CN1253506A - 嵌合黄病毒疫苗 - Google Patents

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Abstract

嵌合活体、感染性、减毒病毒,含有黄热病毒,其中编码prM－E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突变,以至功能性黄热病毒PrM－E蛋白不能表达出来,和编码第二种不同黄病毒PrM－E蛋白的核苷酸序列整合至所述黄热病毒基因组,以至所述第二种黄病毒的所述prM－E蛋白得以表达。

Description

嵌合黄病毒疫苗
                   发明背景
本发明涉及可用作抗黄病毒属所致疾病之疫苗的传染性、减毒病毒。
黄病毒科的几个成员对全球公共健康造成现实或潜在的威胁。例如，日本脑炎(Japanese encephalitis)是一种使远东数百万个体遭受风险的重大的公共健康问题。据估计全球范围内原发性登革热的年发病率为1亿例，出血性登革热的发病率超过450,000例，登革热(Dengue)病毒已经显示出是唯一一种最重要的由节肢动物传播的人类疾病。其它黄病毒不断产生性质变化的地方病，具有随气候，携带者群体的改变，和人类活动导致的环境混乱，而进入新地区的潜能。这些黄病毒包括，例如，St.Louis脑炎病毒，它导致美国中东部，东南部，和西部偶发但严重的急性疾病；西尼罗河(West Nile)病毒，它导致热病，偶尔并发急性脑炎，它在非洲大部，中东，前苏联，和欧洲部分地区广泛传播；Murray山谷(Murray Valley)脑炎病毒，它引起澳大利亚地方性神经系统疾病；蜱传(Tick-borne)脑炎病毒，它在前苏联大部和东欧传播，在那里这种病毒的硬蜱传播者很盛行，造成这些地区脑炎极为严重。
丙型肝炎病毒(HCV)是黄病毒属家族的另一个成员，具有与上述黄病毒相似但不相同的染色体构成和复制策略。HCV大都经非肠道接触感染，它与能够发展成为肝硬化和肝细胞癌的慢性肝炎有关，在美国它还是需要常位移植的肝病的起因。
黄病毒科与α病毒属(alphaviruses)(例如，WEE，VEE，EEE，SFV等)不同，目前包含三个属：黄病毒属、瘟病毒属、和丙型肝炎病毒属。黄病毒属的完全加工后的成熟病毒颗粒包含三个结构蛋白：包膜(envelope，E)蛋白，衣壳(capsid，C)蛋白，和膜(membrane，M)蛋白，以及七个非结构蛋白(NS1，NS2A，NS2B，NS3，NS4A，NS4B，和NS5)。在感染细胞中发现的未成熟的黄病毒颗粒包含前-膜(prM)蛋白，它是M蛋白的前体。
病毒颗粒与宿主细胞受体结合后，E蛋白暴露于内体的酸性pH值下，发生不可逆的构型改变，导致病毒颗粒的双层包膜与胞内小泡融合，由此将病毒基因组释放到宿主胞质溶胶中。含有prM的蜱传脑炎(TBE)病毒无融合能力，表明prM的蛋白酶解加工过程对于产生有融合能力和完全传染性的病毒颗粒是必要的(Guirakhoo等，病毒遗传学杂志(J.Gen.Virol.)，72(Pt.2)：333-338，1991)。在病毒复制循环后期，用氯化铵处理，产生含prM的Murray山谷脑炎(MVE)病毒，并显示无融合能力。利用序列特异性肽和单克隆抗体，证明prM可与E蛋白的200-327位氨基酸相互作用。这种相互作用对于保护E蛋白免受由胞外途径的酸性小泡中熟化导致的不可逆的构型改变是必要的(Guirakhoo等，病毒学，191：921-931，1992)。
prM裂解为M蛋白，随即弗林蛋白酶样细胞蛋白酶释放病毒颗粒，(Stadler等，病毒学杂志，71：8475-8481，1997)，这对激活血凝活性、融合活性、和病毒颗粒的感染性是必要的。M蛋白由位于共有序列R-X-R/K-R(X是可变的)之后的它的前体蛋白(prM)分解而成，并与E蛋白一起掺入病毒的脂质包膜。
裂解序列不仅在黄病毒属中为保守序列，而且在其它非相关病毒的蛋白质，例如鼠冠状病毒的PE2、α病毒属的PE2、流感病毒的HA、和逆转录病毒的p160中也为保守序列。病毒感染性的关键在于前体蛋白的裂解，而不是颗粒的形成。据报道，在一例TBE-登革热4型嵌合体中，prM裂解位点的改变导致这种嵌合体的神经毒力降低(Pletnev等，病毒学杂志，67：4956-4963，1993)，这与以前的观察结果，即prM的有效加工对完全感染性是必要的一致(Guirakhoo等，1991，同上，1992，同上；Heinz等，病毒学，198：109-117，1994)。prM蛋白的抗体可以介导保护性免疫，这显然是因为能够中和所释放的含有一些未裂解prM的病毒颗粒。通过感染性克隆的定点诱变缺失了VEE的PE2的蛋白酶解裂解位点(4个氨基酸)(Smith等，ASTMH会议，12月7-11，1997)。缺失突变体高效复制，PE2蛋白掺入颗粒中。这种突变体在非人灵长动物中得以评价，显示100％的血清转化，并保护所有经免疫猴使之免遭致命的攻击。
                    发明概述
本发明以嵌合、活体、感染性的减毒病毒为特征，它们各由以下方面构成：
(a)第一种黄热病毒(例如，毒株17D)，表示活的、减毒疫苗病毒，其中prM-E蛋白的核苷酸序列或者被缺失、截短、或者被突变，以至于第一黄病毒的功能性prM-E蛋白不能表达，和
(b)编码第二种不同黄病毒的病毒包膜(prM-E)蛋白的核苷酸序列整合到第一种黄病毒的基因组中，以至于第二种黄病毒的prM-E蛋白由第一种黄病毒的改变的基因组表达。
因此嵌合病毒由属于第一种黄病毒的负责胞内复制的基因和基因产物，和第二种黄病毒的包膜基因和基因产物组成。由于病毒包膜含有所有的负责诱导中和抗体的抗原决定簇，用这种嵌合病毒感染的结果是产生的抗体仅仅抗第二种黄病毒。
在本发明的嵌合病毒中，用作第一种黄病毒的优选活病毒是黄热病毒。至少一种疫苗已经使用这种活的、减毒病毒；这种疫苗称为YF17D，已经在人类免疫中应用超过50年。YF17D疫苗已在大量出版物中描述，包括Smithburn等的出版物(“黄热病免疫”，世界卫生组织，p.238，1956)，以及Freestone(in Plotkin等，(编)，疫苗，第二版，W.B.Saunders，Philadelphis，1995)。另外，黄热病毒已经在基因水平得以研究(Rice等，科学，229：726-733，1985)，相关基因型和表型的资料已经建立(Marchevsky等，美国营养医学与健康杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)，52：75-80，1995)。
