CN101891806B

CN101891806B - 抗黄病毒包膜e蛋白的单克隆抗体及其应用

Info

Publication number: CN101891806B
Application number: CN2010101295721A
Authority: CN
Inventors: 秦成峰; 祝庆余; 邓永强; 郭亚军; 戴建新; 秦鄂德; 姬广辉; 姜涛
Original assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Current assignee: Institute of Microbiology and Epidemiology of AMMS
Priority date: 2010-03-19
Filing date: 2010-03-19
Publication date: 2013-07-10
Anticipated expiration: 2030-03-19
Also published as: CN101891806A

Abstract

本发明公开了一种抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体及其应用。本发明的抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体是由保藏号为CGMCC №.3292的鼠源杂交瘤细胞株D2-2A10G6分泌的。本发明抗黄病毒的单克隆抗体与黄病毒属包膜E蛋白的功能表位可特异性结合。该包膜E蛋白的功能表位的氨基酸序列为SEQ ID NO：17。本发明单克隆抗体经间接免疫荧光法筛选，并用间接酶联免疫法等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力。采用本发明的单克隆抗体或免疫偶联物可阻断黄病毒感染细胞和保护乳鼠抵抗病毒攻击，达到抑制病毒感染的效果。采用本发明的单克隆抗体或免疫偶联物还可用于检测黄病毒包膜E蛋白。

Description

抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一种黄病毒包膜E蛋白的功能表位、与这个表位特异性结合的单克隆抗体及其在制备抗黄病毒药物中的用途。

背景技术

黄病毒科(Flaviviridae)黄病毒属(flaviviruses)包括70多种病毒，其中的40种与人类疾病相关，如登革病毒(Dengue virus，DENV)、日本脑炎病毒(JapaneseEncephalitis Virus，JEV)、森林脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis Virus，TBEV)、黄热病毒(Yellow Fever Virus，YFV)和西尼罗病毒(West Nile Virus，WNV)等。这类病毒往往导致人兽共患性疾病，加之其中多数病毒主要通过节肢动物媒介进行传播，常导致疾病的暴发流行，是全球主要的公共卫生问题之一。目前，超过60亿人处于黄病毒感染的危险中，包括亚洲和澳大利亚北部地区的日本脑炎病毒；非洲和南美洲的黄热病毒；非洲、中东、欧洲、亚洲和大洋洲及最近在西半球流行的西尼罗病毒；森林脑炎病毒，包括在欧洲和亚洲某些地区的欧洲和远东亚型；热带和亚热带地区的登革病毒。我国由于地域辽阔，生态环境复杂，加之全球气候变暖，病毒媒介的广泛存在，我国面临包括登革热、乙型脑炎和森林脑炎等病毒在内的严峻的虫媒病毒性传染病威胁，发病率呈不断上升趋势。近2年，在广东，山西和海南等省爆发的日本脑炎流行以及在广东和福建地区的登革热患者就达近千人。

黄病毒引起的疾病临床表现比较复杂，一是表现为头痛、呕吐、嗜睡、抽搐和昏迷等一系列脑炎症状；二是表现为发烧、全身肌痛、关节痛和皮疹等全身系统性疾病的症状，严重者可侵犯内脏如肝和肾，还可发生出血和休克。对于黄病毒病的有效预防和控制的关键是发展安全、有效的黄病毒疫苗，但除黄热病毒，乙型脑炎病毒和森林脑炎病毒外，尚无疫苗预防其它的黄病毒疾病，而且这些疫苗均以传统的灭活疫苗和减毒疫苗为主，在特异性和安全性方面存在不足。抗病毒药物在治疗虫媒黄病毒性疾病方面具有重要意义，但目前也尚无特效药物，临床治疗上均采用支持疗法。尽管目前已有一些核苷类抗病毒药物，如阿昔洛韦、利巴韦林等，但效果并不十分理想，对机体细胞具有一定毒性，并具有诱发基因突变的潜在危害，应用范围有限。相比而言，单克隆抗体治疗具有较强的病原体特异性，不影响正常的组织和细胞，相对比较安全，目前随着人源抗体研究技术的发展，已完全可克服鼠源抗体的免疫原性问题，已有越来越多的学者进行抗病毒单克隆抗体的研究，以期用于病毒感染的被动性免疫治疗与预防，使得其在疾病的诊断和治疗中显示出其它类型药物无可比拟的优势。

研究发现，由于黄病毒包膜E蛋白位于病毒颗粒表面，在病毒吸附、与宿主细胞膜融合以及病毒组装过程中具有重要的作用，而且可通过诱发中和抗体产生保护性免疫应答，因此，近年来黄病毒E蛋白已被作为抗病毒治疗性抗体药物研究的主要靶点。Gould等构建了1个可结合西尼罗病毒E蛋白I和II区的重组人单链变异区抗体片段(scFv)，利用其中的5个Fc融合蛋白可保护免疫小鼠100％抵抗病毒攻击，而其中2个甚至在病毒感染后的第1天和第4天可使80％的小鼠存活，该项研究为探讨针对E基因特异性序列的多肽药物提供了依据。近年来，单克隆抗体应用于黄病毒病治疗是一个重要的突破，如利用一个西尼罗病毒E蛋白III区特异的单克隆抗体(E16)可有效地阻断多种西尼罗病毒对不同小鼠和人类细胞系的感染，而对其他的黄病毒并不产生中和作用。该单抗甚至可在病毒已进入受试小鼠中枢神经系统的情况下，仍可使该小鼠成功存活，存活率在第5天和第9天分别达90％和68％。而他们已成功构建出人源化的单克隆抗体，可安全有效地应用于临床治疗。目前正在进行I期临床试验。国内开展抗体治疗黄病毒属病毒感染的研究起步较早，陈伯权等人早在1984年就报道在小鼠感染JEV后24、48及120h分别腹腔注射中和单抗1次，其保护率分别达到60～80％和20～29％，经治疗存活的小鼠脑内检测不到病毒。张明杰等人在小鼠、幼山羊及恒河猴实验的基础上，用单抗对临床症状典型，血液及脑脊液中JEV-IgM抗体阳性的两例重症乙脑患者进行了抢救性治疗，达到了满意的治疗效果且无后遗症。田长印等人进一步治疗了26例乙脑患者，更加证明抗日本脑炎病毒的单抗是一种简便、安全、有效的治疗方法。然而，上述单抗主要是针对某一特定病毒的，而针对黄病毒属特异的抗体还不多见，此外由于黄病毒属成员，特别是登革1-4型病毒之间抗原彼此交叉，这些属特异抗体对黄病毒成员的中和活性和保护效率存在差异，有的没有交叉保护活性，甚至可能产生负面效应，导致抗体依赖性感染增强作用并引起黄病毒病情加重。因而这些黄病毒属特异抗体多数不适合或需要进一步改造才有可能应用于临床治疗研究。

