RU2815060C1

RU2815060C1 - БЕЛОК И ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ SARS-CoV-2

Info

Publication number: RU2815060C1
Application number: RU2022132719A
Authority: RU
Inventors: Сявэй ВЭЙ; Гуанвэнь ЛУ; Вэй ВАН; Цзиньлян ЯН; Ли Ян; Цзюн ЛИ; Цзинюнь ЯН; Юйцюань Вэй; Чжэньлин ВАН; Чживэй ЧЖАО; Гобо ШЭНЬ
Original assignee: ВестВак Биофарма Ко., Лтд.
Priority date: 2020-02-24
Filing date: 2020-09-18
Publication date: 2024-03-11

Abstract

Изобретение относится к биотехнологии. Описан белковый антиген для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2, отличающийся тем, что содержит домен, который связывается с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2), содержащийся в S-белке SARS-CoV-2, где аминокислотная последовательность указанного домена представляет собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 3 или SEQ ID No. 4. Представлены полинуклеотид, кодирующий указанный агент, а также получение указанного агента. Изобретение расширяет арсенал средств для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2. 8 н. и 7 з.п. ф-лы, 15 ил., 8 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к белку и вакцине против SARS-CoV-2, и принадлежит к области медицины.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

SARS-CoV-2 представляет собой новый бета-коронавирус (p-CoV), названный Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ). Данный вирус имеет оболочку и представлен в круглых или овальных (часто плеоморфных) частицах с диаметром 60-140 нм. С явно отличными характеристиками генов от SARS-CoV (коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома) и MERS-CoV (коронавирус ближневосточного респираторного синдрома) он представляет собой беспрецедентную новую ветвь человеческих коронавирусов. Летучие мыши могут быть природными хозяевами SARS-CoV-2, и панголины также предполагали в качестве возможного животного источника данного вируса. В настоящее время данный новый корнавирус SARS-CoV-2 уже инфицировал десятки тысяч человек, но до сих пор нет определенно эффективных противовирусных лекарственных средств для предупреждения и лечения. Следовательно, исследование и разработка связанной с этим вирусной вакцины являются весьма важными для предупреждения и лечения данного заболевания.

Главные структурные белки SARS-CoV-2 включают белок шипа (S), оболочки (Е), мембраны (М) и нуклеокапсида (N), среди которых S-белок играет ключевую роль в инфекции вирусом и вирулентности. Ангиотензинпревращающий фермент 2 (АСЕ2) представляет собой функциональный рецептор коронавируса SARS, тогда как недавнее исследование показывает то, что SARS-CoV-2 поступает в клетку-хозяина посредством связывания с рецептором АСЕ2 для инфекции вирусом и репликации. S-белок SARS-CoV-2 состоит из двух доменов: S1 и S2. S-белок1 в качестве связывающегося с рецептором домена (RBD), который связывается с рецептором АСЕ2, отвечает за связывание вируса с рецептором клетки-хозяина, слияние с мембраной клетки и вирусную инвазию и инфекцию.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение предназначено для решения одной из технических проблем предшествующего уровня техники. Следовательно, целью настоящего изобретения является предложение белка против инфекции SARS-CoV-2. Другой целью настоящего изобретения является предложение вакцины, содержащей белок для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2.

Согласно настоящему изобретению предложен белок против инфекции SARS-CoV-2, который содержит домен, который связывается с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2), содержащийся в S-белке SARS-CoV-2.

Кроме того, структурной основой данного домена являются аминокислоты 319-541 RBD в S-белке, а 319-ая аминокислота является необязательной.

Кроме того, аминокислотная последовательность данного домена представляет собой SEQ ID No. 1 или SEQ ID No. 2.

Кроме того, аминокислотная последовательность данного белка представляет собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3 и SEQ ID No. 4.

SEQ ID No.1:

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

SEQ ID No. 2:

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNF

SEQ ID No. 3:

RVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVWLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No. 4:

VQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

Состав внеклеточного домена белка S SARS-CoV-2 показан на Фиг. 13; где SP обозначает сигнальный пептид, NTD - N-концевой домен, RBD - рецепторсвязывающий домен, FP - слитый пептид, IFP - внутренний слитый пептид, HR1 - гептадный повтор 1, HR2 - гептадный повтор 2, РТМ -проксимальный трансмембранный домен, и ТМ - трансмембранный домен.

Белок, показанный в SEQ ID No. 1, представляет собой лекарственное средство против инфекции SARS-CoV-2, разработанное на основе RBD (аминокислоты 319-541). В аминокислотную последовательность описанного в данном документе белка вставляют белковые метки, и 1-ая аминокислота R в данной последовательности является необязательной, как показано в SEQ ID No. 2.

Предпочтительно белок, как показано в SEQ ID No. 3, имеет четыре дополнительных аминокислоты NFNG после 541-ой аминокислоты (то есть, в RBD фактически имеются аминокислоты 319-545), которые могут увеличивать стабильность белка против инфекции SARS-CoV-2, описанного в настоящем изобретении. В аминокислотную последовательность описанного в данном документе белка вставляют белковые метки, и 1-ая аминокислота R в данной последовательности не является обязательной, как показано в SEQ ID No. 4.

Кроме того, белковую метку 8×His сливают с С-концом, что может облегчать очистку белка.

Согласно настоящему изобретению предложен предшественник белка, который связывает белок против инфекции SARS-CoV-2 с сигнальным пептидом и/или белковой меткой.

Предпочтительно данная белковая метка представляет собой по меньшей мере одну из гистидиновой метки, тиоредоксиновой метки, глутатионтрансферазной метки, метки на основе модифицированного убиквитин-подобного белка, метки на основе мальтозосвязывающего белка, метки на основе белка с-Мус, метки на основе белка Avi и метки на основе белка - вещества А утилизации источника азота.

Кроме того, данный предшественник также связывает белок против инфекции SARS-CoV-2 с областью распознавания протеазы для удаления белковой метки.

Предпочтительно данная протеаза представляет собой по меньшей мере одну из энтерокиназы, протеазы TEV, тромбина, фактора свертывания Ха, карбоксипептидазы А и протеазы риновируса 3 с.

Кроме того, данная аминокислотная последовательность представляет собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6, SEQ ID No. 7 и SEQ ID No. 14.

SEQ ID No. 5 (сигнальный пептид клетки насекомого + S-белок + аминокислотная последовательность His метки):

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNGHHHHHHHH

SEQ ID No. 6 (сигнальный пептид клетки насекомого + Trx (тиоредоксин) Escherichia coli + аминокислотная последовательность RBD белка S):

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSDKIIHLTDDSFDTDVLKADGAILVDFWAEWCGPCKMIAPILDEIADEYQGKLTVAKLNIDQNPGTAPKYGIRGIPTLLLFKNGEVAATKVGALSKGQLKEFLDANLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No. 7 (сигнальный пептид клетки насекомого + Trx (тиоредоксин) насекомого + аминокислотная последовательность RBD белка S):

MLLVNQSHQGFNKEHTSKMVSAIVLYVLLAAAAHSAFAADSIHIKDSDDLKNRLAEAGDKLVVIDFMATWCGPCKMIGPKLDEMANEMSDCIWLKVDVDECEDIATEYNINSMPTFVFVKNSKKIEEFSGANVDKLRNTIIKLKLAGSGSGHMHHHHHHSSGDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

SEQ ID No. 14 (сигнальный пептид человеческого белка IL-6 + сигнальный пептид 8×His + сайт разрезания рестрикционным ферментом EK + 226 ак (аминокислоты) аминокислотной последовательности RBD 320-545):

MNSFSTSAFGPVAFSLGLLLVLPAAFPAPHHHHHHHHDDDDKVQPTESIVRFPNITNLCPFGEVFNATRFASVYAWNRKRISNCVADYSVLYNSASFSTFKCYGVSPTKLNDLCFTNVYADSFVIRGDEVRQIAPGQTGKIADYNYKLPDDFTGCVIAWNSNNLDSKVGGNYNYLYRLFRKSNLKPFERDISTEIYQAGSTPCNGVEGFNCYFPLQSYGFQPTNGVGYQPYRVVVLSFELLHAPATVCGPKKSTNLVKNKCVNFNFNG

Согласно настоящему изобретению предложено применение белка и/или предшественника в получении лекарственных средств для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2.

Согласно настоящему изобретению предложена вакцина для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2, которая содержит данный белок и/или предшественник, а также фармацевтически приемлемый эксципиент или вспомогательный ингредиент.

Кроме того, данный вспомогательный ингредиент представляет собой иммунологический адъювант.

Предпочтительно данный иммунологический адъювант представляет собой по меньшей мере один из следующих: соль алюминия, соль кальция, растительный сапонин, растительный полисахарид, монофосфат-липид А, муринилдипептид, муринилтрипептид, эмульсия сквалена типа «масло в воде» (MF59), рекомбинантный холерный токсин (rCTB), цитокин GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор), липид, катионное липосомное вещество и CpG ODN (нуклеотидная последовательность с неметилированным цитозином и гуаниндинуклеотидами в качестве последовательности ядра и синтетический CpG).

Кроме того, соль алюминия представляет собой по меньшей мере одну из гидроксида алюминия и квасцов.

Кроме того, соль кальция представляет собой трикальция фосфат.

Кроме того, растительный сапонин представляет собой QS-21 или ISCOM.

Кроме того, растительный полисахарид представляет собой полисахарид астрагала (APS).

Кроме того, липид представляет собой по меньшей мере один из фосфатидилэтаноламина (РЕ), фосфатидилхолина (PC), холестерина (ChoI) и диолеилфосфатидилэтаноламина (DOPE).

Кроме того, катионное липосомное вещество представляет собой по меньшей мере одно из следующих: (2,3-диолеоилокси-пропил)-триметиламмония-хлорид (DOTAP), N-[1-2,3-диолеилокси, пропил]-n,n,n-триметиламмония хлорид (DOTMA), катионный холестерин (DC-ChoI), трифторуксусной кислоты диметил-2, 3-диолеоксипропил-2-(2-сперминформиламино)этиламмоний (DOSPA), додецилтриметиламмония бромид (DTAB), тетрадецилтриметиламмония бромид (ТТАВ), цетил-метил-аммония бромид (СТАВ) и диметилдиоктадециламмония бромид (DDAB).

Кроме того, данная вакцина представляет собой препарат для инъекций.

Предпочтительно данная вакцина представляет собой препарат для внутримышечных инъекций.

Согласно настоящему изобретению предложен полинуклеотид, который кодирует белок и/или предшественник.

Кроме того, нуклеотидная последовательность данного полинуклеотида представляет собой по меньшей мере одну из следующих: SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 и SEQ ID No. 13.

