CN112300251B

CN112300251B - 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗

Info

Publication number: CN112300251B
Application number: CN202010699123.4A
Authority: CN
Inventors: 魏霞蔚; 逯光文; 王玮; 杨金亮; 杨莉; 李炯; 杨静云; 魏于全; 王震玲; 赵志伟; 沈国波
Original assignee: Chengdu Weisk Biomedical Co ltd
Current assignee: Chengdu weisk biomedical Co.,Ltd.
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-07-20
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2040-07-20
Also published as: US20230233665A1; JP2023522795A; EP4112648A1; JP7464789B2; CN112300251A; EP4112648A4; CA3186989A1; BR112022021758A2; WO2021169255A1

Abstract

本发明涉及抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白及疫苗，属于医药领域。为解决针对SARS‑CoV‑2感染尚缺乏有效预防和治疗药物的问题，本发明一方面提供了抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白，该蛋白含有SARS‑CoV‑2的S蛋白中与血管紧张素转换酶2受体结合的结构域，所述结构域N端第一位氨基酸精氨酸可以缺失。另一方面，本发明还提供了用于预防和/或治疗SARS‑CoV‑2感染的疫苗，其含有所述抗SARS‑CoV‑2感染的蛋白，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。本发明主要是通过诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS‑CoV‑2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染。

Description

抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗

技术领域

本发明涉及抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗，属于医药领域。

背景技术

SARS-CoV-2是由世界卫生组织而命名的一种新型的β属的冠状病毒。该病毒有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，常为多形性，直径60-140nm。其基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有明显区别，是一种以前尚未在人类中发现的新冠状病毒分支。蝙蝠可能是SARS-CoV-2的天然宿主，此外，有研究认为穿山甲也可能是该病毒的动物来源。目前，新型冠状病毒SARS-CoV-2已导致数万人感染，还没有确切有效的抗病毒药物能够进行预防与治疗，开发针对该病毒的疫苗对于疾病的防治非常重要。

SARS-CoV-2的主要结构蛋白包括刺突蛋白(Spike，S)、信使蛋白(Envelop，E)、膜蛋白(Membrane，M)和核衣壳蛋白(Nucleocapsid，N)，其中，S蛋白在病毒的感染和毒力中起着关键作用。血管紧张素转换酶2(ACE2)是SARS冠状病毒的功能性受体，而最近研究发现SARS-CoV-2也是通过与ACE2受体的结合进入宿主细胞，进行病毒的感染和复制。SARS-CoV-2的S蛋白由S1和S2两个结构域组成，S1蛋白是与ACE2受体结合的结构域，即受体结合区(RBD，Receptor-binding domain)，负责病毒与宿主细胞受体的结合、与细胞膜的融合及病毒的入侵感染。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的目的在于提供抗SARS-CoV-2感染的蛋白。本发明的另一目的在于提供含有所述蛋白的用于预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗。

本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白，它含有SARS-CoV-2的S蛋白中与血管紧张素转换酶2受体结合的结构域，所述结构域N端第一位氨基酸精氨酸可以缺失。所述结构域的氨基酸序列为SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。

进一步地，所述蛋白的氨基酸序列选自SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4中至少一种。

SEQ ID No.1：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

SEQ ID No.2：

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

SEQ ID No.3：

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.4：

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成如图13所示，SP，信号肽；NTD，N-端结构域；RBD，受体结构域；FP，融合肽；IFP，內融合肽；HR1，七肽重复区1；HR2，七肽重复区2；PTM，近膜区；TM，跨膜区。

上述如SEQ ID No.1所示的蛋白是基于受体结合区即RBD(319-541位氨基酸)来设计的抗SARS-CoV-2感染药物。为在本发明蛋白的氨基酸序列中插入蛋白标签，序列第1位的氨基酸R也可以缺失，即氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

优选地，如SEQ ID No.3所示的蛋白在541位氨基酸后延长了4个氨基酸NFNG，即受体结合区即RBD实际上是319-545位氨基酸，能够增强本发明抗SARS-CoV-2蛋白的稳定性。为在本发明蛋白的氨基酸序列中插入蛋白标签，序列第1位的氨基酸R也可以缺失，即氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。

进一步地，在蛋白的C端融合8xHis蛋白标签，能够方便蛋白的纯化。

本发明提供了所述蛋白的前体：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。

优选地，所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

进一步地，所述的前体在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。

优选地，所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

进一步地，所述前体的氨基酸序列选自SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.14中至少一种。

SEQ ID No.5(昆虫细胞信号肽+S蛋白RBD+His标签的氨基酸序列)：

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGHHHHHHHH

SEQ ID No.6(昆虫细胞信号肽+大肠杆菌Trx(硫氧还蛋白)+S蛋白RBD的氨基酸序列)：

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.7(昆虫细胞信号肽+昆虫Trx(硫氧还蛋白)+S蛋白RBD的氨基酸序列)：

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIVVLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No.14(人IL6蛋白信号肽+8×His信号肽+EK酶酶切位点+RBD 320-545226aa的氨基酸序列)：

MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPHHHHHHHHDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

本发明提供了所述的蛋白和/或所述的前体在制备预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的药物中的用途。

本发明提供了预防和/或治疗SARS-CoV-2感染的疫苗，它含有所述的蛋白和/或所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

进一步地，所述的辅助性成分为免疫佐剂。

优选地，所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A(MPL)、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、鲨烯水包油乳剂(MF59)、重组霍乱毒素(rCTB)、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料、CpG ODN(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列,人工合成的CpG)。

进一步地，所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种。

进一步地，所述的钙盐为磷酸三钙。

进一步地，所述的植物皂苷为QS–21或ISCOM。

进一步地，所述的植物多糖为黄芷多糖(APS)。

进一步地，所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、胆固醇(Chol)、二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)。

进一步地，所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：(2,3-二油氧基丙基)三甲基氯化铵(DOTAP)、N-[1-(2,3-二油酰氯)丙基]-N,N,N-氯化三甲胺(DOTMA)、阳离子胆固醇(DC-Chol)、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-(2-精胺甲酰氨基)乙基铵(DOSPA)、溴化三甲基十二烷基铵(DTAB)、溴化三甲基十四烷基铵(TTAB)、溴化三甲基十六烷基铵(CTAB)、溴化二甲基双十八烷基铵(DDAB)。

进一步地，所述的疫苗为注射制剂。

优选地，所述的疫苗为肌肉注射制剂。

本发明提供了多核苷酸，它编码所述的蛋白或所述的前体。

进一步地，所述多核苷酸的核苷酸序列选自SEQ ID No.8、SEQ ID No.9、SEQ IDNo.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13中至少一种。

SEQ ID No.8(昆虫细胞信号肽+S蛋白RBD+His标签，经过优化的相应核苷酸序列)：

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAATCTCATCAGGGCTTCAACAAAGAACATACTTCAAAAATGGTCTCCGCTATCGTGCTGTACGTGCTCCTCGCTGCTGCTGCTCACTCTGCTTTCGCTGCTGACGAATTCAGGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTCACCACCACCACCACCACCACCACTGATAAGCTT

