CN103352029A - 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用。本发明所提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，是将乙脑病毒基因组RNA中编码乙脑病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段替换为森林脑炎病毒基因组RNA中编码森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段后得到的重组病毒。本发明所提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒具有如下优点：安全性高、稳定性强、可诱导产生针对森林脑炎病毒包膜蛋白的良好免疫应答、能保护动物免受致死剂量的外源森林脑炎病毒的攻击。本发明所提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒在作为疫苗用于预防和/或治疗森林脑炎病毒感染中具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域，涉及一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用，特别涉及一种以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用。
背景技术
森林脑炎病毒也称蜱传脑炎病毒（Tick-borne encephalitis virus，TBEV），是森林脑炎的病原体。该病毒与黄热病毒（Yellow Fever virus，YFV）、流行性乙型脑炎病毒（Japanese Encephalitis virus，JEV)、登革病毒（Dengue virus，DENV）和西尼罗病毒（West Nile virus，TBEV）等共属于黄病毒科（Flaviviridae）黄病毒属（Flavivirus）的重要成员。森林脑炎病毒通过蜱虫叮咬传播，感染人后可导致神经系统类疾病。该病毒分为欧洲型、西伯利亚型和远东型，其中远东亚型致死率高达30-40%。森林脑炎已成为欧洲和亚洲高纬度地区最严重的蜱媒病毒性疾病，也是我国法定的病毒性职业病之一。
疫苗接种是预防森林脑炎最为重要的手段。目前广泛使用的森林脑炎疫苗均为灭活疫苗，主要包奥地利和德国分别用欧洲病毒株研制的FAME-Immun疫苗和Enccpur疫苗、俄罗斯用远东株制造的蜱传脑炎一莫斯科疫苗（TBE．Moscow）和EnceVir疫苗。尽管上述疫苗的安全性和有效性得到了广泛认可，但由于其生产工艺复杂，而且需多次接种才能产生并维持有效的保护性抗体，因此其生产成本高，接种程序复杂。研发新型森林脑炎疫苗业已提上日程。
与灭活疫苗相比，减毒活疫苗具有独特优势，如能够同时诱导体液和细胞免疫反应，生产工艺简单成本低。随着反向遗传学技术的迅猛发展，活疫苗的靶向性减毒等疫苗的理性设计也成为可能。森林脑炎病毒的基因组为单股正链RNA，含有一个单一开放读码框，编码3种结构蛋白：衣壳蛋白（capsid protein，C）、膜蛋白及其前体（membrane protein and its precursor，M/prM）及包膜蛋白（envelope protein，E），和7种非结构蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。森林脑炎病毒的抗原蛋白主要是包膜蛋白E、膜蛋白M和非结构蛋白NS1。其中，E蛋白能诱导产生血凝抑制抗体和中和抗体，prM蛋白见于未成熟的病毒颗粒，可能在病毒颗粒成熟过程中作为分子伴侣来协助包膜E蛋白的正确折叠，在此过程中进一步经宿主细胞的蛋白酶切割后成为M蛋白。法国巴斯德研究所构建了以黄热减毒活疫苗株YF-17D为骨架的黄热/登革，黄热/西尼罗和黄热/乙脑等嵌合病毒，这些疫苗候选株目前已进入I或II期临床试验。但近年来，因接种YF-17D疫苗株而引发的脑炎病例时有发生，表明以该疫苗为骨架的嵌合疫苗的安全性还有待进一步提高。
乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2是由野毒株SA14通过在细胞和动物中不断传代和多轮空斑纯化最终获得。与野毒株SA14相比，SA14-14-2的毒力明显减弱，对成鼠和猴等动物的致病性几乎完全丧失。使用该减毒株研制的乙脑减毒活疫苗在我国使用人群超过3亿，未见因疫苗接种而引发疾病的报告，安全性可靠。同时，SA14-14-2遗传特征稳定，基因组序列明确，与森林脑炎病毒基因组具有十分类似的结构特征，非常适合作为基因骨架用于嵌合疫苗的构建。
发明内容
本发明的目的是提供一种以乙脑病毒为基因骨架的乙脑/森林脑炎嵌合病毒。
本发明所提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，是将乙脑病毒基因组RNA中编码乙脑病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段替换为森林脑炎病毒基因组RNA中编码森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段后得到的重组病毒。
其中，prM-EΔ3蛋白表示缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白。
在本发明中，所述乙脑病毒具体为乙脑病毒SA14-14-2减毒株；所述森林脑炎病毒具体为森林脑炎病毒Senzhang株或其他分离株。
进一步，所述乙脑病毒prM-EΔ3蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；所述森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
更加具体的，所述乙脑病毒prM-EΔ3蛋白的编码基因为序列表中序列4的第477-2468位；所述森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白的编码基因为序列表中序列3的第477-2459位。
在本发明中，所述乙脑病毒（乙脑病毒SA14-14-2减毒株）的基因组RNA对应的cDNA序列具体如序列表中序列4所示。
在本发明中，所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列具体如序列表中序列3所示。
所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒在如下（a1）-（a3）任一中的应用也属于本发明的保护范围：
（a1）制备预防和/或治疗森林脑炎病毒感染的疫苗；
（a2）制备研究森林脑炎病毒感染机制的产品；
（a3）制备筛选抗森林脑炎病毒药物的细胞模型。
如下（b1）-（b3）任一的生物材料也属于本发明的保护范围：
（b1）含有所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的基因组RNA或cDNA的表达盒或重组载体；
（b3）活性成分为所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的疫苗。
