WO2020260716A2 - Trägermaterial, kitsystem und verfahren für biologische assays - Google Patents

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WO2020260716A2
WO2020260716A2 PCT/EP2020/068302 EP2020068302W WO2020260716A2 WO 2020260716 A2 WO2020260716 A2 WO 2020260716A2 EP 2020068302 W EP2020068302 W EP 2020068302W WO 2020260716 A2 WO2020260716 A2 WO 2020260716A2
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    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)

Definitions

  • the present invention relates to a carrier material comprising at least one component, the component being adhesively bound to the carrier material and / or immobilized and / or dried on the carrier material.
  • the present invention relates to a carrier material comprising at least one component, the carrier material, due to its physical nature, being suitable for drying the component under laboratory conditions and thus protecting it from degradation and / or aggregation.
  • the present invention relates to a kit system comprising a reaction vessel and a carrier material according to the invention, as well as the use of a kit system according to the invention for the production of an analysis fluid for the detection of biogenic macromolecules.
  • the present invention relates to a carrier material and a kit system, and their use in a method for detecting an infection with the Sars-CoV-2 virus (English: severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2; SARS-Coronavirus 2, novel coronavirus), Sars- CoV Virus (English: severe acute respiratory syndrome Coronavirus; SARS Coronavirus) or HCov-NL63 Virus (human Coronavirus NL 63).
  • Sars-CoV-2 virus English: severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2; SARS-Coronavirus 2, novel coronavirus
  • Sars- CoV Virus English: severe acute respiratory syndrome Coronavirus; SARS Coronavirus
  • HCov-NL63 Virus human Coronavirus NL 63
  • the present invention also relates to a method for performing a bioassay.
  • the present invention further relates to a method for the detection of an immobilized analyte on a solid matrix (e.g. a membrane).
  • the present invention also relates to a method for the detection of a non-immobilized analyte (e.g. in solution).
  • polymeric substances are often used, the physical characteristic of which is that they are not as finely distributed in solutions as smaller molecules, ie are not distributed monodisperse in the solution.
  • a non-monodisperse solution made from polymeric substances, in particular from macromolecules poses a problem because, on the one hand, storage can lead to aggregation, which reduces the quantity of the substance in the solution, and on the other hand, mixing for removal can cause damage to the substance induced by shear forces which reduces the quality of the substance in the solution.
  • polymeric substances and especially macromolecules are often cost-intensive to produce and therefore particularly worth protecting, such substances are often stored in portions of small volumes or in dried form and are used in production and / or use e.g. as food supplements as well as pharmaceuticals, diagnostics or therapeutic agent and / or as a laboratory analytical agent.
  • macromolecules are often used in bioassays and in particular by immunological methods for the detection of analytes.
  • the detection of an analyte is based on the affinity of a binding partner specific for the analyte for a certain property of the analyte (e.g. epitope), for example in the context of an antibody-antigen reaction.
  • a binding partner specific for the analyte for a certain property of the analyte e.g. epitope
  • the presence of the analyte can be detected via a marker molecule that is linked to the binding partner.
  • the aim is to recognize a signal from the labeled binding partner, indirectly from the analyte, in sufficient strength.
  • the specific binding partner that binds to the analyte to be detected can also be referred to as the primary binding partner (e.g. a primary antibody, receptor, ligand, epitope).
  • the primary binding partner is characterized by a high specificity and affinity for the analyte, for example for a certain epitope of the analyte. This can also mean that no cross-reactions with similar epitopes are shown and / or are present.
  • Immunological methods including immunassays, denote a number of methods in analysis (in particular bioanalytics) for the recognition and thus for the detection of an analyte by binding the analyte to a (specific) binding partner.
  • Common immunassays include methods such as Western bot, enzyme e-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunolabeling, immunohistochemistry, slot blot and / or dot blot, but also lateral flow immunoassays.
  • the detection of an analyte is based on the affinity of a binding partner specific for the analyte for a certain property of the analyte (eg epitope), for example in the context of an antibody-antigen reaction.
  • a binding partner specific for the analyte for a certain property of the analyte (eg epitope)
  • the presence of the analyte can be made detectable.
  • the aim is to recognize a signal from the marker, indirectly from the analyte, with sufficient strength.
  • the specific binding partner that binds to the analyte to be detected can also be referred to as the primary binding partner (e.g. a primary antibody).
  • the primary binding partner is characterized by a high specificity and affinity for the analyte, for example for a certain epitope of the analyte. This can also mean that no cross-reactions with similar epitopes are shown and / or are present.
  • direct verification processes As a rule, a distinction is made between direct verification processes and indirect verification processes.
  • the analyte is brought together with a binding partner specific to the analyte (primary binding partner, e.g. primary antibody), which is directly linked to a marker.
  • primary binding partner e.g. primary antibody
  • the first step is to bring the analyte together with a first binding partner specific to the analyte (primary binding partner, e.g. primary antibody).
  • a second binding partner secondary binding partner, e.g. secondary antibody
  • the second binding partner is linked to a marker. Consequently, an analyte can be detected via the labeled second binding partner, which binds to the first binding partner, which in turn binds to the analyte.
  • Bioanalytical methods and, above all, immunological methods are usually multi-step methods in which the individual components of the detection system are supplied to a preparation which should and / or contain the analyte. For this reason, immunological methods or bioanalytical detection methods are relatively tedious and error-prone, which is why the reliability of the components used in these assays or methods is of particular importance.
  • the immunological processes described require numerous components (for example binding partners or markings), which are not infrequently temperature-sensitive.
  • a large number of the components, e.g. antibodies, at least partially, have to be stored and / or handled at temperatures lower than room temperature in order to remain stable and / or functional and / or to be protected against proteolysis (e.g. chilled on ice, in the refrigerator , at 4 ° C to 8 ° C or lower than 0 ° C, especially at -20 ° C or -80 ° C).
  • Such sensitive components include antibodies or antibody fragments, peptides, proteins, oligonucleotides, DNA probes, RNA probes, nucleic acid fragments, aptamers, anticalins, lectins, affibodies, chemical ligands, nanoparticles, enzymes (especially reporter enzymes) or dyes, in particular also Fluorescent dyes.
  • bioanalytical and / or immunological processes for which these components are required are complex, it would be desirable to present the components in a stable formulation and / or with low susceptibility to structural and / or functional damage for simple use.
  • the common bioanalytical and / or immunological methods are characterized by a long duration and a large number of process steps (for example several binding reactions, several washing steps, blocking of unspecific binding sites and / or enzymatic reactions) and do not represent any practical forms of application.
  • Integrated dry chemical test elements would make the process easier to carry out, reduce the susceptibility to errors and / or shorten the times for carrying out an immunological process.
  • the sensitive components described can be dried and, in the dried form, are protected against damage, for example by proteolysis, oxidation or hydrolysis and / or instability and / or loss of function. This means that otherwise temperature-sensitive and degradation-sensitive components can be stored in a stable manner even without cooling.
  • a simple solution to the problem would therefore be to vacuum dry sensitive components.
  • this method is problematic in that it has to be optimized separately for each component. It is critical that the medium changes when it dries, since the stabilizers are also dried in and therefore concentrated. If this is not optimized, the components can in turn lose their functionality and stability due to the drying process. Storage stability is also critical, as the formulations in highly concentrated salts and auxiliaries are hygroscopic and aggregation and degradation occur if they become damp (e.g. condensation water, humidity during sampling and storage). Components stabilized in this way therefore tend to aggregate, so that homogeneous redissolution is usually not achieved. A loss of material must be accepted, which should be avoided in particular in the case of expensive and laboriously manufactured components.
  • Carrier materials for releasing analysis fluids which contain biogenic analytical components for use in immunological methods are already known from the prior art.
  • the application and, if necessary, the drying of the components on the carrier materials enable a particularly high level of stability against degenerative influences, such as However, changes in temperature (especially increases in temperature) and changes (especially an increase) in air humidity continue to lead to the decomposition of the biogenic components.
  • changes in temperature especially increases in temperature
  • changes (especially an increase) in air humidity continue to lead to the decomposition of the biogenic components.
  • the addition of dry salt packets is required.
  • the so-called conjugate pad which is used in diagnostic immunological applications, such as lateral flow immunoassays (LFIA), comes closest to generating analysis fluids.
  • the carrier material of the conjugate pad mostly consists of glass fiber or cellulose fiber or surface-modified polymer fiber. It is usually up to 1 cm long, 0.5 cm wide and less than 0.5 mm thick. Since the main criterion for the selection of the carrier material is the low protein binding and the low retention volume of a maximum of ⁇ 50pL / cm2, the uptake of the Liquid limited to 25mI_ liquid. To avoid edge effects, mostly 10 to 15 ml conjugate, which mostly contains nanoparticle-labeled primary antibodies, is applied. The carrier materials are pretreated in order to obtain the fastest possible release of the components even with only a small amount of sample and / or analyte.
  • the conjugate pads are vacuum dried and must be kept dry to maintain the integrity of the components.
  • US4366241 B1 discloses non-chromatographic test devices and methods using such devices for the determination of members of an immunological pair (Mip).
  • the test device has an immunosorbing zone to which a mip (against diffuse movements) is attached.
  • the immunosorbing zone serves as an inlet for the sample and reagent solutions.
  • a fluid-absorbing zone which serves to draw fluid through the immunosorbent zone, store fluid and can serve to control the speed with which the liquid is drawn through the immunosorbent zone.
  • EP186799A1 discloses a solid diagnostic agent, consisting of several functional fields, which is used for the detection and quantitative determination of substances or analytes in biological fluids.
  • the invention also relates to a method using this agent, wherein after the agent comes into contact with the liquid, the analytes react with specific bioaffine binding partners and are detected with the aid of labeling reagents.
  • EP2395921 B1 discloses a device for determining the presence and / or the amount of one or more analytes in a sample of a human body fluid, further, among other things, at least one test strip with an absorbent section and with reagents for determining the presence and / or the amount one or more analytes in the sample.
  • EP1361436 A1 discloses multi-layer reagent test strips for quantifying glycated protein in a liquid sample and methods for their use. When using the test strips, a liquid sample is applied to the test strip and a signal is generated with which the content of glycosylated protein in the sample can be quantified.
  • WO2018203145A1 discloses methods for diagnosis, research and screening of chemicals in biological fluids in connection with ethylene glycol poisoning.
  • a test device for measuring glycolate / glycolic acid comprising: a test strip comprising a) an oxidase enzyme (e.g., glycolate oxidase (GOX or GAX)) that generates hydrogen peroxide while the glycolate is oxidized with atmospheric oxygen; b) a peroxidase, for example horseradish peroxidase, which is capable of oxidizing suitable substrates with the hydrogen peroxide generated; and c) a suitable substrate for the peroxidase which serves as a precursor of an indicator dye which can be read photometrically by reflex photometry or fluorimetrically in a reader specially designed for this purpose or visually.
  • an oxidase enzyme e.g., glycolate oxidase (GOX or GAX)
  • a peroxidase for example horseradish peroxidase, which is capable of oxid
  • the described in-vitro diagnostic rapid tests for low concentrations of analytes in biological samples were developed and optimized.
  • an amount of reagents that is required for the actual detection is used for the respective test strips. This is necessary because the requirement of very high flowability is limited by the size of the reagents / components (e.g. nanoparticles) and the small volume of the sample to be analyzed makes it difficult for the components / reagents to freeze out of the carrier material and / or filter.
  • This composition of the rapid tests is optimized for diagnostic use, which involves the detection of the smallest amounts of an analyte from biological samples.
  • the precisely manufactured reagents / components are usually expensive to use for the respective process, e.g. LFIA, optimized carrier material applied and dried in a vacuum.
  • the carrier materials, in particular test strips, are then built into housings that are individually made for the corresponding diagnostics and used there.
  • a carrier material comprising at least one component in an advantageous manner, in particular to the effect that greater flexibility and / or economy is achieved in use.
  • the object is achieved according to the invention by a carrier material having the features of claim 1. It is then provided that a carrier material is provided comprising at least one component, the component being adhesively bonded to the carrier material and / or immobilized and / or dried on the carrier material, characterized in that the carrier material is suitable containing a certain volume of a liquid take up a defined amount of the component and release it again in the presence of an elution fluid.
  • the invention is based on the basic idea that a component is bound to a carrier material, to the effect that the component enters into an adhesive bond to the carrier material, thus enabling easy re-release at a later point in time.
  • An amount of a component adapted for a specific application can be immobilized and / or dried on the carrier material.
  • This component which is adhesively bound and / or immobilized and / or dried to the carrier material, can be stored and / or transported in a stable manner without structural and / or functional damage.
  • the drying of the component on the carrier material can provide a particularly high level of stability against degenerative influences, such as Temperature change, freezing, heat, humidity and biological decomposition can be achieved.
  • the component is made possible for the component to be released again from the carrier material in the form of a homogeneous solution at a desired point in time by an elution fluid.
  • an elution fluid no relevant loss of function and / or structure and / or the quantity of the component has to be accepted, which is advantageous in particular in the case of expensive and laboriously manufactured components which are used for expensive and complex processes.
  • the invention also takes into account the special requirements in general immunological, non-diagnostic use. A particular flexibility in the application is required here, since the researchers frequently have to detect changing analytes.
  • the described invention provides, in particular, for sensitive components to be dried in a careful manner by introducing them onto the carrier material in appropriate portions.
  • the components are protected against damage, e.g. by proteolysis, oxidation or hydrolysis and / or instability and / or loss of function, are easy to solubilize and are not subject to storage instability under ambient conditions, as the carrier material also protects them sufficiently from the influence of the Humidity protects.
  • damage e.g. by proteolysis, oxidation or hydrolysis and / or instability and / or loss of function
  • the carrier material also protects them sufficiently from the influence of the Humidity protects.
  • otherwise temperature-sensitive and also degradation-sensitive polymeric substances can be stored in a stable manner even without cooling.
  • the field of application of the invention includes, in particular, the production of stable, storable substances that are sensitive to degradation and aggregation, such as biogenic and abiogenic macromolecules and / or polymers.
  • Biogenic macromolecules can include recombinant proteins, for example.
  • a “molecule” refers to a particle that consists of two or more atoms that are connected by covalent bonds.
  • a “macromolecule” denotes that consist of many (up to several hundred thousand) identical or different building blocks (atoms or groups of atoms) and thus have a relatively large molecular mass (over 1000 Da; or over 1000 g / mol).
  • the term macromolecules includes proteins, peptides, polymers, colloids, proteins and nucleic acids.
  • the term macromolecule can also include glycoproteins.
  • a “macromolecule” can also, at least partially, include viruses, bacteria, fungi or prions.
  • a “macromolecule” can also include molecules with a mass of over 100 Da or over 100g / mol.
  • a “polymer” refers to a chemical compound that consists of chain or branched molecules that consist of identical or similar units (called monomers).
  • a polymer includes macromolecules, chemical compounds, salts, and metals.
  • a “substance” denotes matter of regular nature, which is defined by the elementary units of which it is composed. These elementary units can be atoms, molecules or formula units (for example in the case of salts). Substances are characterized by their physical properties, such as density, melting point, electrical conductivity, etc.
  • biogenic refers to substances that are derived from or caused by biological systems.
  • abiogenic refers to substances that are not derived from or caused by biological systems. In particular, the term describes artificially or synthetically produced substances.
  • Nanoparticle or “nanoparticle” describes a composite of a few to a few thousand atoms or molecules, the size of which is typically 1 to 100 nanometers, but can also be expanded to 1000 nanometers if necessary. Nanoparticles can be produced naturally (e.g. volcanic eruptions or forest fires), as well as through anthropogenic (man-made) influences (e.g. car and industrial emissions) or synthetically.
  • Bioassays refer to a number of methods in analysis (especially bioanalytics) for recognizing and thus detecting an analyte by binding the analyte to a (specific) binding partner.
  • bioassays include immunological methods such as western bot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunolabeling, immunohistochemistry, slot blot and / or dot blot, but also lateral flow immunoassays.
  • immunological methods such as western bot, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), radioimmunoassay (RIA), immunolabeling, immunohistochemistry, slot blot and / or dot blot, but also lateral flow immunoassays.
  • a “component” in the sense of the present invention relates to a substance that can be a molecule and / or a macromolecule and / or a polymer. .
  • an “analyte” within the meaning of the present invention relates to a molecule that can be detected via the binding of a binding partner to a binding site of the analyte.
  • An analyte can comprise a protein, the binding site being a part of the protein to which the binding partner selectively binds.
  • the analyte can be a single peptide and / or polypeptide, but also a complex of different polypeptides.
  • the analyte can also be a unit that contains or carries proteins or peptides.
  • the analyte can be a bacterium or virus.
  • the analyte comprises an antibody and / or fragment of an antibody and / or an epitope of an antibody. It is also conceivable that the analyte comprises one or more carbohydrates, lipids, DNA, RNA, complex organic molecules such as enzyme inhibitors, receptor binders, hormones and / or pharmaceutical compounds and / or compounds made from one or more substances.
  • an “elution fluid” within the meaning of the present invention refers to a fluid in which a substance can be dissolved.
  • an elution fluid can be a liquid.
  • an elution fluid can be a solution.
  • a solution can be a polar or non-polar solvent.
  • the solution can be a buffer solution.
  • the buffer solution can be a buffer solution common in the laboratory, for example a phosphate-buffered saline (PBS) or a Tris-buffered saline (TBS).
  • the solution can be a clear solution.
  • the buffer solution can also include citrate, 2-ethanesulfonic acid (HEPES), 3- (N-morpholino) propanesulfonic acid (MOPS), 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) or one or more amino acids.
  • Further stabilizing substances and / or substances which promote the release of the component can be added to the elution fluid.
  • proteins such as e.g. Serum albumin or milk powder, carbohydrates, e.g. Sugar, amino acids, surfactants or wetting agents, e.g. Polysorbates and / or polyethylene glycol derivatives or also auxiliaries, such as e.g. Polyvinylpyrrolidone or complexing agents, e.g. Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) may be added.
  • the at least one component comprises a combination of at least one first substance and at least one second substance.
  • This can have the effect that properties, in particular different properties, of at least two substances, in particular at least two different substances, are present combined with one another.
  • Provision can be made for a component according to the invention to have the ability of a first substance to bind to an analyte and the ability of a second substance to give a detectable signal.
  • the combination of the at least two substances with the same property can achieve a stronger expression of the property of the component compared to the expression of the property of the first substance and / or the second substance alone will.
  • the component can also comprise a hybrid of a primary antibody and a secondary antibody.
  • the first substance comprises a specific binding partner of an analyte, the binding partner at least one monoclonal antibody, polyclonal antibody, affinity-purified antibody, antibody fragment, peptide, protein, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin, lectin, affibody and / or chemical Comprises ligand and wherein the second substance comprises a marker, the marker at least one dye, fluorochrome, fluorophore, luminophore, enzyme, peptide, biotin, oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide, nanoparticle, in particular gold nanoparticle, includes fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • the component can combine the ability of a first substance to bind to an analyte and the ability of a second substance to give a detectable signal.
  • a connection of a specific binding partner of an analyte with a nanoparticle, for example a gold nanoparticle can have the advantage of being detectable with the naked eye.
  • the fluorophore and / or fluorochrome can, for example, be a fluorescein, a fluorescein derivative, fluorescein isothiocyanate (FITC), 5 (6) -Tetramethylrhodamine isothiocyanate ((5 (6) -TRITC), rhodamine Texas Red, green fluorescing protein (GFP), yellow fluorescent Protein (yellow fluorescent protein, YFP), red fluorescent protein (RFP) and / or any other fluorophore and / or fluorochrome.
  • a fluorophore and / or fluorochrome can also be a redox-dependent protein, e.g. a roGFP, rxYFT and / or HyPer
  • the flash tag can also be used as a fluorescent protein tag.
  • the enzyme can be a reporter enzyme such as a peroxidase (e.g. a horseradish peroxidase) or an alkaline phosphatase. If an enzyme is used as a marker, the enzyme can catalyze a coloring or chemiluminescence reaction (enhanced chemoluminescence, ECL).
  • a peroxidase e.g. a horseradish peroxidase
  • alkaline phosphatase e.g. a horseradish peroxidase
  • ECL enhanced chemoluminescence
  • a peroxidase can usually be offered hydrogen peroxide as a substrate.
  • the released protons oxidize a chromogenic substrate to its colored end product with the formation of water.
  • the chromogenic substrate can be, for example, 2,2'-azino-di (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid (ABTS), 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC), 4-chloro-1-naphthol (CN), 3,3 '-Diaminobenzidine (DAB), luminol and other dextrans, tetramethylbenzidine (TMB) and / or other chromogenic substrates.
  • An alkaline phosphatase can usually be offered organic phosphate compounds as a substrate.
  • the alkaline phosphatase splits off phosphate and the released compound reacts to a colored end product.
  • the substrate can, for example, 5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate (BCIP) in conjunction with nitro blue tetrazolium chloride (NBT), tetrazolium salt with indoxyl, naphthol-AS-MX-phosphate, naphthol AS with Fast Red TR, Neufuchsin and / or another substrate.
  • BCIP 5-bromo-4-chloro-3-indoxylphosphate
  • NBT nitro blue tetrazolium chloride
  • tetrazolium salt with indoxyl naphthol-AS-MX-phosphate
  • naphthol AS with Fast Red TR Neufuchsin and / or another substrate.
  • Common detection methods and / or detection systems include, inter alia, phosphoimagers, X-ray films, CCD cameras and / or fluorescence detector systems.
  • the radioactive isotope can be, for example, 131 iodine, 32 phosphorus 3 tritium and / or another radioactive isotope.
  • a nanoparticle has a size of about 1-200 nm.
  • the nanoparticle can also have a size ⁇ 1 nm.
  • the nanoparticle can be a metallic nanoparticle, in particular a gold nanoparticle.
  • gold nanoparticles are colloidal gold nanoparticles.
  • a nanoparticle has a size of 2 to 70 nm in diameter, in particular 8-60 nm in diameter.
