DE69215282T2

DE69215282T2 - Immunologisches Testverfahren

Info

Publication number: DE69215282T2
Application number: DE69215282T
Authority: DE
Inventors: Makoto C/O Intellectual Property 2-3 Kuboyama-Cho Hachioji-Shi Tokyo Nakamura; Kenji C/O Intellectual Property 2-3 Kuboyama-Cho Hachioji-Shi Tokyo Takahashi
Original assignee: Olympus Optical Co Ltd
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1991-06-18
Filing date: 1992-06-16
Publication date: 1997-05-15
Anticipated expiration: 2012-06-17
Also published as: EP0522322A1; US5476796A; JPH04369477A; DE69215282D1; JPH0792459B2; EP0522322B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein immunologisches Testverfahren auf der Grundlage von Antigen-Antikörper- Reaktionen zum Diagnostizieren verschiedener Krankheiten, zur Bestimmung von Blutgruppen und dergleichen.
Eine Mikrotitertechnik zur Bildung eines Präzipitationsbildes durch Trägerpartikel auf der Bodenoberfläche eines Reaktionsgefäßes war herkömmlicherweise als ein Verfahren auf der Grundlage einer immunologischen Agglutinationsreaktion zum Nachweisen eines Antigens oder Antikörpers populär, welche in einer Probe vorhanden waren.
Diese Mikrotitertechnik bringt jedoch mehrere Probleme mit sich. Eines der Probleme ist die lange Zeitdauer, welche benötigt wird, um ein Präzipitationsbild zu bilden, da die Präzipitation der Trägerpartikel und der Aggregate daraus allein auf der Schwerkraft beruht. Wie man eine Agglutinationsreaktion erreichen kann, bei der man bewirkt, daß die Trägerpartikel rasch präzipitieren, ist die Hauptaufgabe, welche in der Mikrotitertechnik gelöst werden soll.
Um ein Mittel zur Verfügung zu stellen, um das Problem zu lösen, ist in der Europäischen Patentanmeldung Nr. 0 351 857 A2 ein Verfahren offenbart, welches einen magnetischen Partikel als einen Träger verwendet und ein äußeres Magnetfeld an ein Reaktionsgefäß anlegt, um rasch ein Präzipitationsbild zu bilden. Dieses Verfahren, welches den magnetischen Träger verwendet, wird mit Bezug auf die untenstehenden Figuren 1 bis 3 beschrieben.
Eine Mikroplatte mit einer Mehrzahl von Vertiefungen, welche jeweils einen Bodenbereich mit einer halbkugelförmig oder konisch eingesenkten Oberfläche aufweisen, wird normalerweise in der Mikrotitertechnik verwendet. Fig. 1A ist eine Draufsicht der Mikroplatte, wenn sie von oben betrachtet wird, und Fig. 1B ist eine Seitenansicht, welche die Anordnung der Mikroplatte und der Magneten zeigt, wenn ein Test gemäß der Mikrotitertechnik durchgeführt werden soll. Wie in den Figuren 1A und 1B gezeigt, haben die Vertiefungen 2, welche in einer Mikroplatte 1 gebildet sind, entsprechend halbkugelförmige Bodenoberflächen. Scheibenförmige Magneten 4 sind entsprechend unterhalb der Vertiefungen 2 angeordnet und sind derart auf einer Trägerplatte 3 fixiert, daß die flachen Oberflächen der Magneten 4 horizontal sind.
Ein Antigen oder Antikörper wird nachgewiesen, wobei die Mikroplatte mit der obigen Anordnung verwendet wird. Eine vorbestimmte Menge einer Probe und eine vorbestimmte Menge eines Reagenzes, welches einen magnetischen Träger enthält, werden jeder Vertiefung 2 zugeteilt, und eine Agglutinationsreaktion wird durchgeführt. Als eine Vorbehandlung wird eine Substanz, welche spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen oder einen Antikörper (welche im folgenden ebenfalls als Zielsubstanz bezeichnet werden sollen) bindet, auf dem magnetischen Träger immobilisiert.
Die Figuren 2A und 3A sind Ansichten, welche das Prinzip einer Messung gemäß der Mikrotitertechnik darstellen. Die Figuren 2B und 3B sind Ansichten, welche Präzipitationsbilder zeigen, die durch die Mikrotitertechnik erhalten wurden.
Wenn eine Zielsubstanz in einer Probe vorhanden ist, wird bei der Mikrotitertechnik eine Mehrzahl von präzipitierten Partikeln der magnetischen Träger 12 über die Zielsubstanz 13 verbunden, um ein Aggregat zu bilden, wie in Fig. 2A gezeigt wird. Der magnetische Träger 12, welcher das Aggregat ausmacht, bildet ein Präzipitationsbild, das gleichmäßig auf der Bodenoberfläche der Vertiefung verteilt ist, wie in Fig. 2B gezeigt wird. Dieses Bild wird ein positives (+) Bild genannt. Wenn keine Zielsubstanz in der Probe vorhanden ist, wird ein nicht-agglutinierter magnetischer Träger 12 in der Mitte der Bodenoberfläche jeder Vertiefung 11 präzipitiert, wie in Fig. 3A gezeigt wird. Der präzipitierte nicht-agglutinierte magnetische Träger 12 bildet ein Präzipitationsbild, das wie ein Knopf (bottom) in der Mitte der Vertiefung konzentriert ist, wie in Fig. 3B gezeigt wird. Dieses Bild wird ein negatives (-) Bild genannt. Auf diese Weise werden die Präzipitationsbilder, welche sich auf den Bodenoberflächen der Vertiefungen gebildet haben, mit dem bloßen Auge beobachtet oder durch eine optische Meßeinheit gemessen, um das positive oder negative Bild zu bestimmen, d.h., um zu bestimmen, ob ein nachzuweisendes Antigen oder ein Antikörper in der Probe vorhanden ist.
Wie oben beschrieben wird ein magnetischer Träger verwendet und es wird ein äußeres Magnetfeld an das Reaktionsgefäß angelegt, um die Meßdauer zu verkürzen, da eine lange Meßdauer eines der Probleme der Mikrotitertechnik ist. Dieser Stand der Technik kann jedoch nicht alle Probleme lösen, die von der Mikrotitertechnik aufgeworfen werden.
Als erstes hängen bei einer herkömmlichen Mikrotitertechnik Faktoren, wie z.B. die Größe und Eindeutigkeit eines Präzipitationsbildes, von der Form des Bodens eines Reaktionsgefäßes, wie z.B. einer Mikrotiterplatte ab. Die Formen und Oberflächenbereiche der Böden von Reaktionsgefäßen sind oft bei verschiedenen Herstellern und verschiedenen Herstellungszahlen verschieden. Somit neigen die obigen Faktoren dazu, zwischen den einzelnen Reaktionsgefäßen zu variieren. Wenn die Formen und Oberflächenbereiche der Böden der Reaktionsgefäße, welche mit deren Volumina zusammenhängen, voneinander verschieden sind, müssen die Zusammensetzungen, Verteilungsmengen, Trägerkonzentrationen und dergleichen von Proben und Reagenzien verändert werden, um eine Reaktionsfähigkeit des Systems aufrechtzuerhalten. Aus diesem Grund ist es schwierig, die Ergebnisse der Bestimmung zu vergleichen.
Bei einer herkömmlichen Mikrotitertechnik wird ein Präzipitationsbild gebildet, indem die Neigung der Bodenoberfläche eines Reaktionsgefäßes ausgenutzt wird. Aus diesem Grund neigt das gebildete Präzipitationsbild dazu, durch das Gewicht der Trägerpartikel, eine elektrische Abstoßungskraft oder äußere Kräfte, wie z.B. eine magnetische Kraft, eine Zentrifugalkraft oder eine Vibration, zerstört zu werden. Das Ausmaß der Zusammenbrüche von Präzipitationsbildem ändert sich in Abhängigkeit von den Formen der Böden der Reaktionsgefäße. Der Zusammenbruch des Präzipitationsbildes kann einen Bestimmungsfehler verursachen, so daß eine Probe, welche als positiv bestimmt werden muß, als negativ bestimmt wird, womit ein entscheidendes Problem verursacht wird. Weiterhin neigt in dem Fall, wo der durchschnittliche Korndurchmesser von Trägerpartikeln 3 µm oder weniger beträgt, das gebildete Präzipitationsbild ebenfalls dazu, aufgrund der Brown'schen Bewegung der Partikel zerstört zu werden.
Um dieses Problem zu lösen, kann ein Präzipitationsbild gebildet werden, während ein Reaktionsgefäß mit einer flachen Bodenoberfläche von der horizontalen Richtung weg geneigt wird, und die Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes wird dann in die Horizontale zurückgesetzt. Wenn jedoch das Reaktionsgefäß bewegt wird, wird die Flüssigkeit innerhalb des Reaktionsgefäßes ebenfalls bewegt oder geschüttelt, was bewirkt, daß die Trägerpartikel, welche das Präzipitationsbild ausmachen, wieder schweben oder sich bewegen. Daher weist dieses Verfahren ebenfalls eine schlechte Zuverlässigkeit auf.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein immunologisches Testverfahren zur Verfügung zu stellen, welches nicht von den Typen der Reaktionsgefäße wie beispielsweise einer Mikroplatte abhängt, welches immer ein regelmäßiges Präzipitationsbild liefern kann und welches bei der Bewahrung eines Präzipitationsbildes nach seiner Bildung ausgezeichnet ist.