在上述应用中，（b1）中的所述离体动物细胞具体可为BHK-21细胞；（b2）中的所述重组载体既可为重组克隆载体，也可为重组表达载体；在本发明的一个实施例中，所述重组表达载体具体为在pANCR-L1载体的多克隆位点（如Asc I和Xho I）间插入所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列（序列3）后得到的重组载体；（b3）中的所述疫苗具体为预防和/或治疗森林脑炎病毒感染的疫苗。
其中，所述pANCR-L1载体的核苷酸序列如序列表中序列7所示。
本发明提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒具有如下多方面优点：（1）所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒是充分减毒的，因此安全性很高；（2）所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒减毒特征稳定，回复为野生型病毒的可能性极低；（3）所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒只在细胞质中复制（即RNA病毒基因组的复制、病毒的组装、成熟释放等过程均在细胞质中进行），其携带的病毒基因组无整合到宿主细胞基因组中的危险；（4）所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒能诱导产生针对森林脑炎嵌合病毒包膜蛋白的良好的免疫应答；（5）所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒能够在动物模型中保护动物免受致死剂量的外源森林脑炎病毒的攻击。本发明所提供的乙脑/森林脑炎嵌合病毒在作为森林脑炎病毒疫苗用于预防和/或治疗森林脑炎病毒感染中具有良好的应用前景。
附图说明
图1为乙脑/森林脑炎嵌合病毒（ChinTBEV）全长cDNA克隆的构建示意图。其中，JEV表示乙脑病毒SA14-14-2减毒株；TBEV表示森林脑炎病毒Senzhang株；ChinTBEV表示乙脑/森林脑炎嵌合病毒。
图2为检测ChinTBEV表达乙脑和森林脑炎病毒特异蛋白的IFA结果。其中，JEV表示乙脑病毒SA14-14-2减毒株；ChinTBEV表示乙脑/森林脑炎嵌合病毒；TBEV表示森林脑炎病毒Senzhang株。
图3为ChinTBEV的空斑形态和直径大小。其中，JEV表示乙脑病毒SA14-14-2减毒株；ChinTBEV表示乙脑/森林脑炎嵌合病毒；TBEV表示森林脑炎病毒Senzhang株。
图4为ChinTBEV在不同细胞系中的增殖特征。其中，A为BHK-21细胞；B为Vero细胞；C为C6/36细胞。A-C中，JEV表示乙脑病毒SA14-14-2减毒株；ChinTBEV表示乙脑/森林脑炎嵌合病毒；TBEV表示森林脑炎病毒Senzhang株。
图5为ChinTBEV经Vero细胞传代后的空斑特征。
图6为ChinTBEV诱导小鼠产生的IgG抗体反应和中和抗体反应。其中，A为IgG抗体反应；B为中和抗体反应。
图7为ChinTBEV的免疫保护性评价（经ChinTBEV免疫的小鼠感染森林脑炎病毒后的生存曲线）。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
乙脑病毒SA14-14-2减毒株：购自成都生物制品研究所，在“吴永林,赵宇,黄玉仙等.乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2在小鼠体内的动态分布.中国生物制品学杂志,2007年03期”一文中也有记载。
森林脑炎病毒Senzhang株：GenBank登陆号为JQ650523.1，参考文献：Zhang Y等，2012，Complete genomic characterization of two tick-borne encephalitis viruses isolated from China. Virus Res.167(2):310-3。
克隆质粒pSP64：购自Promega公司。克隆质粒pACYC177：购自Fermentas公司。pGEM-T-Easy克隆载体：Promega公司产品。
大肠杆菌感受态菌株MC1061：购自Invitrogen公司，产品目录号为CC66303。大肠杆菌感受态细菌Top10：天根生物技术公司产品。
BHK-21细胞：购自ATCC，产品目录号为CCL-10。Vero：购自ATCC，产品目录号为CCL-81）。C6/36细胞：购自ATCC，产品目录号为CRL-1660。
乙脑病毒包膜E蛋白单抗：鼠源，购自abcam公司，产品目录号为ab41671。乙脑病毒非结构蛋白NS1单抗：鼠源，购自abcam公司，产品目录号为ab416751。兔抗森林脑炎病毒特异血清：以森林脑炎病毒接种新西兰大白兔，获得兔源抗血请，记载于“刘艳丽,司炳银,户义等.森林脑炎病毒prM-E蛋白在昆虫细胞中的表达及免疫活性测定》，中华实验和临床病毒学杂志，2005,19（4）：335-339”一文中。FITC标记的羊抗鼠IgG抗体：中杉金桥公司，货号ZF-0512。FITC标记的羊抗兔IgG抗体：中杉金桥公司，货号ZF-0311。HRP标记的抗小鼠IgG抗体：中杉金桥公司，货号ZB-2305。
BALB/c雌鼠：购自军事医学科学院实验动物中心。
实施例1、构建以乙脑病毒减毒株为基因骨架的乙脑/森林脑炎嵌合病毒
该实施例以乙脑病毒SA14-14-2减毒株为基因骨架构建乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其中乙型脑炎病毒减毒株SA14-14-2的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列4所示，自5′端第1位-95位为5′UTR；第96-476位为衣壳蛋白C的编码基因（C）；第477-2468位为缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白的编码基因（prM-EΔ3）；第2469-2477位为E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基的编码基因（E3）；第2478位-10394位为非结构蛋白NS的编码基因（NS）；第10395-10977位为3′UTR。
一、乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组5′和3′半分子的构建与鉴定
乙脑病毒SA14-14-2减毒株病毒基因组5′和3′半分子的构建与鉴定分为如下几个步骤：
1、乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组cDNA的制备
按照RNeasy试剂盒（Qiagen公司产品）说明提取乙脑病毒SA14-14-2减毒株的基因组RNA（即：JEV-RNA）。提取步骤如下：
将210μl病毒悬液与700μlRLT（RNeasy Lysis Buffer）和7μlβ-巯基乙醇（β-mercaptoethanol）的混合液震荡混匀，加490μl无水乙醇后剧烈混匀，得到裂解液，将裂解液加入吸附柱，12000rpm离心15s；700μlRW1（RNeasy wash buffer）洗柱一次，12000rpm离心15s；500μlRPE（RPE是RNeasy试剂盒中的洗涤液）洗柱2次，10000rpm30s；空柱10000rpm离心1min。加50μl无RNase的水，静置2min，12000rpm离心1min。加2μlRNase inhibitor。混匀后置-80℃待用。
