DE3925093C2 - Vorrichtung zur Trennung von an magnetischen Partikeln (Beads) gebundenem biologischem Material in einem Magnetfeld - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Vor­ richtung zur quantitativen Fraktionierung von an mag­ netischen Partikeln (Beads) gebundenem biologischem Material, wie z.B. Zellen, Organellen, Chromosomen, Viren oder dergleichen, in einem die biologischen Partikel in­ folge ihrer magnetischen Eigenschaften separierenden Magnetfeld, wobei das biologische Material einer Trenn­ kammer in einer Suspension zugeführt wird und in dieser Suspension auf einer Pufferflüssigkeit durch das Magnet­ feld strömt.

Sortierverfahren zur Trennung von Einzelkorn-Stoffge­ mischen (Mineralien, chemische Produkte, Schlacken) nach ihren magnetischen Eigenschaften gehören längst zum Stand der Technik. Da die bekannten Verfahren nach dem Grund­ prinzip eines Filters arbeiten, in dem die ausgesonderten Materialien zurückgehalten werden, werden sie auch als mag­ netische Filter bezeichnet. Durch Fortschritte im Bereich supraleitender Magnetspulen wurden neuerdings magnetische Filter entwickelt, mit denen auch Teilchen im Mikrometer- Bereich und mit entsprechend geringen magnetischen Momenten separierbar sind. Derartige Anwendungen sind bereits in Ver­ bindung mit der Reinigung von Abwässern, aber auch in Ver­ bindung mit der Separation roter Blutkörperchen aus dem restlichen Blut bekanntgeworden.

Während bei den vorgenannten Verfahren und Anwendungen die magnetischen Eigenschaften der zu sortierenden Materialien bzw. Medien an sich genutzt werden, setzt sich in der Mole­ kularbiologie und in der Medizin ein weiteres Anwendungs­ verfahren für die magnetische Sortierung durch. Hierbei werden die zu sortierenden Materialien spezifisch an mag­ netische Partikel, sogenannte magnetische Beads (das sind Kügelchen auf Latex-Basis, in die zuvor Fe₃O₄ eindiffun­ diert wurde und die mit einer spezifisch bindenden Substanz, z.B. mit Antikörpern, beschichtet sind) gebunden bzw. ange­ lagert, so daß man letztlich biologische Materialien erhält, die magnetische Eigenschaften aufweisen und somit separier­ bar sind. Auf dieser Basis können also Zellen, Chromosomen oder Biomoloküle getrennt bzw. selektiert werden, was seit Beginn der 80er Jahre verschiedentlich auch erfolgreich praktiziert wurde.

Nach dem Stand der Technik sind drei unterschiedliche Ver­ fahren zur magnetischen Sortierung an magnetische Beads angelagerten biologischen Materials bekannt.

Bei der sogenannten Reagenzglas-Methode läßt man die mag­ netischen Beads auf einem Magneten absedimentieren und pipettiert dann die ungebundenen Partikel mit dem Überstand ab. Dabei besteht jedoch die Gefahr, daß die magnetischen Beads unter dem Einfluß des Magneten sehr stark aggregieren, so daß innerhalb der Aggregate größere Mengen ungebundener und damit unspezifischer Partikel eingeschlossen werden. Darüber hinaus ist es möglich, daß die Aggregationskräfte Schädigungen des gebundenen biologischen Materials verur­ sachen.

Eine zweite Methode beruht auf der Anwendung der magnetischen Filter. Dieser besteht aus einem Solenoid-Magneten, in dessen Kern sich die mit rostfreier Stahlwolle gefüllte Filter­ kammer befindet. Die zu reinigende Suspension durchströmt die Filterkammer und die magnetischen Partikel bleiben im Stahlwollgeflecht zurück. Die Stahlwolle gewährleistet hier­ bei sehr große Feldgradienten, so daß auch Partikel mit sehr geringem magnetischem Moment festgehalten werden. Abge­ sehen davon, daß im Stahlwollgeflecht auch ungebundene Materialien eingeschlossen werden können, ist das Einsatz­ gebiet der magnetischen Filter auch deshalb stark einge­ schränkt, weil die richtige Abschätzung der Filterkapazi­ tät und die Filterreinigung selbst mit erheblichen Problemen verbunden sind.