SEQ ID No. 8 (сигнальный пептид клетки насекомого + RBD белка S + соответствующая оптимизированная нуклеотидная последовательность His метки):

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAATCTCATCAGGGCTTCAACAAAGAACATACTTCAAAAATGGTCTCCGCTATCGTGCTGTACGTGCTCCTCGCTGCTGCTGCTCACTCTGCTTTCGCTGCTGACGAATTCAGGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTCACCACCACCACCACCACCACCACTGATAAGCTT

SEQ ID No. 9 (сигнальный пептид клетки насекомого + Trx (тиоредоксин) Escherichia coli + соответствующая нуклеотидная последовательность RBD белка S):

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAGAGCCACCAGGGCTTCAACAAGGAACACACTTCCAAGATGGTGTCCGCCATCGTCCTGTACGTGCTGCTGGCCGCCGCTGCTCACAGCGCTTTCGCCGCTGACAGCGACAAGATCATCCACCTGACTGACGACAGCTTCGACACTGACGTGCTGAAGGCTGACGGTGCTATCCTGGTCGACTTCTGGGCCGAGTGGTGCGGCCCTTGCAAGATGATCGCTCCCATCCTGGACGAGATCGCCGACGAGTACCAGGGTAAACTGACTGTGGCCAAGCTGAACATCGACCAGAACCCCGGTACTGCTCCTAAGTACGGCATCCGTGGTATCCCCACTCTGCTGCTGTTCAAGAACGGTGAGGTGGCCGCTACCAAGGTCGGTGCTCTGAGCAAGGGCCAGCTGAAGGAGTTCCTGGACGCTAACCTGGCTGGTTCCGGCAGCGGCCACATGCACCACCACCACCATCACAGCAGCGGCGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAAAAGCTT

SEQ ID No. 10 (сигнальный пептид клетки насекомого + Trx (тиоредоксин) насекомого + соответствующая нуклеотидная последовательность RBD белка S):

GGATCCATGCTGCTGGTCAACCAGAGCCACCAGGGTTTCAACAAGGAACACACCAGCAAGATGGTGAGCGCTATCGTGCTGTACGTCCTGCTGGCCGCTGCTGCTCACAGCGCTTTCGCTGCTGACTCCATCCACATCAAGGACAGCGACGACCTGAAGAACCGTCTGGCCGAGGCCGGTGACAAGCTGGTCGTCATCGACTTCATGGCCACTTGGTGCGGTCCTTGCAAGATGATCGGCCCTAAGCTGGACGAGATGGCTAACGAGATGTCCGACTGCATCGTGGTCCTGAAGGTGGACGTCGACGAGTGCGAGGACATCGCCACCGAATACAACATCAACAGCATGCCCACCTTCGTGTTCGTGAAGAACAGCAAGAAGATCGAGGAATTTTCCGGCGCTAACGTCGACAAGCTGCGTAACACCATCATCAAGCTGAAGCTGGCCGGCTCCGGCTCCGGCCACATGCATCACCACCACCACCATTCCTCCGGTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCAACCGAATCTATCGTCAGATTCCCAAACATCACTAACCTGTGCCCTTTCGGAGAGGTGTTCAACGCTACCAGGTTCGCCAGCGTCTACGCTTGGAACCGCAAGCGTATCAGCAACTGCGTCGCCGACTACTCTGTGCTGTACAACTCCGCTAGCTTCTCTACTTTCAAGTGCTACGGCGTGTCACCTACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACTAACGTCTACGCCGACTCCTTCGTGATCCGCGGAGACGAAGTCCGTCAGATCGCTCCTGGACAGACCGGAAAGATCGCTGACTACAACTACAAGCTGCCAGACGACTTCACTGGCTGCGTGATCGCTTGGAACTCAAACAACCTGGACTCCAAGGTCGGTGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGAAAGTCAAACCTGAAGCCTTTCGAGCGCGACATCTCAACCGAAATCTACCAGGCTGGTTCCACTCCCTGCAACGGTGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGTCCTACGGTTTCCAGCCAACCAACGGAGTCGGTTACCAGCCTTACCGTGTGGTCGTGCTGAGCTTCGAACTGCTCCACGCTCCTGCTACTGTGTGCGGTCCCAAGAAGTCTACTAACCTGGTCAAAAACAAATGTGTCAACTTCAACTTCAACGGTTAAAAGCTT

SEQ ID No. 11, включающая сайт разрезания рестрикционным ферментом BgIII (1-6) + сайт разрезания рестрикционным ферментом EK (7-21) + S-RBD(aK320-545), оптимизированный по кодонам, предпочтительным у Escherichia coli, + сайт разрезания рестрикционным ферментом Xho I (последние 6 отрезанных):

AAGCTTGACGACGACGACAAGGTGCAGCCGACCGAAAGCATTGTGCGCTTTCCGAACATTACCAACCTTTGTCCTTTCGGTGAGGTATTCAATGCAACACGCTTTGCTTCAGTTTATGCTTGGAACCGCAAACGCATTTCAAACTGTGTTGCTGATTATTCAGTTCTTTATAACTCAGCTTCATTCTCCACCTTTAAATGTTATGGCGTTTCACCTACAAAGCTGAATGATCTTTGTTTCACCAATGTTTATGCTGATTCATTTGTTATTCGCGGCGATGAAGTTCGCCAGATTGCTCCTGGCCAGACAGGCAAGATAGCCGATTATAACTATAAACTTCCTGATGATTTCACGGGATGTGTTATTGCTTGGAACTCAAACAACCTTGATTCAAAGGTCGGTGGCAACTATAACTATCTTTATCGCCTGTTCCGGAAGTCAAACCTTAAACCTTTCGAGAGAGATATTTCAACAGAAATTTATCAGGCTGGCTCAACACCTTGTAACGGCGTTGAAGGCTTTAACTGTTATTTCCCACTGCAAAGCTATGGCTTTCAGCCTACAAACGGCGTTGGCTATCAGCCTTATCGCGTTGTTGTTCTTTCATTTGAACTTCTTCATGCTCCTGCTACAGTTTGTGGCCCTAAGAAAAGCACTAATCTGGTGAAAAACAAATGTGTGAACTTTAACTTTAACGGCTGATAACTCGAG

SEQ ID No. 12, включающая сайт разрезания рестрикционным ферментом XhoI (1-6) + сайт расщепления сигнального пептида (7-21) + S-RBD(aK320-545), оптимизированный по кодонам, предпочтительным у Escherichia coli, + сайт разрезания рестрикционным ферментом Xba I (последние 6 отрезанных):

CTCGAGAAAAGAGTTCAACCTACAGAATCAATCGTTAGATTTCCTAACATCACAAACCTTTGTCCTTTCGGCGAGGTCTTCAATGCCACAAGATTTGCATCAGTTTATGCATGGAACAGAAAGCGTATATCAAACTGTGTTGCAGATTATTCAGTTCTTTATAACTCAGCATCATTCTCTACCTTTAAATGTTATGGAGTTTCACCTACAAAGCTCAATGATCTTTGTTTCACTAATGTTTATGCAGATTCATTTGTTATCAGAGGAGATGAAGTTAGACAAATCGCACCTGGACAAACAGGAAAGATTGCCGATTATAACTATAAACTTCCTGATGATTTCACCGGCTGTGTTATCGCATGGAACTCAAACAATCTCGACAGCAAAGTAGGTGGGAATTACAATTACTTGTACCGGCTATTTAGGAAGTCCAACCTCAAGCCGTTCGAGCGCGATATCTCAACAGAAATCTATCAAGCAGGATCAACACCTTGTAACGGAGTTGAAGGATTTAACTGTTATTTCCCGCTACAATCATATGGATTTCAACCTACAAACGGAGTTGGATATCAACCTTATAGAGTTGTTGTTCTTTCATTTGAACTTCTTCATGCACCTGCAACAGTTTGTGGACCTAAGAAGTCTACGAACCTTGTTAAGAATAAGTGTGTTAACTTTAACTTTAACGGATGATAATCTAGA

SEQ ID No. 13 (сигнальный пептид белка человеческого IL6 + сигнальный пептид 8×His + сайт разрезания рестрикционным ферментом EK + 226 ак 320-545 RBD):

ATGAACAGCTTCAGCACCAGCGCCTTCGGCCCCGTGGCCTTCAGCCTGGGCCTGCTGCTGGTGCTGCCCGCCGCCTTCCCCGCCCCCCACCACCACCACCACCACCACCACGACGACGACGACAAGGTGCAGCCCACCGAGAGCATCGTGAGGTTCCCCAACATCACCAACCTGTGCCCCTTCGGCGAGGTGTTCAACGCCACCAGGTTCGCCAGCGTGTACGCCTGGAACAGGAAGAGGATCAGCAACTGCGTGGCCGACTACAGCGTGCTGTACAACAGCGCCAGCTTCAGCACCTTCAAGTGCTACGGCGTGAGCCCCACCAAGCTGAACGACCTGTGCTTCACCAACGTGTACGCCGACAGCTTCGTGATCAGGGGCGACGAGGTGAGGCAGATCGCCCCCGGCCAGACCGGCAAGATCGCCGACTACAACTACAAGCTGCCCGACGACTTCACCGGCTGCGTGATCGCCTGGAACAGCAACAACCTGGACAGCAAGGTGGGCGGCAACTACAACTACCTGTACAGGCTGTTCAGGAAGAGCAACCTGAAGCCCTTCGAGAGGGACATCAGCACCGAGATCTACCAGGCCGGCAGCACCCCCTGCAACGGCGTGGAGGGCTTCAACTGCTACTTCCCCCTGCAGAGCTACGGCTTCCAGCCCACCAACGGCGTGGGCTACCAGCCCTACAGGGTGGTGGTGCTGAGCTTCGAGCTGCTGCACGCCCCCGCCACCGTGTGCGGCCCCAAGAAGAGCACCAACCTGGTGAAGAACAAGTGCGTGAACTTCAACTTCAACGGCTGA

Согласно настоящему изобретению предложен рекомбинантный вектор, который содержит данный полинуклеотид.

Кроме того, данный рекомбинантный вектор представляет собой по меньшей мере один из экспрессионного вектора на основе бакуловируса насекомых, экспрессионного вектора клетки млекопитающего, экспрессионного вектора Escherichia coli и дрожжевого экспрессионного вектора.

Предпочтительно экспрессионный вектор бакуловируса насекомых представляет собой pFastBacI.

Предпочтительно экспрессионный вектор Escherichia coli представляет собой рЕТ32а.

Предпочтительно дрожжевой экспрессионный вектор представляет собой pPICZaA.