  • a nanoparticle has a size of 2 to 14 nm in diameter, in particular 4-12 nm in diameter, in particular 8 nm to 10 nm in diameter. It is also conceivable that the nanoparticles are or include magnetic nanoparticles, particularly superparamagnetic nanoparticles and / or silica spheres filled with dyes, fluorescent nanoparticles, particularly quantum dots and / or quantum rods and / or nanoparticles containing rare earths.
  • nanoparticles comprise substances that are present as a unit in polymer micelles and / or encased, for example, in acrylate, surfmer, dendrimer and / or polymer, if these directly or indirectly bound allow the solubilization and attachment of a component within the meaning of this document .
  • the at least one component has at least one monoclonal antibody, polyclonal antibody, affinity-purified antibody, antibody fragment, peptide, protein, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin, lectin, affibody, chemical ligand, dye, fluorochrome, fluorophore, luminophore, enzyme , Peptide, biotin, Oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide, nanoparticles, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • a carrier material comprising at least one component, the component being adhesively bonded to the carrier material and / or immobilized and / or dried on the carrier material, characterized in that the carrier material is suitable for a certain volume of a liquid containing a defined amount of Taking up the component and releasing it again in the presence of an elution fluid, the component comprising a compound of recombinant angiotensin converting enzyme 2 and a marker molecule, preferably the marker molecule comprising at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • the combination (component) of at least one first substance (recombinant ACE2) and at least one second substance (marker molecule) can bring about properties, in particular different properties, of at least two substances, in particular at least two different substances, combined with one another. Provision can be made for a component according to the invention to have the ability of a first substance to bind to an analyte and the ability of a second substance to give a detectable signal.
  • the first substance prefferably or additionally comprise only part of the angiotensin-converting enzyme 2, for example the receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2.
  • the component prefferably includes a marker molecule and one or more units (molecules) of the angiotensin-converting enzyme 2.
  • the component comprises more than one marker molecule and one or more units (molecules) of the angiotensin-converting enzyme 2.
  • the carrier material comprises at least one porous material, in particular a fiber fabric made of cellulose, glass fiber, polymer fiber, nylon, silk, wool, felt and / or cotton linter and / or a sponge. Due to the porous nature of the carrier material, the carrier material is suitable for absorbing and / or storing liquids.
  • a sponge can be a synthetic and / or natural sponge.
  • the carrier material can be made from any synthetic and / or non-synthetic material and / or any synthetic or non-synthetic material combination.
  • the carrier material can be a combination of several fabrics and / or materials and / or substances.
  • the carrier material can be made up of carbohydrates.
  • the carrier material comprises at least one porous material and is soluble in an elution fluid.
  • a carrier material which is soluble in an elution fluid it can be avoided that after the component has been released into the elution fluid, there may be unwanted interfering carrier material in the elution fluid. In particular, it can also be avoided in this way that a loss of elution fluid has to be recorded, because a volume fraction of the elution fluid is bound in the carrier material.
  • the carrier material is a sugar, protein and / or polymer or a mixture of these or similar water-soluble materials.
  • the carrier material is a releasable tablet.
  • the carrier material has a thickness greater than 0.1 mm and a diameter of 0.5 cm to 5 cm, in particular 1 cm to 5 cm.
  • the carrier material has a largely round shape.
  • the carrier material prefferably has a circular shape.
  • a round shape of the carrier material enables the carrier material to be precisely fitted into a round reaction vessel. It is possible that the carrier material was punched out and / or cut out from a blank.
  • the carrier material has a binding volume of up to 20 ml.
  • a binding volume of up to 20 ml can ensure that a sufficient, defined amount of a component is absorbed even with low-concentration liquids.
  • the present invention also relates to a kit system.
  • kit system includes:
  • reaction vessel which is suitable for receiving a fluid
  • a carrier material wherein the carrier material comprises at least one component, characterized in that the carrier material is suitable to take up a certain volume of a liquid containing a defined amount of the component and to release it again in the presence of an elution fluid, and wherein the carrier material is introduced into the otherwise empty reaction vessel is.
  • the component can comprise a compound of recombinant angiotensin-converting enzyme 2 and a marker molecule, wherein the marker molecule preferably comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • a kit system according to the invention enables an experiment, for example a bioassay, to be carried out quickly and easily.
  • a kit system according to the invention allows a user to apply precisely defined, standardized conditions when using the kit system, so that experiments and / or test series carried out with the kit system and their results can be directly compared with one another.
  • a reaction vessel can generally be any form of container.
  • the reaction vessel is a tube.
  • the reaction vessel can be designed to measure any conceivable volume (e.g. 10OmI, 200mI, 1.0 ml, 1.5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500mL, 1 L). It is generally possible that a level indicator (eg in ml) is attached to the reaction vessel. This enables the volumes of liquids, for example an elution fluid, introduced into the reaction vessel to be read off directly.
  • a level indicator e.g in ml
  • the component is adhesively bonded to the carrier material and / or immobilized and / or dried on the carrier material.
  • reaction vessel can be closed in an almost airtight manner, in particular with a lid.
  • the lid can be, for example, a screw cap, a click cap, a capsule, a stopper, a disk and / or a film.
  • An almost airtight seal of the sealable reaction vessel enables the carrier material (and / or the component) to be stabilized, in particular against all types of contamination, e.g. microbial contamination (s), e.g. by bacteria and / or fungi.
  • the almost airtight closure of the reaction vessel enables the carrier material to be stabilized against environmental influences, e.g. high and / or fluctuating humidity.
  • An almost airtight closure of the closable reaction vessel can also enable protective gases to be kept in the reaction vessel, which also enables the carrier material (and / or the component) to be stabilized.
  • reaction vessel can be resealable.
  • the carrier material is attached in the lid of the reaction vessel.
  • the introduction of the carrier material into the lid of the reaction vessel enables simple handling of the reaction vessel itself; for example, it can be made possible that a volume of a liquid located in the reaction vessel can be correctly read off with the aid of a level indicator located on the reaction vessel, without the apparent volume of the liquid is falsified by a carrier material floating freely in the liquid.
  • the carrier material is clamped and / or clicked into the lid of the reaction vessel.
  • the kit system can be used for the production of a protein solution, in particular for the detection of binding of an analyte to a protein, the protein being located in the protein solution.
  • the protein can in particular comprise an antibody, a receptor, an enzyme, a receptor-binding domain or a receptor-binding motif.
  • the analyte comprises a protein, a virus, a virus particle, a viral protein, a bacterium, a bacterial protein or the like.
  • the carrier material and / or kit system according to the invention can be used in a method for detecting an infection with the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • the invention further relates to the use of a carrier material and / or kit system according to the invention in a method for detecting an analyte at least partially by means of a specific binding of the analyte to the recombinant angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • an “analyte” within the meaning of the present invention relates to a molecule that can be detected via the binding of a binding partner to a binding site of the analyte.
  • the analyte comprises an antibody and / or fragment of an antibody and / or an epitope of an antibody.
  • the analyte comprises one or more carbohydrates, lipids, DNA, RNA, complex organic molecules such as enzyme inhibitors, receptor binders, hormones and / or pharmaceutical compounds and / or compounds made from one or more substances.
  • An analyte can comprise a protein, with a binding site present as part of the protein to which the binding partner (ACE2) selectively binds (in other words: the analyte can selectively bind to its binding partner (ACE2) at the binding site).
  • ACE2 binding partner
  • An analyte can comprise a protein, in particular the analyte can be a single peptide and / or polypeptide, but also a complex of different polypeptides.
  • an analyte can also comprise bacterial or viral proteins, for example Surface proteins, for example spike proteins or spike protein trimers.
  • a spike protein trimer can also be understood as a spike protein.
  • a protein can also comprise one or more glycoproteins.
  • the invention accordingly has the advantage that pathogens, in particular viruses or bacteria, can be detected by means of their surface proteins. Both the pathogen itself and the surface proteins can be referred to as analytes.
  • the analyte comprises at least one viral spike protein of the Sars-CoV- 2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus, the at least one viral spike protein to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) binds.
  • the at least one viral spike protein binds to the receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2.
  • the at least one viral spike protein comprises a spike protein trimer of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus, the spike protein trimer being linked to the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2) binds.
  • the spike protein timer binds to the receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2.
  • the invention further comprises the use of a carrier material according to the invention or a kit system according to the invention for detecting an infection with the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • the detection of an infection with the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus does not have to be bound to a carrier material or kit system, but can also be made independently of the carrier material or kit system described.
  • the invention comprises the use of at least one component in a method for the detection of an infection with the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HGov-NL.63 virus, at least partially by means of a specific binding of an analyte to recombinant angiotensin converting enzyme 2, the component comprising a compound of recombinant angiotensin-converting enzyme 2 and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot and wherein the analyte comprises at least one comprises viral spike protein of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus, wherein the viral spike protein binds to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • a nanoparticle has a size of 2 to 14 nm in diameter, in particular 4-12 nm in diameter, in particular 8 nm to 10 nm in diameter; as a result, the size of the marker molecule is smaller or at most equal to the distance between the individual spike proteins on the surface of the virus.
  • the invention is not limited to the detection of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • the invention comprises the use of at least one component in a method for the detection of a pathogen, at least partially by means of a specific binding of an analyte to a binding partner, wherein the component comprises a compound of at least one binding partner and a marker molecule, preferably the marker molecule at least one Comprises nanoparticles, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot, the analyte being arranged in multiple numbers with essentially the same spacing on the surface of the pathogen, the size of the marker molecule so depending on the distance between the individual
  • the analyte is adapted to the multiple number of the analyte so that the analyte can bind to the binding partner. This is made possible in particular if the size of the marker molecule is smaller or at most equal to the distance between the individual an
  • the pathogen can generally include a bacterium, virus, fungus, mold or prion, among others.
  • One advantage of the invention is that a pathogen can be detected via the morphology of the analyte, in particular also via the distance between individual analytes of a multiple number of analytes on the surface of a pathogen and the size of the marker molecule. This is explicitly explained below using the example of the SARS-CoV2 virus (Analyt):
  • SARS-Cov2 belongs to the coronavirus family, the virions of which have characteristic particles of 80-160 nm in size with a crown of multiple, approximately 20 nm long petal-shaped prongs.
  • the spikes are formed by spike protein trimers that have the receptor binding site for cell uptake at their outer end. Because of the comparatively homogeneous Distribution, an average distance of about 14 nm between the receptor binding sites of the individual spike trimers can be assumed (Neuman et al., Supramolecular Architecture of Severe Acute Respiratory Syncrome Coronavirus Revealed by Electron Cryomicroscopy, Journal of Virology, 2006).
  • the receptor binding site of the SARS corona viruses (including Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus) is specific for the angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • the invention can use the characteristics of the virus in order to bind suitable molecular probes specifically to the surface of the virus and thereby modify the properties of the probe in such a way that specific detection is made possible.
  • suitable probes for the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus are nanoparticles, e.g. Gold nanoparticles of suitable size (in particular 2 to 14 nm in diameter, in particular 4-12 nm in diameter, in particular 8 nm to 10 nm), which are decorated with ACE2 molecules (in particular recombinant ACE2 molecules). Due to their size, the probes arrange themselves in the spaces between the spike protein trimers and form an outer layer.
  • the detection can be carried out on the analyte in solution (e.g. after the component has been released from the carrier material).
  • the dissolved analyte can, for example, be introduced via a swab, taken from a rinse or obtained from the breath aerosol.
  • the latter is particularly advantageous, since the sample can also be taken from otherwise rather unwilling test persons, such as Children or seriously ill, mentally handicapped or unconscious people can be performed easily.
  • a direct use of e.g. Artificially generated aerosol during ventilation is also conceivable.
  • the sampling can therefore be carried out by introducing exhalations into an analysis liquid.
  • the use of blood is also generally possible.
  • the detection of Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus does not take place via a specific antibody, as is customary in the prior art, which examines the identity of the virus compared to related viruses, but via the recombinantly produced target molecule (receptor, ACE2) of the virus.
  • recombinantly produced target molecule receptor, ACE2
  • the use of the natural target protein is advantageous because the virus cannot escape detection through mutation. If the virus mutates in such a way that it can no longer bind to the receptor, it can no longer cause the serious illness. Thus, this approach reduces the risk of developing an inefficient detection due to the mutation potential of the virus.
  • a particular advantage of the invention lies in the possible use of aerosols or the exhaled flow. Since virtually unlimited samples can be obtained here, the detection limit can be shifted almost as desired and a risk assessment can be made based on the exhalation volume required until detection.
  • Sample pooling to further reduce the material is also possible in order to group such as School classes or other groups, such as aircraft passengers, work teams, play groups, etc. to test without delay before they come into spatial proximity.
  • a carrier material, kit system and / or method according to the invention thus enables a simple and inexpensive identification of potential spreaders of a SARS-CoV, SARS-CoV2 or HCov-NL63 infection.
  • the present invention avoids disadvantages of previously known methods for the detection of SARS-CoV2:
  • SARS-CoV2 SARS-CoV or HCov-NL63 enables reliable detection of a corresponding one Infection even before the onset of disease-related symptoms (in contrast to the detection of an antibody reaction against the viruses mentioned, which can only be measured a few days after the infection).
  • SARS-CoV2 in particular, however, the likelihood of infection is highest even before the first symptoms appear.
  • a carrier material comprising at least one component, the component being adhesively bonded to the carrier material and / or immobilized and / or dried on the carrier material, characterized in that the carrier material is suitable for a certain volume of a Liquid containing a defined amount of the component to be taken up and released again in the presence of an elution fluid, the component being a compound of at least one spike protein and / or one spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov -NL63 virus and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticle, fluorescent nanoparticle, magnetic nanoparticle and / or quantum dot.
  • a corresponding kit system is also conceivable.
  • At least one component in a method for screening antibodies against the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus, the component being a compound of at least one spike protein and / or one spike -Protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov- NL63 virus and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • an antibody can be conceivable as the analyte, a suitable antibody specifically binding the antibodies to at least one spike protein and / or one spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL.63 virus . This enables the virus to be neutralized.
  • An unsuitable antibody does not bind or binds poorly to the at least one spike protein and / or the at least one spike protein receptor binding site.
  • the method makes it possible to differentiate between specific and unspecific antibodies.
  • the antibody should specifically bind to the S1 subunit of SARS-CoV2 (Val16-Arg685).
  • the component can comprise the S1 subunit of SARS-CoV2 (Val 16-Arg 685) (as a receptor-binding domain) and a marker molecule, for example a gold nanoparticle.
  • the antibody should specifically bind to the receptor binding site (RBD) of the SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (RBD) (YP 009724390.1) (Arg319-Phe541).
  • the component can comprise the PBD of the S1 subunit of SARS-CoV2 (Arg319-Phe541) and a marker molecule, for example a gold nanoparticle.
  • the use of at least one component in a method for screening cells to check the expression of membrane-bound or secreted angiotensin-converting enzyme 2 or of the receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2 is conceivable, the component being a compound of at least one spike Protein and / or a spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • Membrane-based and / or secreted angiotensin-converting enzyme 2 can be conceivable as the analyte (different cells or cell lines), with a spike protein and / or a spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov - NL63 virus binds the membrane-bound and / or secreted angiotensin-converting enzyme 2 or the corresponding receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2. This enables the virus to be neutralized.
  • the component being a compound of at least one spike protein and / or one spike protein receptor binding site of Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticle, fluorescent nanoparticle, magnetic nanoparticle and / or quantum dot.
  • the component can also include:
  • Diameter in particular 100 nm diameter
  • PS protein A modified polystyrene
  • Poly-Histidine-Tag on gold nanoparticles in particular 20-500 nm in diameter, in particular 100 nm in diameter.
  • a tag is to be understood as an attachment and / or a mouse Fc as an Fc fragment (antibody fragment that is formed by cleavage of immunoglobulin G, the Fc fragment contains the receptor-binding domain) from the mouse species.
  • the use of at least one component in a method for the treatment of infectious diseases which are triggered by the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL.63 virus is conceivable, the component being a compound of angiotensin- converting enzyme 2 or the receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2, in particular recombinant angiotensin-converting enzyme 2 or recombinant receptor-binding motif of the angiotensin-converting enzyme 2, and a marker molecule, preferably wherein the marker molecule comprises at least one nanoparticle of size 1-14 nm, in particular 4-12 nm, in particular 8-10 nm.
  • Soluble human ACE2 is being tested for therapeutic use. Since ACE2 is a hormone in the renin-angiotensin-aldosterone system, high dosages as therapeutically required can be risky. It is state of the art that drugs bound to nanoparticles can be administered in lower doses, since their blood circulation time is extended in this way. For this purpose, mostly nanoparticles in the 30 to 50 nm range are examined. However, these would lead to virus-mediated agglomeration here and thus to thrombosis.
  • small nanoparticles size 1-14 nm, in particular 4-12 nm, in particular 8-10 nm
  • Using the small nanoparticles would avoid agglomeration and at the same time inactivate the viruses.
  • the present invention also relates to the use of a kit system according to one of claims 1 1 -14 for the production of an analysis fluid for a bioassay.
  • the use of a kit system according to the invention for the production of an analysis fluid for a bioassay, such as an antibody solution for an immunassay, for example, has the advantage that assays can be carried out in the least possible time. In particular, this can be explained by the omission and / or shortening of the blocking and / or incubation and / or washing steps that are usually carried out.
  • kits system for the production of an analysis fluid, such as an antibody solution for an immunassay, for example a Western blot, dot blot, slot blot, ELISA, radioimmunassay, immunolabelling and / or immunohistochemistry
  • an analysis fluid such as an antibody solution for an immunassay, for example a Western blot, dot blot, slot blot, ELISA, radioimmunassay, immunolabelling and / or immunohistochemistry
  • the present invention also relates to a method for detecting an immobilized analyte on a membrane and / or other suitable surface, for example the surface of an ELISA plate.
  • the method can include at least the following steps:
  • the method comprises one or both of the following further steps:
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane comprises fewer method steps than methods carried out according to the prior art.
  • the method according to the invention in comparison to the method carried out according to the prior art, no washing and / or blocking steps are required, which has the advantage of saving time.
  • the process steps of the method are reduced, since the successive incubation of primary and secondary antibodies, as is used in indirect assays, is not required.
  • the drying of the carrier material stabilizes the component adhesively bonded to the carrier material, which leads to a lower susceptibility to errors in the method according to the invention compared to the methods carried out according to the prior art.
  • simple handling of the component is possible during the process, since the component is present in appropriate portions and stabilized and does not have to be carried out on ice and / or in a cooling system as is customary.
  • the method according to the invention enables direct detection of the binding of the specific binding partner of the analyte. In the usual methods, complex and / or expensive detection methods and / or detection systems are usually necessary (including phosphoimagers, X-ray films, CCD cameras and / or fluorescence detector systems).
  • the carrier material and / or kit system and / or method according to the invention can generally be used for bioassays and especially for direct and indirect immunassays and / or non-competitive immunassays or competitive immunassays.
  • Possible areas of application of the carrier material and / or kit system and / or method according to the invention include, for example, diagnostics and / or analysis in the life sciences (biology, medicine, biomedicine, pharmacy, biochemistry, chemistry, molecular biology, biophysics, bioinformatics, human biology, forensics, agricultural science, agricultural technology) , Nutritional science, food research, etc.). Further details and advantages of the invention will now be explained in more detail with the aid of one of the exemplary embodiments shown in the drawings.
  • Fig. 2 a schematic representation of a first embodiment of the
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a first exemplary embodiment of a kit system according to the invention comprising a carrier material according to the invention according to FIG. 1;
  • FIG. 4 a schematic representation of a first exemplary embodiment of the positioning according to the invention of an antibody solution for an immunassay using the kit system according to the invention according to FIG. 3.
  • FIG. 6 a schematic representation of an exemplary embodiment of a method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane
  • FIG. 1 1 a schematic representation of a further exemplary embodiment of a carrier material according to the invention.
  • Fig. 1 shows a schematic representation of a first embodiment of a carrier material T according to the invention.
  • the carrier material T is a porous material.
  • the carrier material T is a fiber fabric.
  • the carrier material T is made of cotton linter.
  • the carrier material T can comprise cellulose, glass fibers, polymer fibers, nylon, silk, wool, felt and / or a sponge.
  • the carrier material T can generally comprise at least one porous material, in particular a fiber fabric made of cellulose, glass fiber, polymer fiber, nylon, silk, wool, felt and / or cotton linter and / or the one sponge.
  • the carrier material T may comprise several porous materials.
  • the carrier material can be a combination of several fabrics and / or materials and / or substances.
  • the carrier material can be made up of carbohydrates.
  • the carrier material comprises at least one porous material and is soluble in an elution fluid. It is especially conceivable that the carrier material is a sugar, protein and / or polymer or a mixture of these or similar water-soluble materials.
  • the carrier material is a releasable tablet.
  • the carrier material T has a largely round shape.
  • the carrier material T can be in any other conceivable form.
  • the carrier material T can be brought into any other conceivable shape.
  • the carrier material T has a thickness of 0.75 mm.
  • the carrier material T has a diameter of 13 mm.
  • the carrier material T it is generally possible for the carrier material T to have a thickness greater than 0.1 mm.
  • the carrier material T it is generally possible for the carrier material T to have a diameter of 0.5 cm to 5 cm, in particular 1 cm to 5 cm.
  • the carrier material T has a binding volume of 0.1 ml 0.5 ml.
  • the carrier material T it is generally possible for the carrier material T to have a binding volume of up to 20 ml.
  • the carrier material T can alternatively comprise at least one porous material and can be soluble in an elution fluid.
  • the carrier material T is suitable to take up a certain volume of a liquid containing a defined amount of the component K and to release it again in the presence of an elution fluid.
  • the carrier material T comprises a component K.
  • the component K is adhesively bonded to the carrier material T.
  • the component K can be immobilized on the carrier material T and / or dried.
  • a component K it is possible for a component K to be adhesively bonded to the carrier material T and / or immobilized on the carrier material T and / or dried.
  • the component K comprises a combination of a first substance and a second substance.
  • the component K can comprise a combination of at least one first substance and at least one second substance.
  • the carrier material T can also comprise more than one component K, wherein the more than one component K can be adhesively bonded to the carrier material T and / or immobilized on the carrier material T and / or dried.