Ein nach Art eines magnetischen Filters arbeitendes Verfahren ist beispielsweise aus der DE 36 24 626 A1 bekannt. Hierbei wird das zu trennende Material vor der Trennung zerstäubt, was im Hinblick auf biologische Materialien als untauglich zu betrachten ist. Darüber hinaus können mit dem be­ kannten Verfahren nur Partikel mit einem Durchmesser von 5 bis 50 nm separiert werden.

Die dritte sogenannte Free-Suspension-Methode arbeitet im Gegensatz zu den beiden vorgenannten mit einem homogenen Magnetfeld, dem das zu trennende Gut, das biologische Material, in Suspension ausgesetzt wird; das biologische Material bleibt dabei während des gesamten Sortiervorgangs in Suspension. Die gesamte Apparatur wirkt dabei ebenfalls als eine Art Filter, welches das magnetische Material während mehrerer Waschzyklen festhält und am Ende des Prozesses in einem separaten Spülschritt freigibt.

Den bekannten Sortier- bzw. Selektierverfahren ist gemeinsam, daß sie quasi chargenweise, also diskontinuierlich ablaufen, und daß dabei die magnetischen Partikel nur festgehalten und nicht spezifisch beeinflußt werden. Somit ist es letzt­ lich nur möglich, magnetische und unmagnetische Partikel zu trennen und die separierten Partikel am Ende des Ver­ fahrensablaufs zu isolieren; dabei besteht insbesondere die Gefahr, daß die separierten und agglomerierten magnetischen Partikel zusammenbacken und somit das biologische Material geschädigt wird.

Im Hinblick auf den allgemeinen Stand der Technik ist noch auf die DE 21 41 245 B1 zu verweisen, aus der eine Apparatur zu Elektrophorese und/oder Magnetophorese bekannt ist. Hierbei wird von einem homogenen Magnetfeld und einem senkrecht dazu wirkenden elektrischen Feld ausgegangen und die Trennung des Analysegutes erfolgt dabei ausschließlich nach der Regel der sogenannten Lorentz-Kraft, wobei als Trennparameter die elektrische Leitfähigkeit im Magnetfeld dient.

Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe be­ steht darin, eine Vorrichtung der gattungsgemäßen Art an­ zugeben, mit der ein kontinuierliches Trennverfahren ausge­ führt werden kann, und mit der die magnetischen Partikel ihrem magnetischen Moment entsprechend spezifisch abgelenkt werden. Dadurch wird letztlich auch die bei den bekannten magnetischen Trennverfahren aufgrund der Magnetisierung zu beobachtende "Kettenbildung" der magnetischen Beads und die damit verbundene Schädigung des biologischen Materials minimiert.

Diese Aufgabe wird durch die im kennzeichnenden Teil des Patentanspruchs 1 angegebenen Merkmale gelöst. Der Kern der vorliegenden Erfindung besteht mithin darin, daß das magne­ tische Material, d.h. die mit den magnetischen Beads ge­ koppelten biologischen Partikel, in Suspension einer Trenn­ kammer zugeführt werden, die ihrerseits so in einem defi­ nierten inhomogenen Magnetfeld angeordnet ist, daß die Be­ wegungsrichtung der magnetischen Partikel etwa senkrecht zur Richtung der Kraftlinien des Magnetfeldes verläuft. Die mag­ netischen Partikel werden dabei in eine laminar durch die Trennkammer fließende Pufferflüssigkeit eingeleitet und in Abhängigkeit von ihrem spezifischen magnetischen Moment, d.h. ihrer magnetophoretischen Beweglichkeit, in diesem Flüssig­ keitsstrom abgelenkt. Das magnetische Material wird dabei in Fraktionen aufgeteilt.