Ein immunologisches Testverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wurde in Anbetracht der obigen Situation entwikkelt. Es wird ein immunologisches Testverfahren zur Verfügung gestellt, welches die folgenden Schritte umfaßt: Einbringen einer Probe und eines magnetischen Trägers, welcher eine Oberfläche aufweist, die mit einer Substanz immobilisiert ist, welche spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen oder einen Antikörper binden soll, in ein Reaktionsgefäß, Anlegen eines Magnetfeldes an das Reaktionsgefäß, um ein Präzipitationsbild auf einer Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes zu bilden, und Bestimmen nach der Form des Präzipitationsbildes, ob das nachzuweisende Antigen oder der Antikörper in der Probe vorhanden ist, wobei ein Magnet mit einer magnetischen Kraft, die den Träger bewegen kann, außerhalb des Reaktionsgefäßes zur Verfügung gestellt wird, so daß er der Wandoberfläche davon während oder nach einer Reaktion zwischen dem nachzuweisenden Antigen oder Antikörper und dem magnetischen Träger gegenüberliegt, und der Magnet ein Magnetfeld bildet, welches bezüglich einer Ebene senkrecht zu einer Richtung, in welcher der Träger bewegt wird, einen vorbestimmten Gradienten aufweist.
Ein Verfahren des Anordnens eines äußeren Magneten außerhalb des Reaktionsgefäßes, so daß der Abstand zwischen der Oberfläche des Magneten und der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes schrittweise erhöht wird, oder ein Verfahren des Anordnens eines äußeren Magneten mit einem Gradienten-Magnetfeld außerhalb des Reaktionsgefäßes wird vorzugsweise als das Verfahren zur Verteilung der Stärke des Magnetfeldes mit dem vorbestimmten Gradienten von der willkürlichen Fläche auf der Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet werden soll, verwendet.
In dem Verfahren, welches in der veröffentlichten ungeprüften japanischen Patentanmeldung Nr. 2-124464 offenbart ist, wird das Präzipitationsbild mit dem magnetischen Träger gebildet, indem die Neigung der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes in einem gleichförmigen Magnetfeld ausgenutzt wird, das durch einen Magneten erzeugt wird, der so angeordnet ist, daß die obere flache Oberfläche des Magneten mit einer horizontalen Ebene zusammenfällt, welche senkrecht zu der Richtung der Schwerkraft verläuft. Aus diesem Grund sind die Formen der Präzipitationsbilder, abhängig von den Formen der Wandoberflächen, unterschiedlich. Im Gegensatz dazu wird bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung die Stärke des Magnetfeldes auf der Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet werden soll, von der willkürlichen Fläche mit dem vorbestimmten Gradienten bezüglich einer Ebene senkrecht zu einer Richtung, in welcher Trägerpartikel präzipitieren, aus verteilt, und das Präzipitationsbild wird durch das magnetische Verhalten gebildet. Daher kann unabhängig von der Form des Reaktionsgefäßes immer ein regelmäßiges Präzipitationsbild erhalten werden, indem die Verteilung der Stärke des Magnetfeldes eingestellt wird.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Präzipitationsbild auf der Grundlage des Unterschiedes in der Stärke des Magnetfeldes auf der Wandoberfläche, auf welcher ein Präzipitationsbild gebildet werden soll, gebildet. Eine vertikale Bewegung der Trägerpartikel ist nicht nötig. Aus diesem Grund kann die Wandoberfläche, auf wel cher ein Präzipitationsbild gebildet werden soll, flach und senkrecht zu der vertikalen Richtung sein. Ein Präzipitationsbild, welches auf einer solchen Wandoberfläche gebildet wird, ist stabiler als ein Präzipitationsbild, welches auf der eingesenkten Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes gebildet wird. Daher kann gemäß der vorliegenden Erfindung ein in hohem Maße zuverlässiger immunologischer Test durchgeführt werden.
Diese Erfindung kann vollständiger durch die folgende detaillierte Beschreibung verstanden werden, wenn sie im Zusammenhang mit den begleitenden Zeichnungen gesehen wird, in welchen:
Fig. 1A eine Draufsicht ist, welche eine herkömmliche Vorrichtung zum Praktizieren einer Mikrotitertechnik unter Verwendung von Magneten und einem magnetischen Träger zeigt;
Fig. 1B eine Seitenansicht der Vorrichtung ist, welche in Fig. 1A gezeigt ist;
Fig. 2A eine Ansicht ist, welche ein Aggregat von magnetischen Trägern darstellt, das als ein Ergebnis einer positiven Reaktion in der Mikrotitertechnik erzeugt wird;
Fig. 2B eine Ansicht ist, welche ein positives Bild bei der Mikrotitertechnik zeigt;
Fig. 3A eine Ansicht ist, welche einen magnetischen Träger beim Präzipitieren darstellt, wenn eine negative Reaktion in der Mikrotitertechnik durchgeführt wird;
Fig. 3B eine Ansicht ist, welche ein negatives Bild bei der Mikrotitertechnik zeigt;
Fig. 4A eine Ansicht ist, welche eine Vorrichtung zum Praktizieren eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform davon darstellt, wobei die Vorrichtung eine Mikroplatte mit einer Vertiefung mit einem flachen Boden und einen Magneten mit einer haibkugelförmigen oberen Oberfläche verwendet, und welche ebenfalls ein positives Reaktionsergebnis darstellt, das erhalten wird, wenn ein Test unter Verwendung dieser Vorrichtung durchgeführt wird;
Fig. 4B eine Ansicht ist, welche ein negatives Reaktionsergebnis darstellt, welches erhalten wird, wenn ein Test unter Verwendung der in Fig. 4A gezeigten Vorrichtung durchgeführt wird;
Fig. 5 eine Ansicht ist, welche eine Vorrichtung zum Praktizieren des Verfahrens gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei die obere Oberfläche des Magneten konisch ist;
Fig. 6 eine Ansicht ist, welche die Struktur eines Magneten als einen Elektromagneten, welcher in der Vorrichtung zum Praktizieren eines Verfahrens der vorliegenden Erfindung gemäß einer Ausführungsform davon verwendet wird, darstellt;
Fig. 7 eine Ansicht ist, welche eine Vorrichtung zum Praktizieren des Verfahrens gemiß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung darstellt, wobei das Reaktionsgefäß eine Mikroplatte mit einer halbkugelförmigen Vertiefung ist;
Fig. 8 eine Ansicht ist, welche eine Vorrichtung zum Praktizieren des Verfahrens gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt, wobei das Reaktionsgefäß eine Mikroplatte mit einer konischen Vertiefung ist;
Fig. 9A eine Ansicht ist, welche eine Vorrichtung darstellt, die eine Mikroplatte mit einer Vertiefung mit einem flachen Boden und einen Magneten mit einer flachen oberen Oberfläche gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet;
Fig. 9B eine Ansicht ist, welche ein positives Bild zeigt, das durch Verwendung der in Fig. 9A gezeigten Vorrichtung erhalten wurde;
Fig. 9C eine Ansicht ist, welche ein negatives Bild zeigt, das durch Verwendung der in Fig. 9A gezeigten Vorrichtung erhalten wurde;
Fig. 10A eine Draufsicht ist, welche eine Vorrichtung zum Praktizieren des Verfahrens zeigt, die eine flache Platte ohne eingesenkte Oberfläche gemäß noch einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet; und
Fig. 10B eine Seitenansicht der in Fig. 10A gezeigten Vorrichtung ist.
Ein magnetischer Träger, welcher in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, hat ein Wesen, durch welches der magnetische Träger auf die ein Magnetfeld erzeugende Quelle, wie z.B. einen permanenten Magneten oder einen Elektromagneten hin bewegt wird. Die Form, die relative Dichte und die Größe des magnetischen Trägers sind nicht auf bestimmte beschränkt. Das heißt, gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein magnetischer Träger mit einer beliebigen relativen Dichte und einer beliebigen Größe verwendet werden. Beispielsweise kann, um ein Präzipitationsbild durch Verwendung eines Trägers mit einer geringen relativen Dichte, wie z.B. eines feinen Partikels mit einer Partikelgröße von 1 µm oder weniger oder eines hohlen Partikels zu bilden, eine relativ starke magnetische Kraft angelegt werden. Wenn ein Träger mit einer hohen relativen Dichte, wie z.B. einer mit einer relativen Dichte, welche 1,5 überschreitet, verwendet wird, wird vorzugsweise eine relativ schwache magnetische Kraft angewendet.