SEQ ID No.9(昆虫细胞信号肽+大肠杆菌Trx(硫氧还蛋白)+S蛋白RBD的相应核苷酸序列)：

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAGAGCCACCAGGGCTTCAACAAGGAACACACTTCCAAGATGGTGTCCGCCATCGTCCTGTACGTGCTGCTGGCCGCCGCTGCTCACAGCGCTTTCGCCGCTGACAGCGACAAGATCATCCACCTGACTGACGACAGCTTCGACACTGACGTGCTGAAGGCTGACGGTGCTATCCTGGTCGACTTCTGGGCCGAGTGGTGCGGCCCTTGCAAGATGATCGCTCCCATCCTGGACGAGATCGCCGACGAGTACCAGGGTAAACTGACTGTGGCCAAGCTGAACATCGACCAGAACCCCGGTACTGCTCCTAAGTACGGCATCCGTGGTATCCCCACTCTGCTGCTGTTCAAGAACGGTGAGGTGGCCGCTACCAAGGTCGGTGCTCTGAGCAAGGGCCAGCTGAAGGAGTTCCTGGACGCTAACCTGGCTGGTTCCGGCAGCGGCCACATGCACCACCACCACCATCACAGCAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAA AAGCTT

SEQ ID No.10(昆虫细胞信号肽+昆虫Trx(硫氧还蛋白)+S蛋白RBD的相应核苷酸序列)：

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACCAGCAAGATGGTGAGCGCTATCGTGCTGTACGTCCTGCTGGCCGCTGCTGCTCACAGCGCTTTCGCTGCTGACTCCATCCACATCAAGGACAGCGACGACCTGAAGAACCGTCTGGCCGAGGCCGGTGACAAGCTGGTCGTCATCGACTTCATGGCCACTTGGTGCGGTCCTTGCAAGATGATCGGCCCTAAGCTGGACGAGATGGCTAACGAGATGTCCGACTGCATCGTGGTCCTGAAGGTGGACGTCGACGAGTGCGAGGACATCGCCACCGAATACAACATCAACAGCATGCCCACCTTCGTGTTCGTGAAGAACAGCAAGAAGATCGAGGAATTTTCCGGCGCTAACGTCGACAAGCTGCGTAACACCATCATCAAGCTGAAGCTGGCCGGCTCCGGCTCCGGCCACATGCATCACCACCACCACCATTCCTCCGGTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAA AAGCTT

SEQ ID No.11，包括酶切位点BglII(1～6位)+EK酶切位点(7～21位)+经大肠杆菌偏爱密码子优化的S-RBD(aa320-545)+酶切位点Xho I(最后6位)：

AAGCTTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCGACCGAAAGCATTGTGCGCTTTCCGAACATTACCAACCTTTGTCCTTTCGGTGAGGTATTCAATGCAACACGCTTTGCTTCAGTTTATGCTTGGAACCGCAAACGCATTTCAAACTGTGTTGCTGATTATTCAGTTCTTTATAACTCAGCTTCATTCTCCACCTTTAAATGTTATGGCGTTTCACCTACAAAGCTGAATGATCTTTGTTTCACCAATGTTTATGCTGATTCATTTGTTATTCGCGGCGATGAAGTTCGCCAGATTGCTCCTGGCCAGACAGGCAAGATAGCCGATTATAACTATAAACTTCCTGATGATTTCACGGGATGTGTTATTGCTTGGAACTCAAACAACCTTGATTCAAAGGTCGGTGGCAACTATAACTATCTTTATCGCCTGTTCCGGAAGTCAAACCTTAAACCTTTCGAGAGAGATATTTCAACAGAAATTTATCAGGCTGGCTCAACACCTTGTAACGGCGTTGAAGGCTTTAACTGTTATTTCCCACTGCAAAGCTATGGCTTTCAGCCTACAAACGGCGTTGGCTATCAGCCTTATCGCGTTGTTGTTCTTTCATTTGAACTTCTTCATGCTCCTGCTACAGTTTGTGGCCCTAAGAAAAGCACTAATCTGGTGAAAAACAAATGTGTGAACTTTAACTTTAACGGCTGATAACTCGAG

SEQ ID No.12，包括酶切位点XhoI(1～6位)+信号肽切割位点(7～12位)+经大肠杆菌偏爱密码子优化的S-RBD(aa320-545)+酶切位点Xba I(最后6位)：

CTCGAGAAAAGAGTTCAACCTACAGAATCAATCGTTAGATTTCCTAACATCACAAACCTTTGTCCTTTCGGCGAGGTCTTCAATGCCACAAGATTTGCATCAGTTTATGCATGGAACAGAAAGCGTATATCAAACTGTGTTGCAGATTATTCAGTTCTTTATAACTCAGCATCATTCTCTACCTTTAAATGTTATGGAGTTTCACCTACAAAGCTCAATGATCTTTGTTTCACTAATGTTTATGCAGATTCATTTGTTATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAAATCGCACCTGGACAAACAGGAAAGATTGCCGATTATAACTATAAACTTCCTGATGATTTCACCGGCTGTGTTATCGCATGGAACTCAAACAATCTCGACAGCAAAGTAGGTGGGAATTACAATTACTTGTACCGGCTATTTAGGAAGTCCAACCTCAAGCCGTTCGAGCGCGATATCTCAACAGAAATCTATCAAGCAGGATCAACACCTTGTAACGGAGTTGAAGGATTTAACTGTTATTTCCCGCTACAATCATATGGATTTCAACCTACAAACGGAGTTGGATATCAACCTTATAGAGTTGTTGTTCTTTCATTTGAACTTCTTCATGCACCTGCAACAGTTTGTGGACCTAAGAAGTCTACGAACCTTGTTAAGAATAAGTGTGTTAACTTTAACTTTAACGGATGATAATCTAGA

SEQ ID No.13(人IL6蛋白信号肽+8×His信号肽+EK酶酶切位点+RBD 320-545226aa)：

ATGAACAGCTTCAGCACCAGCGCCTTCGGCCCCGTGGCCTTCAGCCTGGGCCTGCTGCTGGTGCTGCCCGCCGCCTTCCCCGCCCCCCACCACCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCTGA

本发明提供了重组载体，它含有所述多核苷酸。

进一步地，所述的重组载体采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。

优选地，所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。

优选地，所述的大肠杆菌表达载体为pET32a。

优选地，所述的酵母表达载体为pPICZaA；

优选地，所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。

进一步优选地，所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

本发明提供了宿主细胞，它含有所述的重组载体。

进一步地，所述的宿主细胞采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。

优选地，所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种。

优选地，所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。

本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：培养所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白或前体，然后回收所述的蛋白，即得。

本发明提供了所述蛋白的制备方法，包括如下步骤：构建含有所述多核苷酸的重组载体，对人体进行免疫，产生所述的蛋白。

进一步地，所述的载体选自如下至少一种：mRNA、DNA疫苗、腺病毒、安卡拉痘苗病毒vaccinia Ankara virus、腺相关病毒。

本发明提供了抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗，主要是针对SARS-CoV-2病毒的S蛋白，特别是通过阻断S蛋白的ACE2受体结合区，诱导体内产生抗体等免疫反应，阻断SARS-CoV-2的S蛋白与宿主细胞ACE2受体的结合，从而帮助宿主抵抗冠状病毒感染。