以测序引物R13为反转录引物进行cDNA的合成。
引物R13：5′-AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA-3′。
反转录反应的组分如下：JEV-RNA15μl；R13（10μM）1.25μl；dNTP（2.5mM each）10μl；水（RNase free）6.25μl。将上述反应组分混合均匀，置65℃5min，冰浴2min。补加如下组分：5×first-strand buffer 10μl；DDT(0.1mM)2.5μl；RNase inhibitor2.5μl；Super script III2.5μl。55℃60min；70℃，15min。加1μl（2U）RNaseH，37℃，20min。-20℃保存待用。
2、乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组5′半分子的构建与鉴定
以上述步骤1制备的乙脑病毒基因组cDNA为模板，以AscI(+)和BspEI(-)为引物，用LA TaqDNA聚合酶（TaKaRa公司产品）进行PCR扩增。
AscI(+)：5′-GCTGGCGCGCCatttaggtgacactatagagaagtttatctgtgtgaac-3′（下划线部分为AscI的识别序列，斜体为Sp6启动子，其后的序列为序列4的第1-20位）；
BspEI(-)：5′-ccgtaccagcagccattttctgtccggaatcgtagg-3′（该序列为序列4的第3437-3472位，其中下划线部分为BspEI的识别序列）
PCR反应体系组成如下：10×LA buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；乙脑病毒基因组cDNA3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸3min50s，30个循环，再于72℃10min。
凝胶回收PCR所得的大小约为3400bp的目的片段。用Asc I和BspE I酶切该目的片段，胶回收后将其与经过同样双酶切的克隆载体pANCR-L1骨架大片段相连，将连接产物转化大肠杆菌感受态菌株MC1061。提取质粒后用Asc I和BspE I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确（得到大小约为3400bp和2600bp的两个片段）的质粒送英俊公司测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的Asc I和BspE I酶切位点间插入了序列表序列4中第1位到3450位核苷酸所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白质为乙脑病毒SA14-14-2减毒株的衣壳蛋白C、缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白（prM-EΔ3，其氨基酸序列如序列表中序列1所示，该氨基酸序列的编码基因为序列表中序列4的第477-2468位所示的DNA分子）、E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基（E3）和非结构蛋白NS1，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-JEV-5，将其作为JEV基因组5′半分子克隆。
其中，克隆载体pANCR-L1是按照如下方法构建得到的：
（1）以克隆质粒pSP64为模板，用引物A和引物B进行PCR扩增，得到第2757-2982位的phage sp6区，将扩增得到的DNA片段命名为pSP64-1，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
引物A：5’-gacgtgtcgacgcggccgcgctagcgatgaccctgctg-3’（下划线部分为酶切位点Sal I，该序列为序列5的第1-38位）；
引物B：5’-tcagtccgga-
-cgtatgtgtatgatacataag-3’（下划线部分为酶切位点BspE I，斜体部分为AscI的识别序列，该序列为序列5的第225-263位的反向互补序列）。
（2）以克隆质粒pACYC177为模板，用引物C和引物D进行PCR扩增，得到第1-2335位区域，将扩增得到的DNA片段命名为pACYC177-2，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
引物C：5’-tacgggcgcgcctccgga- -caagacgtttcc-3’（下划线部分为酶切位点BspE I，，斜体部分为XhoI的识别序列，该序列为序列6的第1-36位）；
引物D：5’-gccgcgtcgacacgtcaggtggcacttttcg-3’（下划线部分为酶切位点Sal I，该序列为序列6的第2334-2364位的反向互补序列）。
（3）将步骤（1）中获得的DNA片段pSP64-1和步骤（2）中获得的DNA片段pACYC177-2进行连接：
用BspEI和SalI分别双酶切pSP64-1和pACYC177-2，将酶切所得片段连接后转化大肠杆菌感受态菌株MC1061，提取质粒后用Age I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确（得到大小约为324bp和2265bp的片段）的质粒进行测序。测序结果表明该重组质粒的核苷酸序列如序列表中序列7所示，其中第1-2335位为克隆质粒pACYC177的第1-2335位序列；第2350-2575位为克隆质粒pSP64的phage sp6区；说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-L1。
3.乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组3′半分子的构建与鉴定
以步骤1制备的乙脑病毒基因组cDNA为模板，用配对引物pBRJEV-7289(+)和pBRJEV-7289(-)，以及pBRJEV-7289-3U(+)和pBRJEV-7289-3U(-)分别进行PCR扩增。两对引物扩增的目的片段分别包含乙脑基因组cDNA（序列4）的第3099-7299位核苷酸和第7278-10977位核苷酸区段。
pBRJEV-7289(+)：5′-GGCGCGCCGACACATGGAAACTTGAGAGGGCAGT-3′（下划线部分为AscI的识别序列，其后的序列为序列4的第3099-3124位）；
pBRJEV-7289(-)：5′-GCCATCCCGGGAGCATGTA-3′（下划线部分为XmaI的识别序列，该序列为序列4的第7281-7299位的反向互补序列）；pBRJEV-7289-3U(+)：5′-GGCGCGCCCTCGA
-3′（下划线部分为Asc I的识别序列，斜体序列为序列4的第7278-7296位，斜体下划线序列为Xma I的识别序列）；
pBRJEV-7289-3U(-)：5′-CTCGAGAGATCCTGTGTTCTTCCTCAC-3′（下划线部分为Xho I的识别序列，其后的序列为序列4的第10957-10977位的反向互补序列）。