发明内容

本发明的目的正是在于提供抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体，从而达到广谱治疗多种黄病毒疾病的效果。

在本发明的第一方面中，提供了一种包膜E蛋白的功能表位，所述功能表位为RDXW(SEQ ID NO：17)。

在一个优选例中，所述功能表位为RDGW(SEQ ID NO：17)。在另一个优选例中，所述功能表位位于登革2型病毒包膜E蛋白第98-101氨基酸处。

在本发明的第二方面中，提供了一种与黄病毒包膜E蛋白功能表位特异性结合的具有黄病毒属交叉中和活性的单克隆抗体。

在一个优选实施方式中，体外细胞中和实验显示该抗体可较强地中和登革1-4型病毒，对黄病毒属其他成员，如黄热病毒和西尼罗病毒也有一定的中和活性。

在另一个优选实施方式中，体内保护实验也证实该抗体也可保护乳鼠免受致死剂量登革1-4型病毒的攻击。

在另一个优选实施方式中，所述单克隆抗体的重链可变区的CDR(互补决定区)氨基酸序列分别选自：EYTMH(SEQ ID NO：18)、GIDPNNGGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：19)和RDYYALDY(SEQ ID NO：20)(例如可参见图2A的D2-2A10G6 H chain)；轻链可变区的CDR氨基酸序列分别选自：KASQHVGSAVA(SEQ ID NO：21)、SASNRYT(SEQ ID NO：22)和QQYNSYPT(SEQ ID NO：23)(例如可参见图2B的D2-2A10G6 L chain)。

在另一个优选实施方式中，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列选自：SEQ IDNO：2，轻链可变区氨基酸序列选自：SEQ ID NO：4。

在另一优选实施方式中，所述单克隆抗体的恒定区选自：小鼠抗体恒定区。

在另一优选例中，所述恒定区为小鼠IgG。在一个优选例中，所述单克隆抗体是采用杂交瘤方法制得的。

在本发明的第三方面中，提供了一种DNA分子，其编码本发明的单克隆抗体。

在另一优选例中，所述DNA分子中编码重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：1；并且编码轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：3。

在本发明的第四方面中，提供了一种载体，其包含本发明上述的DNA分子。

在本发明的第五方面中，提供了一种宿主细胞，其包含本发明的载体，或基因组中整合有本发明的DNA分子。

在一个优选例中，所述宿主细胞为原核细胞，优选细菌细胞；低等真核细胞，优选酵母细胞；或高等真核细胞，优选哺乳动物细胞。

在本发明的第七方面中，提供了本发明抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体在制备抗病毒药物中的用途。

在另一优选例中，所述病毒选自：登革1-4型病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、乙型脑炎病毒和森林脑炎病毒。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。本发明的目的是提供一种抗黄病毒包膜E蛋白融合肽的单克隆抗体及其应用。

本发明还提供一株杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株为杂交瘤细胞系D2-2A10G6。该细胞系分泌的单克隆抗体具有上述抗体的特点和功效。杂交瘤细胞株D2-2A10G6已于2009年09月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC№.3292。

上述保藏号为CGMCC №.3292的杂交瘤细胞株D2-2A10G6在制备中和黄病毒属病毒的制剂或者在制备预防和/或治疗黄病毒属病毒病的药物中的应用也属于本发明的保护范围。

所述黄病毒属病毒病为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒和/或日本脑炎病毒和/或西尼罗病毒和/或黄热病毒和/或森林脑炎病毒。

上述黄病毒属特异中和单克隆抗体可制成药物，即预防和/或治疗黄病毒属病毒病的药物，其活性成分为上述抗黄病毒包膜E蛋白融合肽的单克隆抗体。所述黄病毒属病毒病可为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒和/或日本脑炎病毒和/或西尼罗病毒和/或黄热病毒和/或森林脑炎病毒。

本发明的单克隆抗体可特异性中和黄病毒属病毒。在体外细胞中和试验中，该抗体对登革1-4型病毒感染的中和活性较强(其中和指数分别达到2，1.5，2.1和1.8μg/ml)，对其他黄病毒属成员，如黄热病毒和西尼罗病毒也有一定的中和活性(中和指数分别为3.4和46μg/ml)；在体内保护实验中，该抗体也可保护乳鼠免受致死剂量登革1-4型病毒的攻击(中和效价分别达87.4，4.8，45.6和36.6μg/ml)。这表明，本发明制备的单克隆抗体具有黄病毒属交叉活性，可与登革1-4型病毒和黄病毒属其他成员(如黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和森林脑炎病毒)之间有反应。同时，该抗体还具有较好的广谱抗黄病毒作用，在体外细胞中和实验中可有效抑制登革1-4型病毒及其他黄病毒属成员(如黄热病毒和西尼罗病毒)的感染；同时，在体内动物保护实验中也可较好地保护乳鼠免受致死剂量的登革1-4型病毒攻击。而目前国内外报道的黄病毒属特异抗体中，还没有一个抗体能同时中和登革1-4型病毒及其他黄病毒属成员(黄热病毒和西尼罗病毒)感染，这样就避免了因抗体依赖性感染增强作用而可能导致的黄病毒病情加重。因此，这样一个具有广谱抗黄病毒作用的中和抗体，上述杂交瘤细胞系分泌的抗体，可做为广谱抗黄病毒的特异抗体药物，应用于治疗黄病毒严重感染病例，今后应用于临床治疗研究，有望加强和提高我国黄病毒疾病的防治能力和水平，对于人民卫生健康和国民经济发展具有重要意义。本发明单克隆抗体经间接免疫荧光法筛选，并用间接酶联免疫法等方法鉴定了其与抗原结合的特异性和亲和力。采用本发明的单克隆抗体或免疫偶联物可阻断黄病毒感染细胞和保护乳鼠抵抗病毒攻击，达到抑制病毒感染的效果。采用本发明的单克隆抗体或免疫偶联物还可用于检测黄病毒包膜E蛋白。

