oder Mercaptanen hydrophobisiert werden. Eine hierauf aufgebrachte Lipidschicht orientiert sich mit ihrem hydrophoben Teil zum Träger hin, und die hydrophile Seite weist nach außen. Dieses System ist jedoch nicht geeignet, die natürlichen Eigenschaften einer Membran zu simulieren, da weder die Dynamik noch die molekulare Ordnung einer natürlichen Membran widergespiegelt wird. Darüber hinaus ist der Einbau von transmembranen Proteinen in einer solchen Lipidmonoschicht erschwert oder oft überhaupt nicht möglich.
Einen besseren Ansatz bietet daher die Immobilisierung von Lipiddoppelschichten auf Festkörperoberflächen. Für die Präparation solcher festkörperunterstützten Lipiddoppelschichten werden Lipidvesikel auf einer Festkörperoberfläche fusioniert, wobei hierbei spontan eine Lipiddoppelschicht auf der Oberfläche ausgebildet wird (Tamm, L. K.; McConnell, H. M. Biophysical Journal 47, 105-113 (1985); Salafsky, J.; Groves, J. T.; Boxer, S. Biochemistry 35, 14773-14781 (1996)).
Der Prozeß der Vesikelfusion und die Ausbildung der Lipiddoppelschicht ist in seinen Details bisher nicht vollständig verstanden. So werden immer noch zwei mögliche Mechanismen in der Literatur diskutiert (Salafsky, J.; Groves, J. T.; Boxer, S. Biochemistry 1996 (35), 14773- 14781 und Puu, G.; Gustafson, I. Biochim. Biophys. Acta-Biomembranes 1997 (1327), 149-161 ). Hierbei geht es vor allem um die Frage, ob das Vesikel bei der Fusion mit einer Oberfläche seine Orientierung invertiert oder beibehält. Es deutet jedoch alles darauf hin, daß die Orientierung der Vesikel bei der Fusion zufällig erfolgt. Die erste Zufälligkeit bei der Orientierung liegt also im Schritt der Präparation der Membranvesikel, und die zweite Zufälligkeit liegt bei der Fusion mit der Festkörperoberfläche. Somit läßt sich die Orientierung der immobilisierten Lipiddoppelschichten bisher nicht steuern.
Allerdings gibt es verschiedene Hinweise, daß Vesikel/Zellen orientiert auf Festkörperoberflächen angeheftet werden (Jacobson, Branton Science 1977 (195, 4275), 302-304; Wasserman, B. P.; Hultin, H. O.; Jacobson, B. S. Biotechnol. Bioeng. 1980 (22) 271-287. Durch eine hier gezielt herbeigeführte elektrostatische Interaktion von
Festkörperoberfläche mit transmembranen Proteinen konnte eine Orientierung der Lipiddoppelschicht erreicht werden, bei der die ursprünglich innere Seite der Lipiddoppelschicht in der immobilisierten Form nach außen weist (Kalish, D. I.; Cohen, C. M.; Jacobson, B. S.; Branton, D. Biochim. Biophys. Acta 1978 (506), 97-1 10). Hier konnte also zwar die Asymmetrie der Membran erhalten bleiben, es war jedoch nur möglich, die innere Membranseite nach außen zu orientieren. Eine Orientierung der Membran mit der ursprünglich äußeren Seite nach außen war nicht möglich. Darüber hinaus verringerten sich die enzymatischen Aktivitäten infolge der elektrostatischen Wechselwirkungen der Membran mit der Festkörperoberfläche, so daß dieses System für funktionelle Untersuchungen der Membran nicht geeignet ist.
Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Lipiddoppelschichtsystem bereitzustellen, welches eine definierte
Orientierung der Lipidschichten auf einer Oberfläche eines Festkörpers gewährleistet. Dieses System soll festkörperunter-stützt sein, so daß es stabil und leicht handhabbar ist und auch für eine Auto-matisierung geeignet ist. Die Orientierung, also die Asymmetrie der Lipid- doppelschicht, soll frei wählbar sein, so daß entweder die ursprünglich äußere Seite der Lipiddoppelschicht bzw. der Membran nach außen zeigt oder daß diese Seite der Festkörperoberfläche zugewandt ist. Die funktioneilen und strukturellen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht sollen auch in der immobilisierten Form erhalten bleiben, um die natürlichen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bzw. der darin enthaltenen Proteine oder ähnlichem in vitro untersuchen zu können.
Diese Aufgabe wird gelöst durch eine immobilisierte Lipiddoppelschicht, die durch ein Verfahren herstellbar ist, wie es in Anspruch 1 beschrieben ist. Bevorzugte Ausführungsformen dieses Verfahrens sind in den Ansprüchen 2 bis 8 ausgeführt. Die Ansprüche 9 bis 13 betreffen die Verwendung einer modifizierten Festkörperoberfläche zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht. Die Ansprüche 14 bis 20 beziehen sich auf eine immobilisierte Lipiddoppelschicht bzw. immobilisierte Proteine sowie auf einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten bzw. immobilisierten Proteinen. Die Ansprüche 21 und 22 betreffen schließlich ein Verfahren zur Untersuchung von Proteinen. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt der Beschreibung gemacht.