附图说明

图1为试验例1中本发明蛋白与ACE2蛋白的亲和力检测结果图；

图2为试验例2中抗体滴度检测结果图；

图3为试验例3中ELISA测定新型冠状病毒肺炎病人的抗体与本发明蛋白的反应结果图；

图4为试验例4中RBD蛋白与ACE2受体结合的阻断实验结果图；

图5为试验例5中中和抗体检测结果图；

图6为试验例5中肺组织的病毒gRNA和sgRNA拷贝检测结果图；

图7为试验例5中咽拭子的病毒gRNA和sgRNA拷贝检测结果图；

图8为试验例5中肛门拭子的病毒gRNA和sgRNA拷贝检测结果图；

图9为试验例5中肺组织切片染色图；

图10为试验例6中小鼠SARS-CoV-2病毒感染攻毒试验结果图；

图11为试验例7中细胞因子INF-γ和IL-4检测结果图；

图12为试验例8中细胞因子水平检测结果图；

图13为SARS-CoV-2病毒S蛋白的胞外段构成示意图；

图14为实施例3中大肠杆菌表达载体pET32a谱图；

图15为实施例4中酵母表达载体pPICZaA谱图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

S蛋白是一种糖基化蛋白，优选采用昆虫杆状病毒表达系统或哺乳动物细胞表达体系(CHO表达系统)，能够更好地获得天然的S蛋白。具体制备方法如下：

实施例1用昆虫杆状病毒表达系统制备本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白

载体构建：利用昆虫杆状病毒表达系统产生的重组蛋白主要是利用S蛋白受体结合区(RBD)。SARS-CoV-2病毒S蛋白为定位于病毒包膜上的蛋白，为了模拟其分泌过程，在构建S蛋白受体结合区(RBD)时，在其N端加入了GP67信号肽，以辅助蛋白的分泌表达，这一信号肽将在蛋白分泌的过程中自发被昆虫细胞所切除。同时，为了便于纯化与增加蛋白的水溶性，还在序列中引入了硫氧还蛋白标签以及肠激酶(EK酶)酶切位点。完整的核苷酸序列如SEQ ID No.8或SEQ ID No.10所示。基于pFastBac1载体(氨苄抗性)构建S蛋白RBD结构域的表达载体，使用BamHI，HindIII酶切位点插入到pFast-bacI载体中，按昆虫细胞偏爱密码子优化。

重组杆状病毒的扩增：采用Bac-to-Bac表达系统，利用细菌转座子原理，通过Tn7转座元件产生位点特异性转座，在大肠杆菌(DH10Bac，含bacmid(卡那霉素抗性)和helperplasmid(四环霉素抗性))内完成重组bacmid的构建。提取重组成功的bacmid，用Cellfectin II将其转染至sf9昆虫细胞以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。转染72h后收取第一代病毒，然后进行P2到P4代病毒的扩增，利用P3或P4代病毒表达蛋白。

蛋白表达：利用P3或P4代病毒感染Hi5昆虫细胞(也可用sf9和sf21细胞)，感染复数(MOI为0.5-10),培养48-72h后收集上清。最佳收获时间根据毒种病毒量和细胞状态可能每次都有差异，一般以镜检50％左右细胞病变为宜。

蛋白纯化：收获的培养上清4℃高速离心，0.22um滤膜过滤，采用亲合纯化方法(Histrap镍柱)初步纯化重组蛋白，然后利用MonoQ离子柱和Superdex20010/300GL分子筛精纯重组蛋白，SDS-PAGE鉴定蛋白纯度，纯度要求达到95％以上。用酶切缓冲液将制备的蛋白溶解或稀释至1～5mg/ml。根据1U的肠激酶(EK酶)可以酶切50μg重组蛋白的比例加入相应量的肠激酶(EK酶)，混匀，在25℃静置酶切16h，即可切除重组蛋白的标签。其中，用SEQID No.8所示的核苷酸表达出蛋白SEQ ID No.3，用SEQ ID No.10所示的核苷酸表达出蛋白SEQ ID No.4。所得重组蛋白即可用于动物免疫等后续研究。

实施例2用CHO细胞表达系统制备本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白

利用CHO细胞产生的重组蛋白疫苗主要是针对S蛋白受体结合区(RBD)，将这些片段按密码子偏好性进行基因合成，并以多聚组氨酸作为纯化标签(6His)，完整的核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。随后构建至高表达载体pTT5上，表达氨基酸序列如SEQ ID No.14所示的前体蛋白。

实施例3在大肠杆菌中表达本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白

使用pET32a(Novagen公司)作为表达载体(质粒图谱见图14)，它包含T7启动子，受IPTG调节下游目的基因的转录。表达产物的N-端与硫氧还蛋白(Trx)融合，可利用金属螯合柱亲和层析一步纯化。为了在目的蛋白纯化后将Trx去除，在Trx后又加上了肠激酶的酶切位点。完整的核苷酸序列如SEQ ID No.11所示。

将重组表达质粒分别在大肠杆菌菌株BL21(DE3)中进行表达，电泳结果表明得到的目的蛋白大小与预计相似，并经Western Blot鉴定。目的蛋白的含量可达总蛋白量的30％以上，主要以包涵体形式存在，在变性条件下可经金属螯合柱亲和层析一步得到纯化，纯度可达95％以上，产量可达200－400mg/L。目的蛋白可通过透析得到复性，其复性效率可达50％以上。

为了降低生产成本，用反相柱代替金属螯合柱可同样一步层析得到高纯度的目的蛋白，纯度可达95％以上。

实施例4在酵母中表达本发明抗SARS-CoV-2感染的蛋白

将如SEQ ID No.12所示的核苷酸序列克隆到酵母的表达载体――pPICZaA(Invitrogen公司，酵母表达载体pPICZaA的图谱见图15)的双酶(Xho I/Xba I)位点中，以利用甲醇酵母中的a因子分泌信号分泌表达该蛋白。

利用pPICZaA质粒介导S-RBD基因整合到甲醇酵母染色体上后，用甲醇诱导目的蛋白的表达。表达的目的蛋白是以可溶的形式存在于甲醇酵母的培养基中，利用反相柱层析可一步纯化，表达量可达到200-400mg/L。

实施例5本发明抗SARS-CoV-2感染的疫苗的制备

在无菌条件下进行抗原配制。以5mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释纯化后的重组蛋白抗原(根据实施例1～4制备)至浓度为80mcg/mL。在无菌条件下配制佐剂，5mmol/L磷酸缓冲液(pH7.2)稀释氢氧化铝佐剂原液(氢氧化铝含量是14.55mg/mL)至浓度为2.0mg/mL。在无菌条件下进行抗原-佐剂吸附，按照20mL/min的速度，将稀释后的蛋白抗原液体滴加至稀释后的氢氧化铝佐剂工作液中，体积比为(V/V)1：1，使混合液中重组蛋白抗原终浓度为40mcg/mL，铝佐剂终浓度为1.0mg/mL。保持反应温度为25℃，搅拌速度为800rpm。滴加完成后继续保持25℃、800rpm搅拌吸附60min。调节混合后溶液pH至7.2。4℃避光保存。对吸附后的疫苗制剂进行表征，包括粒径、点位、抗原含量、佐剂含量、吸附率、pH值、内毒素、佐剂-抗原吸附率、吸附强度及其保持状态、吸附后抗原完整性和稳定性等。灌装。将检测合格的疫苗制剂灌装如1mL无菌西林/安瓿瓶中，1mL/瓶。灌装时应不停搅拌，使灌装液均匀。罐装后立即封盖，贴上编号标签，4℃避光保存。

以下通过试验例证明本发明的有益效果。

试验例1利用表面等离子共振分析(Surface plasmon resonance，SPR)检测本发明蛋白与ACE2蛋白的亲和力

使用大分子相互作用仪Biacore 8K(瑞典GE Healthcare公司)进行表面等离子共振检测。ACE2-Fc抗体预先以～100RU的捕获响应值(response unit，RU)锚定在SensorChip Protein A芯片表面。当进行动力学分析时，将氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的本发明RBD蛋白以2倍等比例稀释的浓度梯度(1、2、4、6、8、16、32nM)分别流经芯片表面，并设置另一通道为对空白照组。使用HBS-EP⁺解离溶液以30mL/min的流速进行时长为300秒的抗原解离，随后以pH为1.5的甘氨酸溶液作为芯片的再生溶液对芯片进行时长为60秒的再生。在此过程中，分别检测ACE2-Fc抗体与本发明RBD蛋白的结合常数(K_a)和解离常数(K_d)，并计算其亲和力(K_D)。