Grundsätzlich ist es möglich, biologische Partikel unter­ schiedlich magnetisch zu "markieren". Bei Chromosomen kann beispielsweise ein bestimmtes Chromosom mit einer, ein anderes Chromosom mit zwei Markierungsregionen zur Bindung eines oder zweier Beads versehen werden. Diese unterschied­ lich "magnetisierten" Chromosomen können dann im Magnetfeld separiert werden; insbesondere können auch agglomerierte magnetische Partikel, sogenannte Ketten, separiert werden. Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung besteht jedoch da­ rin, eine bestimmte Fraktion magnetischen biologischen Materials möglichst rein von der restlichen Suspension zu trennen.

Die besonderen Ausgestaltungen und Merkmale der vorgenannten Vorrichtung sind Gegenstand der Unteransprüche. Diese Merk­ male beziehen sich insbesondere auf den Magnetaufbau zur Realisierung des inhomogenen Magnetfeldes (Anspruch 2), auf den Aufbau der Trennkammer (Ansprüche 3 und 4), sowie auf die Anordnung und Zuordnung der Elemente zur Zu- und Ab­ führung des magnetischen Materials, der Pufferflüssigkeit und der fraktionierten Partikel.

Die Einzelheiten der Vorrichtung werden im folgenden anhand der Zeichnung näher erläutert. Diese zeigt in

Fig. 1 einen Teilschnitt durch die Trennkammer der Vorrichtung, (entsprechend der Schnittlinie I-I nach Fig. 2), und in

Fig. 2 einen Teilschnitt durch den der Trennkammer nach Fig. 1 zugeordneten Magnetaufbau (ent­ sprechend der Schnittlinie II-II gemäß Fig. 1).

In Fig. 1 ist der Prinzipaufbau der erfindungsgemäßen Vor­ richtung zur quantitativen Fraktionierung magnetischen bio­ logischen Materials dargestellt. Der hier dargestellte Auf­ bau wird vervollständigt durch den in Fig. 2 dargestellten Magnetaufbau, der - vgl. Schnittlinie I-I - auf Fig. 1 über­ tragen senkrecht zur Zeichenebene angeordnet ist. Die Prinzipdarstellung nach Fig. 2 entspricht ihrerseits einer Schnittdarstellung durch die Trennkammer - vgl. Schnitt­ linie II-II.

Das Grundelement der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Trennung biologischen Materials ist eine Trennkammer 1, die aus zwei im Abstand zueinander miteinander fixierten Platten 10, 11 aus magnetisch neutralem Werkstoff, vorzugsweise Plexiglas, besteht. Der Randbereich der miteinander ver­ bundenen Plexiglasscheiben 10, 11 ist abgedichtet, so daß zwischen diesen Plexiglasscheiben 10, 11 ein geschlossener Freiraum 13 entsteht. Die Trennkammer 1, d.h. die Plexi­ glasscheiben 10, 11 sind so angeordnet, daß der genannte Freiraum 13 senkrecht steht und eine an der Oberseite über eine Zuleitung 14 zugeführte Pufferflüssigkeit laminar zur Unterseite fließt und hier über eine Ableitung 15 ab­ gezogen werden kann. Zur Gewährleistung der laminaren Strömung der Pufferflüssigkeit im Freiraum 13 ist dessen lichte Weite entsprechend dimensioniert.

