HU228705B1 - Chimeric flavivirus vaccines - Google Patents

Chimeric flavivirus vaccines Download PDF

Info

Publication number
HU228705B1
HU228705B1 HU0002139A HUP0002139A HU228705B1 HU 228705 B1 HU228705 B1 HU 228705B1 HU 0002139 A HU0002139 A HU 0002139A HU P0002139 A HUP0002139 A HU P0002139A HU 228705 B1 HU228705 B1 HU 228705B1
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
virus
protein
prm
chimeric
flavivirus
Prior art date
Application number
HU0002139A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas P Monath
Farshad Guirakhoo
Thomas J Chambers
Original Assignee
Univ St Louis
Acambis Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ St Louis, Acambis Inc filed Critical Univ St Louis
Publication of HUP0002139A2 publication Critical patent/HUP0002139A2/hu
Publication of HUP0002139A3 publication Critical patent/HUP0002139A3/hu
Publication of HU228705B1 publication Critical patent/HU228705B1/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5258—Virus-like particles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/24011—Flaviviridae
    • C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
    • C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Description

A találmány tárgyát fertőző-, legyengített vírusok képezik, amelyak flavivirusok okozta .betegségek ellen vakcinákként alkalmazhatók..
A flavivírus család jő néhány tagja folyamatos vagy potenciális fenyegetést jelent a globális közegészségügy számára. így például a japán eneephalítis súlyos közegézségügyi problémát jelent, mivel a Távol-Keleten veszélyeztetett emberek milliói vannak kitéve ennek a betegségnek. A dengue-láz vírusa, amely becslések szerint évente 100 millió elsődleges dangua-lázzal járó megbetegedést, és több mint 450 ezer gyomor-vérzéses dengue-iázzal járó megbetegedést okoz. világszerte, az emberszabásúak közvetítette emberi betegségek közül egyedülálló módon a legjelentősebbé vált. Egyéb flavivirusok folyamatosan további, különböző természetű endemikus betegségeket okoznak és - klimabe.il,
Ak ta s zámunk: 90570-9259/32 vírushordozó populációból! és az emberi tevékenység .által okozott környezeti zavarókból! változások eredményeképpen ~ új területeken is felbukkanhatnak. A flavivírusok közé tartozik például a St. Louis encephalitisvírus, amely elszórtan jelentkező, de súlyos akut megbetegedéseket okoz az Egyesült Államok kösépnyugsti, délkeleti és nyugati részén? a Nyugaf-Níius-virus, amely lázzal járó, alkalmanként akut eneephalitisszel súlyosbított betegséget okoz, és széles körben elterjedt Afrikában, a Közel-Keleten, a korábbi Szovjetunió területén ás Európa egyes részein; a Murray Vailey encephalitisvírus, amely endemikus idegrendszeri megbetegedéseket okoz Ausztráliában; továbbá a kullancs által terjesztett encephalitisvírus, amely a korábbi Szovjetunió területén és Kelet-Európábán mindenfelé elterjedt, ahol az Izodesek közé tartozó kullancsvektora elterjedt és ezeken a területeken, az encephalitis súlyos formájáért feli hepati.tis-C vírus (HCV) a fiavivlrus. család további egy tagja, amelynek genotsí szerveződése és replikációs stratégiája bár hasonló, nea azonos a fent amiített íiavivirusokéval. A HCV leginkább parenteráiis úton jut be a szervezetbe, a krónikus hepatitisszel hozható összefüggésbe, amely cirrózissá és hepstocellurális karcinőmává alakulhat át és az ortotopikus transzplantációt igénylő májbetegségek egyik legfőbb okozója az Egyesült Államokban.
A Fíavívlrídse család különbözik az alfavírusoktól (pl. WEE, VSE, EES, SFV, stb.) és jelenleg három nemzetsége (genus) ismert, a fl&vi vírusok, a pestivírnsok νχ ♦ X * ♦ [„pestivíruses) , és a hepatitis C vírusok, A flavivirusok teljes mértékben processzálódétt érett virionjaí három strukturális proteint tartalmasnak, a burokfehérjét (E), a kapsziáfehérjét (C) és a membrántehérjét (N) , továbbá hét nem strukturális fehérjét (MSI, NS2A, NS28, NS3, NS4A, NS4S és NSo). A fertőzött sejtekben található flavivirionok el ©membrán fehérjét „pre-membrane protein, prM) tartalmaznak, amely a M~fehérje prekurzora.
Miután a virionok a gazdasejt receptoraihoz kötődnek, az endoszömák savas pH-jóval érintkezve az E-fehérje irreverzibilis, konformációs változáson megy keresztül, amely az endocltözlsban résztvevő vezikulumok és a vir ionokat burkoló kettős rétegek között fúziót eredményez. Ennek során a vírális- genom bejut a gazdasejt citoszóljába. A kullancs által hordozott eneephalítis („tick-borne eneephalítis, TBE) prM-tartalmú vírusai nem képesek a fúzióra, ami azt jelzi, hogy a prM proteoütikus processzálódása szükséges a fúzióra képes és teljes mértékben fertőző virionok keletkezéséhez [Guirakhoo és mtsai., J. Gén.
vi rol 5t. 2), 333—338 (1991.)} . A vírus replíkációs ciklusának késői szakaszában ammónium-kloridot alkalmazva a p-rM-tartalmü Murray Val.ley eneephalítis. (MVE> vírusokat állítottak elő, és kimutatták, hogy képtelenek a fúzióra. Szekvehciaspecifikus peptidek és monoklonális antitestek alkalmazásával igazolták azt is, hogy a prM kölcsönhat a F,~ fehérje 200-32? aminosavaival- Sz a kölcsönhatás szükséges ahhoz, hogy megvédje az E-fehérj ét az exocítösís-űtvonai savas vezikóláiban bekövetkezett érési folyamat okozta kon-
formáeiós változásoktól. (Guirakhoo és mtsai., Virology 191f 921-931 11992} j.
A prM-fehérjének M-fehérjévé történő elhasadása nem sokkal a vírionok felszabadulása előtt következik he. A hasítást egy fu.rínszerű cellurális proteás (Stadler és mtsai., 3. Vírol., 71, 8475-8481 (1997)} végzi, .amely szükséges ahhoz, hogy aktiválja a virionok hemaglutiláló aktivitását, fúziót kiváltó (fuzogén) aktivitását és fertőzőképességét. Iáfehérje preku.r2orfehérjégéről (prM| az R-X-R/K-R (X változhat) konszenzusszekvencia után hasad ie és a E-íehérjével beépül a vírus lípidburkába.
A hasítási szekvenciák, nem csupán a flavivírusok között konzerváltak, hanem más nea rokon, vírusok fehérjéiben Is. Ilyen például az egér-koronavírusok PE2-fehérjéje, az ai favírusok Pü2~£e.hér jé je, az influenzavírusok HA-fehérjéje és a retrovirusok pl60-fehérjéje. A prekurzorfehérje hasadása létfontosságú a vírus fertőzöképsssége szempontjából, a részeeskekialakulás szempontjából azonban nea. Kimutatták, hogy a TBE-dengue-láz 4-es számú kimérája esetében a prM hasítási helyében bekövetkezett változás a kimére csökkentett mértékű neuroviruienciáját okozta (Pletnev és mtsai., J. Virol., 67, 4956-4963 (1.9.93}}, amely összhangban van azzal a korábbi megfigyeléssel, hogy a prM hatékony processzálódása szükséges a teljes fertözőképességhez (Guirakhoo és mtsai., (1991), lásd fent; (1992) lásd fent; Heinz és mtsai., Virology 198, 109-117 (1994}}. A prMfehérje elleni antitestek közvetíthetnek védőimmunitást, nyilvánvalóan a valamennyi hasitat lan prM-et tartalmazó, » * kibocsátott vírionok közömbösítésének köszönhetően. A VEEbőí származó P.E-2 proteolitíkus hasítási helyet (4 aiaíncsav) a fertőző klón helyspecifikus mutagerxezisévei del.etáiták (Smlth és mtsai./ ASTMH m-eeting, 1997. december 7-ll.j. A deléciős mutáns-ok nagy hatékonysággal replikálódtak és a PE2-fehérjék beépültek a részecskékbe. Ezt a mutánst embertői különböző főemlősökben értékelték ki, és kimutatták, hogy löOá-os szerokonverzíót okoz és minden immunizál majmot megvéd a letális fertőzéstől.
Az alábbiakban röviden összefoglaljuk a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát kimára, életképes (működőképes), fertőző, legyengített vírusok képezik, amelyek az alábbiakno.:. -. .d-o fa? egy első sárgalázvírus (például 17D~törzsl, amely egy életképes, legyengített vakcinávárus, és amelyben a prM-E-fehérje nukieotidszekvenciája del-etáiva, csonkolva vagy mutálva van, miáltal az első flavivírus funkcionális prM-E-fehérjéje nem expres-sz ál ódák, és (b) az első flavivírus genomjába integrálva egy, második, eltérő flavivírus vitális burkát (prM-E-fehérjéket). kódoló nukieotídszekvenciát, miáltal a második flavivírus prM~E~fehérjéje expresszálődik az első flavivírus megváltoztatott genomjábói.
A kimére vírus tehát az első flavivírushoz tartozó, íntraceilurálís replikáeiőért felelős génekből és géntermékekből és a második flavivírus burkának génjeiből és génári. Mivel a virusfourok tartalmazza a közömbötermékeiből.
sitő antitestek indukáiásért felelős összes antigén determinánst, a kiírtéra vírussal való fertőzés eredménye 22, hogy a második £iavívírussaí szemben ilyen, antitestek képződnek.
A találmány szerinti kíméra vírusokban első flavívírusként előnyösen a sárgaláz vírusát alkalmazzuk, mint életképes vírust. Eddig ezt az életképes legyengített vírust legalább egy vakcinában már használták; ez a vakcina
YF17D néven ismeretes, és már 50 éve alkalmazzák emberek
ímmunizáiás< ara. Az YEl7D-vakcinát számos pub iikácíőban
mertettsk, így például Smíthfeurr és muz ikatársaí („Ye.
Eever Vacci .nátron, World healís Crg., 238, (1956)],
Eeestone {„Vaccínes, szerk.: Piotkin és mtsai., 2. kiadás, W.B.Saunders, Philadelphia (1995)j publikációiban. Ezen kívül a sárgaláz vírust genetikai szinten ís tanulmányozták fRi.ce és mtsai., Science, 229, 726-733 (1935) ], és információt nyertek a genotípus és a fenotípus közötti összefüggésre mérve is [Marchevsky és mtsai., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52, 75-80 (1995)j.
