CN100519583C - Sars中和性抗体及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高亲和力的非典型肺炎(SARS)中和性单克隆抗体及制备方法。本发明还提供产生了所述SARS中和性抗体的小鼠杂交瘤细胞系：N-176-15CCTCC-C200507和S-9-11 CCTCC-C200515。本发明的SARS中和性抗体具有非常好的SARS病毒中和作用。

Description

SARS中和性抗体及应用

技术领域

本发明涉及一种非典型肺炎病毒(SARS-CoV)中和性抗体，尤其是SARS中和性单克隆抗体及其制备方法。

背景技术

2002年秋季在中国广东省爆发的传染性非典型肺炎(SARS)疫情是一次严重的公共卫生危机。在短短的几个月时间里，SARS迅速蔓延至超过25个国家和地区，给人们的身体健康和正常生活带来了严重的影响，给中国的经济建设及发展造成了巨大损失。2004年春季，由于实验室科研人员的操作失误致使非典型肺炎再次在京皖两地造成人员感染，引起人们的极大关注。到目前为止，SARS在全世界总共造成8000人左右感染，死亡800多人，死亡率达10％左右。

目前已知，非典型肺炎是由一种新发现的冠状病毒(SARS-CoV)所引起。冠状病毒是因其在电子显微镜下形如王冠得名。这一独特的外观是由其膜表面的棒状膜蛋白所形成。SARS病毒即是一类新型的冠状病毒，主要由以下部分组成：脂双层膜及其上的棒状膜蛋白S、包膜蛋白E、膜糖蛋白M、以及膜内部衣壳蛋白N和由N包裹的基因组RNA。其中S蛋白的主要作用是和宿主细胞膜表面受体相结合，从而介导病毒粒子侵入细胞，目前已经鉴定得到了SARS病毒宿主细胞上的功能性受体为血管紧缩素转换酶2(ACE2)。

从感染免疫角度讲，利用对病毒的中和性抗体对急性期感染的病人施加治疗是目前已知的最有效的治疗SARS的方法。其机理为利用中和性抗体阻断病毒对正常宿主细胞的侵入，或阻断其关键蛋白的生物学功能，从而达到治疗感染的目的。在SARS流行时，曾经有通过注射含有大量中和性抗体的康复期病人血清的治疗方法，使病人病情迅速缓解并治愈证明了中和性抗体抗SARS感染的巨大作用。但是，病人血清来源有限，而且存在安全性等问题。所以针对SARS的中和性抗体药物便成为世界各国关注的热点。

目前已知直接和宿主细胞受体接触的区段位于S蛋白S1亚区上约318-510氨基酸之间，被命名为受体结合区(Receptor Binding Domain)含有重要的病毒中和表位。制备针对这一区段的单克隆抗体，有可能阻断病毒粒子和细胞接触，达到抗感染的目的。

虽然可以直接采用RBD肽段免疫，但是产生的抗体可能由于蛋白全长及部分肽段在结构上存在的差别而使得抗体在识别完整天然的SARS病毒S蛋白上产生缺陷，或者可能得到一些虽然可以识别受体结合区RBD但是却和SARS S蛋白全长完整蛋白无结合作用的单克隆抗体，因此不仅获得有效抗体的效率低，而且难以获得活性很高的中和性抗体。

综上所述，本领域尚没有获得活性很高的、特异性结合于SARS病毒S蛋白的抗体。因此本领域迫切需要开发具有良好中和病毒效果的高亲和力的SARS中和性抗体，尤其是单克隆抗体。

发明内容

本发明的目的是提供一种针对非典型肺炎(SARS)的高亲和力的中和性抗体，及其制备方法。

在本发明的第一方面，提供了一种免疫球蛋白，它具有以下特性：

(a)特异性地结合于SARS病毒的受体结合区，所述的受体结合区是SARS病毒S蛋白的318-510位；

(b)特异性地中和SARS病毒；

(c)所述抗体与受体结合区结合的裸鼠腹水效价为1：50000-1：1000000(较佳地为1：100000-1：800000，更佳地为1：200000-1：600000)。

(d)所述抗体与SARS病毒中和的裸鼠腹水效价为1：4000-1：10000(较佳地1:5000-1:8000)。

在另一优选例中，所述的免疫球蛋白所针对的受体结合区具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的免疫球蛋白是单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的免疫球蛋白由选自下组的细胞所产生：小鼠杂交瘤细胞系N-176-15，CCTCC No.：C200507；或小鼠杂交瘤细胞系S-9-11CCTCC No.：C200515。

