JP2018533934A - C型肝炎ウイルスe1/e2ヘテロダイマー及びそれを生成する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年10月8日に出願された米国仮特許出願第62/239,157号、及び2016年5月16日に出願された米国仮特許出願第62/337,212号の利益を主張するものであり、これらの出願は参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
C型肝炎ウイルス(HCV)は、世界中で150〜200百万の人々が感染していると推定される血液媒介病原体である。HCVによる感染は徴候を示さない場合もあり、医学的介入なしに患者によって排除される場合もある。しかしながら、患者の大部分が慢性HCV感染症を発症し、これは、肝炎、瘢痕化、さらには肝不全または肝癌に至る場合もある。米国単独で3百万を超える人々が慢性感染症を有する。
「C型肝炎ウイルス」(「HCV」)という用語は、本明細書中で使用される場合、C型肝炎ウイルスの多くの異なる遺伝子型及び分離株のいずれか1つを指す。このように、「HCV」は、例えば、遺伝子型1、2、3、4、6、7など及び亜型(例えば、1a、1b、2a、2b、3a、4a、4cなど)、ならびに疑似種を含むHCVの多くの遺伝子型、亜型または疑似種の任意のものを包含する。代表的なHCV遺伝子型及び分離株としては、以下が挙げられる:「Chiron」分離株HCV−1、H77、J6、Con1、分離株1、BK、EC1、EC10、HC−J2、HC−J5;HC−J6、HC−J7、HC−J8、HC−JT、HCT18、HCT27、HCV−476、HCV−KF、「Hunan」、「Japanese」、「Taiwan」、TH、1型、1a型、H77 1b型、1c型、1d型、1e型、1f型、10型、2型、2a型、2b型、2c型、2d型、2f型、3型、3a型、3b型、3g型、4型、4a型、4c型、4d型、4f型、4h型、4k型、5型、5a型、6型及び6a型。
本開示は、C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドと、HCV E2ポリペプチドとを含むアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、E1及びE2ポリペプチドの一方または両方が、ワクチンとしてのHCV E1/E2ヘテロダイマーの送達のためのE1E2ヘテロダイマーの商業的なスケールアップした精製及び生成を容易にするアフィニティ精製タグを含む、ヘテロダイマーポリペプチドを提供する。本開示は、本開示のアフィニティタグ付きE1/E2ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。本開示は、ワクチンとして使用するのに適した(タグなし)HCV E1/E2ヘテロダイマーを生成する方法を提供する。
本開示は、例えば、E2のN末端と融合したヒトFc免疫グロブリンドメインなどのアフィニティ精製タグを使用したE1E2糖タンパク質ヘテロダイマーの大規模精製を促進するための方法を提供する。E1E2ヘテロダイマー複合体の精製後、ヒトFcドメインは、Fcドメインの下流に位置するタンパク質切断部位における適切なプロテアーゼを用いた消化によりE1E2複合体から除去することができる。通常は、E1E2の大規模精製は、非常に困難であり、ヒトへのHCVワクチンとしてのその使用を厳しく制限する。本開示は、この難題に対処するため、及びワクチンとして使用するのに適したHCV E1/E2ヘテロダイマーを生成するための方法を提供する。本開示はまた、a)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチド及びHCV E2ポリペプチド、b)HCV E1ポリペプチド及びHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチド、またはc)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチド及びHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドを提供する。HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドのアフィニティタグ部分は、HCV E1ポリペプチドのN末端、またはHCV E1ポリペプチドのC末端にあってもよい。同様に、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドのアフィニティタグ部分も、HCV E2ポリペプチドのN末端、またはHCV E2ポリペプチドのC末端にあってもよい。
本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適したE2ポリペプチドは、約200アミノ酸(aa)から約250aa、約250aaから約275aa、約275aaから約300aa、約300aaから約325aa、約325aaから約350aa、または約350aaから約365aaの長さを有してもよい。ある場合には、本開示のE1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適したHCV E2ポリペプチドは、HCV E2エクトドメインポリペプチドである。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーに含めるのに適したHCV E2ポリペプチドは、完全長HCV E2ポリペプチドである。
本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適したHCV E1ポリペプチドは、約150アミノ酸(aa)から約175aa、約175aaから約195aa、約131aaから約175aa、または約175aaから約193aaの長さを有してもよい。ある場合には、本開示のE1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適したHCV E1ポリペプチドは、HCV E1エクトドメインポリペプチドである。ある場合には、本開示のE1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適したHCV E1ポリペプチドは、完全長HCV E1ポリペプチドである。
適したアフィニティタグ(本明細書において「アフィニティ精製タグ」とも呼ばれる)としては、免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド、プロテインA、プロテインG、プロテインL、ハイブリッドプロテインA-プロテインGポリペプチド、ポリ(ヒスチジン)トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、及びグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)が挙げられる。
さまざまなIg Fcポリペプチドが、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー中に含めるのに適している。Fc領域(Fcポリペプチド)は、ヒトIgG1 Fc、ヒトIgG2 Fc、ヒトIgG3 Fc、ヒトIgG4 Fcなどであってもよい。Fcポリペプチドは、非ヒト種由来のFcポリペプチドであってもよい。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー中に含まれるアフィニティタグポリペプチドは、プロテインAポリペプチドである。適したプロテインAポリペプチドは、図10Aに表されるアミノ酸27から227プロテインAアミノ酸配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、150から200アミノ酸の長さを有してもよい。適したプロテインAポリペプチドは、図10Aに表されるアミノ酸27から227プロテインAアミノ酸配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、200アミノ酸の長さを有してもよい。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、プロテインGポリペプチドである。適したプロテインGポリペプチドは、図10Bに表されるアミノ酸37〜448プロテインGアミノ酸配列と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、350アミノ酸から411アミノ酸の長さを有してもよい。
プロテインLは、抗体のカッパ軽鎖、単鎖可変フラグメント(scFv)、及びFabフラグメントと結合する。適したプロテインLポリペプチドは、図10Cに表されるプロテインLアミノ酸配列のアミノ酸25〜992と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。適したプロテインLポリペプチドは、図10Cに表されるプロテインLアミノ酸配列のアミノ酸25〜992と少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、800アミノ酸から968アミノ酸の長さを有してもよい。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、ポリ(ヒスチジン)トラクトを含むポリペプチドである。適したポリ(ヒスチジン)トラクト含有ポリペプチドは、約25アミノ酸から約500アミノ酸、例えば、約25アミノ酸(aa)から30aa、30aaから35aa、35aaから40aa、40aaから50aa、50aaから75aa、75aaから100aa、100aaから150aa、150aaから200aa、200aaから250aa、250aaから300aa、300aaから350aa、350aaから400aa、400aaから450aa、または450aaから500aaの長さを有してもよい。ポリ(ヒスチジン)トラクトは、4から20の連続的なヒスチジン、例えば、4から6の連続的なヒスチジン、6から10の連続的なヒスチジン、10から15の連続的なヒスチジン、または15から20の連続的なヒスチジンであってもよい。例えば、適したアフィニティタグポリペプチドは、約50アミノ酸の長さであってもよく、(His)6ヒスチジントラクトを含んでもよい。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーに含まれるアフィニティタグポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖、またはIg軽鎖含有ポリペプチドである。例えば、Ig軽鎖含有ポリペプチドは、単鎖可変フラグメント(scFv)、Fabフラグメント、または任意のその他のIg軽鎖含有ポリペプチドであってもよい。ある場合には、Ig軽鎖含有ポリペプチドは、Igカッパ軽鎖、例えば、ヒトIgカッパ軽鎖を含む。Ig軽鎖アミノ酸配列は、当該技術分野において知られている。