结果如图1所示，显示本发明RBD蛋白可以高效且特异性地与ACE2受体蛋白结合，并提示本发明RBD蛋白可能保持了完整的空间结构，与病毒的S蛋白RBD一样具有ACE2受体能力，为体外重组的S蛋白RBD作为疫苗提供了有力的支撑。其亲和力K_D达到1.52×10^-8M(mol/L)，解离常数K_d为4.41×10^-2(s^-1)、结合常数K_a为3.85×10⁶(Ms^-1)。

试验例2本发明疫苗在接种过的小鼠体内诱导出RBD特异性抗体

免疫动物实验：使用BALB/c小鼠或C57BL/6小鼠，所用的重组蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)的剂量为0.1ug到10.0ug/只；每组5到10只小鼠。每只小鼠注射疫苗(根据实施例5制备)的容积为50μL，在右后腿肌肉注射(im)，免疫接种的方案分为两种：第一种为第1、7与21天；第二种方案为：第1、14、21天。

ELISA(酶联免疫吸附试验)测定小鼠血清抗体：在小鼠每次免疫后的第7天，用毛细管眼眶采血法收集小鼠血浆，每组收集5只。室温放置1-2h凝固后，4℃，3000rpm/min离心10min后，取上层血清保存于-20℃备用。ELISA测定血清IgG及亚型的方法：用50mM碳酸盐包被缓冲液(PH9.6)配制1μg/ml的重组蛋白S-Fc或RBD-Fc溶液，按照100μl/孔加入到96孔包被板中(Thermo Scientific公司，NUNC-MaxiSorp),4℃包被过夜。50mM碳酸盐包被缓冲液(PH9.6)的配制，称取0.15g Na2CO3和0.293g NaHCO3，用双蒸水溶解后，调节PH到9.6，然后定容至100ml，保存于4℃备用。次日用含0.1％Tween20的PBS溶液(PBST)洗涤3次后，用含1％BSA或者5％脱脂牛奶的封闭液(配制在PBST中)室温封闭1h后，PBST洗涤1次。将小鼠血清用封闭液稀释成不同比例后，按照100μl/孔加入，37℃孵育1h-2h，然后用PBST洗涤3次。然后按照100μl/孔加入HRP-山羊抗鼠IgG或者HRP-抗鼠IgG1,IgM等亚型抗体(均是1:5000稀释于封闭液中)，37℃孵育1h后，PBST洗涤5次。最后加入100μl/孔3,3',5,5'-四甲基联苯二胺(TMB)，避光显色10-15min后，加入50μl/孔1M H2SO4终止液，混匀后在酶标仪上450nm波长处读数。1M H2SO4终止液的配制，向47.3mL双蒸水中逐滴加入2.7mL的浓硫酸(98％)。

结果如图2所示，为测量重组蛋白诱导的RBD特异性抗体的滴度，将血清连续不同倍稀释后用滴定法测量，并测量A450光密度值。图2显示，重组蛋白疫苗激发了明显的S蛋白RBD特异性抗体，接种7天后收集的血清显示出强抗体反应，IgG(图2A)与IgM(图2B)在不同的比例升高，这提示该疫苗可以快速诱导免疫反应，对冠状病毒肺炎的预防非常重要，而接种生理盐水的对照组的A450光密度值明显的低。这一结果表明，重组S蛋白RBD疫苗在小鼠体内具有高度的免疫原性。

试验例3 ELISA测定新型冠状病毒肺炎病人的抗体与本发明蛋白的反应

本实验收集了SARS-CoV-2感染患者的16个血清样本，目的是研究本发明RBD蛋白在人体中的免疫原性。检测时使用ELISA测定法，具体操作如下：

以RBD蛋白(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示)包被96孔板，包被浓度0.2ug/孔，100ul/孔，4℃，过夜。包被时设置阴性对照孔。次日取出96孔板，室温复温半小时后，PBS洗板4次，每次1分钟。1％BSA封闭96孔板，100ul/孔，37℃孵育30分钟，再PBS洗板4次，每次1分钟。将血清稀释5倍即每孔血清20ul加pbs80ul。37℃孵育60分钟，再PBS洗板4次，每次1分钟，进而加HRP标记的二抗(抗人IgG/IgM抗体)：原液按1：2000稀释后每孔加入100ul，37℃孵育30分钟。PBS洗板4次，每次1分钟。显色：每孔先加入A液50ul，再加入B液50ul。室温静置15分钟。终止：每孔加入终止液100ul。10分钟之内酶标仪比色。在这一实验中，检测IgM抗体时，加样方式为每孔15ul血清加15ulPBS，再加入IgG吸附剂150ul。10000rpm离心10分钟后取上清100ul检测。

结果如图3所示，所有来自于16个SARS-CoV-2感染患者的血清对本发明RBD蛋白反应明显，IgM与IgG反应均阳性，然而，10名健康人的血清对该抗原呈阴性反应，说明SARS-CoV-2的S蛋白RBD作为疫苗在病人体内具有高度的免疫原性，本发明制备的RBD蛋白能被人体免疫系统认识。

试验例4 RBD蛋白与ACE2受体结合的阻断实验

本实验使用了细胞表达的ACE2，该蛋白被认为可以保留天然构象，以便用流式细胞仪检测RBD结合活性。具体操作如下：

消化并收集体外培养的高表达ACE2细胞株(肺癌A549)到流式管中，106个细胞/管，用PBS/HBSS洗涤数次。向每管细胞中加入终浓度1ug/ml的重组RBD-Fc蛋白；再加入免疫的抗RBD小鼠的血清(将试验例2获得的小鼠血清稀释50倍使用)，室温孵育30min。其中一管阳性对照管不加抗血清或者加未免疫小鼠的正常血清。用PBS/HBSS洗涤数次后再加入Anti-Human IgG(Fcspecific)-FITC(SIGMA)荧光二抗(1:100-1:200),室温避光孵育30min。用PBS/HBSS洗涤数次后，加入500μl含1％多聚甲醛的PBS固定后，流式上机检测。

结果如图4所示，加入RBD-Fc蛋白可与表达ACE2的细胞显著结合，如果未添加RBD-Fc蛋白(阴性对照)，则仅检测到背景信号。小鼠抗血清有效地阻断了RBD-Fc蛋白与表达ACE2的细胞的结合，而相同稀释度的未免疫或免疫前的血清则没有抑制活性。