在本发明的第二方面，提供了一种免疫偶联物，该免疫偶联物含有本发明上述的免疫球蛋白和特异性地结合于所述免疫球蛋白的选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

在本发明的第三方面，提供了一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，它选自下组：小鼠杂交瘤细胞系N-176-15，CCTCC No.：C200507；或小鼠杂交瘤细胞系S-9-11CCTCC No.：C200515。

在本发明的第四方面，提供了一种组合物，它含有本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及可接受的载体。通常，免疫球蛋白或上述的免疫偶联物的含量为组合物总重量的0.001-99.99wt％，较佳地为0.01-90wt％，更佳地为0.1-80wt％。

在另一优选例中，所述的组合物是药物组合物。

在本发明的第五方面，提供了本发明所述的免疫球蛋白的用途，它们被用于制备中和SARS病毒的组合物。

在本发明的第五方面，提供了制备本发明单克隆抗体的方法，它包括步骤：(1)用非典型肺炎病毒(SARS-CoV)的重组假病毒疫苗免疫小鼠；(2)将免疫小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合后，(3)筛选分泌与S蛋白318-510氨基酸区段的非典型肺炎(SARS)病毒受体结合区结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，建株并得到单克隆抗体(4)运用细胞融合及病毒中和系统，从这些单抗中筛选得到具有高亲和力的病毒中和作用的单抗。

在另一优选例中，所述的制备单克隆抗体的方法包括步骤：

(a)用非典型肺炎病毒的重组假病毒疫苗免疫小鼠；

(b)将免疫小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合后，获得杂交瘤细胞：

(c)从步骤(b)的杂交瘤细胞中，选出分泌与S蛋白318-510氨基酸区段的非典型肺炎病毒受体结合区结合的单克隆抗体的杂交瘤细胞，获得与受体结合区结合杂交瘤细胞；

(d)从步骤(c)的杂交瘤细胞中，选出产生的单克隆抗体与SARS病毒结合的裸鼠腹水效价为1：50000-1：1000000的杂交瘤细胞；

(e)从步骤(d)的杂交瘤细胞中制得单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的杂交瘤细胞系是小鼠杂交瘤细胞系N-176-15，其亚型为IgG1、k型。

在另一优选例中，所述的杂交瘤细胞系是是小鼠杂交瘤细胞系S-9-11，其亚型为IgG2a、k型。

附图说明

图1是细胞融合阻断实验的示意图。

图2是报告基因系统的示意图。

图3显示了S-9-11细胞株产生的抗体可以阻断SARS病毒与细胞的融合。

图4显示了N-176-15细胞株产生的抗体可以阻断SARS病毒与细胞的融合。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，发现SARS病毒S蛋白的重组假病毒疫苗可以诱导得到高滴度的中和性抗体，因此特别适合作为免疫原来制备SARS中和性单克隆抗体，同时发现S蛋白的受体结合区(RBD)段具有重要的中和性位点。在上述研究基础上，本发明人利用杂交瘤技术制备了亲和力极高的抗人SARS的单克隆抗体，从而完成了本发明。

如本文所用，术语“SARS受体结合区(RBD)”或“RBD”可互换使用，都指含有SARS病毒S蛋白第318-510位氨基酸序列的多肽。一种优选的SARS受体结合区(RBD)由SARS病毒S蛋白第318-510位氨基酸序列构成。更佳地，所述的RBD具有SEQ ID NO：1或gi：30173397所示的氨基酸。

本发明的SARS中和性单抗或其片段可用于免疫检测SARS病毒，还可用于中和SARS病毒或用于治疗SARS感染，例如通过直接或间接地将SARS中和性单抗或其片段与化学治疗剂、或放疗剂相连从而使其能阻断SARS病毒与细胞的融合。

本发明包括：具有SARS中和性单抗的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有SARS中和性单抗可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其他蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与SARS中和性单抗或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与SARS中和性单抗或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，“免疫毒素”指对靶细胞有特异性亲和力和杀伤力的物质，例如免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子、放射性核素或其他治疗分子与SARS中和性单抗或其片段结合的而形成的偶联物。具体的例子有例如¹³¹I-SARS中和性抗体偶联物等。