Wie oben beschrieben, sind die Form und Größe des magnetischen Trägers nicht auf die bestimmten beschränkt. Der magnetische Träger, welcher in der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist jedoch vorzugsweise ein kugelförmiger oder kugelähnlicher polygonaler Partikel mit einer durchschnittlichen Partikelgröße von 0,1 bis 50 µm. Als ein solcher magnetischer Partikel kann eine magnetische Substanz, welche granulär ist, oder ein Polymer mit einer hydrophilen Oberfläche oder ein Koazervat, welches eine vorbestimmte Menge an feinen magnetischen Partikeln enthält, welche jeweils eine Partikelgröße von weniger als 0,1 µm aufweisen, verwendet werden. Die durchschnittliche Partikelgröße des magnetischen Trägers fällt in Anbetracht des Kontrastes des resultierenden Präzipitationsbildes vorzugsweise in den Bereich von 3 bis 15 µm, und besonders bevorzugt 5 bis 10 µm.
Der magnetische Träger kann leicht hergestellt werden, indem eine geeignete bekannte Technik ausgewählt wird. Der magnetische Träger kann nach Bedarf gefärbt sein.
Beispiele für die innere Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes sind Polystyrol, Vinylchlorid, Siliciumdioxid, Kohlenstoff, Gelatine und Albumin. Eine Substanz oder eine funktionelle Gruppe zur Verbesserung der Hydrophihe-Eigenschaft oder der Reaktivität kann nach Bedarf verwendet werden.
Der Magnet, welcher verwendet wird, um in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Magnetfeld an das Reaktionsgefäß anzulegen, weist eine magnetische Kraft auf, welche in der Lage ist, einen magnetischen Träger, welcher in einer bestimmten Reaktionslösung schwebt, vorzugsweise innerhalb weniger Minuten, zu präzipitieren. Vorzugsweise weist der Magnet in einem bestimmten Abstand von seiner Oberfläche eine fast gleichförmige magnetische Kraft auf. Die Polarität des Magneten ist nicht auf den N- oder S-Pol beschränkt und jeder Pol hat dieselbe Wirkung. Um den Prozeß der Bildung eines Präzipitationsbildes oder das gebildete Präzipitationsbild zu beobachten, ist die Oberfläche des Magneten, welche der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes gegenüberliegt, vorzugsweise in weiß, silbern oder einer ähnlichen Farbe gefärbt. Ein magnetisch durchlässiger flacher Spiegel wird vorzugsweise zwischen dem Reaktionsgefäß und dem Magneten angeordnet.
Das Reaktionsgefäß, welches in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist definiert als ein Gefäß mit einer Wandoberfläche, welche in der Lage ist, eine vorbestimmte Menge an magnetischem Träger und eine vorbestimmte Menge einer Probe aufzunehmen, während der magnetische Träger mit der Probe reagiert, um ein Präzipitations bild zu bilden. Beispielsweise kann ein Reaktionsgefäß, wie z.B. eine Mikroplatte mit einem eingesenkten Bereich zum Speichern einer Flüssigkeit oder dergleichen, oder ein Reaktionsgefäß, wie z.B. eine Glasscheibe zum Festhalten einer Probe oder dergleichen auf einer flachen Oberfläche, als das Reaktionsgefäß verwendet werden. In dem Fall, wo ein Präzipitationsbild auf einer flachen Ebene gebildet wird, ist der Fokussierungsvorgang vereinfacht.
Das Material für das Reaktionsgefäß ist nicht auf irgendein bestimmtes Material beschränkt, wenn das Material eine magnetische Durchlässigkeit aufweist. Beispiele für das Material sind Gläser, Kunststoffe und Papier. Die Farbe des Reaktionsgefäßes ist nicht auf eine bestimmte Farbe beschränkt. Um die Beobachtung des Präzipitationsbildes zu erleichtern, kann vorzugsweise ein transparentes Reaktionsgefäß verwendet werden, und ein weißes oder silbernes Material kann unter dem transparenten Reaktionsgefäß angeordnet werden oder das Reaktionsgefäß selbst kann vorzugsweise in weiß oder silbern gefärbt sein.
Das Material für das Reaktionsgefäß kann ein Material sein, das eine solche ionische Bindungsfähigkeit aufweist, welche durch eine Wasserstoffperoxid-Behandlung oder durch Plasmabestrahlung erhöht wurde, daß eine Immobilisierung eines Antigens oder Antikörpers erleichtert wird. Verschiedene Techniken zur Immobilisierung eines Antigens oder Antikörpers sind bekannt, und jede davon kann verwendet werden.
Eine Substanz, welche spezifisch gebunden wird oder mit einer nachzuweisenden Substanz im Wettbewerb steht, wird als die Substanz ausgewählt, welche in dem Reaktionsgefäß immobilisiert wird. Die Substanz, welche der Immobilisierung unterworfen wird, wird vorzugsweise wenigstens in dem Bereich der Reaktionsgefäßwandoberfläche, in welchem sich das Präzipitationsbild bildet, ohne eine Lücke immobilisiert. Man sollte beachten, daß die Immobilisierung auf der Reaktionsgefäßwandoberfläche kein notwendiges Element der Erfindung ist. Weiterhin kann bei der Erfindung die magnetische Flußdichte (Gauß) gemäß der Affinität zwischen der Reaktionsgefäßwandoberfläche und dem Trägerpartikel verändert werden.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird ein Magnetfeld mit einem vorbestimmten Gradienten auf einer hypothetischen Ebene senkrecht zu der Präzipitationsrichtung des magnetischen Trägers erzeugt. Normalerweise wird der magnetische Träger gemäß einer herkömmlichen Mikrotitertechnik in Richtung der Schwerkraft auf der Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes präzipitiert. Bei dem herkömmlichen Verfahren wird eine magnetfelderzeugende Quelle, wie z.B. ein Magnet, unterhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet, so daß das Magnetfeld bezüglich der horizontalen Ebene einen vorbestimmten Gradienten aufweist. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung muß der magnetische Träger jedoch nicht vertikal präzipitiert werden. Daß heißt, daß wenn sich eine Reaktionsiösung, welche einen magnetischen Träger und eine Probe enthält, in Kontakt mit der Seite oder der oberen Oberflgche des Reaktionsgefäßes befindet, der Magnet über oder seitlich von dem Reaktionsgefäß angeordnet wird, wodurch ein Präzipitationsbild auf der Seite oder der oberen Oberfläche gebildet wird. Einige der Beispiele der Technik zur Bildung eines solchen magnetischen Gradienten sind: einmal Formen der magnetischen polaren Oberfläche eines Magneten, welcher in vertikaler Richtung eine gleichmäßige magnetische Kraft erzeugt, zu einer Ebene, welche in einem geeigneten Winkel geneigt ist, oder einer gekrümmten Oberfläche mit einer geeigneten Krümmung (Figuren 4A - B), einmal Neigen der Flußrichtung des Magneten in einem geeigneten Winkel bezüglich der Wandoberfläche, auf welcher ein Präzipitationsbild gebildet wird (Figuren 9A - 10B), und einmal Zur-Verfügung-Stellen einer Anzahl von Magnetfeldern mit voneinander verschiedenen magnetischen Kräften, benachbart zu der Wandoberfläche, auf welcher ein Präzipitationsbild gebildet wird (erläuternder Abschnitt von Fig. 6).
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail mit Bezug auf die begleitenden Zeichnungen beschrieben.
Die Figuren 4A und 4B sind Ansichten, welche eine Kombination eines Reaktionsgefäßes und eines Magneten darstellen, welche in dem Verfahren gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Mit Bezug auf die Figuren 4A und 4B wird eine Mikroplatte 21 mit einer Vertiefung 22 mit einem flachen Boden als das Reaktionsgefäß verwendet. Ein halbkugelförmiger Magnet 24 ist so unterhalb der Mikroplatte 21 angeordnet, daß die konvexe Oberfläche des Magneten 24 der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 gegenüberliegt Der Abstand zwischen der Vertiefung 22 und dem Magneten 24 ist an dem mittleren Punkt der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 am kleinsten, und der Abstand wird zum Rand der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 hin vergrößert. Der halbkugelförmige Magnet 24 ist ein permanenter Magnet, dessen halbkugelförmige Oberfläche einen N- oder S- Pol aufweist. Mit dieser Anordnung wird ein Magnetfeld derart erzeugt, daß seine Stärke in der Mitte der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 am größten ist und die Stärke zum Rand hin schrittweise abnimmt. Als ein Ergebnis wird bei diesem Reaktionsgefäß eine Kraft, welche auf die Mitte der Vertiefung hin gerichtet ist, auf den magnetischen Träger ausgeübt, im wesentlichen auf dieselbe Weise wie bei der herkömmlichen Kombination aus der Mikroplatte mit der Vertiefung mit der halbkugelförmigen Bodenoberfläche und dem Magneten mit der oberen flachen Oberfläche, wie sie in den Figuren 1A und 1B gezeigt ist.