ある場合には、リンカーは、アフィニティタグ(例えば、Ig Fc)とHCV E1またはHCV E2ポリペプチドとの間に挿入されてもよい。リンカーペプチドは、任意のさまざまなアミノ酸配列を有してもよい。リンカーは、約6から約40の間のアミノ酸長、または約6から約25の間のアミノ酸長のペプチドであってもよい。こうしたリンカーは、タンパク質をつなぐためにリンカーをコードする合成のオリゴヌクレオチドを使用することによって作製することができる。ある程度の柔軟性を可能にするペプチドリンカーが、使用されてもよい。連結ペプチドは、適切なリンカーが一般に柔軟なペプチドをもたらす配列を有することになることを留意して実質的にいかなるアミノ酸配列を有してもよい。グリシン及びアラニンなどの小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドを作り出す際に役立つ。そのような配列の作製は、当業者には通常のものである。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーは、a)HCV E1-Fc融合ポリペプチドと、b)HCV E2ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーは、a)HCV E2-Fc融合ポリペプチドと、b)HCV E1ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーは、a)HCV E1-Fc融合ポリペプチドと、b)HCV E2-Fc融合ポリペプチドとを含む。
本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー中に存在するアフィニティタグは、精製中に切断され除かれて、アフィニティタグを含まないHCV E1/E2ヘテロダイマーを形成する。この目的を達成するために、タンパク質分解切断可能なリンカーは、アフィニティタグと、HCV E1及び/またはHCV E2ポリペプチドとの間に配置することができる。
真核(例えば、哺乳類)細胞における野生型HCV E1−E2ポリタンパク質のプロセッシングの間に、内在性のプロテアーゼがE2タンパク質からE1タンパク質を切断し;内在性のプロテアーゼがE1−E2接合部を認識し、接合部にて切断する。哺乳類細胞におけるポリタンパク質前駆体からの本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーの合成及びプロセッシングの間に、野生型E1−E2接合部が繰り返されることができるので、E2のN末端に由来するアミノ酸(例えば、2から15のアミノ酸(aa)(例えば、2aa、3aa、4aa、5aa、6aa、7aa、8aa、9aa、10aa、11aa、12aa、13aa、14aa、または15aa))が、図6Aで描かれるようにアフィニティタグのN末端で繰り返される。ある場合には、HCV E2ポリペプチドのN末端に由来する2アミノ酸がアフィニティタグのN末端に位置する。ある場合には、ジペプチドQT、ET、HT、GT、TT、RH、NT、AY、VI、またはSTがアフィニティタグのN末端に位置する。E1E2の遺伝子型及び特定の分離株に応じて、E2の最初の2つのアミノ酸の2つ組はシグナルペプチダーゼ(SP)によるプロセッシングに続いてE2のN末端で作り出される望ましくないアミノ酸を生じてもよい(図6A)。アミノ末端でのそのようなアミノ酸にはアスパラギン(N)、グルタミン(Q)またはシステイン(C)が挙げられる。そのようなアミノ酸はN末端則経路を介したプロテアソームが介在する分解についてタンパク質を標的とすることができる(Tasaki,T,et al.2012.Annu Rev Biochem 81,261−289で概説された)。この場合、特定の遺伝子型についてのいずれかのコンセンサス配列に従って代替のアミノ酸が選択されることができ、または特定の遺伝子型サブクラスが選択されることになる。
本開示は、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列を含む核酸と、本核酸を含む組換え発現ベクターを提供する。したがって、本開示は、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーをコードするヌクレオチド配列を含む組換え発現ベクターを提供する。本開示は、本開示の核酸または組換え発現ベクターによって遺伝子改変されたホスト細胞を提供する。
ある場合には、本開示の核酸はN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはHCV E1ポリペプチドとHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはHCV E1ポリペプチドとHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとiii)HCV E2ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際に、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E1ポリペプチドとHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとiii)HCV E2ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E1ポリペプチドとHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとiii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含み、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとiii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含み、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含み、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E1ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチドアとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示の核酸は、N末端からC末端に順番に、i)HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとii)HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとを含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、その際、HCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含み、HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。好適なホスト細胞での発現の際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが産生され、その際、アフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーはアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとアフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチドとii)アフィニティタグポリペプチドとを含む。そのように産生されたHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドはN末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチドとii)HCV E2ポリペプチドとを含む。
本開示は、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーの生成方法を提供する。本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーの2つのポリペプチド鎖は任意の好適な方法、例えば、組換え法及び非組換え法(例えば、化学合成)を用いて生成することができる。本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーの2つのポリペプチド鎖が組換え法によって生成される場合、2つのポリペプチド鎖は別々のホスト細胞または同一のホスト細胞にて生成することができる。ある場合には、本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーの2つのポリペプチド鎖は同一のホスト細胞にて生成される。
ある場合には、タグなしのHCV E1/E2ヘテロダイマー開示の生成方法は、a)遺伝子改変ホスト細胞(遺伝子改変ホスト細胞が本開示のアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマー(例えば、HCV E2ポリペプチドとHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチド;HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドとE1ポリペプチド;またはHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドとHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチド)を産生する場合)のライセートを不溶性の支持体上に固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドに接触させ、その際、ライセートに存在するアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーが固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドに結合して固定されたアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーを生成することと、b)アフィニティタグとアフィニティタグ付きHCV E1及び/またはE2ポリペプチドとの間で切断する酵素に固定されたアフィニティタグ付きHCV E1/E2ヘテロダイマーを接触させ、それによってタグなしのHCV E1/E2ヘテロダイマーを遊離し、遊離されたタグなしのHCV E1/E2ヘテロダイマーを回収することとを含む。ある場合には、タグなしのHCV E1/E2ヘテロダイマーは1以上のさらなる精製工程に供される。