A találmány szerinti kimére vírusokban második flavivírusként előnyösen alkalmazható flavivírusok, amelyek így az immunizáló antigén forrásai, többek között a japán encephaiitís (7E) vírus, a dengue-láz vírusa (DEN, ez például az 1-4 dengue-típusok bármelyike lehet), a Murray V'alley encephaiitís (MVEj vírusa, a st. Louis encephaiitís (SLE) vírusa, a Nyugat-Nílus-vírus (WN-vírus), által hordozott encephaiiti vírus (HCV). Második ílavivírusként alkalmazható további vírusok például a Kunjin-vírus, a kösép-euréoai encechalía kullancs (TSE) vírusa és a heoatitis-C tisvírus, az orosz tavaszi-nyári encephalítisvírus, Powassan-virus, Kyasanur-erdő betegség vírusa és Omszki gyomorvérzéses iáz vírusa.. A találmány szerinti egy előnyös kiméra vírusban a második flavivírus. prM-E-fehérjér kódoló szekvenciája helyettesíti a sárgaláz vírus prM-E~ fehérjét kódoló szekvenciáját. Egy előnyös kiméra vírusban a prM-E~ fehérjét kódoló szekvencia egy legyengített vírus;törzsből származik, például egy vakcinatörzsből. Továbbá, amint azt az alábbiakban ismertetjük, a fehérje prM-szakasza tartalmazhat egy mutációt, amely megakadályozza az érett membránfehérjét létrehozó hasítást.
A találmány tárgyát képezik eljárások flavivírus™ fertőzések megelőzésére vagy kezelésére emlősben, például, emberben a találmány szerinti, kiméra flavivírus emlősnek történő beadása útján; a találmány szerinti kiméra flavivirusok alkalmazása fLavivírus-feriőzés megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszerek előállítására; a találmány szerinti kiméra flavivírusokat kódoló mukleínsavmolekulák; továbbá eljárások a találmány szerinti kiméra fiavivírusok előállítására.
A találmány szerinti megoldásnak számos előnye van. így például, mivel életképesek és raplíkálődní képesek, a találmány szerinti kiméra vírusok hosszantartó védöimmunitás kialakítására alkalmazhatók. Hívei a vírusok legyengített vírusok (például sárgaláz 17D vírusa) replikációs génjeit hordozzák, a kapott kiméra vírus olyan mértékben legyengít ett, hogy ez biztonságossá teszi emberben való alkalmazásra ,
X Φ
A találmány egyéb jellemzői és előnyei az alábbi részletes leírás, rajzok és igénypontok alapján nyilvánvalóak.
A következőkben röviden ismertetjük a leíráshoz tartozó rajzokat.
Az 1. ábra azoknak a genetikai manipulációs lépéseknek a vázlatos ábrázolása# amelyeket a találmány szerinti sárgaláz/'japán, encephaiitís kimér a vírus (kimére YF/1Evírus·} megalkotása érdekében végeztünk el.
A 2. ábra a találmány szerinti kimára. YF/JS -vírusok
szaporodás i görbéi nek. egy sorozata# amely száporodé. s emberi.
vakcina készítése szempontjából elfogadható se j tt enyésze-
tökben mén t végbe.
A 3. ábra az RMS (Research Master See# ' YFZ’ JE SAm-14-
2; és az Y F-Vax MR C-5-sej tekbeli szaporodásána : k OS S zehason-
látását nu tatja be
A 4. ábra egy# a találmány szerinti } kimér£ i YF/JE-
vírussal elvégzett egérneurovirulencia-analízis- eredményeit mutatja be grafíkonos és táblázatos formában.
Az 5. ábra kimér a YF/DSN-2-vírus előállítására, szolgáló két plazmidból álló rendszert mutat be vázlatosan. A stratégia lényegében ugyanaz, mint a kimér a. YF/JE-vírus esetében.
A 6. ábra olyan, módosított YF-klónok szerkezetének sematikus bemutatása# amelyeket úgy terveztünk meg, hogy deletáljuk az RS1~fehérje egyes szakaszait és/vagy expreszszálhassunk idegen fehérjéket egy belső riboszóma-kapcsolódási hely („internál ríbosome: entry sita# IRES) irányítása alatt. Az ábra csupán a virális genom E/NS'1-rég.ióját mutatja, A burokfehérje (S-fehérjej karboxí1-termínáiísára egy transzlációs stopkodon.t viszünk be, A 3* -irányú transzláció egy génközi nyílt leolvasási kereten belül (ORF) kezdődik meg, az IRES-1 révén, ami az idegen fehérjék (például a HGV-eretíetű Sl és/vagy £2 fehérjék) expresszióját irányitja. Ά második TRÉS (az 1RSS-2:) szabályozza a nem strukturális YF-régió transzlációs iniciáeióját, amelyben beágyazott („nestsd), csonkolt NS1-fehérjék (például az NSldel-1, az NSi-áel2 vagy az NS'l-del.3> expresssilódnak. Az NSl-deléció mérete fordítottan arányos az zRES-l-hes kapcsolt ORF-évei.
A 7. ábra egy, kiméra TF/JS-SA^-14-2 vakcinával ixsraunizáit egér közömbösítő antitest válaszát bemutató grafikon, angol 7
Az alábbiakban részletesen ismertetjük a találmány szerinti megoldást.
A találmány tárgyát kiméra fiavivírusok képezik, aiaeIvek alkalmazhatók flavivirus-fertözés elleni vakcinázási eljárásokban. A találmány szerinti kiméra flavivlrusok például a sárgalázvírus és a japán encephaiitisvírus (JE), a dengue-láz vírusa (DEN·, ez például az 1-4 dengue-típusok bármelyike lehet), a Murray Valley eneephalilis ÍMVE) vírusa, a St. Louís encephalitis (Sbrj vírusa, a Nyugat-Nílusvírus (WN-vírus), a kullancs által hordozott encephalitis (TBE) vírusa vagy a hepatitls-C vírus (HCV) kiméráinak megalkotását és analízisét az alábbiakban ismertetjük.
A fiavivírus-fehérjék egyetlen, hosszú nyílt leolvasási keret transzlációjával és öoszttranszlácíös nroteoütikus hasítások összetett sorozatával keletkeznek. A nyílt leolvasási keret többek között strukturális fehérjéket, kapszidfehérjét <C), előx&ewrán-fehérjét <prM) és burokfehérjét (Ej , továbbá nem-strukturális fehérjéket kódol. A fent ismertetetteknek megfelelően a találmány tárgyát képezik azok a kiméra fiaví vírusok is, amelyekben az egyik fiavivlrus prM- és E-fehérjéit egy másik fiavivlrus pr-M~ és E-fehérjéivel lettek helyettesítve. Ezen kiméra flavívírusok létrehozása tehát magában foglalja a két különböző fiavivlrus kspszid- és elömembrán-fehérjéi, valamint burokfehérjéje és nea-strukturális régiója (NSÍ) közötti új illesztések kialakítását. A felsorolt fehérjék (C- és prM~, valamint E~ és ESI) készleteinek mindegyike közötti hasítás megtörténik a flavivírus-fehérjék természetes proteolítikus proeesszálödása során. A hasítás a hasítási helyek illesztéseit („junction) szegélyező szignálszekvenciák jelenlétét követeli meg.
A találmány szerinti kiméra flavivírusokban a kimérát alkotó vírusok szignálszekvenciáit előnyösen megtartjuk, igy a C- és prM~, valamint a E- és az NSi-fehérjék közötti megfelelő hasítás hatékonyan végbemehet. Ezeket a szignálszekvenciákat az alább ismertetett kamerákban is fenntartottuk. Másik lehetőségként a számos ismert szignálszekvencia bármelyikét génsebészeti úton bevihetjük annak érdekében, hogy a kímérák C- és prM-fehérjéit, vagy E~ és NS1fehérjéihez hozzákössük azokat [lásd pl. von Jeijho, Eur. J. Bíochem.., 133, 17-21 (1983); von Heijne, J. Moi. Siói.
187, 99-105 (1985) I vagy, például, útmutatásul ismert székvenciákat alkalmazva szakember további szígnálszekvenoiákat tervezhet, amelyek a találmány szerinti kimérákfoan alkalmazhatók. Jellemző módon például a szignál-szekvencia utolsó aminosavaként olyan aminosavat tartalmaz, -amely kicsi és oldallánca se® töltött. Ilyen például az alanin, a glíein, a szerin, a eísztein, a treonín és a giutamin. A technika állása .szerint további, szignálszekvenciákkal kapcsolatos követelmények ís ismertek (lásd pl. von Halj.ne (1983), lásd fent; von Heijne, (1985) lásd fent] . A kimérát alkotó vírusok bármelyikének s-zi-g-ná-i szekvenciája is -előállítható és lényegében fenntartható, ami szintén megfelelő hasításhoz.
vezet.
YF/JF-kiméra-vírusok előállifására szolgáló cDNSp templátok megalkotása
Az alábbiakban ismertetett, találmány szerinti YF/ü'ECi
L fJ céljára. A stratégiát például Nestorowic; ismertetik (Virology, 199/ 114-123 (1394)],
Röviden összefoglalva, a találmány kiméra származtatása az alábbiakat foglalj genoml YF-szekvenciákat két plazmádban IV és YfKS.2) , .amelyek az 1-227' nukleotidíg (YWS'IY), illetve az 1373-8704
teljes cD NS-templátok
;ratégiat alkalmazunk,
Y r!7D előáll í fására
s genetikai analízise
rowicz és munkatársai
3.94} ] .
.mány szer inti YF/Jó-
foglalja magában . A
azmidban szapor.it juk
'7 z* / „ „ £ s a tr. í> -ct 8279-10861.
L373-8704. nukie-otídig
[Rica és mtsai., The
A teljes ; ho-sszús-ácű
cDNS-templátokat az ezekből a plaz-mí dókból származó megfelelő restrikciós fragmensek 1igáiésával állítottuk elő. Sz az eljárás volt a legmegbízhatóbb az YF-szekvenciák stabil expressziója és nagy specifikus fertőző-képességű RNStranszkriptumok előállítása céljára.
A kimérák. megalkotására irányuló stratégiánk egyik eleme az YFS'S'IV- és az 1FM5.2-plazmidoko-n belül az YFszekvenciák helyettesítése a megfelelő JS-szekvenciákkal? angol9 a prM~fehérje kezdetétől (478. nukíeotid, 128. amino-sav) az F/NSl-hasitási helyen keresztül <2452. nukíeotid, 817. -aminosav). A JF-cDRS klónozásán kívül számos lépésre volt szükség ahhoz, hogy az YF- és .a JE-szekvenciák mindegyikében restrikciós helyeket építsünk ki, vagy azokat kiküszöböljük annak érdekében, hogy lehetővé tegyük az in vit.ro Iigálást. A kiméra YF(Cj/YE (prM~S) vírus regenerálására szolgáló terápiát szerkezetét a 4. ábra mutatja be. Hasonló stratégiát alkalmazva egy másik, a teljes JF strukturális régiót (C-prM-Ej kódoló kímérát is előállítottunk génsebészeti úton.
A JE-vírus strukturális régiójának molekülár is klórnoA hiteles JE-struktórféhérjét kódoló gének klánjait a JE-SAm~14-2-törzsből (JE életképes, legyengített vakcinatörzs) állítottuk elő, mivel ezen törzs biológiai tulajdonságai es molekuláris jellemzői jól dokumentáltak (lásd pl. Eckels és mtsai., Vaccine,- 8, 513-518 (1988); a JE~SAi<~Í4~
2-vírus beszerezhető a Centere fo-r Disease Control Intézménytől (Fort Coilins, Colorado, USA), továbbá a Yale-. Egye.».«« » * * * ♦ ♦ « * tere Yale Arbovírus Research Unit egységétől (New Haven, Connecticut, USA), amelyek a World Health Qrganizatíon {Világegészségügyi Szerveset, WHö által elismert arbovírusreferenciaközpontok as Egyesült Államokban], A JE SAu-142-vírust a PDK-5 passzálási szinten kinyertük és LLC-NKZ~ sejtekben passzáltuk annak érdekében, hogy a cDNS-klónozáshoz elegendő mennyiségű vírust kapjunk. As alkalmazott stratégia része volt a. strukturális régió két részként történő klónozása, amely részek a2 hhel-helyen (1125. JE-nukleotíd) átfednek. Az így kiónozott strukturális régiót in vitro ligáláshoz alkalmazhatjuk.
