CN113336832A

CN113336832A - 抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及含有该蛋白的疫苗

Info

Publication number: CN113336832A
Application number: CN202110227867.0A
Authority: CN
Inventors: 魏霞蔚; 逯光文; 王玮; 杨静云; 杨金亮; 杨莉; 李炯; 魏于全; 王震玲; 沈国波; 赵志伟
Original assignee: Chengdu Weisk Biomedical Co ltd
Current assignee: Chengdu Weisk Biomedical Co ltd
Priority date: 2020-03-02
Filing date: 2021-03-01
Publication date: 2021-09-03
Anticipated expiration: 2041-03-01
Also published as: CN113336832B

Abstract

本发明涉及抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白以及含有该蛋白的疫苗，属于医药领域。为解决针对SARS‑CoV‑2感染尚缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明一方面提供了抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白，该蛋白是基于SARS‑CoV‑2病毒的S蛋白胞外段NTD至PTM区域设计得到的。另一方面，本发明还提供了用于预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染的疫苗，其含有所述抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。本发明主要是通过诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS‑CoV‑2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染。

Description

抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及含有该蛋白的疫苗

技术领域

本发明涉及抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及含有该蛋白的疫苗，属于医药领域。

背景技术

SARS-CoV-2是由世界卫生组织而命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。蝙蝠可能是SARS-CoV-2的天然宿主，此外，有研究认为穿山甲也可能是该病毒的动物来源。目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2已导致数万人感染，还没有确切有效的抗病毒药物能够进行预防与治疗，开发针对该病毒的疫苗对于疾病的防治非常重要。

SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike，S)、信使蛋白(Envelop，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，其中，S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS冠状病毒的功能性受体，而最近研究发现SARS-CoV-2也是通过与ACE2受体的结合进入宿主细胞，进行病毒的感染和复制。SARS-CoV-2的S蛋白由S1和S2两个结构域组成，S1蛋白是与ACE2受体结合的结构域，即受体结合区(RBD，Receptor-binding domain)，负责病毒与宿主细胞受体的结合、与细胞膜的融合及病毒的入侵感染。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2感染的蛋白。本发明的另一目的在于提供含有所述蛋白的用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗。

本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白，其含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或者含有与SEQ ID No.1具有99％以上的同源性且具有相同或相似生物学活性的氨基酸序列。

其中，氨基酸序列SEQ ID No.1的第一位和/或最后一位氨基酸缺失。

进一步地，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者与SEQ ID No.1具有99％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性。

SEQ ID No.1：

SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成如图6所示，SP，信号肽；NTD，N-端结构域；RBD，受体结构域；FP，融合肽；IFP，內融合肽；HR1，七肽重复区1；HR2，七肽重复区2；PTM，近膜区；TM，跨膜区。

上述SEQ ID No.1是基于S蛋白胞外段NTD至PTM区域(20-1220位氨基酸)来设计的抗SARS-CoV-2感染药物，为了避免疏水氨基酸结尾，所以减少了几个PTM的氨基酸，使用的序列SEQ ID No.1对应的是S蛋白胞外段20-1208位氨基酸。但是，完整的20-1220位氨基酸序列也能发挥抗SARS-CoV-2感染的作用。进一步地，为在本发明蛋白的氨基酸序列中插入蛋白标签，SEQ ID No.1第一位和/或最后一位的氨基酸可以缺失。

本发明提供了所述蛋白的前体，它在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。

优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

其中，在蛋白的C端融合8xHis蛋白标签，能够方便蛋白的纯化。

进一步地，所述的前体在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。

优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

进一步地，所述前体的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

SEQ ID No.2(昆虫细胞信号肽+S蛋白胞外段+His标签的氨基酸序列)：

本发明提供了所述的蛋白和/或所述的前体在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。

本发明提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，其含有所述的蛋白和/或所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。

优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A(MPL)、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列，人工合成的CpG)。

进一步地，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。

其中，所述的免疫佐剂优选为氢氧化铝佐剂；所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白：氢氧化铝佐剂的配比优选为(32～48)mcg/mL：(0.8～1.2)mg/ml，佐剂以氢氧化铝的含量计；进一步优选地，所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白：氢氧化铝佐剂的配比优选为40mcg/mL：1.0mg/ml，佐剂以氢氧化铝的含量计。