附图说明

图1：单抗D2-2A10G6抗体亚型和轻链的检测结果。

图2：单抗D2-2A10G6重链(图2A)和轻链(图2B)氨基酸序列与相关序列的比对图。

图3：单抗D2-2A10G6的分子模拟结构示意图；FR区残基用浅色条带表示，CDR区残基用深色条带表示，10个位于CDR区周围距离内的关键鼠源FR区残基用球棒状表示。

图4：单抗D2-2A10G6与登革1-4型病毒及黄病毒属其它成员间接免疫荧光检测结果。

图5：单抗D2-2A10G6识别登革病毒prM-E抗原的间接免疫荧光检测结果。

图6：单抗D2-2A10G6与登革病毒、E蛋白I/II区抗原和合成多肽的ELISA检测结果。

图7：单抗D2-2A10G6在细胞上对不同黄病毒属病毒感染的中和活性检测效果。

图8：单抗D2-2A10G6在乳鼠模型中对登革1-4型病毒攻击的保护效果观察。

图9：单抗D2-2A10G6淘选三轮后的产出效率比较图。

图10：单抗D2-2A10G6阳性噬菌体ELISA鉴定结果。

图11：单抗D2-2A10G6识别的阳性噬菌体克隆的12肽序列比对结果。

图12：单抗D2-2A10G6识别的功能表位与黄病毒属病毒E蛋白的比对结果。

图13：单抗D2-2A10G6结合表位在登革2型病毒E蛋白三维结构的相对部位结果。

具体实施方式

下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法。

下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为质量百分含量。

本发明人经过长期而深入的研究，获得了分泌抗黄病毒包膜E蛋白特定功能表位的单克隆抗体的杂交瘤细胞株D2-2A10G6，并进一步明确了其编码序列。通过研究本发明人还证明了本发明的单克隆抗体在体内外对黄病毒感染具有较好的中和活性和保护效率，可用于黄病毒感染的治疗。在此基础上，本发明人完成了本发明。

具体而言，本发明人首先并通过细胞融合-杂交瘤的方法制备了鼠源抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体D2-2A10G6，还对此单克隆抗体的基因进行了克隆并测定了其序列。

发明人利用地鼠肾细胞株BHK-21进行了一系列实验验证了本发明公开的鼠源抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体D2-2A10G6对多种黄病毒感染的抑制作用。细胞中和实验结果显示，抗黄病毒包膜E蛋白的抗体可有效阻断多种黄病毒感染和BHK21细胞的结合。相应地，作为对照的无关抗体则没有中和作用，从而说明了本发明公开的上述抗黄病毒包膜E蛋白的抗体可有效抑制病毒感染的作用。

本发明人还利用建立的登革病毒感染乳鼠动物模型进行了抗体保护实验，验证本发明的鼠源抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体D2-2A10G6抵抗致死剂量登革病毒的攻击作用。体内保护实验显示，抗黄病毒包膜E蛋白的抗体可有效保护乳鼠抵抗登革病毒的攻击，存活率和生存时间均显著提高。相应地，作为对照的无关抗体则没有上述作用，从而说明了本发明公开的上述抗黄病毒的抗体具有体内保护作用。

本发明人进一步利用噬菌体展示技术鉴定了抗黄病毒包膜E蛋白的抗体D2-2A10G6作用的包膜E蛋白的功能表位，这个功能表位为RDXW，进一步阐明了包膜E蛋白分子的作用靶点。更具体地，本发明的申请人通过单克隆抗体抗原表位的淘选、噬菌体克隆ELISA鉴定、测序及序列分析推测出包膜E蛋白的功能表位，进一步通过合成与之序列相关的多肽，通过多肽与抗体的特异性结合实验对此表位进行了鉴定。

本发明的单克隆抗体及其制备

本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原位点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常是具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分b折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等，NIH Publ.No.91-3242，卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

例如，本发明单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列优选选自：SEQ ID NO：2，轻链可变区氨基酸序列优选选自：SEQ ID NO：4，而恒定区可选自小鼠抗体恒定区，例如小鼠IgG。

在本发明的一个实施方式中，重链可变区中的CDR1-3氨基酸区序列分别选自：EYTMH，GIDPNNGGTNYNQKFKG和RDYYALDY(例如可参见图2A的D2-2A10G6 H chain)；轻链可变区的CDR1-3氨基酸序列分别选自：KASQHVGSAVA，SASNRYT和QQYNSYPT(例如可参见图2B的D2-2A10G6 L chain)。

单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得。

本发明还包括具有所述的抗黄病毒单克隆抗体的相应氨基酸序列的单克隆抗体、具有所述的抗黄病毒单克隆抗体可变区链的单克隆抗体，以及具有这些链的其它蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物。具体地，本发明包括具有含超变区(互补决定区，CDR)的轻链和重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该超变区与本发明的轻链和重链的超变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与所述的抗黄病毒单克隆抗体或其片段结合的而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗黄病毒单克隆抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab或(Fab’)₂片段；抗体重链；抗体轻链。

抗黄病毒包膜E蛋白的单克降抗体或其片段的编码分子、含该分子的表达载体及宿主细胞

本发明还提供了编码所述的抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体或其片段的DNA分子。这些DNA分子的序列可以用常规技术，比如利用PCR扩增等方法获得。此外，还可将轻链和重链的编码序列融合在一起，形成单链抗体。例如，本发明的DNA分子可包含编码重链可变区的核苷酸序列SEQ ID NO：2；编码轻链可变区的核苷酸序列SEQ IDNO：4。例如，编码D2-2A10G6重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；本发明还公开了含有上述核苷酸序列表达载体，为pcDNA3.1(+)；本发明还公开了被上述表达载体转化的宿主细胞为COS、CHO细胞。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的抗黄病毒单克隆抗体(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。

本发明还提供了可生产本发明抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株；优选的，本发明提供了高效价的抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