Предпочтительно экспрессионный вектор клетки млекопитающего представляет собой экспрессионный вектор клетки СНО (яичник китайского хомяка).

Кроме того, экспрессионный вектор клетки СНО предпочтительно представляет собой рТТ5 или FTP-002.

Согласно настоящему изобретению предложена клетка-хозяин, которая содержит рекомбинантный вектор.

Кроме того, данная клетка-хозяин представляет собой по меньшей мере одну из клетки насекомого, клетки млекопитающего, Escherichia coli и дрожжей.

Предпочтительно клетка насекомого представляет собой по меньшей мере одну из клетки sf9, клетки sf21 и клетки Hi5.

Предпочтительно клетка млекопитающего представляет собой СНО.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения белка, который включает следующую стадию: культивирование клетки-хозяина для экспрессии белка или предшественника и затем выделение данного белка.

Согласно настоящему изобретению предложен способ получения белка, который включает следующую стадию: конструирование рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид, для реализации иммунитета человека и, таким образом, генерация данного белка.

Кроме того, данный вектор представляет собой по меньшей мере один из мРНК, ДНК-вакцины, аденовируса, вируса осповакцины Анкара и аденоассциированного вируса.

Согласно настоящему изобретению предложен белок и вакцина против инфекции SARS-CoV-2, в частности, S-белок, нацеленный на вирус SARS-CoV-2, который, в частности, блокирует домен белка S, связывающийся с рецептором АСЕ2, с индукцией продукции антител в организме для иммунореакции и блокирования связывания белка S SARS-CoV-2 и рецептора АСЕ2 клетки-хозяина, таким образом, помогая хозяину бороться против корона вирусной инфекции.

Краткое описание графических материалов

На Фиг. 1 показаны результаты анализа аффинности для белка, раскрытого в настоящем изобретении, и белка АСЕ2 в экспериментальном примере 1;

На Фиг. 2 показаны результаты анализа титра антител в экспериментальном примере 2;

На Фиг. 3 показаны результаты ответа между антителом у пациента с SARS-CoV-2 и белком, раскрытым в настоящем изобретении, как определяется посредством ELISA (твердофазный иммуноферментный анализ) в экспериментальном примере 3;

На Фиг. 4 показаны результаты испытаний по блокированию связывания между белком RBD и рецептором АСЕ2 в экспериментальном примере 4;

На Фиг. 5 показаны результаты выявления нейтрализующего антитела в экспериментальном примере 5;

На Фиг. 6 показаны результаты по выявлению числа копий для вирусной гРНК (геномная рибонуклеиновая кислота) и сгРНК (субгеномная рибонуклеиновая кислота) в ткани легкого в экспериментальном примере 5;

На Фиг. 7 показаны результаты по выявлению числа копий для вирусной гРНК и сгРНК в мазке из глотки в экспериментальном примере 5;

На Фиг. 8 показаны результаты по выявлению числа копий для вирусной гРНК и сгРНК в анальном мазке в экспериментальном примере 5;

На Фиг. 9 показаны результаты по окрашиванию среза для легочной ткани в экспериментальном примере 5;

На Фиг. 10 показаны результаты эксперимента по заражению мышей против инфекции SARS-CoV-2 в экспериментальном примере 6;

На Фиг. 11 показаны результаты выявления цитокинов IFN-γ (интерферон-гамма) и IL-4 (интерлейкин-4) в экспериментальном примере 7;

На Фиг. 12 показаны результаты выявления уровня цитокинов в экспериментальном примере 8;

Фиг. 13 представляет собой схематическую диаграмму композиции внеклеточного домена белка S SARS-CoV-2;

Фиг. 14 представляет собой спектрограмму экспрессионного вектора рЕТ32а Escherichia coli в воплощении 3;

Фиг. 15 представляет собой спектрограмму дрожжевого экспрессионного вектора pPICZaA в воплощении 4;

Подробное описание предпочтительных вопоплощений

Техническое решение настоящего изобретения будет описано в комбинации с воплощениями. Специалистам в данной области будет понятно то, что следующие воплощения используются только для описания настоящего изобретения, но не ограничивают объем настоящего изобретения. Следует отметить то, что, когда в воплощениях настоящего изобретения не указываются конкретные технологии или условия, следует применять технологии или условия, описанные литературой в настоящей области или точно опредленные в спецификации продукта. Все реактивы или приборы, где не указывается конкретный изготовитель, являются доступными в продаже традиционными продуктами.

S-белок представляет собой гликозилированный белок, и предпочтительно используют экспрессионную систему бакуловируса насекомых или экспрессионную систему клетки млекопитающего (экспрессионная система СНО) для лучшего получения природного белка S. Конкретный способ получения описан ниже:

Воплощение 1. Получение белка против инфекции SARS-CoV-2, раскрытого в настоящем изобретении, посредством применения экспрессионной системы бакуловируса насекомого

Конструирование вектора: в рекомбинантных белках, продуцируемых посредством применения экспрессионной системы бакуловируса насекомого, главным образом, используется рецепторсвязывающий домен (RBD) белка S. S-белок SARS-CoV-2 представляет собой белок, расположенный на оболочке вируса. Для того чтобы стимулировать процесс секреции белка S SARS-CoV-2, для облегчения секреции экспрессированного белка во время конструирования RBD белка S к N-концу добавляют сигнальный пептид GP67. Данный сигнальный пептид будет спонтанно отрезаться клетками насекомого во время процесса секреции данного белка. В то же самое время для того, чтобы облегчать очистку и увеличивать растворимость данного белка в воде, в данную последовательность вводят тиоредоксиновую метку и сайт разрезания рестрикционным ферментом энтерокиназы (EK). Полная нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID No. 8 или SEQ ID No. 10. Экспрессионный вектор RBD белка S конструируют на основе вектора pFastBac1 (устойчивость к ампициллину), в данный вектор pFast-bacI вводят сайты разрезания рестрикционных ферментов BamHI и HindIII, и для оптимизации используют кодоны с отклонением использования кодонов у Escherichia coli.

Амплификация рекомбинантного бакуловируса: экспрессионная система Bac-to-Bac используется для конструирования рекомбинантных бакмид в Escherichia coli (DH10Bac, содержащая бакмиду (устойчивость к канамицину) и хелперную плазмиду (устойчивость к тетрациклину)) посредством генерации сайт-специфичной транспозиции через элемент транспозиции Tn7 с использованием принципа бактериального транспозона. Успешно рекомбинированные бакмиды выделяют и переносят в клетки насекомого sf9 с использованием Cellfectin II, с получением рекомбинантных бакуловирусов, которые могут экспрессировать ген-мишень. Первое поколение вирусов отбирают через 72 ч после трансфекции и затем амплифицируют от Р2 до Р4. Вирусы Р3 или Р4 используют для экспрессии белка.

Экспрессия белка: клетки насекомого Hi5 (или клетки sf9 и sf21) инфицируют вирусами Р3 или Р4 со множественностью заражения (MOI) 0,5-10, и супернатант собирают после 48-72 часов культивирования. Оптимальное время отбора может варьировать согласно количеству вируса и состоянию клетки, и обычно подходящим является, когда инфицировано примерно 50% клеток при наблюдении посредством микроскопической проверки.

Очистка белка: отобранный супернатант культуры центрифугируют при 4°С при высокой скорости и фильтруют с использованием 0,22 мкм фильтрующей мембраны. Рекомбинантный белок исходно очищают посредством способа аффинной очистки (никелевая колонка Histrap). Затем данный рекомбинантный белок очищают далее посредством ионной колонки MonoQ и молекулярного сита Superdex 200 10/300GL. Требуется, чтобы чистота белка достигала более чем 95% при определении посредством выявления SDS-PAGE (электофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия). Полученный белок растворяют или разводят до 1-5 мг/мл с использованием буфера для ферментативного расщепления. Добавляют соответствующее количество энтерокиназы (фермент EK) в пропорции 1U (единица) энтерокиназы на 50 мкг рекомбинантного белка, смешивают и оставляют постоять для расщепления при 25°С в течение 16 часов для удаления метки рекомбинантного белка. Используют нуклеотид, показанный в SEQ ID No. 8, для экспрессии белка SEQ ID No. 3, а нуклеотид, показанный в SEQ ID No. 10, используют для экспрессии белка SEQ ID No. 4. Полученный рекомбинантный белок можно использовать для последующих исследований, таких как иммунизация животного.

Воплощение 2. Получение белка против инфекции SARS-CoV-2, раскрытого в настоящем изобретении, посредством применения экспрессионной системы на основе клеток СНО

Вакцины на основе рекомбинантного белка, полученные посредством применения клеток СНО (яичники китайского хомяка), главным образом, нацелены на рецепторсвязывающий домен белка S (RBD). Данные фрагменты синтезируются генетически согласно предпочтению кодонов, а полигистидин используется в качестве метки для очистки (6His). Полная нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID No. 13. Затем ее конструируют в векторе рТТ5 высокой экспрессии, а экспрессированная аминокислотная последовательность представляет собой белок-предшественник, как показано в SEQ ID No. 14.

Воплощение 3. Осуществление экспрессии белка против инфекции SARS-CoV-2 в Escherichia coli

В качестве экспрессионного вектора (см. профиль плазмиды на Фиг. 14) используют рЕТ32а от Novagen, который содержит промотор Т7, и где транскрипция расположенных ниже генов-мишеней регулируется IPTG (изопропилтиогалактозид). N-концевой экспрессируемый продукт сливают с тиоредоксином (Trx) и очищают за одну стадию посредством аффинной хроматографии на хелате металла (МСАС). Для того, чтобы удалить Trx после очистки белка-мишени, после Trx добавляют сайт разрезания рестрикционным ферментом энтерокиназы (EK). Полная нуклеотидная последовательность показана в SEQ ID No. 11.

Рекомбинантные плазмиды экспрессируются в штамме BL21 (DE3) Escherichia coli соответственно. Результаты электрофореза демонстрируют то, что размер полученного белка-мишени является аналогичным прогнозируемому размеру и подтвержденному вестерн-блоттингом. Содержание белка-мишени составляет больше, чем 30% от общего белка, главным образом, в виде телец включения. При денатурирующих условиях данный белок можно очищать за одну стадию посредством аффинной хроматографии на хелате металла (МСАС) с обеспечением чистоты выше, чем 95% и выхода 200-400 мг/л. Данный белок-мишень можно ренатурировать посредством диализа с эффективностью ренатурации выше, чем 50%.

Для снижения производственных затрат колонки на основе хелата металла можно заменять колонками с обращенной фазой для одноэтапной очистки, которые также могут продуцировать высокочистый белок с чистотой выше, чем 95%.