  • the first substance of component K is a binding partner for an analyte.
  • the first substance of component K is a specific binding partner for an analyte.
  • the specific binding partner for the analyte is an antibody.
  • the specific binding partner for the analyte is a polyclonal antibody.
  • the specific binding partner for the analyte is a polyclonal secondary antibody against analyte-specific primary antibodies generated in mice.
  • the second substance is a marker molecule N.
  • the marker molecule N is a nanoparticle.
  • the nanoparticle is a gold nanoparticle.
  • the first substance of the component comprises a specific binding partner of an analyte, the binding partner at least one monoclonal antibody, polyclonal antibody, affinity-purified antibody, antibody fragment, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin , Lectin, affibody and / or chemical ligand, and wherein the second substance comprises a marker, the marker at least one dye, fluorochrome, fluorophore, luminophore, enzyme, peptide, biotin, oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide , Nanoparticles, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • the at least one component K does not have to be a combination of at least one first substance and at least one second substance.
  • the at least one component K has at least one monoclonal antibody, polyclonal antibody, affinity-purified antibody, antibody fragment, nanobody, nucleic acid fragment, aptamer, anticalin, lectin, affibody, chemical ligand, dye, fluorochrome, fluorophore, luminophore, Enzyme, peptide, biotin, oligonucleotide, protein tag, radioactive isotope, non-radioactive nuclide, nanoparticles, in particular gold nanoparticles, fluorescent nanoparticles, magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • Fig. 2 shows a schematic representation of a first embodiment of the lowering position of a carrier material T according to the invention.
  • the lowering position of a carrier material T according to the invention comprises steps S1 -S4.
  • the setting of a carrier material T according to the invention comprises a smaller number of steps than steps S1-S4.
  • the carrier material T is pretreated in a first step S1.
  • the pretreatment creates an environment that stabilizes the components, especially during the drying process, but also during storage.
  • the carrier material T is pretreated with a solution.
  • the carrier material T is pretreated with a buffer.
  • the carrier material T is incubated in a buffer.
  • the carrier material T pretreated with any form of fluid.
  • the carrier material T pretreated with any form of fluid which contains proteins or peptides.
  • the carrier material T pretreated with a fluid which contains additives.
  • the carrier material T pretreated with a plurality of fluids.
  • the additives carbohydrates especially sugar, especially sucrose and / or trehalose, surfactants, especially polysorbate 80, proteins, especially bovine serum albumin (BSA), antioxidants and / or polyethylene glycol (PEG) and / or other substances.
  • carbohydrates especially sugar, especially sucrose and / or trehalose
  • surfactants especially polysorbate 80
  • proteins especially bovine serum albumin (BSA), antioxidants and / or polyethylene glycol (PEG) and / or other substances.
  • BSA bovine serum albumin
  • PEG polyethylene glycol
  • the carrier material T is dried after the pretreatment.
  • the carrier material T is air-dried after the pretreatment.
  • drying processes are alternatively and / or additionally conceivable. It is generally possible for the drying process to take place in an incubator.
  • the carrier material T It is generally possible for the carrier material T to be vacuum-dried.
  • steps S3-S4 it is generally possible for steps S3-S4 to replace steps S1-S4.
  • a carrier material T is loaded with component K in a third step S3.
  • component K is a combination of at least one first substance and at least one second substance, cf. Fig. 1.
  • the carrier material T is loaded with the component K by dripping on a specific volume of a liquid containing a defined amount of the component K.
  • the carrier material T is loaded with a predetermined volume of a solution of a known concentration of the component K.
  • the carrier material T is loaded with a defined amount of the component K.
  • the component K is adhesively bonded to the carrier material T.
  • the carrier material T is suitable for receiving a certain volume of a liquid containing a defined amount of the component K.
  • a fourth step S4 the carrier material T loaded with the compound is dried.
  • the carrier material T is air-dried.
  • the carrier material T It is generally possible for the carrier material T to be vacuum-dried.
  • FIG. 3 shows a schematic representation of a first exemplary embodiment of a kit system KS according to the invention comprising a carrier material T according to the invention according to FIG. 1.
  • the kit system KS comprises a reaction vessel R.
  • the kit system KS comprises a carrier material T according to the invention.
  • the exemplary embodiment of the carrier material T according to the invention shown in FIG. 1 has essentially the same structural and functional features as the carrier material T of the exemplary embodiment of a kit system KS according to the invention shown in FIG. 3.
  • reaction vessel R has an opening.
  • reaction vessel R can be closed.
  • reaction vessel R is resealable.
  • reaction vessel R is closed.
  • the reaction vessel R can be closed in an almost airtight manner. In this exemplary embodiment, the reaction vessel R can be resealed in an almost airtight manner.
  • reaction vessel R is closed almost airtight.
  • reaction vessel R can be closed with a cover D.
  • reaction vessel R can be resealed with a lid D.
  • reaction vessel R is closed with a lid D.
  • reaction vessel R can be closed with a lid D in an almost airtight manner.
  • reaction vessel R is closed with a lid D in an almost airtight manner.
  • the lid D of the reaction vessel R is a
  • the lid D of the reaction vessel R can be a screw cap, a click cap, a capsule, a stopper, a disk, a film and / or another closure system.
  • the reaction vessel R has a capacity of 15 ml.
  • reaction vessel R is designed to measure any conceivable volume (e.g. 100 ml, 200 ml, 1.0 ml, 1.5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml , 200 ml, 500 ml, 1 1).
  • the carrier material T is placed in the reaction vessel R.
  • the carrier material T is placed in the otherwise empty reaction vessel R. In this exemplary embodiment, the carrier material T is attached in the cover D of the reaction vessel R.
  • the carrier material T can be attached to the bottom or to the wall of the reaction vessel R.
  • a carrier material T according to the invention can be introduced at any point in a reaction vessel R.
  • reaction vessel R is suitable for receiving a fluid.
  • the carrier material T is suitable for taking up a specific volume of a liquid containing a defined amount of the component K and for releasing it again in the presence of an elution fluid.
  • kit system KS can be used for the production of an analysis fluid for a bioassay.
  • kit system KS can be used for the preparation of an antibody solution for an immunassay.
  • FIG. 3 also does not show that the kit system can be used for the production of a protein solution, in particular a protein solution for the detection of binding of an analyte to a protein, the protein being located in the protein solution.
  • FIG. 4 shows a schematic representation of a first exemplary embodiment of the production according to the invention of an antibody solution for an immunassay using the kit system KS according to the invention according to FIG. 3.
  • steps S1 -S4 of the method shown in FIG. 2 are steps S1 1 -S14.
  • the production of an antibody solution for an immunassay using the kit system KS according to the invention according to FIG. 3 comprises steps S1 1 -S16.
  • the production of an antibody solution for an immunassay using the kit system KS according to the invention according to FIG. 3 comprises a larger number of steps than steps S1 1 -S16.
  • the production of an antibody solution for an immunassay using the kit system KS according to the invention according to FIG. 3 comprises a smaller number of steps than steps S1 1 -S16.
  • a reaction vessel R is equipped with the carrier material T comprising the component K in this exemplary embodiment.
  • the carrier material T is introduced into the otherwise dry reaction vessel R.
  • the carrier material T it is generally possible for the carrier material T to be introduced into the reaction vessel even before the pretreatment and / or before the loading with the component K.
  • reaction vessel R loaded with the carrier material T is filled with an elution fluid.
  • the elution fluid is a buffer.
  • any solution can be used as an elution fluid.
  • the elution fluid can contain proteins and / or peptides.
  • the elution fluid prefferably includes a specific binding partner. It is generally possible for the elution fluid to contain specific binding molecules.
  • the component K is detached from the carrier material T by the elution fluid.
  • the successful solvation of component K can be assessed by changing the color of the elution fluid.
  • reaction vessel R is inverted to solvate the component K.
  • the solvation of the component can alternatively and / or additionally be achieved by vibration (vortex) and / or shaking and / or other methods.
  • the carrier material T is suitable for releasing the specific volume of a liquid containing a defined amount of component K, which was previously absorbed, in the presence of the elution fluid.
  • an analysis fluid is formed by step S16.
  • the successful solvation of the component from the elution fluid becomes an analysis fluid.
  • the method for producing an antibody solution for an immunassay with the kit system KS according to the invention produces a functional analysis fluid of known concentration of component K.
  • the analysis fluid can be used for the detection of analytes in liquids.
  • the elution fluid contains proteins.
  • the elution fluid contains a primary antibody.
  • component K is a compound of an antibody with a gold nanoparticle.
  • component K is a compound of a secondary antibody with a gold nanoparticle.
  • the secondary antibody is suitable for binding to the primary antibody.
  • the secondary antibody of the compound binds to the primary antibody.
  • the analysis fluid is an antibody solution.
  • the analysis fluid can be used for the detection of immobilized analytes.
  • the elution fluid does not contain a primary antibody.
  • component K comprises a combination of a primary antibody and a marker.
  • the analysis fluid does not include a secondary antibody.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of an embodiment of a common method according to the prior art for detecting an immobilized analyte on a membrane.
  • the analyte is a protein.
  • proteins are transferred to a membrane including the analyte.
  • the membrane is a nitrocellulose membrane.
  • the proteins are transferred to a membrane using the Western blot method in an upstream method.
  • the proteins are immobilized on the membrane.
  • the current method according to the prior art for detecting an immobilized analyte on a membrane comprises steps S21 -S26.
  • the current method according to the prior art for detecting an immobilized analyte on a membrane comprises a greater number of steps than steps S21-S26.
  • the current method according to the prior art for detecting an immobilized analyte on a membrane comprises a smaller number of steps than steps S21-S26.
  • a blocking solution is added to the membrane.
  • the blocking solution blocks unspecific protein binding sites on the membrane.
  • the blocking is achieved by incubating the membrane in a common blocking solution (e.g. 3-5% (or other) BSA in PBS, 3-5% (or other) BSA in TBS, milk buffer in PBS, or other common blocking solutions, too commercial blocking solutions).
  • a common blocking solution e.g. 3-5% (or other) BSA in PBS, 3-5% (or other) BSA in TBS, milk buffer in PBS, or other common blocking solutions, too commercial blocking solutions.
  • a first antibody solution comprising a primary antibody in blocking solution against a specific analyte is added to the membrane.
  • the membrane is incubated with the first antibody solution.
  • the incubation of the membrane with the first antibody solution usually takes place at about 4 ° C. for 2 hours to overnight.
  • the primary antibody binds specifically to the analyte.
  • the first antibody solution is discarded.
  • a washing solution is added to the membrane.
  • the membrane is washed with the washing solution.
  • the washing solution can be a buffer.
  • the washing solution is discarded.
  • the membrane is washed 3 times for 5 minutes with the washing solution.
  • the membrane In general, it is possible for the membrane to be washed for a longer or shorter period and / or with additional washing steps.
  • a second antibody solution is added to the membrane.
  • the second antibody solution comprises a secondary antibody which is labeled and binds to the primary antibody.
  • the membrane is incubated with the second antibody solution.
  • the secondary antibody specifically binds to the primary antibody.
  • the incubation of the membrane with the second antibody solution usually takes place at room temperature for about 1-2 hours.
  • the second antibody solution is discarded.
  • a washing solution is added to the membrane.
  • the membrane is washed with the washing solution.
  • the washing solution can be a buffer.
  • the washing solution is discarded.
  • the membrane is washed 3 times for 5 minutes with the washing solution.
  • the membrane In general, it is possible for the membrane to be washed for a longer or shorter period and / or with additional washing steps.
  • the marking can be visualized.
  • Common visualization methods include, for example, the detection of fluorescence (fluorescence marking) and / or chemiluminescence.
  • the specific binding of the primary antibody to the analyte can be visualized via the marking of the secondary antibody.
  • a sixth step S26 the marking is visualized using a common visualization method.
  • the marking is a fluorescent dye.
  • a fluorescence detection method is used to visualize the flag.
  • the binding of the primary antibody to the analyte can be quantified via the marker bound to the secondary antibody.
  • FIG. 6 shows a schematic representation of an exemplary embodiment of a method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane.
  • the analyte is a protein.
  • proteins are transferred to a membrane including the analyte.
  • the membrane is a nitrocellulose membrane.
  • the membrane can consist of nylon, glass fiber or polyvinylidene difluoride (PVDF) or other materials.
  • PVDF polyvinylidene difluoride
  • the proteins are transferred to a membrane using the Western blot method in an upstream method.
  • the proteins are immobilized on a membrane.
  • An analysis fluid according to the invention is produced according to the method shown in FIG. 4 with the kit system shown in FIG. 3.
  • An antibody solution according to the invention is produced according to the method shown in FIG. 4 with the kit system shown in FIG. 3.
  • the primary antibody is suitable for specifically binding to the analyte.
  • the membrane is incubated with the analysis fluid.
  • This step can be preceded by a further step which comprises rinsing off the membrane or incubating in a washing buffer or a blocking solution.
  • the blocking solution can or should also be used as an elution fluid.
  • This step is based on the consideration that, after the blotting, the membrane should advantageously be freed from detergent or, in certain applications, this is also necessary before a reagent hits it.
  • the easiest way to do this is to rinse it off under tap water.
  • the incubation can be carried out in a washing buffer or a blocking solution.
  • the membrane is incubated with the analysis fluid in a step S31.
  • a step S31 the membrane is incubated with the analysis fluid for a period of 0.5h-2.0h.
  • the primary antibody specifically binds to an analyte.
  • the analysis fluid is discarded.
  • the binding of the primary antibody to the analyte can be detected by labeling the secondary antibody.
  • the binding of the primary antibody to the analyte can be detected via the gold nanoparticle bound to the secondary antibody.
  • the gold nanoparticles are directly visible.
  • the binding of the primary antibody to the analyte via the marker bound to the secondary antibody can be quantified.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can comprise loading a carrier material T with a specific volume of a liquid containing a defined amount of a compound from a specific binding partner of the analyte and a marker.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can comprise the adhesive binding of the compound to the carrier material T.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can include drying the carrier material T.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can include the introduction of the carrier material T into a dry reaction vessel R.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can comprise the introduction of an elution fluid into the reaction vessel R, the compound being released from the carrier material T into the elution fluid in the presence of the elution fluid and forming an analysis fluid.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can include applying the analysis fluid to the membrane.
  • the method according to the invention for detecting an immobilized analyte on a membrane can comprise the detection of the binding of the specific binding partner of the analyte via the label.
  • the method for detecting an immobilized analyte on a membrane can comprise further steps.
  • the method can include a pretreatment of the carrier material T with a fluid.
  • FIG. 7 shows an illustration of an exemplary embodiment according to the invention with a dot blot directly.
  • the marked primary antibody is the component on the carrier and is solubilized with elution fluid (buffer + protective protein).
  • the resulting analysis fluid is applied to the membrane that carries the analyte.
  • the membrane is stained with an analysis fluid according to the invention consisting of anti-HIS epitope tag antibodies labeled with gold nanoparticles, solubilized from the kit according to the invention with 3% BSA in 1 ⁇ PBS as elution fluid.
  • FIG. 8 shows an illustration of an exemplary embodiment according to the invention with a dot blot indirectly.
  • the marked secondary antibody is the component on the carrier and is solubilized with elution fluid (buffer + protective protein + additional primary antibody).
  • elution fluid buffer + protective protein + additional primary antibody.
  • the resulting analysis fluid is applied to the membrane that carries the analyte. The marking of the analyte, which is visible after 10 minutes of incubation, can be seen (see the points on the membrane).
  • the staining according to the invention of various poly-histidine-labeled target proteins can be seen dropped onto a nitrocellulose membrane.
  • the membrane is stained with analysis fluid according to the invention consisting of anti-mouse secondary antibodies marked with gold nanoparticles and anti-HIS epitope-tag antibodies from mouse solubilized from the kit according to the invention with 3% BSA in 1 xPBS and anti-HIS epitope-tag antibodies from mouse as elution fluid .
  • FIG. 9 shows an illustration of an embodiment according to the invention with a Western blot directly.
  • ECL enhanced chemiluminescence
  • HRP horseradish peroxidase
  • a staining according to the invention of the poly-histidine-labeled target protein (His6-Kin1 L) on a nitrocellulose membrane after blot transfer can be seen on the right.
  • the membrane is stained with an analysis fluid according to the invention consisting of anti-HIS epitope tag antibodies labeled with gold nanoparticles, solubilized from the kit according to the invention with 3% BSA in 1 ⁇ PBS as elution fluid.
  • FIG. 10 shows an illustration of an exemplary embodiment according to the invention with a Western blot indirectly.
  • PVDF polyvinylidene fluoride (also polyvinylidene fluoride)) after blot transfer.
  • the membrane is stained with ECL chemiluminescent substrates after incubation with antibodies against penta-histidine as HRP conjugate.
  • a staining according to the invention of the poly-histidine-labeled target protein (ATX1) on a PVDF membrane after blot transfer is stained with analysis fluid according to the invention consisting of anti-mouse secondary antibodies marked with gold nanoparticles and anti-HIS epitope tag antibodies from mouse solubilized from the kit according to the invention with 3% BSA in 1 xPBS and anti-HIS epitope tag antibodies from mouse as elution fluid .
  • FIG. 11 shows a schematic illustration of a further exemplary embodiment of a carrier material T according to the invention.
  • the carrier material T includes all structural and functional features like the carrier material T, which is shown in FIG.
  • the component K comprises a combination of a first substance and a second substance.
  • component K is a combination of recombinant angiotensin-converting enzyme 2 and a marker molecule.
  • component K can be a compound of the receptor-binding motif (RBM) of the angiotensin-converting enzyme 2 (one or more molecules of RBM) and a marker molecule.
  • RBM receptor-binding motif
  • the marker molecule comprises at least one nanoparticle.
  • the nanoparticle is a gold nanoparticle with a size of 8 nm to 10 nm in diameter.
  • the marker molecule can have a size of 2 to 14 nm in diameter, in particular 4-12 nm in diameter, in particular 8 nm to 10 nm in diameter.
  • the at least one component K can alternatively comprise at least one spike protein and / or one spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • the carrier material T ‘and / or kit system KS can be used in a method for detecting an analyte at least partially by means of a specific binding of the analyte to the recombinant angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2).
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • the analyte can comprise a protein, in particular wherein the analyte comprises a single peptide and / or polypeptide or a complex of different polypeptides.
  • the protein can comprise at least one viral spike protein of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus, the at least one viral spike protein being linked to the angiotensin converting enzyme 2 (ACE2) binds.
  • ACE2 angiotensin converting enzyme 2
  • a spike protein can also be understood as a spike protein trimer or vice versa. It is also not shown in FIG. 11 that the carrier material T 'and / or kit system KS can be used in a method for detecting an infection with the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • component K can alternatively and / or additionally include the following:
  • Diameter in particular 100 nm diameter
  • PS protein A modified polystyrene
  • Poly-histidine tag on gold nanoparticles in particular 20-500 nm in diameter, in particular 100 nm in diameter.
  • FIG. 12 shows schematically the use of a component in a method for the detection of a pathogen.
  • the pathogen is a virus.
  • the virus is a SARS-CoV2 virus.
  • a SARS-CoV virus or an HCov-NL63 virus is conceivable.
  • a virus with virus surface V is shown.
  • a component K is also shown, in particular the component K is shown in multiple numbers (only an exemplary label).
  • a large number of identical surface proteins O are located on the virus surface V (three surface proteins O are indicated by way of example).
  • the surface proteins are O spike proteins.
  • the surface proteins are spike protein trimers (i.e. they consist of three units).
  • a spike protein can also be understood as a spike protein trimer or vice versa.
  • the spike protein trimers are flexible in their alignment.
  • the spike protein trimers are attached to the virus surface V at essentially the same distance A (shown by means of the dashed arrows) from one another.
  • a distance A between the centers Z of two spike protein trimers is approximately 14 nm.
  • a component K comprises a compound of recombinant angiotensin
  • converting enzyme 2 B and a marker molecule N in this example a gold nanoparticle N.
  • component K comprises several units (molecules) of the enzyme angiotensin-converting enzyme 2 (more than one enzyme unit).
  • component K comprises 3-6 units (molecules) of the enzyme angiotensin-converting enzyme 2.
  • component K can comprise 2-100 units (molecules) of the enzyme angiotensin converting enzyme 2.
  • component K can comprise a single unit (molecule) of the enzyme angiotensin converting enzyme 2.
  • the enzyme angiotensin-converting enzyme 2 is a binding partner B for a spike protein.
  • Each of the three spike proteins of a spike protein trimer can bind to a recombinant angiotensin-converting enzyme 2, in particular it is a specific binding.
  • a binding of the three spike proteins of a spike protein trimer to a recombinant angiotensin-converting enzyme 2 of at least two different components K is also made possible.
  • a gold nanoparticle N has a size of 8-10 nm.
  • the size of the gold nanoparticles N of a component K is smaller than the distance A between the centers Z of two surface proteins O, here two spike protein trimers.
  • the distance between two gold nanoparticles (after binding between the spike proteins and recombinant angiotensin-converting enzyme 2) is therefore less than 30 nm.
  • the nanoparticles can be arranged (bridged) in the spaces between the surface proteins O.
  • an outer layer of gold nanoparticles N is formed.
  • the detection of the SARS-CoV 2 virus can accordingly be provided at least partially by means of a specific binding of a spike protein to the recombinant angiotensin-converting enzyme 2B.
  • the arrangement of the component K, in particular the gold nanoparticles between the spike protein trimers on the virus surface O leads to plasmon resonance coupling and thus to an increase in the molar extinction coefficient, whereby the virus is detected optically can.
  • the at least one component K can be used in a method for detecting a pathogen independently of the carrier material T ‘and / or the kit system KS.
  • the component K can be introduced into the method for detecting an infection with the SARS-CoV2 virus via a carrier material T or a kit system KS or another material and / or medium and / or method.
  • Component K can be used in procedures for the detection of one or more (other) pathogens.
  • the detection takes place at least partially by means of a specific binding of an analyte to a binding partner B, component K comprising a compound of at least one binding partner B and a marker molecule N, preferably where marker molecule N has at least one nanoparticle, in particular gold nanoparticle, fluorescent nanoparticle, includes magnetic nanoparticles and / or quantum dot.