本開示は、本開示の方法を用いて生成されるHCV E1/E2ヘテロダイマーを提供する。ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE2ポリペプチドのN末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E2ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE2ポリペプチドのC末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E2ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE1ポリペプチドのN末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E1ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE1ポリペプチドのC末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E1ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーは修飾されたHCV E2ポリペプチド及び修飾されたHCV E1ポリペプチドを含む。
ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE2ポリペプチドのN末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E2ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはa)HCV E1ポリペプチドと、b)N末端からC末端に順番に、i)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のC末端側にある1から6の異種アミノ酸及びii)HCV E2ポリペプチドを含む修飾E2ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE1ポリペプチドのN末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E1ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはa)HCV E2ポリペプチドと、b)N末端からC末端に順番に、i)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のC末端側にある1から6の異種アミノ酸及びii)HCV E1ポリペプチドを含む修飾E1ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE2ポリペプチドのC末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E2ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはa)HCV E1ポリペプチドと、b)N末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチド及びii)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のN末端側にある1から6の異種アミノ酸を含む修飾E2ポリペプチドとを含む。
ある場合には、本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーはE1ポリペプチドのC末端におけるタンパク質分解切断可能なリンカーに由来する1から6のアミノ酸を伴う修飾されたHCV E1ポリペプチドを含む。ある場合には、本開示のヘテロダイマーポリペプチドはa)HCV E2ポリペプチドと、b)N末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチド及びii)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のN末端側にある1から6の異種アミノ酸を含む修飾E1ポリペプチドとを含む。
本開示のHCV E1/E2ヘテロダイマーポリペプチドは薬学的に許容される賦形剤(複数可)と共に製剤化されて免疫原性組成物を形成することができる。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術で知られており、本明細書で詳細に述べる必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,20th edition,Lippincott,Williams,& Wilkins;Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.,eds 7th ed.,Lippincott,Williams,& Wilkins;及びHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assoc.を含む種々の出版物で十分に記載されている。
本開示の免疫原性組成物は、本開示のヘテロダイマーHCV E1/E2ポリペプチドに加えてアジュバントを含むことができる。ヒトで使用することができる既知の好適なアジュバントの例には、ミョウバン、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、MF59(4.3%w/vのスクアレン、0.5%w/vのTween80(商標)、0.5%w/vのSpan85)、CpG含有核酸(シトシンがメチル化されていない)、QS21、MPL、3DMPL、Aquillaの抽出物、ISCOMS、LT/CT突然変異体、ポリ(D,L−ラクチド−co−グリコリド)(PLG)微粒子、Quil A、インターロイキン等が挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。実験動物については、フロイント、N−アセチル−ムラミル−L−スレオニル−D−イソグルタミン(thr−MDP)、N−アセチル−ノル−ムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミン(CGP11637、ノル−MDPと呼ばれる)、N−アセチルムラミル−L−アラニル−D−イソグルタミニル−L−アラニン−2−(1’−2’−dip−アルミトイル−sn−グリセロ−3−ヒドロキシホスホリルオキシ)−エチルアミン(CGP19835A、MTP−PEと呼ばれる)、及び細菌から抽出された3つの成分を含有するRIBI、モノホスホリルリピドA、トレハロースジミコール酸及び2%スクアレン/Tween80エマルション中の細胞壁骨格(MPL+TDM+CWS)を使用することができる。別の好適なアジュバントはAS01、3’−O−デスアシル−4’−モノホスホリルリピドA(MPL)を含むリポソームの懸濁液及びQuillaja saponaria21(QS21)である。ある場合には、アジュバントはMF59、AS01、AS02、AS03、AS04、ミョウバン、水酸化アルミニウム、及びリン酸アルミニウムから選択される。アジュバントの有効性は、免疫原性抗原またはその抗原エピトープに対して向けられた抗体の量を測定すること、抗原に対する細胞傷害性Tリンパ球の応答を測定すること、及び抗原に対するヘルパーT細胞の応答を測定することの1以上によって判定されてもよい。
本開示は、哺乳類対象において少なくとも1つのHCV遺伝子型に対する免疫応答(例えば、防御的免疫応答)を誘導する方法を提供する。ある場合には、方法は、それを必要とする個体に有効量の本開示のヘテロダイマーHCV E1/E2ポリペプチドまたは本開示のヘテロダイマーHCV E1/E2ポリペプチドを含む組成物(例えば、免疫原性組成物)を投与することを含む。他の場合では、方法は、それを必要とする個体に有効量の本開示のヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸(複数可)(例えば、組換え発現ベクター)を投与することを含む。
本開示のHCV組成物による投与に好適である個体には免疫学的にナイーブな個体(例えば、HCVに感染したことがない及び/またはHCVワクチンの投与を受けたことがない個体)が挙げられる。
図6A.完全長E1E2ポリペプチドのコンストラクトにおけるE2のN末端へのFcタグ挿入の模式図
E1E2ポリペプチドはCMVプロモーター(PCMV)の制御下で発現させ、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)に由来するシグナル配列を含める。代表的なHCV E1E2配列:H77(GenBank NP_671941)、JFH1(Genbank ABO47639;遺伝子型2A)、S52(Genbank ADF97232.1;遺伝子型3a)、及び分離株QC69(Genbank:ABN05226.1;遺伝子型7A)について挿入部位を示す。ポリペプチド領域のサイズは上に示す(aa=アミノ酸)。E2のN末端にて、特定の遺伝子型に対してそれぞれ2つ組のE2のN末端アミノ酸が挿入され(例えば、H77についてETの付加;GenBank NP_671941)、ヒトIgG1 Fcタグ(hu IgG1 Fc)及びPreScissionプロテアーゼ(PP)認識配列(LEVLFQGP(配列番号1)がそれに続く。遺伝子型及びE1E2の具体的な分離株に応じて、E2の最初の2つのアミノ酸の2つ組が、シグナルペプチダーゼ(SP)によるプロセッシングに続いてE2のN末端で作り出される望ましくないアミノ酸を生じてもよい(図6A)。アミノ末端でのそのようなアミノ酸にはアスパラギン(N)、グルタミン(Q)またはシステイン(C)が挙げられる。そのようなアミノ酸はN末端則経路を介してプロテアソームが介在する分解についてタンパク質を標的とすることができる(Tasaki T et al.2012.Annu Rev Biochem 81 261−289にて概説された)。この場合、特定の遺伝子型についてのコンセンサス配列のいずれかに従って代替のアミノ酸が選択されてもよく、または特定の遺伝子型のサブクラスが選択される。ポリペプチドの発現に続いて、シグナルペプチダーゼ(SP)の切断は示されている下流のE1及びE2のポリペプチドを生じる。E1及びE2のポリペプチドは相互作用してヘテロダイマーを形成する。精製目的では、Fcタグ付きのE1E2がプロテインAまたはプロテインGの樹脂に固定され、PreScissionプロテアーゼ(PP)によって消化されて(LEVLFQGP(配列番号1)配列におけるQとGの間での切断)タグなしのE1E2ヘテロダイマーを遊離する。