进一步地，所述的钙盐为磷酸三钙。

进一步地，所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM。

进一步地，所述的植物多糖为黄芷多糖(APS)。

进一步地，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

进一步地，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)。

进一步地，所述的疫苗为注射制剂。

优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。

本发明提供了多核苷酸，其编码所述的蛋白或所述的前体。

进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

SEQ ID No.3(昆虫细胞信号肽+S蛋白胞外段+His标签，经过优化的相应核苷酸序)：

本发明提供了重组载体，它含有所述的多核苷酸。

进一步地，所述的重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。

优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。

优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pET32a。

优选地，所述的酵母表达载体为pPICZaA。

优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。

进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

本发明提供了宿主细胞，它含有所述的重组载体。

进一步地，所述的宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。

优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种。

优选地，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。

本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。

本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述多核苷酸的重组载体，对人体进行免疫，产生所述的蛋白。

进一步地，所述的载体选自如下至少一种：mRNA、DNA疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia Ankara virus、腺相关病毒。

本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗，主要是针对SARS-CoV-2病毒的S蛋白，诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS-CoV-2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染。动物实验证明，本发明制备的蛋白安全性好，无明显毒副作用，对SARS-CoV-2感染能够发挥显著的防治作用，具有广阔应用前景。

附图说明

图1为试验例1中小鼠血清的A450吸光度值测量结果图；

图2为试验例2中重组S蛋白胞外段免疫血清体外阻断S蛋白与ACE2结合图；

图3为试验例3中重组S蛋白胞外段免疫血清病毒中和抗体滴度测定结果图；

图4为试验例4中攻毒小鼠肺病毒拷贝数测定结果图；

图5为试验例4中攻毒小鼠肺病理H&E染色图；

图6为SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成示意图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

S蛋白是一种糖基化蛋白，优选采用昆虫杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达体系(CHO表达系统)，能够更好地获得天然的S蛋白。具体制备方法如下：

实施例1用昆虫杆状病毒表达系统制备本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白

载体构建：利用昆虫杆状病毒表达系统产生的重组蛋白主要是利用S蛋白的胞外段。SARS-CoV-2病毒S蛋白为定位于病毒包膜上的蛋白，为了模拟其分泌过程，在构建S蛋白胞外段时，在其N端加入了GP67信号肽，以辅助蛋白的分泌表达，这一信号肽将在蛋白分泌的过程中自发被昆虫细胞所切除。同时，为了方便纯化，还在蛋白的C端融合了8xHis标签。完整的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。基于pFastBac1载体(氨苄抗性)构建S蛋白胞外段的表达载体，使用BamHI，HindIII酶切位点插入到pFast-bacI载体中，按昆虫细胞偏爱密码子优化。

重组杆状病毒的扩增：采用Bac-to-Bac表达系统，利用细菌转座子原理，通过Tn7转座元件产生位点特异性转座，在大肠杆菌(DH10Bac，含bacmid(卡那霉素抗性)和helperplasmid(四环霉素抗性))内完成重组bacmid的构建。提取重组成功的bacmid，用Cellfectin II将其转染至sf9昆虫细胞以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。转染72h后收取第一代病毒，然后进行P2到P4代病毒的扩增，利用P3或P4代病毒表达蛋白。

蛋白表达：利用P3或P4代病毒感染Hi5昆虫细胞(也可用sf9和sf21细胞)，感染复数(MOI为0.5-10)，培养48-72h后收集上清。最佳收获时间根据毒种病毒量和细胞状态可能每次都有差异，一般以镜检50％左右细胞病变为宜。

蛋白纯化：收获的培养上清4℃高速离心，0.22um滤膜过滤，采用亲合纯化方法(Histrap镍柱)初步纯化重组蛋白，然后利用MonoQ离子柱和Superdex200 10/300GL分子筛精纯重组蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，纯度要求达到95％以上。用酶切缓冲液将制备的蛋白溶解或稀释至1～5mg/ml。根据1U的肠激酶(EK酶)可以酶切50μg重组蛋白的比例加入相应量的肠激酶(EK酶)，混匀，在25℃静置酶切16h，即可切除重组蛋白的标签。最后所得重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，可用于动物免疫等后续研究。