Воплощение 4. Осуществление экспрессии белка против инфекции SARS-CoV-2 в дрожжах

Нуклеотидную последовательность, как показано в SEQ ID No.12, клонируют в сайт двойного фермента (Xho I/Xba I) дрожжевого экспрессионного вектора pPICZaA (Invitrogen; см. профиль вектора экспрессии у дрожжей pPICZaA на Фиг. 15) для секреции и экспрессии данного белка с использованием фактора сигнала секреции у метилотрофных дрожжей.

Плазмиду pPICZaA используют для опосредования и интеграции гена S-RBD в хромосому метилотрофных дрожжей, и затем используют метанол для индукции экспрессии белка-мишени. Экспрессируемый белок-мишень присутствует в культуральной среде метилотрофных дрожжей в растворимой форме, которая могла быть очищена за одну стадию посредством хроматографии с обращенной фазой с количеством экспрессии, достигающим 200-400 мг/л.

Воплощение 5. Получение вакцины против инфекции SARS-CoV-2

Антигены получают при стерильных условиях, и очищенные рекомбинантные белковые антигены (полученные согласно воплощениям 1-4) разводят 5 ммоль/л фосфатным буфером (рН 7,2) до концентрации 80 мкг/мл. Адъюванты готовят при асептических условиях, и адъюванты на основе гидроксида алюминия (с содержанием 14,55 мг/мл) разводят 5 ммоль/л фосфатным буфером (рН 7,2) до концентрации 2,0 мг/мл. Адсорбцию антиген-адъювант проводят в стерильных условиях при скорости 20 мл/мин, жидкость разведенного белкового антигена добавляют по каплям в разведенный рабочий раствор адъюванта на основе гидроксида алюминия при соотношении объемов (об./об.) 1:1 таким образом, что конечная концентрация антигенов рекомбинантного белка в данном смешанном растворе составляет 40 мкг/мл, и конечная концентрация адъювантов на основе гидроксида алюминия составляет 1,0 мг/мл. Поддерживается температура реакции 25°С и скорость перемешивания 800 об./мин. После закапывания проводят адсорбцию в течение 60 мин при температуре 25°С и скорости перемешивания 800 об./мин. рН смешанного раствора доводят до 7,2. Данный раствор хранят при 4°С, избегая воздействия света. Характеризуют препараты адсорбированной вакцины, включая размер частиц, расположение сайта, содержание антигена, содержание адъюванта, скорость адсорбции, значение рН, скорость адсорбции эндотоксина, адъюванта и антигена, силу адсорбции и ее состояние удерживания, целостность и стабильность антигена после адсорбции. Для заполнения качественно охарактеризованные препараты вакцины повторно заполняют в 1 мл стерильные пенициллиновые бутыли или ампулизированные бутыли в 1 мл флаконе. При заполнении поддерживают непрерывное перемешивание для получения однородной заполненной жидкости. Заполненные флаконы немедленно закрывают колпачками после заполнения, прикрепляют этикетки с серийным номером и хранят при 4°С, избегая воздействия света.

Полезные эффекты настоящего изобретения продемонстрированы следующими экспериментальными примерами.

Экспериментальный пример 1. Исследование аффинности белка, раскрытого в настоящем изобретении, и белка АСЕ2 посредством анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

Выявление поверхностным плазмонным резонансом проводили с использованием макромолекулярного интерактометра Biacore 8K (GE Healthcare, Швеция). ACE2-Fc предварительно заякоривали на поверхности сенсорного чипа с белком А со значением единиц ответа (RU) захвата приблизительно 100 RU. Для анализа кинетики с белком RBD по настоящему изобретению, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No. 3, манипулировали, пропуская его через поверхность чипа с градиентом концентрации (1, 2, 4, 6, 8, 16, 32 нМ), полученным разведением вдвое в равной пропорции, соотвественно, и другой канал устанавливали в качестве группы пустого контроля. Диссоциацию антигена проводили в течение 300 секунд с использованием раствора для диссоциации HBS-EP + при скорости тока 30 мл/мин, с последующими 60 секундами регенерации чипа с использованием раствора глицина с рН 1,5 в качестве регенерирующего раствора. В данном процессе выявляли константу связывания (K_a) и константу диссоциации (K_d) антитела ACE2-Fc и белка RBD по настоящему изобретению, соответственно, и рассчитывали их аффинность (KD).

Результаты, как показано на Фиг. 1, продемонстрировали то, что белок RBD по настоящему изобретению может эффективно и специфично связываться с белком-рецептором АСЕ2 и свидетельствовали о том, что белок RBD по настоящему изобретению может поддерживать интегральную пространственную структуру и имеет такую же рецепторную способность АСЕ2, что и RBD белка S вируса, обеспечивая сильную поддержку для принятия полученного in vitro рекомбинантного RBD белка S в качестве вакцин. Его K_D аффинности составляла 1,52×10^-8 М (моль/л), константа диссоциации K_d составляла 4,41×10^-2 (с^-1), и константа связывания Ka составляла 3,85×10⁶ (Мс^-1).

Экспериментальный пример 2. Индуцирование RBD-специфичных антител у мышей, вакцинированных вакциной, раскрытой в настоящем изобретении

Анализ иммунизации животных: мышам BALB/c или C57BL/6 инъецировали рекомбинантные белки (с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID No. 3) в дозах, варьирующих от 0,1 до 10,0 мкг на мышь; к каждой группе относили от пяти до десяти мышей. Каждой мыши инъецировали 50 мкл объем вакцины (полученной согласно воплощению 5) внутримышечно (в.м.) в правую заднюю ногу. Использовали две схемы иммунизации: вакцинацию в сутки 1, 7 и 21, и вакцинацию в сутки 1, 14 и 21.

Определение сывороточного антитела мыши посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA): на 7-ые сутки после каждой иммунизации плазму мышей отбирали взятием крови из капилляров глаза от 5 мышей в каждой группе. После свертывания при комнатной температуре в течение 1-2 ч и центрифугирования при 3000 об./мин в течение 10 мин при 4°С отбирали верхний слой сыворотки и хранили при -20°С для применения позднее. Для определения сывороточного IgG и подтипа посредством ELISA, 1 мкг/мл раствор рекомбинантного белка S-Fc или RBD-Fc готовили в 50 мМ карбонатном покрывающем буфере (рН 9,6) и добавляли при 100 мкл/лунка в 96-луночный планшет (Thermo Scientific, NUNC-MaxiSorp) для покрытия в течение ночи при 4°С. Для получения 50 мМ карбонатного покрывающего буфера (рН 9,6) взвешивали 0,15 г Na₂CO₃ и 0,293 г NaHCO₃, растворяли в бидистиллированной воде, рН доводили до 9,6, затем фиксировали объем до 100 мл и хранили при 4°С для применения позднее. На следующие сутки плазму мышей 3 раза промывали раствором PBS, содержащим 0,1% Tween 20 (PBST), блокировали блокирующим раствором, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), или 5% обезжиренным молоком (приготовленным в PBST) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем один раз промывали PBST. Сыворотку мышей разводили блокирующим раствором в разных пропорциях, затем добавляли 100 мкл в лунку для инкубации в течение 1 ч - 2 ч при 37°С и промывали PBST 3 раза. Затем в плазму добавляли конъюгированное с HRP (пероксидаза хрена) антитело козы против мышиного IgG или конъюгированное с HRP антитело против мышиного lgG1, IgM или против других подтипов антител в объеме 100 мкл/лунка (разведенных в блокирующем растворе 1:5000), инкубировали при 37°С в течение 1 ч и затем промывали PBST 5 раз. Наконец, добавляли 3,3',5,5'-тетраметилбифенилдиамин (ТМВ) в объеме 100 мкл/лунка, и после 10-15 мин развития окрашивания в темноте добавляли останавливающий раствор 1 М H₂SO₄в объеме 50 мкл/лунка, и считывание проводили на микропланшет-ридере при длине волны 450 нм после смешивания. Для получения останавливающего раствора 1 М H₂SO₄ 2,7 мл концентрированной серной кислоты (98%) добавляли капля за каплей к 47,3 мл бидистиллированной воды.

Результаты анализа показаны на Фиг. 2. Для того чтобы измерить титр RBD-специфичного антитела, индуцированного данным рекомбинантным белком, сыворотку непрерывно разводили в разных пропорциях, измеряли посредством титрования, и измеряли значение оптической плотности А450 (оптическая плотность при длине волны 450 нм). Как показано на Фиг. 2, данная вакцина на основе рекомбинантного белка индуцировала значительный уровень антител, специфичных в отношении RBD белка S. Сыворотка, отобранная через 7 суток после вакцинации, демонстрировала сильный антительный ответ с уровнями IgG (Фиг. 2А) и IgM (Фиг. 2Б), повышенными в разных соотношениях, тогда как оптическая плотность А450 была значительно ниже в контрольной группе, вакцинированной нормальным физиологическим раствором, свидетельствуя о том, что данная вакцина может быстро индуцировать иммунные ответы и является важной для предупреждения SARS-COV-2. Данные результаты показали то, что вакцина на основе рекомбинантного RBD белка S была высокоиммуногенной у мышей.

Экспериментальный пример 3. Определение реакции между антителом у пациента с SARS-CoV-2 и белком, раскрытым в настоящем изобретении, посредством ELISA

В данном эксперименте 16 образцов сыворотки от пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, отбирали для исследования иммуногенности белка RBD по настоящему изобретению в человеческих организмах. ELISA использовали для определения следующим образом:

96-луночный планшет покрывали белком RBD (с аминокислотной последовательностью, показанной в SEQ ID No. 3) при концентрации 0,2 мкг/лунку, 100 мкл/лунка, при 4°С в течение ночи. Во время покрытия устанавливали лунку негативного контроля. Данный 96-луночный планшет удаляли на следующие сутки, и за пол часа после повторного нагревания до комнатной температуры данный планшет 4 раза промывали PBS по 1 мин каждый раз. Данный 96-луночный планшет блокировали 1% BSA в объеме 100 мкл/лунка, инкубировали при 37°С в течение 30 мин и затем вновь промывали PBS 4 раза по 1 мин каждый раз. Сыворотку разводили в 5 раз, а именно: добавляя 80 мкл PBS для каждых 20 мкл сыворотки в каждой лунке. Затем данный планшет инкубировали при 37°С в течение 30 мин, промывали PBS 4 раза по 1 мин каждый раз, затем добавляли в него меченное HRP вторичное антитело (антитело против человеческого IgG/IgM), разведенное в пропорции 1:2000 в объеме 100 мкл/лунка, инкубировали при 37°С в течение 30 мин, и промывали PBS 4 раза по 1 мин каждый раз. Для развития окрашивания в каждую лунку добавляли 50 мкл жидкости А и затем 50 мкл жидкости Б, и оставляли стоять при комнатной температуре в течении 15 мин. Для остановки в каждую лунку добавляли 100 мкл останавливающего раствора. Колориметрию с использованием микропланшет-ридера проводили в пределах 10 мин. В данном анализе для выявления антител IgM к 15 мкл сыворотки в каждой лунке добавляли 15 мкл PBS и затем 150 мкл адсорбента IgG, и центрифугировали при 10000 об./мин в течение 10 мин; 100 мкл супернатанта отбирали для выявления.