Az RNS-t a fertőzött LLC-hib-sej tek monorét egéből vontuk ki és a negatív szensz cDNS· első szálának szintézisét reverz transzkripiáz alkalmazásával végeztük el egy negatív szensz láncindítö <a JE-nukleotidszekvencia 245€-71. nukleotídjaí) segítségévei, amely egymásba ágyazottan („nested) Xbal, illetve NarI restrikciós helyeket tartalmazott először pBluescriptIIKS{ + }-vektorban, majd azt követően ΪΕΜ5.2(Kari)-vektorba történő klónozáshoz. Az első szál cDNS—szintézisét a JE-szekvencia 1108-2471. nukleotidjainak PCR-amplifikációja követte amelynek során ugyanazt a negatív láncindítót, továbbá egy pozitív szensz láncínditót (a JE-nukleotidszekvencía 1108-1130. nukleotídjaí) alkalmaztunk, amely utóbbi egymásba ágyazottan Xbal, illetve Nsil. restrikciós helyeket tartalmazott. rendre a pBluescript- és az YEM5.2(Kari)-plazmídókba történő klónozás érdekében. A JE-szekvenciákat restrikciós enzimes emésztéssel és nukleotidszekvenálással ellenőriztük. A JE14
Χ-* nukleotidszekvencia 1-1130. nuklsotidokíg terjedő szakasza, a JE-cDNS negatív szálának PCR-amplifikácíójából származott, amely során az 1116-1130. JE-nukleotidokn.a.k megfelelő negatív szensz láncinditöt, továbbá egy, az 1-18, JS-nukleotidóknak megfelelő pozitív szensz láncinditöt alkalmaztunk, amelyek mindketten EcoRI restrikciós helyet tartalmaztak. A PCR-fragmenseket pBluescri.pt-vektorba klónoztuk, és a JE-szekvenciákat nukleotidszekvenálással igazoltuk, A fentiekben tehát a JE~szekvencía 1-2471, nukieotidjaínak (1-792. am-inosávák) megfelelő szakasza klónozását foglaltuk össze,
Az YF5*3ziVZJS- és a.z YEIfó .> 2/JS-szármázέkok megalkotása
Annak érdekében, hogy a JS-burokfehériát az YF E/NS1 hasítási helyre Inszertálhassnk, egy egyedi Kari restrikciós helyet juttattunk be az YEM5.2-plazmádba az E/NS1 hasítási helyen (2447-2452. YF~.nukleotídok, -816-817. aminosavak) található szignaláz-szekvenoía o'ligonukleotiddal irányított műtagenezisével, miáltal az YFM5.2 (NarI)-plazmidot hoztuk létre. A fenti változást magukban hordozó terápiátokból származó transzkriptumokat fertózőképssség szempontjából leellenőriztük, és hasonló specifikus fertőzőképességet tapasztaltunk, mint a kiindulási tsmplátok esetében (kb. 100 plakk-képző egység (pfui/250 ng transzkripfcum]. A JEszekvencia 1108-2471. nuk.leo-tidjai.ig terjedő szakaszát a pBluescript/ÓE független FCR-eredetö klánjai közöl többől szubklónostuk az YFM5.2 (haríj-be az egyedi Nsil és Mari restrikciós helyek felhasználásával. ,A JE-prM-régiőval
szomszédos YFS'-végí nem trsnszlatált régiót (1-118. nuklentiáok) tartalmazó YF5f 3/ IV/-JE-ki ónokat PCR-ampliflká lássa! származtatva hoztuk létre.
Annak érdekében, hogy az YF-kapszid és a JE-PS-prM illesztését tartalmazó szekvenciákat vezethessünk le, egy, ezt a régiót átívelő, negatív szensz kínéra láncánáltót alkalmaztunk egy pozitív szánsz Iáncindítóval együtt, amely az YF5'3'IV 6625-6639. nukieotídjainak felelt meg. Sgy olyan PCR-tranziensekhez jutottunk, amelyeket negatív szensz PCR Ián cl. ndi tokként alkalmaztunk egy, a pBiuescript-vektor EcoRI-h.elyétől 5f -irányban elhelyezkedő szekvenciájával komplementer pozitív szensz láncindítóval együtt. Annak érdekében, hogy amplif íkáljuk a JE-szekvenciát (amely a pSlescript-vektorban fordított orientációban van kódolva) a 477. nukleotidtói (a prM-fehérje N- terminálisa) az 1125. nukleotídnái található Khel-helyíg bezárólag. A kapott PCR.fragmenseket az YFS*3flY-plazmidba ínszertáltuk a Nőt! és az Eco.RI restrikciós helyek felhasználásával. Ez a konstrukció tartalmazza az SPC-promótert, amely megelőzi az YPS'-végi nem rranszlatált régiót, amelyet viszont a következő szekvencia követ: YF(CiJE(prM-E); továbbá tartalmazza az Nbe1-helyet (1125 JE-nukleotíá) , amely az in vitro ligáié sho z szükséges.
Az Y1YÍ5.2- és az YF57'3? IV-génsebészetl átálakltása az.
in vitro ligáláshoz szükséges restrikciós helyek Jtiépítéréhez
Annak érdekében, hogy alkalmazhassuk az Nhel-heiyet 5f-végi ín vitro ligáiási. helyként a JE-burokfehér jót kődolő szekvencián belül/ elimináltunk egy redundáns Nhel-helyet sz YIM5.2~plasmidban (5459. nukleotid}. Ezt a.z YF~ szekvencia 5461. nukl.eotidjánál végrehajtott csendes .mutációjával hajtottuk végre (T -» C; alanin, 1820. aminosav). Ezt a helyet a megfelelő restrikciós fragmensek ligálásávai juttattuk be az Yöl5.2-be é-s az YFH5.2: ÍN-arl)/JE-be pedig egy, a kiméra YF/JE~ szekvenciát kódoló Nsil/NarI-fragmens cseréjével vittük be.
Annak érdekében/ hogy az in vitro ligái áshoz egy egyedi 3?-restrikciós helyet építhessünk ki, az YF5f3'ívből és az YFM5,2-ből normálisan teljes hosszúságú tomp látok előállításához használt Aatll-helytői 3'-irányban egy BspEI-helyet hoztunk létre .génsebészetileg. {&. űE-st.rukturá'lis szekvenciáiban több Aat-hely fordul elő, ami kizárja ezek alkalmazását in vitro- ligáiás céljára.) A. BspEI-helyet a 8581. YF-nukleotid csendes mutációjával hoztuk létre (A —> C; szerin/ 2860. aminosav), es az. YEMS,2~be a megfelelő restrikciós fragmensek cseréjével vittük be. Az egyedi helyet az YFH5.2/úE~be az Xbal/Sphl-fragmens cseréjével juttattuk be, az YF5f 3f IV/ JE (prM-E) -pia.z.mídba pedig az ezen kiindulási plazmidokbői és az Y.FMS.2 (SspSl) -plazmid egy származékából származó megfelelő restrikciós- fragmensek közötti három résztvevős ligáiás sál, deletálvan az 1. és a 6919. nukleotidokná.I található Eco-RI-helyek közötti YF~ szekvenciát.
í* ♦
Sít .¾ JE Na.ka;yam.a cDNS helyettesibőssel történ<y bejuttatása YFZY£ kíméra piazmídókba.
Azzal kapcsolatban, hogy a PCR-eredetü JE SA^lé-k strukturális régió milyen mértékben képes megfelelően .funkcionálni a kíméra vírus által biztosított környezetben, bizonytalanság uralkodik. Emiatt a CE Nakayama törzs egyik kiónjából származó egyik cDNS-t alkalmaztuk. Ezt a törzset expressziős kísérletekben és protektiv immunitást kivártó képessége szempontjából kiterjedten jellemezték (lásd pl. Mclda és mtsai., YiroXogy# 158, 348-360 (1937); a JE
Nakayama törzs beszerezhető a Centers fór Dísease Centről Intézménytől (Fort Collins, Colorado, USA) továbbá a Yale Egyetem. Yale Arbovirns Research Unit egységétől {New Haven, Connecticut, USA.) ). A Naksyama. cDNS-t a rendelkezésre álló restrikciós helyek (Hindllí-töl PvuII-ig és Bpmr-től Kuniig) felhasználásával az YF/JE kimére. plazmidokba inszertáitűk annak érdekében, hogy a két. piazmidrendszerben. - egyetlen aminosav, a 4 9 szerin kivételével, amelyet annak érdekében hagytunk érintetlenül, hogy az bhel-helyet felhasználhassuk in vit.ro lígálásra - a teljes prM-E-régiót helyettesítettük. A Bakayama-klónban a teljes JE-régiót megszekvenáltuk a behelyettesített cDNS hiteles mivoltának igazolása érdekében (2. táblázat).
A teljes hosszúságú cDBS-tempíátok előállítása, RNStranszfekcló és a fertőző vírusok kinyerése A teljes hosszúságú cDU'S-templátok előállítására alkalmazott műveletek lényegében megegyeztek a Rice és munkatársai által leírtakkal [The New Biológiát 1, 235-96 (1989)] (lásd *
az 1. ábrát). -IS - * »'··’ * M. #*♦·>«·» * * * ·-> ·»-* .5» A kiméra temoiátok esetében az
BspSI-gyel emésztet' tűk. angol13 Az ín vítro ligálást 50 ng
tisztított fragmens alkalmazásával végeztük el Té-DNS-lígáz
jelenlétében. A líc lálá.si termékeket Xhol-gyei linearizál-
tűk, hogy lehetővé tegyük a kifufctatő („run-off) transz-
krípciöt. Az SP-6-tri mszkriptumokat 50 ng tisztított terápiát
£ elhasználásával szintetizáltuk löegy mennyiségüket ’h-UTP beépítésével becsültük meg és az RNS épségét ne® denaturáló agaróz-gélelektroforézissel igazoltuk, Amennyiben ezt az eljárást alkalmazzuk, 5-10 |ig RNS-t kapunk egy reakcióban, amelynek legnagyobb része teljes hosszúságú transzkriptumok formájában van jelen. Az RNS-transzkriptumokkal végzett
transzfekeiét - kát ionos líposzömák jelenlétében - a Rice
és munkatársai (Iái s-d fent) által YF17D~re leírt eljárás
szerint végeztük el „ A kezdeti kísérletekben LLE-MKj-sejte-
két használtunk a t ;ranszfekfcáláskor és a vírus mennyiségi
b ecs 1 é s e ko r, ra i ve 1 meghatároztuk az YF és a JE kiindulási
törzsek plakk-k! spző és replikáciős hajlamát
(„psrmissivenessA) . Az 1. táblázat a transzfekciös szállt-
fertőző virustörzse) < előállítására, jelölt fehérjék jellem-
zésére és neut raliz! í c l ó s t e s z fc e kb en.