试验例5使用活SARS-CoV-2进行非人灵长类动物(恒河猴)的攻毒实验

1、实验方法

所有涉及非人灵长类动物研究的程序均经过中国医学科学院医学生物学动物保护与使用委员会审阅和批准，并在中国云南昆明国家高等级生物安全灵长类动物研究中心的动物生物安全4级(ABSL-4)设施中进行。本实验所用RBD蛋白即本发明氨基酸序列如SEQID No.4所示的蛋白，疫苗根据实施例5制备。将12只非人灵长类动物(恒河猴)(5-9年龄)用于活SARS-CoV-2攻毒实验，分组如下：(a)每剂40μg RBD蛋白加氢氧化铝佐剂的疫苗组(4只)，(b)每剂20μg RBD蛋白加氢氧化铝佐剂的疫苗组(3只)，(c)生理盐水组对照组(3只)，(d)仅氢氧化铝佐剂对照组(2只)。非人灵长类动物在第0天和第7天通过肌肉注射免疫，然后在首次免疫28天后使用SARS-CoV-2经鼻攻毒(0.5ml,10⁶pfu/毫升)。为了评估SARS-CoV-2感染的中和作用，在第一次免疫后28天与35天(接种病毒后第5天)采集血清用于中和抗体测定。将Vero E6细胞(5×10⁴/孔)接种在96孔板中并培养过夜。将100倍TCID50(50％组织培养感染剂量)的SARS-CoV-2与等体积的稀释血清预孵育，在37℃孵育1小时后，将混合物添加到Vero E6细胞中。感染后第3天，在显微镜下记录细胞病变效应(CPE)，并计算产生EC50抑制(50％中和)的血清稀释液的中和滴度。对照组包括采用生理盐水组或氢氧化铝单独处理的猴血清。

通过定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)测定病毒基因组RNA(gRNA)和病毒亚基因组RNA(sgRNA，代表病毒的复制)的含量。根据WHO和中国疾控中心推荐的序列，使用qRT-PCR法测定肺组织、咽喉拭子和肛门拭子中的病毒载量，其中所用的引物和探针序列来自NP基因：

正向：5’-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3’(SEQ ID No.15)；

反向：5’-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3’(SEQ ID No.16)；

探针：5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'(SEQ ID No.17)；

参考TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix(货号:4444434)使用说明，反应体系为10μL：正向引物1μL，反向引物1μL，探针0.25μL，mRNA模板2.5μL，Master Mix 2.5μL，RNase-Free H2O 2.75μL。PCR程序设定与运行参考BioRad CFX384 Real Time PCR System仪器操作：逆转录(25℃孵育2min、50℃孵育15min)；起始(95℃孵育2min)；两步扩增，40个循环(95℃孵育5s、58℃孵育31s)。

测定指示病毒复制的SARS-CoV-2E基因的亚基因组mRNA(sgmRNA)的含量，其中使用的引物和探针序列：

正向：5’-GCTAGAGAACATCTAGACAAGAG-3’(SEQ ID No.18)；

反向：5’-ACACACGCATGACGACGTTATA-3’(SEQ ID No.19)；

探针：5’-FAM-TGTGATCGGTAGGAATGACGCGAAGC-Quencher-3’(SEQ ID No.20)；反应体系及PCR程序与gRNA测定一致。

石蜡包埋切片，收集组织并用10％中性福尔马林固定，包埋于石蜡中。切片厚度5μm，并使用苏木精和伊红(HE)染色。

2、实验结果

在所有接种了疫苗的非人灵长类动物中均检测到针对活SARS-CoV-2的中和抗体，而在两个对照组中均未检测到中和抗体，如图5所示。

采用定量实时逆转录PCR(qRT-PCR)检测病毒基因组RNA(gRNA)和病毒亚基因组RNA(sgRNA，代表病毒复制)。攻击后第7天收集非人灵长类动物的肺组织以评估病毒复制状态。对照组(生理盐水组和氢氧化铝佐剂组)的肺组织中显示出过量的病毒gRNA和sgRNA拷贝；相比之下，在以20μg和40μg RBD蛋白加佐剂的疫苗接种的组中均无可测到的病毒复制(图6)。此外，对照组(生理盐水组和氢氧化铝佐剂组)在接种后3天观察到咽喉拭子中的病毒gRNA的峰值载量，并且这些病毒峰值可以被使用疫苗阻断，接种20μg和40μg疫苗组的病毒负荷仅为百万分之1.6和3.8；重要的是，20μg和40μg疫苗组受到病毒攻击后，咽拭子均未观察到可测到的sgRNA，而对照组(生理盐水组和氢氧化铝佐剂组)中的sgRNA含量较高，表明病毒在复制(图7)。在接种后第5天和6天，对照组(生理盐水组和氢氧化铝佐剂组)肛门拭子中可观察到病毒gRNA和sgRNA的峰值载量，但在接种组中只检测到极低水平，并且接种过20μg和40μg疫苗的非人灵长类动物的肛门拭子中没有可测到的sgRNA(图8)。以上结果说明接种本发明RBD蛋白疫苗能预防SARS-CoV-2感染。

两个对照组(生理盐水组和氢氧化铝佐剂组)的肺组织显示出SARS-CoV-2病毒性间质性肺炎的典型组织病理学变化，这是COVID-19的关键特征。如图9所示，显微镜下可见明显增厚的肺泡壁，大量间质单核炎性细胞浸润。肺泡腔内也有大量炎性浸润和浆液性渗出物，伴随着可辨认的肺组织结构的消失。此外，还观察到弥漫性出血和II型肺细胞增生。相比之下，接种RBD蛋白疫苗(20μg或40μg)的非人灵长类动物则没有显示出明显的组织病理学变化，具有正常的肺组织外观。

试验例6小鼠SARS-CoV-2病毒感染攻毒试验

小鼠免疫，6至8周龄的BALB/c或C57BL/6小鼠以不同剂量(每只0.1-20μg)和间隔时间肌肉注射重组RBD蛋白疫苗(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白，疫苗根据实施例5制备)。比如，小鼠在第0天接受一次注射，在第7天采集血清，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水。在免疫后的7天后再次收集血清。血清在4℃保存直到用于实验。由北京联合医学院实验动物科学研究所建立的SPF级hACE2转基因小鼠被用于SARS-CoV-2感染的动物实验。在第1次接种的7天后采集0.8ml血清，疫苗免疫的小鼠血清作为实验组，生理盐水处理的小鼠正常血清作为对照，在SARS-CoV-2病毒攻击(经鼻内感染，剂量为10⁵TCID50)前1天腹腔注射至hACE2转基因小鼠。此外，感染该病毒且不接受血清的小鼠作为对照。病毒攻击5天后处死小鼠，切取小鼠的肺和其他器官。肺组织用于检测病毒复制或用10％缓冲福尔马林溶液固定用于组织病理学分析。用PowerUp SYBG Green Master Mix试剂盒(Applied Biosystems,USA)进行实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)反应，测定受SARS-COV-2攻击的小鼠肺组织中的病毒RNA拷贝数，并以肺组织的RNA拷贝数/ml表示。用于qRT-PCR的引物序列为针对SARS-cov-2的包膜(E)基因，如下：

前向：5’-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3’(SEQ ID No.21)；

反向：5’-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3’(SEQ ID No.22)。

切片用苏木精和伊红染色，光镜观察组织病理学变化。

本实验测试了疫苗接种的早期体液免疫是否能够阻止小鼠受SARS-CoV-2病毒感染。用SARS-CoV-2病毒攻击人ACE-2转基因小鼠，并于病毒攻击后5天收集小鼠肺组织，测量其接受免疫血清(第1次免疫接种后7天的血清)或对照组血清后的病毒复制情况。如图10所示，用RBD蛋白疫苗诱导的免疫血清处理小鼠后，定量实时逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)未检测到病毒复制，而对照组小鼠肺组织中病毒复制水平较高。相应地，对照组小鼠肺组织出现明显的间质性肺炎组织病理学变化，包括肺泡壁明显增厚，间质大量单核细胞和淋巴细胞浸润，栓塞，以及肺泡腔有血清渗出物。与此形成对照的是，重组RBD蛋白疫苗免疫小鼠的血清处理小鼠，未见组织病理学改变或轻微渗出。此外，接受免疫血清处理的小鼠在感染后的5天体重轻微增加(大约8％)，而对照组体重则无增加，未处理组体重降低8％。本实验进一步证实RBD蛋白疫苗诱导产生的抗体可以完全阻断病毒的感染。