Как показано на Фиг. 3, сыворотка от 16 пациентов, инфицированных SARS-CoV-2, имела очевидный ответ на белок RBD по настоящему изобретению, и реакции как IgM, так и IgG были положительными, в то время как сыворотка от 10 здоровых людей демонстрировала отрицательную реакцию на данный антиген, указывая то, что RBD белка S SARS-CoV-2 имел высокую иммуногенность в качестве вакцины у пациентов. Белок RBD, полученный по настоящему изобретению, может распознаваться человеческой иммунной системой.

Экспериментальный пример 4. Анализ блокирования для связывания между белком RBD и рецептором АСЕ2

В данном эксперименте экспрессируемый клеткой АСЕ2 - белок, который, как полагают, сохраняет его природную конформацию, использовали для того, чтобы обеспечивать активность связывания RBD посредством измерения проточной цитометрией. Конкретные операции являются следующими:

Культивируемые in vitro штаммы клеток с высокой экспрессией АСЕ2 (А549 рака легкого) расщепляли и отбирали в пробирки для проточной цитометрии по 10⁶клеток/пробирку, и несколько раз промывали PBS/HBSS. В каждую пробирку с клетками добавляли рекомбинантный белок RBD-Fc в конечной концентрации 1 мкг/мл, и затем добавляли сыворотку от иммунизированных против RBD мышей (после того, как мышиная сыворотка, полученная из Экспериментального примера 2, была разведена в 50 раз) для инкубации в течение 30 мин при комнатной температуре. Для пробирки позитивного контроля не добавляли антисыворотку или добавляли нормальную сыворотку от неиммунизированных мышей. После промывки PBS/HBSS несколько раз добавляли вторичное флуоресцентное антитело против человеческого IgG (Fc-специфичное)-FITC (флуоресцеинизотиоцианат) (SIGMA) (1:100-1:200) для инкубации при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. После промывки PBS/HBSS несколько раз и фиксации посредством добавления 500 мкл PBS (фосфатно-солевой буферный раствор), содержащего 1% параформальдегида, осуществляли выявление посредством проточной цитометрии.

Как показано на Фиг. 4, добавленный белок RBD-Fc мог значительно связываться с клетками, экспрессирующими АСЕ2, тогда как был выявлен лишь фоновый сигнал, если не добавляли белок RBD-Fc (негативный контроль). Мышиная антисыворотка эффективно блокировала связывание белка RBD-Fc с клетками, экспрессирующими АСЕ2, тогда как неиммунизированная или преиммунная сыворотка такого же разведения не демонстрировала ингибирующей активности.

Экспериментальный пример 5. Эксперимент по заражению приматов, не являющихся человеком (таких как макак-резус), живым вирусом SARS-CoV-2

1. Экспериментальный способ

Все методики исследований с участием приматов, не являющихся человеком, были подвергнуты обзору и одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных Института медицинской биологии, Китайская академия медицинских наук, и были выполнены в помещении с уровнем 4 биобезопасности животных (ABSL-4) в National Kunming High-level Biosafety Primate Research Center в Юнане, Китай. Белок RBD, использованный в данном эксперименте, представлял собой белок по данному изобретению, аминокислотная последовательность которого показана в SEQ ID No. 4, и данная вакцина была получена согласно воплощению 5. В экспериментах по заражению живым SARS-CoV-2 использовали двенадцать приматов, не являющихся человеком (макаков-резусов) (в возрасте 5-9 лет), и их группировали следующим образом: (а) группа 1 с 4 макаками-резусами (п равно 4), которых вакцинировали вакциной, содержащей в каждой дозе 40 мкг белка RBD+адъювант на основе гидроксида алюминия; (б) группа 2 с 3 макаками-резусами (n равно 3), которых вакцинировали вакциной, содержащей в каждой дозе 20 мкг белка RBD + адъювант на основе гидроксида алюминия; (в) группа 3 с 2 макаками-резусами (n равно 2), которые представляли собой контрольную группу с введением нормального физиологического раствора; (г) группа 4 с макаками-резусами (n равно 2), которые представляли собой контрольную группу с введением адъюванта на основе гидроксида алюминия. Приматов, не являющихся человеком, иммунизировали внутримышечной инъекцией в сутки 0 и 7, с последующим назальным заражением SARS-CoV-2 (0,5 мл, 10⁶ БОЕ(бляшкообразующая единица)/мл) через 28 суток после исходной иммунизации. Для оценки нейтрализующего влияния на инфекцию SARS-CoV-2 сыворотки отбирали в сутки 28 и 35 (5 суток после вакцинации против вируса) после первой иммунизации для анализа нейтрализующих антител. Клетки Vero Е6 (5×10⁴/лунку) инокулировали в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи. SARS-CoV-2 со 100-кратной TCID50 (цитопатическая доза 50%) предынкубировали с равным объемом разведенной сыворотки, и после инкубации в течение 1 ч при 37°С данную смесь добавляли к клеткам Vero Е6. В сутки 3 после инфекции записывали цитопатический эффект (СРЕ) под микроскопом, и титры нейтрализации рассчитывали для разведений сыворотки, получая ЕС 50 (полумаксимальная эффективная концентрация) ингибирования (50% нейтрализации). Контрольные группы включали сыворотку обезьяны, обработанную одним нормальным физиологическим раствором или гидроксидом алюминия.

Содержания вирусной геномной РНК (гРНК) и вирусной субгеномной РНК (сгРНК, представляющая репликацию вируса) определяли посредством количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени, сопряженной с обратной транскрипцией (кПЦР-ОТ). Вирусные нагрузки в ткани легкого, мазках из глотки и анальных мазках определяли посредством кПЦР-ОТ на основе последовательностей, рекомендованных ВОЗ и Китайским центром контроля и предупреждения заболеваний, с использованием праймеров и зондов от NP gene.

Прямой: 5'-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3' (SEQ ID No. 15);

Обратный: 5'-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3' (SEQ ID No. 16);

Зонд: 5'-FAM-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3' (SEQ ID No. 17)

Согласно инструкциям для TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix (продукт №: 4444434) данная реакционная система представляла собой 10 мкл: 1 мкл прямого праймера, 1 мкл обратного праймера, 0,25 мкл зонда, 2,5 мкл матрицы мРНК, 2,5 мкл мастер-микса и 2,75 мкл H₂O, не содержащей РНКаз. Относительно установок и работы программы ПЦР консультировались с инструкциями по работе с ПЦР-системой реального времени BioRad CFX384: обратная транскрипция (инкубировали при 25°С в течение 2 мин и 50°С в течение 15 мин); инициация (инкубировали при 95°С в течение 2 мин); двухэтапная амплификация, 40 циклов (инкубировали при 95°С в течение 5 с и 58°С в течение 31 с).

Содержание субгеномной мРНК (сгмРНК) гена Е SARS-CoV-2, указывающее на репликацию вируса, определяли с использованием праймера и зонда со следующими последовательностями:

Прямой: 5'-GCTAGAGAACATCTAGACAAGAG-3' (SEQ ID No. 18);

Обратный: 5'-ACACACGCATGACGACGTTATA-3' (SEQ ID No. 19);

Зонд: 6'-FAM-TGTGATCGGTAGGAATGACGCGAAGC-Гаситель-3' (SEQ ID No. 20).

Реакционная система и методика ПЦР согласовались с анализом гРНК.

Для заливки срезов в парафин ткани отбирали и фиксировали 10% нейтральным формалином и заливали в парафин. Срезы имели 5 мкм в толщину, и их окрашивали гематоксилином и эозином (НЕ).

2. Экспериментальные результаты

Нейтрализующие антитела против живого SARS-CoV-2 выявляли у всех вакцинированных приматов, не являющихся человеком, но не в одной из двух контрольных групп, как показано на Фиг. 5.

Для выявления вирусной геномной РНК (гРНК) и вирусной субгеномной РНК (сгРНК, представляющая репликацию вируса) использовали количественную ПЦР в реальном времени, сопряженную с обратной транскрипцией (кПЦР-ОТ). Ткани легкого от приматов, не являющихся человеком, отбирали в сутки 7 после заражения для оценки состояния репликации вируса. Ткань легкого контрольной группы (группа, обработанная нормальным физиологическим раствором, и группа, обработанная адъювантом на основе гидроксида алюминия) демонстрировала избыточные копии вирусной гРНК и сгРНК. В отличие от этого, не было выявляемой репликации вируса в группах, вакцинированных 20 или 40 мкг белка RBD + адъювант (Фиг. 6). Кроме того, в контрольных группах (группа, обработанная нормальным физиологическим раствором, и группа, обработанная адъювантом на основе гидроксида алюминия) пиковые нагрузки вирусной гРНК в мазках из глотки наблюдали через 3 суток после вакцинации, и данные вирусные пики могли блокироваться вакциной, тогда как вирусные нагрузки составляли только 1,6 и 3,8 процентов на миллион в группах вакцины 20 мкг и 40 мкг. Важно то, что в мазках из глотки не наблюдали выявляемой сгРНК после заражения вирусом в обеих группах вакцины 20 и 40 мкг, тогда как большое количество сгРНК наблюдали в контрольных группах (группа, обработанная нормальным физиологическим раствором, и группа, обработанная адъювантом на основе гидроксида алюминия), указывающей на репликацию вируса (Фиг. 7). В сутки 5 и 6 после инокуляции пиковые нагрузки вирусной гРНК и сгРНК в анальных мазках наблюдали в контрольных группах (группа, обработанная нормальным физиологическим раствором, и группа, обработанная адъювантом на основе гидроксида алюминия), тогда как лишь крайне низкий уровень был выявлен в вакцинированных группах без выявляемой сгРНК в анальных мазках приматов, не являющихся человеком, вакцинированных 20 мкг и 40 мкг вакцины (Фиг. 8). Приведенные выше результаты показывают, что вакцинация вакциной на основе белка RBD по настоящему изобретению может предупреждать инфекцию SARS-CoV-2.