在获得生产本发明的抗黄病毒单克隆抗体的杂交瘤，本领域人员可很方便地获知本发明的抗体的结构(比如抗体的重链可变区和轻链可变区)，然后可通过以下方法来制备本发明的单克隆抗体。

首先，提供含有编码本发明单克隆抗体的核苷酸序列以及与该序列操作性相连的表达调控序列的表达载体。

本文所用的术语“表达调控序列”通常指参与控制核苷酸序列表达的序列。表达调控序列包括与目标核苷酸序列操作性相连的启动子和终止信号。它们通常还包括核苷酸序列适当翻译所需的序列。“操作性相连”是指线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果启动子或增强子增加了编码序列的转录，则它与编码序列是操作性相连的。

编码本发明单克隆抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段来制得。例如，可根据本发明公开的序列人工合成或用PCR法扩增得到编码该单克隆抗体重链可变区和轻链可变区的核苷酸序列。然后，用本领域熟知的各种方法通过选择合适的酶切位点将这些核苷酸序列插入合适的表达载体中，使它们分别在表达载体所携带的重链恒定区编码序列和轻链恒定区编码序列之前，并使它们在同一阅读框内。本发明中所用的表达载体是本领域技术人员已知的各种市售的表达载体，例如pcDNA3.1(+)。

随后，用上述获得的表达载体转化合适的宿主细胞。“宿主细胞”一般包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。在本发明中，优选哺乳动物细胞。通常用哺乳动物细胞系来作为表达真核细胞衍生多肽的宿主细胞。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。见《组织培养》，Academic Press，Kruse andPatterson编辑(1973)，该文纳入本文作为参考。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的无限增殖细胞系。这些无限增殖细胞系包括但不局限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、Vero细胞、Hela海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。它们为蛋白质分子提供了翻译后修饰，包括正确的折叠、正确的二硫键形成以及正确位点的糖基化。

用表达载体转化宿主细胞的方法有很多种，所用的转化程序取决于待转化的宿主。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞中的方法是本领域所知的，其包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、Polybrene(1，5-二甲基-1，5-二氮十一亚甲基聚甲溴化物)介导转染、原生质体融合、电穿孔、脂质体介导转染以及将DNA直接显微注射到胞核中。在本发明中，较佳的方法是电穿孔法或脂质体介导法等。例如可采用Invitrogen公司的脂质体法试剂盒来转染诸如COS、CHO细胞等宿主细胞。

然后，在适合本发明单克隆抗体表达的条件下，培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤，如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的鼠源抗黄病毒单克隆抗体。

单克隆抗体的鉴定、表达及纯化

所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。比如，单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如间接免疫荧光测定(IFA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来测定。单克隆抗体的结合亲和力例如可用Munson等，Anal.Biochem.，107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

本发明的抗黄病毒单克隆抗体可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

实施例

以下结合实施例、实验例进一步对本发明进行说明，这些实施例、实验例不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法以及经典的细胞融合和单克隆抗体筛选及纯化的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A LaboratoryManual，(《分子克隆：实验室指南》第2版，冷泉港实验室出版社，Cold spring HarborLaboratory Press)。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例或实验例中未标明来源的原、辅料均为市售。

实施例抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体的制备

实施例1.登革2型病毒抗原的制备

将本实验室保存的登革2型病毒43株(GeneBank号为AF204178)用细胞维持液(含2％(体积百分比)小牛血清，100U/mL青链霉素的RPMI-1640培养基，pH7.0～7.6)5倍或10倍稀释后脑内接种1～3日龄昆明种或Balb/C乳鼠，每只接种0.02mL。接种后于24h内死亡的视为非特异性死亡。然后每天观察乳鼠发病情况，其症状表现为不吃奶、嗜睡、四肢抽搐或麻痹、弓背等脑炎症状。在病毒接种后5～9d期间如有发病乳鼠，待其呈濒死状态时拉颈处死，无菌条件下解剖取脑，每个脑约重0.2g，加入1.8mL稀释液，研磨制成10％的脑悬液。

实施例2.单克隆抗体的筛选与制备

将10％乳鼠脑悬液与等体积的弗氏完全佐剂(Sigma公司产品)或弗氏不完全佐剂(Sigma公司产品)乳化，得到弗氏完全佐剂抗原和弗氏不完全佐剂抗原作为抗原免疫9周龄雌性健康BALB/C小鼠。经腹腔、肌肉及皮下多点注射，间隔3-4周用同剂量的弗氏不完全佐剂抗原加强免疫。共免疫3次，选取血清中抗登革2型病毒抗体滴度较高的小鼠经腹腔途径注射登革2型病毒感染的乳鼠脑悬液，3天后取免疫小鼠的脾脏淋巴细胞，利用经典的PEG法，将小鼠脾脏淋巴细胞与SP2/0细胞进行细胞融合。用登革2型病毒感染BHK-21细胞后制备成抗原片，采用间接免疫荧光法(IFA)反复筛选获得了一株稳定表达抗登革2型病毒抗体的杂交瘤细胞株——D2-2A10G6。大量扩增单克隆细胞株，腹腔注射Balb/C小鼠5×10⁶/只，10天左右开始收集小鼠腹水，并利用protein A/G Affinity column(Pharmacia公司产品)纯化抗黄病毒包膜E蛋白的的单克隆抗体D2-2A10G6。

杂交瘤细胞株D2-2A10G6已于2009年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管委理员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCC №.3292。

实施例3.D2-2A10G6抗体亚型测定

按照IsoStrip Mouse Monoclonal Antibody Isotyping Kit(Roche公司产品)操作手册步骤对D2-2A10G6抗体的亚型和轻链进行测定。结果显示，D2-2A10G6抗体属于IgG1(图1中A)，轻链为κ链(图1中B)。

实施例4.D2-2A10G6单抗的可变区基因克隆和序列测定

收集D2-2A10G6的5×10⁶～1×10⁷个杂交瘤细胞；用TRIzol(Invitrogen公司产品；目录号：15596-026)提取其总RNA，根据小鼠抗体恒定区序列，设计引物如下：

HGSP1：5′-gTAgAggTCAgACTgCAggAC-3′(SEQ ID NO：5)