  • the analyte is arranged in multiple numbers with an essentially equal distance A on the surface of the pathogen.
  • the size of the marker molecule N is so adapted to the distance A between the individual analytes of the multiple number of analytes that binding of the analyte to the binding partner B is made possible.
  • component K is a compound of at least one spike protein and / or a spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus and a marker molecule N.
  • a suitable antibody binds to the at least one spike protein and / or the spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 Virus.
  • the detection can be done as described above (color shift, depending on the size of the gold nanoparticles).
  • the component is a compound of at least one spike protein and / or a spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus and a marker molecule N, in particular gold nanoparticles.
  • Suitable cells bind to the at least one spike protein and / or the spike protein receptor binding site of the Sars-CoV-2 virus, Sars-CoV virus or HCov-NL63 virus.
  • the detection can be carried out, for example, as described above (color shift, depending on the size of the gold nanoparticles),

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägermaterial (T,T') umfassend mindestens eine Komponente (K), wobei die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, wobei das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben. Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Kitsystem (KS), die Verwendung eines Kitsystems (KS) für die Herstellung einer Antikörperlösung oder Proteinlösung, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran, sowie ein Verfahren zum Nachweis eines nicht-immobilisierten Analyten (z.B. in Lösung), sowie die Verwendung mindestens einer Komponente (K), eines Kitsystems (KS) oder eines Trägermaterials (T) in verschiedenen Verfahren.

Description

Trägermaterial, Kitsystem und Verfahren für biologische Assays
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Trägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Trägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, wobei das Trägermaterial aufgrund seiner physikalischen Beschaffenheit geeignet ist die Komponente unter Laborbedingungen zu Trocknen und so vor Degradation und/oder Aggregation zu schützen.
Zudem betrifft die vorliegende Erfindung ein Kitsystem, umfassend ein Reaktionsgefäß und ein erfindungsgemäßes Trägermaterial, sowie die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids für den Nachweis biogener Makromoleküle.
Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Trägermaterial und ein Kitsystem, sowie deren Verwendung in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus (englisch: severe acute respiratory syndrome Coronavirus 2; SARS-Coronavirus 2, neuartiges Coronavirus), Sars-CoV Virus (englisch: severe acute respiratory syndrome Coronavirus; SARS-Coronavirus) oder HCov-NL63 Virus (humanes Coronavirus NL 63).
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Durchführung eines Bioassays.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer festen Matrix (z.B. einer Membran). Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines nicht-immobilisierten Analyten (z.B. in Lösung).
Im naturwissenschaftlichen Bereich werden häufig polymere Stoffe verwendet, deren physikalisches Kennzeichen es ist, dass sie sich in Lösungen nicht so fein verteilen wie kleinere Moleküle, d.h. nicht monodispers in der Lösung verteilt sind. Eine nicht monodisperse Lösung aus polymere Stoffen, insbesondere aus Makromolekülen stellt ein Problem dar, da zum einen die Lagerung zur Aggregation führen kann, welche die Quantität des Stoffs in der Lösung mindert, zum anderen auch die Durchmischung zur Entnahme Scherkraft induzierte Schädigung des Stoffes hervorrufen kann, welche die Qualität des Stoffes in der Lösung mindert. Da polymere Stoffe und insbesondere Makromoleküle oftmals kostenintensiv in der Herstellung und daher besonders schützenswert sind, werden solche Stoffe oftmals in Portionen kleiner Volumina oder in getrockneter Form gelagert und zur Anwendung in der Produktion und/oder der Verwendung z.B. als Nahrungsergänzungsmittel sowie als Pharm azeutikum, Diagnostikum oder Therapeutikum und/oder als Labor Analytikum dargereicht.
Im Labor werden Makromoleküle häufig in Bioassays und insbesondere durch immunologische Verfahren, zum Nachweis von Analyten verwendet.
Bei einem Bioassay beruht der Nachweis eines Analyten auf der Affinität eines für den Analyten spezifischen Bindungspartners zu einer bestimmten Eigenschaft des Analyten (z.B. Epitop), beispielsweise im Rahmen einer Antikörper-Antigen-Reaktion. Über ein Markierungsmolekül, das mit dem Bindungspartner verbunden ist, kann das Vorhandensein des Analyten detektiert werden. Das Ziel ist es, ein Signal des markierten Bindungspartners, dabei indirekt des Analyten, in ausreichender Stärke zu erkennen.
Der spezifische Bindungspartner, der an den zu detektierenden Analyten bindet, kann auch als Primärbindungspartner bezeichnet werden (z.B. ein Primärantikörper, Rezeptor, Ligand, Epitop). In der Regel zeichnet sich der Primärbindungspartner durch eine hohe Spezifität und Affinität gegenüber dem Analyten, beispielsweise gegenüber einem bestimmten Epitop des Analyten aus. Dies kann auch beinhalten, dass keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen gezeigt werden und/oder vorliegen.
Immunologische Verfahren, auch Immunassays, bezeichnen eine Reihe von Verfahren in der Analytik (insbesondere der Bioanalytik) zur Erkennung und damit zum Nachweis eines Analyten durch Bindung des Analyten an einen (spezifischen) Bindungspartner.
Gängige Immunassays umfassen unter anderem Verfahren wie Western-Bot, Enzym e-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Immunmarkierung, Immunhistochemie, Slot Blot und/oder Dot Blot, aber auch Lateral- Flow Immunoassays.
Bei einem Immunassay beruht der Nachweis eines Analyten auf der Affinität eines für den Analyten spezifischen Bindungspartners zu einer bestimmten Eigenschaft des Analyten (z.B. Epitop), beispielsweise im Rahmen einer Antikörper-Antigen-Reaktion. Über einen Marker, der mit dem Bindungspartner verbunden ist, kann das Vorhandensein des Analyten detektierbar gemacht werden. Das Ziel ist es, ein Signal des Markers, dabei indirekt des Analyten, in ausreichender Stärke zu erkennen.
Der spezifische Bindungspartner, der an den zu detektierenden Analyten bindet, kann auch als Primärbindungspartner bezeichnet werden (z.B. ein Primärantikörper). In der Regel zeichnet sich der Primärbindungspartner durch eine hohe Spezifität und Affinität gegenüber dem Analyten, beispielsweise gegenüber einem bestimmten Epitop des Analyten aus. Dies kann auch beinhalten, dass keine Kreuzreaktionen mit ähnlichen Epitopen gezeigt werden und/oder vorliegen.
In der Regel wird zwischen direkten Nachweisverfahren und indirekten Nachweisverfahren unterschieden. Bei direkten Nachweisverfahren wird der Analyt mit einem für den Analyten spezifischen Bindungspartner (Primärbindungspartner, z.B. Primärantikörper) zusammengebracht, welcher direkt mit einem Marker verbunden ist. Bei indirekten Nachweisverfahren wird in einem ersten Schritt der Analyt mit einem für den Analyten spezifischen ersten Bindungspartner (Primärbindungspartner, z.B. Primärantikörper) zusammengebracht. In einem zweiten Schritt wird ein zweiter Bindungspartner (Sekundärbindungspartner, z.B. Sekundärantikörper) verwendet, der sich gegen den ersten Bindungspartner richtet. Der zweite Bindungspartner ist mit einem Marker verbunden. Folglich kann über den markierten zweiten Bindungspartner, welcher an den ersten Bindungspartner bindet, welcher wiederum an den Analyten bindet, ein Analyt detektiert werden.
Üblicherweise sind bioanalytische Verfahren und vor allem immunologische Verfahren Meh rsch rittverfahren , in welchen die einzelnen Komponenten des Nachweissystems einem Präparat, welches den Analyten beinhalten soll und/oder beinhaltet zugeführt werden. Aus diesem Grund sind immunologische Verfahren bzw. bioanalytische Nachweisverfahren relativ langwierig und fehleranfällig, weswegen die Verlässlichkeit der in diesen Assays bzw. Verfahren verwendeten Komponenten eine besondere Bedeutung zukommt.
Die beschriebenen immunologischen Verfahren benötigen zur Durchführung zahlreiche Komponenten (beispielsweise Bindungspartner oder Markierungen), welche nicht selten temperaturempfindlich sind. In der Regel müssen eine Vielzahl der Komponenten, z.B. Antikörper, zumindest teilweise, bei Temperaturen niedriger als Raumtemperatur gelagert und/oder gehandhabt werden um stabil und/oder funktional zu bleiben und/oder gegen Proteolyse geschützt zu sein (z.B. gekühlt auf Eis, im Kühlschrank, bei 4°C bis 8°C oder niedriger als 0°C, insbesondere bei -20°C oder -80°C). Schon kaum vermeidbare Temperaturschwankungen während des Transports und/oder der Lagerung, insbesondere Temperaturerhöhungen (beispielsweise über -20°C, -80°C oder 4°C-8°C) können die Komponenten schädigen, insbesondere sodass die Struktur und/oder Funktion der Komponenten zumindest teilweise verändert und/oder gestört ist. Besonders kritisch können auch die Entnahmen von Teilmengen der Komponenten sein, da hier neben den unweigerlichen Temperaturänderungen, insbesondere Temperaturerhöhungen, auch noch mögliche Kontaminationen mit ubiquitären Proteasen und/oder Mikroben schädigend auf die Struktur und/oder Funktion der Komponenten wirken können.
Beispiele derartiger empfindlicher Komponenten sind unter anderem Antikörper oder Antikörperfragmente, Peptide, Proteine, Oligonukleotide, DNA-Sonden, RNA-Sonden, Nukleinsäurefragmente, Aptamere, Anticaline, Lektine, Affibodies, chemische Liganden, Nanopartikel, Enzyme (insbesondere Reporterenzyme) oder Farbstoffe, insbesondere auch Fluoreszenzfarbstoffe.
Bisher bekannte Verfahren und Komponenten sind zwar spezifisch für bestimmte Analyten, jedoch aufgrund der Komplexität der Verfahren und der Instabilität der Komponenten fehlerempfindlich. Den Komponenten ist nicht anzusehen, ob sie in ihrer Struktur und/oder Funktion geschädigt wurden, sodass falsch negative Ergebnisse von bioanalytischen und/oder immunologischen Verfahren, in welchen die Komponenten verwendet wurden, aufgrund geschädigter, Struktur- und/oder funktionsbeeinträchtigter Komponenten zum Forschungsalltag gehören.
Da die gängigen bioanalytischen und/oder immunologischen Verfahren, für die diese Komponenten benötigt werden, aufwändig sind, wäre es wünschenswert die Komponenten in stabiler Formulierung und/oder mit geringer Anfälligkeit für Struktur- und/oder Funktionsschäden zur einfachen Anwendung darzureichen. Zudem sind die gängigen bioanalytischen und/oder immunologischen Verfahren von einer langen Dauer und einer Vielzahl an Verfahrensschritten (beispielsweise mehrere Bindungsreaktionen, mehrere Waschschritte, Blockieren unspezifischer Bindungsstellen und/oder enzymatische Reaktionen) gekennzeichnet, und stellen keine praktischen Anwendungsformen dar.
Integrierte trockenchemische Testelemente würden die Verfahrensdurchführung erleichtern, die Fehleranfälligkeit vermindern und/oder Zeiten für das Durchführen eines immunologischen Verfahrens verkürzen. Die beschriebenen empfindlichen Komponenten können getrocknet werden und sind in getrockneter Form geschützt gegen Beschädigung, z.B. durch Proteolyse, Oxidation oder Hydrolyse und/oder Instabilität und/oder Funktionsverlust. So können vor allem ansonsten temperatursensitive und auch Degradations-empfindliche Komponenten auch ohne Kühlung stabil gelagert werden.
Eine einfache Lösung des Problems wäre daher das Vakuumtrocknen empfindlicher Komponenten. Dieses Verfahren ist aber insofern problematisch, als dass es für jede Komponente gesondert optimiert werden muss. Kritisch ist dabei, dass sich beim Trocknen das Medium verändert, da auch die Stabilisatoren mit eingetrocknet und daher konzentriert werden. Wird dies nicht optimiert, können die Komponenten wiederum ihre Funktionalität und Stabilität durch den Trocknungsprozess verlieren. Auch die Lagerstabilität ist kritisch, da die Formulierungen in hoch konzentrierten Salzen und Hilfsstoffen hygroskopisch sind und bei Feuchtwerden (z.B. Kondenswasser, Luftfeuchtigkeit bei Probenentnahme und Lagerung) Aggregation und Degradation auftreten. So stabilisierte Komponenten neigen daher zur Aggregation, sodass eine homogene Rücklösung meist nicht erreicht wird. Es muss ein Verlust von Material in Kauf genommen werden, was insbesondere bei teuren und aufwendig hergestellten Komponenten vermieden werden soll.
Aus dem Stand der Technik sind bereits Trägermaterialien zur Freisetzung von Analysefluids, welche biogene analytischen Komponenten enthalten, für die Verwendung in immunologischen Verfahren bekannt. Die Aufbringung und ggf. das Eintrocknen der Komponenten auf den Trägermaterialien ermöglichen eine besonders hohe Stabilität gegenüber degenerativen Einflüssen, wie z.B. Temperaturänderungen (insbesondere Temperaturanstiege), Änderungen (insbesondere ein Anstieg) der Luftfeuchtigkeit führen hier jedoch weiterhin zur Zersetzung der biogenen Komponenten. Neben einer verschweißten, luftdichten Verpackung ist die Zugabe von Trockensalzpäckchen erforderlich.
Der Erzeugung von Analysefluiden kommt das sogenannte Conjugate Pad, welches in diagnostischen immunologischen Anwendungen, wie z.B. Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA), Verwendung findet am nächsten. Das Trägermaterial des Conjugate Pad besteht zumeist aus Glasfaser oder Cellulose Faser oder auch oberflächen-modifizierter Polymerfaser. Es ist in der Regel bis zu 1 cm lang, 0,5cm breit und unter 0,5mm dick. Da das hauptsächliche Kriterium der Auswahl des Trägermaterials in der geringen Proteinbindung sowie dem niedrigen Rückhaltevolumen von maximal <50pL/cm2 liegt ist die Aufnahme der Flüssigkeit auf 25mI_ Flüssigkeit beschränkt. Zur Vermeidung von Randeffekten werden zumeist 10 bis 15mI_ Konjugat, welches zumeist Nanopartikel markierte Primärantikörper beinhaltet, aufgetragen. Die Trägermaterialien werden vorbehandelt, um eine möglichst schnelle Freisetzung der Komponenten auch bei nur geringer Proben- und/oder Analytmenge zu erhalten. Die Conjugate Pads werden im Vakuum getrocknet und müssen trocken gehalten werden, um die Integrität der Komponenten zu erhalten.
Neben einer verschweißten, luftdichten Verpackung ist die Zugabe von Trockensalzpäckchen erforderlich. Diese Schritte sind Stand der Technik in diagnostischen, chromatographischen Anwendungen, wie Lateral-Flow-Immunoassays (LFIA), welche jeweils der Diagnose eines bestimmten Analyten dienen.
Die US4366241 B1 offenbart nicht-chromatographische Testvorrichtungen und Verfahren, die solche Vorrichtungen verwenden, für die Bestimmung von Mitgliedern eines immunologischen Paares (Mip). Die Testvorrichtung verfügt über eine immunsorbierende Zone, an der ein Mip (gegen diffuse Bewegungen) befestigt ist. Die immunsorbierende Zone dient als Eingang für die Proben- und Reagenzlösungen. In flüssigkeitsaufnehmender Beziehung, entweder direkt oder indirekt mit der immunsorbierenden Zone und normalerweise quer dazu verlaufend, befindet sich eine flüssigkeitsabsorbierende Zone, die dazu dient, Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone zu ziehen, Flüssigkeit zu speichern und dazu dienen kann, die Geschwindigkeit zu steuern, mit der die Flüssigkeit durch die immunsorbierende Zone gezogen wird.
Die EP186799A1 offenbart ein festes diagnostisches Mittel, bestehend aus mehreren Funktionsfeldern, welches zum Nachweis und zur quantitativen Bestimmung von Substanzen oder Analyten in biologischen Flüssigkeiten dient. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren unter Verwendung dieses Mittels, wobei nach Kontakt des Mittels mit der Flüssigkeit die Analyten mit spezifischen bioaffinen Bindungspartnern reagieren und mit Hilfe von Markierungsreagenzien nachgewiesen werden.
Ferner offenbart die EP2395921 B1 eine Vorrichtung zum Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge eines oder mehrerer Analyten in einer Probe einer Körperflüssigkeit eines Menschen, ferner unter anderem zumindest einen Teststreifen mit einem saugfähigen Abschnitt sowie mit Reagenzien zum Bestimmen des Vorliegens und/oder der Menge eines oder mehrerer Analyten in der Probe. Ferner offenbart die EP1361436 A1 mehrschichtige Reagenzteststreifen zur Quantifizierung von glykosiliertem Protein in einer flüssigen Probe sowie Verfahren zu deren Verwendung. Bei der Verwendung der Teststreifen wird eine flüssige Probe auf den Teststreifen aufgebracht und ein Signal erzeugt, mit dem der Gehalt glykosilierten Proteins in der Probe quantifiziert werden kann.
Die WO2018203145A1 offenbart Verfahren zur Diagnose, Forschung und zum Screening von Chemikalien in biologischen Flüssigkeiten im Zusammenhang mit der Ethylenglykolvergiftung. In einigen Ausführungsformen wird eine Testvorrichtung zum Messen von Glykolat/Glykolsäure beschrieben, umfassend: einen Teststreifen, umfassend a) ein Oxidase- Enzym (z.B, Glykolatoxidase (GOX oder GAX)), das Wasserstoffperoxid erzeugt, während das Glykolat mit Luftsauerstoff oxidiert wird; b) eine Peroxidase, zum Beispiel Meerrettichperoxidase, die in der Lage ist, geeignete Substrate mit dem erzeugten Wasserstoffperoxid zu oxidieren; und c) ein geeignetes Substrat für die Peroxidase, das als Vorläufer eines Indikatorfarbstoffs dient, der photometrisch durch Reflexphotometrie oder fluorimetrisch in einem speziell für diesen Zweck konstruierten Lesegerät oder visuell gelesen werden kann.
Allgemein wurden die beschriebenen in-vitro Diagnostik Schnelltests für geringe Konzentrationen von Analyten in biologischen Proben entwickelt und optimiert. In den im Stand der Technik beschriebenen in-vitro-Diagnostik-Vorrichtungen und Verfahren wird eine über die für den eigentlichen Nachweis hinaus benötigte Menge an Reagenzien für die jeweiligen Teststreifen verwendet. Dies ist erforderlich, da die Anforderung der sehr hohen Fließfähigkeit durch die Größe der Reagenzien/Komponenten (z.B. Nanopartikel) limitiert ist und das geringe Volumen der zu analysierenden Probe das Fierauslösen der Komponenten/Reagenzien aus dem Trägermaterial und/oder Filter erschwert. Diese Zusammensetzung der Schnelltests ist für die diagnostische Anwendung, bei der es um die Detektion kleinster Mengen eines Analyten aus biologischen Proben geht, optimiert. Die präzise hergestellten Reagenzien/Komponenten werden aufgrund ihrer Hochwertigkeit und des Bedarfs der gleichmäßigen Verteilung der eher geringen Mengen zumeist aufwändig auf das für das jeweilige Verfahren, z.B. LFIA, optimierte Trägermaterial aufgebracht und im Vakuum getrocknet. Die Trägermaterialien, insbesondere Teststreifen, werden dann in für die entsprechende Diagnostik individuell angefertigten Gehäuse eingebaut und dort verwendet.
Derartige Verfahren sind für die wissenschaftliche Anwendung nicht geeignet. In Anwendungen im Laboralltag der Forschung im Bereich der Lebenswissenschaften (Biologie, Medizin, Biomedizin, Pharmazie, Biochemie, Chemie, Molekularbiologie, Biophysik, Bioinformatik, Humanbiologie, Forensik, Agrarwissenschaft, Agrartechnologie, Ernährungswissenschaft, Lebensmittelforschung, etc.), wie beispielsweise der Detektion eines Analyten, insbesondere eines Proteins mittels eines Immunassays, stellen sich andere Anforderungen. In der Regel werden hier variable Mengen mehrerer Proben, jeweils mindestens einen Analyten umfassend, parallel analysiert. Dabei ist der Analyt auf einer Fläche wesentlich größer als die der aus dem Stand der Technik bekannten Teststreifen immobilisiert. Zur Benetzung der Gesamtfläche wird daher eine große Menge von Reagenzien/Komponenten in großem Volumen benötigt (Milliliter). Die aus dem Stand der Technik bekannten Trägermaterialien und/oder Verfahren sind zudem in der Regel nur auf die Detektion/Diagnose einen einzigen Analyten ausgelegt und daher sehr unflexibel in ihrer Anwendung.
Da die gängigen Diagnoseverfahren auch so ausgelegt sind, dass sie vergleichsweise teuer und aufwändig produziert werden müssen, kann eine große Anzahl an Tests nicht in kurzer Zeit, vor allem nicht kostengünstig bereitgestellt werden. Bei einer großen Anzahl an benötigten Tests für ein Diagnoseverfahren innerhalb einer kurzen Zeit, beispielsweise während einer Epidemie oder Pandemie, würde die erforderliche Anzahl an Tests über das für die diagnostische Analytik übliche Maß - und das, was in kurzer Zeit zur Verfügung gestellt werden kann, hinausgehen.
Würden nach dem Stand der Technik hergestellte Trägermaterialien, insbesondere Teststreifen, für größere Nachweisflächen, Ansätze, eine größere Probenanzahl und/oder Probenmenge und/oder die Analyse verschiedener Analyten, wie es in der Forschung der Lebenswissenschaften in der Regel nötig ist, bereitgestellt werden, würde das eine entsprechend größere Menge an Komponenten/Reagenzien erfordern. Eine flexible und/oder wirtschaftliche Nutzung ist nach dem Stand der Technik nicht ermöglicht, daher sind die in der in-vitro-Diagnostik gängigen Produkte und/oder Verfahren für den Laboralltag in der Forschung nachteilig.