Ткани легкого от двух контрольных групп (группа, обработанная нормальным физиологическим раствором, и группа, обработанная адъювантом на основе гидроксида алюминия) демонстрировали типичные гистопатологические изменения вирусной интерстициальной пневмонии SARS-CoV-2 - ключевой характеристики COVID-19. Как показано на Фиг. 9, альвеолярные стенки были значительно утолщенными при наблюдении под микроскопом, и инфильтрировало большое число интерстициальных одноядерных воспалительных клеток. Также имелись многочисленные воспалительные инфильтраты и серозные выпоты в альвеолярном пространстве, сопровождаемые распознаваемой потерей структур ткани легкого. Кроме того, приматы, не являющиеся человеком, вакцинированные белком RBD (20 мкг или 40 мкг), не демонстрировали значимых гистопатологических изменений и имели нормальный внешний вид ткани легкого.

Экспериментальный пример 6. Эксперимент по заражению мышей против инфекции SARS-CoV-2

Мышей BALB/c или C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель иммунизировали внутримышечной инъекцией вакцины на основе рекомбинантного белка RBD (т.е. белка с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID NO. 3; вакцина, полученная согласно воплощению 5) в разных дозах (каждая 0,1-20 мкг). Например, у мышей, получавших инъекцию в сутки 0, сыворотку отбирали в сутки 7, и мышам в контрольной группе инъецировали либо один адъювант на основе гидроксида алюминия, либо наормальный физиологический раствор. Сыворотку вновь отбирали в сутки 7 после иммунизации. Данную сыворотку хранили при 4°С для применения в более позднем эксперименте. В экспериментах на животных по инфекции SARS-CoV-2 использовали трансгенных мышей SPF hACE2, созданных Институтом науки о лабораторных животных, Китайская академия медицинских наук и Пекинский единый медицинский колледж. Через семь суток после первой вакцинации отбирали 0,8 мл сыворотки. Сыворотку от иммунизированных вакциной мышей использовали в качестве экспериментальной группы, и нормальную сыворотку от мышей, обработанных нормальным физиологическим раствором, использовали в качестве контрольной группы. За одни сутки до заражения вирусом SARS-CoV-2 (интраназальная инфекция, 10⁵ TCID50) трансгенным мышам hACE2 внутрибрюшинно инъецировали сыворотку. Кроме того, мыши, инфицированные вирусом, но не получившие инъекцию сыворотки, служили в качестве контролей. Через пять суток после заражения вирусом мышей умерщвляли, и отбирали их легкие и другие органы. Ткань легкого использовали для выявления репликации вируса или фиксировали 10%-ным буферизованным раствором формалина для гистопатологического анализа. Проводили количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени, сопряженную с обратной транскрипцией (кПЦР-ОТ) с использованием набора мастер-микса PowerUp SYBG Green (Applied Biosystems, США) для определения числа копий вирусной РНК в тканях легкого мышей, зараженных SARS-CoV-2, выраженного в числе копий РНК/мл ткани легкого. Последовательностью праймера, использованного для кПЦР-ОТ, была следующая последовательность гена оболочки (Е) против SARS-CoV-2:

Прямой: 5'-TCGTTTCGGAAGAGACAGGT-3' (SEQ ID No. 21);

Обратный: 5'-GCGCAGTAAGGATGGCTAGT-3' (SEQ ID No. 22).

Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а гистопатологические изменения наблюдали под световым микроскопом.

В данном эксперименте анализировали, может ли ранний гуморальный иммунитет посредством вакцинации предупреждать инфицирование мышей вирусом SARS-CoV-2. Трансгенных мышей с человеческим АСЕ-2 заражали вирусом SARS-CoV-2, и ткани легкого мышей отбирали через 5 суток после заражения вирусом для измерения состояния репликации вируса сыворотки получивших иммунизацию (сыворотка через 7 суток после первой иммунизации) или контрольной сыворотки. Как показано на Фиг. 10, вирусную репликацию не выявляли количественной полимеразной цепной реакцией в реальном времени, сопряженной с обратной транскрипцией (кПЦР-ОТ), у мышей, обработанных иммунной сывороткой, индуцированной вакциной на основе белка RBD, тогда как уровень вирусной репликации был выше в тканях легкого контрольных мышей. Соответственно, ткани легкого контрольных мышей демонстрировали значительные гистопатологические изменения, обусловленные интерстициальной пневмонией, включающие значительное утолщение альвеолярной стенки, обширную инфильтрацию интерстициальных моноцитов и лимфоцитов, эмболию и выпот сыворотки в альвеолярном пространстве. В отличие от этого, отсутствие гистопатологических изменений или легкое образование выпота наблюдали у мышей, обработанных сывороткой от мышей, иммунизированных вакциной на основе рекомбинантного белка RBD. Кроме того, мыши, обработанные иммунной сывороткой, набирали небольшое количество веса (приблизительно 8%) на протяжении первых 5 суток после инфекции, тогда как не наблюдали набора веса в контрольной группе и потерю 8% веса в группе необработанных. Данный эксперимент дополнительно подтвердил то, что антитело, индуцированное вакциной на основе белка RBD, могло конкурентно блокировать вирусную инфекцию.

Экспериментальный пример 7. Индукция клеточного иммунного ответа посредством вакцины на основе белка RBD, раскрытой в настоящем изобретении

Мышей BALB/c или C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель иммунизировали внутримышечной инъекцией вакцины на основе рекомбинантного белка RBD (т.е. белка с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID No. 3; данная вакцина получена согласно воплощению 5) в разных дозах (0,1-20 мкг каждая). Например, мыши получали инъекцию в сутки 0, сыворотку отбирали в сутки 7, и мышам в контрольной группе инъецировали либо один адъювант на основе гидроксида алюминия, либо нормальный физиологический раствор. Т-лимфоциты селезенки вновь отбирали через 7 суток после иммунизации. Для исследования клеточного иммунного ответа мышей, иммунизированных RBD белка S или PBS, умерщвляли, и их лимфоциты выделяли для выявления IL-4 и IFN-γ посредством ELISA. Вкратце, лимфоциты мышиной селезенки (1×10⁶/мл) культивировали в среде RPMI 1640 (содержащей 10% фетальной телячей сыворотки, 100 U/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 1 мМ пируват, 50 мкМ β-меркаптоэтанол, 20 U/мл IL-2). В то же самое время 1 мкг/мл белка RBD добавляли для культивирования и стимуляции на 72 часа. Клетки без стимуляции белком RBD использовали в качестве негативного контроля. Супернатант отбирали для ELISA.

Поскольку клеточные иммунные ответы могут играть роль в устранении инфекции SARS-CoV-2, при котором CD4- и CD8-позитивные Т-клетки участвуют в иммунных ответах против инфекции вирусом SARS, также проверяли потенциальные клеточные иммунные ответы на вакцину. Лимфоциты отбирали в сутки 7 после первой вакцинации, и цитокины, продуцируемые лимфоцитами, такие как INF-γ (гамма-интерферон) и IL-4 (интерлейкин-4) измеряли посредством ELISA.

Стимуляция выделенных мышиных лимфоцитов рекомбинантный белком RBD показала то, что иммунизированные вакциной мыши продуцировали больше IFN-γ и IL-4 в лимфоцитах, тогда как лишь IFN-γ и IL-4 на фоновом уровне были выявлены у мышей, обработанных нормальным физиологическим раствором после стимуляции лимфоцитов рекомбинантным белком RBD (Фиг. 11).

Экспериментальный пример 8. Эксперимент по безопасности для вакцины, раскрытой в настоящем изобретении

Мышей иммунизировали вакциной по настоящему изобретению. Мышей BALB/c или C57BL/6 в возрасте от 6 до 8 недель иммунизировали внутримышечной инъекцией вакцины на основе рекомбинантного белка RBD (т.е. белка с аминокислотной последовательностью, как показано в SEQ ID No. 3; данная вакцина получена согласно воплощению 5) в разных дозах (0,1-20 мкг каждая). Не обнаружили патологических изменний в сердце, мозге, печени, селезенке, легком, почке и других органах. Не обнаружили изменений клеток крови или биохимических показателей крови. Например, в данном эксперименте измеряли уровень цитокинов в крови для того, чтобы понять, вызывала ли вакцинация изменения цитокинов в системном воспалительном ответе. Мыши получали одиночную инъекцию в сутки 0, сыворотку отбирали в сутки 7, и контрольные мыши получали один иммуноадъювант на основе гидроксида алюминия или нормальный физиологический раствор. На 7-ые сутки после первой инокуляции у мышей отбирали сыворотку, и цитокины TNF-a, IFN-γ, IFN-a, IFN-b, IL-6 и IL-4 выявляли посредством ELISA. Содержание цитокинов в сыворотке определяли с использованием набора для ELISA от Thermo Fisher Scientific-eBioscience следующим образом: осуществляли покрытие антигеном, разведенным буфером для покрытия в объеме 200 мкл/лунка, запечатывали и инкубировали в течение ночи при 4°С; раствор для покрытия отбрасывали после покрытия, и планшет три раза промывали промывочным буфером в объеме 250 мкл/лунка или больше; для блокирования в течение 1 ч при комнатной температуре использовали 200 мкл разбавителя (1 ×) ELISA/ELISPOT (метод иммуноферментных пятен); стандарт получали согласно требованиям по концентрации в спецификации, и данный стандарт в наивысшей концентрации разводили способом двухкратного разведения - всего 8 точек, а в качестве контроля использовали разбавитель (1 ×) ELISA/ELISPOT; сыворотку разводили разбавителем (1 ×) ELISA/ELISPOT для более позднего применения; после промывки планшета в данный планшет добавляли 100 мкл стандартов и образцов, подлежащих анализу, запечатывали и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре; антитело, подлежащее выявлению, разводили разбавителем (1 ×) ELISA/ELISPOT, данный планшет промывали 3-5 раз, разведенное антитело, подлежащее выявлению, добавляли в каждую лунку в объеме 100 мкл/лунка, и данный планшет запечатывали и инубировали в течение 1 часа при комнатной температуре; меченные HRP антитела разводили разбавителем (1 ×) ELISA/ELISPOT, данный планшет промывали 3-5 раз, разведенное меченное HRP антитело против белка биотина добавляли в каждую лунку в объеме 100 мкл/лунка, и данный планшет запечатывали и инубировали в течение 30 мин при комнатной температуре; данный планшет промывали 5-7 раз, в каждую лунку добавляли 1 × раствор ТМВ (тетраметилбензидин) в объеме 100 мкл/лунка, и осуществляли проявление окрашивания в течение 10-15 мин при комнатной температуре; для терминации добавляли останавливающий раствор в объеме 100 мкл/лунка; осуществляли считывание планшета с длиной волны выявления 450 нм и контрольной длиной волны 570 нм.