对于本发明SARS中和性单抗重链和轻链序列，可以用常规方法测定。SARS中和性单抗V链的超变区或互补决定区(complementarity determining region，CDR)特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的免疫球蛋白轻链和重链可变链的分子，只要其CDR与SARS中和性单抗CDR具有90％以上(较佳地95％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明还提供了编码RBD的DNA。本发明的SARS中和性单抗的抗原的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据RBD的核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，按本领域技术人员已知的常规方法制备模板，通过扩增而得到有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

本发明还提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以如上用常规技术，利用小鼠杂交瘤细胞系SARS中和性(CCTCC No.：C200507或200515)获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞、或Bowes黑素瘤细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔，脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

此外，本发明还提供了一种检测SARS病毒的试剂盒，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的免疫球蛋白或免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于中和SARS病毒(尤其是用于阻断SARS病毒与细胞的融合)，还可用于SARS病毒的治疗。此外，还可同时使用其他治疗剂，如抗体与干扰素、白细胞介素等。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的免疫球蛋白或上述的免疫偶联物以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的SARS中和性免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

在本发明的一个实例中，用人工制备的非典型肺炎(SARS)S蛋白重组假病毒疫苗免疫小鼠，然后将免疫小鼠的脾细胞和鼠骨髓瘤细胞融合后，筛选得到了与S蛋白318-510氨基酸区段的非典型肺炎(SARS)病毒受体结合区结合的杂交瘤细胞。从所述的和RBD结合的若干株杂交瘤细胞中鉴定得到具有中和作用的单抗。

两株优选的杂交瘤细胞系是分别命名为：S-9-11和N-176-15；其中S—9-11为脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合而成，N-176-15为脾细胞和NS-1骨髓瘤细胞株融合而成。经亚型鉴定，S-9-11为IgG2a、k型，N-176-15为IgG1、k型。细胞融合及病毒中和检测证明，上述两株小鼠杂交瘤细胞株具有很好的病毒中和作用。

本发明的主要优点在于：

(a)重组假病毒疫苗可以诱导高滴度的针对RBD的中和性抗体，非常适合作为制备SARS中和性抗体的免疫原。

(b)本发明的中和性抗体对SARS病毒有极其优异的中和活性，裸鼠腹水效价为1：50000-1：1000000或更高。

(c)与采用的SARS病毒受体结合区肽段RBD免疫并用其筛选单抗的方法相比，本发明的方法具有的效率高，即筛选到的单抗只要和RBD结合就必然可以识别完整天然状态下的SARS S蛋白，而且中和活力高。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：动物免疫

抗原为SARS假病毒疫苗，为减毒的安卡拉病毒通过重组SARS S全长蛋白基因于其基因组中得到。该病毒膜表面表达了SARS病毒S蛋白，浓度：2×10⁹pfu/ml，Balb/c小鼠免疫剂量：5×10⁷pfu每只每次。肌肉多点注射。使用时用PBS或生理盐水稀释。免疫程序：0，3，6周三次免疫。融合前三天取5×10⁷pfu疫苗原液PBS稀释至0.5ml腹腔注射，做回忆刺激。

SARS重组假病毒疫苗简介：载体病毒为改造后的活减毒安卡拉疫苗病毒(MVA)，制备方法如下：用常规方法，将SARS病毒S蛋白全长基因插入该病毒的基因组的III号删除区(Deletion III Region)而成为改造后的SARS疫苗，改造后的SARS重组假病毒疫苗被命名为ADS-MVA。该疫苗抗原能在小鼠、兔、猴等动物体内诱导高滴度的中和性抗体。并且经研究表明中和抗体针对的表位有很大一部分位于RBD区域。

实施例2：杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备

回忆刺激后三天做融合。取免疫后小鼠的脾脏细胞和鼠骨髓瘤细胞NS-1和SP2/0采用聚乙二醇(PEG)常规的融合法做融合。融合后加HAT选择性培养基，将非杂交瘤细胞全部杀死。具体步骤后述。

然后，进行杂交瘤的筛选工作。筛选采用ELISA法(具体步骤后述)，所用筛选用抗原为真核表达的位于S蛋白318-510氨基酸区段的SARS病毒受体结合区(Receptor Binding Domain)(接人IgG恒定区Fc段作为蛋白标签)。将长出的杂交瘤细胞样品孔中的细胞上清取出，作为样品做ELISA实验，看是否含有和RBD结合的抗体。如果有，则进一步做杂交瘤细胞的克隆化。