Das erfindungsgemäße Verfahren dient zur Herstellung einer Lipiddoppelschicht, die auf einem Festkörper immobilisiert ist. Die Lipiddoppelschicht bedeckt nach Abschluß des Verfahrens den Festkörper als im wesentlichen kontinuierlicher Membranfilm. Die Lipiddoppelschicht besteht aus einer inneren und äußeren Lipidschicht („inner leaflet" bzw. „outer leaflet"), wobei diese beiden Lipid-schichten in bestimmter Weise orientiert sind, so daß die immobilisierte Lipiddoppelschicht eine definierte Orientierung bzw. Asymmetrie hinsichtlich der Festkörperoberfläche aufweist. Auf der Oberfläche des Festkörpers ist die Lipiddoppelschicht im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert, so daß die strukturellen und funktionellen Eigenschaften einer natürlichen Lipiddoppelschicht, insbesondere einer Membran, widergespiegelt werden. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Oberfläche des Festkörpers zunächst in der Weise modifiziert, daß eine Fläche ausgebildet wird, die vorzugsweise mit einer der beiden Lipidschichten, also mit der inneren oder der äußeren Lipid-schicht, wechselwirken kann. In einem weiteren Verfahrensschritt wird auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche die Lipiddoppelschicht deponiert. Durch die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche wird hierbei ermöglicht, daß sich die Lipiddoppelschicht derart auf der Festkörperoberfläche ausrichtet, daß eine bestimmte Orientierung der Lipiddoppelschicht erreicht wird. Erfindungsgemäß verantwortlich sind hierfür im wesentlichen elektrostatische Wechselwirkungen zwischen der modifizierten Festkörperoberfläche und den beiden Schichten der Lipiddoppelschicht, wobei die Wechselwirkungen sowohl attraktiver wie auch repulsiver Natur sein können. Die elektrostatischen Wechselwirkungen führen insbesondere in Kombination mit der weiter unten näher ausgeführten „ultraweichen" Oberfläche zu der gewünschten Orientierung der Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper. Nähere Details hierzu ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung und insbesondere aus den Beispielen.
Die Asymmetrie der Lipiddoppelschicht kann zum einen durch unterschiedliche Lipide oder lipidanaloge Moleküle in den beiden Lipidschichten der Lipiddoppel-schicht verursacht sein. Weiterhin kann die Asymmetrie auch durch weitere Komponenten in den Lipidschichten begründet sein, die in den beiden Lipidschichten unterschiedlich verteilt sind. Vorteilhafterweise sind diese weiteren Komponenten Proteine, insbesondere Membranproteine. Es kann sich hierbei um sogenannte transmembrane Membranproteine handeln, die die gesamte Lipiddoppelschicht in einer bestimmten Orientierung durchspannen. Beispiele hierfür sind verschiedene Transportproteine, die einen gerichteten Transport durch eine Membran bzw. eine Lipiddoppelschicht hindurch ermöglichen. Ein Beispiel für solche transmembranen Proteine sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR), die sehr interessante Angriffsstellen für potentielle Medikamente darstellen. Die Bindungsstellen dieser Rezeptoren befinden sich an der Außenseite von Membranen. Zur Untersuchung der Wechselwirkung dieser Rezeptoren mit potentiellen Wirkstoffen ist das erfindungsgemäße Verfahren also besonders geeignet, da hier die Orientierung der solche Rezeptoren enthaltenen Lipiddoppelschichten so gesteuert werden kann, daß diese Bindungsstellen im immobilisierten Membransystem von außen zugänglich sind.
Da mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens eine festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht hergestellt werden kann, die eine bestimmte Orientierung aufweist, kann hierdurch natürlich auch die Orientierung der in der Lipiddoppelschicht integrierten Bestandteile, also beispielsweise der Transportproteine, kontrolliert werden. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren wird also ein Membranmodellsystem bereitgestellt, welches in hervorragender Weise für die Untersuchung und Charakterisierung der Membraneigenschaften und/oder der Eigenschaften von einzelnen Membrankomponenten geeignet ist.
Neben den transmembranen Membranproteinen, die die Doppelschicht in einer Vorzugsrichtung ganz oder teilweise durchspannen, kann die Lipiddoppelschicht auch sogenannte periphere Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen, die sich nur in einer der beiden Lipidschichten bzw. auf einer der beiden Oberflächen der Lipiddoppelschicht befinden. Ein Beispiel für solche peripheren Proteine sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPR), die ebenfalls sehr interessante Angriffsstellen für potentielle Medikamente darstellen. Sie befinden sich auf der Innenseite der Zellmembran und sind somit erst nach Inversion der ursprünglichen Orientierung zugänglich.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine Vielzahl unter-schiedlicher Lipidstrukturen immobilisiert werden. Gemäß dem Verfahren werden die zu immobilisierenden Lipidstrukturen hierbei zunächst in die Form von Vesikeln überführt, welche durch Fusion mit der modifizierten Festkörper-Oberfläche die erfindungsgemäße festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht bilden. Für die Fusion der Vesikel mit der modifizierten Oberfläche werden die Vesikel vorteilhafterweise in wässriger Dispersion bereitgestellt.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung von Vesikeln aus natürlichem Material, so daß die erfindungsgemäß immobilisierte Lipiddoppelschicht ein Modell der natürlichen Membran darstellt, bei welchem entweder die ursprünglich innere oder die ursprünglich äußere Membranoberfläche letztendlich nach außen zeigt. Besonders geeignet hierfür sind beispielsweise Membranvesikel, die aus Erythrozyten oder kultivierbaren Zellen, beispielsweise CACO-2-Zellen, gewonnen werden. Weiterhin kann die Lipiddoppelschicht zumindest teilweise aus Membranfragmenten von natürlichen Zellen aufgebaut sein. Die Präparation der Vesikel erfolgt nach herkömmlichen Methoden. Erfindungsgemäß werden die Vesikel mit der modifizierten Festkörperoberfläche in Kontakt gebracht, wodurch die Vesikel spontan miteinander verschmelzen und die Lipiddoppelschicht bzw. die Membranschicht ausbilden. Durch die Wahl einer entsprechend modifizierten Oberfläche kann die Endorientierung der Lipiddoppel- bzw. Membranschicht im voraus bestimmt werden.