实施例2本发明抗SARS-CoV-2感染的疫苗的制备

在无菌条件下进行抗原配制。以5mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释纯化后的重组蛋白抗原(实施例1制备)至浓度为80mcg/ml。在无菌条件下配制佐剂，5mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释氢氧化铝佐剂原液(氢氧化铝含量是14.55mg/ml)至浓度为2.0mg/ml。在无菌条件下进行抗原-佐剂吸附，按照20ml/min的速度，将稀释后的蛋白抗原液体滴加至稀释后的氢氧化铝佐剂工作液中，体积比为(V/V)1：1，使混合液中重组蛋白抗原终浓度为40mcg/mL，铝佐剂终浓度为1.0mg/ml。保持反应温度为25℃，搅拌速度为800rpm。滴加完成后继续保持25℃、800rpm搅拌吸附60min。调节混合后溶液pH至7.2。4℃避光保存。对吸附后的疫苗制剂进行表征，包括粒径、点位、抗原含量、佐剂含量、吸附率、pH值、内毒素、佐剂-抗原吸附率、吸附强度及其保持状态、吸附后抗原完整性和稳定性等。灌装。将检测合格的疫苗制剂灌装如1mL无菌西林/安瓿瓶中，1mL/瓶。灌装时应不停搅拌，使灌装液均匀。罐装后立即封盖，贴上编号标签，4℃避光保存。

以下通过生物实验证明本发明的有益效果。

试验例1在接种过本发明疫苗的小鼠体内诱导出S蛋白胞外段(ECD)的特异性抗体

免疫动物实验：使用BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠，分组如图1所示，每组5到10只小鼠。所用重组蛋白胞外段(根据实施例1制备)的剂量为1.0μg到20.0μg/只不等，具体剂量见图1。实验组小鼠每只注射疫苗(根据实施例2制备)的容积为50μL，在小鼠右后腿肌肉注射(im)，免疫程序为：分别于第1、7与21天共免疫3次。

ELISA(酶联免疫吸附试验)测定小鼠血清抗体：在小鼠首次免疫后的第28天，用毛细管眼眶采血法收集小鼠血浆，每组6只。室温放置1-2h，待血浆凝固后于4℃，3000rpm/min离心10min，取上层血清保存于-20℃备用。ELISA测定血清IgG的方法：用50mM碳酸盐包被缓冲液(PH9.6)配制1μg/ml的重组蛋白ECD溶液，每孔100μl加入到96孔包被板中(ThermoScientific公司，NUNC-MaxiSorp)，放置4℃包被过夜。50mM碳酸盐包被缓冲液(PH9.6)的配制：称取0.15g Na₂CO₃和0.293g NaHCO₃，用少量双蒸水溶解后，调节PH到9.6，然后定容至100ml，保存于4℃备用。次日用含0.1％Tween20的PBS溶液(PBST)洗涤3次后，用含1％BSA或者5％脱脂牛奶的封闭液(配制在PBST中)室温封闭1h后，PBST洗涤1次。将小鼠血清用封闭液稀释成不同比例后，按照100μl/孔加入，37℃孵育1h-2h，然后用PBST洗涤3次。然后按照100μl/孔加入HRP-山羊抗鼠IgG抗体(1:5000稀释于封闭液中)，37℃孵育1h后，PBST洗涤5次。最后加入100μl/孔3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，避光显色10-15min后，加入50μl/孔1M H₂SO₄终止液，混匀后在酶标仪上450nm波长处读数。1M H₂SO₄终止液的配制方法为：向47.3mL双蒸水中逐滴加入2.7mL的浓硫酸(98％)，并不停搅拌。

为测量重组蛋白诱导的ECD特异性抗体的滴度，将血清连续不同倍数稀释后用滴定法测量，并测量A450吸光度值。以450nm吸光度值为纵坐标，以稀释倍数为横坐标作图。从图1可以看出，接种生理盐水的对照组和接种氢氧化铝佐剂的对照组的A450光密度值较低，其他接种蛋白组的A450光密度值较对照组都有显著升高，证明本发明重组蛋白激发了明显的ECD特异性抗体。进一步地，氢氧化铝佐剂显著提高了蛋白疫苗的抗体滴度，且呈重组蛋白剂量依赖关系。以上结果表明，重组ECD蛋白疫苗在小鼠体内具有高度的免疫原性。

试验例2 ECD蛋白与ACE2受体结合的阻断实验

本实验使用了细胞表达的ACE2，该蛋白被认为可以保留天然构象，以便用流式细胞仪检测ECD结合活性。具体操作如下：

消化并收集体外培养的高表达ACE2细胞株(肺癌A549)到流式管中，10⁶个细胞/管，用PBS/HBSS洗涤数次。向每管细胞中加入终浓度1μg/ml的重组ECD-Fc蛋白；再加入免疫的抗ECD小鼠的血清(将试验例1中10μg/只剂量免疫获得的小鼠血清稀释50倍)，室温孵育30min。其中阳性对照管不加抗血清，生理盐水管加入试验例1中未免疫小鼠的正常血清。用PBS/HBSS洗涤数次后再加入Anti-Human IgG(Fc specific)-FITC(SIGMA)荧光二抗(1:100-1:200)，室温避光孵育30min。用PBS/HBSS洗涤数次后，加入500μl含1％多聚甲醛的PBS固定后，流式上机检测。