HGSP2：5′-CTCAgggAAATAgCCCTTgAC-3′(SEQ ID NO：6)

HGSP3：5′-AgATCCAggggCCAgTggATAgAC-3′(SEQ ID NO：7)

LGSP1K：5′-TTgCTgTCCTgATCAgTCCAACT-3′(SEQ ID NO：8)

LGSP2K：5′-TgTCgTTCACTgCCATCAATCTT-3′(SEQ ID NO：9)

LGSP3K：5′-TTgTTCAAgAAgCACACgACTgA-3′(SEQ ID NO：10)

采用Roche 5’RACE试剂盒(目录号：18374-058)，分别以HGSP1、LGSP1K为引物，合成第一链cDNA；在TdT和dATP作用下，给第一链cDNA 3’端加poly C尾；分别以HGSP2、HGSP3、LGSP2K、LGSP3K为5’引物，通过巢式PCR得到VH、VL的PCR产物；PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，挑取克隆抽提质粒，限制性内切酶鉴定得到阳性克隆，通过测序确定其序列。D2-2A10G6单抗的重链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：1，氨基酸序列为SEQ ID NO：2，D2-2A10G6单抗的轻链可变区的核苷酸序列为SEQ ID NO：3，氨基酸序列为SEQ ID NO：4。D2-2A10G6单抗的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列与相关序列(重链分别与抗个体遗传性抗体4C11(GeneBank号为PL0011)、抗人CD34细胞因子抗体2E10(GeneBank号为ABY61982)和抗PRSV衣壳蛋白抗体PRSV-H 10-9(GeneBank号为AAT74919)；轻链分别与抗YGNNV抗体(GeneBank号为AAN86781)、抗FimA抗体123(GeneBank号为ACX70087)和IgM抗体MP-18-3-117(GeneBank号为AAG12167))的比对图见图2。

然后我们分别对D2-2A10G6抗体轻重链可变区包含的3个CDR区和FWR区的氨基酸序列进行预测。结果显示，重链可变区3个CDR区的氨基酸序列依次为EYTMH(SEQID NO：18)；GIDPNNGGTNYNQKFKG(SEQ ID NO：19)；RDYYALDY(SEQ ID NO：20)。其轻链可变区3个CDR区的氨基酸序列依次为KASQHVGSAVA(SEQ ID NO：21)；SASNRYT(SEQID NO：22)；QQYNSYPT(SEQ ID NO：23)。

实施例5.鼠源D2-2A10G6单抗可变区(Fv)三维结构的同源模建

利用Accelrys公司的Insight II程序包来模拟D2-2A10G6鼠源单抗可变区的三维结构。首先，用BLAST程序在蛋白质结构数据库(Protein Data Bank，PDB)中分别搜索D2-2A10G6重链和轻链可变区蛋白的模板蛋白。选取同源性最高的抗体作为D2-2A10G6的模建模板，利用Insight II程序模建出D2-2A10G6的三维结构(图3)。

实验例I.抗黄病毒包膜E蛋白的抗体D2-2A10G6生物学特性测定

实验例I-1.D2-2A10G6抗体与登革其它血清型和黄病毒属其它成员之间的交叉反应鉴定

实验例I-1-1.病毒抗原片的制备.

我们将登革1、3、4型病毒、黄热病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒和森林脑炎病毒(其中登革1型病毒毒株名为DENV1 128，GENEBANK号为FJ176780；登革3型病毒毒株名为DENV3 80-2，GENEBANK号为AF317645；登革4型病毒毒株名为DENV4 B5，GENEBANK号为AF289029；黄热病毒毒株名为YFV 17D，GENEBANK号为X03700；西尼罗病毒毒株名为WNV chin-01，GENEBANK号为AY490240；日本脑炎病毒毒株名为JEVBeijing-01，GENEBANK号为L48961；森林脑炎病毒毒株名为TBEV Senzhang，GENEBANK号为AY174188)。以上病毒毒株的悬液分别接种单层BHK-21细胞，37℃培养3～7天后用0.25％胰蛋白酶消化液将病毒感染的细胞消化下来制成细胞悬液；将其滴加到处理好的镀膜细胞玻片孔内，放入湿盒中置37℃培养使细胞贴壁；用PBS缓冲液漂洗掉未贴壁的悬浮细胞，室温晾干玻片后放入预冷丙酮中进行固定，晾干玻片即得到登革1、3、4型病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒、黄热病毒和森林脑炎病毒的病毒抗原片，-20℃密封保存。

实验例I-1-2.间接免疫荧光实验.

将D2-2A10G6单克隆抗体加入不同黄病毒感染制备的病毒抗原片，放入湿盒中置37℃作用60min，然后病毒抗原片放入PBS缓冲液(10mM K₂HPO₄，2mM KH₂PO₄，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4)振荡洗涤5min，室温晾干。在病毒抗原片上加入用0.02％伊文思兰溶液200倍稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记的羊抗鼠IgG抗体(中杉金桥公司产品)，放入湿盒中再置37℃作用30min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤5min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。阴性对照为正常BHK-21细胞。

实验结果见图4所示，结果显示，D2-2A10G6抗体与登革1-4型病毒及黄病毒属其它成员均有反应，而与正常BHK-21细胞无反应；同样步骤检测的SP2/0细胞培养上清与这些病毒抗原均无反应，表明D2-2A10G6抗体具有黄病毒属交叉活性。

实验例I-2.D2-2A10G6抗体与登革病毒prME抗原的反应鉴定

实验例I-2-1.登革病毒prM-E抗原在BHK21细胞上的瞬时表达

以登革2型病毒43株毒株RNA(该病毒序列具有GENBANK号为AF204178的第1-10723位核苷酸序列)为模板，通过RT-PCR扩增带信号肽的全长prM-E基因片段(具有GENBANK号为AF204178的第350-2429位核苷酸序列)，设计引物如下：

prME有义引物(引物1)：TgCA

CACCATggggAAAgAgATTggAAggATg(Nhe I)(SEQ ID NO：11)

prME反义引物(引物2)：Cg

TTAACTATCATCggCCTgCACCATAACTCC(Kpn I)(SEQ ID NO：12)