PCR反应体系组成：10×LA buffer 5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；乙脑病毒基因组cDNA3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
反应条件：94℃变性4min，94℃30s、62℃退火30s、72℃延伸4min30s或4min，每个循环退火温度降0.5℃，共10个循环；退火温度降至58℃后再进行20个循环；最后于72℃10min。
凝胶回收PCR所得的大小约为4209bp（采用引物为pBRJEV-7289(+)和pBRJEV-7289(-)）和3719bp（采用引物为pBRJEV-7289-3U(+)和pBRJEV-7289-3U(-)）目的产物，分别将其连入pGEM-T-Easy克隆载体，转化大肠杆菌感受态细菌Top10，经蓝白斑筛选出重组质粒。将测序结果与预期一致的重组质粒分别命名为pT-3099-7299和pT-7279-10977。进一步用Asc I和Xma I酶切pT-3099-7299和pT-7279-10977，分别回收4201bp和6716bp的目的片段后进行连接，转化大肠杆菌感受态细菌Top10。提取质粒后用Mlu I和Xho I进行酶切鉴定，将酶切图谱正确（得到大小约为2816bp和8079bp的两个片段）的重组质粒命名为pT-3099-10977。
用BspE I和Xho I酶切重组质粒pT-3099-10977，回收大小约为7532 bp的片段，同时，用BspEI和Xho I酶切克隆载体pANCR-L1，回收大小约为2567bp的骨架片段，将回收的目的片段进行连接，进一步转化大肠杆菌感受态菌株MC1061，再用EcoR V酶切鉴定重组质粒，将酶切图谱正确（得到大小约为4129bp和5970bp的片段）的克隆进行测序。测序结果表明在载体pANCR-L1的BspE I和Xho I的酶切位点间插入了序列表序列4中第3445-10977位所示的DNA片段序列，该DNA片段编码的蛋白为乙脑病毒SA14-14-2减毒株的部分非结构蛋白NS，说明重组质粒构建正确，将该重组质粒命名为pANCR-JEV-3，将其作为JEV基因组3′半分子克隆。
二、乙脑/森林脑炎嵌合病毒全长cDNA克隆的构建与鉴定
该克隆的构建与鉴定分为如下几个步骤：
1、森林脑炎病毒基因组cDNA的制备
选取森林脑炎病毒Senzhang株（Genebank登录号为：JQ650523.1），扩增该病毒的prM-EΔ3基因（缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白的编码基因）。森林脑炎病毒基因组RNA的提取以及cDNA的制备方法参见上述步骤一1。其中反转录引物为TBEV-R。TBEV-R：5’-cgggaggactctgtgggtcttc-3’。
2、包含森林脑炎病毒prM-E基因的JEV/TBEV嵌合片段的构建
选用Pyrobest DNA聚合酶（TaKaRa公司产品），以上述步骤1得到的森林脑炎病毒基因组cDNA（Geneban：JQ650523.1）为模板，用引物TBEV-prME(+)和TBEV-prME(-)进行PCR扩增，获得2022bp的森林脑炎病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E编码区段，命名为TBEV-prM-EΔ3；以上述步骤一1中所得的乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组cDNA（序列4）为模板，用引物TBEV-J-BspEI(+)和TBEV-J-BspEI(-)进行PCR扩增，获得1017bp的目的片段，该片段编码的蛋白为乙脑病毒的E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和部分非结构蛋白NS1，将其命名为JEV-TBEV-NS；选用LA Taq DNA聚合酶（TaKaRa公司产品），将TBEV-prM-EΔ3和JEV-TBEV-NS通过融合PCR获得3003bp的包含森林脑炎病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E编码区段（TBEV-prM-EΔ3，其氨基酸序列如序列表中序列2所示，该氨基酸序列的编码基因为序列表中序列3的第477-2459位所示的DNA分子），以及乙脑病毒的E蛋白羧基末端3个氨基酸残基和非结构蛋白NS编码区段（JEV-TBEV-NS）的DNA片段，将其命名为JEV/TBEV嵌合片段。
其中，相关引物序列如下：
TBEV-prME(+)：5′-agcttgtgcaggcgccgtgacacttgcagccacagt-3′（该序列为序列3的第461-496位，下划线部分为酶切位点Kas I的识别序列，其后为Genebank：JQ650523.1的第466-485位）；
TBEV-prME(-)：5′-gcacatccagtgtcagcatgc-actccgagtgtcatggccagaaccagt-3′（序列3的第2435-2482位的反向互补序列，-后的序列为Genebank：JQ650523.1的第2424-2450位的反向互补序列，-前的粗体序列为序列4的第2471-2491位的反向互补序列）；
TBEV-J-BspEI(+)：5′-catgacactcgga-gt-gcatgctgacactggatgtgc-cattgacatc-3′（序列3的第2447-2492位，该序列的第一个-后的序列为序列4的第2469-2501位）；
TBEV-J-BspEI(-)：5′-ccgtaccagcagccattttctgtccggaatcgtagg-3′（序列3的第3428-3463位的反向互补序列，序列4的第3437-3472位的反向互补序列，下划线部分为酶切位点BspE I的识别序列）。
扩增TBEV-prM-EΔ3和JEV-TBEV-NS的反应体系组成如下：10×buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；森林脑炎病毒基因组cDNA或乙脑病毒基因组cDNA3μl；Pyrobest DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸，延伸时间按1kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。
融合PCR扩增JEV/TBEV嵌合片段的反应体系组成如下：10×LA buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；TBEV-prM-EΔ3和JEV-TBEV-NS混合物（10nM each）3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
将片段TBEV-prM-EΔ3和JEV-TBEV-NS进行融合的反应条件如下：首先94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸2min，共10个循环；之后补加引物TBEV-prME(+)（10μM）和TBEV-J-BspEI(-)（10μM）各2μl进行PCR扩增，反应条件为94℃变性4min，94℃30s、57℃退火30s、72℃延伸3min，共30个循环；再于72℃10min。
3、缺失prM-E基因的JEV基因组5′半分子的构建与鉴定