试验例7本发明RBD蛋白疫苗诱导细胞免疫反应

小鼠免疫，6至8周龄的BALB/c或C57BL/6小鼠以不同剂量(每只0.1-20μg)和间隔时间肌肉注射重组RBD蛋白疫苗(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白，疫苗根据实施例5制备)。比如，小鼠在第0天接受一次注射，在第7天采集血清，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水。在免疫后的7天后再次收集脾脏的T淋巴细胞。为了探究细胞免疫反应，经S蛋白RBD或PBS免疫的小鼠被处死并提取其淋巴细胞用于IL-4,IFN-γ的ELISA检测。简言之，使用RPMI1640培养基(含有10％胎牛血清，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素，1mM丙酮酸，50μMβ-巯基乙醇，20U/mL IL-2)培养小鼠脾脏淋巴细胞(1×10⁶/mL)，同时加入1μg/mLRBD蛋白培养刺激72小时,未加RBD蛋白刺激的细胞作为阴性对照。收集上清进行ELISA。

由于细胞免疫反应可能在清除SARS-CoV-2感染中发挥作用，其中CD4和CD8阳性T细胞都参与了针对SARS病毒感染的免疫反应，因此，本实验还检测了疫苗潜在的细胞免疫反应。在第1次接种疫苗后的第7天收集淋巴细胞,用ELISA检测淋巴细胞产生的细胞因子如INF-γ(伽玛干扰素)和IL-4(白介素4)。用重组RBD蛋白刺激分离出的小鼠淋巴细胞，发现疫苗免疫后的小鼠淋巴细胞产生更多的IFN-γ和IL-4，而用生理盐水处理的小鼠淋巴细胞在RBD重组蛋白刺激后，只检测到背景水平的IFN-γ和IL-4(图11)。

试验例8本发明疫苗的安全性实验

使用本发明疫苗免疫小鼠，6至8周龄的BALB/c或C57BL/6小鼠以不同剂量(每只0.1-20μg)和间隔时间肌肉注射本发明重组RBD蛋白疫苗(氨基酸序列如SEQ ID No.3所示的蛋白，疫苗根据实施例5制备)。没有发现在心、脑、肝、脾、肺、肾等器官有病理学改变。也未发现血细胞以及血的生化指标改变。例如，本实验测量了血液中的细胞因子水平,观察疫苗接种是否会引起全身性炎症反应的细胞因子改变。小鼠在第0天接受一次注射，在第7天采集血清，对照组小鼠注射氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水。在第1次接种后的第7天收集小鼠血清，用ELISA检测TNF-α阿尔法-肿瘤坏死因子、IFN-γ(伽玛-干扰素)、IFN-α(阿尔法-干扰素)、IFN-β(贝塔-干扰素)、IL-6(白介素-6)、以及IL-4(白介素-4)细胞因子。使用Thermo Fisher Scientific-eBioscience Elisa试剂盒测定血清中细胞因子含量。简要操作如下：抗原包被，用包被缓冲液稀释抗原，200μL/孔，密封板并在4℃下孵育过夜，包被后弃去包被液，用>250μL/孔的洗涤缓冲液洗涤3次。用200μL ELISA/ELISPOT稀释液(1×)在室温下封闭1小时。按照说明书浓度要求准备标准品，对最高浓度标准品进行2倍系列稀释，总计8点，并以ELISA/ELISPOT稀释液(1×)作为对照。用ELISA/ELISPOT稀释液(1×)将血清稀释待用。洗涤孔板后上样，将100μL标准品和待检测样品加到孔板中，密封孔板并在室温下孵育2小时。用ELISA/ELISPOT稀释液(1×)稀释检测抗体，孔板洗涤3-5次，向所有孔中加入100μL/孔稀释的检测抗体，密封板并在室温下孵育1小时。用ELISA/ELISPOT稀释液(1×)稀释HRP标记抗体，孔板洗涤3-5次，加入每孔100μL稀释的抗生物素蛋白HRP，密封板并在室温下孵育30分钟。洗涤孔板5-7次，加入100μL/孔的1X TMB溶液，在室温下进行显色10-15分钟。加入100μL/孔的终止液进行终止。在450nm为检测波长，570nm为参比波长条件下进行读板。

实验结果发现，血液中的细胞因子水平在疫苗免疫组小鼠和对照组小鼠(氢氧化铝免疫佐剂或仅生理盐水)中没有区别(见图12)。上述实验结果表明，接种本发明疫苗可能不会引起全身性炎症反应。

需要说明的是，本说明书中描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例以及不同实施例的特征进行结合和组合。

序列表

<110> 四川大学

<120> 抗SARS-CoV-2感染的蛋白及疫苗

<130> A200520K（序）

<150> 202010113054.4

<151> 2020-02-24

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 2

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 3

<211> 227

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly

225

<210> 4

<211> 226

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

210 215 220

Asn Gly

225

<210> 5

<211> 274

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

35 40 45

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

50 55 60

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

65 70 75 80

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

85 90 95

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

100 105 110

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

115 120 125

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

130 135 140

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

145 150 155 160

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

165 170 175

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

180 185 190

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

195 200 205

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

210 215 220

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

225 230 235 240

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

245 250 255

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly His His His His His His

260 265 270

His His

<210> 6

<211> 395

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr

35 40 45

Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu

50 55 60

Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro

65 70 75 80

Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala

85 90 95

Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala

115 120 125

Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp

130 135 140

Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His

145 150 155 160

His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

165 170 175

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

180 185 190

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

195 200 205

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

210 215 220

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

225 230 235 240

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

245 250 255

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

260 265 270

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

275 280 285

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

290 295 300

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

305 310 315 320

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

325 330 335

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

340 345 350

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

355 360 365

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

370 375 380

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

385 390 395

<210> 7

<211> 394

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Ser Ile His Ile Lys Asp Ser Asp

35 40 45

Asp Leu Lys Asn Arg Leu Ala Glu Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Ile

50 55 60

Asp Phe Met Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Gly Pro Lys

65 70 75 80

Leu Asp Glu Met Ala Asn Glu Met Ser Asp Cys Ile Val Val Leu Lys

85 90 95

Val Asp Val Asp Glu Cys Glu Asp Ile Ala Thr Glu Tyr Asn Ile Asn

100 105 110

Ser Met Pro Thr Phe Val Phe Val Lys Asn Ser Lys Lys Ile Glu Glu

115 120 125

Phe Ser Gly Ala Asn Val Asp Lys Leu Arg Asn Thr Ile Ile Lys Leu

130 135 140

Lys Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His

145 150 155 160

Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

165 170 175

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

180 185 190

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

195 200 205

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

210 215 220

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

225 230 235 240

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

245 250 255

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

260 265 270

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

275 280 285

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

290 295 300

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

305 310 315 320

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

325 330 335

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

340 345 350

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

355 360 365

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

370 375 380

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

385 390

<210> 8

<211> 847

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ggatccatgc tgctggtcaa ccaatctcat cagggcttca acaaagaaca tacttcaaaa 60