结果如图2所示，加入ECD-Fc蛋白可与表达ACE2的细胞显著结合，未添加ECD-Fc蛋白则仅检测到背景信号(阴性对照)。小鼠抗血清有效地阻断了ECD-Fc蛋白与表达ACE2的细胞的结合，而相同稀释度的未免疫或免疫前的血清则没有表现出阻断作用。

试验例3 ECD蛋白免疫血清的假病毒中和实验

将待检测的免疫血清(或血浆)于56℃水浴灭活30min，6000g离心3min，将上清转移至1.5ml离心管中待用。

取96孔板，于第2列(细胞对照CC，见表1)加入DMEM完全培养基(1％双抗，25mMHEPES，10％FBS)150μl/孔，于第3～11列(第3列为病毒对照VC，第4～11列为样品孔)加入DMEM完全培养基100μl/孔，于B4～B11孔中再加入DMEM完全培养基42.5μl/孔。

表1

于B4和B5孔加入血浆样品1(7.5μl)……以此类推，于B10和B11孔加入血浆样品4(7.5μl)，血浆样品1～4均取自试验例1中剂量为10μg/只的实验组小鼠血清。

将多道移液器调至50μl，对B4～B11孔中液体轻柔的反复吹吸6～8次充分混匀，然后转移50μl液体至对应的C4～C11孔，轻柔的反复吹吸6～8次后转移至D4～D11孔，以此类推，最后从G4～G11中吸弃50μl液体，加样顺序参照表1。

本实验使用的假病毒由中国食品药品检定研究院提供，是基于水疱性口炎病毒(VSV)的假病毒检测系统，表达全长S蛋白，该假病毒以与活病毒相同的方式进入细胞，可用于SARS-CoV-2中和抗体的检测和定量分析。

用DMEM完全培养基将假病毒稀释至1.3×10⁴(1×10⁴～2×10⁴)TCID50/ml(按提供的稀释倍数稀释)，于第3～11列每孔加50μl，使每孔含假病毒的量为650(500-1000)/孔。

将上述96孔板置于细胞培养箱中(37℃，5％CO₂)孵育1小时。

当孵育时间至半小时，取出培养箱中事先准备好的hACE2-293T细胞(汇合率达80％～90％)，以T75培养瓶为例，吸弃瓶中的培养基，加入5ml PBS缓冲液清洗细胞，倾去PBS后，加入3ml 0.25％胰酶-EDTA，使其浸没细胞消化1分钟，倾去胰酶，置于细胞培养箱中消化5分钟，轻轻拍打培养瓶侧壁使细胞脱落，加入10ml培养基中和胰酶，吹打几次后转移至离心管中，210g离心5分钟，倾去上清，用10ml DMEM完全培养基重悬细胞，细胞计数，用DMEM完全培养基将细胞稀释至2×10⁵个/ml。

孵育至1小时，向96孔板中每孔加100μl细胞，使每孔细胞为2×10⁴个。

将96孔板前后左右轻轻晃动，使细胞在孔中分散均匀，将96孔板放入细胞培养箱中，37℃，5％CO₂培养20～28小时。

20～28小时后从细胞培养箱中取出96孔板，用多道移液器从每个上样孔中吸弃150μl上清，然后加入100μl荧光素酶检测试剂，室温避光反应2min。

反应结束后，用多道移液器将反应孔中的液体反复吹吸6～8次，使细胞充分裂解，从每孔中吸出150μl液体，加于对应96孔化学发光检测板中，置于化学发光检测仪中读取发光值。