将该片段经Nhe I和Kpn I双酶切后插入pcDNA3.1(+)载体的相应酶切位点之间，经PCR、酶切和序列测定，获得的带信号肽序列的全长prM-E基因的重组表达质粒(pcDNA-prME)。用脂质体2000(Invitrogen公司产品)按操作手册步骤将pcDNA-prME转染至已经长成单层的BHK-21细胞中，48hr后按照实验例I-1-1)的方法固定转染细胞。

实验例I-2-2.D2-2A10G6抗体与登革病毒prME抗原的反应活性

按照实验例I-1-2)的方法对D2-2A10G6抗体进行IFA检测，并以登革2型病毒腹水抗体为阳性对照，以正常小鼠血清为阴性对照。

结果如图5所示，结果表明，该抗体在瞬时表达prM-E蛋白的BHK-21细胞中可见到特异性荧光(5A)，在空载体转染的对照细胞中无荧光(5C)，这表明D2-2A10G6抗体是针对prM-E抗原的。

实验例I-3.D2-2A10G6抗体与登革病毒E蛋白I/II抗原的反应鉴定

实验例I-3-1.登革病毒E蛋白I/II区和E蛋白III区抗原的表达

以登革2型病毒43株毒株RNA(该病毒序列具有GENBANK号为AF204178的第1-10723位核苷酸序列)为模板，通过RT-PCR扩增分别扩增E蛋白I/II区和E蛋白III区基因片段(分别具有GENBANK号为AF204178的第937-1927和1828-2136位核苷酸序列)，设计引物如下：

EI/II有义引物(引物3)：CCg

ATgCgTTgCATAggAATATC(EcoR V)(SEQ IDNO：13)

EI/II反义引物(引物4)：TgCA

TTATTTgAgCTgTAgTTTgTC(Xho I)(SEQ IDNO：14)

EIII有义引物(引物5)：CCg

TCATACTCTATgTgCACA(EcoR V)(SEQ ID NO：15)

EIII反义引物(引物6)：TgCA

TTggCCgATAgAACTTCC(Sal I)(SEQ ID NO：16)

通过PCR扩增E蛋白I/II和III区基因片段，分别经EcoR V和Xho I与经EcoR V和SalI双酶切后与同样酶切的pET-32a(+)质粒(Novagen公司产品)连接，转化感受态表达细菌BL21(DE3)。通过PCR、酶切和序列分析对重组质粒进行鉴定，挑选正确插入E蛋白III区基因的重组质粒pET-D2-EIII，用IPTG进行诱导。然后以纯化的大肠杆菌表达的E蛋白I/II和III区蛋白作为抗原进行间接酶联免疫吸附试验。

实验例I-3-2.D2-2A10G6抗体与I/II和III区抗原的结合活性

将E蛋白I/II区和III区抗原用包被液(0.1M NaHCO₃，pH9.6)稀释成1μg/mL后加入96孔ELISA板，每孔100μL，4℃包被过夜。用PBST缓冲液(PBS缓冲液，0.5％(体积百分含量)Tween-20)充分洗涤板孔5次，加入200μL含5g/L脱脂奶粉的PBST缓冲液37℃封闭2h，PBST缓冲液洗涤5次。将D2-2A10G6抗体用PBS缓冲液5倍倍比稀释(500，100，20，4，0.8，0.1600和0.032μg/mL)，每孔加入100μL，重复3孔；室温作用2h，用PBST缓冲液洗涤5次，每孔加入100μL 5000倍稀释的HRP标记的的羊抗鼠IgG(中杉金桥公司产品)，室温作用1h；用PBST缓冲液洗涤5次；每孔加入100μL TMB显色液(Promega公司产品)，室温作用10min，用2N H₂SO₄终止，然后在OD 450nm处测定吸光值。

结果见图6，显示该抗体与登革2型病毒E蛋白I/II区抗原有反应，而与E蛋白III区无反应，以正常小鼠血清作为阴性对照结果成立，表明该抗体是E蛋白I/II区特异的单抗。

实验例II.抗黄病毒包膜E蛋白抗体体外中和黄病毒感染实验

首先我们将不同稀释度(100，20，4，0.8μg/ml)的D2-2A10G6抗体与含100PFU/ml(蚀斑形成单位，plague-forming unit)的登革1-4型病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、西尼罗病毒和森林脑炎病毒悬液(病毒毒株同实验例I-1-1)等量混合，37℃水浴作用1h。并同时设立各种病毒悬液和PBS缓冲液等量混合的阳性对照于与仅加入PBS缓冲液的正常对照。将上述制备的抗体与病毒混合液分别加入培养于6孔板的BHK-21单层细胞，37℃吸附1h。弃混合液后每孔加入含1％琼脂糖的2×DMEM维持液，37℃继续培养5-7天。用甲醛固定细胞1h，弃琼盖，用PBS缓冲液清洗数次，然后用结晶紫染色30min，PBS清洗后计数蚀斑数，并计算抗体的中和指数。

结果见图7和表1所示，结果显示，D2-2A10G6抗体对登革1-4型病毒均具有较强的中和活性，中和指数(PRNT₅₀)分别达到2，1.5，2.1和1.8μg/ml。此外，该抗体对黄病毒属其它成员，如黄热病毒和西尼罗病毒也具有一定的中和作用，中和指数分别达到3.4和46μg/ml。图7中，DENV1表示登革1型病毒，DENV2表示登革2型病毒，DENV3表示登革3型病毒，DENV4表示登革4型病毒，YFV表示黄热病毒，JEV表示日本脑炎病毒，WNV表示西尼罗病毒，TBEV表示森林脑炎病毒。

表1、D2-2A10G6抗体对登革1～4型病毒及其他黄病毒属成员的蚀斑减少中和试验结果

实验例III.鼠抗黄病毒抗体体内保护效率实验

在乳鼠动物模型上观察D2-2A10G6抗体是否可保护乳鼠免受致死剂量的登革1-4型病毒(病毒毒株同实验例I-1-1)攻击。首先将不同稀释度的D2-2A10G6抗体(100μg/ml，20μg/ml，4μg/ml)与等量的100倍稀释登革1-4型病毒悬液(登革1-4型病毒对乳鼠的半数致死剂量(LD₅₀)分别为10^-4.8，10^-4.2，10^-4.6和10^-4.5/ml)混匀，37℃水浴作用1～2h。并同时设立登革1-4型病毒悬液和PBS缓冲液等量混合的阳性对照。脑内接种1日龄昆明种乳鼠(军事医学科学院实验动物中心)，0.03mL/只，每个抗体稀释度接种1窝(每窝9-12只)。每天观察，记录发病和死亡情况，共观察三周，并计算乳鼠存活率。