Als natürliche Membranen kommen neben der Plasmamembran von Zellen selbstverständlich auch intrazelluläre Membranen in Frage, die beispielsweise von Leber- oder Nierenzellen stammen können. Für die Präparation von intrazellulären Membranen können beispielsweise Zellorganellen eingesetzt werden. Diese intrazellulären Membranen sind für verschiedene Wirkstoffscreening- und/oder Testanwendungen sehr interessant. Gerade in den intrazellulären Membranen sind im wesentlichen alle Enzyme lokalisiert, die beim Metabolismus von Pharmaka eine entscheidende Rolle spielen.
Neben natürlichen Membranen sind auch künstliche Lipidschichten bzw. Membranen für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet. Solche künstlichen Strukturen können in vitro aus verschiedenen Komponenten zusammengefügt (rekonstituiert) werden, so daß hierdurch ein entsprechendes Membranvesikel zur Verfügung gestellt wird, welches im erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht genutzt werden kann. Künstliche Lipidschichten sowie auch natürliche Lipidschichten können aus verschiedenen Lipiden, Lipidderivaten, lipidähnlichen und/oder lipidanalogen Substanzen zusammengesetzt sein. Weiterhin können die Lipidschichten Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, ionische oder nichtionische Tenside und/oder Polymere aufweisen. Bei diesen zusätzlichen Komponenten der Lipidschichten kann es sich vorteilhafterweise um Enzyme, Rezeptoren und/oder Liganden handeln, die die Lipidschicht oder die Lipiddoppelschicht mehr oder weniger durchspannen, darin eingebettet sind und/oder oberflächlich auf der Lipiddoppelschicht angelagert sind.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Festkörperoberfläche zunächst so modifiziert, daß hierdurch die anschließende Ausbildung einer Lipiddoppelschicht infolge der Fusion von Vesikeln von ihrer Orientierung her gesteuert wird. Weiterhin bietet die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche optimale Bedingungen für die schonende Immobilisierung einer Lipiddoppelschicht bzw. einer Membran. Diese optimalen Bedingungen beziehen sich auf eine Kombination verschiedener intermolekularer Wechselwirkungen, aus deren Überlagerung eine anziehende Kraft zwischen der aufzubringenden Lipiddoppelschicht und dem Festkörper resultiert. Hierdurch wird gleichzeitig ein direkter Kontakt der Lipiddoppelschicht mit dem Festkörper verhindert. Auf diese Weise werden die charakteristischen dynamischen Bewegungseigenschaften der Lipiddoppelschicht, insbesondere die laterale Diffusion der verschiedenen Lipidkomponenten, weitgehend unverändert gelassen.
Durch die Modifizierung wird im molekularen Sinne eine „ultraweiche" Oberfläche gebildet, die zum einen die darauf immobilisierte Lipiddoppelschicht weitgehend unbeeinflußt läßt und zum anderen einen ausreichenden Abstand zwischen Festkörperoberfläche und Lipiddoppelschicht gewährleistet. Hierdurch werden denaturiende Effekte der Festkörperoberfläche auf die Lipiddoppelschicht mit den darin enthaltenen Komponenten vermieden. Weiterhin hat die erfindungsgemäße Modifizierung der Festkörperoberfläche den Vorteil, daß Wechselwirkungen von Komponenten der Lipiddoppelschicht, insbesondere von Proteinen, mit der Festkörperoberfläche weitgehend minimiert bzw. eliminiert werden, so dass die Membranproteine beispielsweise ihre Aktivität, beispielsweise ihre Enzymaktivität, auch in der neuen Umgebung beibehalten. Durch die erfindungsgemäße Immobilisierung werden auch die Lipideigenschaften der Lipiddoppelschicht erhalten, wodurch die natürlichen Eigenschaften einer Membran perfekt imitiert werden. Insgesamt bewirkt die Oberflächenmodi-fizierung u. a. also eine Entkopplung der Lipiddoppelschicht von der Festkörperoberfläche. Dies ist beispielsweise für eine Anwendung im Bereich der Biosensorik ein ganz entscheidender Vorteil, da hier immobilisierte Lipiddoppelschichten, insbesondere Membranen, die ihre nativen Eigenschaften, also beispielsweise enzymatische Aktivitäten und/oder Kanalaktivitäten, beibehalten, benötigt werden. Dieser Vorteil der Erfindung kann beispielsweise in einer Anwendung mit Biochips besonders vorteilhaft ausgenutzt werden.
Erfindungsgemäß wird durch die Wahl einer bestimmten Modifizierung der Festkörperoberfläche die letztendliche Orientierung der darauf immobilisierten Lipidschichten bestimmt. Für das Deponieren der Lipiddoppelschicht auf der modifizierten Oberfläche können vorteilhafterweise Membranvesikel zufälliger Orientierung, also sogenannte ISO- und RSO-Vesikel, hergestellt werden und mit dem modifizierten Festkörper in Kontakt gebracht werden. Aufgrund der Oberflächeneigenschaften des modifizierten Festkörpers findet im wesentlichen nur die Fusion der Vesikel einer bestimmten Orientierung statt. Hierdurch wird durch das erfindungsgemäße Verfahren eine festkörperunterstützte Lipiddoppelschicht erhalten, die eine definierte Orientierung aufweist. In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird dem modifizierten Festkörper eine Vesikelpräparation mit nur einer Orientierung angeboten. Hierdurch können ggf. größere Ausbeuten an immobilisierter Lipiddoppelschicht bestimmter Orientierung erhalten werden.
Um die letztendliche Orientierung der durch das erfindungsgemäße Verfahren immobilisierten Lipidschichten zu überprüfen, können verschiedene her-kömmliche Methoden eingesetzt werden. Beispielsweise kann die Funktionalität und/oder Aktivität immobilisierter Membranproteine analysiert werden, von denen bekannt ist, daß sie sich auf der ursprünglich inneren, also insbesondere der zytoplasmatischen Seite, oder der äußeren Seite der Membran bzw. der Lipiddoppelschicht befinden. Weiterhin kann die durch Neuramidase freigesetzte N- Acetylsialinsäure untersucht werden. Auch die auf der Außenseite der ursprünglichen Membranschicht sich befindliche Glykokalix kann mittels fluoreszenzmarkierter Lektine markiert werden. Einzelheiten zu diesen Analyse-methoden lassen sich den Beispielen entnehmen.