计算中和抑制率：抑制率＝[1－(样品组的发光强度均值－空白对照CC均值)/(阴性组的发光强度VC均值－空白对照值CC均值)]×100％。

根据中和抑制率结果，利用Reed-Muench法计算IC50，见图3。

试验例4小鼠SARS-CoV-2病毒感染攻毒试验

小鼠免疫，6至8周龄的hACE2转基因C57BL/6小鼠，以每只10μg剂量肌肉注射重组S蛋白胞外段蛋白疫苗(根据实施例2制备)。比如，小鼠在第1、14、21天受一次疫苗注射，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水。在免疫后的7天后再次收集血清。在免疫后的第7天，SARS-CoV-2病毒攻击(经鼻内感染，剂量为10⁵TCID50)。此外，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水感染该病毒的小鼠作为对照。病毒攻击5天后处死小鼠，切取小鼠的肺和其他器官。肺组织用于检测病毒复制。用PowerUp SYBG Green Master Mix试剂盒(Applied Biosystems,USA)进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)反应，测定受SARS-CoV-2攻击的小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数，并以肺组织的RNA拷贝数/ml表示。用于qRT-PCR的引物序列为针对SARS-cov-2的包膜(E)基因，如下：

前向：5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’(SEQ ID No.4)；

反向：5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’(SEQ ID No.5)。

本实验测试了疫苗接种是否能够阻止小鼠受SARS-CoV-2病毒感染。用SARS-CoV-2病毒攻击人ACE-2转基因小鼠，并于病毒攻击后5天收集小鼠肺组织，测量其接受疫苗或对照的病毒复制情况。

从图4可以看出，用本发明蛋白疫苗免疫小鼠后，定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)未检测到病毒复制，而对照组小鼠肺组织中病毒复制水平较高。

收集部分肺组织并用10％中性福尔马林固定，包埋于石蜡中，切片厚度5μm，并使用苏木精和伊红(HE)染色。光镜观察组织病理学变化。从图5可以看出，对照组小鼠肺组织出现明显的间质性肺炎组织病理学变化，包括肺泡壁明显增厚，充血、间质大量单个核细胞浸润，以及肺泡腔有血清渗出物。与此形成对照的是，重组蛋白疫苗免疫小鼠，未见组织病理学改变或轻微渗出。

以上实验结果进一步证实本发明蛋白疫苗可以完全阻断SARS-CoV-2病毒的感染。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