atggtctccg ctatcgtgct gtacgtgctc ctcgctgctg ctgctcactc tgctttcgct 120

gctgacgaat tcagggtgca gccaaccgaa tctatcgtca gattcccaaa catcactaac 180

ctgtgccctt tcggagaggt gttcaacgct accaggttcg ccagcgtcta cgcttggaac 240

cgcaagcgta tcagcaactg cgtcgccgac tactctgtgc tgtacaactc cgctagcttc 300

tctactttca agtgctacgg cgtgtcacct accaagctga acgacctgtg cttcactaac 360

gtctacgccg actccttcgt gatccgcgga gacgaagtcc gtcagatcgc tcctggacag 420

accggaaaga tcgctgacta caactacaag ctgccagacg acttcactgg ctgcgtgatc 480

gcttggaact caaacaacct ggactccaag gtcggtggca actacaacta cctgtacagg 540

ctgttcagaa agtcaaacct gaagcctttc gagcgcgaca tctcaaccga aatctaccag 600

gctggttcca ctccctgcaa cggtgtggag ggcttcaact gctacttccc cctgcagtcc 660

tacggtttcc agccaaccaa cggagtcggt taccagcctt accgtgtggt cgtgctgagc 720

ttcgaactgc tccacgctcc tgctactgtg tgcggtccca agaagtctac taacctggtc 780

aaaaacaaat gtgtcaactt caacttcaac ggtcaccacc accaccacca ccaccactga 840

taagctt 847

<210> 9

<211> 1200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

ggatccatgc tgctggtcaa ccagagccac cagggcttca acaaggaaca cacttccaag 60

atggtgtccg ccatcgtcct gtacgtgctg ctggccgccg ctgctcacag cgctttcgcc 120

gctgacagcg acaagatcat ccacctgact gacgacagct tcgacactga cgtgctgaag 180

gctgacggtg ctatcctggt cgacttctgg gccgagtggt gcggcccttg caagatgatc 240

gctcccatcc tggacgagat cgccgacgag taccagggta aactgactgt ggccaagctg 300

aacatcgacc agaaccccgg tactgctcct aagtacggca tccgtggtat ccccactctg 360

ctgctgttca agaacggtga ggtggccgct accaaggtcg gtgctctgag caagggccag 420

ctgaaggagt tcctggacgc taacctggct ggttccggca gcggccacat gcaccaccac 480

caccatcaca gcagcggcga cgacgacgac aaggtgcagc caaccgaatc tatcgtcaga 540

ttcccaaaca tcactaacct gtgccctttc ggagaggtgt tcaacgctac caggttcgcc 600

agcgtctacg cttggaaccg caagcgtatc agcaactgcg tcgccgacta ctctgtgctg 660

tacaactccg ctagcttctc tactttcaag tgctacggcg tgtcacctac caagctgaac 720

gacctgtgct tcactaacgt ctacgccgac tccttcgtga tccgcggaga cgaagtccgt 780

cagatcgctc ctggacagac cggaaagatc gctgactaca actacaagct gccagacgac 840

ttcactggct gcgtgatcgc ttggaactca aacaacctgg actccaaggt cggtggcaac 900

tacaactacc tgtacaggct gttcagaaag tcaaacctga agcctttcga gcgcgacatc 960

tcaaccgaaa tctaccaggc tggttccact ccctgcaacg gtgtggaggg cttcaactgc 1020

tacttccccc tgcagtccta cggtttccag ccaaccaacg gagtcggtta ccagccttac 1080

cgtgtggtcg tgctgagctt cgaactgctc cacgctcctg ctactgtgtg cggtcccaag 1140

aagtctacta acctggtcaa aaacaaatgt gtcaacttca acttcaacgg ttaaaagctt 1200

<210> 10

<211> 1197

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggatccatgc tgctggtcaa ccagagccac cagggtttca acaaggaaca caccagcaag 60

atggtgagcg ctatcgtgct gtacgtcctg ctggccgctg ctgctcacag cgctttcgct 120

gctgactcca tccacatcaa ggacagcgac gacctgaaga accgtctggc cgaggccggt 180

gacaagctgg tcgtcatcga cttcatggcc acttggtgcg gtccttgcaa gatgatcggc 240

cctaagctgg acgagatggc taacgagatg tccgactgca tcgtggtcct gaaggtggac 300

gtcgacgagt gcgaggacat cgccaccgaa tacaacatca acagcatgcc caccttcgtg 360

ttcgtgaaga acagcaagaa gatcgaggaa ttttccggcg ctaacgtcga caagctgcgt 420

aacaccatca tcaagctgaa gctggccggc tccggctccg gccacatgca tcaccaccac 480

caccattcct ccggtgacga cgacgacaag gtgcagccaa ccgaatctat cgtcagattc 540

ccaaacatca ctaacctgtg ccctttcgga gaggtgttca acgctaccag gttcgccagc 600

gtctacgctt ggaaccgcaa gcgtatcagc aactgcgtcg ccgactactc tgtgctgtac 660

aactccgcta gcttctctac tttcaagtgc tacggcgtgt cacctaccaa gctgaacgac 720

ctgtgcttca ctaacgtcta cgccgactcc ttcgtgatcc gcggagacga agtccgtcag 780

atcgctcctg gacagaccgg aaagatcgct gactacaact acaagctgcc agacgacttc 840

actggctgcg tgatcgcttg gaactcaaac aacctggact ccaaggtcgg tggcaactac 900

aactacctgt acaggctgtt cagaaagtca aacctgaagc ctttcgagcg cgacatctca 960

accgaaatct accaggctgg ttccactccc tgcaacggtg tggagggctt caactgctac 1020

ttccccctgc agtcctacgg tttccagcca accaacggag tcggttacca gccttaccgt 1080

gtggtcgtgc tgagcttcga actgctccac gctcctgcta ctgtgtgcgg tcccaagaag 1140

tctactaacc tggtcaaaaa caaatgtgtc aacttcaact tcaacggtta aaagctt 1197

<210> 11

<211> 711

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

aagcttgacg acgacgacaa ggtgcagccg accgaaagca ttgtgcgctt tccgaacatt 60

accaaccttt gtcctttcgg tgaggtattc aatgcaacac gctttgcttc agtttatgct 120

tggaaccgca aacgcatttc aaactgtgtt gctgattatt cagttcttta taactcagct 180

tcattctcca cctttaaatg ttatggcgtt tcacctacaa agctgaatga tctttgtttc 240

accaatgttt atgctgattc atttgttatt cgcggcgatg aagttcgcca gattgctcct 300

ggccagacag gcaagatagc cgattataac tataaacttc ctgatgattt cacgggatgt 360

gttattgctt ggaactcaaa caaccttgat tcaaaggtcg gtggcaacta taactatctt 420

tatcgcctgt tccggaagtc aaaccttaaa cctttcgaga gagatatttc aacagaaatt 480

tatcaggctg gctcaacacc ttgtaacggc gttgaaggct ttaactgtta tttcccactg 540

caaagctatg gctttcagcc tacaaacggc gttggctatc agccttatcg cgttgttgtt 600

ctttcatttg aacttcttca tgctcctgct acagtttgtg gccctaagaa aagcactaat 660

ctggtgaaaa acaaatgtgt gaactttaac tttaacggct gataactcga g 711

<210> 12

<211> 702

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ctcgagaaaa gagttcaacc tacagaatca atcgttagat ttcctaacat cacaaacctt 60