A kiméra cDNS- ' templátok n ak1eo t idsz e kvená1á s a
A kiméra YF/o E~cDNS~t tartalmazó plazraidokban a kló-
·< *<* ««V φ * * Je. <
* érdekében, hogy azonosítsuk az :S&«~14-2-fehérje és a
Nakayaíaa-burokfehérje helyes szekvenciáit. A már közölt szekvenciák (McAda és mtsai., lásd fent) és a fenti konstrukciók közötti nukieotídszekvencía-küiönbségeket a 2. táblázatban mutatjuk be.
A kimér a.....YP/JE-vlrusok szerkezeti és bio lóg iái jellemzése
A transzfekeios kísérletek során kapott, kimére YF/JE-virusok genoai struktúráját fertőzött egysejtrétegekböl begyűjtött vírális RNS RT/PCR-alapü analízisével igazoltuk. A kísérletek elvégzésével célunk annak a lehetőségnek a kizárása volt, hogy a vírustörzsek szennyeződnek a transzfektáiási műveletek során. A kísérletekhez egyszer masszáit (,,fifst-pass) vírust használtunk a fertőzési ciklus beindítása érdekében, abból a célból, hogy kiküszöböljük bármilyen lehetséges műtermék keletkezését, amit a maradók, transzfekcióval bevitt vírális RNS jelenléte eredményezhetne. Az akár YF/-JE (prM-Ej~SAi«14-2- akár YF/JE (pr.M~ £}-NakayöKia. kimérákkal fertőzött sejtek teljes RNS-kivonatait RT/RCR-nek vetettünk alá. A PCR során YF- és JEspecifikus lánc indító kát. alkalmazunk, amelyek lehetővé tették, hogy a teljes strukturális régiót két, körülbelül .1 kb méretű PCR-termék ként előállítsuk. A termékeket. azután restrikciós enzimes emésztéssel analizáltuk, a vírusok közötti különbségtételt lehetővé tevő, jósolt JE~SAK.14~2~ és Nakayama-szekvenciákon belül restrikciós helyek felhasználáséval.. Ezt a megközelítést alkalmazva a virus-RNS-ről kimutattuk, hogy kiraéra, és igazoltuk, hogy az így nyert ví20 rusok restrikciós helyeik megfelelők. Az aktuális C-prMhatárról kimutattuk, hogy érintetlen ssekvenciaszínten. Ezt a kiméra YF/JE-C-prM-illésztésen keresztüli ciklikus székvenc.iaan.al i zissel végeztük.
A JE-burok f ehérje jelenlétét a két kimérában egyrészt JE-specif ikus antiszérummai végzett immunpreclpi rációval másrészt plakk-redukciós neutralizácíós teszttel igazoltuk, utóbbihoz YF- és JF-specifíküs antiszérumokat használva. A kimérákkal fertőzött LLC-MKs-sejtek 3s-S~jelölt extrakturnáinak egy, a JF-S-fehérje elleni monokionális antitesttel végzett iíamunpreeipifcációs vizsgálata azt mutatta, hogy a J.E-burokf ehérje egy 55 kD fehérjeként kinyerhető, miközben ugyanezzel az antiszérummal nem lehetett immunprecipitátumot létrehozni YE-sejtekbői fertőzött fehérjével. Mind a JE- mind az YF-hiperimmunszérumok keresztreaktivitást mutattak a két vírusburok-fehérjére, de reprodakálhatőan megfigyelhető volt a fehérjék közötti méretkülönbség (YF; 53 kD, glíkoiizálstian, JE; 55 kD, glikolizált). Az YF monokionális antitestek alkalmazása nem volt kielégítő az immunpracipitációs körülmények között, ezért ebben az analízisben a specifitás a JE monokionális antitestektől függött. Plakkredukclós neutralizácíós tesztet („piaque reduction neutralízation testing, ERET) végeztünk a kimére vírusokon és az YF- valamint a JS SAU-14-2-virusokon YFés JE-specifikus hiperimmunizált aszcitesz folyadék ÍATCCÍ és YF-specifíkus tisztított IgG (monokionális 2E10antitest) alkalmazásával. Az antiszérumok 50%-os plakk— redukciós titerében jelentős különbségeket figyeltünk
X φ « κ * <
»«« « · φ V β * meg az egyes fcímárákra nézve, amennyiben a kísérletben alkalmazott kontrollvírusokk-ai hasonlítottuk Össze őket (3» táblázat). így tehát a közömbösítéshez (neutralizáció) szükséges epifcőpok expresszáiődtak a fertőző, kíméra. YF/JEvírusokban.
Növekedési tulajdonságok sejttenyészetben A kimérék növekedési sajátosságait kvantitatÍven is megvizsgáltuk mind főemlős-, mind szúnyogeredetű sejtvonalakban. A 2. ábra a kimérák kumulatív növekedési görbéit szemlélteti ILC-HK^-sejtekben alacsony multiplicitásé fertőzés (0,5 plakk- képző egység/sejt) után. Ebben, a kísérletben YF5.2ÍV- (klónozott származék) és JE-SA^~14-2~ (nem klónozott) vírusokat alkalmaztunk összehasonlítás céljából. Mindkét kimére vírus körülbelül egy logaritmikus egységgel magasabban ért el maximális hozamot, mint bármelyik kiindulási vírus. Az YF/JE SA;U-”i4-2 kíméra esetében a vírustermeiés csúcsa 12 órával később következett be, mint az YF/JE-Nakayama-kíméra esetében {50 óra vs. 38 óra). Az YF/JE-Makayama-kiméra jelentősen nagyobb cítopatikus hatást mutatott, mint az ¥P/JE-S&i4~X4~2~kÍKvéra, ebben a sejtvonalban. Egy hasonló kísérletet végeztünk C6/3S~sejtekben alacsony multiplicitásé fertőzés után (0,5 plakk-képző egység/sejt) . A 2. ábra a vírusoknak -ebben a gerinctelen eredetű sejtvonalban megfigyelt növekedési kinetikáját is szemlélteti. Hasonló virushozaaokat figyeltünk meg minden pontban, amit ebben a kísérletben vírusbegyüjtésre használtuk. Ez még inkább alátámasztja azt az elgondolást, hogy a kimére vírusok replikációs hatékonysága nem sérül.
Az RMS í YFZ JF-SA3,¢-14.-2) s2aporodási sapátságainak összehasonlítása YF1 ?D-vakcina val MRC-5-sej tekfoen
Annak érdekében, hogy megbecsüljük a vakcina jelölt
Képessegét arra, emberi vakcinákként eifoaadhatő seítvonalban szaporodjon, újabb kísérletet hajtottunk végre. Kereskedelmi forgalomban kapható sárgaláz 17D-vakcínát (¥F~ Vax^j szereztünk be a Connaught Laboratories cégtől (Swíftwater, PA) . Az ATCC-tői .MRC-5-sejteket (dipioid emberi eredetű embrionális tüdősejtek, ATCC 171-CCL, sarzss-zám: F-14308, 18. passzálásj szereztünk be, és EKEM-, 2 mM L-Gin-, illetve Earle-féle BSS-tápközegben szaporítottuk, amit úgy állítottunk be, hogy 1,S g/l nátrium-bikarbonátot, 0,1 mM nem-esszenciális aminosavakat és 10% FBS-t tartalmazzon .
Annak érdekében, hogy a BMS (Research Master Seed, YF/-JE SA14-14-2} növekedési kinetikáját összehasonlíthassuk az YF-VaxS-évai, a sejteket 90% összefolyásig szaporítottuk, és RMS-sei vagy YF-Vax®-szaI fertőztük 0,1 pfu Mólnál. .Mivel az MRC-5-sejtek általában lassan szaporodnak, ezeket a sejteket 10 napig tartottuk fent a beoltás után. A mintákat naponta fagyasztottuk le 7-20 napon keresztül, és a fertőzőképességet p.lakk-vizsgálattal határoztuk meg Verese j bekben.
MRC-5-sej bekben az YF-Vax® és az YF/JE-kiméra érte el a legszerényebb ti tereket <3. ábra). A legmagasabb titer körülbelül 4,7 lög55 pfu volt az YF'-Vax® esetében, amit a
2. napon ért el és enyhén kisebb, 4,5 log;,o pfu volt az RMS esetében, amit hat nap elteltével ért el.
* ♦1
Neurovimlencla-f észt normális felnott egerekben
Az YF/ JE-SAu-14~2~kíméra víruiencíatula jdonságait fiatal felnőtt egerekben vizsgáltuk intraeelebráiis beoltással, 10 egérből állő csoportokat <4 hetes hím és nőstény TCP.-egerek, csoportonként 5-5 darab) oltottunk be 10- ezer plakk-képzö egységnyi YF/J£-SAu~lé~2~kímérával, YFS.2ivvel, vagy JE-SAh- 14-2-vel, és naponta megfigyeltük, őket 3 héten keresztül, A kísérletek eredményeit a 4. ábrán szemléltettük, A2 YF5,2ív kiindulási vírust kapott egerek körülbelül egy héttel a beoltás- után elpusztultak. A JE-SAi«14-2-kiindulási vírust, illetve a kimérát kapott egerek között nem figyeltünk meg mortalitást vagy betegséget, A kísérletek során a beoltásra használt készítmények ti terétmeghatároztuk az injektálás időpontiában, és a túlélő egerek egy alcsoportját teszteltük közömbösítő antitestek jelenlétére nézve, annak érdekében, hogy ellenőrizzük a fertőzés bekövetkeztét. & vizsgált egerekben a YF/JS-SAi<-142-virussal szembeni titer hasonló volt azokban az állatokban, .amelyek ezt a törzset kapták, és azokban, amelyek a kimérát.
Az YF/ J£-SA«-14“2~kimérs· egerekben neurovírulenórájának vizsgálatára szolgáló kiegészítő kísérletek eredményeit a 4, táblázatban foglaltuk össze. Ezekben a kísérletekben az egerek mindegyike, amelyek YF5.2i.v-vei oltottunk be, 7—8 napon elpusztult.- Ezzel szemben az YF/JE-SA^14-2-vei beoltott, egerek egyike sem pusztult el az oltást követő két hétben végzett megfigyelés szerint.
Az YF/JE-kímérák patogenezisének és neuroinvarivifásának vizsgálatára szolgáló kísérletek eredményeit az 5. táblázatban mutatjuk be. Ezekben a kísérletekben a kiméra vírusokat háromhetes egerekbe oltottuk be, 10 ezer és 1 millió plakk-képző egység között változó dózisban, intraperitoneális úton. Άζ YF/JE.~Nakayama~vírus-sai vagy az YF/JES?u4~lí<2-vlrussal beoltott egerek egyike -sem pusztult el a beoltás utáni két héten keresztül végzett megfigyelés szerint, ami azt jelzi,· hogy a vírus képtelen betegséget okozni. perifériális beoltás után. Az YF/lE-SA^-14~2-vel beoltott egerek közömbösítő antitesteket termeltek JE-vírus ellen {7, ábra.') .