选用PyrobestDNA聚合酶，以上述步骤一1中所得的乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组cDNA（序列4）为模板，用引物AscI(+)（序列见步骤一2）和J-REP-kas(-)进行PCR扩增，得到525bp的目的片段（包含序列4的第1-476位序列），将其命名为的J-REP-kas；同时，以上述步骤一1中所得的乙脑病毒SA14-14-2减毒株基因组cDNA（序列4）为模板，用引物J-REP-kas(+)和J-REP-Bgl II(-)扩增得到212bp的目的片段（包含序列4的第2460-2650位），将其命名为J-REP-BglII。再用引物AscI(+)（序列见步骤一2）和J-REP-Bgl II(-)将J-REP-kas和J-REP-Bgl II融合获得缺失JEVprM-EΔ3的696bp的目的片段（其核苷酸序列包含序列4第1-476和第2460-2650位序列），命名为JEV-ΔprM-EΔ3。
扩增J-REP-kas和J-REP-BglII的反应体系组成如下：10×buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；乙脑病毒基因组cDNA3μl；Pyrobest DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
反应条件如下：94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸，延伸时间按1kb/min计算，共30个循环，再于72℃10min。
融合PCR扩增JEV-ΔprM-EΔ3的反应体系组成如下：10×LA buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mMeach）8μl；J-REP-kas和J-REP-Bgl II混合物（10nMeach）3μl；LA Taq DNA聚合酶0.5μl；水29.5μl。
首先将片段J-REP-kas和J-REP-Bgl II进行融合，反应条件为94℃变性4min，94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共10个循环；之后补加引物AscI(+)（10μM）和J-REP-Bgl II(-)（10μM）各2μl进行PCR扩增，反应条件为94℃变性4min，94℃30s、57℃退火30s、72℃延伸50s，共30个循环；再于72℃10min。
进一步用Asc I和Bgl II酶切JEV-ΔprM-EΔ3，凝胶回收目的片段，与经过同样双酶切的步骤一2中得到的JEV基因组5′半分子克隆pANCR-JEV-5的骨架大片段相连。再将连接产物转化大肠杆菌感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用Kas I和Bgl II进行酶切鉴定，得到大小约为186bp和3871bp的片段，说明酶切图谱正确。将该重组质粒命名为pANCR-J-ΔprME-5。将该重组质粒用于下一步构建嵌合病毒的5′半分子。
相关引物序列如下：
J-REP-kas(+)：5′-gtcatagcttgtgca 
gtgcatgctgacactggatg-3′（下划线部分为序列4的第456-476位序列，其后序列为序列4的第2469-2488位序列，其中粗体部分为Kas I的识别序列）；
J-REP-kas(-)：5′-catccagtgtcagcatgcacggcgcctgcacaagctatgac-3′（为J-REP-kas(+)的反向互补序列）；
J-REP-BglII(-)：5′-gtgacagatctgactccgcacacgc-3′（下划线部分为BglII的识别序列，该序列为序列4的第2635-2659位的反向互补序列）。
4、乙脑/森林脑炎嵌合病毒5′半分子的构建与鉴定
用Kas I和BspE I依次酶切步骤2得到的嵌合片段JEV/TBEV和步骤3得到的半分子pANCR-J-ΔprME-5，分别回收大小约为2965bp和3075bp的目的片段并进行连接，再转化大肠杆菌感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用Kas I和Sca I进行酶切鉴定，得到大小约为684bp和5356bp的片段，说明酶切图谱正确。将该重组质粒命名pANCR-ChinTBEV-5。
5、乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组全长cDNA克隆的构建与序列测定
用BspE I和Xho I酶切上述步骤4得到的乙脑/森林脑炎嵌合病毒5′半分子重组质粒pANCR-ChinTBEV-5，回收大小约为6034bp的片段，同时用BspEI和XhoI酶切步骤一3中获得的JEV基因组3′半分子克隆pANCR-JEV-3，回收大小约为7526bp的片段，将以上回收的两个目的片段连接后转化大肠杆菌感受态菌株MC1061。提取重组质粒后用HindIII进行酶切鉴定，得到大小约为9555、1392、2000和613bp的片段，说明酶切图谱正确。将酶切图谱正确的克隆进行测序。测序结果表明，在载体pANCR-L1的Asc I和Xho I酶切位点间插入了“atttaggtgacactatag-序列3”所示的核苷酸序列，其中序列3的第96位-476位编码乙脑病毒SA14-14-2减毒株的衣壳蛋白C（图1中所示ChinTBEV中的C），第477位-2459位编码森林脑炎病毒的缺失了E蛋白羧基末端3个氨基酸残基的prM-E蛋白（图1中所示ChinTBEV中的prM-EΔ3），第2460位-2468位编码乙脑病毒SA14-14-2E蛋白羧基末端的3个氨基酸残基（图1中所示ChinTBEV中的E3），第2469位-10385位编码乙脑病毒SA14-14-2减毒株的非结构蛋白（图1中所示ChinTBEV中的NS1-NS5），第1-95位和第10386位-10968位为乙脑病毒SA14-14-2减毒株RNA的非编码区（图1中所示ChinTBEV中的5’-UTR和3’-UTR）。酶切和测序结果表明，重组质粒构建正确。将该重组质粒命名为pANCR-ChinTBEV，将其作为乙脑/森林脑炎嵌合病毒全长cDNA克隆质粒。
三、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的拯救
1、乙脑/森林脑炎嵌合病毒全长cDNA克隆的体外转录
用质粒中提试剂盒（Qiagen公司产品）抽提乙脑/森林脑炎嵌合病毒的全长cDNA克隆质粒pANCR-ChinTBEV，经XhoI酶切后再用酚氯仿抽提，将线性化质粒定量并分装后-20℃冻存待用。
以线性化后的嵌合病毒全长cDNA克隆质粒为模板，用SP6RiboMAX Express Large ScaleRNA Production Systems（Promega公司产品）进行体外转录。反应体系与条件如下：
37℃反应3h。补加2μl DNase后于37℃作用30min。依照RNeasy mini kit（Qiagen公司产品）操作说明纯化转录体RNA后定量，分装后置-80℃冻存待用。
2、嵌合病毒的拯救
用脂质体Lipofectamin2000（购自Invitrogen公司）将步骤1获得的转录体RNA转染单层BHK-21细胞（汇合度为80%），方法如下：首先将50μl OPTI-MEM与4μl脂质体混匀，于室温放置5min后再与10μl RNA（5μg）和50μl OPTI-MEM混合，室温放置20min。将上述混合液加入到6孔板中的1孔，同时补加450μl OPTI-MEM。37℃，5%CO2孵育6h。移去上清，补加含有2%FBS的DMEM培养基，置37℃，5%CO2孵箱。待细胞出现病变后，离心收集培养液上清。将上清重新接种于BHK-21细胞，待细胞出现病变后，离心收集上清。冻存于-80℃，作为乙脑/森林脑炎嵌合病毒种子液。