Экспериментальные результаты показали то, что не было обнаружено различия в уровне цитокинов крови между мышами, иммунизированными вакциной, и контрольными мышами (иммунизированные только адъювантом на основе гидроксида алюминия или нормальным физиологическим раствором) (см. Фиг. 12). Приведенные выше экспериментальные результаты показали то, что вакцинация данной вакциной вероятно не вызывает системной воспалительной реакции.

Важно отметить то, что конкретные характеристики, структуры, вещества или свойства, описанные в данном описании изобретения, могут быть объединены в любом одном или более чем одном воплощении подходящим образом. Кроме того, при условии, что не вызывается взаимного противоречия, специалисты в данной области могут включать и объединять разные воплощения, описанные в данном описании изобретения, и характеристики разных воплощений.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> WestVac Biopharma Co., Ltd.

<120> БЕЛОК И ВАКЦИНА ПРОТИВ ИНФЕКЦИИ SARS-CoV-2

<130> G20P0020K

<150> 202010113054.4

<151> 2020-02-24

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 223

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 2

<211> 222

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe

210 215 220

<210> 3

<211> 227

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

Arg Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn

1 5 10 15

Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val

20 25 30

Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser

35 40 45

Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val

50 55 60

Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp

65 70 75 80

Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln

85 90 95

Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr

100 105 110

Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly

115 120 125

Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys

130 135 140

Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr

145 150 155 160

Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser

165 170 175

Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val

180 185 190

Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly

195 200 205

Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn

210 215 220

Phe Asn Gly

225

<210> 4

<211> 226

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu

1 5 10 15

Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr

20 25 30

Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val

35 40 45

Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser

50 55 60

Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser

65 70 75 80

Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr

85 90 95

Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly

100 105 110

Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly

115 120 125

Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro

130 135 140

Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro

145 150 155 160

Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr

165 170 175

Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val

180 185 190

Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro

195 200 205

Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe

210 215 220

Asn Gly

225

<210> 5

<211> 274

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

35 40 45

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

50 55 60

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

65 70 75 80

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

85 90 95

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

100 105 110

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

115 120 125

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

130 135 140

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

145 150 155 160

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

165 170 175

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

180 185 190

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

195 200 205

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

210 215 220

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

225 230 235 240

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

245 250 255

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly His His His His His His

260 265 270

His His

<210> 6

<211> 395

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 6

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr

35 40 45

Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu

50 55 60

Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro

65 70 75 80

Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala

85 90 95

Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile

100 105 110

Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala

115 120 125

Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp

130 135 140

Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His

145 150 155 160

His Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile

165 170 175

Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe

180 185 190

Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile

195 200 205

Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe

210 215 220

Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu

225 230 235 240

Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu

245 250 255

Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn

260 265 270

Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser

275 280 285

Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg

290 295 300

Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr

305 310 315 320

Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe

325 330 335

Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly

340 345 350

Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu

355 360 365

His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val

370 375 380

Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

385 390 395

<210> 7

<211> 394

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 7

Met Leu Leu Val Asn Gln Ser His Gln Gly Phe Asn Lys Glu His Thr

1 5 10 15

Ser Lys Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala

20 25 30

Ala His Ser Ala Phe Ala Ala Asp Ser Ile His Ile Lys Asp Ser Asp

35 40 45

Asp Leu Lys Asn Arg Leu Ala Glu Ala Gly Asp Lys Leu Val Val Ile

50 55 60

Asp Phe Met Ala Thr Trp Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Gly Pro Lys