Sá r galáz/dengne-láz (YF/DEN) kiméra vírusok előállítására szolcáló oDNS-temoiátok ne otása
A kiméra sárgaiáz/dengue-Iáz (YF/DEN) vírusok létrehozását kiindulási vírusokból származtatva az alábbiakban ismertetjük. Ezt lényegében hasonlóan végeztük el, mint a fent ismertetett YE/YE kiméra vírusok esetében. Egyéb fiaví vírus- kimérákat is létrehozhatunk hasonló stratégiát követve, természetes vagy génsebészetíleg létrehozott restrikciós helyek és, például a 6. táblázatban bemutatott oiígonukleotid iáncindítök felhasználásával.
Az YF/DEN kiméra vírusok iétrehozása
Bár a áengoe-vírusokhoz több molekuláris kiönt is kifejlesztettek, igen gyakran problémák merültek föl a vírális cDNS stabilitásával a plazmidrendszerekhen, továbbá a rrnyert vírus rep.trxa.ciós hatékonyságában. Kísérleteinkhez, egy, Dr. Fater Origót ('Dept. of .Microbiology, Monash
University, Clayton., Ausztrália? által kifejlesztett DSN-2kiónt választottunk, mivel ez a rendszer viszonylag hatékony a vírus kinyerése szempontjából és a ad. módszereinkhez hasonlóan két plazmidot alkalmaz. A használt D£N-2~klón teljes szekvenciája hozzáférhető.. EZ a szekvencia elősegítette a- kiméra YF/DEN-tempiátok megalkotását, mivel csupán néhány módosítást kellett végrehajtani az YF~klónon. Az idevonatkozó lépéseket az alábbiak szerint végeztük.
Az YF5.2ÍV- és az- IY/JE-vírusokhoz kifejlesztett kétplaz.mid.os rendszerhez- hasonlóan az YP/DEN-rendszer is egy egyedi restrikciós helyet használ a DEK-2-burokfehérj én (Ej belül, mint ami a strukturális régió (prlí-E) szaporításánál alkalmazott töréspont a két plazmádban, -amelyeket ezentúl YF5''3f iv/DE-K <prM~£' )-n-ek és YE5.2/DEN {Ez-Ej-nek jelölünk (lásd az 5. ábrát). A kiméra templát in vítro ligálására szolgáló két restrikciós hely az AatlI és az SphI. A DEN-Sfehérjeszekvéneia 3*—szakaszát befogadó plazmid az YFM5.2 (Narl{+].SphI (“] ) . Ez a plazmíd tartalmazza az E/NSIillesztésnél a Kari-helyet, amelyet a JE-E-fehérje karboxiterminálisának insze.rtálás-ára használtunk. Ezt tovább módosítottuk egy többlet Sph~he.lv kiküszöbölésével -az KS5fehérjerégión belül, csendes helyspecifikus mutagenezissel. Ez tette lehetővé a DEK2-s-zekvencia inszertálását az egyedi SphI-heiytől a Kari-helyig egyszer irányított klónozással. A DEK2'-cDNS megfelelő fragmensét PCR-rel hoztuk létre. A MON31Q-je'lü DSK-2-jfölö. kIónból, amelyet dr. Wright bocsátott a rendelkezésünkre. A PCR-Iáncíndítők között volt egy, az Sph!-helyet szegélyező 5f-láncindító is, továbbá egy 3'lánc indító, amely homológ volt az E/NS'I-illesztésnél található szignálás-helytől közvetlenül 5-irányban elhelyezkedő
DEN-2-nnkleotidokkai, és helyettesítette a szígnaláz-hel.yet, szubsztitúció útján egyrészt létrehozva egy új helyet, másrészt egyben egy Narl-h.elyet is bejuttatva. A kaPCR-fragmenst ezut án
pott 1170 bp h összűságű PCR-
YFM5.2 0 2arl( H Sphl [ -))- be juttat!
£ prM- •et és az F~fehérje ainínot
kódoló szekvenciákat magában 1 foglaló- DEN-2-kl ón 5'-szaka-
szát génsebészeti öto-í z, kiméra PCR-iáncinditó alkaimazásá-
val YF5f 3f IV-plazmídb a vittük be, A kiméra láncindítót,
amely az YF-C-fehérje negatív- szens z 3f -végé t és a DEN-2-
prM-fehérje 5'-végét foglalta magában, egy, az YF5'3'XY~
plazmid SPS-promóterét szegélyező pczitiv-szensz láncindítóval együtt arra használtuk, hogy agy 771 bp hosszúságú PCR-terméket állítsunk elő, amely tartalmas egy 20 bázis hosszúságú, a DEN-2-prM-székvencíát képviselő nyúlványt. Ezt a PCR-terméket használtuk fel azután a DEN-2-plazmádon végzett láncindításra egy, az Sphl-helyet szegélyező, a DEN-2-szekvencia 1501-1522. nukleotidjait képviselő 3f-
láncindítí Svai együtt, amelyekkel e
végső PCR- -tér méket állítottunk elő.
mazta az YF- szekvenciát a Notl-hel
bezáró1ag (a promótert is), az YFft
régiót és a s YF-C-fehérjét a ΠΕΝ-Ι-
csatlakoz·’ va. Α PCR-terméket YFSf3?i
Sphl-heiys sk f elhasználásával. Ezáltc
E) -plazmái ioi kaptuk.
es κ- * ♦ ♦ « « 49* *** «> « « St « *
Egyéb flavivírusok kimére templát j a inak elő á Ilitása Kirnéra YF/MVE-, YF/SLS-, IF/W-, YF/TBK-vírus okát. kódoló teljes .hosszúságú cDKS-tempiátok előállítására szolgáló eljárások hasonlók azokhoz, amelyeket a fentiekben az YF/DEN-2- rendszer kapcsán ismertettünk. A 6, táblásat YF17D-;alapú kiméra vírusok előállítására szolgáló stratégiát ismertet. As ín vitro ligálás'hoz alkalmazott egyedi restrikciós helyeket és a C/prM-, valamint E/NSI-illesztések génsebészeti előállítására szolgáló kiméra iáncinditókat szintén bemutatjuk. A fenti heterológ flavivírusok forrásaiként alkalmazható cDKS könnyen hozzáférhető (HVE:
Palgarno é s mt.saí., J .Hói. Bioi., 18 7, 309- 323, (1986) ; SLE ’
Trést és mtsai., Virology , 156, 29 3-304 (1987); TBE; Manói
és mtsai.., Virology, 166, 197-2 03 (1988); Pengne 1: Mason
és mtsai., Virology, 161, 262-267 (1987); Pengne 2; Deubel
és mtsai., Virology, 365-3 77, (1986) ; Pengne 3 * í'icÚ'iti
és mtsai., Víro logy. 162, 167-1 80, (1988) ; Pengne 4 : Zhao
6S TTltSciJl - < Virology, 15 5, 77- δ 8 (1986) ] .
További kiméra vírusok génsebészeti úton történő létrehozására alternatív lehetőség az, amikor á CZprM-ilic-sztést olyan PCR-eredetű restrikciós fragmensek. tompavégű ligálásával hozzák létre, amely fragmensek végei ezen illesztésnél találkoznak, és 5'-, valamint 3'-terminálisaik YFSr3' XV-plazmidba vagy egy köztes plazmidba, például BBSKS(+)~foa való bejuttatásra szolgáló megfelelő restrikciós helyeket szegélyeznek (azokon „kívül helyezkednek. el) . A választás, hogy kiméra oligonukleotidokat vagy tompavégű iigálást alkalmazzunk-e, attól függ, hogy a szóban foraó vírus bnrokfehérjéjét kódoló régión beiül milyen egyedi restrikciós helyek találhatók.
HCV-antigéneket kódoló YF-vírassk megalkotása Mivel a HCV SÍ- és E2~struktúrfehérjói nem homológok a fent ismertetett f la vi vírusok struktúrfehérjóival, az ezen fehérjék expresszálására szolgáló stratégia magában foglalja a fenti fehérjéket kódoló gének inszercíöját a genom nem esszenciális régiójába, ügy, hogy a fehérjék mindegyike azután a sárgaláz fehérjéivel együtt koe-xpresszálődik a fertőzött sejtekben a vírus replikáélója idején. A fehérjék inszsreíőjának céirégiója az MSI-fehérje N-terminális szakasza, mivel a teljes MSI-fehérjéről elmondható, hogy nem szükséges a vírus replikációjához. Az YF-genom - a genom normál méretét (mintegy lö ezer nukieotid) meghaladó heterolög szekvenciák jelenlétében fellépő - potenciális stabilitási problémái miatt az alábbi kimutatási stratégiát alkalmazhatjuk. Ezen kívül az MSI deléciója is előnyös lehet a fent leírt kimére YF/flavívírus-rendszerekben, mivel ezen fehérje már részleges»· deléció ja is megszüntetheti az YF-vel szembeni, MSI elleni antitestekkel kapcsolatos immunitást, és így - amennyiben egy adott befogadóban több mint egy kimére vakcina lenne szükséges, vagy ha egy YF-vakcina a jövőben szükségessé válna vagy korábban beadásra került a vektorimmunitással kapcsolatos problémák elkerülhetők. A stratégia magában foglalja egy sorozat megfelelő fázisú b,ín-frarne) deléció létrehozását az YFMS.2~piazm.id NSXkődolő régióján beiül, összefüggésben az E-fehérje végén génsebészetiieg létrehozott transzlációs termináciős kodon25 nal és egy, két IRES-ekből (belső riboszómakötő hely, „internál rihosoxae entry sítes*} élló sorozattal. Az egyik IRES közvetlenül a termináeíos kodontól 3*-irányban helyezkedik el, és egy, a E és az NS1 közötti régión belül található nyílt leolvasási keret expresszióját teszi lehetővé. A második IRES a csonkolt. NSl-fehérjéről induló transzlációt indítja be, biztosítva, as YF nem-strukturális poliproteínje maradékának expressziéját. Ezeket a származékokat a fertőző vírus kinyerése szempontjából teszteljük és a legnagyobb deiéciót tartalmazó konstrukciót használjuk az idegen szekvenciák (például. HCV-fehérjék) ínszertálásához az első IRES-nek megfelelő helyre. Ez az egyedi konstrukció szolgálhat annak meghatározására is, hogy vajon, az JíSl deléciőja befolyásolja-S: a vektorspacifikus immunitást a prM-E-t expresszáló kiméra YF/f lavivírus-vírusok összefüggésében, amint azt fent említettük.
Az El-, az S2- és/vagy az együttesen az El- és E2HCV-fehérjéket kódoló nukieotidok inszercióját az NSl-fehérje által tolerált deléciő mérete korlátozza. Emiatt csonkolt HCV- fehérjéket alkalmazhatunk a módosított YFkiónon belüli stabilitás fokozására. A HCV-fehérjéket génsebésze ti lég módosítjuk egy N-terminális szignálszekvemcíával közvetlenül az IRES után, a C-terminálison pedig egy terminácíós kodonnai. Ez a konstrukció a HCV™fehérjéket az endoplazmás retikuiumba irányítja a sejtből való szekréció érdekében. Az ezen konstrukció létrehozására irányuló stratégiát vázlatosan a 6. ábra mutatja be. Az I.genotípusa HCV-fehérjéket kódoló plazmídokat felhasználhatjuk esen
Κ * *Κ» , <t > * • · *« 5» < -ν V V 4.