(A)にて略図に表したようなFcタグ付きのE1E2 H77コンストラクトを発現しているCHO細胞の抽出物をプロテインGセファロース4ファストフローに固定し、GST−PreScissionプロテアーゼ(GST−PP)で消化してFcタグを外した。GST−PPによる消化及びタグなしE1E2の遊離に続いて、グルタチオンセファロース4BによってGST−PPを取り除いた。次いでタグなしE1E2タンパク質濃縮物をCHT(商標)セラミックヒドロキシアパタイト((Ca5(PO4)3OH)2)I型(HAP)カラムに適用した。最終的なE1E2ヘテロダイマーを含有するHAP通過分画を回収し、試料をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)ゲルに負荷した。電気泳動の後、ゲルを染色した、またはブロットし次いで抗体によって探査した。(1)抗E1(A4)及び抗E2(H52)モノクローナル抗体(mAb)によるウエスタンブロット(レーン当たり0.5μg負荷した)。(2)コロイド状クマシーブリリアントブルーG250染色したゲル(レーン当たり2μg負荷した)。
材料及び方法
細胞培養及び抗体
遺伝子型1a H77c株(GenBank受入番号AF009606)に由来する組換えE1E2コンストラクトを安定して発現しているチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、10%熱非働化ウシ胎児血清(FBS)(Thermo Fisher Scientific)と0.1mM/0.016mMのヒポキサンチンナトリウム/チミジン(HTサプリメント;Thermo Fisher Scientific)と0.002mMのメソトレキセートと100単位/mLのペニシリンと100μg/mLのストレプトマイシン(PenStrep;Invitrogen,Carlsbad,CA,USA)とを含有するIscove改変Dulbecco培地(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)にて増殖させた。Huh−7.5細胞は、10%熱非働化ウシ胎児血清(Omega Scientific,Tarzana,CA,USA)と0.1mMの非必須アミノ酸(Invitrogen)とペニシリンとストレプトマイシン(PenStrep;Invitrogen)とを含有するDulbecco改変Eagle培地(Thermo Fisher Scientific)にて増殖させた。mAbマウス抗分化抗原群81(CD81)クローンJS−81(BD Biosciences,Franklin Lakes,NJ,USA)、マウスアイソタイプ対照IgG1(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)、抗HCVmAb(HC33.4、HC84.26、AR3B、AR4A及びAR5A)及びヒト抗HIV抗体B6は記載されている。
組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)のシグナルペプチド配列が先行する、H77c(遺伝子型1a)(GenBank AF009606;アミノ酸192−746)に由来するE1E2糖タンパク質のコーディング領域を、IRES−AcGFPレポーターを持つpTRIPレンチウイルスベクターのSpeI/MluI部位に挿入した。Fcタグ付きのE1E2コンストラクトについては、2つ組のアミノ酸384〜385(ET)がE2のN末端に挿入され、ヒトIgG1 Fcタグ(227アミノ酸)とPreScissionプロテアーゼ/ヒトのライノウイルスプロテアーゼ3C(HRV3C)配列(LEVLFQGP(配列番号1)がそれに続いた(図11A)。以前の方法(Schoggins et al.(2011)Nature 472:481)に従ってレンチウイルス粒子をHEK−293T細胞にて形成し、パッケージしたレンチウイルスでCHO細胞に形質導入した。WTのまたはFcタグ付きの組換えE1E2を発現しているGFP陽性のCHO細胞を、BD FACSAria IIIセルソータ(BD Biosciences)を用いて選別し、次いで250mlの振盪器フラスコ(Corning,Corning,NY,USA)にて6%FBSを伴ったPROCHO4培地(Lonza,Walkersville,MD,USA)にて浮遊適合させ、3Lのスピナーフラスコ(Corning,Corning,NY,USA)にて増殖させた。
ワクチン接種実験に使用したメスCB6F1マウス(Charles River Laboratories,Montreal,QC,Canada)(5〜7週齢)はカナダ動物管理指針評議会に従って飼育した。実験方法はAlberta大学保健科学、動物福祉委員会によって検閲され、認可された。組換えE1E2 H77抗原(2μg)を1:1の比で75μgのミョウバン及び7.5μgのモノホスホリルリピドA(MPLA Vaccigrade)(Invivogen,San Diego,CA,USA)と混合した(30μLの最終注射容量)。0、14及び28日目に筋肉内でマウスに注射した。ワクチン接種前の血清を0日目に採取し、ワクチン接種後の血清(最終採血)を42日目に得た。5000gで15分間の試料の遠心分離の後、血清を回収した。56℃で30分間インキュベートすることによって血清を熱非働化し、使用まで−80℃にてアリコートで保存した。
(i)E1E2のELISA:炭酸緩衝液(15mMの炭酸ナトリウム、35mMの重炭酸ナトリウム、pH9.6)(PBST)中のE1E2抗原(100ng/ウェル)でマイクロタイタープレート(Corning)を4℃にて一晩コーティングした。0.2%のTween20を含有するリン酸緩衝化生理食塩水(PBST)でプレートを洗浄し、PBST中の4%ウシ血清アルブミン(Sigma−Aldrich,St.Louis,MO,USA)で1時間ブロックした。E2に特異的なmAb(HC33.4、HC84.26、及びAR3B)(Law et al.(2008)Nat.Med.14:25;Keck et al.(2013)J.Virol.87:37;及びKeck et al.(2012)PLoS Pathogens 8:e1002653)、E1E2に特異的なmAb(AR4A及びAR5A)(15)、または対照(B6)(16)mAb(50μL/ウェル)を1時間加え、抗ヒトアルカリホスファターゼを結合した二次抗体(1:10,000;Jackson Immuno Research,West Grove,PA,USA)とリン酸p−ニトロフェニル(MilliporeSigma)基質によって検出した。Enspireプレートリーダー(Perkin−Elmer,Waltham,MA,USA)を用いて吸光度(405〜495nm)を読み取った。
以前記載された(Hsu et al.(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:7271)ように、ルシフェラーゼレポーターを発現しているHCVppを形成した。中和アッセイについては、ポリリシンをコーティングした96穴プレートにヒト肝癌細胞(Huh7.5)を感染の1日前に入れた。HCVppは1:10に希釈し、熱非働化した希釈血清と37℃で1時間予め混合し、その後Huh7.5細胞に加えた。感染の6時間後に、抗体/ウイルスの植菌を新しい培養培地で置き換えた。Bright−gloルシフェラーゼアッセイ系(Promega,Madison,WI,USA)を用いて感染後48時間に細胞を処理した。Enspireプレートリーダー(Perkin Elmer)を用いて発光を測定した。中和活性は以下の式を用いて算出したが:中和%=(pre−post)/pre×100、式中pre/postはワクチン接種前(pre−)またはワクチン接種後(post−)血清のいずれかでインキュベートした後、与えられたルシフェラーゼ活性を表す。ID50の力価については、1:25〜1:1600の血清の2倍希釈を調べた。力価はウイルスの50%を中和するように算出された希釈の逆数として表される。調べた最高濃度(1:25)で50%中和が達成されなかったら、その時は次に最高の濃度(すなわち、1:12.5)を試料に割り当てた。同様に、調べた最低希釈(1:1600)が>50%中和を生じたら、我々は次の希釈(すなわち、1:3200)をこの試料に割り当てた。
結果は図11〜14に描かれている。
E1E2の発現に使用されたコンストラクトを図11Aにて示す。H77c(GenBank AF009606)に由来する完全長のE1E2の配列をtPAリーダー配列とCMVプロモーターの下流に挿入した。E1E2のアフィニティタグ付き形態を形成するために、ヒトIgG1に由来するFcドメインをE1とE2の間の接合部で挿入した。WT及びFc−E1E2の双方がGNAによって沈殿できるのに対して後者のみがプロテインGセファロースによって沈殿した(図11B)。重要なことに、沈殿したFc−E2がE1と会合したということはFcタグはヘテロダイマー形成を妨害しないことを実証している。