Vorteilhafterweise wird bei der erfindungsgemäßen Modifizierung der Festkörperoberfläche eine im wesentlichen hydrophile Fläche erreicht. Hierfür wird zunächst die Oberfläche funktionalisiert. Beispielsweise können hierbei Aminofunktionen, Epoxyfunktionen,
Halogenalkylfunktionen und/oder Thiofunktionen auf die Oberfläche aufgebracht werden. Für die Funktionalisierung können vorteilhafterweise Silane eingesetzt werden. Weiterhin sind auch Mercaptane und/oder Disulfide, insbesondere Alkyldisulfide, bevorzugt. Für die Funktionalisierung ganz besonders bevorzugt sind N-(2- Aminoethyl)-3-Aminopropyl-trimethoxysilan (EDA), Polyethylenimin (PEI) und/oder Cysteamin, insbesondere Cysteaminhydrochlorid. In einem weiteren Schritt werden mit diesen Funktionen wechselwirkende Moleküle adsorbiert und/oder chemisorbiert. Eine vorherige Funktionalisierung der Oberfläche kann auch entfallen, wenn aufgrund der Materialeigenschaften des Festkörpers eine Wechselwirkung von weiteren Molekülen ohne weiteres möglich ist. Als wechselwirkende Moleküle können verschiedene Polymere, insbesondere Polyelektrolyte, vorzugsweise anionische Polyelektrolyte, eingesetzt werden. Auch Polyampholyte, vorzugsweise Proteine, und/oder Polyzwitterionen sind erfindungsgemäß geeignet. Besonders bevorzugt sind Polystyrolsulfonat (PSS), insbesondere Na- Polystyrolsulfonat, und/oder Poly(styrol-co-Maleinsäureanhydrid) (PSPMA). Eine besonders bevorzugte Substanz, die chemisorbiert wird, ist Polyoxyethylen bis(glycidylether).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden weitere wechselwirkende Moleküle zur Modifizierung der Oberfläche eingesetzt, die mit den zunächst aufgebrachten wechselwirkenden Molekülen interagieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden als wechselwirkende Moleküle funktionelle Substanzen eingesetzt, die für eine Analyse der Eigenschaften der Lipiddoppelschicht bzw. der in der Lipiddoppelschicht enthaltenen Komponenten genutzt werden können. Hierbei handelt es sich vorteilhafterweise um Farbstoffe, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffe, und/oder um enzymatisch, chemisch und/oder photochemisch reaktive Moleküle.
Erfindungsgemäß wird die Modifizierung der Oberfläche so gewählt, daß die modifizierte Oberfläche im wesentlichen nur mit einer der beiden Lipidschichten der Lipiddoppelschicht wechselwirkt, wobei die Wechselwirkung im wesentlichen elektrostatischer Natur ist, die sowohl repulsiv als auch attraktiv sein kann. Hierdurch wird gewährleistet, daß sich die Lipiddoppelschicht bei der Fusion der Vesikel im Zuge des Deponierens der Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper in einer bestimmten Orientierung ausrichtet. In einer ersten Ausführungsform der Erfindung wechselwirkt die modifizierte Oberfläche vorzugsweise mit der ursprünglich inneren Lipidschicht (inner leaflet) der Lipiddoppelschicht. Bevorzugterweise weist die modifizierte Oberfläche hierbei eine negative Nettoladung auf. Hierfür wird vorteilhafterweise die Modifizierung der Festkörperoberfläche durch die Herstellung „ultraweicher" Polymeroberflächen mit negativer Nettoladung vorgenommen. Für das Deponieren der Lipid-doppelschicht auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche werden beispielsweise orientierte Vesikelsysteme eingesetzt, die eine negative Nettoladung an der Außenseite tragen. Durch die Modifizierung wird eine im wesentlichen hydrophile Oberfläche bereitgestellt, die derart repulsiv mit der äußeren Lipidschicht reagiert, daß sich die Lipiddoppelschicht bei einer Fusion einer Vesikelpräparation im wesentlichen so ausrichtet, daß die ursprünglich äußere Seite der Lipid-doppelschicht nach außen zeigt, also vom Festkörper abgewandt ist, und so für verschiedene Untersuchungen zugänglich ist.
In einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Festkörperoberfläche so modifiziert, daß sie vorzugsweise mit der ursprünglich äußeren Lipidschicht der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht wechselwirkt. Bevorzugterweise weist die modifizierte Oberfläche hierbei eine positive Nettoladung auf. Hierfür wird die Modifizierung der Oberfläche vorzugsweise durch Herstellung weicher Polymeroberflächen mit positiver Nettoladung vorgenommen. Für das Deponieren der Lipiddoppelschichten auf dieser modifizierten Festkörperoberfläche werden vorteilhafterweise orientierte Vesikelsysteme eingesetzt, die eine negative Nettoladung an der Außenseite tragen. Bei der Fusion richten sich die Vesikel dann so aus, daß die ursprünglich äußere Lipidschicht dem Festkörper zugewandt ist. Hierdurch werden die Komponenten, die sich ursprünglich in oder an der inneren Seite der Lipiddoppelschicht, also beispielsweise an der cytoplasmatischen Seite befanden, einer Untersuchung zugänglich. Durch diese Beispiele wird deutlich, daß in Abhängigkeit von den Eigenschaften der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht durch die Wahl einer entsprechend geeigneten Oberfläche die Orientierung der immobilisierten Lipiddoppelschicht auf dem Festkörper gesteuert werden kann.