Ebenso sind die gängigen Produkte und/oder Verfahren für Situationen, in welchen viele kostengünstige Tests in kurzer Zeit benötigt werden nachteilig.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein T rägermaterial umfassend mindestens eine Komponente, in vorteilhafter Weise weiterzubilden, insbesondere dahingehend, dass eine höhere Flexibilität und/oder Wirtschaftlichkeit in der Anwendung erreicht wird. Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Trägermaterial mit den Merkmalen des Anspruchs 1 . Danach ist vorgesehen, dass ein Trägermaterial bereitgestellt wird, umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
Die Erfindung basiert auf dem Grundgedanken, dass ein Binden einer Komponente auf einem Trägermaterial erfolgt, und zwar dahingehend, dass die Komponente eine adhäsive Bindung an das Trägermaterial eingeht und so eine einfache Wiederfreisetzung zu einem späteren Zeitpunkt ermöglicht wird. Dabei kann eine für eine bestimmte Anwendung angepasste Menge einer Komponente auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet werden. Diese an das Trägermaterial adhäsiv gebundene und/oder immobilisierte und/oder eingetrocknete Komponente kann einerseits stabil ohne strukturelle und/oder funktionelle Schädigung gelagert und/oder transportiert werden. Durch das Eintrocknen der Komponente auf dem Trägermaterial kann eine besonders hohe Stabilität gegenüber degenerativen Einflüssen, wie z.B. Temperaturänderung, Einfrieren, Wärme, Luftfeuchte und biologische Zersetzung erreicht werden. Andererseits wird es ermöglicht, dass die Komponente durch ein Elutionsfluid zu einem gewünschten Zeitpunkt vom Trägermaterial in Form einer homogenen Lösung wieder freigegeben wird. Insgesamt muss kein relevanter Verlust von Funktion und/oder Struktur und/oder der Menge der Komponente in Kauf genommen werden, was insbesondere bei teuren und aufwendig hergestellten Komponenten, welche für teure und aufwendige Verfahren verwendet werden, vorteilig ist.
Die Erfindung berücksichtigt ferner die besonderen Erfordernisse in der allgemein immunologischen, nicht diagnostischen Anwendung. Hier wird eine besondere Flexibilität in der Anwendung benötigt, da die Forscher häufig wechselnde Analyten nachweisen müssen.
Die beschriebene Erfindung sieht insbesondere vor, empfindliche Komponenten durch Einbringen auf das Trägermaterial in schonender Weise, portionsgerecht zu trocknen. Die Komponenten sind in der so getrockneten Form geschützt gegen Beschädigung, z.B. durch Proteolyse, Oxidation oder Hydrolyse und/oder Instabilität und/oder Funktionsverlust, sind einfach zu Solubilisieren und unterliegen keiner Lagerinstabilität unter Umgebungsbedingungen, da das Trägermaterial sie hinreichend auch vor dem Einfluss der Luftfeuchtigkeit schützt. So können vor allem ansonsten temperatursensitive und auch Degradations-empfindliche polymere Stoffe auch ohne Kühlung stabil gelagert werden.
Zum Anwendungsbereich der Erfindung sind insbesondere die Erzeugung stabil lagerfähiger degradations- und aggregations-sensitiver Stoffe, wie beispielsweise biogene und abiogene Makromoleküle und/oder Polymere zu nennen. Biogene Makromoleküle können beispielsweise rekombinante Proteine umfassen.
Ein„Molekül“ bezeichnet ein Teilchen, das aus zwei oder mehreren zusammenhängenden Atomen besteht, welche durch kovalente Bindungen verbunden sind.
Ein„Makromolekül“ bezeichnet, die aus vielen (bis zu mehreren Hunderttausend) gleichen oder unterschiedlichen Bausteinen (Atome oder Atomgruppen) bestehen und damit eine relativ große Molekülmasse (über 1000 Da; bzw. über 1000 g/mol) haben. Der Begriff Makromoleküle umfasst Proteine, Peptide, Polymere, Kolloide, Proteine und Nukleinsäuren. Der Begriff Makromolekül kann zudem auch Glykoproteine umfassen.
Ein „Makromolekül“ kann ferner auch, zumindest teilweise, Viren, Bakterien, Pilze oder Prionen umfassen.
Ein „Makromolekül“ kann ferner Moleküle mit einer Masse von über 100 Da bzw. über 100g/mol umfassen.
Ein „Polymer“ bezeichnet eine chemische Verbindung, die aus Ketten- oder verzweigten Molekülen besteht, die aus gleichen oder gleichartigen Einheiten (den sogenannten Monomeren) bestehen. Ein Polymer umfasst Makromoleküle, chemische Verbindungen, Salze und Metalle.
Ein „Stoff“ bezeichnet Materie regelmäßiger Beschaffenheit, die sich durch die Elementareinheiten, aus denen sie zusammengesetzt ist, definiert. Diese Elementareinheiten können Atome, Moleküle oder Formeleinheiten (etwa bei Salzen) sein. Stoffe werden durch ihre physikalischen Eigenschaften, wie Dichte, Schmelzpunkt, elektrische Leitfähigkeit etc., charakterisiert.
Der Begriff „biogen“, bezeichnet Stoffe, die von biologischen Systemen abstammend oder durch solche bedingt. Der Begriff„abiogen“, bezeichnet Stoffe, die nicht von biologischen Systemen abstammend oder durch solche bedingt. Insbesondere bezeichnet der Begriff künstlich, bzw. synthetisch erzeugte Stoffe.
Ein„Nanopartikel“ bzw.„Nanoteilchen“ bezeichnet einen Verbund von wenigen bis einigen tausend Atomen oder Molekülen, dessen Größe typischerweise bei 1 bis 100 Nanometern liegt, ggf. aber auch bis 1000 Nanometer erweitert werden kann. Nanopartikel können sowohl auf natürlichem Wege (z. B. Vulkanausbruch oder Waldbrand), als auch durch anthropogene (vom Menschen verursachte) Einflüsse (z. B. Auto- und Industrieabgase) oder synthetisch Nanopartikel hergestellt sein.
„Bioassays“ bezeichnen eine Reihe von Verfahren in der Analytik (insbesondere der Bioanalytik) zur Erkennung und damit zum Nachweis eines Analyten durch Bindung des Analyten an einen (spezifischen) Bindungspartner.
Gängige Bioassays umfassen unter anderem immunologische Verfahren wie Western-Bot, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), Radioimmunassay (RIA), Immunmarkierung, Immunhistochemie, Slot Blot und/oder Dot Blot, aber auch Lateral- Flow Immunoassays.
Eine„Komponente“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf einen Stoff, der ein Molekül und/oder ein Makromolekül und/oder ein Polymer sein kann. .
Ein„Analyt", im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf ein Molekül, das über die Bindung eines Bindungspartners an eine Bindestelle des Analyten nachgewiesen werden kann.
Ein Analyt kann ein Protein umfassen, wobei die Bindungsstelle ein Teil des Proteins ist, an welche der Bindungspartner selektiv bindet. Der Analyt kann ein einzelnes Peptid und/oder Polypeptid sein, aber auch ein Komplex aus verschiedenen Polypeptiden. Der Analyt kann auch eine Einheit sein, die Proteine oder Peptide beinhaltet oder trägt. Beispielsweise kann der Analyt ein Bakterium oder Virus sein.
Denkbar ist auch, dass der Analyt einen Antikörper und/oder Fragment eines Antikörpers und/oder ein Epitop eines Antikörpers umfasst. Denkbar ist auch, dass der Analyt ein oder mehrere Kohlenhydrate, Lipide, DNA, RNA, komplexe organische Moleküle wie Enzymhemmer, Rezeptorbindemittel, Hormone und/oder pharmazeutische Verbindungen und/oder Verbindungen aus einem oder mehreren Stoffen umfasst.
Ein„Elutionsfluid“, im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf ein Fluid, in welchem ein Stoff gelöst werden kann. Insbesondere kann ein Elutionsfluid eine Flüssigkeit sein. Insbesondere kann ein Elutionsfluid eine Lösung sein. Insbesondere kann eine Lösung ein polares oder unpolares Lösungsmittel sein. Insbesondere kann die Lösung eine Pufferlösung sein. Insbesondere kann die Pufferlösung eine im Labor gängige Pufferlösung sein, beispielsweise eine phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS), oder eine Tris-gepufferte Salzlösung (Tris-buffered saline, TBS). Insbesondere kann die Lösung eine klare Lösung sein. Insbesondere kann die Pufferlösung auch Citrat, 2-ethansulfonsäure (HEPES), 3-(N-Morpholino)propansulfonsäure (MOPS), 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) oder eine oder mehrere Aminosäuren umfassen. Dem Elutionsfluid können weitere stabilisierende und/oder das Freigeben der Komponente begünstigende Substanzen zugesetzt sein. Insbesondere können dem Elutionsfluid Proteine, wie z.B. Serum Albumin oder Milchpulver, Kohlehydrate, wie z.B. Zucker, Aminosäuren, Tenside bzw. Netzmittel, wie z.B. Polysorbate und/oder Polyethylenglycol-Derivate oder auch Hilfsstoffe, wie z.B. Polyvinylpyrrolidon oder Komplexbildner, wie z.B. Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) zugesetzt sein.
Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass die mindestens eine Komponente eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfasst. Dadurch kann bewirkt werden, dass Eigenschaften, insbesondere verschiedene Eigenschaften, von mindestens zwei Stoffen, insbesondere mindestens zwei verschieden Stoffen, miteinander kombiniert vorliegen. Es kann vorgesehen sein, dass bei einer erfindungsgemäßen Komponente die Fähigkeit eines ersten Stoffes an einen Analyten zu binden und die Fähigkeit eines zweiten Stoffes ein detektierbares Signal zu geben vorliegt.
Werden mindestens zwei Stoffe mit einer gleichen Eigenschaft zu einer Komponente verbunden, so kann durch die Verbindung der mindestens zwei Stoffe mit der gleichen Eigenschaft eine stärkere Ausprägung der Eigenschaft der Komponente im Vergleich zur Ausprägung der Eigenschaft des ersten Stoffes und/oder des zweiten Stoffes alleine erzielt werden. Insbesondere kann die Komponente auch ein Hybrid aus einem Primärantikörper und einem Sekundärantikörper umfassen. Zudem ist denkbar, dass der erste Stoff einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Peptid, Protein, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Ligand umfasst und wobei der zweite Stoff einen Marker umfasst, wobei die Markierung mindestens einen Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold- Nanopartikel, fluoreszierendes Nanopartikel, magnetisches Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst. Dadurch kann bewirkt werden, dass bei der Komponente die Fähigkeit eines ersten Stoffes an einen Analyten zu binden und die Fähigkeit eines zweiten Stoffes ein detektierbares Signal zu geben kombiniert vorliegt. Insbesondere kann eine Verbindung eines spezifischen Bindungspartners eines Analyten mit einen Nanopartikel, z.B. einem Gold- Nanopartikel, den Vorteil haben, per bloßem Auge detektierbar zu sein.
Das Fluorophor und/oder Fluorochrom kann beispielsweise ein Fluorescein, ein Fluoresceinderivat, Fluoresceinisothiozyanat (FITC), 5(6)-T etramethylrhodamine isothiocyanate ((5(6)-TRITC), Rhodamin Texas Red, Grün Fluorescierendes Protein (GFP), Gelb Fluoreszierendes Protein (yellow fluorescent protein, YFP), Rot Fluoreszierendes Protein (RFP) und/oder jedes beliebige andere Fluorophor und/oder Fluorochorm sein sein. Ein Fluorophor und/oder Fluorchrom kann auch ein Redox-abhängiges Protein, z.B. ein roGFP, rxYFT und/oder HyPer sein. Als fluoreszentes Protein-Tag kann auch das Flash- Tag verwendet werden.
Das Enzym kann ein Reporterenzym sein, beispielsweise eine Peroxidase (z.B. eine Meerrettichperoxidase) oder eine alkalische Phosphatase. Wird ein Enzym als Marker verwendet, kann durch das Enzym eine Färb- oder Chemolumineszenzreaktion (enhanced chemoluminescence, ECL) katalysiert werden.
Einer Peroxidase kann üblicherweise Wasserstoffperoxid als Substrat angeboten werden. Die freiwerdenden Protonen oxidieren ein chromogenes Substrat zu seinem farbigen Endprodukt unter Bildung von Wasser. Das chromogene Substrat kann beispielsweise 2,2'-Azino-di(3- ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure (ABTS), 3-Amino-9-ethylcarbazol (AEC), 4-Chlor-1 -naphthol (CN), 3,3'-Diaminobenzidin (DAB), Luminol und andere Dextrane, T etramethylbenzidin (TMB) und/oder andere chromogene Substrate sein. Einer alkalischen Phosphatase können üblicherweise organische Phosphatverbindungen als Substrat angeboten werden. Die alkalische Phosphatase spaltet Phosphat ab und die freigesetzte Verbindung reagiert zu einem farbigen Endprodukt. Das Substrat kann beispielsweise 5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat (BCIP) in Verbindung mit Nitroblau- Tetrazoliumchlorid (NBT), Tetrazolium-Salz mit Indoxyl, Naphthol-AS-MX-Phosphat, Naphthol AS mit Fast Red TR, Neufuchsin und/oder ein anderes Substrat sein.
Gängige Detektionsverfahren und/oder Detektionssysteme umfassen unter anderem Phosphoimager, Röntgenfilme, CCD Kameras und/oder Fluoreszenzdetektorsysteme.
Das radioaktive Isotop kann beispielsweise 131 lod, 32Phosphor 3Tritium und/oder ein anderes radioaktives Isotop sein.
Es ist denkbar, dass ein Nanopartikel eine Größe von etwa 1 -200 nm hat. Der Nanopartikel kann auch eine Größe <1 nm haben. Der Nanopartikel kann ein metallischer Nanopartikel sein, insbesondere ein Gold-Nanopartikel. Generell ist es auch möglich, dass Gold-Nanopartikel kolloidale Gold-Nanopartikel sind.
Insbesondere ist denkbar, dass ein Nanopartikel eine Größe von 2 bis 70 nm Durchmesser, insbesondere 8-60 nm Durchmesser, aufweist.
Alternativ ist auch denkbar, ein Nanopartikel eine Größe von 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm Durchmesser aufweist. Es ist auch vorstellbar, dass die Nanopartikel magnetische Nanopartikel sind bzw. umfassen, besonders superparamagnetische Nanopartikel und/oder Silika-Sphären gefüllt mit Farbstoffen, fluoreszierende Nanopartikel, besonders Quantum Dots und/oder Quantum Rods und/oder Nanopartikel beinhaltend seltene Erden sind bzw umfassen. Weiterhin ist vorstellbar, dass Nanopartikel, Stoffe umfasst, die als Einheit in Polymermizellen vorliegen, und/oder eingehüllt beispielsweise in Acrylat, Surfmer, Dendrimer und/oder Polymer, so diese direkt oder indirekt gebunden die Solubilisierung und Anheftung einer Komponente im Sinne dieser Schrift erlauben.
Weiter ist vorstellbar, dass die mindestens eine Komponente mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Peptid, Protein, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, chemischen Ligand, Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Generell kann ein Trägermaterial bereitgestellt werden umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, wobei die Komponente eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin konvertierendem Enzym 2 und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Durch die Verbindung (Komponente) aus mindestens einem ersten Stoff (rekombinantes ACE2) und mindestens einem zweiten Stoff (Markierungsmolekül) kann bewirkt werden, dass Eigenschaften, insbesondere verschiedene Eigenschaften, von mindestens zwei Stoffen, insbesondere mindestens zwei verschieden Stoffen, miteinander kombiniert vorliegen. Es kann vorgesehen sein, dass bei einer erfindungsgemäßen Komponente die Fähigkeit eines ersten Stoffes an einen Analyten zu binden und die Fähigkeit eines zweiten Stoffes ein detektierbares Signal zu geben vorliegt.
Es ist generell möglich, dass der erste Stoff alternativ oder zusätzlich nur einen Teil des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2 umfasst, beispielsweise das rezeptorbindende Motiv des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2.
Es ist generell möglich, dass die Komponente ein Markierungsmolekül und eine oder mehrere Einheiten (Moleküle) des Angiotensin-konvertierenden Enzym 2 umfasst.
Alternativ ist es möglich, dass die Komponente mehr als ein Markierungsmolekül und eine oder mehrere Einheiten (Moleküle) des Angiotensin-konvertierenden Enzym 2 umfasst. Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst, insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwoll-Linter und/der einen Schwamm. Durch die poröse Beschaffenheit des Trägermaterials ist das Trägermaterial geeignet, Flüssigkeiten aufzunehmen und/oder zu speichern. Ein Schwamm kann ein synthetischer und/oder natürlicher Schwamm sein.
Generell kann das Trägermaterial aus jedem synthetischen und/oder nicht-synthetischen Material und/oder jeder synthetischen oder nicht-synthetischen Materialkombination hergestellt sein.
Generell kann das Trägermaterial eine Kombination aus mehreren Geweben und/oder Materialen und/oder Stoffen sein.
Generell kann das Trägermaterial aus Kohlehydraten aufgebaut sein.
Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist. Bei einem Trägermaterial, das in einem Elutionsfluid lösbar ist kann vermieden werden, dass nach Freigabe der Komponente in das Elutionsfluid möglicherweise ungewollt störendes Trägermaterial im Elutionfluid vorliegt. Insbesondere kann so auch vermieden werden, dass ein Verlust an Elutionsfluid verzeichnet werden muss, dadurch, dass ein Volumenanteil des Elutionsfluids im Trägermaterial gebunden ist.
Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial ein Zucker, Protein und/oder Polymer ist oder ein Gemisch aus diesen oder ähnlichen wasserlöslichen Materialien.
Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial eine lösbare Tablette ist.
Weiter ist denkbar, dass das das Trägermaterial eine Dicke größer als 0,1 mm und einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
Diese Dimensionen des Trägermaterials ermöglichen die Aufnahme und/oder Bindung eines gewissen Flüssigkeitsvolumens.
Weiter ist vorstellbar, dass das Trägermaterial eine weitgehend runde Form aufweist.
Insbesondere ist es möglich, dass das Trägermaterial eine kreisrunde Form aufweist.
Denkbar ist, dass eine runde Form des Trägermaterials das passgenaue einbringen des Trägermaterials in ein rundes Reaktionsgefäß ermöglicht. Es ist möglich, dass das Trägermaterial aus einem Rohling ausgestanzt und/oder ausgeschnitten wurde.
Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat. Ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml kann bewirkten, dass auch bei niedrig konzentrierten Flüssigkeiten eine ausreichende, definierte Menge einer Komponente aufgenommen wird. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Kitsystem.
Es ist denkbar, dass ein Kitsystem folgendes umfasst:
- ein Reaktionsgefäß, welches zur Aufnahme eines Fluids geeignet ist;
- ein Trägermaterial, wobei das Trägermaterial mindestens eine Komponente umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, und wobei das Trägermaterial in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß eingebracht ist.
Die Komponente kann eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 und einem Markierungsmolekül umfassen, wobei das Markierungsmolekül vorzugsweise mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Ein erfindungsgemäßes Kitsystem ermöglicht eine einfache und schnelle Durchführung eines Versuches, zum Beispiel eines Bioassays. Ein erfindungsgemäßes Kitsystem erlaubt es einem Anwender bei Einsatz des Kitsystems genau definierte, standardisierte Bedingungen anzuwenden, sodass, mit dem Kitsystem durchgeführte Versuche und/oder Testreihen, sowie deren Ergebnisse untereinander direkt vergleichbar sind.
Ein Reaktionsgefäß kann generell jede Form von Behälter sein. Insbesondere ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß ein Röhrchen ist.
Generell ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß zum Erfassen jedes erdenklichen Volumens ausgebildet sein kann (z.B. 10OmI, 200mI, 1 ,0 ml, 1 ,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500mL, 1 L). Es ist generell möglich, dass auf dem Reaktionsgefäß eine Füllstandanzeige (z.B. in ml) angebracht ist. Dies ermöglicht das direkte Ablesen von in das Reaktionsgefäß eingebrachten Volumina von Flüssigkeiten, z.B. eines Elutionsfluids.
Ferner ist denkbar, dass die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist.
Weiter ist vorstellbar, dass das Reaktionsgefäß nahezu luftdicht verschließbar ist, insbesondere mit einem Deckel.
Der Deckel kann beispielsweise ein Schraubverschluss, ein Klickverschluss, eine Kapsel, ein Stopfen, eine Scheibe und/oder eine Folie sein. Ein nahezu luftdichter Verschluss des verschließbaren Reaktionsgefäßes ermöglicht eine Stabilisierung des Trägermaterials (und/oder der Komponente), insbesondere gegen Kontaminationen aller Art, z.B. mikrobielle Kontamination(en), z.B. durch Bakterien und/oder Pilze. Ferner ermöglicht der nahezu luftdichte Verschluss des Reaktionsgefäßes eine Stabilisierung des Trägermaterials gegen Umwelteinflüsse, z.B. hohe und/oder schwankende Luftfeuchtigkeit. Ein nahezu luftdichter Verschluss des verschließbaren Reaktionsgefäßes kann zudem das Halten von Schutzgasen in dem Reaktionsgefäß ermöglichen, was ebenso eine Stabilisierung des Trägermaterials (und/oder der Komponente) ermöglicht.
Generell kann das Reaktionsgefäß wiederverschließbar sein.
Vorstellbar ist, dass das Trägermaterial im Deckel des Reaktionsgefäßes angebracht ist. Das Einbringen des T rägermaterials in den Deckel des Reaktionsgefäßes ermöglicht eine einfache Handhabung des Reaktionsgefäßes selbst, beispielsweise kann es so ermöglicht werden, dass ein Volumen einer sich in dem Reaktionsgefäß befindlichen Flüssigkeit mit Hilfe einer auf dem Reaktionsgefäß befindlichen Füllstandanzeige korrekt abgelesen werden kann, ohne dass das scheinbare Volumen der Flüssigkeit durch ein frei in der Flüssigkeit schwimmendes Trägermaterial verfälscht wird.