Wenn eine vorbestimmte Menge einer Probe mit einer vorbestimmten Menge eines magnetischen Trägers, welcher eine immobilisierte Substanz enthält, die spezifisch an eine Zielsubstanz gebunden wird, umgesetzt wird und wenn die Probe die Zielsubstanz enthält, wird ein magnetischer Träger 25, welcher über die Zielsubstanz 26 agglutiniert ist, durch das magnetische Verhalten des Magneten 24 auf der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 präzipitiert, wie in Fig. 4A gezeigt ist. Nach dem Präzipitieren ist der agglutinierte magnetische Träger 25 abgesetzt worden, ohne entlang der Bodenoberfläche bewegt worden zu sein. Als ein Ergebnis wird ein gleichmäßig verteiltes Präzipitationsbild auf der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 wie in Fig. 3A gebildet.
Wenn die Probe jedoch die Zielsubstanz nicht enthält, werden die Partikel des magnetischen Trägers 25 nicht agglutiniert und werden auf der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 präzipitiert. Die Partikel werden kontinuierlich auf den mittleren Bereich der Bodenoberfläche der Vertiefung 22 hin bewegt, da die Stärke des Magnetfeldes an dem mittleren Bereich größer ist als die Stärke an dem Randbereich. Als ein Ergebnis wird der magnetische Träger 25 in dem mittleren Bereich konzentriert, wodurch ein Präzipitationsbild ähnlich einem Knopf wie in Fig. 3B erhalten wird.
Die Krümmung der halbkugelförmigen konvexen Oberfläche des Magneten 24 entspricht vorzugsweise der Krümmung der Innenwand des Bodenbereichs der herkömmlichen Vertiefung, welche als die halbkugelförmige eingesenkte Bodenoberfläche dient.
Fig. 5 ist eine Ansicht, welche ein Anordnung unter Verwendung eines Magneten 34 darstellt, welcher eine Form aufweist, die von der des Magneten 24 verschieden ist, in der Kombination des Reaktionsgefäßes und des Magneten, welche in den Figuren 4A und 4B gezeigt ist. Der Magnet 34 hat eine konische konvexe Oberfläche, deren distaler Endabschnitt leicht abgeschnitten (broken) ist. Diese konvexe Oberfläche liegt einem Reaktionsgefäß 21 gegenüber. Der abgeschnittene distale Endabschnitt wird durch eine flache Oberfläche ausgebildet. Ein nicht-agglutinierter magnetischer Träger wird auf einem Bodenoberflächenbereich der Vertiefung konzentriert, welcher der flachen Oberfläche gegenüberliegt, wodurch ein negatives Bild mit einer bestimmten Fläche gebildet wird. Man beachte, daß der Apexwinkel des Konus, welcher die konvexe Oberfläche des Magneten 34 bildet, vorzugsweise dem Apexwinkel der herkömmlichen Vertiefung mit der konisch eingesenkten Bodenoberfläche entspricht.
Fig. 6 ist eine teilweise Schnittansicht, welche einen Elektromagneten darstellt, der als eine magnetfelderzeugende Quelle verwendet wird, im Gegensatz zu der magnetfelderzeugenden Quelle (Figuren 4A und 4B oder 5) aus einem permanenten Magneten. Wie in Fig. 6 gezeigt, besteht dieser Elektromagnet aus einem nietenähnlichen (rivet-like) magnetischen Element 44a und zylindrischen magnetischen Elementen 44b bis 44f. Das zylindrische magnetische Element 44b ist so angeordnet, daß es das nietenähnliche magnetische Element 44a in einer Position unterhalb der des magnetischen Elementes 44a umgibt. In ähnlicher Weise sind die zylindrischen magnetischen Elemente 44c, 44d, 44e und 44f konzentrisch um das magnetische Element 44a herum angeordnet, so daß ihre Höhen schrittweise nach außen hin kleiner werden. Windungen 45 sind entsprechend um die Körper der magnetischen Elemente 44a bis 44f herumgewunden und sind über einen Potentialtransformator 46 und einen Schalter 47 mit einer Stromquelle 48 verbunden. Wenn der Schalter 47 eingeschaltet wird, ist die Stromquelle 48 mit dem Potentialtransformator 46 verbunden. Strom fließt über den Potentialtransformator 46 in die Windungen 45, wodurch die magnetischen Elemente 44a bis 44f gleichermaßen magnetisiert werden.
Wenn der Elektromagnet mit der obigen Anordnung unterhalb der Mikroplatte, welche in den Figuren 4A und 4B oder in Fig. 5 gezeigt ist, angeordnet wird, wird auf der Bodenoberfläche der Vertiefung ein Magnetfeld so erzeugt, daß seine Stärke von der Mitte zum Rand hin abnimmt. Daher kann ein Präzipitationsbild wie bei der Kombination der Figuren 4A und 4B gebildet werden.
Bei dem Elektromagneten, welcher in Fig. 6 gezeigt ist, sind die Windungen 45 entsprechend um das nietenähnliche magnetische Element 44a und die zylindrischen magnetischen Elemente 44b bis 44f herumgewunden. Jedoch können die unteren Bereiche der magnetischen Elemente 44a bis 44f einstückig ausgebildet sein und eine Windung kann um diesen gemeinsamen Bereich herumgewunden werden, um dieselbe Magnetisierung zu erhalten, wie bei dem obigen Elektromagneten.
Alternativ können die oberen Oberflächen des nietenähnlichen magnetischen Elementes 44a und der zylindrischen magnetischen Elemente 44b bis 44f bündig aneinander anschließen und die Anzahl von Umdrehungen der Windungen 45 der entsprechenden magnetischen Elemente kann unterschiedlich zueinander eingestellt werden, um das Magnetfeld elektrisch so zu steuern, daß seine Stärke zum Rand hin abnimmt. Mit einem elektrisch gesteuerten Elektromagneten kann der magnetische Gradient verändert werden, ohne die Form der oberen Oberfläche des Magneten zu verändern. Daher kann die Analyse einer Mehrzahl von Testposten dadurch abgedeckt werden.
Die Figuren 7 und 8 sind Ansichten, welche Mikroplatten als Reaktionsgefäße zeigen, die Vertiefungen mit halbkugelförmigen bzw. konischen Bodenoberflächen anstelle der Mikroplatte mit Vertiefungen mit flachen Böden aufweisen.
Mit Bezug auf Fig. 7 ist ein Magnet 54 mit einer eingesenkten Oberfläche unterhalb einer Vertiefung 52 mit einer halbkugelförmigen inneren Oberfläche in einer Mikroplatte 51 so angeordnet, daß die eingesenkte Oberfläche des Magneten 54 der Vertiefung 52 gegenüberliegt Der Abstand zwischen der inneren Oberfläche der Vertiefung 52 und der eingesenkten Oberfläche des Magneten 54 ist nahe der Mitte am kürzesten, an welcher die Neigung der inneren Oberfläche der Vertiefung am kleinsten ist. Der Abstand wird zum Rand hin erhöht, an welchem die Neigung erhöht wird. Die Krümmung der eingesenkten Oberfläche des Magneten 54 wird in Verbindung mit der Krümmung der inneren Oberfläche der Vertiefung 52 so festgelegt, daß eine Kraft, welche der entspricht, die beim Ändern der halbkugelförmigen Bodenoberfläche der Vertiefung der Mikroplatte, die in Fig. 1B gezeigt ist, in eine konische Bodenoberfläche erhalten wird, auf den magnetischen Träger angewendet wird.
Mit Bezug auf Fig. 8 wird ein Magnet 64 mit einer eingesenkten Oberfläche so unterhalb einer Vertiefung 62 mit einer konischen inneren Oberfläche in einer Mikroplatte 61 angeordnet, daß die eingesenkte Oberfläche des Magneten 64 der Vertiefung 62 gegenüberliegt Der Abstand zwischen der Vertiefung 62 und der eingesenkten Oberfläche des Magneten 64 ist am Rand der Vertiefung 62 am kürzesten, im Gegensatz zu dem in Fig. 7. Der Abstand wird zu dem mittleren Bereich der Vertiefung 62 hin erhöht. Die Krümmung des Magneten 64 wird in Verbindung mit dem Apexwinkel der konischen Vertiefung 62 festgelegt. Dieselbe Kraft wie in der Vertiefung mit der halbkugelförmigen Bodenoberfläche in der Mikroplatte, welche in Fig. 1B gezeigt ist, wird auf den magnetischen Träger angewendet.
Mit der Anordnung, welche in Fig. 7 oder 8 gezeigt ist, kann durch Verwendung der Mikroplatte, bei welcher die Form der Bodenoberfläche der Vertiefung halbkugelförmig oder konisch ist, dasselbe Ergebnis erhalten werden wie mit der Platte, bei welcher die Form der Vertiefung konisch oder halbkugelförmig ist. Daß heißt, eine Platte kann als eine Platte mit einer Vertiefung mit einer halbkugelförmigen Bodenoberfläche oder als eine Platte mit einer Vertiefung mit einer konischen Bodenoberfläche verwendet werden. Wenn eine im Handel erhältliche Mikroplatte verwendet wird, müssen Unterschiede, welche durch unterschiedliche Formen der Vertiefung verursacht werden (z.B. bei unterschiedlichen Herstellern und unterschiedlichen Chargennummern), nicht in Erwägung gezogen werden, und die Kompatibilität kann verbessert werden.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail anhand des folgenden Beispiels beschrieben.