序列表

<110> 四川大学

<120> 抗SARS-CoV-2感染的蛋白以及含有该蛋白的疫苗

<130> A210099K

<150> 202010135921.4

<151> 2020-03-02

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1189

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly

1 5 10 15

Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr

20 25 30

Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala

35 40 45

Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val

50 55 60

Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn

65 70 75 80

Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln

85 90 95

Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys

100 105 110

Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys

115 120 125

Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala

130 135 140

Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu

145 150 155 160

Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys

165 170 175

Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn

180 185 190

Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val

195 200 205

Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala

210 215 220

Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr

225 230 235 240

Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe

245 250 255

Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys

260 265 270

Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr

275 280 285

Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr

290 295 300

Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly

305 310 315 320

Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg

325 330 335

Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser

340 345 350

Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu

355 360 365

Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg

370 375 380

Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala

385 390 395 400

Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala

405 410 415

Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr

420 425 430

Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp

435 440 445

Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val

450 455 460

Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro

465 470 475 480

Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe

485 490 495

Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr

500 505 510

Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr

515 520 525

Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln

530 535 540

Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro

545 550 555 560

Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val

565 570 575

Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu

580 585 590

Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp

595 600 605

Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe

610 615 620

Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser

625 630 635 640

Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln

645 650 655

Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser

660 665 670

Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr

675 680 685

Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr

690 695 700

Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr

705 710 715 720

Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln

725 730 735

Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala

740 745 750

Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln

755 760 765

Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser

770 775 780

Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu

785 790 795 800

Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys

805 810 815

Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys

820 825 830

Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp

835 840 845

Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr

850 855 860

Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala

865 870 875 880

Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val

885 890 895

Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile

900 905 910

Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys

915 920 925

Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val

930 935 940

Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp

945 950 955 960

Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg

965 970 975

Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln

980 985 990

Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr

995 1000 1005

Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys

1010 1015 1020

Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly

1025 1030 1035 1040

Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe

1045 1050 1055

Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg

1060 1065 1070

Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg

1075 1080 1085

Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser

1090 1095 1100

Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp

1105 1110 1115 1120

Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr

1125 1130 1135

Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly

1140 1145 1150

Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn

1155 1160 1165

Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu

1170 1175 1180

Gly Lys Tyr Glu Gln

1185

<210> 2

<211> 1237

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala

35 40 45

Tyr Thr Asn Ser Phe Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe

50 55 60

Arg Ser Ser Val Leu His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe

65 70 75 80

Ser Asn Val Thr Trp Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly

85 90 95

Thr Lys Arg Phe Asp Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr

100 105 110

Phe Ala Ser Thr Glu Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly

115 120 125

Thr Thr Leu Asp Ser Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala

130 135 140

Thr Asn Val Val Ile Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro

145 150 155 160

Phe Leu Gly Val Tyr Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser

165 170 175

Glu Phe Arg Val Tyr Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val

180 185 190

Ser Gln Pro Phe Leu Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys

195 200 205

Asn Leu Arg Glu Phe Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile

210 215 220

Tyr Ser Lys His Thr Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly

225 230 235 240

Phe Ser Ala Leu Glu Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile

245 250 255

Thr Arg Phe Gln Thr Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro

260 265 270

Gly Asp Ser Ser Ser Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val

275 280 285

Gly Tyr Leu Gln Pro Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly

290 295 300

Thr Ile Thr Asp Ala Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr

305 310 315 320

Lys Cys Thr Leu Lys Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr

325 330 335

Ser Asn Phe Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn

340 345 350

Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe

355 360 365

Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala

370 375 380

Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys

385 390 395 400

Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val

405 410 415

Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala

420 425 430

Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp

435 440 445

Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser

450 455 460

Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser

465 470 475 480

Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala

485 490 495

Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro

500 505 510

Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro

515 520 525

Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr

530 535 540

Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val

545 550 555 560

Asn Phe Asn Phe Asn Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser

565 570 575

Asn Lys Lys Phe Leu Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp

580 585 590

Thr Thr Asp Ala Val Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile

595 600 605

Thr Pro Cys Ser Phe Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn

610 615 620

Thr Ser Asn Gln Val Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu

625 630 635 640

Val Pro Val Ala Ile His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val

645 650 655

Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile

660 665 670

Gly Ala Glu His Val Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly

675 680 685

Ala Gly Ile Cys Ala Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg

690 695 700

Ala Arg Ser Val Ala Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu

705 710 715 720

Gly Ala Glu Asn Ser Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro

725 730 735

Thr Asn Phe Thr Ile Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met

740 745 750

Thr Lys Thr Ser Val Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr

755 760 765

Glu Cys Ser Asn Leu Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu

770 775 780

Asn Arg Ala Leu Thr Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln

785 790 795 800

Glu Val Phe Ala Gln Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys

805 810 815

Asp Phe Gly Gly Phe Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys

820 825 830

Pro Ser Lys Arg Ser Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr

835 840 845

Leu Ala Asp Ala Gly Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp

850 855 860

Ile Ala Ala Arg Asp Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr

865 870 875 880

Val Leu Pro Pro Leu Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser

885 890 895

Ala Leu Leu Ala Gly Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly

900 905 910

Ala Ala Leu Gln Ile Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn

915 920 925

Gly Ile Gly Val Thr Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile

930 935 940

Ala Asn Gln Phe Asn Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser

945 950 955 960

Ser Thr Ala Ser Ala Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn

965 970 975

Ala Gln Ala Leu Asn Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly

980 985 990

Ala Ile Ser Ser Val Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val

995 1000 1005

Glu Ala Glu Val Gln Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser

1010 1015 1020

Leu Gln Thr Tyr Val Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg

1025 1030 1035 1040

Ala Ser Ala Asn Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly

1045 1050 1055

Gln Ser Lys Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser

1060 1065 1070

Phe Pro Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr

1075 1080 1085

Val Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His

1090 1095 1100

Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn Gly

1105 1110 1115 1120

Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln Ile Ile

1125 1130 1135

Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val Val Ile Gly

1140 1145 1150

Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro Glu Leu Asp Ser

1155 1160 1165

Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn His Thr Ser Pro Asp

1170 1175 1180

Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn Ala Ser Val Val Asn Ile

1185 1190 1195 1200

Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu

1205 1210 1215

Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu Gly Lys Tyr Glu Gln His His His

1220 1225 1230

His His His His His

1235

<210> 3

<211> 3733

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggatccatgc tgctcgtcaa ccaaagtcat caaggcttca acaaagaaca tacaagtaaa 60