在本发明嵌合病毒中用作第二种黄热病毒，并因此作为免疫抗原来源的优选黄病毒包括：日本脑炎(JE)，登革热(DEN，例如1-4型登革热的任意一种)，Murray山谷脑炎(MVE)，St.Louis脑炎(SLE)，西尼罗河(WN)，蜱脑炎(TBE)，和丙型肝炎(HCV)病毒。用作第二种黄病毒的其它黄病毒包括Kunjin病毒，中欧脑炎(Central European Enecphalitis)病毒，俄罗斯春-夏脑炎(Russian Spring-Summer Encephalitis)病毒，Powassan病毒，Kyasanur森林病(Kyasanur Forest Disease)病毒，以及Omsk出血热(Omsk出血热)病毒。本发明的优选嵌合病毒中，第二种黄病毒的prM-E蛋白编码序列代入(snbstitute into)活黄热病毒的prM-E蛋白编码序列。在优选嵌合病毒中，prM-E蛋白编码序列来源于减毒病毒株，例如疫苗株。同时，如同进一步将描述的，蛋白质的prM部分可以含有防止裂解产生成熟膜蛋白的突变。
本发明还包括通过给哺乳动物施用本发明的嵌合黄病毒，预防或治疗哺乳动物(例如人)的黄病毒感染的方法；本发明的嵌合黄病毒在制备预防或治疗黄病毒感染的药物中的用途；编码本发明的嵌合黄病毒的核酸分子；以及本发明嵌合黄病毒的制备方法。
本发明具备以下优点。例如，因为它们是活体，并且正在复制，本发明的嵌合病毒可以用于产生长期保护性免疫力。因为病毒具有减毒病毒复制基因(例如，黄热17D)，得到的嵌合病毒毒力衰减到可以对人类安全使用的程度。
本发明的其它特征和优点将由下列详细描述、附图和权利要求说明。
                    附图简述
图1图示构建本发明的黄热/日本脑炎(YF/JE)嵌合病毒进行的基因操作步骤。
图2是本发明的嵌合YF/JE病毒在可接受用于制备人类疫苗的细胞培养中的一系列生长曲线。
图3是显示RMS(Research Master Seed，YF/JE SA14-14-2)和YF-Vax在MRC-5细胞中的生长比较。
图4是显示用本发明YF/JE嵌合病毒进行的小鼠神经毒力分析结果的图和表。
图5图示了产生嵌合YF/DEN-2病毒的两个质粒系统的结构图。该策略基本上与描述的YF/JE嵌合病毒的一致。
图6图示了经修饰的YF克隆的结构，该克隆被设计为缺失了部分NS1蛋白和/或在内部核糖体进入位点(IRES)的调控下表达外源蛋白。该图仅显示病毒基因组的E/NS1区。翻译终止密码子被导入包膜(E)蛋白的羧基末端。下游翻译在基因间的开放读码框(ORF)内，由IRES-1起始，驱动外源蛋白的表达(例如，HCV蛋白E1和/或E2)。第二个IRES(IRES-2)控制YF非结构区的翻译起始，其中嵌套，截短的NS1蛋白得以表达(例如，NS1del-1，NS1del-2，或NS1del-3)。NS1缺失的大小与连接于IRES-1的ORF的大小成反比。
图7是显示经YF/JE SA14-14-2嵌合疫苗免疫之小鼠的中和抗体反应图。
                         详细描述
本发明提供可以用于预防黄病毒感染之免疫法的嵌合黄病毒。下文描述了本发明的嵌合黄病毒的构建和分析，例如黄热病毒和日本脑炎(JE)、登革热1-4型(DEN1-4)、Murray山谷脑炎(MVE)、St.Louis脑炎(SLE)、西尼罗河(WN)、蜱传脑炎(TBE)、和丙型肝炎(HCV)病毒的嵌合体。
黄病毒蛋白由单一、长的开放阅读框(编码，i.a.，结构蛋白：衣壳(C)蛋白、前-膜(pr-M)蛋白、和包膜(E)蛋白，以及非结构蛋白)翻译，以及随后的一系列复杂的翻译后蛋白酶解裂解而成。如上面讨论的，本发明的嵌合黄病毒包括其中一种黄病毒的pr-M和E蛋白由另一种黄病毒的pr-M和E蛋白取代的黄病毒。因此，这些嵌合黄病毒的产生涉及两种不同黄病毒的衣壳蛋白和前-膜蛋白之间，以及包膜蛋白和非结构区(NS1)之间的新连接的产生。这些蛋白之间的裂解(C和pr-M，以及E和NS1)在黄病毒蛋白的天然蛋白酶解加工过程中发生，并需要裂解位点连接处的旁侧信号序列的存在。
在本发明的嵌合黄病毒中，优选组装成嵌合体的病毒的信号序列基本上保留，以使C和pr-M以及E和NS1蛋白之间的适当裂解可以有效发生。这些信号序列在下述的嵌合体中已经得以保留。换句话说，大量已知信号序列中的任一种经改造可连接嵌合体的C和pr-M或者E和NS1蛋白(参见，例如，von Heijne，欧洲生物化学杂志，133：17-21，1983；von Heijne，分子生物学杂志，184：99-105，1985)，或者，例如，利用已知序列为指导，本领域技术人员可以设计能够用于本发明嵌合体的其它信号序列。具体地说，例如，信号序列的最后一个氨基酸残基具有小的无电荷侧链，例如丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、或谷氨酰胺。信号序列的其它要求为本领域已知(参见，例如，von Hei jne，1983，同上；von Heijne，1985，同上)。同样，每种组装成嵌合体的病毒的信号序列可以被保留或基本上保留，以便进行适当的裂解。生产YF/JE嵌合病毒的cDNA模板的构建
本发明的下述YF/JE嵌合体的全长cDNA模板的获得，利用了早期工作者在YF复制的分子遗传分析中使用的由cDNA再生YF17D的操作中应用的类似方法。该方法由，例如，Nestorowicz等描述(病毒学，199：114-123，1994)。
简要地说，本发明的YF/JE嵌合体的获得包括以下步骤。YF基因组序列在两个质粒中(YF5’3’IV和YFM5.2)扩增，这两个质粒编码YF序列的核苷酸1-2276和8279-10861(YF5’3’IV)，以及核苷酸1373-8740(YFM5.2)(Rice等，新生物学家，1：285-296，1989)。全长cDNA模板由来源于上述质粒的合适限制性片段连接而成。这是目前确保YF序列稳定表达和产生高度特异性感染的RNA转录物的最可靠方法。