Beispiel 1

Herstellung einer Platte, die mit humanem IgG immobilisiert ist

Eine Lösung, welche erhalten wurde, indem ein humanes IgG (ICN; Produktnr. 64-145, erhältlich von Seikagaku Kogyo KK) mit einem 0,01 M PBS, pH 7,43, auf eine Konzentration von 15,6 µg/ml verdünnt wurde, wurde mit 50 µl/Vertiefung in jede Vertiefung einer Platte mit einem flachen Boden (2 x 8 Vertiefungen; Vertiefungsdurchmesser: 6 mm; Produktnr. 469914), die von der NUNC Corp. erhältlich ist, verteilt und wurde 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die inkubierte Lösung mit einem PBS gewaschen, und die Reaktionsprodukte wurden natürlich getrocknet.

Herstellung von magnetischen Partikeln. welche mit antihumanem IgG sensibilisiert sind

200 µl einer Suspension (Partikelkonzentration: 5% (w/w)) von magnetischen Gelatinepartikeln mit einem durchschnittlichen Partikeldurchmesser von 6,1 µm (erhältlich von Olympus Optical Co., Ltd.) wurden mit einem 0,01 M PBS, pH 7,43 gewaschen. Nachdem 1 ml einer PBS-Lösung von Tannin zu der Suspension zugegeben worden war, wurde die resultierende Lösung 30 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Nachdem das Reaktionsprodukt mit einer 0,01 M PBS-Lösung, pH 7,43 gewaschen worden und 1 ml einer 0,01 M PBS-Lösung (Konzentration: 25 µg/ml), pH 7,43 eines anti-human-IgG-Ziegen-Antikörpers (erhältlich von CAPPEL Corp.) dazugegeben worden war, wurde die resultierende Lösung eine Stunde lang bei 37ºC inkubiert. Nach dieser Inkubation wurden die magnetischen Gelatinepartikel, welche mit dem Antikörper sensibilisiert waren, mit einem 0,01 M PBS, pH 7,43 gewaschen. Die magnetischen Gelatinepartikel wurden suspendiert, um eine Partikelkonzentration von 0,25% (w/w) in einem 0,01 M PBS, pH 7,43, welcher 0,2% Rinderserumalbumin und 0,05% NaN&sub3; enthielt, zu erhalten.

Herstellung von nicht-sensibiliserten magnetischen Partikeln

Nicht-sensibilisierte magnetische Partikel wurden hergestellt, indem dieselben Vorgänge durchgeführt wurden wie bei der Herstellung der magnetischen Partikel, welche mit dem anti-humanen IgG-Antikörper sensibilisiert waren, außer daß die Konzentration des anti-human-IgG-Ziegen-Antikörpers auf 0 µg/ml gesetzt wurde.