克隆化过程采用有限稀释法，具体实验步骤后述。

经过三次连续的ELISA检测及克隆化后，得到若干株和RBD抗原结合的单克隆抗体。进一步做分析试验。从亲和力和功能实验方面考察，最后筛选得到两株抗体被发现为亲和力极高、中和实验效果非常好，分别命名为：S-9-11和N-176-15。其中S—9-11为脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合而成，N-176-15为脾细胞和NS-1骨髓瘤细胞株融合而成。经亚型鉴定，S-9-11为IgG2a、k型，N-176-15为IgG1、k型。两株抗体分别按常规方法制备了腹水。腹水效价经检测，约1：256000-1：512000。

实验方法

(a)细胞融合：

1.无菌操作，做好实验前准备；

2.小鼠眼球取血。泡入酒精缸中。固定于解剖板上。用一套剪刀镊子剪开小鼠外皮向上撕开露出胸、腹腔，用另一套剪刀镊子剪开腹膜，并取出脾脏。置于预先盛有培液的6孔板内；

3.用RDF培液带尼龙网烧杯上的尼龙网，将脾脏置于其上用镊子剪刀剪碎、挤压，使细胞过滤入尼龙网下的烧杯中；

4.将烧杯中脾细胞置于50ml离心管内，离心1500rpm，3min；

5.再用无血清培液洗一下，计数，分5×10⁷细胞若干份，备用；

6.收集NS-1及SP2/0细胞，离心1500rpm，3min；

7.RDF培养液洗一下，计数，取骨髓瘤细胞，每种10⁷；

8.将脾细胞一份和取好的一种骨髓瘤细胞混合，离心，2000rpm，5min，倒光培液，用无菌滤纸吸干离心管内残余液体，弹松细胞块；

9.加PEG0.8-1ml，需1min之内加完，边加边摇晃；

10.静止1.5min；

11.加10ml准备好的RDF培液，2.5min内加完，边加边摇晃；

12.静止5min；

13.离心，1000rpm，3min；

14.用滴管将上清液吸出；

15.加25ml，12％BS的培养液，轻轻吸打混匀；

16.用排枪加入做好饲养层的96孔板内，50ul/孔。

(b)ELISA：

1.抗原包被：取抗原用碳酸盐缓冲液(pH9.6)配制成0.05mol/L浓度的包被液，混匀，加入塑料96孔检测板，50ul/孔，置于4℃冰箱内过夜；

2.Block：洗板，加Block液(稀释液即PBS配制的10％新生牛血清+0.1％Tween20或3％明胶)，100ul/孔，37℃温箱温育2小时；

3.加一抗：洗板，将处理好的一抗(即杂交瘤细胞上清)溶液加到孔内，50ul/孔，37℃温箱温育2小时；

4.加二抗：洗板，稀释好的二抗(羊抗小鼠IgG(H+L)HRP酶标记的抗体，Calbiochem-Novabiochem)加入孔内，50ul/孔，37℃温育1小时；

5.显色：洗板，配好TMB底物，加入孔中，50ul/孔，显色5-10min，加2M硫酸，50ul/孔，终止反应；

6.检测：用酶标仪(Thermo)检测孔溶液的OD(450nm)值，得到数据。

(c)有限稀释法实验步骤：

1.用吸管小心吸取吹打阳性孔至细胞完全混入培养液；

2.加1滴至一玻璃离心管内，补加9滴HT培养液，混匀，其余加到96孔板(做好饲养层)前排几孔内；

3.第一次稀释：将混匀的培养液吸出，加一滴至第二个带刻度的10ml玻璃离心管内，补加9滴培液，混匀；

4.第二次稀释：其余加前排几孔，吸出培液，再加2滴于这个离心管内，补加HT培液至10ml，混匀后加入96孔板内，50ul/孔，96孔板置于培养箱内。

实施例3：细胞融合阻断实验

本实施例用细胞融合阻断实验用来模拟病毒和细胞的膜融合过程，从而检测抗体的中和性作用。这一系统通过对细胞分别转染并表达SARS病毒的膜蛋白Spike及其相应宿主细胞膜受体ACE2来实现受体配体介导的细胞融合过程，并通过共转染在细胞融合后才发生表达的报告基因系统定量表示其融合效果，即表示发生融合的细胞的多少。在这一系统中加入抗体或多肽，如果其对细胞融合有阻断作用，则这一阻断作用的大小可由报告基因表达量的下降程度来表示(如图1)。pSpike、pACE2分别为含S蛋白及ACE2蛋白基因全长的表达质粒，p13-luc及p15-1为组成报告基因系统的两种质粒，rellina为一种表达海胆荧光素酶的内参质粒。