我们构建嵌合体的策略包括：由从prM蛋白开始(核苷酸478，氨基酸128)，经过E/NS1裂解位点(核苷酸2452，氨基酸817)的相应JE序列取代YF5’3’IV和YFM5.2质粒中的YF序列。除克隆JEcDNA之外，还需要以下步骤导入或除去YF和JE序列的限制性位点，以进行体外连接。再生嵌合YF(C)/JE(prM-E)病毒的模板的结构如图4所示。编码完整JE结构区(C-prM-E)的第二嵌合体用类似方法改造。JE病毒结构区的分子克隆
真正的JE结构蛋白基因的克隆由JE SA14-14-2毒株(JE活体减毒疫苗株)产生，因为这一毒株的生物学性质和分子特征已有大量记载(参见，例如，Eckels等，疫苗，6：513-518，1988；JE SA14-14-2由疾病控制中心提供，Fort Collins，Colorado和Yale虫媒病毒研究单位，Yale University，New Haven，Connecticut，它们是世界卫生组织指定的美国虫媒查询中心)。获得传代水平为PDK-5的JESA14-14-2病毒，并在LLC-MK2细胞中传代以获得足够用于cDNA克隆的病毒量。我们使用的方法包括将结构区克隆为在NheI位点(JE核苷酸1125)重叠的两段，它们随后可以用于体外连接。
从感染的LLC-MK2单层细胞提取RNA，利用逆转录酶以及反义引物(JE核苷酸序列2456-71)进行反义cDNA的第一条链合成，所述反义引物包含嵌套的XbaI和NarI限制性位点区，分别用于在开始时克隆到pBluescript II KS(+)中，随后克隆到YFM5.2(NarI)中。cDNA的第一条链合成之后，对JE的核苷酸序列1108-2471进行PCR扩增，该PCR扩增使用同样的反义引物和有义引物(JE核苷酸序列1108-1130)，所述引物包含嵌套的XbaI和NsiI限制性位点，分别用于克隆到pBluescript和YFM5.2(NarI)中。JE序列由限制性酶消化和核苷酸测序验证。JE核苷酸序列的1-1130位核苷酸来源于反义JE cDNA的PCR扩增，该扩增使用相应于JE核苷酸1116-1130的反义引物和相应于JE核苷酸1-18的有义引物，二者均含有EcoRI限制性位点。PCR片段克隆到pBluescript中，并通过核苷酸测序验证JE序列。它们合起来表示JE序列1-2471位核苷酸(1-792位氨基酸)的克隆。YF5’3’IV/JE和YFM5.2/JE衍生物的构建
为了在YF E/NS1裂解位点插入JE包膜蛋白的C末端，由E/NS1裂解位点信号酶序列的(YF的2447-2452位核苷酸，816-817位氨基酸)寡核苷酸-定点突变将唯一一个NarI限制性位点导入YFM5.2质粒，以产生YFM5.2(NarI)。对来源于插入上述突变的模板的转录物，检查其感染力，产生类似于亲代模板(约100噬斑形成单位/250纳克的转录物)的特异感染力。JE序列的1108-2471位核苷酸从几个独立的pBluescript/JE的PCR来源的克隆用单一NsiI和NarI限制性位点亚克隆到YFM5.2(NarI)中。邻近JE prM-E区的包含YF 5’非翻译区(核苷酸1-118)的YF5’3’IV/JE克隆来源于PCR扩增。
为了得到含有YF衣壳蛋白和JE prM蛋白之连接的序列，使用跨越该区的反义嵌合引物和相应于YF5’3’IV核苷酸6625-6639的有义引物，以生产PCR片段，该片段随后用作反义PCR引物，并与互补于pBluescript载体EcoRI位点上游序列的有义引物联合使用，通过位于1125位核苷酸的NheI位点，从477位核苷酸(prM蛋白的N末端)扩增JE序列(在pBluescript载体中被反向编码)。得到的PCR片段通过NotI和EcoRI限制性位点插入YF5’3’IV质粒。该构建体包括位于YF 5’-非翻译区之前的SP6启动子，其后紧跟YF(C)JE(prM-E)序列，该构建体还包括体外连接必要的NheI位点(JE核苷酸1125)。
对YFM5.2和YF5’3’IV进行改造，使它们含有用于体外连接的限制性位点
为了将JE包膜序列中的NheI位点用作体外连接的5’位点，将YFM5.2质粒中多余的NheI位点(核苷酸5459)缺失。这通过YF序列5461位核苷酸的沉默突变实现(T→C；丙氨酸，1820位氨基酸)。该位点通过与合适的限制性片段连接而插入YFM5.2，并通过与编码嵌合YF/JE序列的NsiI/NarI片段交换导入YFM5.2(NarI)/JE。
为了产生用于体外连接的单一3’限制性位点，将BspEI位点连接于AatII位点的下游，AatII位点正常用于由YF5’3’IV和YFM5.2产生全长模板。(在JE的结构序列中出现多个AatII位点，用于体外连接时排除使用该位点。)BspEI位点通过YF的8581位核苷酸沉默突变产生(A→C；丝氨酸，2860位氨基酸)，并通过与合适的限制性片段交换导入YFM5.2。该单一位点通过与XbaI/SphI片段交换插入YFM5.2/JE，并通过三段合适限制性片段的连接插入YF5’3’IV/JE(prM-E)质粒，这些限制性片段来源于母体质粒以及缺失1位和6912位核苷酸处的EcoRI位点之间的YF序列的YFM5.2(BspEI)衍生物。JE Nakayama cDNA通过交换插入YF/JE嵌合质粒
由于PCR来源的JE SA14-14-2结构区在嵌合病毒的上下文行使适当功能能力的不确定性，我们使用来源于JE Nakayama毒株的一个克隆的cDNA，该毒株在表达实验中已被详细鉴定，并且具有导入保护性免疫的能力(参见，例如，McIda等，病毒学158：348-360，1987；JE Nakayama毒株由疾病控制中心提供，Fort Collins，Colorado，和Yale虫媒病毒研究单位，Yale University，NewHaven，Connecticut)。Nakayama cDNA通过合适的限制性位点(HindIII到PvuII和BpmI到MunI)插入YF/JE嵌合质粒，以替代两个质粒系统中的全部prM-E区，除了49位的一个氨基酸，丝氨酸，它被完整保留下来以便利用NheI位点进行体外连接。对Nakayama克隆的全部JE区进行测序以便验证cDNA是否真正被取代(表2)。全长cDNA模板的产生，RNA转染，以及感染性病毒的回收