Bildung eines Reaktionsmusters

Die hergestellte IgG-immobilisierte Platte wurde horizontal gestellt und 25 µl der hergestellten Antikörper-sensibilisierten Partikel und 25 µl der hergestellten nicht-sensibilisierten Partikel wurden entsprechend zu zwei Vertiefungen der Platte zugegeben und gerührt. Sofort danach wurde, wie in Fig. 9A gezeigt ist, die Platte horizontal gestellt und ein Magnet 74 wurde mit einem Punkt des Randes der Bodenoberfläche von jeder Vertiefung in Kontakt gebracht und wurde so fixiert, daß ein Winkel, welcher sich zwischen der Bodenoberfläche jeder Vertiefung und der oberen Oberfläche des entsprechenden Magneten 74 bildete, auf einen Winkel θ gesetzt wurde. Der Magnet 74 war ein säulenförmiger Gußeisenmagnet mit einer Flußdichte von ca. 2.000 Gauß, einem Durchmesser von 24 mm und einer Höhe von 22 mm, und der Winkel θ wurde auf 20º gesetzt. In diesem Zustand wurden die Reaktionen der sensibilisierten und der nicht-sensibilisierten Partikel 5 Minuten lang fortgesetzt, um Reaktionsmuster zu bilden.
Als ein Ergebnis war ein positives Bild der sensibilisierten Partikel ein Muster, das fast gleichmäßig auf der Bodenoberfläche der entsprechenden Vertiefung verteilt war, wie in Fig. 9B gezeigt ist. Jedoch war ein negatives Bild, welches durch die nicht-sensibilisierten Partikel gebildet wurde, ein Muster, das in der Nähe des Punktes gebildet wurde, mit welchem der entsprechende Magnet 74 in Kontakt war, wie in Fig. 9C gezeigt ist. Dieselbe Wirkung wurde unabhängig von der Polarität (N- oder S-Pol) der Oberfläche jedes Magneten 74 an einer Stelle gegenüber der Oberfläche der entsprechenden Vertiefung erzielt. Darüber hinaus wurde das positive Bild, welches sich in der flachen Vertiefung bildete, über eine Woche lang stabil beibehalten, selbst wenn der Magnet 74 von dem Boden der Vertiefung entfernt wurde.
Wie oben beschrieben war der Magnet geneigt und so fixiert, daß die Oberfläche des Magneten graduell von einem Punkt der Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes mit der flachen Bodenoberfläche getrennt wurde, und Präzipitationsbilder, welche Muster aufwiesen, die für die positiven und negativen Bilder eindeutig waren, gebildet werden konnten.
Als nächstes wurden, indem einem ähnlichen Verfahren wie in dem oben beschriebenen Beispiel gefolgt wurde, für jeden der vier Typen von magnetischen Partikeln, welche sich voneinander durch die durchschnittlichen Durchmesser unterschieden, sowohl sensibilisierte als auch nicht-sensibilisierte Typen von magnetischen Partikeln hergestellt. Die durchschnittlichen Durchmesser der magnetischen Partikel betrugen 1,8 µm, 3,2 µm, 4,0 µm und 6,1 µm. Direkt nach dem Zugeben von 25 µl/ml von jedem der Partikel zu jeder Vertiefung einer Mikroplatte, wurden die folgenden Fälle untersucht:
(a) der Fall, wo der Magnet 74 an einem Punkt mit dem Randbereich der anderen Bodenoberfläche einer Vertiefung in Kontakt gebracht wird, wie in Fig. 9A gezeigt ist; und
(b) der Fall, wo der Magnet 3 mm von dem Punkt entfernt angeordnet ist.
Bezüglich dieser Fälle wurde das Bild, welches sich 5 Minuten nachdem der Magnet 74 in verschiedenen Winkeln bezüglich der geraden Linie, welche durch den Punkt und den Mittelpunkt der Bodenoberfläche lief, geneigt wurde, bildete, für alle Typen von Partikeln beobachtet, und die Formen der erhaltenen Bilder wurden in 5 Kategorien klassifiziert. Die Klassifizierung beruhte auf der Länge des Bildes auf der Durchmesserlinie, welche gleichmäßig von der Kontaktpunktseite aus in 5 Teilabschnitte unterteilt war. Das Symbol (+++) steht für ein Bild von Partikeln, das sich über die gesamte Oberfläche der Vertiefung ausdehnte, das Symbol (++) steht für das von Partikeln, welche sich so ausdehnten, daß sie 4/5 der Länge erreichten, wie in Fig. 9B gezeigt ist, das Symbol (+) für eine Ausdehnung bis zu 3/5 der Länge, das Symbol (+) für eine Ausdehnung bis zu 2/5 der Länge, und das Symbol (-) für ein Bild von Partikeln, die auf 1/5 oder weniger der Länge koaguliert waren. Die Ergebnisse waren so, wie sie in Tabelle 1, welche unten angegeben ist, gezeigt sind, und dieselben Ergebnisse wurden unabhängig von dem Durchmesser der Partikel erhalten und änderten sich nicht, nachdem sie über Nacht stehen gelassen wurden. Tabelle 1
Was positiv/negativ in Tabelle 1 betrifft, so zeigt die "positive" Seite ein Bild von mit anti-IgG-Antikörper immobilisierten Partikeln an, welche eine positive Reaktion zeigen, wogegen die "negative" Seite ein Bild von nichtsensibilisierten Partikeln anzeigt, welche eine negative Reaktion zeigen.
In der Zwischenzeit wurden weitere Bilder gebildet, indem demselben Verfahren wie in Beispiel 1 gefolgt wurde, außer daß die magnetische Flußdichte und die Fläche der oberen Oberfläche des Magneten verändert wurden. Durch Verwendung eines Seltenerdmagneten mit einem Durchmesser von 5 mm und einer Magnetflußdichte von 2800 Gauß wurde ein Bild, welches dem aus Beispiel 1 ähnelte, erhalten, wogegen durch Verwendung eines Seltenerdmagneten mit einem Durchmesser von 3 mm und einer Magnetflußdichte von 2500 Gauß positive und negative Bilder mit einem Durchmesser von 3 mm oder weniger an einer gewünschten Stelle auf der Bodenoberfläche einer Vertiefung gebildet wurden. Folglich kann bei der Erfindung unabhängig von der Fläche der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes die Fläche des Magneten kleiner als die der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes gemacht werden. Somit kann ein Bild auf einer so kleinen Fläche gebildet werden, daß die Nachweisempf indlichkeit bei einer zu analysierenden Substanz in einer kleinen Menge oder mit einer geringen Reaktivität erhöht werden kann.
Wie in Tabelle 1 gezeigt, ist es möglich, ein Magnetfeld mit verschiedenen Gradienten bezüglich der Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes zu verwenden, und daher können natür lich dieselben Vorteile durch Verwendung von Magneten erhalten werden, die runde Formen haben, wie sie in den Figuren 4 - 8 gezeigt sind. Weiterhin können, wie erwähnt, klare positive und negative Bilder erhalten werden, indem der magnetische Gradient verändert wird, beispielsweise nachdem nur die Präzipitation des magnetischen Trägers verstärkt wurde.
Die Antikörper-sensibilisierten Partikel und die nicht-sensibilisierten Partikel wurden auf dieselbe Weise wie oben beschrieben zu zwei Vertiefungen, welche von den zwei obigen Vertiefungen in der IgG-immobilisierten Platte verschieden waren, zugegeben und gerührt. Der säulenförmige Magnet 74 wurde horizontal an der Bodenoberfläche jeder Vertiefung angebracht und die sensibilisierten und nichtsensibilisierten Partikel wurden gleichmißig innerhalb einer Minute auf den gesamten Bodenoberflächen der entsprechenden Vertiefungen präzipitiert und dann wurden die entsprechenden Magneten 74 2 Minuten lang in dem vorbestimmten Winkel θ geneigt. Als ein Ergebnis wurden, wie in dem obigen Fall, positive und negative Bilder gebildet.
Die Antikörper-sensibilisierten Partikel und die nicht-sensibilisierten Partikel wurden zu zwei Vertiefungen, welche von den obigen Paaren von Vertiefungen in der IgG-immobilisierten Platte verschieden waren, auf dieselbe Weise wie oben beschrieben zugegeben und gerührt. Die magnetischen Partikel wurden zeitweise präzipitiert ohne irgendein Magnetfeld daran anzulegen, und dann wurden die Magneten 74 fixiert, um in dem vorbestimmten Winkel θ geneigt zu werden. Als ein Ergebnis wurden wie in den obigen zwei Fällen positive und negative Bilder gebildet. Dieses zeigt, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewendet werden kann, nachdem die Trägerpartikel durch eine natürliche Sedimentationskraft, eine magnetische Kraft, eine Zentrifugalkraft oder dergleichen auf der Bodenoberfläche des Reak tionsgefäßes zeitweise präzipitiert wurden, um das Präzipitationsbild zu bilden. Als ein Ergebnis zeigen die obigen Testergebnisse, daß ein Präzipitationsbild mit einer gleichmäßigen Form erhalten werden kann, ohne von der Form des Reaktionsgefäßes abhängig zu sein.
Verschiedene Anderungen und Modifikationen der Beispiele können wie folgt gemacht werden.
In Beispiel 1 wird der Magnet mit einem Punkt auf dem Rand der Bodenoberfläche jeder Vertiefung in Kontakt gebracht und der Neigungswinkel des Magneten wird auf 20º gesetzt. In diesem Fall beträgt der Neigungswinkel vorzugsweise weniger als 50º bezüglich der horizontalen Richtung oder der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes, in welchem ein Präzipitationsbild gebildet werden soll. Wenn der Neigungswinkel bezüglich der Wandoberfläche des Gefäßes gleich oder größer als 50º ist, wird die magnetische Kraft entlang der Neigung in hohem Maße vermindert und das resultierende Präzipitationsbild neigt dazu, durch die Form des Reaktionsgefäßes nachteilig beeinflußt zu werden. Der Neigungswinkel des Magneten, welcher in der vorliegenden Erfindung anwendbar ist, fällt daher in den Bereich von 4º bis weniger als 50º, vorzugsweise 10º bis 35º.
Der Magnet kann leicht wie benötigt im Abstand von der Bodenoberfläche des Gefäßes angeordnet werden oder der Neigungswinkel des Magneten kann leicht in Erwägung von optimalen Reaktionszeiten, Bewegungseigenschaften der magnetischen Träger, Konzentrationen der Trägerpartikel, Zusammensetzungen der Suspensionen und Stärken der Magnetfelder verändert werden. Beispielsweise kann durch schrittweises oder kontinuierliches Erhöhen des Neigungswinkels des Magneten oder durch ein starkes Neigen des Gradientenmagnetfeldes die Bildungsgeschwindigkeit der Präzipitationsbilder erhöht werden, obwohl die Bildungsgeschwindigkeit an einem bestimmten Punkt eine Sättigung erfährt. Im Gegensatz dazu können durch ein schrittweises oder kontinuierliches Erniedrigen des Neigungswinkels oder ein Mäßigen der Neigung des Gradientenmagnetfeldes Unterschiede in der Reaktivität in einem größeren Bereich verglichen werden. Daher kann ein Test zu mehreren Zwecken oder mit mehreren Testposten durchgeführt werden.