A ♦·' X -w ♦ **' konstrukciók előállítására. Ilyennek például a dr.Charles Rice-tól (Washington University; Graoui. és mtsai., öl Viroiogy, ö ?, Í3ö5~í395 (1993)1 beszerzett HCV-plazmídok, aki a vírusnak ezt a régióját expresszáltatta precesszióé rendszerekben és egy, a repiikáeict komplementáló teljes hosszúságú HCV-klőnon belül.
PrM-hasitási deléciós mutánsok mint flavivirusok e 1 leni legyengítettvakcína-jelöltek
További, a találmány szerinti kiméra. vírusok olyan mutációkat tartalmaznak, amelyek megakadályozzák a prM-hasadását. Ilyenek például a prM-hasításí helyének mutációi, így például a szóbanforgó· fertőző flavivirus-klónokban (például dengue-láz, IBS, SLS stb.) a prM-hasíhási helyét hel.yspecif.ikus mutagenezissei megváltoztathatjuk. A hasítási hely aminosavaí közül bármelyik vagy azok mindegyike deietálhatő vagy szubsztituáiható a fentieknek megfelelően. A mutált prK~E—génekét tartalmazó nukieinsav-fragmenst azután a fent leírt eljárások alkalmazásával sárgalázvírusvektorba ínszer tálhat juk. A prN-deléció alkalmazható gyengítő mutációkkal vagy azok nélkül (például a E~.f ehérje mutációival), amelyeket a. sárgaláz vírusába viszünk be. Az ilyen mutánsok előnyösek az egyszerű szubsztitűeiős mutánsokhoz képest, mivel vakcinajelöltekként. ezekben majdnem lehetetlen visszafordítani a deistáit szekvenciát és helyreállítani a virulen.ciát.
Az alábbi, találmány szerinti kiméra flavivírust helyeztük letétbe az American Type Cuiture Collectíon-nél (ATCC; Rockville, Maryland, USA) a. Budapesti Egyezménynek megfele« » « « « » « χ *
0 X
lŐSHí .'1 L9S8. jan .uár 6~ánf 30t hivatalos
napon: kiméra sárgaláz Ί7Ώ / 2. tipu
ÍYT/DEN -2; ATCC nyílvántaj ctási szám: ATCC
(-2533), valamint kiméra sárgaláz 17D / japán encepfealitis SAu~14~2virus (YF/JE Ά1.3; ATCC nyilvántartási szám: ATCC VR---2594) .
1, táblásat
Az YF/JB-kimérák jellemzése
♦ *♦
3. táblásat
Plakkredukciós neutralizáciős titarek TF/JE kimérek esetébe;·
4. táblásat
YF/ <7£~SA;4.-142-klm.érák. nenrovíruíénei áj a 3 hetes hím ICR-egerek
»
5. táblázat
YFZJF-kímérák ne uroínvazív túlajdonsága hetes hím ICR-egerek
lóg időse) (íp) %-os: mortalitás
YF/JF bakavarna 4 ö (0/5)
YF/JE bakayama 5 0 (0/4)
YF/uS Nakayama 6 0 (0/4)
YF/JE SA 14-14-2 4 0 (0/5)
YF/JE SA 14-14-2 5 0 (0/4)
YF/JE SA 14-14-2 6 0 (0/4)
3. táblázat /F/flavivírus kimérák génsebészetí átalakítása
Vírus Kíméra C/prM illesztés' Kíméra B/NS.1- illesztés2 5 - ligáiás3 3~ ligálás'5 KiküszöbeÍt’ vagy (létrehozott) helyek
YF/KN X- c a c t gg g a g ag c ttgaaggtc (1. asz.sz.) a a ag cc ag 11 gca g ccgcggtítaa i2.asz.sz.) Aat II Ks.il
YF/DEN X- gatcctcag tacea AatlI SpAI Spöl DEN-
~1 aa gg taga ct gg tgggctocc (3.asz.52.) accgcggtttaa (4 .asz., ss.) ben
YF/DEN X- a a c cc t c a g t a. c c a Aat II Sphi
* * > .
«« «*« « <
* ♦ ♦ A <
' «* ««
1,2: az oszlop a C/prM- vagy az E/NSl-illesztésnek megfelelő kiméra YF/flavlvirus-láncindítók előállításához használt oligonukleotídókat szemlélteti (.lásd: a szöveget) . X ~ az YF-kapszid kódoló s-zekvenciájának karboxíterx&inálísa. Az aláhúzott régió a közvetlenül a Narl-helytol 5'-i35 rányban elhelyezkedő célzott heterológ .szekvenciának felel meg lantiszensz-ccgcgg) , Ez a hely teszi lehetővé a PCRtermékek, inssertálását az ΥΠ45..2 literi) -plazmidba, amire a teljes hosszúságú cDNS-tempiátok előállításához van szükség. Egyéb nukleotidok specifikusak a heterológ vírusra. Az oligonukleotid-láncindító'kat S-' -3f -elhelyezkedéssel ábrázoltuk.
3,4’ As egyedi restrikciós helyeket, amelyeket teljes hosszúságú kiméra cDNS-templáfeok előállítása érdekében ín vitro izolálható és ligálható restrikciós fragmensek megalkotásához használtunk, szintén felsoroltuk. Mivel egyes szekvenciák nem tartalmaznak kényelmesen használható helyeket, néhány 'esetben a megfelelő helyek génsebészeti úton történő létrehozása szükséges (5. lábjegyzet) .
5: Zárójelben azokat a restrikciós enzimes hasltőhelyefcet adtuk meg, amelyeket létre kell hozni a hatékony in vitro ligáiás érdekében az YF-gezincnek megfelelő szakaszon
v a g y a heterológ vírusban. A zár éjeibe nem tett helyeket ki
kell küszöbölni. Mindezeket a módosii táso kat a me gr e1e1ő
klón cDNS-ének c ssndes mutagene zisével hajtottuk végre. A
ki nem töltött helyek azt jelzik, hogy nem volt szükség a cDNS-kiónok módos1tására.
Egyéb megva1ó s í tás i módok
A találmány egyéb megvalósítási módjait az alább felsorolt igénypontok határozzák meg. így például egyéb, orvosi szempontból jelentős fiavivírusok prM-S-fehérjéínsk génjei is inszertálhatók a sárgaláz-vakcinavírus gerincébe, amivel egyéb orvosi szempontból jelentős fiavivírusok elleni vakcinák állíthatók elő flásd pl. Monath és mtsai., „Flaviviruses, In Virology, szerk. Fielás, RavenLippincott, New York, Volume I, 961-1034].
Az alábbiakban példaképpen felsorolunk néhány olyan flavivirust, amelyekből a találmány szerint kímsra vektorokba inszertálható géneket nyerhetünk: Kunjin-vírus, közép-európai encephaiítisvírus, orosz tavasz-nyári encephalit is vírus, Powassa.n~vi.rus, Kyasanur-erdő betegség vírusa és omszki gyoraorvérzéses láz vírus. Ezen belül távolabbi rokon vírusokból, származó gének: is inszertálhatók a sárgaiáz-vakcinavírusokfea, amivel új vakcinák hozhatók létre.
Vakcinák előá11itása és a1ka1ma zása
A találmány szerinti vakcinákat olyan mennyiségben és eljárások alkalmazásával adjuk be, amelyek szakember által könnyen meghatározhatók. A vakcinákat beadhatjuk például ugyanúgy, mint a sárgaláz 17D~vakcírát, például fertőzött csirkeeHíbriö-szövet derített szuszpenziójaként vagy egy, a kimér a sárg.alázví russal fertőzött sejttenyészetből nyert folyadékként. így tehát az életképes, legyengített kiméra vírust steril vizes oldatként fo-rmu lázhat juk, amely 100 és 1 millió fertőzött közötti egységet (pl. plakk-képző egységet vagy szovettenyészet-fertőző dózist) tartalmaz 0,1-1,0 mm dóri stér fogatban, például iütramuszkuiáris, szubku.tán vagy intradermális beadásra. Ezen kívül, mivel a flavivírusok képesek lehetnek nyálkahártyán keresztül fertőzni az emberi gazdaszervezeteket, így például orális úton is [Gresikova és mtsai., „Yick-borne Encephaiitis, In The Arbovíruses, Fcology and Epidemioiogry, szerk. Monath, CRC »κ
Μ « $ ** »♦·
Press. Boca Haton, Florida, Volurne IV, 177-203 (1988)), a vakcinavlrust beadhatjuk nyálkahártyán keresztül is, és így is. protektív immunválaszt érhetünk el. A vakcinát beadhatjuk elsődleges prof Hektikus szerként felnőttekbe vagy gyerekekbe flavivirus~fertőzés kockázata esetén. A vakcinát alkalmazhatjuk továbbá másodlagos szerként flavivírus-fertőzött páciensek kezelésére, amivel flavivírusok elleni immunválaszt stimulálhatunk.
Előnyös lehet a sárgaláz-vakclnavektor-rendszer alkalmazása egy adott, első vírus ellen gazdaszervezet immunizálására (ez lehet például a japán encephaíitisvírus), majd később ugyanazt a személyt egy második vagy harmadik vírus ellen -újra .immunizálhatjuk egy másik kiméra konstrukciót alkalmazva. A .kiméra sárgái .áz vírust alkalmazó rendszer jelentős előnye, hogy a vektor önmaga nea vált ki erős immunitást. Ugyanakkor a sárgalázzal szembeni korábbi immunitás sem. zárja ki a kiméra vakcina alkalmazását heterológ génexpressziős. vektorként. Ezek az előnyök annak köszönhetők, hegy a sárgaláz-vakcina E-génjének azt a szakaszát., .amely a sárgalázzal szembeni közömbösítést (védekezést) kiváltó antigéneket kódolja, eltávolítottuk és egy másik, heterológ génnel helyettesítettük, amely nem eredményez- keresztvédekezést sárgalázzal szemben. Bár az YFi7D-vírus nem strukturális fehérjéi szerepet játszhatnak a védekezésben, például NSl-elleni antitestek termelése útján, ami a fertőzött sejtek kompiementfüggő, antitest-közvetített lizisében játszik szerepet (Sch les inger és mtsai., J. Immunolog-y. 135, 2805-2809 (1985) vagy az 'NS3~mai vagy a vírus más * κ· «*« 9 * * ·*.♦»'* « » ♦ *·* #<· fehérjéivel szembeni oifotoxikus ϊ-sejt-válaszok indukálása folytán,· mégis valószínűtlen az, hogy ezek a válaszok megszüntetnék az életképes virusvakcina azon képességét,· .hogy közömbösítő antitestek termelését stimulálja,.. Ezt támasztja, alá az, hogy (1) azok a személyek, akik előzőleg JE-virussal fertőződtek, az YFl?D-vel való vakcinázásr-a hasonlóképpen reagáltak azokhoz a személyekhez, akik nem estek át korábban JS~fertőzésen, továbbá (2) azok a személyek, akik előzőleg YF17D-vakcinát kaptak, az ismételt, vakcinázásra a közömbösítő antitsst-titerek emelésével válaszolnak [Swset és mtsai., Am. u. Trop, Med. Hyg. 11, 562-569 (1962)1. így tehát a kiméra vektor alkalmazható olyan populációkban, amely - korábbi természetes .fertőződés vagy vakcinázás következtében - immunis sárgalázzal szemben, és alkalmazható ismételten vagy több, különböző konstrukcióval való egyidejű vagy sorozatos immunizálásra. A konstrukciók között lehetnek például japán, eneephaiítisböi, St. Louis encephalifcisből vagy Nyugat Nilus-vírusokból származó íriszért eket tartalmazó sárgaláz-kimérák.