生产全长cDNA模板的方法基本上与Rice等的描述相同(新生物学家1：285-96，1989)(参见图1)。对于嵌合模板，用NheI/BspEI消化质粒YF5’3’IV/JE(prM-E)和YFM5.2/JE，然后在T4 DNA连接酶存在下，利用50纳克纯化片段进行体外连接。连接产物用XhoI线性化，从而可以进行失控转录。用50纳克纯化模板合成SP6转录产物，通过掺入3H-UTP定量，RNA的完整性通过非变性琼脂糖凝胶电泳验证。该方法的产量范围为每次反应产生5-10微克RNA，它们中的大多数为全长转录产物。按照Rice等对YF17D的描述(同上)在阳离子脂质体的存在下进行RNA转录产物的转染。在实验开始，LLC-MK2细胞用于转染和定量病毒，因为我们已经确定该细胞对YF和JE亲代毒株的复制和噬菌斑形成是许可的。表1例举了利用脂转染法(GIBCO/BRL)作为转染载体的转染实验的主要结果。Vero细胞系也已经常规用于制备感染性病毒贮存物、表征标记蛋白、以及中和实验。嵌合cDNA模板的核苷酸序列
对含有嵌合YF/JE cDNA的质粒进行克隆的JE部分的序列分析，以验证SA14-14-2和Nakayama包膜蛋白的正确序列。表2显示这些构整体与报道序列(McAda等，同上)之间核苷酸序列差异的比较。嵌合YF/JE病毒的结构和生物学特征
通过由感染的单层细胞收获到的病毒RNA的RT/PCR分析验证从转染实验回收得到的嵌合YF/JE病毒的基因组结构。进行这些实验是为了消除转染过程中病毒贮存物被污染的可能性。为了进行这些实验，使用第一代病毒起始感染循环，以便消除由于残存的转染病毒RNA存在而产生的任何可能的假产物。利用YF和JE特异性引物对YF/JE(prM-E)-SA14-14-2或YF/JE(prM-E)-Nakayama嵌合体感染的细胞的总RNA提取物进行RT-PCR，所述引物允许以两个约1千碱基大小的PCR产物回收全部结构区。然后，利用SA14-14-2和Nakayama序列中可区别这些病毒的预定位点，通过限制性酶消化分析这些产物。使用该方法，确定病毒RNA是嵌合的，经证实回收到的病毒具有合适的限制性位点。然后通过跨越嵌合YF/JE C-prM连接的循环序列分析确证真正的C-prM边界在序列水平上是完整的。
通过与JE-特异性抗血清的免疫沉淀以及利用YF和JE-特异性抗血清进行的噬菌斑减少中和实验验证两个嵌合体中JE包膜蛋白的存在。利用JE E蛋白的单克隆抗体对经嵌合体感染之LLC-MK2细胞的35S-标记的提取物进行免疫沉淀，显示JE包膜蛋白可以作为55kD的蛋白被回收，然而同样的抗血清不能对YF感染细胞的蛋白质发生免疫沉淀。JE和YF超免疫血清证明均能与两个包膜蛋白交叉反应，但是蛋白之间的大小差异(YF＝53kD，未糖基化；JE＝55kD，糖基化)可以重复观察到。在免疫沉淀条件下使用YF单克隆抗体不令人满意，因此，该分析中的特异性依赖于JE单克隆抗体。利用YF和JE-特异性超免疫腹水(ATCC)和YF-特异性纯化IgG(单抗2E10)对嵌合病毒以及YF和JE SA14-14-2病毒进行噬菌斑减少中和实验(PRNT)。在这些实验中(表3)观察到与对照病毒相比，对于嵌合体，噬菌斑减少50％之滴度下的抗血清显示出显著差异。因此，中和反应需要的表位在感染性嵌合YF/JE病毒中得到表达。
细胞培养中的生长特征
在来源于灵长类动物和蚊子的细胞系中定量检查了上述嵌合体的生长能力。图2例举低复数感染(low multiplicity infection)(0.5噬斑形成单位/细胞)后，在LLC-MK2细胞上嵌合体的累积生长曲线。该实验中，使用YF5.2iv(克隆的衍生物)和JE SA14-14-2(未克隆)病毒进行比较。两种嵌合病毒都达到比各自亲代病毒高约一个对数的最大病毒产量。对于YF/JE SA14-14-2嵌合体，病毒产量峰比YF/JE Nakayama嵌合体迟12小时(50小时对38小时)出现。对于上述细胞系，YF/JE Nakayama嵌合体比YF/JE SA14-14-2嵌合体表现明显更强的细胞病变作用。对C6/36细胞低复数感染后(0.5噬斑形成单位/细胞)，进行类似实验。图2也例举了在这种无脊椎动物细胞系中病毒的生长动力学。该实验中收获病毒的各点均得到类似的病毒产量，进一步支持这样的观点，即嵌合病毒的复制效力没有被削弱。
RMS(YF/JE SA14-14-2)与YF 17D疫苗在MRC-5细胞中的生长动力学比较
进行下述实验评价可接受用作人类疫苗的侯选疫苗在细胞系中的增殖能力。商购的黄热病17D疫苗(YF-Vax)得自Connaught实验室，Swiftwater，PA。MRC-5(二倍体人胚肺细胞)购自ATCC(171-CCL，Batch#：F-14308，第18代)，并在EMEM、2mM L-谷氨酰胺、调整到含1.5g/L碳酸氢钠、0.1mM非必需氨基酸、和10％FBS的Earle’s BSS中生长。
为了比较RMS(Research Master Seed，YF/JE SA14-14-2)和YF-Vax的生长动力学，细胞生长到90％的铺满度，然后用感染复数为0.1pfu的RMS或YF-Vax感染。因为MRC-5细胞通常生长较缓慢，因此这些细胞接种后保留10天。每日留样，冷冻7-10天，感染力由在Vero细胞中的噬菌斑检测确定。
YF-Vax和YF/JE嵌合体在MRC-5细胞中生长到中度滴度(图3)。YF-Vax在第二天获得的峰滴度为~4.7log10pfu，RMS略低，6天后的峰滴度为4.5log10pfu。对正常成年小鼠的神经毒力实验
通过刚成年小鼠脑内接种，分析YF/JE SA14-14-2嵌合体的毒性。对每组10只小鼠(4周龄的雄性和雌性ICR小鼠，每组各5只)以10,000噬斑形成单位接种YF/JE SA14-14-2嵌合体、YF5.2iv、或JESA14-14-2，每日观察，连续3周。该实验的结果由图4说明。接种YF5.2iv亲代的小鼠接种后约1周死亡。接种JE SA14-14-2亲代或嵌合体的小鼠没有观察到致死症状或疾病症状。注射时测定用于该实验的接种物的滴度，测定存活小鼠小组中和抗体的存在，以确定动物已经被感染。在这些实验中，抗JE SA14-14-2病毒的滴度与接种该毒株或嵌合体的动物产生的滴度近似。
其它研究YF/JE SA14-14-2嵌合体在小鼠体内的神经毒力的实验结果如表4说明。这些实验中，接种YF5.2iv的鼠在7-8天内全部死亡。相反，接种YF/JE SA14-14-2的小鼠接种后两周没有观察到死亡。