Die Größe des Magneten und die Stärke des Magnetfeldes hängen mit den Ausdehnungsflächen der Präzipitationsbilder, welche gebildet werden sollen, zusammen. Wenn die Menge an Antigen oder Antikörper, welche nachgewiesen werden soll, sehr klein ist oder deren Reaktivität wegen der Gründe, daß eine Probe eine Verdünnung auf eine sehr niedrige Konzentration nötig macht und eine Probe eine Probe bei einem Anfangssymptom ist, gering ist, muß die Bodenfläche des Reaktionsgefäßes gemäß dem herkömmlichen Verfahren vermindert werden. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann jedoch die Größe des Magneten vermindert werden, um die Größe des Präzipitationsbildes zu vermindern, um so die Reaktivität, Empfindlichkeit und Klarheit des Musters zu erhöhen, ohne die Bodenfläche des Reaktionsgefäßes zu verändern.
In Beispiel 1 wird eine Mikroplatte mit einer Merhzahl von Vertiefungen als das Reaktionsgefäß verwendet. Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung muß das Reaktionsgefäß jedoch keine eingesenkte Vertiefung haben. Beispielsweise kann, wie in den Figuren 10A und 10B gezeigt ist, eine Vorrichtung zur Durchführung einer Agglutinationsreaktion auf einer flachen Platte verwendet werden. Diese Vorrichtung umfaßt eine flache Platte 81, die aus einer magnetisch durchlässigen Substanz gefertigt ist, und säulenförmige Magneten 84, welche bezüglich der flachen Platte 81 so fixiert sind, daß sie drehbar um die Achsen 83 herum angeordnet sind. Die Mehrzahl der Magnete 84 ist unterhalb der unteren Oberfläche der flachen Platte 81 angeordnet und ist im Abstand zueinander angeordnet. Der Abstand zwischen jedem Magneten 84 und der unteren Oberfläche der flachen Platte 81 ist so eingestellt, daß der Magnet mit der flachen Platte 81 in Kontakt gebracht werden kann, wenn der Magnet 84 um die Achse gedreht wird. Die Ausrichtungen der Achsen 83 sind parallel zueinander und die Achsen 83 sind in gleichem Abstand von der flachen Platte 81 entfernt angeordnet. Plattenförmige Teststücke 82, auf welchen Präzipitationsbilder gebildet werden sollen, können abnehmbar an Stellen auf der oberen Oberfläche der flachen Platte 81 angebracht werden, welche direkt über den entsprechenden Magneten 84 liegen. Jedes Teststück 82 ist durch ein Element (nicht gezeigt), wie z.B. einen Vorsprung, an einer vorbestimmten Stelle angeordnet. Jedes Teststück 82 ist aus einer magnetisch durchlässigen Substanz (z.B. Glas oder Kunststoff) gefertigt, welche eine Antigen-Antikörper-Reaktion oder eine Immobilisierung erlaubt. Die obere Oberfläche jedes Teststückes 82 ist flach und ist parallel zu der horizontalen Ebene. Dieses Teststück 82 ist ein Wegwerfartikel. Die Drehbewegung der Magneten 84 und das Austauschen der Teststücke 82 werden durch einen Drehmechanismus und eine Austauscheinheit durchgeführt (beide nicht gezeigt).
Ein Test unter Verwendung der Vorrichtung mit der obigen Anordnung wird wie folgt durchgeführt. Die Immobilisierungsbehandlung auf den oberen Oberflächen der plattenförmigen Teststücke 82 wird durchgeführt, wobei denselben Vorgängen wie in Beispiel 1 gefolgt wird, indem eine Pipette 85 verwendet wird. Eine gewisse Menge jedes Reagenzes, welches eine Probenlösung mit einer ausreichenden Konzentration oder magnetische Tägerpartikel enthält, wird auf die entsprechenden Teststücke 82 verteilt, wo die Reagenzien miteinander gemischt werden, wie in Fig. 10B gezeigt ist. Es wird hier vorgeschlagen, daß der magnetische Träger zugegeben wird, während der Magnet 84 in einem horizontalen Zustand gehalten wird, um gleichmäßig auf dem Teststück 82 aufgebracht zu werden, und dann Proben mit dem Träger auf den Teststücken 82 in Kontakt gebracht werden. Die Magnete 84 werden gleichzeitig in dieselbe Richtung gedreht. Wie in Fig. 10B gezeigt ist, werden die entsprechenden Magnete 84 mit demselben Neigungswinkel mit der flachen Platte 81 in Kontakt gebracht. Nachdem eine vorbestimmte Präzipitations reaktion auf jedem Teststück abgeschlossen ist, wird ein positives oder negatives Bild wie bei dem Präzipitationsbild, welches in Fig. 9B oder 9C gezeigt ist, gebildet. Nachdem die Präzipitationsbilder auf den entsprechenden Teststücken gebildet worden sind, werden die Magnete 84 so gedreht, daß sie parallel zu der flachen Platte 81 sind. Eine Anziehungskraft wird auf all die Partikel des magnetischen Trägers, welche die Präzipitationsbilder bilden, in einer Richtung ausgeübt, die senkrecht zu den oberen Oberflächen der Teststücke 82 ist. Die Präzipitationsbilder können für eine lange Zeitperiode stabil erhalten werden, ohne die Muster zu zerstören, selbst wenn Vibrationen oder dergleichen darauf ausgeübt werden. Nach Abschluß der optischen Messung des Präzipitationsbildes wird das Teststück 82 allein oder das ganze Mittel, einschließlich der flachen Platte 81 und des Teststückes 82, durch eine Austauschvorrichtung ausgetauscht, und die folgende Analyse wird durchgeführt. Die flache Platte 81 kann durch eine Trägervorrichtung über dem Magneten 84 gehalten werden.
Bezüglich der Aufrechterhaltung von Präzipitationsbildern nach Ablauf einer vorbestimmten Zeitperiode vom Beginn der Bildung von Präzipitationsbildern gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ist es wirkungsvoll, außerhalb des Reaktionsgefäßes einen Magneten anzuordnen, der eine Form oder Struktur aufweist, um eine magnetische Kraft, die immer senkrecht zu der Wandoberfläche ist, auf welcher ein Präzipitationsbild gebildet werden soll, auszuüben. Beispielsweise kann eine Magnetanordnung mit einer Oberfläche, auf welcher ein kompakter Magnet zur Erzeugung eines gleichmäßigen Magnetfeldes von einem N- oder S-Pol aus auf einer halbkugelförmigen inneren Oberfläche mit einem Radius, welcher größer ist als der der Halbkugel, welche die innere Wand jeder Vertiefung ausmacht, befestigt ist, verwendet werden, wenn die Wandoberfläche, auf welcher ein Präzipitationsbild gebildet werden soll, eine Innenwand einer Vertiefung mit einer halbkugelförmigen Bodenoberfläche ist. Alternativ kann, wenn die Wandoberfläche eine innere Oberfläche einer Vertiefung mit einer konischen Bodenoberfläche ist, eine Magnetanordnung verwendet werden, auf welcher ein kompakter Magnet an einer konisch eingesenkten Oberfläche mit demselben Apexwinkel auf dieselbe Weise wie oben beschrieben befestigt ist. Zusätzlich kann, wenn die Wandoberfläche eine flache Bodenoberfläche einer Vertiefung ist, ein Magnet mit einer flachen oberen Oberfläche wie oben beschrieben verwendet werden.
Ein Präzipitationsbild, welches aufrechterhalten wird, indem der Magnet mit der obigen Form oder Struktur verwendet wird, ist nicht auf das gebildete Präzipitationsbild beschränkt. Das heißt, es ist möglich, ein Präzipitationsbild während seiner Bildung zu bewahren. Das Bildungsverfahren des Präzipitationsbildes, welches in diesem Fall angewendet wird, ist nicht auf das Verfahren der vorliegenden Erfindung beschränkt, sondern kann ein herkömmliches Verfahren unter Verwendung von natürlicher Sedimentation, einer magnetischen Kraft, einer Zentrifugalkraft oder dergleichen sein.
Um ein Präzipitationsbild während seiner Bildung zu bewahren, wird ein magnetischer Träger durch natürliche Sedimentation, eine magnetische Kraft, eine Zentrifugalkraft oder dergleichen präzipitiert. Zu einem gewünschten Zeitpunkt wird ein Magnet mit der Form oder Struktur, welche passend nach der Form des Reaktionsgefäßes ausgewählt wurde, unterhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet. Zu dieser Zeit erfahren die magnetischen Trägerpartikel, welche die Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes erreichen, die magnetische Kraft senkrecht zu der Wandoberfläche und werden in den derzeitigen Positionen gehalten. Die magnetischen Trägerpartikel während der Präzipitation werden zu den nächstgelegenen Wandoberflächenstellen des Reaktionsgefäßes hin bewegt. Diese Partikel erfahren dann die magnetische Kraft senkrecht zu der Wandoberfläche und werden an den derzeitigen Positionen gehalten. Als ein Ergebnis kann das Präzipitationsbild während der Bildung fast wahrheitsgetreu als ein Ganzes bewahrt werden.
Wenn der Magnet wie oben beschrieben nach der Bildung des Präzipitationsbildes unterhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet wird, erfahren all die magnetischen Trägerpartikel, welche das Präzipitationsbild ausmachen, die magnetische Kraft senkrecht zu der Wandoberfläche, und das Präzipitationsbild wird stabilisiert.
Das Verfahren der Stabilisierung und Aufrechterhaltung des Bildes, welches oben beschrieben wird, ist am wirksamsten, wenn das Antigen oder der Antikörper wie oben beschrieben auf der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes beschichtet ist. In diesem Fall ist es möglich, das Präzipitationsbild für eine lange Zeitperiode zu stabilisieren, selbst wenn ein Magnetfeld für eine relativ kurze Zeitperiode angelegt wird.
Wenn die Stabilisierung für eine lange Zeitperiode, z.B. einen halben Tag oder mehr fortgesetzt wird, ist es bevorzugt, das Reaktionsgefäß bei einer relativ hohen Feuchtigkeit stehen zu lassen oder einen Verschluß auf der Öffnung des Reaktionsgefäßes zu befestigen, wodurch eine Verdunstung der Lösung in dem Reaktionsgefäß verhindert wird.
Gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung kann die Form des Magneten oder die Verteilung der Stärke des Magnetfeldes geeignet korrigiert werden. Da beispielsweise in einem Bereich, welcher der Kante des Magneten entspricht, leicht ein ungleichmäßiges Magnetfeld erzeugt wird, kann ein Magnet mit einer Fläche, die ausreichend größer ist als die der Bodenoberfläche des Reaktionsgefäßes verwendet werden.
Weiterhin hat in den obigen Beispielen ein horizontaler Querschnitt des Magneten eine runde Form, dieses kann aber wenn nötig ein Polygon sein. Beispielsweise kann der Magnet in Beispiel 1 (Fig. 9A), dessen Flußrichtung bezüglich der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes geneigt ist, einen fächerförmigen oder dreieckigen Querschnitt aufweisen. Unterdessen ist der zusammengesetzte Magnet mit einem vorstehenden Abschnitt an seinem oberen Ende, welcher durch ein Kombinieren einer Anzahl von zylindrischen Magneten miteinander gebildet wird, wie es in Fig. 6 gezeigt ist, für die Erfindung nicht wesentlich. Ein runder Konus oder ein polygonaler Konus, welcher an der Spitze eine konvexe oder konkave Fläche aufweist, kann hergestellt werden, indem eine Anzahl von Magnetblöcken, die jeweils einen fächerförmigen oder einen dreieckigen Querschnitt aufweisen, anstelle der Zylinder zusammengesetzt werden, wodurch sich ein Vorteil ähnlich zu den Magneten zeigt, welche in den Figuren 4 - 8 gezeigt sind.