Vakcinákban történő alkalmazás esetében szakember számára ismert adjuvánsokat is használhatunk. A kiméra vakcinák ÍESsunogén hatását fokozó adjuvánsok lehetnek például llposzóma készítmények, szintetikus adjuvánsok, például szaponinok (például GS21), muramil-peptid, monofoszforillipid-A, vagy polífoszfazin. Bár ezeket az adjuvánsokat jellemző módon inaktíváit vakcinákkal szembeni immunválaszok fokozására alkalmazzák, életképes vakcinákkal szintén alkalmazhatók. Nyálkahártyán keresztül (néldáui orálisan) * ♦'* célbajuttatott kiméra vakcina esetében hasznosak a nyalkahártya-adjuvánsok, például as Eb coli hőlabilis toxínja (ITi vagy az LT-mutánsszármazékai. Ezen kívül azok a citokínokét kódoló gének, amelyeknek adjuváns aktivitása van, szintén inszertálhatók a sárgalázvektorokba. így például az olyan citokineket kódoló gének, mint amilyen a GM-CSF, az XL-2, az IL-1'2, az IL—13 vagy az Ib-5, heterolög flavívirus-génekkel együtt inszertálhatók. fokozott immunválaszt eredményező vakcinák előállítása érdekében, vagy cellurális, humoráils vagy nyálkahártya-válaszok kiváltása irányában specifikusaiban célzott immunitás -modulálására. A vakcinában történő alkalmazás mellett - nyilvánvaló módon - a találmány szerinti vektorok alkalmazhatók génterápiás eljárásokban is abból a célból, hogy terápiás génterméket a páciens sejtjeibe juttassunk. Ezekben az eljárásokban a terápiás géntermékeket kódoló géneket a vektorokba inszertál™ juk, például a prM-E-fehérjét kódoló gén helyére.
A sárgaláz-vektorrendszer további előnye, hogy a fiavivirusok a sejtek citoplazraájában replíkálődnak, ezért a virnsreplikációs stratégia nem foglalja magában a vírusos-
integrálődását a gazdasejtb e [Chambers és mtsai.,
vivírus Genome Or gani za t ion, Exp r es ?sion, and.
ication. In Annuai .fíeviev of . Mi czObiol ogy, 44, 649-688
ö) ], ami bi ztonsagí megfontolá sokból igen j eléntős.
As idéz ;ett publikációk telj? ís egészükben a kltanitás
részét képezik.
* « ·#>
SZEKVENCIÁLIS ΤΑ
AS 1, AZONOSÍTÖSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;
HOSSZA; 21 bázispár
TÍPUSA; nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ; egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: C.DNS
AZ X. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA;
CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA:; lineáris
MOLEKULÁT í PUS : cDN'S
A 2. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA
A 3. AZONOSÍTÖSZÁMÖ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA; 21 bázispár TÍPUSA: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ; egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
- 41 - ... .. ... .., ♦ * * * » ♦ Λ * « **♦ « A ν ♦* * * * * * < Κ « * *Χ »♦ Μ «♦«
MOLEKULÁTίFüS; cDNS
Α. 3. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C 21
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐT:
HOSSZA: 2δ fcázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 4. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA 26
AZ 5 . AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: '21 bázíspár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
AZ 5, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGGTAGATT GGTGTGCATT G .21
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 26 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav « *
HÁNY SZÁLÚí egy
TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris
MOLEKULÁT! PUS; cDNS
A 6. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA. LEÍRÁSA:
AACCCTCAGT ACGACCCGCO GTTTÁA
A ?♦ AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 toásispár TÍPUSA: nukle ins av HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 7, AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAGGTGAATT GAAGTGCTCT A
A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 feázispár TÍPUSA.: nukleinsav HÁNY SZÁLÚ: egy TOPOLÓGIÁJA; lineáris MOLEKULATÍ.PUS: cDNS A 8. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA
ACCCCCASCA CCACCCGCGG ΤΤΤΑΆ .A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
* » X * ***
HOSSZA: 21 bázispár
T1 PUS A: nu k 1 e i n s av
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 9. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AAAAGGAACA GTTGITCTCT A 21
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA; nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 10. AZONOSÍTÓSZÁMÖ SZEKVENCIA LEtSÁSA:
ACCCGAAGTG TCAACCGCGG ΤΤΤΆΑ 25
A 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAT:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 bárispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: 1ine ár i s
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 11. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AACGTGÁATA GTTGCATAGT C
A 12. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 búsispán
TÍPUSA: nukieinsav
HÁNY SZÁLÚ; egy
TOPOLóGIÁJA: 1.i.neár í s
MOLEKULÁT 1PUSi cDNS
A 12. AZONOSíTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACCGTTGGTC GCACCCGCGG TTTAA 25
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 21 'bázispár
TÍPUSA: nukieinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA; lineáris
MOLEKULÁT íRúS: cDNS
A 13. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
AATTTCOAAA GGTGGAAGGI C 21
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HŐS S ZA; 2 6 barisp ár
TÍPUSA; nukieinsav
HÁNY SZÁLÚ; egy
TOPOLÓGIAJA; 1ineáris
MOLEKULA!í PÚS: eDNS
A 14. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
GACGGGTGTT TÁCAGCCGCG GTTIAA
A IS. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI: A SZEKVENCIA JELLEMZŐI;
HOSSZA: 21 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: 1ineáris
MOLEKULÁTíPUS: cDNS
A 15. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
TACTGCGAAC GACG7TGCCA C
A. 16.. AZONOSÍTÓSZÁMÚ SZEKVENCIA ADATAI:
A SZEKVENCIA JELLEMZŐI:
HOSSZA: 25 bázispár
TÍPUSA: nukleinsav
HÁNY SZÁLÚ: egy
TOPOLÓGIÁJA: lineáris
MOLEKULATÍPUS: cDNS
A 16. AZONOSÍTŐSZÁMÖ SZEKVENCIA LEÍRÁSA:
ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA

Claims (25)

1. Kínéra, életképes:, fertőző, legyengített vírus, amely tartalmaz egy sárgalázvírust, amelyben a prh-E-fehérjét kódoló nukleotidszekveneia deistáivá, csonkolva vagy mutálva van, ás amely így nem expresszál funkcionális sárgalázvirus-prdE-fehérjét, és a aárgalázvirus genomjába integrálva egy második, eltérő flavivírns prE-E-fehérjéjét kódoló nukleotídszekvenciát, oly mádon, hogy a második fiavivlrus prM-Efahérjéje expresszálődni zenes,
2. Az 1. igénypont szerinti kimére vírus, amely második tlavívirusként japán encephalitis (JE) vírusból származó prM-E-fehérjót tartalmaz.
3. áz 1. igénypont szerinti kimére vírus, amely második flavívirusként 1-á. t.ipusú dengne-vírusok bármelyikéből származó prM-E-rehérjét tartalmaz.
4. Az 1. igénypont szerinti kiméra-virus, amely második £lavívirusként Murray Valiey enoephaiítisvítusból, St.. Louis enoephaii.tisvirnsböi , byugat-hílus-virusból, kullancs által hordozott encephalitis vírusból, hepatitis-C vírusból, Kunjín-vírusból, közép-európai encephaütisvirusbói, orosz tavasz-nyári enoephaiítisvítusból, Poeassan-virnsból,
Kyasanur-erdő betegség vírusából és Omszki gyomorvérzéses láz vírusából származó prM-fehérjét tartalmaz,
5. Az 1-1. igénypontok bármelyike szerinti kimére vírus, amelyben a második, el térő fiavivirus prd-ü-fehérjej ét kódoló nukleotidszekvencía e sárgalázvirus prM-E-fehérjéjét kódoló n u kIe o 11d s z e k v enc i á s helyettesíti.
6. Az 1~5. igénypontok bármelyike szerinti kimére vírus, amelyben a második, eltérd fisvivírus prM~E---f ehér j é j ét kódoló nukieotidszekvencia egy, a prM-fehérje M~fehérjévé történő hasadását megakadályozó mutációt tartalmaz.
7. Az 1-6. igénypontok bármelyike szerinti kiméra vírus, amelyben a kiméra fiavivirus megalkotása során a C/prM- és az E/ESl-iilesztéseknél található szignalszekvenc1á k megm a radt a k.
8. Kiméra, életképes, fertőző, legyengített vírus alkalmazása páciensben flavívlrus-fertőzés kezelésére vagy megelőzésére szolgáló gyógyszer előállítására, amely kiméra, életképes, fertőző, legyengített vírus tartalmaz egy sárgalázvírust, amelyben a prM~E~.febérjét kódoló nukieot idszekvencia; deletáiva, csonkolva vagy mutálva van, éa amely igy nem enpresszái funkcionális sárgalázvírus-prME-febérjét, és a sárgalázvirus genomjába integrálva egy második, eltérő fiavivirus prM-E-feherjéjét kódoló nukieotíd« ««** ·· 48 - .......
szekvenciát, miáltal a második flavivírus prtí-S-fehér jéje expresszálódni képes.
9. A 8. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a második flavivírus japán eneephalítis (át? vírus.
10. A S. igénypont szs?rinti alkalmazás, ahol a második flavivírus az 1-4. típusú dengue-vírusok bármelyike.
11. A δ. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a második fiává vírus an alábbi vírusok bármelyike::
Hartáy Vaiiey eneephalítis virus, St. Louis eneephalítis vírus, Nyugat-Nílns-vírus, kullancs által hordozott eneephalítis vírus, hepatitis-C vírus, Kuniin-virus, közép-európai sncephal.it isvirus, orosz tavasz-nyári encephaiitísvírus, Powassan-vírus, Kyasanur-erdő betegség vírus és omszki gyomorvérzéses láz vírus.
'
12. A 8-11. igénypontok bármelyike szer inti alkalmazás, ahol a második, eltérő flavivírus prM-E-fehérgéjét kódoló nukleotid-szekvencia a sárgalázvirus prA-E-fehérjéjét kódoid nakleotfdszekvenciát helyettesíti.
13. A 8-12. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a második, eltérő flavivírus prM-fehérjéjét kódoló nskleGtídszekveneía egy olyan mutációt tartalmaz, amely megakadályozza a prM-E-fehérjét eredményezd hasadását.
φ *
14. A S-13. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol a kiméra fiavivirus-konstrukcíőban a C/prd- és az E/NE 1-1 Ítész rés éknél található szignál szekvenciák megmaradtak.
15. Kimére, életképes, fertőző, legyengített vírust kódoló nukleinsavmolekuia, amely vírus tartalmaz egy sárgalázvírust, amelyben, a prM-E~fehérjót kódoló nskleotidszekveneia tíeietáima, csonkolva vagy mutálva van, éa amely így nem e.xprasszál funkoionáiis sárgeiázvirus-prME~fehérjót, és a sárgalázvirus genomjába integrálva egy második, eltérő flavi vírus prM-E-fehérjéjét kódoló nukieotidszekvenciát, miáltal a második fiavlvírus prM-E~fehérjéje expresszálódni képes.