细胞融合阻断实验的示意图如图1所示。被转染细胞为HEK293T细胞系。分为等量两组，一组共转染S蛋白(Spike)、p13-luc、和rellina内参质粒；另一组共转染ACE2和p15-1质粒(质粒均由上海生化细胞研究所朱学良老师惠增)。其中Spike和ACE2介导细胞膜融合，p15-1和p13-luc为报告基因系统，表达报告基因luciferase荧光素酶。Rellina质粒为内参。

报告基因系统采用的为BD Bioscience公司的四环素调节报告基因系统(Tet-Off系统)。表达机理为：p15-1为调节质粒，在pCMV启动子作用下本底表达一种起调节作用的蛋白tTA，该蛋白由两种蛋白亚基TetR和VP16融合表达而成。它结合到目标质粒p13-1uc的四环素(Tet)操纵子上诱导下游启动子启动表达luciferase蛋白(如图2)。检测采用Promega公司的双通道Luciferase检测系统。

实验流程为：

(1)按实验设计转染两组293T细胞，37℃培养；

(2)24小时后收细胞，分别计数，调节密度。Spike组加入腹水10ul、20ul、40ul/0.5ml体系，冰上孵育30分钟。两组细胞等量混合，37℃培养；

(3)24小时后，按Promega公司双通道Luciferase检测系统说明所示处理检测Luciferase。

2、实验结果

S-9-11细胞株腹水细胞融合阻断实验：

对照腹水：抗鼠CD4抗原细胞株的腹水，经检测其浓度和S-9-11细胞株腹水浓度相同。

+组：无抗体阻断组

-组：不转ACE2受体组

血清：抗原免疫小鼠多克隆抗血清

S-9-11细胞株腹水细胞融合阻断实验的结果如图3所示。可以看出待检测腹水对细胞融合有明显的阻断作用，且其作用为剂量依赖型，可以判断S-9-11细胞株腹水对这一膜融合过程有阻断效果。

N-176-15细胞株腹水细胞融合阻断实验：

对照腹水：抗鼠CD4抗原细胞株的腹水，经检测其浓度和N-176-15细胞株腹水浓度相同。

+组：无抗体阻断组

-组：不转ACE2受体组

血清：抗原免疫小鼠多克隆抗血清。

N-176-15细胞株腹水细胞融合阻断实验结果如图4所示。可以看出N-176-15细胞株腹水对细胞膜融合过程也有较好的阻断作用。且S-9-11和N-176-15两细胞株的抗体有协同作用。

实施例4：病毒中和实验

病毒中和实验：

1、SARS病毒毒株GZ50由广州2003年SARS疫情中被感染的病人样本中分离得到。GenBank上的序号为AY304495。将抗体腹水做系列的两倍稀释(1:80至1:10，240)。分别与100 TCID₅₀(病毒半数感染剂量)的SARS病毒(GZ50)混合，在37℃温育1小时。然后将其分别加到FRhK-4细胞培液中。培液做系列稀释并和病毒混合作为阳性对照。每个稀释度做10个复孔。每天观察样品孔状态，细胞病理效应(CPE)结点在加入病毒3天后读取。各样品孔的TCID₅₀由里得-明奇(Reed-Muench)法计算得到。中和性抗体的滴度由能够抑制病毒引起CPE的单抗腹水的最大稀释度决定(10个复孔中至少有5孔)。

结果如下：

 

稀释度	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
													80		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
160		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													320		-	-	-	-	-	-	-	-	--	-
640		--	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													1280		-	-	--	-	-	-	-	-	-	-
2560		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
													5120		-	-	-	-	-	-	-	-	-	-
10240		+	+	-	+	+	+	-	-	+	+

由表中可见，抗体腹水样品在1：5120稀释时各样品孔没有CPE效应，而在1：10240稀释时由7孔出现CPE效应，说明样品腹水抗病毒的最大稀释度为1：5120左右。