Die derart modifizierten Festkörperoberflächen werden bevorzugterweise mit den vesikulären Strukturen der zu immobilisierenden Lipiddoppelschicht innerhalb eines Mediums, vorzugsweise eines wässrigen Mediums, in Kontakt gebracht, wodurch die Vesikel spontan miteinander und mit der modifizierten Oberfläche fusionieren und so infolge der Eigenschaften der modifizierten Oberfläche eine immobilisierte Lipiddoppelschicht ausbilden, die eine definierte Asymmetrie aufweist. Es handelt sich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren um ein ausgesprochen leicht zu handhabendes System, welches lediglich geringen präparativen Aufwand erfordert.
Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können verschiedene herkömmliche Trägermaterialien eingesetzt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird ein im wesentlichen planarer Träger als Festkörper verwendet. Dieser kann aus unterschiedlichen Materialien bestehen. Vorteilhafterweise kann auch die Oberfläche aus einem anderen Material als der restliche Träger hergestellt sein. Die Festkörperober läche besteht vorzugsweise aus Silikat, einem Halbleiter, insbesondere Silizium, einem Edelmetall, beispielsweise Gold, und/oder einem Polymer, beispielsweise Polystyrol. Andere Oberfläche sind selbstverständlich auch möglich. Darüber hinaus können als Oberflächenmaterialien Filme aus pulverförmigen Metallen, Halbleitern, Edelmetallen und/oder Polymeren eingesetzt werden, die auf weitgehend planaren Trägermaterialien aufgebracht sind oder auf diesen aufgebracht werden können. Bei diesen Trägermaterialien kann es sich beispielsweise um Unterlagen aus Papier, Glas, Kunststoff o. dgl. handeln, mit denen die Festkörper in geeigneter Weise verbunden werden, insbesondere durch Verkleben oder Verschmelzen.
Besonders bevorzugt ist der Einsatz von dispergierbaren Festkörpern, die vorteilhafterweise aus Partikeln von beispielsweise mikroskopischen Dimensionen bestehen. Bevorzugte Materialien für solche Festkörper sind Aluminate, Borate und/oder Zeolithe. Weiterhin sind kolloidale Lösungen von Edelmetallen, Metallen usw. geeignet. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung von Silikatpartikeln. Diese Partikel können beispielsweise herkömmliche Silikatkugeln sein.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden poröse Partikel eingesetzt, wodurch die für die Immobilisierung zur Verfügung stehende Oberfläche vergrößert wird.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei den verwendeten Partikeln um magnetische Partikel, wodurch die Handhabbarkeit in verschiedenen Anwendungen wesentlich erleichtert werden kann. Dies spielt insbesondere bei dem Einsatz der erfindungsgemäß immobilisierten Lipiddoppelschichten in
Automatisierungsprozessen eine Rolle. Weiterhin ist die Verwendung von Kernschalenpolymerpartikeln bevorzugt.
Bevorzugterweise werden die verwendeten Festkörper in Form einer Dispersion eingesetzt. Diese Dispersion wird vorteilhafterweise in wäßrigen Lösungen hergestellt. Weiterhin umfaßt die Erfindung die Verwendung einer modifizierten Oberfläche eines Festkörpers zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer definierten Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche des Festkörpers. Die modifizierte Oberfläche ist dafür geeignet, die Lipiddoppelschicht im wesentlichen stabil und dynamisch zu immobilisieren. Bezüglich der weiteren Eigenschaften der Verwendung der modifizierten Oberfläche wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Ferner umfaßt die Erfindung eine immobilisierte Lipiddoppelschicht, die durch ein Verfahren herstellbar ist, wie es oben beschrieben ist. Diese immobilisierte Lipiddoppelschicht weist eine definierte Orientierung auf und ist auf einem Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert.
Weiterhin umfaßt die Erfindung immobilisierte Proteine, die durch ein oben beschriebenes Verfahren herstellbar sind. Hierbei handelt es sich um Proteine, die mit einer Lipiddoppelschicht assoziiert sind, welche ihrerseits auf einem Festkörper immobilisiert ist. Die Proteine sind insbesondere Membranproteine, die die Lipiddoppelschicht ganz oder teilweise durchspannen, die nur eine der die Lipiddoppelschicht bildenden Lipidschichten durchspannen oder hier eingebettet sind, oder die auf einer oder beiden Seiten der Lipiddoppelschicht eingebettet oder angelagert sind.
Außerdem umfaßt die Erfindung einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten. Dieser Kit ist dafür vorgesehen, Lipiddoppelschichten zu immobilisieren, so daß diese Lipiddoppelschichten mit ihrer inneren und äußeren Lipidschicht eine definierte Orientierung auf der Oberfläche eines Festkörpers aufweisen. Die Orientierung ist im vorhinein bestimmbar. Die derart immobilisierten Lipiddoppelschichten sind im wesentlichen stabil und dynamisch auf dem Festkörper fixiert, so daß sie für funktionelle und strukturelle Untersuchungen der Lipiddoppelschicht, beispielsweise einer Membran, in besonderer Weise geeignet sind. Dieser Kit umfaßt mindestens einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, der für die Immobilisierung der Lipiddoppelschicht im erfindungsgemäßen Sinne geeignet ist. Bezüglich der Eigenschaften dieser modifizierten Festkörperoberfläche wird auf die obige Beschreibung verwiesen. Weiterhin kann es bevorzugt sein, daß der Kit nicht die fertig modifizierte Oberfläche enthält, sondern vielmehr die verschiedenen Komponenten, die zur Herstellung einer solchen modifizierten Oberfläche notwendig sind. Dies kann beispielsweise aus Lagerungs- und/oder Stabilitätsgründen vorteilhaft sein. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kits sind in diesem Kit weiterhin Lipidvesikel vorhanden, wobei die Lipidvesikel vorzugsweise zusätzliche Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen. Diese Lipidvesikel sind für eine Fusion auf der modifizierten Festkörperoberfläche vorgesehen und bilden somit das Material für die immobilisierte Lipiddoppelschicht. Hierbei kann es bevorzugt sein, daß weitere Komponenten für die Lipiddoppelschicht vom Anwender selbst bereitgestellt und in die Lipidvesikel eingebracht werden. Die Lipidvesikel liegen vorteilhafterweise in Form einer Dispersion vor. Dies kann beispielsweise eine wäßrige Dispersion sein, die unter Umständen entsprechende Zusätze enthält, die die Stabilität und Haltbarkeit der Lipidvesikel verbessern. Selbstverständlich können die Lipide auch in anderer Form als in Vesikeln, beispielsweise in trockener Form, bereitgestellt werden.