tgtcctttcg gcgaggtctt caatgccaca agatttgcat cagtttatgc atggaacaga 120

aagcgtatat caaactgtgt tgcagattat tcagttcttt ataactcagc atcattctct 180

acctttaaat gttatggagt ttcacctaca aagctcaatg atctttgttt cactaatgtt 240

tatgcagatt catttgttat cagaggagat gaagttagac aaatcgcacc tggacaaaca 300

ggaaagattg ccgattataa ctataaactt cctgatgatt tcaccggctg tgttatcgca 360

tggaactcaa acaatctcga cagcaaagta ggtgggaatt acaattactt gtaccggcta 420

tttaggaagt ccaacctcaa gccgttcgag cgcgatatct caacagaaat ctatcaagca 480

ggatcaacac cttgtaacgg agttgaagga tttaactgtt atttcccgct acaatcatat 540

ggatttcaac ctacaaacgg agttggatat caaccttata gagttgttgt tctttcattt 600

gaacttcttc atgcacctgc aacagtttgt ggacctaaga agtctacgaa ccttgttaag 660

aataagtgtg ttaactttaa ctttaacgga tgataatcta ga 702

<210> 13

<211> 807

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

atgaacagct tcagcaccag cgccttcggc cccgtggcct tcagcctggg cctgctgctg 60

gtgctgcccg ccgccttccc cgccccccac caccaccacc accaccacca cgacgacgac 120

gacaaggtgc agcccaccga gagcatcgtg aggttcccca acatcaccaa cctgtgcccc 180

ttcggcgagg tgttcaacgc caccaggttc gccagcgtgt acgcctggaa caggaagagg 240

atcagcaact gcgtggccga ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc 300

aagtgctacg gcgtgagccc caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc 360

gacagcttcg tgatcagggg cgacgaggtg aggcagatcg cccccggcca gaccggcaag 420

atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac 480

agcaacaacc tggacagcaa ggtgggcggc aactacaact acctgtacag gctgttcagg 540

aagagcaacc tgaagccctt cgagagggac atcagcaccg agatctacca ggccggcagc 600

accccctgca acggcgtgga gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggcttc 660

cagcccacca acggcgtggg ctaccagccc tacagggtgg tggtgctgag cttcgagctg 720

ctgcacgccc ccgccaccgt gtgcggcccc aagaagagca ccaacctggt gaagaacaag 780

tgcgtgaact tcaacttcaa cggctga 807

<210> 14

<211> 268

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro His His His

20 25 30

His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser

35 40 45

Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val

50 55 60

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

85 90 95

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

100 105 110

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

115 120 125

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

130 135 140

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

145 150 155 160

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

165 170 175

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

180 185 190

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

195 200 205

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

210 215 220

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

225 230 235 240

Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

260 265

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gctagagaac atctagacaa gag 23

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

acacacgcat gacgacgtta ta 22

<210> 20

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tgtgatcggt aggaatgacg cgaagc 26

Claims

1.抗SARS-CoV-2感染的蛋白，其特征是：含有SARS-CoV-2的S蛋白中与血管紧张素转换酶2受体结合的结构域，所述结构域N端第一位氨基酸精氨酸可以缺失；氨基酸序列选自SEQID No.3或SEQ ID No.4中至少一种。

2.权利要求1所述蛋白的前体，其特征是：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上连接了信号肽和/或蛋白标签。

3.如权利要求2所述蛋白的前体，其特征是：所述的蛋白标签选自如下至少一种：组氨酸标签、硫氧还蛋白标签、谷胱甘肽转移酶标签、泛素样修饰蛋白标签、麦芽糖结合蛋白标签、c-Myc蛋白标签、Avi tag蛋白标签、氮源利用物质A蛋白标签。

4.如权利要求2所述的前体，其特征是：在所述抗SARS-CoV-2感染的蛋白上还连接了切除蛋白标签的蛋白酶识别区。

5.如权利要求4所述的前体，其特征是：所述的蛋白酶选自如下至少一种：肠激酶、TEV蛋白酶、凝血酶、凝血因子Xa、羧肽酶A、鼻病毒3c蛋白酶。

6.如权利要求2～5任意一项所述的前体，其特征是：氨基酸序列选自SEQ ID No.5、SEQID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.14中至少一种。

7.权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2～6任意一项所述的前体在制备预防SARS-CoV-2感染的药物中的用途。

8.预防SARS-CoV-2感染的疫苗，其特征是：含有权利要求1所述的蛋白和/或权利要求2～6任意一项所述的前体，以及药学上可接受的辅料或者辅助性成分。

9.如权利要求8所述的疫苗，其特征是：所述的辅助性成分为免疫佐剂。

10.如权利要求9所述的疫苗，其特征是：所述的免疫佐剂选自如下至少一种：铝盐、钙盐、植物皂苷、植物多糖、单磷酸脂质A、胞壁酰二肽、胞壁酰三肽、鲨烯水包油乳剂、细菌毒素、GM-CSF细胞因子、脂质、阳离子脂质体材料。

11.如权利要求10所述的疫苗，其特征是：满足以下至少一项：所述的铝盐选自氢氧化铝、明矾中至少一种；所述的钙盐为磷酸三钙；所述的植物皂苷为QS – 21或ISCOM；所述的植物多糖为黄芷多糖；所述的鲨烯水包油乳剂为MF59；所述的细菌毒素选自重组霍乱毒素、白喉毒素中至少一种；所述的脂质选自如下至少一种：磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、胆固醇、二油酰基磷脂酰乙醇胺；所述的阳离子脂质体材料选自如下至少一种：（2,3-二油氧基丙基）三甲基氯化铵、N-[1-（2,3-二油酰氯）丙基]-N,N,N-氯化三甲胺、阳离子胆固醇、三氟乙酸二甲基-2,3-二油烯氧基丙基-2-（2-精胺甲酰氨基）乙基铵、溴化三甲基十二烷基铵、溴化三甲基十四烷基铵、溴化三甲基十六烷基铵、溴化二甲基双十八烷基铵、CpG ODN。

12.如权利要求8～11任意一项所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为注射制剂。

13.如权利要求12所述的疫苗，其特征是：所述的疫苗为肌肉注射制剂。

14.多核苷酸，其特征是：编码权利要求1所述的蛋白、权利要求2～6任意一项所述的前体。

15.如权利要求14所述的多核苷酸，其特征是：核苷酸序列选自SEQ ID No.8、SEQ IDNo.9、SEQ ID No.10、SEQ ID No.11、SEQ ID No.12、SEQ ID No.13中至少一种。

16.重组载体，其特征是：含有权利要求14或15所述多核苷酸。

17.如权利要求16所述的重组载体，其特征是：采用昆虫杆状病毒表达载体、哺乳动物细胞表达载体、大肠杆菌表达载体、酵母表达载体中至少一种。

18.如权利要求17所述的重组载体，其特征是：所述的昆虫杆状病毒表达载体为pFastBac1。

19.如权利要求17所述的重组载体，其特征是：所述的大肠杆菌表达载体为pET32a。

20.如权利要求17所述的重组载体，其特征是：所述的酵母表达载体为pPICZaA。

21.如权利要求17所述的重组载体，其特征是：所述的哺乳动物细胞表达载体为CHO细胞表达载体。

22.如权利要求21所述的重组载体，其特征是：所述的CHO细胞表达载体为pTT5或FTP-002。

23.宿主细胞，其特征是：含有权利要求16～22任意一项所述的重组载体。

24.如权利要求23所述的宿主细胞，其特征是：采用昆虫细胞、哺乳动物细胞、大肠杆菌、酵母中至少一种。

25.如权利要求24所述的宿主细胞，其特征是：所述的昆虫细胞选自sf9细胞、sf21细胞、Hi5细胞中至少一种。

26.如权利要求24所述的宿主细胞，其特征是：所述的哺乳动物细胞为CHO细胞。

27.权利要求1或2所述蛋白的制备方法，其特征是：包括如下步骤：培养权利要求23-26所述的宿主细胞，使其表达所述的蛋白，然后回收所述的蛋白，即得。