Claims

1. Immunologisches Testverfahren, welches die folgenden Schritte umfaßt: Einbringen einer Probe und eines magnetischen Trägers, welcher eine Oberfläche aufweist, die mit einer Substanz immobilisiert ist, welche spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen oder einen Antikörper binden soll, in ein Reaktionsgefäß, Anlegen eines Magnetfeldes an das Reaktionsgefäß, um ein Präzipitationsbild auf einer Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes zu bilden, und Bestimmen nach einer Form des Präzipitationsbildes, ob das nachzuweisende Antigen oder der Antikörper in der Probe vorhanden ist,

wobei ein Magnet mit einer magnetischen Kraft, die den Träger bewegen kann, außerhalb des Reaktionsgefäßes zur Verfügung gestellt wird, so daß er der Wandoberfläche davon während oder nach einer Reaktion zwischen dem nachzuweisenden Antigen oder Antikörper und dem magnetischen Träger gegenüberliegt, und der Magnet ein Magnetfeld bildet, welches bezüglich einer Ebene senkrecht zu einer Richtung, in welcher der Träger bewegt wird, einen vorbestimmten Gradienten aufweist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Magnet außerhalb des Reaktionsgefäßes so angeordnet wird, daß der Abstand zwischen einer oberen Oberfläche des Magneten und der Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes schrittweise vergrößert wird, um eine Verteilung der Stärke des Magnetfeldes zu erzeugen.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Magnet mit einem Magnetfeldgradienten außerhalb des Reaktionsgefäßes angeordnet wird, um eine Verteilung der Stärke des Magnetfeldes zu erzeugen.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet werden soll, flach ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet werden soll, im wesentlichen senkrecht zu einer vertikalen Richtung ist.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein nicht-agglutinierter Träger auf einem Wandoberflächenbereich konzentriert wird, der einem starken Magnetfeld unterworfen ist, und ein Aggregat des Trägers auf einem Wandoberflächenbereich verteilt ist, der einem schwachen Magnetfeld unterworfen ist.

7. Verfahren gemäß Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Magnetfeld-bildende Oberfläche des Magneten eine konzentrisch runde konvexe oder konkave Oberfläche ist.

8. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Magnetflußrichtung des Magneten bezüglich der Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet wird, in einem effektiven Winkel geneigt ist.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der effektive Winkel bezüglich der Wandoberfläche 4º oder mehr, aber weniger als 50º beträgt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der effektive Winkel bezüglich der Wandoberfläche 11º oder mehr, aber weniger als 34º beträgt.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ein Oberflächenbereich einer Oberfläche, die der Wandoberfläche des Magneten gegenüberliegt, kleiner ist als ein Oberflächenbereich der Wandoberfläche, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet wird.

12. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet so angeordnet ist, daß eine Magnetflußrichtung des Magneten senkrecht zu der Wandoberfläche ist, auf welcher das Präzipitationsbild gebildet wird, um den Träger zu präzipitieren, und der Magnet bezüglich der Wandoberfläche in einem vorbestimmten Winkel geneigt ist, um ein Präzipitationsbild zu bilden.

13. Verfahren gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Probe nach der Präzipitation des Trägers in das Reaktionsgefäß zugegeben wird.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet aus einer Vielzahl von Magneten gefertigt ist, welche zusammengesetzt sind.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Magnet eine Form eines runden Konus oder eines polygonalen Konus mit einem konvexen oder einem konkaven Bereich an seiner Spitze aufweist, welcher durch ein punktsymmetrisches Zusammensetzen einer Mehrzahl von zylindrischen Blöcken oder Blöcken, die jeweils einen fächerförmigen oder dreieckigen Querschnitt aufweisen, hergestellt wird.

16. Immunologisches Testverfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Wandoberfläche des Reaktionsgefäßes mit einer Substanz immobilisiert ist, welche spezifisch an ein nachzuweisendes Antigen oder einen Antikörper binden soll, und wobei die Probe in das Reaktionsgefäß eingebracht wird, gefolgt von einem Einbringen des magnetischen Trägers in das Gefäß, direkt nachdem der Magnet außerhalb des Reaktionsgefäßes zur Verfügung gestellt wurde.