Weiterhin umfaßt die Erfindung einen Kit zur Herstellung von immobilisierten Proteinen, die sich in oder an ihrerseits immobilisierten
Lipiddoppelschichten mit definierter Orientierung befinden. Dieser Kit umfaßt mindestens einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche sowie vorzugsweise Lipide, insbesondere in Form von Vesikeln, die die zu immobilisierenden Proteine aufweisen. Bevorzugterweise handelt es sich bei diesen Proteinen um Membranproteine, die durch die Immobilisierung in Lipiddoppelschichten ihre natürliche Umgebung vorfinden und so unter nahezu nativen Bedingungen analysiert werden können. Bezüglich der verschiedenen Einzelheiten im Hinblick auf die immobilisierten Proteine wird auf die obige Beschreibung verwiesen.
Schließlich umfaßt die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung von Proteinen, insbesondere von Membranproteinen, wobei diese Proteine als immobilisierte Proteine in ihrerseits immobilisierten Lipiddoppelschichten eingesetzt werden. Hinsichtlich der eingesetzten immobilisierten Proteine in Lipiddoppelschichten wird ebenfalls auf die obige Beschreibung Bezug genommen. Die weitere Durchführung des Verfahrens wird nach üblichen Methoden vorgenommen, die einem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind.
Die beschriebenen Merkmale sowie weitere Merkmale der Erfindung ergeben sich aus den Figuren und der folgenden Beschreibung von Beispielen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die verschiedenen Merkmale jeweils für sich oder in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Figuren ist gezeigt:
Fig. 1 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter
Erythrozytenmembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Aktivität der Acetylcholinesterase,
Fig. 2 Vergleich von erfindungsgemäß immobilisierten CACO-2
Plasmamembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Hydrolyseaktivität des P- Glykoproteins in Gegenwart eines Modulators (Verapamil),
Fig. 3 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter Plasmamembranen auf HEK293-Zellen in unterschiedlicher
Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand durch Neuromidase freigesetzter N-Acetylsialinsäure und
Fig. 4 Vergleich erfindungsgemäß immobilisierter Erythrozytenmembranen in unterschiedlicher Orientierung auf der Festkörperoberfläche anhand der Bindung von
Peanuts Lektin-FITC an die Glykokalix nach
Neuramidasebehandlung.
Beispiele
1. MODIFIZIERUNG DER FESTKÖRPEROBERFLÄCHE
1.1. Funktionalisierung der Festkörperoberfläche
1.1.1 Aminofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatober-flächen mit N-(2-Aminoethyl)-3- Aminopropyltrimethoxysilan (EDA)
Eine Silanlösung, bestehend aus 9,2 mL N-(2-Aminoethyl)-3- Aminopropyl-trimethoxysilan (EDA) und 243 μL konzentrierter Essigsäure in 450 mL entionisiertem Wasser, wurde frisch hergestellt. Nach 5 Minuten wurden 2 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 50- 10 von Macherey-Nagel, Düren) zu der Silanlösung gegeben und unter Schütteln aufgeschlämmt. Diese Dispersion wurde drei Stunden langsam rotiert, danach wird das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Silanisierung wird mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert. In ähnlicher Weise wurden weitere Trägermaterialien mit Porengrößen zwischen 5 und 400 nm funktionalisiert.
1.1.2. Aminofunktionalisierung von pulverförmigen und porösen Silikatoberflächen mit Polyethylenimin (PEI)
Zu einer Polyethylenimin (PEI)-Lösung bestehend aus 250 mg PEI (50 %-Lösung in Wasser, Aldrich, Steinheim) in 50 ml entionisiertem Wasser wurden 5 g eines porösen Silikatmaterials (Nucleosil 4000-10) von Macherey-Nagel, Düren) gegeben und drei Stunden langsam rotiert. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Umsetzung wurde mittels Infrarotspektroskopie in diffuser Reflexion (DRIFT) am getrockneten Silikatmaterial dokumentiert. In ähnlicher Weise wurden weitere Trägermaterialien mit Porengrößen zwischen 5 und 400 nm funktionalisiert.
1.2. Einstellung besonders bevorzugter Eigenschaften
1.2.1. Chemisorption von Polyoxyethylen bis(glycidylether (PEG- DiGly) auf EDA-funktionalisierten Silikatoberflächen
Zu 10 mL einer 5 %igen Lösung aus Polyoxyethylen bis(glycidylether PEG-DiGly) (Mw~3350 SIGMA) in Phosphatpuffer (pH 7,4) wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.1. aminofunktionalisierten Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Chemisorption wurde mittels DRIFT dokumentiert. 1.2.2. Adsorption von Na-Polystyrolsulfonat (PSS) auf Polyethylenimin-funktionalisierten Silikatoberflächen
Zu einer Na-Polystyrolsulfonat (PSS)-Lösung, bestehend aus 25 mg PSS (Mw~70.000, Aldrich, Steinheim) in 50 mL einer 3molaren NaCI- Lösung wurde 1 g eines entsprechend Beispiel 1.1.2. aminofunktionalisierten Silikatmaterials gegeben und drei Stunden geschüttelt. Danach wurde das Silikatmaterial sedimentiert und dreimal mit entionisiertem Wasser gewaschen. Der Erfolg der Adsorption wurde mittels DRIFT und der Abnahme der PSS-Konzentration in der Lösung dokumentiert.