研究YF/JE嵌合体的神经侵入力和致病性的实验结果如表5说明。这些实验中，以10,000到1百万噬斑形成单位的剂量经腹膜内途径给3周龄小鼠接种嵌合病毒。接种YF/JE Nakayama或YF/JESA14-14-2的小鼠在接种后3周内没有观察到死亡，表明外周接种后病毒不能产生疾病症状。接种YF/JE SA14-14-2的小鼠产生抗JE病毒的中和抗体(图7)。生产黄热/登革热(YF/DEN)嵌合病毒的cDNA模板的构建
嵌合黄热/登革热(YF/DEN)病毒的获得如下所述，原则上，与上述YF/JE嵌合体的构建方法相同。其它黄病毒嵌合体可以利用天然或经改造的限制性位点以及，例如，如表6所示的寡核苷酸引物，以类似方法构建。YF/DEN嵌合病毒的构建
虽然已经研制出几种登革热病毒的分子克隆，但是还是经常遇到病毒cDNA在质粒系统中的稳定性以及回收到的病毒的复制效能的问题。我们选择使用澳大利亚，Clayton，Monash大学，分子生物学系，Peter Wright博士研制的DEN-2克隆，因为该系统对于再生病毒相对有效，并利用了类似我们自己方法学的双质粒系统。该DEN-2克隆的完全序列已有公开，从而促进了嵌合YF/DEN模板的构建，因为仅需要对YF克隆作少许修饰。有关步骤如下所示。
与YF5.2iv和YF/JE病毒的双质粒系统类似，YF/DEN系统使用DEN-2包膜蛋白(E)内唯一的限制性位点作为扩增两个质粒内的结构区(prM-E)的转效点，所述结构区在下文被称为YF5’3’IV/DEN(prM-E’)和YFM5.2/DEN(E’-E)(见图5)。嵌合模板的两个体外连接限制性位点为AatII和SphI。DEN E蛋白序列的3’部分的受体质粒为YFM5.2(NarI[+]SphI[-])。该质粒包含E/NSI连接处的NarI位点，它用于插入JE E蛋白的羧基末端。通过沉默定点诱变缺失NS5蛋白区的额外SphI位点以进一步修饰该质粒。这使得DEN-2序列可以通过简单定向克隆由唯一SphI位点至NarI位点处插入。DEN-2cDNA的合适片段为Wright博士提供的DEN-2克隆MON310的PCR产物。PCR引物包括SphI位点旁侧的5’引物和与E/NSI连接处的信号酶位点上游紧邻的DEN-2核苷酸同源的3’引物，其由产生新位点的取代物取代信号酶位点，并且导入NarI位点。然后将得到的1170个碱基对的PCR片段导入YFM5.2(NarI[+]SphI[-])。
用嵌合PCR引物将包含prM和E蛋白氨基末端部分的DEN-2克隆的5’部分插入YF5’3’IV质粒。该嵌合引物，插入反义YF C蛋白的3’末端和DEN-2prM蛋白的5’末端，与YF5’3’IV质粒的SP6启动子旁侧的有义引物联合用于制备771个碱基对的PCR产物，它含有代表DEN-2prM序列的20个碱基的延伸。然后该PCR产物用于引发DEN-2质粒与代表DEN-2序列1501-1522并位于SphI旁侧的3’引物连接，以产生1800个碱基对的终PCR产物，该产物包括从NotI位点开始，经过SP6启动子、YF5’非翻译区和YF C蛋白的YF序列，该序列与DEN-2prM-E1522序列紧邻。利用NotI和SphI位点将上述PCR产物连接到YF5’3’IV中，以产生YF5’3’IV/DEN(prM-E)质粒。其它黄病毒的嵌合模板的构建
生产编码嵌合YF/MVE、YF/SLE、YF/WN、YF/TBE病毒的全长cDNA模板的方法与上述用于YF/DEN-2系统的方法类似。表6例举基于YF17D之嵌合病毒的制备方法的特征。表6还显示了用于体外连接的单一限制性位点、以及用于改造C/prM和E/NSI连接的嵌合引物。这些异源黄病毒的cDNA是易于得到的(MVE：Dalgarno等，分子生物学杂志187：309-323，1986；SLE：Trent等，病毒学156：293-304，1987；TBE：Mandl等，病毒学166：197-205，1988；登革热1：Mason等，病毒学161：262-267，1987；登革热2：Deubel等，病毒学155：365-377，1986；登革热3：Hahn等，病毒学162：167-180，1988；登革热4：zhao等，病毒学155：77-88，1986)。
改造其它嵌合病毒的另一种方法是通过PCR来源的限制性片段的平端连接产生C/prM连接，该限制性片段含有适应该连接的末端，以及用于导入YF5’3’IV或中间质粒例如pBS-KS(+)的合适限制性位点旁侧的5’和3’末端。嵌合寡核苷酸或平端连接的应用选择，根据有问题的病毒包膜蛋白编码区内的单一限制性位点的可用性而改变。编码HCV抗原的YF病毒的构建
因为HCV的结构蛋白E1和E2与上述黄病毒的结构蛋白不同源，表达这些蛋白的方法包括在基因组的非必要区内插入，以便所有这些蛋白随后可以与黄热蛋白一起在感染细胞的病毒复制期间共表达。用于插入蛋白的目标区是NS1蛋白的N末端部分，因为病毒复制不需要完整的NS1蛋白。由于存在超过正常基因组大小(约10,000个核苷酸)的异源序列，而导致YF基因组稳定性的潜在问题，可以使用下述检测方法。另外，上述嵌合YF/黄病毒系统中NS1的缺失也许是有利的，因为该蛋白的部分缺失可以消除对与抗NS1抗体有关的YF的免疫力，因此可以避免如果给定受体需要一种以上嵌合疫苗，或者如果YF疫苗以前已经使用过或者需要进一步使用情况下的载体免疫问题。
该方法包括在YFM5.2质粒的NS1编码区内产生一系列框内缺失，与E末端的翻译终止密码子连接，并产生一系列双IRES(内部核糖体进入位点)。一个IRES紧接终止子的下游，允许E区和NS1区之间的开放读码框得以表达。第二个IRES从截短的NS1蛋白开始翻译，用于表达其余的YF非结构多蛋白。检测这些衍生物的感染病毒的回收率，在具有最大缺失的构建体的第一个IRES处插入外源序列(例如，HCV蛋白)。这种特殊构建体也可以作为判断是否在上述表达prM-E的YF/黄病毒嵌合体病毒中缺失NS1将影响载体-特异性免疫的基础。
编码E1、E2、和/或E1加E2 HCV蛋白的核苷酸的插入受NS1蛋白能够承受的缺失大小限制。基于此，截短的HCV蛋白可以用于在修饰的YF克隆内增强稳定性。用紧接IRES之后的N-端信号序列和C末端终止密码子改造HCV蛋白。这种构建体将使HCV蛋白进入发挥细胞分泌作用的内质网。这种构建方法如图6所示。编码I型基因型的HCV蛋白的质粒可以用于这种构建，例如，从华盛顿大学Charles Rice博士处获得的HCV质粒(Grakoui等，病毒学杂志，67：1385-1395，1993)，他已经在加工系统中和一种有复制能力的全长HCV克隆内表达出该病毒的该区。PrM裂解缺失突变体用作候选的黄病毒减毒疫苗