四、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的病毒特异蛋白的检测
通过如下步骤观察乙脑/森林脑炎嵌合病毒能否同时表达乙脑非结构蛋白和森林脑炎病毒包膜E蛋白：
1、乙脑/森林脑炎嵌合病毒感染的BHK-21细胞抗原片的制备
将乙脑/森林脑炎嵌合病毒以MOI=0.01的剂量感染单层BHK-21细胞（汇合度为80％），于感染后24-72h收取细胞，重悬于含有10%FBS的DMEM培养液，再铺于载玻片。于37℃，5%的CO2孵箱中培养8-12h。之后将该载玻片置于-20℃的丙酮中固定30-60min。晾干，得到乙脑/森林脑炎嵌合病毒抗原片，放于-20℃冰箱密封待用。依同样的方法制备乙脑病毒SA14-14-2减毒株和森林脑炎病毒Senzhang株的抗原片。
2、乙脑和森林脑炎病毒特异蛋白的检测
分别用乙脑病毒包膜E蛋白单抗、乙脑病毒非结构蛋白NS1单抗，兔抗森林脑炎病毒特异血清，通过间接免疫荧光（IFA）对乙脑/森林脑炎嵌合病毒感染的BHK-21细胞中的病毒特异蛋白进行检测。方法如下：将上述抗体按照说明书记载用PBS进行适当比例的稀释，与步骤1制得的抗原片中的BHK-21细胞在37℃孵育1-2h，PBS缓冲液（10mM K2HPO4，2mM KH2PO4，135mM NaCl，2.7mM KCl，pH7.4）振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干。在病毒抗原片上加入用0.02％伊文思兰溶液（百灵威科技公司，货号19555）800倍稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体或FITC标记的羊抗兔IgG抗体，置37℃作用60min，然后将病毒抗原玻片放入PBS缓冲液振荡洗涤3次，每次10min，室温晾干，荧光显微镜下观察结果。实验同时设置不加一抗的阴性对照。
间接免疫荧光的结果显示，乙脑/森林脑炎嵌合病毒感染的BHK-21细胞中可检测到森林脑炎病毒E蛋白（TBEV-E）和乙脑病毒非结构蛋白NS1（JEV-NS1），而检测不到乙脑病毒包膜E蛋白（JEV-E），详见图2。
五、乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组全序列测定与分析
1、乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组5′和3′末端序列测定（5′和3′RACE法）
按照5′和3′RACEkit(Roche)操作方法和反应条件测定乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组5′和3′末端序列。首先用引物5′-1(-)将病毒RNA反转录获得cDNA，再通过末端脱氧核苷酰转移酶（简称TdT）在其3′末端添加dATP同聚物。以之为模板，采用寡聚d(T)锚定引物和引物5′-1(-)进行第一次PCR扩增，扩增条件如下：94℃变性4min，94℃15s、62℃退火30s、72℃延伸30s，共30个循环，再于72℃10min。将该PCR产物回收后作为模板，通过PCR锚定引物和引物5′-2(-)以同样扩增条件进行套式扩增，扩增条件中退火温度改为60℃。将PCR产物克隆至pGEM-T Easy克隆载体后进行序列测定。测序结果表明，PCR产物具有序列3的自5′端第1-287位所示的核苷酸序列。
采用3′-RACE法扩增乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组3′末端序列。首先通过Poly(A)RNA聚合酶在病毒RNA3′末端添加poly(A)尾，通过引物3′-1(+)和寡聚d(T)锚定引物进行初次扩增，条件如下：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸30s，30个循环，再于72℃10min。继续以PCR产物为模板，通过引物3′-2(+)和PCR锚定引物以同样扩增条件进行套式PCR，退火温度改为55℃。将PCR产物克隆至pGEM-TEasy克隆载体并进行序列测定。测序结果表明，PCR产物具有序列3的自5′端第10720-10959位所示的核苷酸序列。
相关引物序列如下：
5′-1(-)：5′-cacactcttttccactgctttccat-3′（序列3的第299-323位的反向互补序列）；
5′-2(-)：5′-cgccttggtcggggctaatgctgta-3′（序列3的第263-287位的反向互补序列）；
寡聚d(T)锚定引物：
5′-GACCACGCGTATCGATGTCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
PCR锚定引物：5′-GACCACGCGTATCGATGTCGAC-3′；
3′-1(+)：5′-gaggactgggttaccaaagccgtt-3′（序列3的第10665-10688位）；
3′-2(+)：5′-tgcaatagacgaggtgtaaggact-3′（序列3的第10720-10743位）。
2、乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组全序列的分段扩增和序列测定
以乙脑/森林脑炎嵌合病毒基因组cDNA为模板，用引物F1(+)-R1(-)～F13(+)-R13(-)将基因组分为13段进行扩增。相关引物序列见表1（标有“*”的引物同时用于扩增和测序）。
表1用于乙脑/森林脑炎嵌合病毒全基因组分段扩增和测序引物
| 引物名称 | 序列（5′-3′） | 位置（在序列3中的位置） |
| F1* | AGAAGTTTATCTGTGTGA | 1-18 |
| F2 | GTGACACTTGCAGCCACAGT | 477-496 |
| F3 | TTGTGTGGCTGACCGTGGAAAGCGT | 901-925 |
| F4 | GTCATTCTGGAACTTGACAAGACCT | 1572-1596 |
| F5 | CTCATCATTCCGCACACCAT | 3189-3208 |
| F6 | GGGATGAGGGCTCTATACCT | 4005-4024 |
| F7 | ATTGACGCCATACTGGGGTA | 4790-4809 |
| F8 | GACTCAAATGCCCCAATCCA | 5580-5599 |
| F9 | ATGCAGATCACCAGGCCCTC | 6403-6422 |
| F10 | CTTGGCTGTTGGGGTCAAGT | 7200-7219 |
| F11 | GAAGAACCGATGCTCATGCA | 7998-8017 |
| F12 | GGCTGTGGGCCTACTTGTCA | 8812-8831 |
| F13 | AGGACCTGGCTCTTTGAGAA | 9612-9631 |
| F14 | GACAGGGTCATCTAGTGTGA | 10371-10390 |
| R1(-) | CAACATTCCTGCAGAAGCAATC | 675-696 |
| R2(-) | ACAGCTTTGCGTGCAGGCAGTACT | 1153-1176 |