2. DEPOSITION VON LIPIDSCHICHTEN AUF DEN MODIFIZIERTEN OBERFLÄCHEN
2.1. Immobilisierung von nativen Erythrozyten-Membranen auf unbehandelten Silikatoberflächen und Messung der Acetylcholin- esterase-Funktion
Orientierte RSO- und ISO-Plasmamembranvesikel wurden nach einem Verfahren von Steck und Kant (Methods in Enzym. 1974, 31 , 172-180) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu jeweils 900 μL dieser Lösungen (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines porösen Silikatträgers (Mache-rey- Nagel, Düren) zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCI (Inkubations-puffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Aktivität der in der Außenschicht vorkommenden Acetylcholinesterase wurde nach einer Methode von Ellman et. al. (Biochem. Pharmacol. 1961 , 7, 88) auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer bestimmt. Dabei ist es wichtig, in einer Kontrolle mittels Detergenz Löcher in der Lipiddoppelschicht herzustellen und so eventuell von der Oberfläche abgewandte Enzymmoleküle zu messen (Figur 1 ). Diese Funktionstests belegten eine Invertierung bei der Fusion mit der angebotenen Festkörperoberfläche, sowie die Einheitlichkeit (>90%) der erhaltenen Oberfläche.
2.2. Immobilisierung von nativen CACO-2-Membranen auf unterschϊed-lichen Silikatoberflächen und Messung der ATPase- Funktion des P-Glykoproteins
ISO-orientierte Plasmamembranvesikel aus CACO-2 Zellen wurden nach einem Verfahren von Schlemmer und Sirotnak (Anal. Biochem. 1995, 228, 226-231 ) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 μL dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden jeweils 50 mg eines ent-sprechend Beispiel 1.2.1. bzw. Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCI (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurden die Trägermaterialien sedimentiert und dreimal mit Inkubations-puffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Bestimmung der Aktivität des P-Glykoproteins auf den Trägermaterialien erfolgte nach der Waschung im Inkubationspuffer durch Bestimmung der ATP-Hydrolyse-Aktivität in Abhängigkeit eines bekannten Modulators (Verapamil). Im Falle des nach Beispiel 1.2.2. modifizierten Träger wird nach der Immobilisierung eine RSO-orientierte Oberfläche erhalten, die jedoch aufgrund der falschen Orientierung des zu untersuchenden Proteins keine nennenswerte Enzymaktivität besitzt. Anders die mit Hilfe des Trägers aus Beispiel 1.2.1. hergestellten ISO- Oberfläche. Sie besitzt eine zu den isolierten Vesikeln vergleichbare Hydrolyseaktivität (Figur 2) auf dem Trägermaterial.
2.3. Immobilisierung von nativen HEK293-Membranen auf unterschied-lichen Silikatoberflächen und Messung der mittels Neuramidase freigesetzten N-Acetylsialinsäure
RSO-orientierte Plasmamembranvesikel aus HEK293-Zellen wurden nach einem Verfahren von DePierre und Karnovsky (Journal of Cell Biology 1973, 56, 275-303) hergestellt. Diese Dispersion wurde anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 μL dieser Lösung (etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden jeweils 50 mg eines ent-sprechend Beispiel 1.2.1. bzw. Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Triethanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCI (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurden die Trägermaterialien sedimentiert und dreimal mit Inkubations-puffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Freisetzung von N-Acetylsialinsäure durch Neuramidase auf den Trägermaterialien erfolgte nach der Waschung im Inkubationspuffer durch einen Kit der Firma CalBiochem (Bad Soden) entsprechend des beigefügten Protokolls. Im Falle des nach Beispiel 1.2.1. modifizierten Trägers wird nach der Immobilisierung eine ISO- orientierte Oberfläche erhalten, die jedoch aufgrund der falschen Orientierung der zu untersuchenden Glykokalix keine nennenswerte Freisetzung an N-Acetylsiliansäure durch Neuramidase besitzt. Erst durch Zugabe von Detergenz kann eine vergleichbare Freisetzung erzielt werden. Anders die mit Hilfe des Trägers aus Beispiel 1.2.2. hergestellte RSO-Oberfläche. Sie besitzt eine zu den isolierten Vesikeln vergleichbare Freisetzung (Figur 3) auf dem Trägermaterial.
2.4. Immobilisierung von nativen Erythrozyten-Membranen auf PEI/PSS-modifizierten Silikatoberflächen und Markierung der Glykokalix mit FITC-Lektinen
Orientierte RSO- und ISO-Plasmamembranvesikel wurden nach einem Verfahren von Steck und Kant (Methods in Enzym. 1974, 31 , 172-180) hergestellt. Diese Dispersionen wurden anschließend durch Extrusion in kleine, einschalige Vesikel mit einem Durchmesser von 20-90 nm überführt. Zu 900 μL einer 1 :1 (v/v) Mischung dieser Lösungen (insgesamt etwa 0,5 mg Gesamtprotein) wurden 50 mg eines entsprechend Beispiel 1.2.2. modifizierten porösen Silikatträgers zugegeben und für 18 Stunden bei 4°C inkubiert, wobei als Pufferlösung 100 mM Trie-thanolamin (pH 7,4) und 100 mM NaCI (Inkubationspuffer) verwendet wurde. Danach wurde das Trägermaterial sedimentiert und dreimal mit Inkubationspuffer gewaschen. Der Erfolg der Beschichtung wurde mittels DRIFT am getrockneten Material dokumentiert. Die Markierung der Glykokalix (Außenseite der RSO-Vesikel) wurde mit Hilfe der Bindung von Peanut Lektin (FITC-gekoppelt, Sigma-Aldrich GmbH, München) auf dem Trägermaterial nach der Waschung im Inkubationspuffer vorgenommen und im Fluoreszenzmikroskop dokumentiert. Diese Markierung belegt, daß nur eine RSO-Oberfläche mit einer Einheitlichkeit von mind. 90% hergestellt wurde (Figur 4).