Insbesondere ist vorstellbar, dass das Trägermaterial in den Deckel des Reaktionsgefäßes hineingespannt und/oder geklickt wird.
Es ist generell auch möglich, dass das Trägermaterial in den Deckel geklebt wird. Das Kitsystem kann für die Herstellung einer Proteinlösung verwendet werden, insbesondere für den Nachweis einer Bindung eines Analyten an ein Protein, wobei sich das Protein in der Proteinlösung befindet. Das Protein kann insbesondere einen Antikörper, einen Rezeptor, ein Enzym, eine Rezeptor-bindende Domäne oder ein Rezeptor-bindendes Motiv umfassen. Möglich ist, dass der Analyt ein Protein, ein Virus, ein Viruspartikel, ein virales Protein, ein Bakterium, ein bakterielles Protein oder ähnliches umfasst.
Insbesondere kann das erfindungsgemäße Trägermaterial und/oder Kitsystem in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus eingesetzt werden.
Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials und/oder Kitsystems in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung des Analyten an das rekombinante Angiotensin konvertierende Enzym 2 (ACE2).
Ein„Analyt", im Sinne der vorliegenden Erfindung, bezieht sich auf ein Molekül, das über die Bindung eines Bindungspartners an eine Bindestelle des Analyten nachgewiesen werden kann.
Denkbar ist auch, dass der Analyt einen Antikörper und/oder Fragment eines Antikörpers und/oder ein Epitop eines Antikörpers umfasst.
Denkbar ist auch, dass der Analyt ein oder mehrere Kohlenhydrate, Lipide, DNA, RNA, komplexe organische Moleküle wie Enzymhemmer, Rezeptorbindemittel, Hormone und/oder pharmazeutische Verbindungen und/oder Verbindungen aus einem oder mehreren Stoffen umfasst.
Ein Analyt kann ein Protein umfassen, wobei eine Bindungsstelle als ein Teil des Proteins vorliegt, an welche der Bindungspartner (ACE2) selektiv bindet (mit anderen Worten: der Analyt kann an der Bindungsstelle selektiv an seinen Bindungspartner (ACE2) binden).
Ein Analyt kann ein Protein umfassen, insbesondere kann der Analyt ein einzelnes Peptid und/oder Polypeptid sein, aber auch ein Komplex aus verschiedenen Polypeptiden. Insbesondere kann ein Analyt auch bakterielle, oder virale Proteine umfassen, beispielswiese Oberflächenproteine, beispielswiese Spike-Proteine oder Spike-Protein Trimere. Insbesondere kann ein Spike-Protein Trimer auch als Spike-Protein verstanden werden. Insbesondere kann ein Protein auch ein oder mehrere Glykoproteine umfassen. Die Erfindung hat demnach den Vorteil, dass Erreger, insbesondere Viren oder Bakterien mittels ihrer Oberflächenproteine nachgewiesen werden können. Sowohl der Erreger selbst, als auch die Oberflächenproteine können als Analyt bezeichnet werden.
Insbesondere ist denkbar, dass der Analyt mindestens ein virales Spike-Protein des Sars-CoV- 2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfasst, wobei das mindestens eine virale Spike-Protein an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet. Insbesondere bindet das das mindestens eine virale Spike-Protein an das rezeptorbindende Motiv des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2.
Denkbar ist auch, dass das mindestens eine virale Spike-Protein ein Spike-Protein Trimer des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfasst, wobei das Spike-Protein- Trimer an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet. Insbesondere bindet das Spike-Protein-T rimer an das rezeptorbindende Motiv des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2.
Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen T rägermaterials oder eines erfindungsgemäßen Kitsystems zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus.
Der Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus muss jedoch nicht an ein Trägermaterial oder Kitsystem gebunden sein, sondern kann auch unabhängig von dem beschriebenen Trägermaterial oder Kitsystem erfolgen.
Des Weiteren umfasst die Erfindung die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HGov-NL.63 Virus, zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Analyten an rekombinantes Angiotensin-konvertierendes Enzym 2, wobei die Komponente eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst und wobei der Analyt mindestens ein virales Spike-Protein des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfasst, wobei das virale Spike-Protein an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet. Insbesondere ist denkbar, dass ein Nanopartikel eine Größe von 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm Durchmesser aufweist; dadurch ist die Größe des Markierungsmoleküls kleiner oder maximal gleich groß ist wie der Abstand zwischen den einzelnen Spike-Proteinen auf der Oberfläche der Viren.
Die Erfindung ist nicht auf den Nachweis des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov- NL63 Virus beschränkt. Des Weiteren umfasst die Erfindung die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zum Nachweis eines Erregers, zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Analyten an einen Bindungspartner, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Bindungspartner und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst, wobei der Analyt in vielfacher Anzahl mit einem im Wesentlichen gleichen Abstand auf der Oberfläche des Erregers angeordnet ist, wobei die Größe des Markierungsmoleküls so an den Abstand zwischen den einzelnen Analyten der vielfachen Anzahl des Analyten angepasst ist, dass eine Bindung des Analyten an den Bindungspartner ermöglicht wird. Insbesondere wird dies ermöglicht, wenn die Größe des Markierungsmoleküls kleiner oder maximal gleich groß ist wie der Abstand zwischen den einzelnen Analyten der vielfachen Anzahl des Analyten.
Der Erreger kann generell unter anderem ein Bakterium, Virus, Pilz, Schimmelpilz oder Prion umfassen.
Ein Vorteil der Erfindung ist, dass über die Morphologie des Analyten, insbesondere auch über den Abstand zwischen einzelnen Analyten einer vielfachen Anzahl von Analyten auf der Oberfläche eines Erregers und die Größe des Markierungsmoleküls ein Nachweis eines Erregers ermöglicht werden kann. Explizit wird dies im Folgenden am Beispiel des SARS- CoV2 Virus (Analyt) erläutert:
SARS-Cov2 gehört zur Familie der Coronaviren, deren Virionen charakteristische Partikel der Größe 80-160 nm mit einer Krone aus multiplen, etwa 20 nm langen Kronblatt-förmigen Zacken aufweisen.
Die Zacken werden durch Spike-Protein-Trimere gebildet, die an ihrem äußeren Ende die Rezeptor-Bindestelle für die Zellaufnahme tragen. Aufgrund der vergleichsweise homogenen Verteilung lässt sich ein mittlerer Abstand von ca. 14 nm zwischen den Rezeptor-Bindestellen der einzelnen Spike-Trimere annehmen (Neuman et al., Supramolecular Architecture of Severe Acute Respiratory Syncrome Coronavirus Revealed by Electron Cryomicroscopy, Journal of Virology, 2006).
Die Rezeptor-Bindestelle der SARS-Corona Viren (umfassend Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus) ist spezifisch für das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2).
Die Erfindung kann die Charakteristika des Virus nutzen, um geeignete molekulare Sonden spezifisch an die Oberfläche der Viren zu binden und dadurch die Eigenschaften der Sonde so zu verändern, sodass ein spezifischer Nachweis ermöglicht wird. Als Sonden eignen sich für das Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus Nanopartikel, z.B. Goldnanopartikel geeigneter Größe (insbesondere 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm), die mit ACE2 Molekülen (insbesondere rekombinanten ACE2 Molekülen) dekoriert sind. Die Sonden arrangieren sich aufgrund Ihrer Größe in den Zwischenräumen der Spike-Protein-Trimere und bilden eine äußere Schicht. Aufgrund der räumliche Nähe der Nanopartikel kommt es zu einer Kopplung der Plasmonresonanz und damit zu einer Rotverschiebung und damit verbundenen Verstärkung der sichtbaren roten Farbe. Eine Lösung der zuvor kaum wahrnehmbaren Goldnanopartikel (insbesondere 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm), erscheint deutlich rot, eine Lösung größerer, roter Goldnanopartikel wird violett.
Der Nachweis kann am in Lösung befindlichen Analyten erfolgen (z. B. nach Freigabe der Komponente aus dem Trägermaterial). Der gelöste Analyt kann beispielsweise über einen Abstrich-T upfer eingebracht werden, aus einer Spülung entnommen oder auch aus dem Atem- Aerosol gewonnen werden. Letzteres ist besonders vorteilhaft, da die Probennahme auch bei sonst eher unwilligen Testpersonen, wie z.B. Kinder oder schwer Kranke, geistig eingeschränkte oder auch bewusstlose Personen unkompliziert vollzogen werden kann. Eine direkte Verwendung von z.B. bei Beatmung künstlich erzeugtem Aerosol ist ebenfalls denkbar. Die Probennahme kann also durch Einleitung von Ausatemstößen in eine Analyseflüssigkeit erfolgen. Auch der Einsatz von Blut ist generell möglich.
Der Nachweis von Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus erfolgt erfindungsgemäß nicht wie im Stand der Technik üblich über einen spezifischen Antikörper, der die Identität des Virus gegenüber verwandten Viren untersucht, sondern über das rekombinant hergestellte Zielmolekül (Rezeptor, ACE2) des Virus. Dies ist vorteilhaft, da rekombinante Proteine deutlich einfacher und preisgünstiger herstellbar sind, als Antikörper. Des Weiteren ist der Einsatz des natürlichen Zielproteins vorteilhaft, da das Virus hierbei nicht durch Mutation dem Nachweis entgehen kann. Mutiert das Virus so, dass es nicht mehr an den Rezeptor binden kann, kann es auch nicht mehr die schwere Erkrankung hervorrufen. So reduziert dieser Ansatz das Risiko der Entwicklung eines aufgrund des Mutationspotentials des Virus ineffizienten Nachweises.
Aufgrund der Übereinstimmung des Zielmoleküls zwischen SARS-CoV, SARS-CoV2 und NL63 kann der Nachweis nicht zwischen diesen Viren unterscheiden. Alle drei Viren binden an die gleiche Stelle des ACE2-Rezeptors, weisen die gleiche Morphologie auf und sind gleich groß. Da die Bindung an den ACE2-Rezeptor ein wesentlicher Bestandteil der möglichen Schwere der Erkrankung ist, wird jedoch das Vorhandensein eines potentiell schwerwiegenden Virus angezeigt, sowohl für die nunmehr bekannten ACE2-bindenden Viren, als auch für zukünftige. Der potentielle Virus-Verbreiter kann umgehend isoliert und die Proben einer eingehenden, diagnostischen Analytik zugeführt werden.
Ein besonderer Vorteil der Erfindung liegt zudem in der möglichen Verwendung von Aerosolen, bzw. dem Ausatemstrom. Da hier quasi unbegrenzt Probe gewonnen werden kann, lässt sich die Nachweisgrenze fast beliebig verschieben und über das bis zum Nachweis benötigte Ausatemvolumen eine Gefährdungseinschätzung vornehmen.
Auch Probenpooling zur weiteren Reduktion des Materials ist möglich, um Gruppen wie z.B. Schulklassen oder andere Gruppen, wie Flugzeugpassagiere, Arbeitsteams, Spielgruppen, o.ä. ohne Zeitverzug zu testen, bevor sie in räumliche Nähe treten.
Ein erfindungsgemäßes Trägermaterial, Kitsystem und/oder Verfahren ermöglicht also eine, einfache und kostengünstige Identifikation potentieller Verbreiter einer SARS-CoV, SARS- CoV2 oder HCov-NL63 Infektion.
Weiterhin umgeht die vorliegende Erfindung Nachteile bisher bekannter Verfahren zur Detektion von SARS-CoV2:
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Trägermaterials zur Detektion von SARS-CoV2, SARS-CoV oder HCov-NL63 ermöglicht eine sichere Detektion einer entsprechenden Infektion schon vor dem Auftreten von krankheitsbedingten Symptomen (Im Gegensatz zu zum Nachweis einer Antikörperreaktion gegen die genannten Viren, welche erst einige Tage nach der Infektion messbar ist). Gerade bei SARS-CoV2 ist jedoch die Ansteckungswahrscheinlichkeit sogar vor Auftreten erster Symptome am höchsten.
Insbesondere ist es auch möglich, dass ein Trägermaterial bereitgestellt wird, umfassend mindestens eine Komponente, wobei die Komponente adhäsiv an das Trägermaterial gebunden und/oder auf dem Trägermaterial immobilisiert und/oder eingetrocknet ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst. Ferner ist ein entsprechendes Kitsystem denkbar.
Auch die Verwendung eines Trägermaterials und/oder entsprechenden Kitsystems in einem Antikörperscreening oder Zellscreening ist möglich.
Möglich ist zudem die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zum Screening von Antikörpern gegen das Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov- NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Als Analyt kann ein Antikörper denkbar sein, wobei ein geeigneter Antikörper spezifisch an mindestens ein Spike-Protein und/oder eine Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars- CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL.63 Virus die Antikörper bindet. Somit wird eine Neutralisierung des Virus ermöglicht. Ein ungeeigneter Antikörper bindet nicht oder schlecht an das mindestens ein Spike-Protein und/oder die mindestens eine Spike-Protein Rezeptor Bindestelle. Das Verfahren ermöglicht es, spezifische von unspezifischen Antikörpern zu unterscheiden. Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Antikörper spezifisch an die S1 Untereinheit des SARS-CoV2 (Val16-Arg685) binden soll. Mit anderen Worten, die Komponente kann die S1 Untereinheit des SARS-CoV2 (Val 16- Arg 685) (als Rezeptor-bindende Domäne) und ein Markierungsmolekül, beispielsweise einen Gold-Nanopartikel, umfassen.
Insbesondere kann vorgesehen sein, dass der Antikörper spezifisch an die Rezeptorbindestelle (RBD) des SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Protein (RBD) (YP 009724390.1 ) (Arg319-Phe541 ) binden soll. Mit anderen Worten, die Komponente kann die PBD der S1 Untereinheit des SARS-CoV2 (Arg319-Phe541 ) und ein Markierungsmolekül, beispielsweise einen Gold-Nanopartikel, umfassen.
Des Weiteren ist die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zum Screening von Zellen zur Überprüfung der Expression von membranständigen oder sekretiertem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 oder des rezeptorbindenden Motivs des Angiotensin-konvertierenden Enzym 2 denkbar, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars- CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Als Analyt kann membranständiges und/oder sekretiertes Angiotensin-konvertierende Enzym 2 denkbar sein (unterschiedlicher Zellen oder Zelllinien), wobei ein Spike-Protein und/oder eine Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov- NL63 Virus das membranständiges und/oder sekretiertes Angiotensin-konvertierende Enzym 2 oder das entsprechende rezeptorbindenden Motifs des Angiotensin-konvertierenden Enzym 2 bindet. Somit wird eine Neutralisierung des Virus ermöglicht.
Insbesondere ist auch die Verwendung eines Trägermaterials und/oder entsprechenden Kitsystems in der Einbringung von Virus-Simulationspartikeln möglich.
Darüber hinaus ist die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zur Einbringung von Virus-Simulationspartikeln, insbesondere in Zielzellen, denkbar, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike- Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Ferner kann die Komponente umfassen:
• Tag mit Maus-Fc auf Sulfat-modifiziertem, orange fluoreszierendem Polystyrol (PS), insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Tag mit Maus-Fc auf unmodifiziertem Polystyrol (PS), insbesondere 20-500nm
Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Tag mit Maus-Fc auf Protein A modifizierten Polystyrol (PS) 100 nm Durchmesser, insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Poly-Histidin-T ag auf Gold-Nanopartikeln, insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser.
Insbesondere ist ein Tag als Anhang und/oder ein Maus-Fc als Fc-Fragment (Antikörperfragment das durch Spaltung von Immunglobulin G entsteht, das Fc-Fragment enthält die rezeptorbindende Domäne) aus der Spezies Maus zu verstehen.
Des Weiteren ist die Verwendung mindestens einer Komponente in einem Verfahren zur Behandlung von Infektionskrankheiten, welche durch das Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL.63 Virus ausgelöst werden, denkbar, wobei die Komponente eine Verbindung aus Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 oder dem rezeptorbindenden Motiv des Angiotensin-konvertierendem Enzym 2, insbesondere rekombinantem Angiotensin konvertierendem Enzym 2 oder rekombinantem rezeptorbindenden Motiv des Angiotensin- konvertierendem Enzym 2, und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel der Größe 1 -14 nm, insbesondere 4-12 nm, insbesondere 8-10 nm umfasst.
Lösliches humanes ACE2 wird zu therapeutischen Zwecken geprüft. Da ACE2 ein Hormon im Renin-Angiotensin-Aldosteron-System ist, kann eine hohe Dosierung, wie sie therapeutisch erforderlich ist, riskant sein. Es ist Stand der Technik, das Arzneimittel an Nanopartikel gebunden in geringerer Dosierung verabreicht werden können, da ihre Blutzirkulationszeit so verlängert wird. Für diese Zwecke werden meist Nanopartikel im Bereich 30 bis 50 nm untersucht. Diese würden hier jedoch zu einer Virus-vermittelten Agglomeration führen können und somit zu Thrombosen. Eine Anwendung der kleinen Nanopartikel (Größe 1 -14 nm, insbesondere 4-12 nm, insbesondere 8-10 nm), die sich in die Zwischenräume der Spike- Protein-Trimere anordnen, würde Agglomeration vermeiden und gleichzeitig die Viren inaktivieren.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Kitsystems nach einem der Ansprüche 1 1 -14 für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay. Die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay, wie zum Beispiel einer Antikörperlösung für einen Immunassay, hat den Vorteil, dass Assays mit möglichst geringem Zeitaufwand durchgeführt werden können. Insbesondere ist dies durch das Wegfallen und/oder Verkürzen von üblicherweise durchgeführten Blockier- und/oder Inkubations- und/oder Waschschritten zu erklären. Zudem können durch die Verwendung eines erfindungsgemäßen Kitsystems für die Herstellung eines Analysefluids, wie zum Beispiel einer Antikörperlösung für einen Immunassay, beispielsweise einen Western Blot, Dot Blot, Slot Blot, ELISA, Radioimmunassay, Immunmarkierung und/oder Immunhistochemie, standardisierte Bedingungen gewährleistet werden, sodass mit dem Kitsystem durchgeführte Versuche und/oder Testreihen, sowie deren Ergebnisse miteinander vergleichbar sind.
Des Weiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran und/oder anderer, geeigneter Oberfläche, beispielsweise der Oberfläche einer ELISA-Platte.
Das Verfahren kann mindestens die folgenden Schritte umfassen:
- Beladung eines Trägermaterials mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Verbindung aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Marker;
- Adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial;
- Trocknung des Trägermaterials;
- Einbringen des Trägermaterials in ein trockenes Reaktionsgefäß;
- Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß, wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet;
- Aufbringen des Analysefluids auf die Membran;
- Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über den Marker. Ferner ist vorstellbar, dass das Verfahren einen oder beide weitere folgende Schritte umfasst:
- Vorbehandlung des Trägermaterials mit einem Fluid und/oder
- Einbringung von Zusatzstoffen zur aufzutragenden Komponente
Das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran umfasst weniger Verfahrensschritte als nach dem Stand der Technik durchgeführte Verfahren. Beispielsweise sind im erfindungsgemäßen Verfahren im Vergleich zu dem nach dem Stand der Technik durchgeführten Verfahren keine Wasch- und/oder Blockierungsschritte erforderlich, was den Vorteil einer Zeitersparnis mit sich bringt. Des Weiteren verringern sich die Prozessschritte des Verfahrens, da die nacheinander durchzuführende Inkubation von Primär- und Sekundärantikörper, wie es bei indirekten Assays angewandt wird nicht erforderlich.
Ferner wird durch das Trocknen des Trägermaterials die adhäsiv an das Trägermaterial gebundene Komponente stabilisiert, was zu einer geringeren Fehleranfälligkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber den nach dem Stand der Technik durchgeführten Verfahren führt. Insgesamt ist während des Verfahrens eine einfache Handhabung der Komponente möglich, da die Komponente portionsgerecht und stabilisiert vorliegt und nicht wie üblich auf Eis und/oder in einer Kühlung gearbeitet werden muss. Bei Verwendung Goldnanopartikel markierter Antikörper als Komponente ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren direkt den Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten. In den üblichen Verfahren sind in der Regel aufwendige und/oder teure Detektionsverfahren und/oder Detektionssysteme nötig (unter anderem Phosphoimager, Röntgenfilme, CCD Kameras und/oder Fluoreszenzdetektorsysteme).
Das erfindungsgemäße Trägermaterial und/oder Kitsystem und/oder Verfahren kann generell für Bioassays und vor allem für direkte und indirekte Immunassays und/oder nicht kompetitive Immunassays oder kompetitive Immunassays verwendet werden.
Mögliche Anwendungsgebiete des erfindungsgemäßen Trägermaterials und/oder Kitsystems und/oder Verfahrens umfassen beispielsweise die Diagnostik und/oder Analytik in den Lebenswissenschaften (Biologie, Medizin, Biomedizin, Pharmazie, Biochemie, Chemie, Molekularbiologie, Biophysik, Bioinformatik, Humanbiologie, Forensik, Agrarwissenschaft, Agrartechnologie, Ernährungswissenschaft, Lebensmittelforschung, etc.). Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung sollen nun anhand eines/der in den Zeichnungen dargestellten Ausführungsbeispiels/e näher erläutert werden.
Es zeigen:
Fig. 1 : eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials;
Fig. 2: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der
Fierstellung eines erfindungsgemäßes Trägermaterials;
Fig. 3: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems umfassend ein erfindungsgemäßes Trägermaterial gemäß Fig. 1 ;
Fig. 4: eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Fierstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems gemäß Fig. 3.
Fig. 5: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines gängigen
Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran;
Fig. 6: eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran;
Fig. 7: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem
Dot-Blot direkt;
Fig. 8: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem
Dot-Blot indirekt;
Fig. 9: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem
Western Blot direkt; Fig. 10: eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem
Western Blot indirekt;
Fig. 1 1 : eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials; und
Fig. 12: eine schematische Darstellung die Verwendung einer Komponente in einem
Verfahren zum Nachweis eines Erregers.
Fig. 1 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T ein poröses Material.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T ein Fasergewebe.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T aus Baumwoll-Linter.