(A)野生型(WT)及びFcタグ付きのコンストラクト及びポリペプチドのプロセッシングの模式図である。E1E2 H77c(GenBank AF009606)ポリペプチドはCMVプロモーター(PCMV)の制御下で発現され、組織プラスミノーゲン活性化因子(tPA)に由来するシグナル配列が先行する。Fcタグ付きのE1E2については、2つ組のE2N末端アミノ酸(384〜385)(ET)が挿入され、その後にヒトIgG1 Fcタグ(hu IgG1 Fc)とPreScissionプロテアーゼ(PP)認識配列(LEVLFQGP(配列番号1)が続く。ポリペプチド領域のサイズは、シグナルペプチダーゼ(SP)による切断部位と同様に上にて示す(aa=アミノ酸)。(B)CHO細胞抽出物に由来する野生型(WT)のまたはFcタグ由来(Fc−d)のE1E2の捕捉をそれぞれGNA及びプロテインGセファロースで行い、タンパク質をSDS−PAGEによって分離し、抗E1(A4)及び抗E2(H52)モノクローナル抗体(mAb)でブロットした。(C)精製したE1E2抗原(Fc−dについてはPPが介在するFcタグ除去工程を伴って)をSDS−PAGEによって分離した。左のパネル:ウエスタンブロット:抗E1(A4)及び抗E2(H52)mAb(レーン当たり1μgの負荷)。右のパネル:クマシーブリリアントブルーG250(レーン当たり2μgの負荷)。(D)野生型(WT)の及びFcタグ由来(Fc−d)のE1E2抗原(1μg/レーン)を1%β−メルカプトエタノールと共に(R)またはそれを伴わずに(NR)Laemelli緩衝液にて95℃で5分間変性させた。試料をSDS−PAGEによって分離し、抗E1(A4)及び抗E2(H52)mAbでブロットした。
E1E2抗原をELISAプレートにコーティングし、E2に特異的な(HC33.4、HC84.26及びAR3B)及びE1E2に特異的な(AR4A及びAR5A)交差中和mAbを用いて調べた。HC33.4、HC84.26及びAR3Bは、CD81受容体結合部位(CD81bs)を形成するE2の完全に異なる領域を標的とし、可溶性E2と結合することができる。HC33.4はE2の線状エピトープ(aa409〜423)を認識する。AR3B及びHC84.26は構造特異的なE2のエピトープに向けられている。しかしながら、HC84.26はさらにE2の線状合成ペプチド(aa433〜447)を認識する。AR4A及びAR5AはCD81dsの外側の独特の構造エピトープを認識し、ネイティブのE1E2と結合することができるが、E2またはE1と単独では結合できない。WT及びFc−d E1E2抗原はほぼ同一の方法でE2特異的な及びE1E2特異的な抗体と結合した。これらのデータは、WTに類似して、Fc−d E1E2が正確な折り畳みを維持し、構造特異的なE2及びE1E2交差中和エピトープを提示することを支持している。
8匹のCB6F1マウスを1:1の比でアジュバント(75μgのミョウバン及び7.5μgのMPLA)と共にWTまたはFc−d E1E2(注射当たり2μg)で免疫した。4匹の動物には対照としてアジュバントを含有する緩衝液を注射した。動物は2週間間隔で合計3回の注射を受けた。最終の採血から得た血清を、組換えE2 HCV1(1a)でコーティングしたELISAプレートによって同種抗E2活性について調べた。WT及びFc−d E1E2でワクチン接種した血清は調べた希釈すべて(1000、5000及び10,000倍)においてE2 HCV1について強い抗E2の力価を示した(図12A)。調べた各希釈について、WT及びFc−d E1E2でワクチン接種したマウスに由来する血清は対照から統計的に上昇した(p<0.05;一元ANOVA;Tukeyの事後検定)(図12A)。WT及びFc−d E1E2でワクチン接種したマウスに由来する血清間の平均吸光度の値は調べた各希釈で統計的な差異を示さなかった。
(A)組換えE2 HCV1(1a)(アミノ酸384〜661:Genbank M62321.1)を3つ組でのELISAプレートにコーティングし、ワクチン接種後のマウス血清で調べた。対照ワクチン接種血清(1000倍希釈)と比較したWT及びFcタグ由来(Fc−d)のE1E2でワクチン接種したマウス血清(1000、5000、10,000倍希釈)におけるE2特異的な抗体の結合は、抗マウス西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合二次抗体とペルオキシダーゼ基質によって検出した。3回の独立した実験に由来するOD450〜507nmでの値(平均値及びSEM)を血清希釈に対してプロットして示す。(B)2倍連続希釈(1:25〜1:1600)のワクチン接種前及び後の血清を用いてHCVpp H77c(1a)エントリーの中和を行い、ID50値を決定した(50%の中和を達成する希釈の逆数値として示される)。2回の独立した実験の代表からSEMを伴った群の平均値を示す。ワクチン接種したマウスの群:対照(C):緩衝液+ミョウバン/MPL;WT(GNAアガロース由来のE1E2 H77c+ミョウバン/MPL;Fc−d(Fcタグ由来のE1E2 H77c+ミョウバン/MPL)。(*)一元ANOVA;Kruskal Wallis、Dunnの事後検定による対照(C)に対するp<0.05を表す。
同種HCVpp H77(1a)及び異種HCVpp SA13(5a)の中和を、ワクチン接種前及び後の血清(1:50)を用いて行い、2回の独立した実験の代表からSEMを伴った群の平均値をプロットした。陽性対照:抗CD81mAb(1μg/ml)。(*)は一元ANOVA、Tukeyの事後検定による対照(C)に対するp<0.05を表す。
HCVpp H77(1a)及びHCVpp SA13(5a)についてWT及びFc−dでワクチン接種したマウスの観察された中和反応は同種(1a)E1E2エピトープに向けた優越性を示した。WT及びFc−dのE1E2でワクチン接種した動物に由来する抗E1E2抗体が十分に特徴付けられたHCV中和mAbに対する保存されたエピトープを標的としたかどうかを判定するために、Wong et al(2014)上記に従って競合ELISAアッセイを行った。対照動物の抗血清は調べたmAbそれぞれとの無視できる競合しか示さなかった:>90%のmAbの結合(任意の血清の非存在下での最大結合に対して正規化した)(図14)。WT及びFc−d E1E2によるワクチン接種は対照血清に比べてAR3B、AR4A、AR5A、及びHC84.26の結合を有意に低下させた(p<0.05;一元ANOVA;Tukeyの事後検定)。HC33.4については、WT E1E2群もFc−d E1E2群も対照に比べてこのmAbの結合を有意に損傷しなかった。
マウス抗血清及び交差中和ヒトHCV抗体のパネルによる競合試験。GNA精製したE1E2 H77cを含有するマイクロタイターウェルを希釈したワクチン接種後の抗血清(1:100)と共に3つ組で1時間インキュベートし、その後、示したmAbと共にインキュベートした。抗ヒトアルカリホスファターゼ結合二次抗体によってmAbの結合を検出した。mAb結合のパーセンテージは抗血清の非存在下で結合したmAbの量と比べて算出した。示されるのは、2回の独立した実験に由来する各群についての平均値±範囲である。ワクチン接種したマウスの群:対照(C):緩衝液+ミョウバン/MPL;WT(GNAアガロース由来のE1E2 H77c+ミョウバン/MPL;Fc−d(Fcタグ由来のE1E2 H77c+ミョウバン/MPL)。E2特異的な抗体:HC33.4、HC84.26、AR3B。E1E2特異的な抗体:AR4A、AR5A。(*)は一元ANOVA;Tukeyの事後検定によるp<0.05を表す。n=2SEMを伴うのは実際、範囲と同じである。
Claims (80)
- a)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチドと、
を含み、前記HCV E1及びHCV E2ポリペプチドの少なくとも1つがアフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記アフィニティタグポリペプチドと前記HCV E1またはHCV E2ポリペプチドとの間に挿入されたタンパク質分解切断可能なリンカーを含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LEVLFQGP(配列番号1)を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる;
b)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ENLYFQS(配列番号2)を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる;
c)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列DDDDK(配列番号3)を含み、切断は、リシン残基のすぐC末端側で起こる;または
d)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列I(E/D)GR(配列番号45)を含み、切断は、アルギニン残基のすぐC末端側で起こる;または
e)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LVPRGS(配列番号5)を含む、請求項2に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記アフィニティタグは、免疫グロブリン(Ig)Fcポリペプチド、プロテインA、プロテインG、ハイブリッドプロテインA-プロテインGポリペプチド、プロテインLポリペプチド、ポリ(ヒスチジン)トラクトを含むポリペプチド、免疫グロブリン軽鎖、またはグルタチオン−S−トランスフェラーゼである、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)HCV E1ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - a)HCV E1ポリペプチド及びIg Fcポリペプチドを含むHCV E1-Fc融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記HCV E1-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記HCV E1ポリペプチド、及びii)前記Ig Fcポリペプチドを含む、請求項6に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E1-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記Ig Fcポリペプチド、及びii)前記HCV E1ポリペプチドを含む、請求項6に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)HCV E2ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)HCV E1ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - a)HCV E2ポリペプチド及びIg Fcポリペプチドを含むHCV E2-Fc融合ポリペプチドと、