结果如图8所示，结果显示，D2-2A10G6抗体可保护乳鼠免受登革1-4型病毒的攻击，其中和效价分别为100，4.8，45.6和36.6μg/ml。图8：A为登革1型病毒攻毒实验结果；B为登革2型病毒攻毒实验结果；C为登革3型病毒攻毒实验结果；D为登革4型病毒攻毒实验结果；PBS为阳性对照

上述体内外中和试验结果表明，该抗体在体外可同时有效中和登革1-4型病毒及黄热病毒和西尼罗病毒感染，在体内也可保护乳鼠免受致死剂量的登革1-4型病毒攻击，具有良好的广谱黄病毒作用，这在目前国内外的相关研究中尚未见报道，因而本发明制备的杂交瘤细胞系D2-2A10G6及其分泌的单克隆抗体为下一步研制黄病毒属特异的抗体药物奠定了基础。

实验例IV.D2-2A10G6单抗抗原表位的鉴定实验

实验例IV-1.鼠抗黄病毒单克隆抗体(D2-2A10G6)抗原表位的淘选

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100μg/ml，100μl/孔D2-2A10G6抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤10次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM噬菌体展示肽实验室试剂盒Phage Display Peptide Library Kit)2×10¹¹pfu+100μl TBS，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-200.1％)15次；用100μl含1mg/ml BSA的甘氨酸-Cl(Glycine-Cl pH2.2)洗脱，室温轻摇15min，用15μl Tris-Cl(pH9.1)中和。10μl用于测定滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测定噬菌体滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。每次加入(input)噬菌体数相同(2×10¹¹pfu)。经过三轮亲和淘选，与单克隆抗体D2-2A10G6特异结合的噬菌体克隆被富集，滴度与得率均逐步升高，三轮淘选选出噬菌体数分别为2×10⁴pfu、6×10⁶pfu、1×10⁸pfu；淘选效率分别是第一轮的333和2000倍，结果表明：经过三轮淘选，特异性结合于单克隆抗体D2-2A10G6的噬菌体得到了有效富集，见图9和表2。

表2、D2-2A10G6抗体阳性噬菌体的富集结果

实验例IV-3.无关对照抗体2B8对应噬菌体克隆的淘选

采用随机肽库免疫淘选法，整个过程在96孔板上进行。100μg/ml，100μl/孔2B8抗体4℃包被过夜，10％脱脂奶粉(TBST稀释)封闭过夜，1×TBST(Tween-200.1％)洗涤6次；噬菌体随机肽库(购自NEB，Ph.D.-12^TM噬菌体展示肽实验室试剂盒)4×10¹⁰pfu+100μl正常小鼠血清，室温轻摇1小时。1×TBST(Tween-200.1％)洗涤15次；用含1mg/ml BSA的甘氨酸-Cl(pH2.2)洗脱，室温轻摇15min，15μl Tris-Cl PH9.1中和。10μl用于测滴度，其余扩增。扩增产物经PEG/NaCl沉淀，测滴度，同时进行第二轮淘选，相同过程进行第三轮淘选。用2B8抗体包板，ELISA方法检测，选取阳性反应克隆——9H8，作为对照噬菌体。

实验例IV-3.噬菌体克隆ELISA法鉴定

ELISA过程在96孔板进行，1μg/ml，100μl/孔D2-2A10G6单抗4℃包被过夜，5％脱脂奶粉(TBST稀释)37℃封闭2小时，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤5次；各单克隆噬菌体扩增上清(用字母和数字组合表示)用1×TBS 2倍稀释后加入96孔板，每孔100μl，阴性对照噬菌体为其他单抗的阳性克隆噬菌体上清(例如2B8抗体的阳性克隆9H8)。室温结合1小时，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤5次后，每孔加入200μ11∶5000稀释的HRP标记的抗-M13抗体(Pharmacia公司产品，目录号：27-9411-01)，室温震荡作用1小时，1×TBST(Tween-20 0.1％)洗涤5次，晶美公司ELISA检测试剂盒A∶B＝1∶1新鲜配置的反应底物50μl/孔，室温1-5分钟。2N H₂SO₄终止反应。每个克隆对D2-2A10G6和对照抗体2B8均设3复孔平行检测。OD 450nm处测定吸光值。ELISA检测结果表明，阳性噬菌体克隆与抗体的反应是特异的。如图10A和10B。

实验例IV-4.抗体识别表位的测序及序列分析

噬菌体DNA提取试剂盒(OMEGA公司)制备DNA模板，测序引物为M13-96引物，其序列为：5′-GCC CTC ATA GTT AGC GTA ACG-3′。序列测定后用Chromas软件读取序列，94个阳性克隆有4个独立序列；AlignX分析结果显示有一致序列FFDRTWP(见图11)。其中，F与P均为非极性，疏水氨基酸；T与W均为极性，不带电荷氨基酸；D为酸性氨基酸；R为碱性氨基酸。在抗原登革2型病毒包膜E蛋白序列上，可以找到DRXW的同源基序，由此可见，D2-2A10G6的可能抗原表位为：DRXW。结果见图12。

实验例IV-5.合成多肽与抗体结合能力分析

以登革2型病毒E蛋白氨基酸序列为参照，人工合成含有DRXW的7肽多肽(上海英维捷基生物有限公司)。将多肽包被96孔板，1μg/ml，100μl/孔，其余步骤参见实验例I-3-2。结果显示：人工合成的多肽可与抗体特异性结合。该实验进一步证实：D2-2A10G6的表位含有DRXW序列。结果见图6。实验也说明D2-2A10G6抗体的特异识别表位是DRXW，位于登革2型病毒包膜E蛋白第98-101位，是一个新的表位，表位的位置和序列如图13所示，氨基酸序列见SEQID NO：17。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<160>23