atggtctcgg ctatcgtgct ctacgtcctg ctggctgccg ctgcccactc agctttcgct 120

gccgacgaat tcaccaggac tcagctgcct cccgcctaca ccaactcctt cactcgcggt 180

gtgtactacc ctgacaaggt cttccgttcc agcgtgctgc actctactca ggacctgttc 240

ctgcccttct tctctaacgt cacctggttc cacgccatcc acgtgtccgg taccaacggc 300

actaagcgct tcgacaaccc agtgctgcct ttcaacgacg gagtctactt cgctagcacc 360

gagaagtcta acatcatccg tggatggatc ttcggtacca ctctggactc aaagactcag 420

tccctgctga tcgtcaacaa cgccaccaac gtggtcatca aggtgtgcga gttccagttc 480

tgcaacgacc cattcctggg cgtctactac cacaagaaca acaagagctg gatggagtct 540

gagttccgcg tctactcttc agctaacaac tgcactttcg agtacgtgtc acagcctttc 600

ctgatggacc tggaaggaaa gcagggtaac ttcaagaacc tgagggagtt cgtgttcaag 660

aacatcgacg gttacttcaa gatctactca aagcacaccc caatcaacct ggtgcgcgac 720

ctgcctcagg gattctccgc tctggagcca ctggtggacc tgcctatcgg tatcaacatc 780

acccgcttcc agactctgct ggctctgcac cgtagctacc tgactcctgg cgactcttct 840

tctggatgga ctgctggagc tgctgcttac tacgtgggtt acctgcagcc taggaccttc 900

ctgctgaagt acaacgaaaa cggcaccatc actgacgccg tcgactgcgc tctggaccct 960

ctgagcgaaa ccaagtgcac tctgaagtct ttcaccgtgg agaagggtat ctaccagact 1020

agcaacttca gggtgcagcc caccgaatct atcgtcagat tccctaacat cactaacctg 1080

tgccccttcg gcgaggtctt caacgccacc agattcgctt ccgtgtacgc ctggaacagg 1140

aagagaatca gcaactgcgt cgctgactac tctgtgctgt acaacagcgc ctctttctca 1200

accttcaagt gctacggtgt gagcccaact aagctgaacg acctgtgctt caccaacgtc 1260

tacgccgact ctttcgtgat caggggcgac gaggtcagac agatcgctcc tggccagact 1320

ggaaagatcg ccgactacaa ctacaagctg cccgacgact tcaccggttg cgtcatcgct 1380

tggaactcaa acaacctgga ctccaaagtg ggtggcaact acaactacct gtaccgcctg 1440

ttccgtaagt caaacctgaa gccattcgag agggacatct caactgaaat ctaccaggct 1500

ggctccaccc cttgcaacgg tgtcgagggc ttcaactgct acttccccct gcagtcctac 1560

ggattccagc caactaacgg tgtgggctac cagccttaca gagtggtcgt gctgtcattc 1620

gaactgctcc acgctcctgc tactgtgtgc ggaccaaaga agtccaccaa cctggtcaag 1680

aacaagtgcg tgaacttcaa cttcaacggt ctgaccggaa ctggtgtcct gaccgagtca 1740

aacaagaagt tcctgccctt ccagcagttc ggcagggaca tcgctgacac cactgacgct 1800

gtgcgcgacc ctcagaccct ggaaatcctg gacatcactc catgcagctt cggaggtgtc 1860

tctgtgatca ctccaggaac caacacttcc aaccaggtcg ctgtgctgta ccaggacgtc 1920

aactgcaccg aggtccctgt ggccatccac gctgaccagc tgacccccac ttggcgcgtg 1980

tactctaccg gctcaaacgt cttccagact cgtgctggtt gcctgatcgg cgccgagcac 2040

gtgaacaact catacgaatg cgacatcccc atcggcgctg gaatctgcgc ctcctaccag 2100

acccagacta actcaccacg cagggctagg tctgtggctt cccagagcat catcgcttac 2160

accatgagcc tgggtgctga aaactctgtg gcctactcca acaacagcat cgccatcccc 2220

accaacttca ctatcagcgt gaccactgag atcctgccag tctcaatgac caagacttcc 2280

gtggactgca ctatgtacat ctgcggcgac tcaaccgaat gctccaacct gctgctgcag 2340

tacggttctt tctgcaccca gctgaaccgt gctctgactg gcatcgccgt ggagcaggac 2400

aagaacactc aggaagtctt cgctcaggtg aagcagatct acaagacccc acctatcaag 2460

gacttcggcg gattcaactt ctcccagatc ctgcctgacc cctctaagcc ttcaaagcgc 2520

tccttcatcg aggacctgct gttcaacaag gtcactctgg ccgacgctgg cttcatcaag 2580

cagtacggag actgcctggg tgacatcgcc gctcgtgacc tgatctgcgc tcagaagttc 2640

aacggactga ccgtgctgcc cccactgctg actgacgaaa tgatcgccca gtacacttca 2700

gccctgctgg ctggtaccat cacttctgga tggaccttcg gtgctggtgc tgctctgcag 2760

atccccttcg ctatgcagat ggcctaccgt ttcaacggaa tcggtgtcac ccagaacgtg 2820

ctgtacgaga accagaagct gatcgctaac cagttcaaca gcgccatcgg caagatccag 2880

gactcactgt catccactgc ctccgctctg ggaaagctgc aggacgtcgt gaaccagaac 2940

gcccaggctc tgaacaccct ggtcaagcag ctgagctcta acttcggagc tatctcatcc 3000

gtgctgaacg acatcctgtc tcgcctggac aaggtcgagg ccgaagtgca gatcgaccgc 3060

ctgatcactg gtcgtctgca gagcctgcag acctacgtga ctcagcagct gatcagggcc 3120