65 70 75 80

Leu Asp Glu Met Ala Asn Glu Met Ser Asp Cys Ile Val Val Leu Lys

85 90 95

Val Asp Val Asp Glu Cys Glu Asp Ile Ala Thr Glu Tyr Asn Ile Asn

100 105 110

Ser Met Pro Thr Phe Val Phe Val Lys Asn Ser Lys Lys Ile Glu Glu

115 120 125

Phe Ser Gly Ala Asn Val Asp Lys Leu Arg Asn Thr Ile Ile Lys Leu

130 135 140

Lys Leu Ala Gly Ser Gly Ser Gly His Met His His His His His His

145 150 155 160

Ser Ser Gly Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val

165 170 175

Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn

180 185 190

Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser

195 200 205

Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser

210 215 220

Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys

225 230 235 240

Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp Glu Val

245 250 255

Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr

260 265 270

Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn

275 280 285

Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu

290 295 300

Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu

305 310 315 320

Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn

325 330 335

Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val

340 345 350

Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu Leu His

355 360 365

Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys

370 375 380

Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

385 390

<210> 8

<211> 847

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 8

ggatccatgc tgctggtcaa ccaatctcat cagggcttca acaaagaaca tacttcaaaa 60

atggtctccg ctatcgtgct gtacgtgctc ctcgctgctg ctgctcactc tgctttcgct 120

gctgacgaat tcagggtgca gccaaccgaa tctatcgtca gattcccaaa catcactaac 180

ctgtgccctt tcggagaggt gttcaacgct accaggttcg ccagcgtcta cgcttggaac 240

cgcaagcgta tcagcaactg cgtcgccgac tactctgtgc tgtacaactc cgctagcttc 300

tctactttca agtgctacgg cgtgtcacct accaagctga acgacctgtg cttcactaac 360

gtctacgccg actccttcgt gatccgcgga gacgaagtcc gtcagatcgc tcctggacag 420

accggaaaga tcgctgacta caactacaag ctgccagacg acttcactgg ctgcgtgatc 480

gcttggaact caaacaacct ggactccaag gtcggtggca actacaacta cctgtacagg 540

ctgttcagaa agtcaaacct gaagcctttc gagcgcgaca tctcaaccga aatctaccag 600

gctggttcca ctccctgcaa cggtgtggag ggcttcaact gctacttccc cctgcagtcc 660

tacggtttcc agccaaccaa cggagtcggt taccagcctt accgtgtggt cgtgctgagc 720

ttcgaactgc tccacgctcc tgctactgtg tgcggtccca agaagtctac taacctggtc 780

aaaaacaaat gtgtcaactt caacttcaac ggtcaccacc accaccacca ccaccactga 840

taagctt 847

<210> 9

<211> 1200

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 9

ggatccatgc tgctggtcaa ccagagccac cagggcttca acaaggaaca cacttccaag 60

atggtgtccg ccatcgtcct gtacgtgctg ctggccgccg ctgctcacag cgctttcgcc 120

gctgacagcg acaagatcat ccacctgact gacgacagct tcgacactga cgtgctgaag 180

gctgacggtg ctatcctggt cgacttctgg gccgagtggt gcggcccttg caagatgatc 240

gctcccatcc tggacgagat cgccgacgag taccagggta aactgactgt ggccaagctg 300

aacatcgacc agaaccccgg tactgctcct aagtacggca tccgtggtat ccccactctg 360

ctgctgttca agaacggtga ggtggccgct accaaggtcg gtgctctgag caagggccag 420

ctgaaggagt tcctggacgc taacctggct ggttccggca gcggccacat gcaccaccac 480

caccatcaca gcagcggcga cgacgacgac aaggtgcagc caaccgaatc tatcgtcaga 540

ttcccaaaca tcactaacct gtgccctttc ggagaggtgt tcaacgctac caggttcgcc 600

agcgtctacg cttggaaccg caagcgtatc agcaactgcg tcgccgacta ctctgtgctg 660

tacaactccg ctagcttctc tactttcaag tgctacggcg tgtcacctac caagctgaac 720

gacctgtgct tcactaacgt ctacgccgac tccttcgtga tccgcggaga cgaagtccgt 780

cagatcgctc ctggacagac cggaaagatc gctgactaca actacaagct gccagacgac 840

ttcactggct gcgtgatcgc ttggaactca aacaacctgg actccaaggt cggtggcaac 900

tacaactacc tgtacaggct gttcagaaag tcaaacctga agcctttcga gcgcgacatc 960

tcaaccgaaa tctaccaggc tggttccact ccctgcaacg gtgtggaggg cttcaactgc 1020

tacttccccc tgcagtccta cggtttccag ccaaccaacg gagtcggtta ccagccttac 1080

cgtgtggtcg tgctgagctt cgaactgctc cacgctcctg ctactgtgtg cggtcccaag 1140

aagtctacta acctggtcaa aaacaaatgt gtcaacttca acttcaacgg ttaaaagctt 1200

<210> 10

<211> 1197

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 10

ggatccatgc tgctggtcaa ccagagccac cagggtttca acaaggaaca caccagcaag 60

atggtgagcg ctatcgtgct gtacgtcctg ctggccgctg ctgctcacag cgctttcgct 120

gctgactcca tccacatcaa ggacagcgac gacctgaaga accgtctggc cgaggccggt 180

gacaagctgg tcgtcatcga cttcatggcc acttggtgcg gtccttgcaa gatgatcggc 240

cctaagctgg acgagatggc taacgagatg tccgactgca tcgtggtcct gaaggtggac 300

gtcgacgagt gcgaggacat cgccaccgaa tacaacatca acagcatgcc caccttcgtg 360

ttcgtgaaga acagcaagaa gatcgaggaa ttttccggcg ctaacgtcga caagctgcgt 420

aacaccatca tcaagctgaa gctggccggc tccggctccg gccacatgca tcaccaccac 480

caccattcct ccggtgacga cgacgacaag gtgcagccaa ccgaatctat cgtcagattc 540

ccaaacatca ctaacctgtg ccctttcgga gaggtgttca acgctaccag gttcgccagc 600

gtctacgctt ggaaccgcaa gcgtatcagc aactgcgtcg ccgactactc tgtgctgtac 660

aactccgcta gcttctctac tttcaagtgc tacggcgtgt cacctaccaa gctgaacgac 720

ctgtgcttca ctaacgtcta cgccgactcc ttcgtgatcc gcggagacga agtccgtcag 780

atcgctcctg gacagaccgg aaagatcgct gactacaact acaagctgcc agacgacttc 840

actggctgcg tgatcgcttg gaactcaaac aacctggact ccaaggtcgg tggcaactac 900

aactacctgt acaggctgtt cagaaagtca aacctgaagc ctttcgagcg cgacatctca 960

accgaaatct accaggctgg ttccactccc tgcaacggtg tggagggctt caactgctac 1020

ttccccctgc agtcctacgg tttccagcca accaacggag tcggttacca gccttaccgt 1080

gtggtcgtgc tgagcttcga actgctccac gctcctgcta ctgtgtgcgg tcccaagaag 1140

tctactaacc tggtcaaaaa caaatgtgtc aacttcaact tcaacggtta aaagctt 1197

<210> 11

<211> 711

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 11

aagcttgacg acgacgacaa ggtgcagccg accgaaagca ttgtgcgctt tccgaacatt 60

accaaccttt gtcctttcgg tgaggtattc aatgcaacac gctttgcttc agtttatgct 120

tggaaccgca aacgcatttc aaactgtgtt gctgattatt cagttcttta taactcagct 180

tcattctcca cctttaaatg ttatggcgtt tcacctacaa agctgaatga tctttgtttc 240

accaatgttt atgctgattc atttgttatt cgcggcgatg aagttcgcca gattgctcct 300

ggccagacag gcaagatagc cgattataac tataaacttc ctgatgattt cacgggatgt 360

gttattgctt ggaactcaaa caaccttgat tcaaaggtcg gtggcaacta taactatctt 420

tatcgcctgt tccggaagtc aaaccttaaa cctttcgaga gagatatttc aacagaaatt 480

tatcaggctg gctcaacacc ttgtaacggc gttgaaggct ttaactgtta tttcccactg 540

caaagctatg gctttcagcc tacaaacggc gttggctatc agccttatcg cgttgttgtt 600

ctttcatttg aacttcttca tgctcctgct acagtttgtg gccctaagaa aagcactaat 660

ctggtgaaaa acaaatgtgt gaactttaac tttaacggct gataactcga g 711

<210> 12

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 12

ctcgagaaaa gagttcaacc tacagaatca atcgttagat ttcctaacat cacaaacctt 60

tgtcctttcg gcgaggtctt caatgccaca agatttgcat cagtttatgc atggaacaga 120

aagcgtatat caaactgtgt tgcagattat tcagttcttt ataactcagc atcattctct 180

acctttaaat gttatggagt ttcacctaca aagctcaatg atctttgttt cactaatgtt 240

tatgcagatt catttgttat cagaggagat gaagttagac aaatcgcacc tggacaaaca 300

ggaaagattg ccgattataa ctataaactt cctgatgatt tcaccggctg tgttatcgca 360

tggaactcaa acaatctcga cagcaaagta ggtgggaatt acaattactt gtaccggcta 420

tttaggaagt ccaacctcaa gccgttcgag cgcgatatct caacagaaat ctatcaagca 480

ggatcaacac cttgtaacgg agttgaagga tttaactgtt atttcccgct acaatcatat 540

ggatttcaac ctacaaacgg agttggatat caaccttata gagttgttgt tctttcattt 600

gaacttcttc atgcacctgc aacagtttgt ggacctaaga agtctacgaa ccttgttaag 660

aataagtgtg ttaactttaa ctttaacgga tgataatcta ga 702

<210> 13

<211> 807

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 13

atgaacagct tcagcaccag cgccttcggc cccgtggcct tcagcctggg cctgctgctg 60

gtgctgcccg ccgccttccc cgccccccac caccaccacc accaccacca cgacgacgac 120

gacaaggtgc agcccaccga gagcatcgtg aggttcccca acatcaccaa cctgtgcccc 180

ttcggcgagg tgttcaacgc caccaggttc gccagcgtgt acgcctggaa caggaagagg 240

atcagcaact gcgtggccga ctacagcgtg ctgtacaaca gcgccagctt cagcaccttc 300

aagtgctacg gcgtgagccc caccaagctg aacgacctgt gcttcaccaa cgtgtacgcc 360

gacagcttcg tgatcagggg cgacgaggtg aggcagatcg cccccggcca gaccggcaag 420

atcgccgact acaactacaa gctgcccgac gacttcaccg gctgcgtgat cgcctggaac 480

agcaacaacc tggacagcaa ggtgggcggc aactacaact acctgtacag gctgttcagg 540

aagagcaacc tgaagccctt cgagagggac atcagcaccg agatctacca ggccggcagc 600

accccctgca acggcgtgga gggcttcaac tgctacttcc ccctgcagag ctacggcttc 660

cagcccacca acggcgtggg ctaccagccc tacagggtgg tggtgctgag cttcgagctg 720

ctgcacgccc ccgccaccgt gtgcggcccc aagaagagca ccaacctggt gaagaacaag 780

tgcgtgaact tcaacttcaa cggctga 807

<210> 14

<211> 268

<212> ПРТ

<213> Искусственная последовательность

<400> 14

Met Asn Ser Phe Ser Thr Ser Ala Phe Gly Pro Val Ala Phe Ser Leu

1 5 10 15

Gly Leu Leu Leu Val Leu Pro Ala Ala Phe Pro Ala Pro His His His

20 25 30

His His His His His Asp Asp Asp Asp Lys Val Gln Pro Thr Glu Ser

35 40 45

Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys Pro Phe Gly Glu Val

50 55 60

Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala Trp Asn Arg Lys Arg

65 70 75 80

Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu Tyr Asn Ser Ala Ser

85 90 95

Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro Thr Lys Leu Asn Asp

100 105 110

Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe Val Ile Arg Gly Asp

115 120 125

Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly Lys Ile Ala Asp Tyr

130 135 140

Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys Val Ile Ala Trp Asn

145 150 155 160

Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn Tyr Asn Tyr Leu Tyr

165 170 175

Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe Glu Arg Asp Ile Ser

180 185 190

Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys Asn Gly Val Glu Gly

195 200 205

Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly Phe Gln Pro Thr Asn

210 215 220

Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val Leu Ser Phe Glu Leu

225 230 235 240

Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys Lys Ser Thr Asn Leu

245 250 255

Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn Gly

260 265

<210> 15

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 15

ggggaacttc tcctgctaga at 22

<210> 16

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 16

cagacatttt gctctcaagc tg 22

<210> 17

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 17

ttgctgctgc ttgacagatt 20

<210> 18

<211> 23

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 18

gctagagaac atctagacaa gag 23

<210> 19

<211> 22

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 19

acacacgcat gacgacgtta ta 22

<210> 20

<211> 26

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<400> 20

tgtgatcggt aggaatgacg cgaagc 26

<---

Claims

1. Белковый антиген для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2, отличающийся тем, что содержит домен, который связывается с рецептором ангиотензинпревращающего фермента 2 (АСЕ2), содержащийся в S-белке SARS-CoV-2, где аминокислотная последовательность указанного домена представляет собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 3 или SEQ ID No. 4.

2. Предшественник белка по п. 1, отличающийся тем, что он имеет аминокислотную последовательность, представляющую собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 7 и SEQ ID No. 14.

3. Применение белка по п. 1 и/или предшественника по п. 2 в получении лекарственных средств для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2.

4. Вакцина для предупреждения и/или лечения инфекции SARS-CoV-2, отличающаяся тем, что она содержит белок по п. 1 и/или предшественник по п. 2, а также фармацевтически приемлемый эксципиент или вспомогательный ингредиент.

5. Вакцина по п. 4, отличающаяся тем, что указанный вспомогательный ингредиент включает иммунологический адъювант; предпочтительно указанный иммунологический адъювант представляет собой по меньшей мере один из следующих: соль алюминия, соль кальция, растительный сапонин, растительный полисахарид, монофосфат-липид А, муринилдипептид, муринилтрипептид, эмульсия сквалена типа «масло в воде», бактериальный токсин, цитокин GM-CSF, липид и катионное липосомное вещество.

6. Вакцина по п. 5, отличающаяся тем, что она удовлетворяет по меньшей мере одной из следующих характеристик: соль алюминия представляет собой по меньшей мере одну из гидроксида алюминия и квасцов; соль кальция представляет собой трикальция фосфат; растительный сапонин представляет собой QS-21 или ISCOM; растительный полисахарид представляет собой полисахарид астрагала; эмульсия сквалена типа «масло в воде» представляет собой MF59; бактериальный токсин представляет собой по меньшей мере один из рекомбинантного холерного токсина и дифтерийного токсина; липид представляет собой по меньшей мере один из фосфатидилэтаноламина, фосфатидилхолина, холестерина и диолеилфосфатидилэтаноламина; катионное липосомное вещество представляет собой по меньшей мере одно из следующих: (2,3-диолеоилокси-пропил)- триметиламмония-хлорид, N-[1-(2,3-диолеилокси хлорид)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид, катионный холестерин, трифторуксусной кислоты диметил-2, 3-диолеоксипропил-2-(2-сперминформиламино)этиламмоний, додецилтриметиламмония бромид, тетрадецилтриметиламмония бромид, цетил-метил-аммония бромид, диметилдиоктадециламмония бромид (DDAB) и CpG ODN.

7. Вакцина по любому из пп. 4-6, отличающаяся тем, что указанная вакцина представляет собой препарат для инъекций; предпочтительно указанная вакцина представляет собой препарат для внутримышечных инъекций.

8. Полинуклеотид, кодирующий предшественник по п. 2, отличающийся тем, что он имеет нуклеотидную последовательность, представляющую собой по меньшей мере одну из SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12 и SEQ ID No. 13.

9. Рекомбинантный экспрессионный вектор, содержащий полинуклеотид по п. 8, отличающийся тем, что используют по меньшей мере один из экспрессионного вектора на основе бакуловируса насекомого, экспрессионного вектора клетки млекопитающего, экспрессионного вектора Escherichia coli и дрожжевого экспрессионного вектора.

10. Вектор по п. 9, отличающийся тем, что указанный экспрессионный вектор на основе бакуловируса насекомого представляет собой pFastBac1; указанный экспрессионный вектор Escherichia coli представляет собой pET32a; указанный дрожжевой экспрессионный вектор представляет собой pPICZaA; указанный экспрессионный вектор клетки млекопитающего представляет собой экспрессионный вектор клетки яичника китайского хомяка (СНО) и указанный экспрессионный вектор клетки СНО предпочтительно представляет собой pTT5 или FTP-002.

11. Клетка-хозяин для экспрессии белка по п. 1, отличающаяся тем, что содержит вектор по п. 9 или 10.

12. Клетка-хозяин по п. 11, отличающаяся тем, что используют по меньшей мере одну из клетки насекомого, клетки млекопитающего, Escherichia coli и дрожжей; предпочтительно указанная клетка насекомого представляет собой по меньшей мере одну из клетки sf9, клетки sf21 и клетки Hi5; предпочтительно указанная клетка млекопитающего представляет собой клетку СНО.

13. Способ получения белка по п. 1, отличающийся тем, что он включает следующую стадию: культивирование клетки-хозяина по п. 11 для экспрессии белка или предшественника и затем выделение указанного белка.

14. Способ получения белка по п. 1, отличающийся тем, что он включает следующую стадию: конструирование рекомбинантного вектора, содержащего полинуклеотид по п. 8 для реализации человеческого иммунитета, и, таким образом, получение данного белка.

15. Способ получения по п. 14, отличающийся тем, что указанный вектор представляет собой по меньшей мере один из мРНК, ДНК-вакцины, аденосируса, вируса осповакцины Анкара и аденоассоциированного вируса.