<210>1

<211>468

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>1

atgtcctctc ctcagacact gaacacactg actctaacca tgggatggag ctggatcttt 60

ctctttctcc tgtcaggaac tgcaggtgtc ctctctgagg tccagctgca acagtctgga 120

cctgaactgg tgaagcctgg ggcttcagtg aaattatcct gcaagacttc tgaaaacaca 180

ttcactgaat acaccatgca ctgggtgaag cagagccatg gaaagagcct tgagtggatt 240

ggaggtattg atcctaacaa tggtggtact aactacaacc agaagttcaa gggcaaggcc 300

acattgactg ttgacaagtc ctccaacaca gcctacatgg agctccgcag cctgacatct 360

gaagattctg cagtctatta ctgtggacga cgggactact atgctttgga ctactggggt 420

caaggaacct cagtcaccgt cgcctcagcc aaaacgacac ccccatct 468

<210>2

<211>156

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>2

Met Ser Ser Pro Gln Thr Leu Asn Thr Leu Thr Leu Thr Met Gly Trp

1 5 10 15

Ser Trp Ile Phe Leu Phe Leu Leu Ser Gly Thr Ala Gly Val Leu Ser

20 25 30

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

35 40 45

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Thr Ser Glu Asn Thr Phe Thr Glu Tyr

50 55 60

Thr Met His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile

65 70 75 80

Gly Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

85 90 95

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

100 105 110

Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

115 120 125

Gly Arg Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser

130 135 140

Val Thr Val Ala Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser

145 150 155

<210>3

<211>459

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>3

atgggcttca agatggagtc tcatactcag gcctttgtat tcgcgtttct ctggttgtct 60

ggtgttgatg gagacattgt gatgacccag tctcaaaaat tcatgtccac atcagtggga 120

gacagggtca gcatcacctg caaggccagt cagcatgttg gttctgctgt tgcctggtat 180

gacagggtca gcatcacctg caaggccagt cagcatgttg gttctgctgt tgcctggtat 240

caacagaaac caggacaatc tcctacacta ctgatacact cggcatccaa tcgttacact 300

ggagtccctg atcgcttcac aggcagtgga tctgggacag atttcactct caccatcagc 360

ttcggagggg ggaccaagct ggaaataaaa cgggctgatg ctgcaccaac tgtatccatc 420

ttcccaccat ccagtgagca gttaacatct ggaggtgcc 459

<210>4

<211>153

<212>PRT

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>4

Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Thr Gln Ala Phe Val Phe Ala Phe

1 5 10 15

Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Gln

20 25 30

Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys

35 40 45

Ala Ser Gln His Val Gly Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Thr Leu Leu Ile His Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Thr Ile Ser Asn Ile Gln Ser Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys

100 105 110

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu

115 120 125

Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala

145 150

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>5

gtagaggtca gactgcagga c 21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>6

ctcagggaaa tagcccttga c 21

<210>7

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>7

agatccaggg gccagtggat agac 24

<210>8

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>8

ttgctgtcct gatcagtcca act 23

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>9

tgtcgttcac tgccatcaat ctt 23

<210>10

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>10

ttgttcaaga agcacacgac tga 23

<210>11

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>11

tgcagctagc caccatgggg aaagagattg gaaggatg 38

<210>12

<211>38

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>12

cgggtacctt aactatcatc ggcctgcacc ataactcc 38

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>13

ccggatatca tgcgttgcat aggaatatc 29

<210>14

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>14

tgcactcgag ttatttgagc tgtagtttgt c 31

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>15

ccggatatct catactctat gtgcaca 27

<210>16

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<400>16

tgcagtcgac ttggccgata gaacttcc 28

<210>17

<211>4

<212>DNA

<213>登革2型病毒(Dengue virus type 2)

<400>17

Arg Asp Gly Trp

1

<210>18

<211>5

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>18

Glu Tyr Thr Met His

1 5

<210>19

<211>17

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>19

Gly Ile Asp Pro Asn Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210>20

<211>9

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>20

Arg Asp Tyr Tyr Ala Leu Asp Tyr

1 5

<210>21

<211>11

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>21

Lys Ala Ser Gln His Val Gly Ser Ala Val Ala

1 5 10

<210>22

<211>7

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>22

Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr

1 5

<210>23

<211>8

<212>DNA

<213>小鼠(Mus musculucs)

<400>23

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Thr

1 5

Claims

1.一种包膜E蛋白的功能表位，其特征在于，所述功能表位的氨基酸序列为SEQID NO：17，位于黄病毒包膜E蛋白融合肽。

2.与权利要求1所述的功能表位特异性结合的一种抗黄病毒包膜E蛋白的单克隆抗体，是由保藏号为CGMCC№.3292的鼠源杂交瘤细胞株D2-2A10G6分泌的。

3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区的三个CDR氨基酸序列分别为SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20；轻链可变区的三个CDR的氨基酸序列分别为SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23。

4.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：2，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO：4。

5.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体的恒定区选自小鼠抗体恒定区。

6.一种DNA分子，其编码权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体。

7.一种载体，其包含权利要求6所述的DNA分子。

8.一种宿主细胞，其包含权利要求7所述的载体，或基因组中整合有权利要求6所述的DNA分子。

9.保藏号为CGMCC №.3292的鼠源杂交瘤细胞株D2-2A10G6。

10.权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体在制备中和黄病毒属病毒的制剂中的应用；所述黄病毒属病毒为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒和/或日本脑炎病毒和/或西尼罗病毒和/或黄热病毒和/或森林脑炎病毒。

11.保藏号为CGMCC №.3292的鼠源杂交瘤细胞株D2-2A10G6在制备中和黄病毒属病毒的制剂中的应用；所述黄病毒属病毒为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒和/或日本脑炎病毒和/或西尼罗病毒和/或黄热病毒和/或森林脑炎病毒。

12.权利要求2-5中任一项所述的单克隆抗体在制备预防和/或治疗黄病毒属病毒病的药物中的应用；所述黄病毒属病毒病为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒引起的病毒病。

13.保藏号为CGMCC №.3292的鼠源杂交瘤细胞株D2-2A10G6在制备预防和/或治疗黄病毒属病毒病的药物中的应用；所述黄病毒属病毒病为登革1型病毒和/或登革2型病毒和/或登革3型病毒和/或登革4型病毒引起的病毒病。