b)HCV E1ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記HCV E2-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記HCV E2ポリペプチド、及びii)前記Ig Fcポリペプチドを含む、請求項10に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E2-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記Ig Fcポリペプチド、及びii)前記HCV E2ポリペプチドを含む、請求項10に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)HCV E1ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチド及びアフィニティタグポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - a)HCV E1ポリペプチド及びIg Fcポリペプチドを含むHCV E1-Fc融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチド及びIg Fcポリペプチドを含むHCV E2-Fc融合ポリペプチドと
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - a)前記HCV E1-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記HCV E1ポリペプチド、及びii)前記Ig Fcポリペプチドを含み、
b)前記HCV E2-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記HCV E2ポリペプチド、及びii)前記Ig Fcポリペプチドを含む、請求項14に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - a)前記HCV E1-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記Ig Fcポリペプチド、及びii)前記HCV E1ポリペプチドを含み、
b)前記HCV E2-Fc融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、i)前記Ig Fcポリペプチド、及びii)前記HCV E2ポリペプチドを含む、請求項14に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記HCV E2ポリペプチドは、図1A〜1C、図2A〜2C、図3A〜3C、及び図4A〜4Bの1つに表されるE2ポリペプチドと少なくとも20%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E1ポリペプチドは、図1A〜1C、図2A〜2C、図3A〜3C、及び図4A〜4Bに表されるE1ポリペプチドと少なくとも20%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜16のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記Ig Fcポリペプチドは、図5A〜5Cに表されるアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1〜18のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- アフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドを含み、前記HCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、
i)HCV E2ポリペプチドのN末端の2から15のアミノ酸、
ii)前記アフィニティタグポリペプチド、
iii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及び
iv)HCV E2ポリペプチド
を含む、請求項1に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - HCV E2ポリペプチドのN末端の前記2から15のアミノ酸は、QT、ET、HT、GT、TT、RH、NT、AY、VI、及びSTから選択されるジペプチドである、請求項20に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LEVLFQGP(配列番号1)を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる;
b)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ENLYFQS(配列番号2)を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる;
c)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列DDDDK(配列番号3)を含み、切断は、リシン残基のすぐC末端側で起こる;
d)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列I(E/D)GR(配列番号45)を含み、切断は、アルギニン残基のすぐC末端側で起こる;または
e)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LVPRGS(配列番号5)を含む、請求項20に記載のヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記HCV E2ポリペプチド及び前記HCV E1ポリペプチドは、同じ遺伝子型のものである、請求項1〜22のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E2ポリペプチド及び前記HCV E1ポリペプチドは、異なる遺伝子型のものである、請求項1〜22のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E2ポリペプチドは、遺伝子型1、2、3、4、5、6、または7のものである、請求項1〜22のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E1ポリペプチドは、遺伝子型1、2、3、4、5、6、または7のものである、請求項1〜22のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)請求項1〜26のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチドを含む、組成物。
- a)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドをコードする第1のヌクレオチド配列と、
b)HCV E2ポリペプチドをコードする第2のヌクレオチド配列と
を含む、核酸であって、前記HCV E1及びHCV E2ポリペプチドの少なくとも1つは、アフィニティタグポリペプチドを含む融合ポリペプチドである、核酸。 - 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)HCV E1ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチド、ii) タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)HCV E2ポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - HCV E2ポリペプチドのN末端から2から15のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼE1/E2接合部切断部位が前記HCV E1ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、前記HCV E1ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドの間に挿入される、請求項29に記載の核酸。
- 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)HCV E1ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)アフィニティタグポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)N末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)HCV E1ポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)N末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)アフィニティタグポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)HCV E2ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位が前記アフィニティタグポリペプチドと前記HCV E2ポリペプチドとの間に形成されるよう、前記アフィニティタグポリペプチドと前記HCV E2ポリペプチドとの間に挿入される、請求項33に記載の核酸。
- 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)N末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)HCV E1ポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、i)アフィニティタグポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)HCV E2ポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - HCV E2ポリペプチドのN末端から2から15のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列は、野生型シグナルプロテアーゼE1/E2接合部切断部位が前記HCV E1ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドとの間に形成されるよう、前記HCV E1ポリペプチドと前記アフィニティタグポリペプチドの間に挿入される、請求項35に記載の核酸。