经检测，S-9-11克隆的腹水有明显的病毒中和效果。其稀释效价可达1：5000。另外，N-176-15稀释效价可大于1：5000。说明这些抗体可以很有效地阻断病毒对细胞的入侵，起到保护作用。

实施例5：分离纯化抗体

纯化分离抗体的方法：饱和硫酸铵沉淀法结合Protein G亲和层析法可以从腹水或细胞上清中得到纯化的抗体(IgG)，方法如下：

具体步骤：

1.饱和硫酸铵沉淀：1体积腹水或细胞上清样品加1体积PBS或生理盐水缓冲液，在振荡的情况下逐滴加入2体积的饱和硫酸铵溶液，离心得沉淀，透析，去除离子；

2.Protein G亲和层析法：

用5倍柱体积的PBS洗柱；

(2)加透析好样品；

(3)用5倍柱体积PBS洗柱；

(4)用1-3倍柱体积甘氨酸洗脱抗体；

(5)用Tris复性抗体溶液；

(6)20％乙醇再生Protein G柱；

(7)检测抗体浓度，保存。

Protein G层析柱：Hi-Trap Protein G Column(Pharmacia Biotech#17-0404-01)

所需试剂为：

PBS缓冲液-1.084g NaH₂PO₄，3.273g Na₂HPO_4·7H₂O，ddH₂O定容至1升0.1M甘氨酸，pH 2.8-3.75g Glycine 1.4ml HCl，ddH₂O定容至1升1M Tris-141.1g Tris base ddH₂O。定容至1升

20％乙醇

结果：

获得了纯度大于95％的单克隆抗体S-9-11和N-176-15。

实施例6：含SARS中和抗体的组合物：SARS治疗注射剂

实验前的准备：

1.空安瓿的处理：安瓿在锯口前，应先经外观检查、清洁度实验、耐热性能实验、中性实验、耐热耐碱等实验。合格者可切割、圆口，然后洗涤，在100以上烘干备用；

2.实验用具的处理：调配器具使用前，先用肥皂、洗衣粉等刷洗，玻璃器具可用洗液处理，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水冲洗，沥干，临用前新鲜注射用水荡洗。新橡皮、橡皮塞先用0.5-1％氢氧化钠煮沸30分钟，然后再用1％盐酸煮沸30分钟，水洗，加蒸馏水煮沸30分钟，再用蒸馏水洗，最后用注射用水冲洗即可使用。

处方：无菌纯化的SARS中和抗体免疫球蛋白(生理盐水溶液)50g，加无菌生理盐水定容至100ml，用HCl调节pH值为7。用3号重熔玻璃漏斗过滤至澄明，灌注于2ml安剖，熔封，即得。

成品做澄明度、热源、药品含量、含菌等检查，所得产品应符合《中国药典》及有关国家标准对注射剂药品的要求。

菌种保藏

本发明的小鼠杂交瘤细胞系N-176-15和小鼠杂交瘤细胞系S-9-11，于2005年6月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)，保藏号为中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国，武汉市)CCTCC No.：C200507和C200515。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>SARS中和性抗体及应用

<130>055503

<160>1

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>193

<212>PRT

<213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus)

<400>1

Claims (8)

1.一种免疫球蛋白，其特征在于，它由小鼠杂交瘤细胞系N-176-15，CCTCCNo.：C200507所产生，并且具有以下特性：

(a)特异性地结合于SARS病毒的受体结合区，所述的受体结合区是SARS病毒S蛋白的318-510位；

(b)特异性地中和SARS病毒；

(c)所述抗体与受体结合区结合的裸鼠腹水效价为1：50000-1：1000000；

(d)所述抗体与SARS病毒中和的裸鼠腹水效价为1：4000-1：10000。

2.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，所述的受体结合区是SEQ IDN0：1所示的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的免疫球蛋白，其特征在于，它是单克隆抗体。

4.一种免疫偶联物，其特征在于，该免疫偶联物含有权利要求1所述的免疫球蛋白和特异性地结合于所述免疫球蛋白的选自下组的偶联部分：药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶。

5.一种产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，其特征在于，它选自小鼠杂交瘤细胞系N-176-15，CCTCC No.：C200507。

6.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的免疫球蛋白或权利要求4所述的免疫偶联物以及可接受的载体。

7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是药物组合物。

8.如权利要求1所述的免疫球蛋白的用途，其特征在于，用于制备中和SARS病毒的组合物。

Images