Alternativ und/oder zusätzlich kann das Trägermaterial T Zellulose, Glasfasern, Polymerfasern, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/der einen Schwamm umfassen.
In anderen Worten, generell kann das Trägermaterial T mindestens ein poröses Material umfassen, insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwoll-Linter und/der einen Schwamm.
Generell ist es möglich, dass das Trägermaterial T mehrere poröse Materialien umfasst.
Generell kann das Trägermaterial eine Kombination aus mehreren Geweben und/oder Materialen und/oder Stoffen sein.
Generell kann das Trägermaterial aus Kohlehydraten aufgebaut sein.
Im Übrigen kann vorgesehen sein, dass das Trägermaterial mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist. Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial ein Zucker, Protein und/oder Polymer ist oder ein Gemisch aus diesen oder ähnlichen wasserlöslichen Materialien.
Denkbar ist insbesondere, dass das Trägermaterial eine lösbare Tablette ist.
In diesem Ausführungsbeispiel weist das Trägermaterial T eine weitgehend runde Form auf.
Alternativ kann das Trägermaterial T in jeder erdenklichen anderen Form vorliegen.
Alternativ kann das Trägermaterial T in jede erdenkliche andere Form gebracht werden.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass das Trägermaterial T eine Dicke von 0,75 mm hat.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass das Trägermaterial T einen Durchmesser von 13 mm hat.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T eine Dicke größer als 0,1 mm aufweist.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass das Trägermaterial T ein Bindungsvolumen von 0,1 mL 0,5 ml hat.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass Trägermaterial T alternativ mindestens ein poröses Material umfassen kann und in einem Elutionsfluid lösbar sein kann.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass das Trägermaterial T geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
Das Trägermaterial T umfasst eine Komponente K. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden.
Alternativ kann die Komponente K auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder Eingetrocknet sein.
Generell ist es möglich, dass eine Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden und/oder auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder ein getrocknet ist.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass die Komponente K eine Verbindung aus einem ersten Stoff und einem zweiten Stoff umfasst.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfassen kann.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass das Trägermaterial T auch mehr als eine Komponente K umfassen kann, wobei die mehr als eine Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden und/oder auf dem Trägermaterial T immobilisiert und/oder eingetrocknet sein kann.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der erste Stoff der Komponente K ein Bindungspartner für einen Analyten.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der erste Stoff der Komponente K ein spezifischer Bindungspartner für einen Analyten.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein Antikörper.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein polyklonaler Antikörper.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der spezifische Bindungspartner für den Analyten ein polyklonaler Sekundärantikörper gegen in Maus erzeugte, Analyt-spezifische Erstantikörper.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der zweite Stoff ein Markierungsmolekül N. In diesem Ausführungsbeispiel ist das Markierungsmolekül N ein Nanopartikel.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Nanopartikel ein Gold-Nanopartikel.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass es generell möglich ist, dass der erste Stoff der Komponente einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody und/oder chemischen Ligand umfasst und wobei der zweite Stoff einen Marker umfasst, wobei die Markierung mindestens einen Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein -Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass alternativ die mindestens eine Komponente K keine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff sein muss.
Nicht gezeigt in Fig. 1 ist, dass die mindestens eine Komponente K mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, chemischen Ligand, Farbstoff, Fluorochrom, Fluorophor, Luminophor, Enzym, Peptid, Biotin, Oligonukleotid, Protein-Tag, radioaktives Isotop, nicht radioaktives Nuklid, Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfassen kann.
Fig. 2 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der Fierstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Fierstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T die Schritte S1 -S4.
Es ist generell möglich, dass die Fierstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S1 -S4 umfasst.
Es ist generell möglich, dass die Fierstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S1 -S4 umfasst. In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in einem ersten Schritt S1 vorbehandelt.
Durch die Vorbehandlung wird ein Milieu geschaffen, dass die Komponenten vor allem während des Trocknungsvorgangs, aber auch bei der Lagerung stabilisiert.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einer Lösung vorbehandelt.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einem Puffer vorbehandelt.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in einem Puffer inkubiert.
Es ist generell möglich, dass das T rägermaterial T mit jeder Form von Fluid vorbehandelt wird.
Es ist generell möglich, dass das T rägermaterial T mit jeder Form von Fluid vorbehandelt wird, welches Proteine oder Peptide enthält.
Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T mit einem Fluid vorbehandelt wird, welches Zusatzstoffe enthält.
Generell ist es möglich, dass das Trägermaterial T mit mehreren Fluiden vorbehandelt wird.
Es ist generell möglich, dass die Zusatzstoffe Kohlenhydrate, vor allem Zucker, vor allem Saccharose und/oder Trehalose, Tenside, vor allem Polysorbat 80, Proteine, vor allem Bovines Serum Albumin (BSA), Antioxidantien und/oder Polyethylenglycol (PEG) und/oder weitere Stoffe sind.
In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem zweiten Schritt S2 das Trägermaterial T nach der Vorbehandlung getrocknet.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T nach der Vorbehandlung luftgetrocknet.
Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Trocknungsverfahren denkbar. Es ist generell möglich, dass das Trocknungsverfahren in einem Inkubator stattfindet.
Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T vakuumgetrocknet wird.
Alternativ ist es möglich, dass keine Vorbehandlung des Trägermaterials T stattfindet.
Es ist generell möglich, dass keine Vorbehandlung des Trägermaterials T und/oder keine Trocknung nach der Vorbehandlung des Trägermaterials stattfindet.
In anderen Worten, es ist generell möglich, dass die Schritte S3-S4 die Schritte S1 -S4 ersetzten.
In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem dritten Schritt S3 ein Trägermaterial T mit der Komponente K beladen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff, vgl. Fig. 1.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T durch Auftropfen eines bestimmten Volumens einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K mit der Komponente K beladen.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einem vorbestimmten Volumen einer Lösung einer bekannten Konzentration der Komponente K beladen.
In anderen Worten, in diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T mit einer definierten Menge der Komponente K beladen.
Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Verfahren möglich, um das Trägermaterial T mit der Komponente K zu beladen.
Denkbar sind Verfahren wie Sprühen, Tauchen, Injizieren und/oder weitere Verfahren.
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Komponente K adhäsiv an das Trägermaterial T gebunden. In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen.
In einem vierten Schritt S4 wird das mit der Verbindung beladene Trägermaterial T getrocknet.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T luftgetrocknet.
Generell sind alternativ und/oder zusätzlich andere Trocknungsverfahren denkbar.
Es ist generell möglich, dass das Trocknungsverfahren in einem Inkubator stattfindet.
Es ist generell möglich, dass das Trägermaterial T vakuumgetrocknet wird.
Fig. 3 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems KS umfassend ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T gemäß Fig. 1 .
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Kitsystem KS ein Reaktionsgefäß R.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Kitsystem KS ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T.
Das in Fig. 1 dargestellte Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Trägermaterials T weist im Wesentlichen dieselben strukturellen und funktionalen Merkmale wie das Trägermaterial T des in Fig. 3 dargestellten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Kitsystems KS auf.
In diesem Ausführungsbeispiel hat das Reaktionsgefäß R eine Öffnung.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R verschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R wiederverschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R verschlossen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht verschließbar. ln diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht wiederverschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R nahezu luftdicht verschlossen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D verschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D wiederverschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D verschlossen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D nahezu luftdicht verschließbar.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R mit einem Deckel D nahezu luftdicht verschlossen.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Deckel D des Reaktionsgefäßes R ein
Schraubverschluss.
Alternativ und/oder zusätzlich kann der Deckel D des Reaktionsgefäßes R ein Schraubverschluss, ein Klickverschluss, eine Kapsel, ein Stopfen, eine Scheibe, eine Folie und/oder ein anderes Verschlusssystem sein.
In diesem Ausführungsbeispiel hat das Reaktionsgefäß R ein Fassungsvolumen von 15 ml.
Generell ist es möglich, dass das Reaktionsgefäß R zum Erfassen jedes erdenklichen Volumens ausgebildet ist (z.B. 100 mI, 200mI, 1 ,0 ml, 1 ,5 ml, 2 ml, 5 ml, 15 ml, 25 ml, 50 ml, 100 ml, 200 ml, 500 ml, 1 1).
In diesem Aufführungsbeispiel ist das Trägermaterial T in dem Reaktionsgefäß R eingebracht.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß R eingebracht. In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T im Deckel D des Reaktionsgefäßes R angebracht.
Alternativ und/oder zusätzlich kann das Trägermaterial T am Boden oder an der Wand des Reaktionsgefäßes R angebracht sein
Alternativ und/oder zusätzlich kann ein erfindungsgemäßes Trägermaterial T an jede beliebe Stelle eines Reaktionsgefäßes R eingebracht sein.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Reaktionsgefäß R zur Aufnahme eines Fluids geeignet.
Nicht gezeigt in Fig. 3 ist, dass das Trägermaterial T geeignet ist, ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
Nicht gezeigt in Fig. 3 ist, dass das Kitsystem KS für die Herstellung eines Analysefluids für einen Bioassay verwendet werden kann.
Nicht gezeigt in Fig. 3 ist, dass das Kitsystem KS für die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay verwendet werden kann.
In Fig. 3 ist auch nicht gezeigt, dass das Kitsystem für die Herstellung einer Proteinlösung verwendet werden kann, insbesondere einer Proteinlösung für den Nachweis einer Bindung eines Analyten an ein Protein, wobei sich das Protein in der Proteinlösung befindet.
Fig. 4 zeigt eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß Fig. 3.
Das in Fig. 4 dargestellte erste Ausführungsbeispiel der erfindungsgemäßen Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß Fig. 3 umfasst zunächst die Schritte S1 -S4 des in Fig. 2 dargestellten ersten Ausführungsbeispiels der erfindungsgemäßen Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T. In diesem Ausführungsbeispiel sind die Schritte S1 -S4 des in Fig. 2 dargestellten Verfahrens die Schritte S1 1 -S14.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß Fig. 3 die Schritte S1 1 -S16.
Es ist generell möglich, dass die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß Fig. 3 eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S1 1 -S16 umfasst.
Es ist generell möglich, dass die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay unter Verwendung des erfindungsgemäßen Kitsystems KS gemäß Fig. 3 eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S1 1 -S16 umfasst.
In einem fünften Schritt S15 wird in diesem Ausführungsbeispiel ein Reaktionsgefäß R mit dem Trägermaterial T umfassend die Komponente K bestückt.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Trägermaterial T in das ansonsten trockene Reaktionsgefäß R eingebracht.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass es generell möglich ist, dass das Trägermaterial T schon vor der Vorbehandlung und/oder vor der Beladung mit der Komponente K in das Reaktionsgefäß eingebracht ist.
In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem sechsten Schritt S16 das mit dem Trägermaterial T beladene Reaktionsgefäß R mit einem Elutionsfluid befüllt.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass das Elutionsfluid ein Puffer ist.
Nicht gezeigt in Fig. 4, ist, dass jede Lösung als Elutionsfluid eingesetzt werden kann.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass das Elutionfluid Proteine und/oder Peptide enthalten kann.
Es ist generell möglich, dass das Elutionsfluid einen spezifischen Bindungspartner umfasst. Es ist generell möglich, dass das Elutionsfluid mit spezifischen Bindungsmolekülen versetzt ist.
In diesem Ausführungsbeispiel wird durch das Elutionsfluid die Komponente K von dem Trägermaterial T gelöst.
In diesem Ausführungsbeispiel kann die erfolgreiche Solvatisierung der Komponente K durch eine Farbveränderung des Elutionsfluids beurteilt werden.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass zur Solvatisierung der Komponente K das Reaktionsgefäß R invertiert wird.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass die Solvatisierung der Komponente alternativ und/oder zusätzlich durch Vibration (Vortex) und/oder Schütteln und/oder andere Verfahren erreicht werden kann.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Trägermaterial T geeignet das bestimmte Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente K, das zuvor aufgenommen wurde, in Anwesenheit des Elutionsfluids wieder freizugeben.
In diesem Ausführungsbeispiel wird durch den Schritt S16 ein Analysefluid gebildet.
In diesem Ausführungsbeispiel wird durch die erfolgreiche Solvatisierung der Komponente aus dem Elutionsfluid ein Analysefluid.
Nicht gezeigt in Fig. 4 ist, dass das Verfahren zur Fierstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay mit dem erfindungsgemäßen Kitsystem KS ein funktionales Analysefluid bekannter Konzentration der Komponente K hervorbringt.
Das Analysefluid kann für den Nachweis von in Flüssigkeiten befindlichen Analyten genutzt werden.
In diesem Ausführungsbeispiel enthält das Elutionsfluid Proteine.
In diesem Ausführungsbeispiel enthält das Elutionsfluid einen Primärantikörper.
Der Primärantiköper ist geeignet spezifisch an einen Analyten zu binden. In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung eines Antikörpers mit einem Gold-Nanopartikel.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung eines Sekundärantikörpers mit einem Gold-Nanopartikel.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Sekundärantikörper geeignet an den Primärantikörper zu binden.
In diesem Ausführungsbeispiel bindet der Sekundärantikörper der Verbindung an den Primärantikörper.
In anderen Worten, es entsteht eine Verbindung zwischen dem mit dem Gold-Nanopartikel markierten Sekundärantikörper mit dem Primärantikörper.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Analysefluid eine Antikörperlösung.
Das Analysefluid kann für den Nachweis von immobilisierten Analyten genutzt werden.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass das Elutionsfluid keinen Primärantikörper enthält.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass die Komponente K eine Verbindung aus einem Primärantikörper und einem Marker umfasst.
In einem alternativen Ausführungsbeispiel ist es denkbar, dass das Analysefluid keinen Sekundärantikörper umfasst.
Fig. 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Analyt ein Protein. Nach einem gängigen Verfahren werden Proteine umfassend den Analyten auf eine Membran transferiert.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran eine Nitrozellulosemembran.
In diesem Ausführungsbeispiel werden in einem vorgelagerten Verfahren die Proteine durch das Verfahren Western Blot auf eine Membran transferiert.
Die Proteine liegen immobilisiert auf der Membran vor.
Generell sind alternativ andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen denkbar.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die Schritte S21 -S26.
Es ist generell möglich, dass das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran eine größere Anzahl an Schritten als die Schritte S21 -S26 umfasst.
Es ist generell möglich, dass das gängige Verfahren nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran eine kleinere Anzahl an Schritten als die Schritte S21 -S26 umfasst.
In einem ersten Schritt S21 wird eine Blockierungslösung zu der Membran gegeben.
Durch die Blockierungslösung werden unspezifische Proteinbindestellen auf der Membran blockiert.
In diesem Ausführungsbeispiel wird das Blockieren durch Inkubation der Membran in einer üblichen Blockierungslösung (z.B. 3-5% (oder andere) BSA in PBS, 3-5% (oder andere) BSA in TBS, Milchpuffer in PBS, oder andere gängige Blockierungslösungen, auch kommerzielle Blockierungslösungen) erreicht.
Die Blockierungslösung wird verworfen. In einem zweiten Schritt S22 wird eine erste Antikörperlösung umfassend einen Primärantikörper in Blockierungslösung gegen einen bestimmten Analyten zu der Membran gegeben.
Die Membran wird mit der ersten Antikörperlösung inkubiert.
Die Inkubation der Membran mit der ersten Antikörperlösung findet üblicherweise bei etwa 4°C für 2 Stunden bis über Nacht statt.
Der Primärantikörper bindet spezifisch an den Analyten.
Die erste Antikörperlösung wird verworfen.
In einem dritten Schritt S23 wird eine Waschlösung zu der Membran gegeben.
Die Membran wird mit der Waschlösung gewaschen.
Generell kann die Waschlösung ein Puffer sein.
Die Waschlösung wird verworfen.
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Membran 3 mal 5 Minuten mit der Waschlösung gewaschen.
Generell ist es möglich, dass die Membran länger oder kürzer und/oder mit weiteren Wasch sch ritten gewaschen wird.
In einem vierten Schritt S24 wird eine zweite Antikörperlösung zu der Membran gegeben.
Die zweite Antikörperlösung umfasst einen Sekundärantikörper, welcher markiert ist und an den Primärantikörper bindet.
Die Membran wird mit der zweiten Antikörperlösung inkubiert.
Der Sekundärantikörper bindet spezifisch an den Primärantikörper. Die Inkubation der Membran mit der zweiten Antikörperlösung findet üblicherweise bei Raumtemperatur für etwa 1 -2 Stunden statt.
Die zweite Antikörperlösung wird verworfen.
In einem fünften Schritt S25 wird eine Waschlösung zu der Membran gegeben.
Die Membran wird mit der Waschlösung gewaschen.
Generell kann die Waschlösung ein Puffer sein.
Die Waschlösung wird verworfen.
In diesem Ausführungsbeispiel wird die Membran 3 mal 5 Minuten mit der Waschlösung gewaschen.
Generell ist es möglich, dass die Membran länger oder kürzer und/oder mit weiteren Wasch sch ritten gewaschen wird.
Die Markierung kann visualisiert werden.
Gängige Visualisierungsmethoden umfassen beispielsweise die Detektion von Fluoreszenz (Fluoreszenzmarkierung) und/oder Chemolumineszenz.
In diesem Ausführungsbeispiel kann die spezifische Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über die Markierung des Sekundärantikörpers visualisiert werden.
In einem sechsten Schritt S26 wird die Markierung durch ein gängiges Visualisierungsverfahren visualisiert.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Markierung ein Fluoreszenzfarbstoff.
In diesem Ausführungsbeispiel wird ein Fluoreszenzdetektionsverfahren zur Visualisierung des Merkers benutzt. Die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten kann über den an den Sekundärantikörper gebundenen Marker quantifiziert werden.
Die gestrichelt umrandeten Verfahrensschritte sind sowohl Bestandteil von Verfahren gemäß dem Stand der Technik als auch nach dem erfindungsgemäßen Verfahren, vgl. Fig. 6.
Fig. 6 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Analyt ein Protein.
Nach einem gängigen Verfahren werden Proteine umfassend den Analyten auf eine Membran transferiert.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Membran eine Nitrozellulosemembran.
Alternativ und/oder zusätzlich kann die Membran aus Nylon, Glasfaser oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) oder anderen Materialien bestehen.
In diesem Ausführungsbeispiel werden in einem vorgelagerten Verfahren die Proteine durch das Verfahren Western Blot auf eine Membran transferiert.
Die Proteine liegen immobilisiert auf einer Membran vor.
Generell sind alternativ andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen denkbar.
Ein erfindungsgemäßes Analysefluid wird gemäß des in Fig. 4 dargestellten Verfahrens mit dem in Fig. 3 dargestellten Kitsystem hergestellt.
Eine erfindungsgemäße Antikörperlösung wird gemäß des in Fig. 4 dargestellten Verfahrens mit dem in Fig. 3 dargestellten Kitsystem hergestellt.
Der Primärantikörper ist geeignet, spezifisch an den Analyten zu binden.
Die Membran wird mit dem Analysefluid inkubiert. Diesem Schritt kann ein weiterer Schritt vorgelagert sein, der das Abspülen der Membran oder das Inkubieren in einem Waschpuffer oder einer Blockierungslösung umfasst. Die Blockierungslösung kann bzw. soll auch als Elutionsfluid benutzt werden.
Diesem Schritt liegt die Überlegung zu Grunde, dass nach dem Blotten die Membran vorteilhafter Weise von Detergenz befreit werden sollte bzw. ist dies in bestimmten Anwendungsfällen auch notwendig, bevor ein Reagenz darauf trifft. Das kann am einfachsten durch Abspülen unter Leitungswasser geschehen. Alternativ kann das das Inkubieren in einem Waschpuffer oder einer Blockierungslösung durchgeführt werden.
In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem Schritt S31 die Membran mit dem Analysefluid inkubiert.
In diesem Ausführungsbeispiel wird in einem Schritt S31 die Membran für einen Zeitraum von 0,5h-2,0h mit dem Analysefluid inkubiert.
Generell sind längere oder kürzere Inkubationszeiten möglich.
Der Primärantikörper bindet spezifisch an einen Analyten.
Das Analysefluid wird verworfen.
In diesem Ausführungsbeispiel kann die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über Markierung des Sekundärantikörpers nachgewiesen werden.
In diesem Ausführungsbeispiel kann die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über den an den Sekundärantikörper gebundenen Gold-Nanopartikel nachgewiesen werden.
Die Gold-Nanopartikel sind direkt sichtbar.
In diesem Ausführungsbeispiel bedarf es keines weiteren Visualisierungsverfahrens, z.B. eines Chemolumineszenzdetektionsverfahren oder eines Fluoreszenzdetektionsverfahrens.
Die Bindung des Primärantikörpers an den Analyten über den an den Sekundärantikörper gebundenen Marker kann quantifiziert werden. Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die Beladung eines Trägermaterials T mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Verbindung aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Marker umfassen.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial T umfassen.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran die Trocknung des Trägermaterials T umfassen.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Einbringen des Trägermaterials T in ein trockenes Reaktionsgefäß R umfassen.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß R umfassen, wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial T in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran das Aufbringen des Analysefluids auf die Membran umfassen.
Generell kann das erfindungsgemäße Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran den Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über die Markierungumfassen.
Ferner kann das Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran weitere Schritte umfassen.
Ferner kann das Verfahren eine Vorbehandlung des Trägermaterials T mit einem Fluid umfassen.
Fig. 7 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot- Blot direkt. Beim Dot-Blot direkt ist der markierte Primärantikörper die Komponente auf dem Träger und wird mit Elutionsfluid (Puffer + Schutzprotein) solubilisiert. Das so entstandene Analysefluid wird auf die Membran aufgebracht, die den Analyten trägt.
Zu sehen ist die nach 10-minütiger Inkubation sichtbare Markierung des Analyten (vgl. die Punkte auf der Membran), nämlich die erfindungsgemäße Färbung verschiedener poly- Histidin markierter Zielproteine aufgetropft auf einer Nitrocellulose Membran.
Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1 xPBS als Elutionsfluid.
Fig. 8 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Dot- Blot indirekt.