Die genannte Zuleitung 14 für die Pufferflüssigkeit ist mit einem Puffervorratsgefäß 5 verbunden, von dem aus die Pufferflüssigkeit dem Freiraum 13 zugeführt wird. Dieses Puffervorratsgefäß 5 steht auf einem höhenveränderlichen Stativ 51 , mit dem der Pegel h₂ der Pufferflüssigkeit relativ zur Position h1 einer Einleitung 40 für das magnetische Material verändert werden kann. Je nachdem, ob der Pegelstand der Pufferflüssigkeit im Puffervorratsge­ fäß 5 über oder unter der Einleitung 40 für das mag­ netische Material liegt, wird dieses angesaugt (h2 < h1) oder die Pufferflüssigkeit strömt in das Gefäß (Probenvorrats­ gefäß 4), welches das magnetische Material bereithält (h2 < h1). Durch die Höhe des Pegels h2 der Pufferflüssig­ keit wird letztlich die Ansaugmenge des biologischen Materials pro Zeiteinheit geregelt. Je tiefer sich das Puffervorrats­ gefäß 5 befindet, desto mehr Suspension mit dem biologischen Material wird angesaugt.

Das magnetische Material wird unterhalb des Zuleitungsan­ schlusses an der Trennkammer 1 bzw. am Freiraum 13 zuge­ führt. Das magnetische Material wird - wie bereits erwähnt - in einem Probenvorratsgefäß 4 , beispielsweise einem Reagenz­ glas mit etwa 1 ml Fassungsvermögen bereitgestellt, das nahe­ zu horizontal, d. h. senkrecht zur Orientierung des Frei­ raums 13, auf einer Welle steckt und über eine mit einer Antriebseinheit verbundene Kupplung 41 stetig in Drehbewegung gehalten wird. Mit Rücksicht auf die Bindungskräfte zwischen den biologischen Partikeln, also z.B. den Chromosomen und den Beads wird mit extrem geringen Fließgeschwindigkeiten der Pufferflüssigkeit (etwa 10..20 cm min^-1) und mit sehr geringen Ansaugvolumina (etwa 10..20 µl min^-1) gearbeitet. Damit lassen sich zu hohe Strömungsgeschwindigkeiten und Schädigungen des biologischen Materials vermeiden.

Das Probenvorratsgefäß 4 ist zur Vermeidung von Einflüssen durch das - noch zu beschreibende - Magnetfeld magnetisch abgeschirmt, und zwar beispielsweise durch einen Weicheisen­ block 42.

Ein weiteres wesentliches Bauteil der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung ist eine (Trenn-) Pumpe 3, die die dem Frei­ raum 13 zugeführte Pufferflüssigkeit und die das biolo­ gische Material enthaltende Suspension über die Ableitung 15 absaugt. Als Pumpe 3 wird vorzugsweise eine Schlauchpumpe eingesetzt, die das biologische Material sehr gleichmäßig und nahezu pulsationsfrei abführt und in die angekoppelten - in Fig. 2 angedeuteten spezifischen Reagenzgläser drückt. Wesentlich ist dabei, daß die Pumpe 3 die laminare Strömung im Freiraum 13 nicht stört.

Die Funktions- und Betriebsweise der in Fig. 1 dargestellten Vorrichtung ist wie folgt: über die Pumpe 3 wird aus dem Puffervorratsgefäß 5 Pufferflüssigkeit in den Freiraum 13 der Trennkammer 1 gesaugt. Dieser Pufferflüssigkeit, die laminar durch diesen Freiraum 13 fließt, wird aus dem Probenvorratsgefäß 4 die das biologische Material ent­ haltende Suspension zugeführt. Diese Suspension strömt zu­ sammen mit der Pufferflüssigkeit laminar durch den Freiraum 13, wobei infolge der senkrecht zur Zeichenebene wirkenden Kraft­ linien des Magnetfeldes die in der Suspension enthaltenen biologischen magnetischen Partikel aufgrund ihrer magnetischen Momente ablenkt und somit von unmagnetischen Partikeln, also z.B. Verunreinigungen, separiert werden.