- 前記核酸は、N末端からC末端に順番に、
a)N末端からC末端に順番に、i)HCV E1ポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)アフィニティタグポリペプチドを含むHCV E1-アフィニティタグ融合ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、i)HCV E2ポリペプチド、ii)タンパク質分解切断可能なリンカー、及びiii)アフィニティタグポリペプチドを含むHCV E2-アフィニティタグ融合ポリペプチドと
を含むポリタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項28に記載の核酸。 - シグナルペプチドをコードするヌクレオチド配列は、シグナルプロテアーゼ切断部位が前記アフィニティタグポリペプチドと前記HCV E2ポリペプチドとの間に形成されるよう、前記アフィニティタグポリペプチドと前記HCV E2ポリペプチドとの間に挿入される、請求項37に記載の核酸。
- 前記ポリタンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列は、プロモーターと機能可能に連結される、請求項29〜38のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記アフィニティタグポリペプチドは、Ig Fcポリペプチドである、請求項29〜38のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記Ig Fcポリペプチドは、図5A〜5Cに表されるアミノ酸配列と少なくとも85%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項40に記載の核酸。
- HCV E2ポリペプチドのN末端の前記2から15のアミノ酸は、QT、ET、HT、GT、TT、RH、NT、AY、VI、及びSTから選択されるジペプチドである、請求項30または請求項36に記載の核酸。
- a)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LEVLFQGP(配列番号1)を含み、切断は、グルタミンとグリシンの間で起こる;
b)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列ENLYFQS(配列番号2)を含み、切断は、グルタミンとセリンの間で起こる;
c)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列DDDDK(配列番号3)を含み、切断は、リシン残基のすぐC末端側で起こる;
d)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列I(E/D)GR(配列番号45)を含み、切断は、アルギニン残基のすぐC末端側で起こる;または
e)前記タンパク質分解切断可能なリンカーは、配列LVPRGS(配列番号5)を含む、請求項29〜38のいずれか1項に記載の核酸。 - 前記HCV E2ポリペプチドは、図1A〜1C、図2A〜2C、図3A〜3C、及び図4A〜4Bの1つに表されるE2ポリペプチドと少なくとも20%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29〜38のいずれか1項に記載の核酸。
- 前記HCV E1ポリペプチドは、図1A〜1C、図2A〜2C、図3A〜3C、及び図4A〜4Bに表されるE1ポリペプチドと少なくとも20%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項29〜38のいずれか1項に記載の核酸。
- 請求項28〜45のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項28〜38のいずれか1項に記載の核酸または請求項46に記載の組換え発現ベクターを含む、遺伝子改変インビトロホスト細胞。
- 前記ホスト細胞は、真核細胞である、請求項47に記載の遺伝子改変ホスト細胞。
- 前記ホスト細胞は、哺乳動物細胞である、請求項48に記載の遺伝子改変ホスト細胞。
- 請求項1〜26のいずれか1項に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドを作製する方法であって、
a)前記アフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーが細胞中で産生されるような条件下において請求項47〜49のいずれか1項に記載の遺伝子改変ホスト細胞を培養することと、
b)前記細胞を溶解させて、前記アフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーを含む細胞ライセートを形成することと
を含む、方法。 - HCV E1/E2ヘテロダイマーを生成する方法であって、
a)請求項47〜49のいずれか1項に記載の遺伝子改変ホスト細胞のライセートを不溶性の支持体に固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと接触させることであって、前記ライセート中に存在する前記アフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーは、前記固定されたアフィニティタグ結合ポリペプチドと結合し、固定されたアフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーを形成する、前記接触させることと、
b)前記固定されたHCV E1-E2ヘテロダイマーを、前記固定されたアフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマー中に存在する前記タンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それにより前記HCV E1-E2ヘテロダイマーを前記アフィニティタグから遊離させることと、
c)前記HCV E1-E2ヘテロダイマーを回収することと
を含む、方法。 - 前記遊離したHCV E1-E2ヘテロダイマーは、少なくとも50%純粋である、請求項51に記載の方法。
- 前記アフィニティタグポリペプチドは、Ig Fcポリペプチドであり、前記アフィニティタグ結合ポリペプチドは、Fc結合ポリペプチドである、請求項51に記載の方法。
- 前記Fc結合ポリペプチドは、プロテインA、プロテインG、またはプロテインA/G融合物である、請求項51に記載の方法。
- a)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドと、
b)アフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドと
を含む、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドであって、前記アフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、
i)Ig Fcポリペプチド;
ii)アミノ酸配列LEVLFQGP(配列番号1)を有するタンパク質分解切断可能なリンカー;及び
iii)HCV E2ポリペプチド
を含む、アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記HCV E1ポリペプチドは、AVI1a129 E1ポリペプチド、H77 E1ポリペプチド、S52 E1ポリペプチド、またはAVI3a177 E1ポリペプチドであり、前記AVI1a129 E1ポリペプチド、前記H77 E1ポリペプチド、前記S52 E1ポリペプチド、及び前記AVI3a177 E1ポリペプチドは、図7及び図8に表されるアミノ酸配列を含む、請求項55に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記HCV E2ポリペプチドは、AVI1a129 E2ポリペプチド、H77 E1ポリペプチド、S52 E2ポリペプチド、またはAVI3a177 E2ポリペプチドであり、前記AVI1a129 E2ポリペプチド、前記H77 E2ポリペプチド、前記S52 E2ポリペプチド、及び前記AVI3a177 E2ポリペプチドは、図7及び図8に表されるアミノ酸配列を含む、請求項55に記載のアフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチド。
- アフィニティタグ付きヘテロダイマーポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸であって、前記ヌクレオチド配列は、5’から3’に、機能可能な結合で、
a)アミノ酸配列MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPS(配列番号6)を有する組織プラスミノーゲンシグナル配列をコードするヌクレオチド配列と、
b)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
c)QT及びETから選択されるジペプチドをコードするヌクレオチド配列と、
d)アフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
を含み、前記アフィニティタグ付きHCV E2ポリペプチドは、N末端からC末端に順番に、
i)Ig Fcポリペプチド;
ii)アミノ酸配列LEVLFQGP(配列番号1)を有するタンパク質分解切断可能なリンカー;及び
iii)HCV E2ポリペプチド
を含む、核酸。 - 前記HCV E1ポリペプチドは、AVI1a129 E1ポリペプチド、H77 E1ポリペプチド、S52 E1ポリペプチド、またはAVI3a177 E1ポリペプチドであり、前記AVI1a129 E1ポリペプチド、前記H77 E1ポリペプチド、前記S52 E1ポリペプチド、及び前記AVI3a177 E1ポリペプチドは、図7及び図8に表されるアミノ酸配列を含む、請求項58に記載の核酸。
- 前記HCV E2ポリペプチドは、AVI1a129 E2ポリペプチド、H77 E1ポリペプチド、S52 E2ポリペプチド、またはAVI3a177 E2ポリペプチドであり、前記AVI1a129 E2ポリペプチド、前記H77 E2ポリペプチド、前記S52 E2ポリペプチド、及び前記AVI3a177 E2ポリペプチドは、図7及び図8に表されるアミノ酸配列を含む、請求項58に記載の核酸。