本发明包括的其它嵌合病毒包括防止prM裂解的突变，例如在prM裂解位点的突变。例如，目标黄病毒的感染克隆(例如登革热、TBE、SLE等)的prM裂解位点可以经定点诱变进行突变。裂解位点的部分或所有氨基酸可以如上述缺失或取代。然后含有突变的prM-E基因的核酸片段可以利用上述方法插入黄热病毒载体。prM缺失可以伴随也可以不伴随其它减毒突变，例如，E蛋白的突变，然后插入黄热病毒。作为候选疫苗，这些突变体比单取代突变体具有优势，因为这些突变体几乎不可能恢复缺失序列并恢复毒性。
按照布达佩斯条约的规定，本发明的下列嵌合黄病毒由美国典型培养物保藏中心(ATCC)(Rockville，Maryland，U.S.A.)保藏，授予保藏日为：1998年1月6日：嵌合黄热17D/2型登革热病毒(YF/DEN-2；ATCC登记号为：ATCC VR-2593)和嵌合黄热17D/日本脑炎SA14-14-2病毒(YF/JE A1.3；ATCC登记号为：ATCC VR-2594)。
                    表1.YF/JE嵌合体的特征克隆         产量     感染力         PBS       RNAse     DNAse
         (μg)    噬菌斑/100ng   log滴度   log滴度   log滴度
                  LLC-MK2        VERO      VERO      VEROYF5.2iv      5.5      15             7.2       0         7YF/JE-S      7.6      50             6.2       0         6.2YF/JE-N      7        60             5         0         5.4
表2.JE毒株与YF/JE嵌合体的序列比较病毒           E      E      E      E      E      E      E     EJE             107    138    176    177    227    243    244   279SA14-14-2YF/JE          F      K      V      T      S      K      G      MSA14-14-2YF/JE          F      K      V      A      S      E      G      MNAKJE NAK         L      E      l      T      P      E      E      KJE SA14        L      E      l      T      P      E      E      K
           L      E      l      T      S      E      G      K
表3.YF/JE嵌合体的噬斑减少中和滴度病毒             无免疫  YF腹水   JE腹水  无免疫   YF IgG
             腹水                     IgGYF5.2iv          ＜1.3   3.7      ＜1.3   ＜2.2    ＞4.3JE SA 14-14-2    ＜1.3   ＜1.3    3.4     ＜2.2    ＜2.2YF/JE SA14-14-2  ＜1.3   ＜1.3    3.1     ＜2.2    ＜1.9YF/JE Nakayama   ＜1.3   ＜1.3    3.4     ＜2.2    ＜2.2
表4.YF/JE SA14-14-2嵌合体对3周龄雄性ICR小鼠的神经毒力
                  log剂量I.C.         ％死亡率YF5.2iv                    4        100       (7/7)YF/JE SA 14-14-2           4         0        (0/7)YF/JE SA 14-14-2           5         0        (0/7)YF/JE SA 14-14-2           6         0        (0/8)
表5.YF/JE嵌合体对3周龄雄性ICR小鼠的神经侵入力
                  log剂量(腹膜内)       ％死亡率YF/JE Nakayama        4              0        (0/5)YF/JE Nakayama        5              0        (0/4)YF/JE Nakayama      6          0       (0/4)YF/JE SA 14-14-2    4          0       (0/5)YF/JE SA 14-14-2    5          0       (0/4)YF/JE SA 14-14-2    6          0       (0/4)
表6.YF/黄病毒嵌合体的改造病毒      嵌合C/prM连接             嵌合E/NSI连接               5’      3’  删除或(产生)
                                                            连接     连接   的位点YF/WN     X-cactgggagagcttgaaggtc   aaagccagttgcagccgcggtttaa   Aatll    Nsil
      (SEQ ID NO：1)            (SEQ ID NO：2)YF/DEN-1  X-aaggtagactggtgggctccc   gatcctcagtaccaaccgcggtttaa  Aatll    Sphl   Sphl in DEN