Um ggf. die die Ablenkung der Partikel beeinflussenden ver­ schiedenen Parameter leichter aufeinander abstimmen zu können, ist eine Detektionseinrichtung vorgesehen. Diese besteht aus einem Detektionsfenster 6 in einer der Plexi­ glasscheiben 10 und einem mit diesem korrelierendem Spiegel 7 an der anderen Plexiglasscheibe 11. Damit läßt sich die durch den Freiraum 13 strömende Flüssig­ keit beobachten und auch analysieren, indem ein Lichtstrahl 81 einer Lichtquelle 8 durch das Detektionsfenster 6 und den Flüssigkeitsstrom geschickt wird. Der dann am Spiegel 7 reflektierte Lichtstrahl 82 kann dann relativ zum (Ausgangs-) Lichtstrahl 81 in einer Auswerteelektronik 83 ausge­ wertet werden. Als Meßwerte werden dabei insbesondere das Absorptions- und Streulichtverhalten der Suspension ana­ lysiert.

Die obige Beschreibung der Funktions- und Betriebsweise der Vorrichtung zur Fraktionierung von biologischem Material im Magnetfeld soll anhand von Fig. 2 weiter erläutert werden.

In Fig. 2 ist strichpunktiert die Ebene des Freiraums 13 der Trennkammer 1 angedeutet, die in der Zeichenebene liegt und als Strömungsebene der Pufferflüssigkeit und der Suspen­ sion mit dem biologischen Material zu betrachten ist. Dieser Trennkammer 1 liegt ein Magnetaufbau 2 gegenüber, der ein über die Höhe der gesamten Trennkammer 1 und damit des gesamten Freiraums 13 aufgefächertes inhomogenes Feld H erzeugt, dessen Kraftlinien nahezu senkrecht zur Bewegungsrichtung V der Pufferflüssigkeit und der Suspension, und damit der magnetischen biologischen Partikel ausgerichtet sind. Gemäß dem in Fig. 2 dargestellten Ausführungsbeispiel besteht der Magnetaufbau 2 aus einer Magnetspule 21, in die ein Eisen­ kern 22 eingeschoben ist, dem seinerseits ein Vierkant­ stahl 23 vorgesetzt ist. Dieser Vierkantstahl 23 liegt parallel zum Flüssigkeitsstrom.

Die Funktions- und Betriebsweise der Vorrichtung soll anhand von Fig. 2 nochmals erläutert werden: Die über die Zuleitung (14) zugeführte Pufferflüssigkeit wird über eine Mehrzahl von Einspeisstellen 141 in die Trennkammer 1 bzw. in den Freiraum 13 eingeleitet. Die Suspension mit dem mag­ netischen biologischen Material kann - in Strömungsrichtung v betrachtet - im Abstand von den Einspeisstellen 141 über eine Mehrzahl von Einleitungen 401 in den Freiraum 13 der Trennkammer 1 eingeleitet werden. Aufgrund der magnetischen Wechselwirkung zwischen dem magnetischen Moment der Beads einerseits und dem Magnetfeld H des Magnetaufbaus 2 anderer­ seits werden nun die magnetischen biologischen Partikel, also z.B. die Chromosomen oder Zellen aus ihrer strömungsbe­ dingten Bewegungsbahn ausgelenkt - vgl. die schräg zur Strömungsrichtung v verlaufenden strichpunktierten Be­ wegungsbahnen unterschiedlicher magnetischer Partikel. An der Unterseite der Trennkammer 1 werden die separierten Partikel fraktioniert und den andeutungsweise dargestellten Reagenzgläsern 151 zugeführt. Diese Reagenzgläser 151 ent­ halten dann aussortierte spezifische Fraktionen biologischer Partikel, wobei nicht nur unerwünschtes unspezifisches Material, sondern auch verklumptes spezifisches Material scharf separiert ist.