| R3(-) | ATCCATTTTCACAGCATGTGGAGCT | 1715-1739 |
| R4(-) | GAAGCTCATGGACATGGTCGGATTC | 2396-2420 |
| R5(-) | GACTGCTTCCTGTGATTGCA | 4403-4422 |
| R6(-) | ACCAGGGTGCAAATCTAGCA | 5170-5189 |
| R7(-) | TCCGAGGATGACTCTGCCTT | 5914-5933 |
| R8(-) | TCTGGGATGAGAACCACCAT | 6798-6817 |
| R9(-) | GCCAGGTAGCTACCTCGCAT | 7590-7609 |
| R10(-) | CATTCGCCCCAGTAATACCT | 8380-8399 |
| R11(-) | CCTCCTTGCTTTCCTGCTAT | 9237-9256 |
| R12(-) | CTACTGGCACTGCTGAGCAA | 10019-10038 |
| R13(-) | AGATCCTGTGTTCTTCCTCACCACCAGCTACA | 10937-10968 |
PCR反应体系如下：10×LA buffer5μl；正向引物（10μM）2μl；反向引物（10μM）2μl；dNTP（2.5mM each）8μl；嵌合病毒cDNA2μl；LA Taq DNA 聚合酶0.5μl；水30.5μl。
反应条件为：94℃变性4min，94℃30s、60℃退火30s、72℃延伸1min20s，每个循环退火温度降0.5℃，共10个循环；退火温度降至55℃后再进行20个循环；最后于72℃10min。将PCR产物进行序列测定。
PCR扩增结果显示，13对引物均可扩增出大小与预期一致的目的片段，序列测定的结果也显示，所得片段为乙脑病毒SA14-14-2减毒株和森林脑炎病毒Senzhang株的特异序列。
以上测序结果表明乙脑/森林脑炎嵌合病毒全长cDNA序列如序列表中序列3所示。
六、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的空斑特征
为了观察嵌合病毒的空斑形态特征，用2%FBS的DMEM将步骤三得到的乙脑/森林脑炎嵌合病毒种子液以10倍比稀释为10-1、10-2、10-3、10-4，10-5、10-6和10-7，以500μl/孔接种于铺于6孔板的单层BHK-21细胞（汇合度为90%）。吸附1-2h后，弃去病毒液，添加含有DMEM培养基（含2%FBS）的1%（1g/100mL）的琼脂盖，置于37℃，5%CO2的孵箱中培养。3d后用4%甲醛室温固定1h，弃琼脂盖，结晶紫室温染色10min，观察空斑形态，统计空斑直径。以相同方法对乙脑病毒SA14-14-2减毒株和森林脑炎病毒Senzhang株的空斑进行分析。
空斑试验的结果如图3所示，乙脑/森林脑炎嵌合病毒能形成大小均一，边缘清晰的空斑，直径为0.27±0.09mm（n=40）；森林脑炎病毒Senzhang株也能形成大小较为均一的空斑，其直径为1.46±0.23mm（n=25）；而乙脑病毒SA14-14-2减毒株的空斑较大，直径为0.56±0.19mm（n=30）。上述结果表明，乙脑/森林脑炎嵌合病毒的空斑直径明显小于乙脑病毒SA14-14-2减毒株，因此其具有显著的小斑（small plaque,sp）特征（小斑特征一般认为是减毒的标志之一）。
七、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的在不同细胞内的增殖特征
为了观察嵌合病毒在鼠类、灵长类和蚊虫类细胞系中的增殖特征，分别将乙脑/森林脑炎嵌合病毒、乙脑病毒SA14-14-2减毒株和森林脑炎病毒Senzhang株以MOI=0.01接种24孔板中汇合度为90%的BHK-21（幼仓鼠肾传代细胞）、Vero（非洲绿猴肾细胞）和C6/36细胞（蚊子细胞），置于37℃（BHK-21和Vero细胞）或28℃（C6/36细胞），5%CO2的培养箱中吸附1h后，弃去病毒液，补加含有2% FBS的DMEM培养基（BHK-21细胞和Vero细胞）或1640培养基（C6/36细胞），置于37℃（BHK-21和Vero细胞）或28℃（C6/36细胞）的5%CO2的培养箱培养。于接种后第24、48、72和96h收取细胞上清液，用空斑滴定法测定病毒滴度（参见步骤六相关内容进行），绘制一步生长曲线（图4）。
一步生长曲线的结果显示，乙脑/森林脑炎嵌合病毒在BHK-21（图4中A）和Vero细胞（图4中B）中均能有效复制，分别于感染后48和96h达到复制顶点，滴度分别为106.8PFU/ml和107.0PFU/ml。乙脑/森林脑炎嵌合病毒在C6/36细胞（图4中C）中也能维持低水平增殖，最高滴度约为104.1PFU/ml。这表明乙脑/森林脑炎嵌合病毒可在不同细胞系中有效复制。
八、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的神经侵袭力特征
为了观察乙脑/森林脑炎嵌合病毒的神经侵袭力特征，分别将乙脑/森林脑炎嵌合病毒（ChinTBEV）和森林脑炎病毒Senzhang株（TBEV）以103，104，105PFU的剂量皮下（s.c.）接种感染4周龄BALB/c雌鼠（每个处理6-8只小鼠）。同时，还分别以将乙脑/森林脑炎嵌合病毒（ChinTBEV）和森林脑炎病毒Senzhang株（TBEV）以（ChinTBEV：103，104，105，106PFU）和（TBEV：103，102和10PFU）以腹腔（i.p.）接种途径感染后4周龄BALB/c雌鼠（每个处理8-9只小鼠）。24h内死亡视为非特异性死亡。观察21天内的小鼠发病和死亡情况，并计算病毒的半数致死剂量（LD50）（采用国际通用的计算方法Reed and Muench法计算得到）和小鼠的平均存活时间。
结果如表2所示，乙脑/森林脑炎嵌合病毒和森林脑炎病毒Senzhang株的皮下LD50分别为>105PFU和<103PFU，腹腔LD50分别为105.5和<10PFU。这表明乙脑/森林脑炎嵌合病毒的神经侵袭力也明显弱于森林脑炎病毒Senzhang株。
表2ChinTBEV的神经侵袭力特征
注：aN/A表示不适用
九、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的遗传稳定性
通过如下步骤观察乙脑/森林脑炎嵌合病毒在Vero细胞连续传代后的基因和空斑特征稳定性：
1、乙脑/森林脑炎嵌合病毒在Vero细胞中连续传代
将乙脑/森林脑炎嵌合病毒以MOI=0.01接种于单层Vero细胞（汇合度为90%），3d后收集细胞上清，通过空斑试验测定病毒滴度。再以MOI=0.01接种于单层Vero细胞（汇合度为90%）。如此连续传代8次后，将各代次病毒冻存于-80℃。
2、不同代次乙脑/森林脑炎嵌合病毒prM蛋白和E蛋白基因序列分析
分别提取原代（第0代）、第4代和第8代的乙脑/森林脑炎嵌合病毒RNA，以引物R13(-)（序列见表1）反转录得到基因组cDNA，再分别以引物TBEV-prM(+)和TBEV-prM(-)（步骤二2中的TBEV-prME(+)和TBEV-prME(-)）扩增乙脑/森林脑炎嵌合病毒的prM蛋白和E蛋白编码区段并测序。将第4代和第8代病毒序列与原代病毒进行序列比对，结果显示，经细胞传代后所得的乙脑/森林脑炎嵌合病毒的prM蛋白和E蛋白编码区段序列保持一致。
3、不同代次乙脑/森林脑炎嵌合病毒的空斑特征