      (SEQ ID NO：3)            (SEQ ID NO：4)YF/DEN-2  X-aaggtagattggtgtgcattg   aaccctcagtaccacccgcggtttaa  Aatll    Sphl
      (SEQ ID NO：5)            (SEQ ID NO：6)YF/DEN-3  X-aaggtgaattgaagtgctcta   acccccagcaccacccgcggtttaa   Aatll    Sphl   Xhol in DEN
      (SEQ ID NO：7)            (SEQ ID NO：8)                              (Sphl in DEN)YF/DEN-4  X-aaaaggaacagttgttctcta   acccgaagtgtcaaccgcggtttaa   Aatll    Nsil
      (SEQ ID NO：9)            (SEQ ID NO：10)YF/SLE    X-aacgtgaatagttggatagtc   accgttggtcgcacccgcggtttaa   Aatll    SphI    Aatll in SLE
      (SEQ ID NO：11)           (SEQ ID NO：12)YF/MVE    X-aatttcgaaaggtggaaggtc   gaccggtgtttacagccgcggtttaa  AatII    Agel    (Agel in YF)
      (SEQ ID NO：13)           (SEQ ID NO：14)YF/TBE    X-tactgcgaacgacgttgccac   actgggaacctcacccgcggtttaa   Aatll    Agel    (Agel in YF)
      (SEQ ID NO：15)           (SEQ ID NO：16)
1，2：这两栏分别说明用于产生嵌合YF/黄病毒引物的寡核苷酸，所述引物对应于C/prM或E/NS1连接。(见正文)。X＝YF衣壳蛋白的羧基末端编码序列。下化线区对应NarI位点(反义--ccgcgg)上游紧邻的目标异源序列。该位点允许PCR产物插入产生全长cDNA模板必须的Yfm5.2(NarI)质粒。其它核苷酸为异源病毒专属的。寡核苷酸引物以5’至3’方向列出。
3，4：列出用于产生限制性片段的单一限制性位点，产生的限制性片段可以体外分离和连接以制备全长嵌合cDNA模板。因为一些序列不含有满意的位点，某些情况下对适当位点的改造是必要的(脚注5)。
5：圆括号中是必须产生在YF骨架中或者异源病毒中以保证体外连接有效的限制性酶位点。不在圆括号中的位点必须除去。所有这些修饰均通过用于各自克隆的cDNA的沉默突变实现。空栏说明不需要对cDNA克隆进行修饰。
                     其它实施方案
其它实施方案在本发明权利要求范围内。例如，其它具有医药重要性的黄病毒的prM-E蛋白基因可插入黄热疫苗病毒骨架，产生抗其它具有医药重要性的黄病毒的疫苗(参见，例如，Monath等，“黄病毒，”在病毒学中，Fields(编)，Raven-Lippincott，New York，1995，第1卷，961-1034)。
可以获得的其它黄病毒(其基因可以插入本发明的嵌合载体)的实例包括：例如，Kunjin，、中欧脑炎、俄罗斯春-夏脑炎、Powassan、Kyasanur森林病、和Omsk出血热病毒。另外，甚至关系较远的病毒的基因也可以插入黄热疫苗病毒，用以构建新疫苗。疫苗的制备和使用
本发明的疫苗可以采用本领域普通技术人员容易确定的剂量和给药方法给药。例如，可采用与黄热17D疫苗同样的方式施用和配制本发明疫苗，例如，作为感染的鸡胚组织的澄清悬液，或者作为嵌合黄热病毒感染的细胞培养物的收获液。因此，活的、减毒嵌合病毒可以制成含100到1,000,000感染单位(例如，噬斑形成单位或组织培养感染剂量)的无菌水溶液，单剂量体积为0.1到1.0ml，通过，例如肌内、皮下、或真皮内途径给药。另外，因为黄病毒可以经粘膜途径，例如口腔途径，感染人类宿主(Gresikova等，“蜱-传脑炎，”在《虫媒病毒，生态学和流行病学》中，Monath(编)，CRC出版社，Boca Raton，Florida，1988，第6卷，177-203)，所以本疫苗病毒可以通过粘膜途径给药，以获得保护性免疫反应。本疫苗可以作为初级预防药物对可能存在黄病毒感染风险的成人或儿童使用。本疫苗也可以用作治疗黄病毒感染病人的二级药物，通过刺激抗黄病毒的免疫反应实现。
需要将黄热疫苗载体系统用于免疫宿主抗一种病毒(例如，日本脑炎病毒)，以后再用不同的嵌合构建体再次免疫同样的宿主抗第二种或第三种病毒。嵌合黄热系统的显著优点在于载体将不引起对其自身的强烈免疫作用。以前黄热病毒的免疫也将不排除嵌合疫苗用作异源基因表达的载体。这些优点是因为去除了部分黄热疫苗中编码中和(保护性)黄热病抗原的E基因，并用另一种不具备对黄热病交叉保护的异源基因代替。虽然YF17D病毒的非结构蛋白可以起到保护作用，例如，通过引发抗NS1的抗体，其与补体依赖性抗体介导的感染细胞的溶解有关(Schlesinger等，免疫学杂志，135：2805-2809，1985)，或者通过诱导对NS3或其它病毒蛋白的细胞毒性T细胞反应，但是看起来这些反应将不会消除活病毒疫苗刺激中和抗体的能力。这一结论由下列事实支持：(1)以前感染JE病毒的个体对YF17D的免疫反应类似于以前不曾感染JE病毒的个体，(2)以前接种YF17D疫苗的个体再次免疫，表现为中和抗体滴度升高(Sweet等，美国营养学、医学和卫生学杂志(Am.J.Trop.Med.Hyg.)11：562-569，1962)。因此，嵌合载体可以对以前由于自然感染或接种疫苗而接受黄热病毒免疫的人群使用，也可以重复使用，或者用几种不同的构建体同步或连续免疫，上述构建体包括黄热嵌合体，其中含有来自，例如日本脑炎、St.Lousis脑炎、或西尼罗河病毒的插入物。