Mit der vorbeschriebenen Vorrichtung steht ein kontinuier­ lich arbeitendes Gerät zur Verfügung, das magnetische und unmagnetische Partikel mit Durchmessern im Bereich einiger Mikro-Meter mit hoher Effizienz trennt. Dabei müssen keine Filterkapazitäten einkalkuliert werden, und es entfällt der Aufwand der Filterreinigung mit den damit verbundenen Ver­ lusten an separiertem Rückstand. Da Waschzyklen und mehr­ maliges Umpumpen entfallen, ist mit der vorstehend erläuter­ ten Vorrichtung auch eine schonende Behandlung des biolo­ gischen Materials möglich; dieser positive Effekt wird darüberhinaus auch dadurch begünstigt, daß das separierte Material kontinuierlich entnommen werden kann.

Claims (9)

1. Vorrichtung zur quantitativen Fraktionierung von an magnetischen Partikeln (Beads) gebundenem biologischem Material, wie Zellen, Organellen, Chromosomen, Viren, in einem die biologischen Partikel infolge ihrer magnetischen Eigenschaften separierenden Magnetfeld,

• - mit einer Trennkammer (1) aus zwei im Abstand und parallel zueinander angeordneten Platten, deren umlaufender offener Randbereich abgedichtet ist,
• - mit Anschlußverbindungen zur Zuführung des biologischen Materials, der Pufferflüssigkeit und zur Entnahme der fraktionierten Partikel,

dadurch gekennzeichnet, daß das Magnetfeld (H) inhomogen realisierbar ist, und daß die aus magnetisch neutralen Platten bestehende Trennkammer (1) relativ zum Magnetfeld (H) so angeordnet ist, daß die magnetischen Kraft­ linien senkrecht zur Bewegungsrichtung (v) der biologischen Partikel in der Trennkammer (1) ver­ laufen und auf die Länge der Trennkammer aufgefächert sind.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das inhomogene Magnetfeld (H) durch einen Magnetaufbau (2) realisiert ist, der aus einer Magnetspule (21), einem eingeschobenen Eisenkern (22) und einem auf die Stirnseite der Magnetspule und des Eisenkerns aufgesetzten Vierkantstahl (23) besteht, und daß der Magnetaufbau (2) mit seiner vom Vierkant­ stahl begrenzten Seite der Trennkammer (1) gegenüberliegt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie zur Entnahme der fraktionierten Partikel vorgesehenen Anschlußverbindungen mit einer gleichmäßig und pulsationsfrei arbeitenden Trennpumpe (3), insbesondere einer Schlauchpumpe, verbunden sind.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Probenvorratsgefäß (4) zur Zuführung der Suspension in die Trennkammer der biologischen Partikel so konstruiert ist, daß es über eine mit einer Antriebseinheit verbundenen Kupplung (41) stetig in Drehbewegung gehalten wird.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Probenvorratsgefäß (4) in einer magnetischen Abschirmung, vorzugsweise einem Weicheisenblock (42), eingesetzt ist.

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Höhe des Pegels der Pufferflüssigkeit relativ zur Position des Probenvorratsgefäßes (4) veränderlich ist.

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß zur Beobachtung der Auslenkung der biolo­ gischen Partikel in der Trennkammer (1) in dieser ein Detektionsfenster (6) angeordnet ist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, mit einer aus zwei beabstandeten, magnetisch neutralen Platten, insbesondere Plexiglas­ scheiben aufgebauten Trennkammer, dadurch gekennzeichnet,
daß das Detektionsfenster in einen Durchbruch der vorderen Platte (10) eingesetzt ist,
daß an der hinteren Platte (11) lagemäßig mit dem Detektionsfenster (6) korrespondierend ein Spiegel (7) vorgesehen ist, und
daß dem Detektionsfenster (6) eine Lichtquelle (8) zugeordnet ist, deren Lichtstrahl (81) durch das Detektionsfenster und das biologische Material tritt und am Spiegel reflektiert (82) in einer Auswerteelektronik (83) analysiert wird.