- 図7または図8に表されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項58に記載の核酸。
- 請求項58から61のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクター。
- 請求項58から61のいずれか1項に記載の核酸を含む組換え発現ベクターを伴う遺伝子改変哺乳動物ホスト細胞。
- HCV E1/E2ヘテロダイマーを生成する方法であって、
a)請求項63に記載の遺伝子改変ホスト細胞のライセートを、不溶性の支持体に固定されたプロテインAまたはプロテインGポリペプチドと接触させることであって、前記ライセート中に存在する前記アフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーは、前記固定されたプロテインAまたはプロテインGと結合し、固定されたアフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマーを形成することと、
b)前記固定されたHCV E1-E2ヘテロダイマーを、前記固定されたアフィニティタグ付きHCV E1-E2ヘテロダイマー中に存在する前記タンパク質分解切断可能なリンカーを切断するプロテアーゼと接触させ、それにより前記HCV E1-E2ヘテロダイマーを前記アフィニティタグから遊離させることと、
c)前記遊離したHCV E1-E2ヘテロダイマーを回収することと
を含む、方法。 - 前記遊離したHCV E1-E2ヘテロダイマーは、少なくとも50%純粋である、請求項64に記載の方法。
- a)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、
i)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のC末端側にある1から6の異種アミノ酸;及び
ii)HCV E2ポリペプチド
を含む、修飾E2ポリペプチドと
を含むか、または
a)HCV E2ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、
i)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のC末端側にある1から6の異種アミノ酸;及び
ii)HCV E1ポリペプチド
を含む修飾E1ポリペプチドと
を含む、ヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記1から6の異種アミノ酸は、Gly−Proである、請求項66に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記1から6の異種アミノ酸は、SerまたはGlyである、請求項66に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記1から6の異種アミノ酸は、Gly−Serである、請求項66に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)C型肝炎ウイルス(HCV)E1ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、
i)HCV E2ポリペプチド;及び
ii)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のN末端側にある1から6の異種アミノ酸
を含む、修飾E2ポリペプチドと
を含むか、または
a)HCV E2ポリペプチドと、
b)N末端からC末端に順番に、
i)HCV E1ポリペプチド;及び
ii)タンパク質分解切断可能なリンカーのタンパク質分解切断の部位のN末端側にある1から6の異種アミノ酸
を含む修飾E1ポリペプチドと
を含む、ヘテロダイマーポリペプチド。 - 前記1から6の異種アミノ酸は、DDDDK(配列番号3)である、請求項70に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記1から6の異種アミノ酸は、LEVLFQ(配列番号7)である、請求項70に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記1から6の異種アミノ酸は、ENLYFQ(配列番号8)である、請求項70に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- 前記1から6の異種アミノ酸は、LVPR(配列番号4)またはI(E/D)GR(配列番号45)である、請求項70に記載のヘテロダイマーポリペプチド。
- a)請求項66〜74のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチドと、
b)薬学的に許容される賦形剤と
を含む、組成物。 - 前記薬学的に許容される賦形剤は、アジュバントを含む、請求項75に記載の組成物。
- 前記アジュバントは、MF59、ミョウバン、ポリ(DL−ラクチドco−グリコリド)、CpGオリゴヌクレオチド、キーホールリンペットヘモシアニン、または3’−O−デスアシル−4’−モノホスホリルリピドA(MPL)及びQuillaja saponaria 21(QS21)を含むリポソームの懸濁液を含む、請求項76に記載の組成物。
- 個体におけるC型肝炎ウイルス(HCV)ポリペプチドに対する免疫応答を誘発する方法であって、前記個体に有効量の請求項66〜74のいずれか1項に記載のヘテロダイマーポリペプチドまたは請求項75〜77のいずれか1項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
- 前記投与することは、筋肉内投与による、請求項78に記載の方法。
- 前記投与することは、皮下投与による、請求項78に記載の方法。
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CN109705222A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-05-03 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 黄病毒科病毒囊膜蛋白的融合蛋白及其制备方法与应用 |
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Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2005087813A1 (en) * | 2003-02-13 | 2005-09-22 | Virexx Research, Inc. | Chimeric antigens comprising an fc-fragment for eliciting an immune response |
JP2015503349A (ja) * | 2011-12-29 | 2015-02-02 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | アスパルチルtRNAシンテターゼ−Fcコンジュゲート |
JP2015034165A (ja) * | 2009-02-03 | 2015-02-19 | アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド | 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 |
JP2015518836A (ja) * | 2012-05-18 | 2015-07-06 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
JP2015528461A (ja) * | 2012-08-27 | 2015-09-28 | シンタクシン リミテッドSyntaxin Limited | 融合タンパク質および疼痛を治療、予防または緩和するための方法 |
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US20060068421A1 (en) * | 2004-08-05 | 2006-03-30 | Biosite, Inc. | Compositions and methods for phage display of polypeptides |
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WO2015132619A1 (en) * | 2013-05-15 | 2015-09-11 | The Governors Of The University Of Alberta | E1e2 hcv vaccines and methods of use |
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---|---|---|---|---|
WO2005087813A1 (en) * | 2003-02-13 | 2005-09-22 | Virexx Research, Inc. | Chimeric antigens comprising an fc-fragment for eliciting an immune response |
JP2015034165A (ja) * | 2009-02-03 | 2015-02-19 | アムニクス オペレーティング インコーポレイテッド | 延長組換えポリペプチドおよび延長組換えポリペプチドを含む組成物 |
JP2015503349A (ja) * | 2011-12-29 | 2015-02-02 | エータイアー ファーマ, インコーポレイテッド | アスパルチルtRNAシンテターゼ−Fcコンジュゲート |
JP2015518836A (ja) * | 2012-05-18 | 2015-07-06 | ヤンセン バイオテツク,インコーポレーテツド | フエントキシンiv変異体及びその使用方法 |
JP2015528461A (ja) * | 2012-08-27 | 2015-09-28 | シンタクシン リミテッドSyntaxin Limited | 融合タンパク質および疼痛を治療、予防または緩和するための方法 |
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