Beim Dot-Blot indirekt ist der markierte Sekundärantikörper die Komponente auf dem Träger und wird mit Elutionsfluid (Puffer + Schutzprotein +zusätzlich Primärantikörper) solubilisiert. Das so entstandene Analysefluid wird auf die Membran aufgebracht, die den Analyten trägt. Zu sehen ist die nach 10-minütiger Inkubation sichtbare Markierung des Analyten (vgl. die Punkte auf der Membran).
Zu sehen ist die erfindungsgemäße Färbung verschiedener poly-Histidin markierter Zielproteine aufgetropft auf einer Nitrocellulose Membran.
Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-Maus Sekundärantikörper und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1 xPBS und Anti- HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus als Elutionsfluid.
Fig. 9 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot direkt.
Zu sehen ist links eine ECL-Färbung (ECL = enhanced chemiluminescence) des poly-Histidin markierten Zielproteins (His6-Kin1 L) auf einer Nitrocellulose Membran nach Blottransfer. Die Färbung der Membran erfolgt mit ECL Chemiluminescent Substrate nach Inkubation mit Antikörpergegen Penta Histidin als HRP Konjugat (HRP = horseradish peroxidase).
Rechts ist eine erfindungsgemäße Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (His6- Kin1 L) auf einer Nitrocellulose Membran nach Blottransfer zu sehen. Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1 xPBS als Elutionsfluid.
Fig. 10 zeigt eine Darstellung eines erfindungsgemäßen Ausführungsbeispiels mit einem Western Blot indirekt.
Zu sehen ist links eine ECL-Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (ATX1 ) auf einer PVDF Membran (PVDF = Polyvinylidenfluorid (auch Polyvinylidendifluorid)) nach Blottransfer. Die Färbung der Membran erfolgt mit ECL Chemiluminescent Substrate nach Inkubation mit Antikörpergegen Penta Histidin als HRP Konjugat.
Rechts ist eine erfindungsgemäße Färbung des poly-Histidin markierten Zielproteins (ATX1 ) auf einer PVDF Membran nach Blottransfer zu sehen. Die Färbung der Membran erfolgt mit erfindungsgemäßem Analysefluid bestehend aus mit Goldnanopartikeln markiertem Anti- Maus Sekundärantikörper und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus solubilisiert aus erfindungsgemäßem Kit mit 3%BSA in 1 xPBS und Anti-HIS Epitop-Tag Antikörper aus Maus als Elutionsfluid.
Fig. 11 zeigt eine schematische Darstellung eines weiteren Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Trägermaterials T.
Das Trägermaterial T umfasst alle strukturellen und funktionellen Merkmale wie das Trägermaterial T, welches in Figur 1 gezeigt ist.
Die Komponente K umfasst eine Verbindung aus einem ersten Stoff und einem zweiten Stoff umfasst.
In diesem Ausführungsbeispiel ist die Komponente K eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 und einem Markierungsmolekül. Alternativ und/oder zusätzlich kann die Komponente K eine Verbindung aus dem rezeptorbindenden Motiv (RBM) des Angiotensin-konvertierenden Enzyms 2 (ein oder mehrere Moleküle RBM) und einem Markierungsmolekül sein.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Nanopartikel ein Gold-Nanopartikel mit einer Größe von 8 nm bis 10 nm Durchmesser.
Generell kann das Markierungsmolekül eine Größe von 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm Durchmesser aufweisen.
Nicht gezeigt in Fig. 1 1 ist, dass die mindestens eine Komponente K alternativ mindestens ein Spike-Protein und/oder eine Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars- CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfassen kann.
Das Trägermaterial T‘ kann Bestandteil eines erfindungsgemäßen Kitsystems (Fig. 3) sein.
Nicht gezeigt in Fig. 1 1 ist auch, dass das Trägermaterial T‘ und/oder Kitsystem KS in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung des Analyten an das rekombinante Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) verwendet werden kann.
Nicht gezeigt in Fig. 1 1 ist, dass der Analyt ein Protein umfassen kann, insbesondere wobei der Analyt ein einzelnes Peptid und/oder Polypeptid oder einen Komplex aus verschiedenen Polypeptiden umfasst.
Nicht gezeigt in Fig. 1 1 ist, dass das Protein mindestens ein virales Spike-Protein des Sars- CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfassen kann, wobei das mindestens eine virale Spike-Protein an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet.
Insbesondere kann ein Spike-Protein auch als Spike-Protein Trimer verstanden werden oder umgekehrt. Nicht gezeigt in Fig. 11 ist auch, dass das Trägermaterial T‘ und/oder Kitsystem KS in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus verwendet werden kann.
Nicht gezeigt in Fig. 1 1 ist auch, dass die Komponente K alternativ und/oder zusätzlich folgendes umfassen kann:
• Tag mit Maus-Fc auf Sulfat-modifiziertem, orange fluoreszierendem Polystyrol (PS), insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Tag mit Maus-Fc auf unmodifiziertem Polystyrol (PS), insbesondere 20-500nm
Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Tag mit Maus-Fc auf Protein A modifizierten Polystyrol (PS) 100 nm Durchmesser, insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser; und/oder
• Poly-Histidin-Tag auf Gold-Nanopartikeln, insbesondere 20-500nm Durchmesser, insbesondere 100 nm Durchmesser.
Fig. 12 zeigt schematisch die Verwendung einer Komponente in einem Verfahren zum Nachweis eines Erregers.
In diesem Ausführungsbeispiel ist der Erreger ein Virus.
In diesem Ausführungsbeispiel ist das Virus ein SARS-CoV2 Virus. Alternativ ist ein SARS- CoV Virus oder ein HCov-NL63 Virus denkbar.
Gezeigt ist ein Virus mit der Virusoberfläche V.
Gezeigt ist ferner eine Komponente K, insbesondere ist die Komponente K in vielfacher Anzahl gezeigt (nur eine exemplarische Beschriftung).
Auf der Virusoberfläche V befinden sich eine Vielzahl gleicher Oberflächenproteine O (exemplarisch sind drei Oberflächenprotein O gekennzeichnet).
In diesem Ausführungsbeispiel sind die Oberflächenproteine O Spike-Proteine. Insbesondere sind die Oberflächenproteine Spike-Protein Trimere (bestehen also aus drei Einheiten).
Insbesondere kann ein Spike-Protein auch als Spike-Protein Trimer verstanden werden oder umgekehrt.
Die Spike-Protein Trimere sind flexibel in ihrer Ausrichtung.
Die Spike-Protein Trimere sind in einem im wesentlichen gleichen Abstand A (dargestellt mittels der gestrichelten Pfeile) zueinander auf der Virusoberfläche V angebracht.
In diesem Ausführungsbeispiel beträgt ein Abstand A zwischen den Zentren Z zweier Spike- Protein Trimere in etwa 14 nm.
Eine Komponente K umfasst eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin
konvertierenden Enzym 2 B und einem Markierungsmolekül N, in diesem Beispiel einen Gold-Nanopartikel N.
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Komponente K mehrere Einheiten (Moleküle) des Enzyms Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 (mehr als eine Enzymeinheit).
In diesem Ausführungsbeispiel umfasst die Komponente K 3-6 Einheiten (Moleküle) des Enzyms Angiotensin-konvertierendes Enzym 2.
Alternativ kann die Komponente K 2-100 Einheiten (Moleküle) des Enzyms Angiotensin konvertierendes Enzym 2 umfassen.
Alternativ kann die Komponente K eine einzelne Einheit (Molekül) des Enzyms Angiotensin konvertierendes Enzym 2 umfassen.
Das Enzym Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 ist ein Bindungspartner B für ein Spike- Protein. Jedes der drei Spike-Proteine eines Spike-Protein Trimers kann an ein rekombinantes Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 binden, insbesondere handelt es sich hier um eine spezifische Bindung.
Auch eine Bindung der drei Spike-Proteine eines Spike-Protein Trimers an jeweils ein rekombinantes Angiotensin-konvertierendes Enzym 2 von mindestens zwei verschiedenen Komponenten K wird ermöglicht.
In diesem Ausführungsbeispiel hat ein Gold-Nanopartikel N eine Größe von 8-10 nm.
Alternativ wäre eine Größe von 1 -14 nm denkbar.
Die Größe der Gold-Nanopartikel N einer Komponente K ist kleiner ist als der Abstand A zwischen den Zentren Z zweier Oberflächenproteine O, hier zweier Spike-Protein Trimere.
Der Abstand zwischen zwei Gold-Nanopartikeln (nach erfolgter Bindung zwischen den Spike- Proteinen und rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2) beträgt damit weniger als 30nm.
Die Nanopartikel können in den Zwischenräumen zwischen den Oberflächenproteinen O arrangiert (verbrückt) werden.
Insbesondere bildet sich eine äußere Schicht aus Gold-Nanopartikeln N.
Der Nachweis des SARS-CoV 2 Virus kann demnach zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Spike-Proteins an das rekombinante Angiotensin-konvertierende Enzym 2 B erbracht werden.
Nicht gezeigt in Fig. 12 ist, dass es durch die Anordnung der Komponente K, insbesondere der Gold-Nanopartikel zwischen den Spike-Protein Trimeren auf der Virusoberfläche O zur Plasmonresonanzkopplung und somit zur Erhöhung des molaren Extinktionskoeffizienten kommt, wodurch der Nachweis des Virus optisch erfolgen kann.
Insbesondere kommt es aufgrund der in diesem Ausführungsbeispiel genutzten Gold- Nanopartikel zu einer Rotverschiebung und einer damit verbundenen Verstärkung der sichtbaren roten Farbe. Nicht gezeigt in Fig. 12 ist, dass bei der Nutzung größerer Gold-Nanopartikel eine Verstärkung der sichtbaren violetten Farbe möglich ist.
Die mindestens eine Komponente K kann unabhängig von dem Trägermaterial T‘ und/oder dem Kitsystem KS in einem Verfahren zum Nachweis eines Erregers verwendet werden.
Nicht gezeigt in Fig. 12 ist, dass die Komponente K über ein Trägermaterial T oder ein Kitsystem KS oder ein anderes Material und/oder Medium und/oder Verfahren in das Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem SARS-CoV2 Virus eingebracht werden kann.
Die Komponente K kann in Verfahren für den Nachweis von einem oder mehreren (anderen) Erregern verwendet werden.
Der Nachweis erfolgt zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Analyten an einen Bindungspartner B, wobei die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem Bindungspartner B und einem Markierungsmolekül N umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül N mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
Der Analyt ist in vielfacher Anzahl mit einem im Wesentlichen gleichen Abstand A auf der Oberfläche des Erregers angeordnet.
Die Größe des Markierungsmoleküls N ist dabei so an den Abstand A zwischen den einzelnen Analyten der vielfachen Anzahl des Analyten angepasst ist, dass eine Bindung des Analyten an den Bindungspartner B ermöglicht wird.
Nicht gezeigt in Fig. 12 ist ferner, dass alternativ in einem Verfahren zum Screening von Antikörpern gegen das Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus die Komponente K eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike- Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül N umfen kann.
Ein geeigneter Antikörper (Analyt) bindet an das mindestens eine Spike-Protein und/oder die Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus. Der Nachweis kann wie oben beschrieben erfolgen (Farbverschiebung, je nach Größe der Gold-Nanopartikel).
Nicht gezeigt in Fig. 12 ist ferner, dass in einem Verfahren zum Screening von Zellen zur Überprüfung der Expression von membranständigen oder sekretiertem Angiotensin konvertierendem Enzym 2 oder des rezeptorbindenden Motivs des Angiotensin konvertierenden Enzym 2, die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike- Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül N, insbesondere Gold- Nanopartikel, umfassen kann.
Geeignete Zellen (Analyt) binden an das mindestens eine Spike-Protein und/oder die Spike- Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus. Der Nachweis kann beispielsweise wie oben beschrieben erfolgen (Farbverschiebung, je nach Größe der Gold-Nanopartikel),
Bezugszeichen
A Abstand
B Bindungspartner
D Deckel
K Komponente
KS Kitsystem
N Markierungsmolekül, Nanopartikel
O Oberflächenprotein
R Reaktionsgefäß
T, T Trägermaterial
V Virusoberfläche
51 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
52 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
53 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
54 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Trägermaterials
51 1 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
512 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
513 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
514 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
515 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
516 Schritt in der Herstellung eines erfindungsgemäßen Kitsystems
521 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
522 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
523 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
524 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran 525 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
526 Schritt eines gängigen Verfahrens nach dem Stand der Technik zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran
S31 Schritt eines erfindungsgemäßen Verfahrens zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer Membran

Claims

Ansprüche
1. Trägermaterial (T) umfassend mindestens eine Komponente (K), wobei die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist,
dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben.
2. T rägermaterial (T) nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (K) mindestens einen Stoff umfasst.
3. Trägermaterial (T) nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Stoff ein biogenes Makromolekül ist oder umfasst.
4. Trägermaterial (T) nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das biogene Makromolekül einen spezifischen Bindungspartner eines Analyten umfasst, wobei der Bindungspartner mindestens einen monoklonalen Antikörper, polyklonalen Antikörper, affinitätsaufgereinigten Antikörper, ein Antikörperfragment, Nanobody, Nukleinsäurefragment, Aptamer, Anticalin, Lektin, Affibody, Peptid, Enzym und/oder chemischen Ligand umfasst und/oder ein Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
5. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Komponente (K) eine Verbindung aus mindestens einem ersten Stoff und mindestens einem zweiten Stoff umfasst.
6. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) mindestens ein Material umfasst, welches durch seine physikalische Beschaffenheit geeignet ist die Komponente (K) unter Laborbedingungen zu Trocknen und so vor Degradation und/oder Aggregation zu schützen, wobei das Trägermaterial (T) insbesondere ein Fasergewebe aus Zellulose, Glasfaser, Polymerfaser, Nylon, Seide, Wolle, Filz und/oder Baumwolle, einen festen Schaum, ein poröses Material und/oder einen Schwamm umfasst.
7. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) mindestens ein poröses Material umfasst und in einem Elutionsfluid lösbar ist.
8. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das das Trägermaterial (T) eine Dicke größer als 0,1 mm und einen Durchmesser von 0,5 cm bis 5 cm, insbesondere von 1 cm bis 5 cm aufweist.
9. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) eine weitgehend runde Form aufweist.
10. Trägermaterial (T) nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) ein Bindungsvolumen von bis zu 20 ml hat.
1 1 . Kitsystem (KS) umfassend:
- ein Reaktionsgefäß (R), welches zur Aufnahme eines Fluids geeignet ist;
-ein Trägermaterial (T), wobei das Trägermaterial (T) mindestens eine Komponente (K) umfasst,
dadurch gekennzeichnet, dass das Trägermaterial (T) geeignet ist ein bestimmtes Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge der Komponente (K) aufzunehmen und in Anwesenheit eines Elutionsfluids wieder freizugeben, und wobei das Trägermaterial (T) in dem ansonsten leeren Reaktionsgefäß (R) eingebracht ist.
12. Kitsystem (KS) nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (K) adhäsiv an das Trägermaterial (T) gebunden und/oder auf dem Trägermaterial (T) immobilisiert und/oder eingetrocknet ist,
13. Kitsystem (KS) nach Anspruch 1 1 oder Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsgefäß (R) nahezu luftdicht verschließbar ist, insbesondere mit einem Deckel (D).
14. Kitsystem (KS) nach Anspruch 13, dadurch charakterisiert, dass das Trägermaterial (T) im Deckel (D) des Reaktionsgefäßes (R) angebracht ist.
15. Verwendung eines Kitsystems (KS) nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14 für die Fierstellung eines Analysefluids für einen Bioassay.
16. Verwendung eines Kitsystems (KS) nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14 für die Herstellung einer Antikörperlösung für einen Immunassay.
17. Verwendung eines Kitsystems (KS) nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14 für die Fierstellung einer Proteinlösung, insbesondere für den Nachweis einer Bindung eines Analyten an ein Protein, wobei sich das Protein in der Proteinlösung befindet.
18. Verfahren zum Bereitstellung eines biogenen Makromoleküls und/oder eines Markierungsmoleküls, umfassend mindestens die Schritte:
Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge mindestens einer Komponente aus einem biogenen Makromolekül und/oder eines Markierungsmoleküls;
Bindung der Komponente (K) an das Trägermaterial (T);
Trocknung des Trägermaterials (T);
Freisetzen der Komponente (K) aus dem Trägermaterial (T).
19. Verfahren zur Nutzung eines biogenen Makromoleküls und/oder eines Markierungsmoleküls in einem Bioassay, umfassend mindestens die Schritte:
Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge mindestens einer Komponente (K) umfassend mindestens ein biogenes Makromolekül und/oder Markierungsmoleküls;
Bindung der Komponente (K) an das Trägermaterial (T);
Trocknung des Trägermaterials (T);
Freisetzen der Komponente (K) aus dem Trägermaterial (T) durch Zugabe eines Elutionsfluids, wobei die Komponente (K) in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet;
Einbringen des Analysefluids, bestehend aus der im Elutionsfluid und der freigesetzten Komponente (K), in einem Bioassay.
20. Verfahren zum Nachweis eines Analyten, umfassend mindestens die Schritte:
Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmtem Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Komponente (K) umfassend eine Verbindung eines spezifischen Bindungspartners des Analyten und eines Markierungsmoleküls; Bindung der Verbindung an das Trägermaterial (T);
Trocknung des Trägermaterials (T);
Einbringen des Trägermaterials (T) in ein trockenes Reaktionsgefäß (R);
Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß (R), wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet;
Aufbringen des Analysefluids auf die Membran;
Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über das Markierungsmolekül.
21 . Verfahren zum Nachweis eines immobilisierten Analyten auf einer festen Matrix, umfassend mindestens die Schritte:
Beladung eines Trägermaterials (T) mit einem bestimmten Volumen einer Flüssigkeit beinhaltend eine definierte Menge einer Komponente aus einem spezifischen Bindungspartner des Analyten und einem Markierungsmolekül;
Adhäsive Bindung der Verbindung an das Trägermaterial (T);
Trocknung des Trägermaterials (T);
Einbringen des Trägermaterials (T) in ein trockenes Reaktionsgefäß (R);
Einbringen eines Elutionsfluids in das Reaktionsgefäß (R), wobei die Verbindung in Anwesenheit des Elutionsfluids aus dem Trägermaterial (T) in das Elutionsfluid freigegeben wird und ein Analysefluid bildet;
Aufbringen des Analysefluids auf die Membran;
Nachweis der Bindung des spezifischen Bindungspartners des Analyten über das Markierungsmolekül.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , weiter umfassend den Schritt:
Vorbehandlung des Trägermaterials (T) mit einem Fluid.
23. Trägermaterial (T) nach einem der Ansprüche 1 bis 10, oder Kitsystem nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Komponente (K) eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 (ACE2) und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
24. Trägermaterial (T, T‘) oder Kitsystem nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass der mindestens eine Nanopartikel eine Größe von 2 bis 14 nm Durchmesser, insbesondere 4-12 nm Durchmesser, insbesondere 8 nm bis 10 nm Durchmesser aufweist.
25. Verwendung eines Trägermaterials (T, T‘) oder Kitsystems (KS) nach Anspruch 23 oder Anspruch 24 in einem Verfahren zum Nachweis eines Analyten zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung des Analyten an das rekombinante Angiotensin konvertierende Enzym 2 (ACE2).
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt ein Protein umfasst, insbesondere wobei der Analyt ein einzelnes Peptid und/oder Polypeptid oder einen Komplex aus verschiedenen Polypeptiden umfasst.
27. Verwendung nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein mindestens ein virales Spike-Protein des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfasst, wobei das mindestens eine virale Spike-Protein an das Angiotensin konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet.
28. Verwendung eines Trägermaterials (T, T‘) oder Kitsystems (KS) nach Anspruch 23 oder Anspruch 24 in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus.
29. Verwendung mindestens einer Komponente (K) in einem Verfahren zum Nachweis einer Infektion mit dem Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus, zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Analyten an rekombinantes Angiotensin konvertierendes Enzym 2, wobei die Komponente eine Verbindung aus rekombinantem Angiotensin-konvertierendem Enzym 2 und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst und wobei der Analyt mindestens ein virales Spike-Protein des Sars- CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus umfasst, wobei das virale Spike-Protein an das Angiotensin-konvertierende Enzym 2 (ACE2) bindet.
30. Verwendung mindestens einer Komponente (K) in einem Verfahren zum Nachweis eines Erregers, zumindest teilweise mittels einer spezifischen Bindung eines Analyten an einen Bindungspartner, wobei die Komponente (K) eine Verbindung aus mindestens einem Bindungspartner und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst, wobei der Analyt in vielfacher Anzahl mit einem im Wesentlichen gleichen Abstand auf der Oberfläche des Erregers angeordnet ist, wobei die Größe des Markierungsmoleküls so an den Abstand zwischen den einzelnen Analyten der vielfachen Anzahl des Analyten angepasst ist, dass eine Bindung des Analyten an den Bindungspartner ermöglicht wird.
31 . Verwendung mindestens einer Komponente (K) in einem Verfahren zum Screening von Antikörpern gegen das Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus, wobei die Komponente (K) eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike- Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
32. Verwendung mindestens einer Komponente (K) in einem Verfahren zum Screening von Zellen zur Überprüfung der Expression von membranständigen oder sekretiertem Angiotensin konvertierendem Enzym 2 oder des rezeptorbindenden Motivs des Angiotensin konvertierenden Enzym 2, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars- CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold- Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
33. Verwendung mindestens einer Komponente (K) in einem Verfahren zur Einbringung von Virus-Simulationspartikeln, insbesondere in Zielzellen, wobei die Komponente eine Verbindung aus mindestens einem Spike-Protein und/oder einer Spike-Protein Rezeptor Bindestelle des Sars-CoV-2 Virus, Sars-CoV Virus oder HCov-NL63 Virus und einem Markierungsmolekül umfasst, vorzugsweise wobei das Markierungsmolekül mindestens einen Nanopartikel, insbesondere Gold-Nanopartikel, fluoreszierenden Nanopartikel, magnetischen Nanopartikel und/oder Quantumdot umfasst.
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