应用疫苗时，可以使用本领域技术人员已知的佐剂。能够增强嵌合疫苗免疫力的佐剂包括：例如，脂质体制剂、合成佐剂，例如皂甙(例如，QS21)、胞壁酰二肽、单磷脂酰脂类A、或聚膦嗪。虽然这些佐剂通常用于增强灭活疫苗的免疫反应，但是它们也能够用于活疫苗。当嵌合疫苗经粘膜途径，例如经口腔途径给药时，例如E.coli(LT)的热-不稳定毒素或LT的突变体衍生物等粘膜佐剂是有效的佐剂。另外，具有佐剂活性的编码细胞因子的基因可以插入黄热病毒载体。因此，编码细胞因子的基因，例如GM-CSF、IL-2、IL-12、IL-13、或IL-5可以与异源黄病毒基因一起插入，用于制备产生增强的免疫反应的疫苗，或者用于调节更为特异性地对细胞、体液、或粘膜的免疫反应。除疫苗应用外，如同本领域的技术人员能够容易地理解到的那样，本发明的载体可以用于基因治疗方法，用以将治疗基因产物导入病人细胞。在这些方法中，编码治疗基因产物的基因插入载体，例如，代替编码prM-E蛋白的基因。
黄热病毒载体系统的其他优点还在于黄病毒在细胞质中复制，因此病毒复制过程与病毒基因组整合入宿主细胞无关(Chambers等，(1990)“黄病毒基因组结构、表达、和复制，”微生物学年度综述44：649-688)，并因此提供了一种重要的安全方法。
本文引证的所有参考文献全文列入本文作为参考。序列表(1)一般资料：(i)申请人：OraVax，有限公司，等。(ii)发明题目：嵌合黄病毒疫苗(iii)序列数：16(iv)通讯地址：
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Claims (21)

1.嵌合活体、感染性、减毒病毒，包括：
黄热病毒，其中编码prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突变，以至功能性黄热病毒prM-E蛋白不能表达出来，和
第二种不同黄病毒之编码prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黄热病毒基因组，以至所述第二种黄病毒的所述prM-E蛋白得以表达。
2.权利要求1的嵌合病毒，其中所述第二种黄病毒为日本脑炎(JE)病毒。
3.权利要求1的嵌合病毒，其中所述第二种黄病毒为选自1-4型登革热病毒中的一种登革热病毒。
4.权利要求1的嵌合病毒，其中所述第二种黄病毒选自Murray山谷脑炎病毒、St.Louis脑炎病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中欧脑炎病毒、俄罗斯春-夏脑炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血热病毒。
5.权利要求1的嵌合病毒，其中编码所述第二种不同黄病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代编码所述黄热病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
6.权利要求1的嵌合病毒，其中编码所述第二种不同黄病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解产生M蛋白的突变。
7.权利要求1的嵌合病毒，其中C/prM和E/NS1连接处的信号序列在所述嵌合黄病毒的结构中保留。
8.嵌合活体、感染性、减毒病毒在制备预防或治疗黄病毒感染病人的药物中的用途，其中嵌合的、活体、感染性、减毒病毒包括：
黄热病毒，其中编码prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突变，以至功能性黄热病毒prM-E蛋白不能表达出来，和
编码第二种不同黄病毒prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黄热病毒基因组，以至所述第二种黄病毒的所述prM-E蛋白得以表达。
9.权利要求8的用途，其中所连第二种黄病毒为日本脑炎(JE)病毒。
10.权利要求8的用途，其中所述第二种黄病毒为选自1-4型登革热病毒中的一种登革热病毒。
11.权利要求8的用途，其中所述第二种黄病毒选自Murray山谷脑炎病毒、St.Louis脑炎病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中欧脑炎病毒、俄罗斯春-夏脑炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血热病毒。
12.权利要求8的用途，其中编码所述第二种不同黄病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代编码所述黄热病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
13.权利要求8的用途，其中编码所述第二种不同黄病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解产生M蛋白的突变。
14.权利要求8的用途，其中C/prM和E/NS1连接处的信号序列在所述嵌合黄病毒的结构中保留。
15。编码嵌合活体、感染性、减毒病毒的核酸分子，所述病毒包括：
黄热病毒，其中编码prM-E蛋白的核苷酸序列或者缺失、截短、或者突变，以至功能性黄热病毒prM-E蛋白不能表达出来，和
第二种不同黄病毒编码prM-E蛋白的核苷酸序列整合至所述黄热病毒基因组，以至所述第二种黄病毒的所述prM-E蛋白得以表达。
16.权利要求15的核酸分子，其中所述第二种黄病毒为日本脑炎(JE)病毒。
17.权利要求15的核酸分子，其中所述第二种黄病毒为选自1-4型登苹热病毒中的一种登革热病毒。
18.权利要求15的核酸分子，其中所述第二种黄病毒选自Murray山谷脑炎病毒、St.Louis脑炎病毒、西尼罗河病毒、蜱传脑炎病毒、丙型肝炎病毒、Kunjin病毒、中欧脑炎病毒、俄罗斯春-夏脑炎病毒、Powassan病毒、Kyasanur森林病病毒、和Omsk出血热病毒。
19.权利要求15的核酸分子，其中编码所述第二种不同黄病毒prM-E蛋白的核苷酸序列取代编码所述黄热病毒prM-E蛋白的核苷酸序列。
20.权利要求15的核酸分子，其中编码所述第二种不同黄病毒的所述prM-E蛋白的所述核苷酸序列包括防止prM裂解产生M蛋白的突变。
21.权利要求15的核酸分子，其中C/prM和E/NS1连接处的信号序列在所述嵌合黄病毒的结构中保留。
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