gctgaaatca gagcctctgc taacctggcc gctaccaaga tgtcagagtg cgtcctggga 3180

cagtccaagc gtgtggactt ctgcggcaag ggataccacc tgatgagctt ccctcagtct 3240

gctccccacg gtgtcgtgtt cctgcacgtc acctacgtgc cagcccagga aaagaacttc 3300

accactgccc ctgctatctg ccacgacggc aaggctcact tccccaggga aggagtcttc 3360

gtgagcaacg gtacccactg gttcgtcact cagagaaact tctacgagcc acagatcatc 3420

accactgaca acactttcgt gtctggcaac tgcgacgtcg tgatcggaat cgtcaacaac 3480

accgtgtacg accccctgca gccagagctg gacagcttca aggaggaact ggacaagtac 3540

ttcaagaacc acacctctcc tgacgtcgac ctgggcgaca tcagcggaat caacgcttct 3600

gtcgtgaaca tccagaagga gatcgaccgc ctgaacgaag tggccaagaa cctgaacgaa 3660

tccctgattg acctccaaga actcggaaaa tacgaacagc accaccacca ccaccaccac 3720

cactgataag ctt 3733

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcgtttcgga agagacaggt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gcgcagtaag gatggctagt 20

Claims

1.抗SARS-CoV-2感染的蛋白，其特征是：含有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列，或者含有与SEQ ID No.1具有99％以上的同源性且具有相同或相似生物学活性的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的蛋白，其特征是：氨基酸序列SEQ ID No.1的第一位和/或最后一位氨基酸缺失。

3.如权利要求1所述的蛋白，其特征是：所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，或者与SEQ ID No.1具有99％以上的同源性且具有相同或相似的生物学活性。

4.如权利要求3所述的蛋白，其特征是：氨基酸序列SEQ ID No.1的第一位和/或最后一位氨基酸缺失。

5.权利要求1～4任意一项所述蛋白的前体，其特征是：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签；优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

6.如权利要求5所述的前体，其特征是：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区；优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

7.如权利要求5或6所述的前体，其特征是：氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

8.权利要求1～4任意一项所述的蛋白和/或权利要求5～7任意一项所述的前体在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。

9.预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，其特征是：含有权利要求1～4任意一项所述的蛋白和/或权利要求5～7任意一项所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征是：所述的辅助性成分为免疫佐剂；优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、鲨烯水包油乳剂、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN。

11.如权利要求10所述的疫苗，其特征是：满足以下至少一项：所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种；所述的钙盐为磷酸三钙；所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM；所述的植物多糖为黄芷多糖；所述的鲨烯水包油乳剂为MF59；所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种；所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺；所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵。

12.如权利要求9～11任意一项所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为注射制剂；优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。

13.多核苷酸，其特征是：编码权利要求1～4任意一项所述的蛋白、权利要求5～7任意一项所述的前体。

14.如权利要求13所述的多核苷酸，其特征是：核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

15.重组载体，其特征是：含有权利要求13或14所述的多核苷酸。

16.如权利要求15所述的重组载体，其特征是：采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种；优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1；优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pET32a；优选地，所述的酵母表达载体为pPICZaA；优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体；进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

17.宿主细胞，其特征是：含有权利要求15或16所述的重组载体。

18.如权利要求17所述的宿主细胞，其特征是：采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种；优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种；优选地，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。

19.权利要求1～4任意一项所述蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤：培养权利要求17或18所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。

20.权利要求1～4任意一项所述蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤：构建含有权利要求13或14所述多核苷酸的重组载体，对人体进行免疫，产生所述的蛋白。

21.如权利要求20所述的制备方法，其特征是：所述的载体选自如下至少一种：mRNA、DNA疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia Ankara virus、腺相关病毒。