3. EIGENSCHAFTEN DER MEMBRANEN AUF OPTIMIERTEM TRÄGERMATERIAL 3.1. Stabilität im fließenden wäßrigen Medium
Die in Beispielen 2.1. bis 2.4. beschriebenen Systeme wurden für die Dauer von 24 Stunden einem strömenden Medium (Inkubationspuffer des jeweiligen Beispiels) in einem Testbad ausgesetzt. In Abständen von 2 Stunden wurden jeweils gleiche Mengen Trägermaterial aus dem Testbad entnommen, getrocknet und anschließend mittels DRIFT auf ihre Beschichtung hin untersucht. Es wurde keine meßbare Abnahme der Membranbeschichtung mit der Zeit beobachtet.
3.2. Stabilität nach Einfrieren
Die in den Beispielen 2.1. bis 2.4. beschriebenen Systeme wurden bei - 80°C im dispergierten Zustand eingefroren und anschließend auf Raumtemperatur gebracht und getrocknet. Vergleichende DRIFT- Messungen vor und nach dem Einfrieren ergaben unveränderte Lipid- und Proteinmengen auf dem Trägermaterial. Die beschriebenen Systeme wurden zusätzlich nach der Präparation über die Dauer von 3 Monaten bei -80°C aufbewahrt. Im Abstand von 1 Monat wurden Proben entnommen und entsprechend in den Beispielen beschriebenen Meßgrößen untersucht. Nach 2 Monaten waren die Enzymaktivitäten auf ca. 70% des ursprünglichen Wertes (unmittelbar nach der Präparation und Waschung des Trägermaterials gemessen) abgesunken, während die Markierung der Glykokalix mit FITC-Lektin unveränderte Ergebnisse brachten. In den jeweiligen Überständen der gelagerten Proben konnte kein Protein nachgewiesen werden.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer inneren und einer äußeren Lipidschicht, wobei die Lipiddoppel-schicht eine definierte Orientierung hinsichtlich der
Lipidschichten auf einer Oberfläche eines Festkörpers aufweist und auf der Oberfläche des Festkörpers im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert ist, umfassend die folgende Verfahrensschritte: a) Modifizieren der Oberfläche des Festkörpers zur Ausbildung einer Fläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt und b) Deponieren der Lipiddoppelschicht auf der modifizierten Oberfläche.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß in die Lipiddoppelschicht weitere Komponenten, insbesondere Proteine, eingefügt sind.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Deponieren der Lipiddoppelschicht durch Fusion von Lipidvesikeln vorgenommen wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche des
Festkörpers folgende Teilschritte umfaßt: aa) Funktionalisieren der Oberfläche und/oder ab) Adsorbieren und/oder Chemisorbieren von wechselwirkenden Molekülen.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Verfahrensschritt a) modifizierte Oberfläche mit der inneren Lipidschicht wechselwirkt.
6. Verfahren nach Anspruch 4 oder Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche durch Aufbringen von Polymerfilmen mit negativer Nettoladung vorgenommen wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die gemäß Verfahrensschritt a) modifizierte Oberfläche mit der äußeren Lipidschicht wechselwirkt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Modifizieren der Oberfläche durch Aufbringen von Polymerfilmen mit positiver Nettoladung vorgenommen wird.
9. Verwendung einer modifizierten Oberfläche eines Festkörpers zur Herstellung einer immobilisierten Lipiddoppelschicht mit einer inneren und einer äußeren Lipidschicht, wobei die
Lipiddoppelschicht eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf einer Oberfläche eines Festkörpers aufweist und auf der Oberfläche des Festkörpers im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert ist.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Festkörpers zur Wechselwirkung mit der inneren Lipidschicht vorgesehen ist.
11. Verwendung nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche eine negative Nettoladung, insbesondere einen Polymerfilm mit negativer Nettoladung, aufweist.
12. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Oberfläche des Festkörpers zur Wechselwirkung mit der äußeren Lipidschicht vorgesehen ist.
13. Verwendung nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche eine positive Nettoladung, insbesondere einen Polymerfilm mit positiver Nettoladung, aufweist.
14. Immobilisierte Lipiddoppelschicht, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9.
15. Immobilisierte Proteine, insbesondere Membranproteine, herstellbar durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 8.
16. Kit zur Herstellung von immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren Lipidschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert sind, mindestens umfassend einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt.
17. Kit nach Anspruch 16, weiterhin umfassend Lipidvesikel, die vorzugsweise weitere Komponenten, insbesondere Proteine, aufweisen.
18. Kit zur Herstellung von immobilisierten Proteinen in immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren
Lipidschichten, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte
Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch stabilisiert sind, mindestens umfassend einen Festkörper mit einer modifizierten Oberfläche, die vorzugsweise mit nur einer der beiden Lipidschichten wechselwirkt, sowie vorzugsweise Lipidvesikel, die Proteine aufweisen.
19. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche nach einem Verfahren gemäß Anspruch 5 oder Anspruch 6 herstellbar ist.
20. Kit nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß die modifizierte Oberfläche nach einem Verfahren gemäß Anspruch 7 oder Anspruch 8 herstellbar ist.
21. Verfahren zur Untersuchung von Proteinen, insbesondere von Membranproteinen, dadurch gekennzeichnet, daß diese Proteine als immobilisierte Proteine in immobilisierten Lipiddoppelschichten mit inneren und äußeren Lipidschichten eingesetzt werden, wobei die Lipiddoppelschichten eine definierte Orientierung hinsichtlich der Lipidschichten auf der Oberfläche von Festkörpern aufweisen und auf der Oberfläche der Festkörper im wesentlichen stabil und dynamisch immobilisiert sind.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, daß die immobilisierten Lipiddoppelschichten nach einem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 herstellbar sind.
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