具体操作方法参见步骤六进行。结果显示，与原代（第0代）病毒（空斑直径0.41±0.12mm，n=30）相比，经细胞传代后的第4代（空斑直径0.45±0.16mm，n=30）和第8代（空斑直径0.44±0.17mm，n=30）乙脑/森林脑炎嵌合病毒的空斑形态未发生明显改变，无统计学差异（图5）。
综合以上结果，可见乙脑/森林脑炎嵌合病毒具有基因和空斑形态稳定性。
十、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的免疫原性
通过以下步骤评价乙脑/森林脑炎嵌合病毒的免疫原性：
1、乙脑/森林脑炎嵌合病毒经腹腔注射方式免疫BALB/c小鼠
使用不同剂量的乙脑/森林脑炎嵌合病毒（104和105PFU/只）腹腔（i.p.）接种4周龄BALB/c小鼠，每组6-7只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。分别于免疫后第14d和28d剪尾取血。于4℃静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。
2、乙脑/森林脑炎嵌合病毒经腹部皮下注射方式免疫BALB/c小鼠
使用不同剂量的乙脑/森林脑炎嵌合病毒（104和105PFU/只）经腹部皮下（s.c.）接种4周龄BALB/c小鼠，每组6-7只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。于免疫后第28天剪尾取血。于4℃静置3h后离心收取血清，56℃灭活30min，-20℃冻存待用。
3、免疫小鼠血清中的森林脑炎病毒特异IgG抗体效价的测定
用PBS将步骤1所得免疫血清制备成1：25-216的稀释液，再加入预先以104PFU的森林脑炎病毒Senzhang株包被的ELISA板中，37℃孵育1h，PBST洗3次，在加入1:5000稀释（抗体稀释液为PBS）的HRP标记的抗小鼠IgG抗体，37℃孵育半小时，PBST洗3次，加入TMB显色液，避光反应15-20分钟，加入终止液（2M硫酸）。在OD450nm波长读取数值。以高于PBS组数值2.1倍以上判断为阳性。结果显示，皮下（s.c.）和腹腔（i.p.）免疫途径可诱导小鼠产生高滴度的IgG抗体，且成剂量依赖性反应（图6中A）。表明该乙脑/森林脑炎嵌合病毒具有良好的免疫原性。
4、免疫小鼠血清中的森林脑炎病毒中和抗体效价的测定
采用空斑减少中和试验测定血清中的中和抗体效价。首先将各免疫组在免疫后第14天和28天的血清用含2%FBS的DMEM培养基制备成1:10、1:20、1:40、1:80和1:160的稀释液，与等体积的含100PFU的森林脑炎病毒Senzhang株悬液混合，37℃孵育1.5h。再将混合液接种于12孔板中汇合度为90%的BHK-21细胞。通过空斑试验对血清病毒混合液中的病毒颗粒进行计数，计算血清中的中和抗体效价（采用国际通用的计算方法Reed and Muench法）。结果显示，各剂量组均能诱发小鼠产生效价大于或等于1:10的中和抗体，且其效价与免疫剂量呈正相关，其中最高剂量组（105PFU/只）的中和抗体效价可达1:40以上。此外，高水平中和抗体能维持4周以上。上述数据表明，乙脑/森林脑炎嵌合病毒还能有效诱发小鼠产生具有保护作用的中和抗体（图6中B）。
十一、乙脑/森林脑炎嵌合病毒的免疫保护性
将乙脑/森林脑炎嵌合病毒以（105和104PFU/只）的剂量分别经腹腔（i.p.）和皮下（s.c.）两种接种途径免疫4周龄BALB/c小鼠，每组6-7只小鼠，同时以PBS作为阴性对照。免疫后第28天，再经腹腔（i.p.）途径接种≈100i.p.LD50的森林脑炎病毒Senzhang株。每天记录小鼠发病和死亡情况，共计21天。
结果显示，PBS免疫组的的小鼠在15天内全部死亡。腹腔（i.p.）免疫组中，105PFU的剂量可为小鼠提供完全保护，104PFU剂量组也可保护60%的小鼠免于死亡。在皮下（s.c.）免疫组中，104和105PFU免疫的小鼠存活率分别为50%和71%。这表明，乙脑/森林脑炎嵌合病毒免疫后能够有效保护小鼠免受致死剂量的森林脑炎病毒Senzhang株的攻击，具有良好的免疫保护效果（图7）。
Claims (9)
1.乙脑/森林脑炎嵌合病毒，是将乙脑病毒基因组RNA中编码乙脑病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段替换为森林脑炎病毒基因组RNA中编码森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白的脱氧核糖核苷酸片段后得到的重组病毒。
2.根据权利要求1所述的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其特征在于：所述乙脑病毒为乙脑病毒SA14-14-2减毒株；或
所述森林脑炎病毒为森林脑炎病毒Senzhang株。
3.根据权利要求1或2所示的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其特征在于：所述乙脑病毒prM-EΔ3蛋白为由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白；所述森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。
4.根据权利要求3所示的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其特征在于：所述乙脑病毒prM-EΔ3蛋白的编码基因为序列表中序列4的第477-2468位；所述森林脑炎病毒prM-EΔ3蛋白的编码基因为序列表中序列3的第477-2459位。
5.根据权利要求1-4中任一所示的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其特征在于：所述乙脑病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列4所示。
6.根据权利要求1-5中任一所述的乙脑/森林脑炎嵌合病毒，其特征在于：所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的基因组RNA对应的cDNA序列如序列表中序列3所示。
7.权利要求1-6中任一所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒在如下（a1）-（a3）任一中的应用：
（a1）制备预防和/或治疗森林脑炎病毒感染的疫苗；
（a2）制备研究森林脑炎病毒感染机制的产品；
（a3）制备筛选抗森林脑炎病毒药物的细胞模型。
8.如下（b1）-（b3）任一的生物材料：
（b1）含有权利要求1-6中任一所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的离体动物细胞或重组菌；
（b2）含有权利要求1-6中任一所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的基因组RNA或cDNA的表达盒或重组载体；
（b3）活性成分为权利要求1-6中任一所述乙脑/森林脑炎嵌合病毒的疫苗。
9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于：所述疫苗为预防和/或治疗森林脑炎病毒感染的疫苗。
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