1.6, a lő, igénypont szerinti nukleinsavszekvencia, amely második flavívirusként japán encephalítis blEj vírustól származó prM-E-fehérjét kódol.
17. A lő. igénypont szerinti nukleinsav-moleknla, amely második f lavívirusként 1-1.. típusú dongna-v 1 msek bármelyikéből származó prk!~E~fehérjét kódol.
18. A 15, igénypont szerinti nukleinsav-molekula, amely második f 1 avívá.tusként az alábbi vírusok bármelyikéből származó prM-S-.fehérjét kódol:
+ **
Murray Válley encephaiitis vírus, St. Louis enoephalitis vírus, hyugat-díl/us-vi rus, kullancs által 'hordozott encephalrtis vírus, hopati.ti.s~C vírus, Kuni in-vírus, közép-európai encephaiitIsvlras, orosz tavasz-nyári encephalitísvírus, Powassan-vírus, Kyasarmr-erdő betegség vírus és omszki gyomorvérzéses láz vírus.
18. A 15-18. igénypontok bármelyike szerinti nuklei.nsav-s zekvenoia, amelyben a második,· eltérő flavivírus prM~ E-fehérjéjét kódoló nukleotid-szekvencia a sárgalázvirus ptM-E-sehérjéjét kódoló nukieotldszekvenoiát helyettesíti.
20. A 15-12. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvencia, amelyben a második, eltérő flavivírus prM~ fehérjéjét kódoló nukleotidszekvencia egy olyan mutációt tartalmaz, amely megakadályozza a prM-fehérje ki-fehérjét eredményező hasadását.
21. A 15-20. igénypontok bármelyike szerinti nukleinsav-szekvencia, amely olyan kimére flavi.virus-konstrukoiőt kódol, amelyben a. C/prM- és az E./hSl-iliesztéseknéi található szúgnáIszekvenciák megmaradtak.
22. A 15-21. igénypontok bármelyike szerinti nuk.le.in~ sav-molekula génterápiában való alkalmazásra.
23. Páciensben flavi.vlrus-fertőzés megelőzésére vagy kezelésére szolgáló gyógyszer, amely gyógyszer az 1-7>
X igénypontok bármelyike szerinti, kamera, életképes, legyengített vírust tartalmaz.
24. Eljárás a 23, igénypont szerinti gyógyszer előállítására, azzal jellemezve, hogy 1-2. igénypontok bármelyike szerinti, kimére, életképes, legyengített vírus gyógyászat ilag hatásos mennyiségét megfelelő exoiplenssel összekeverjük .
25. Páciensben fiavívirus-fertőzés megelőzésére vagy kezelésére szolgáló vakcina, amely vakolna az 1-7, igénypontok .bármelyike szerinti, kiméra, életképes, fertőző, legyengített vírust tarta.íma.z,
26. A 25. igénypont szerinti vakcina, amely adjutánst tartaImaz.
27. Eljárás a 26. igénypont szerinti vakcina élőéülkására, azzal jelier.ezve, hogy 1-7. igénypontok bármelyike szerinti, kiméra, életképes, fertőző, legyengített vírus fiavívirus-fertőzés megelőzésére vagy kezelésére alkalmas mennyiségét adjuvánssal összekeverjük.
HU0002139A 1997-02-28 1998-03-02 Chimeric flavivirus vaccines HU228705B1 (en)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US80744597A 1997-02-28 1997-02-28
US766498A 1998-01-15 1998-01-15
PCT/US1998/003894 WO1998037911A1 (en) 1997-02-28 1998-03-02 Chimeric flavivirus vaccines

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HUP0002139A2 HUP0002139A2 (hu) 2000-10-28
HUP0002139A3 HUP0002139A3 (en) 2001-10-29
HU228705B1 true HU228705B1 (en) 2013-05-28

Family

ID=26677253

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU0002139A HU228705B1 (en) 1997-02-28 1998-03-02 Chimeric flavivirus vaccines

Country Status (21)

Country Link
EP (3) EP2251036A1 (hu)
JP (2) JP4504464B2 (hu)
KR (1) KR100517323B1 (hu)
CN (1) CN1187088C (hu)
AT (2) ATE468858T1 (hu)
AU (1) AU740961B2 (hu)
BR (1) BR9807873A (hu)
CA (1) CA2282790C (hu)
CZ (1) CZ300172B6 (hu)
DE (2) DE69841690D1 (hu)
DK (2) DK0977587T3 (hu)
ES (2) ES2345614T3 (hu)
HK (1) HK1025743A1 (hu)
HU (1) HU228705B1 (hu)
IL (4) IL131600A0 (hu)
NO (1) NO329693B1 (hu)
NZ (1) NZ337522A (hu)
PL (1) PL192957B1 (hu)
PT (2) PT1625852E (hu)
RU (1) RU2209082C2 (hu)
WO (1) WO1998037911A1 (hu)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6962708B1 (en) 1997-02-28 2005-11-08 Acambis, Inc. Chimeric flavivirus vaccines
AU778988B2 (en) 1998-06-04 2004-12-23 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US7227011B2 (en) * 1998-06-04 2007-06-05 United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
US7009044B1 (en) * 1999-06-04 2006-03-07 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services HCV/BVDV chimeric genomes and uses thereof
US7425437B2 (en) 1999-11-26 2008-09-16 Crucell Holland B.V. Vaccines against West Nile Virus
WO2001039802A1 (en) * 1999-12-01 2001-06-07 Oravax, Inc. Chimeric flavivirus vaccines
US6589531B1 (en) * 2000-01-21 2003-07-08 The Regents Of The University Of California Recombinant yellow fever virus and method of use thereof
DE60137491D1 (de) * 2000-02-10 2009-03-12 Us Gov Nat Inst Health Vollständiger, infektiöser cdna klon des tick borne flavivirus
AU3844101A (en) 2000-02-16 2001-08-27 Us Health Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras
AU2007202304B2 (en) * 2001-04-04 2010-03-18 THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection
FR2823222B1 (fr) * 2001-04-06 2004-02-06 Merial Sas Vaccin contre le virus de la fievre du nil
US7740863B2 (en) 2001-04-06 2010-06-22 Merial Recombinant vaccine against West Nile Virus
EP2305299B1 (en) 2001-05-31 2017-03-01 GlaxoSmithKline Biologicals SA Chimeric alphavirus replicon particles
US20030232324A1 (en) 2001-05-31 2003-12-18 Chiron Corporation Chimeric alphavirus replicon particles
CN1551782A (zh) 2001-06-01 2004-12-01 ��������ķ������ 嵌合黄病毒载体
US6682883B1 (en) * 2001-07-19 2004-01-27 Acambis, Inc. Diagnosis of flavivirus infection
RU2313367C2 (ru) * 2001-10-19 2007-12-27 Экэмбис, Инк. Способы профилактики и лечения инфекции, вызываемой флавивирусами у животных
EP1461441A4 (en) * 2001-11-26 2006-02-22 Univ Queensland FEEDING SYSTEM FOR FLAVIVIRUS VACCINES
EP1471873A4 (en) 2002-01-15 2005-03-16 Acambis Inc VACCINES AGAINST FLAVIVIRUS
DE60233038D1 (de) 2002-06-20 2009-09-03 Pasteur Institut Infektiöse cDNA eines zugelassenen Impfstammes des Masern Virus. Verwendung in immunogenen Zusammensetzungen
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
WO2004009764A2 (en) * 2002-07-19 2004-01-29 Board Of Regents, The University Of Texas System Methods and compositions concerning altered yellow fever virus strains
DE60330708D1 (de) 2002-11-15 2010-02-04 Sanofi Pasteur Biologics Co Impfstoff gegen das west-nile-virus
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
WO2005040390A1 (fr) * 2003-07-21 2005-05-06 Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. Vaccin recombine utilisant le virus de la fievre jaune comme vecteur
CN1304579C (zh) * 2003-07-21 2007-03-14 上海天甲生物医药有限公司 重组的以黄热病病毒为载体的疫苗
CN103088038B (zh) * 2004-07-12 2015-06-24 美国天甲生物医药有限公司 黄病毒疫苗
EA015907B1 (ru) * 2004-10-20 2011-12-30 Санофи Пастер Байолоджикс Ко. Рекомбинантный флавивирус и его применение
CA2591665C (en) 2004-12-20 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof
AU2005320001B2 (en) 2004-12-24 2011-05-19 The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone
BRPI0609949A2 (pt) 2005-04-24 2010-05-11 Acambis Inc flavivìrus recombinante, seu uso na preparação de vacina, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico e método para atenuar candidato a vacina de flavivìrus
AU2006245734C1 (en) 2005-05-12 2012-05-24 Crucell Holland B.V. Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof
BRPI0504945B8 (pt) 2005-10-31 2022-08-02 Fundacao Oswaldo Cruz Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos.
CU23586A1 (es) 2005-11-22 2010-10-30 Ct Ingenieria Genetica Biotech Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus
CA2654712C (en) 2006-06-06 2015-05-05 Crucell Holland B.V. Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof
RU2009105099A (ru) 2006-07-14 2010-08-27 Санофи Пастер Байолоджикс Ко. (Us) Конструирование рекомбинантных вирусных вакцин путем прямой транспозон-опосредованной инсерции чужеродных иммунологических детерминант в белки векторного вируса
FR2906724B1 (fr) 2006-10-04 2009-03-20 Sanofi Pasteur Sa Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue.
RU2541784C2 (ru) 2006-11-07 2015-02-20 Санофи Пастер Байолоджикс Ко. Лиофилизированная композиция для индукции иммунного ответа на флавивирус, композиция и способ для ее получения
CA2676689C (en) * 2007-01-31 2014-12-16 Sanofi Pasteur Biologics Co. Recombinant bicistronic flavivirus vectors
US20110003884A1 (en) * 2007-02-09 2011-01-06 Pugachev Konstantin V Viral Vectors and Methods of Use
EP2589392B1 (en) 2008-03-05 2016-11-30 Sanofi Pasteur Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition
BRPI0908936A2 (pt) * 2008-03-14 2017-03-28 Sanofi Pasteur Biologics Co vacinas de flavivírus de replicação defeituosa e vetores de vacina
EP2143440A1 (fr) 2008-07-09 2010-01-13 Sanofi Pasteur Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués
EP2353609A1 (en) 2010-02-04 2011-08-10 Sanofi Pasteur Immunization compositions and methods
SG11201500412TA (en) 2012-07-24 2015-02-27 Sanofi Pasteur Vaccine compositions
US20150265695A1 (en) 2012-07-24 2015-09-24 Sanofi Pasteur Vaccine compositions for prevention against dengue virus infection
KR20150072411A (ko) 2012-10-03 2015-06-29 사노피 파스퇴르 일본 뇌염, 홍역, 유행성 이하선염, 및 풍진에 대한 백신접종
BR112015012515B1 (pt) 2012-11-30 2023-04-11 Sanofi Pasteur Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola
PE20211814A1 (es) 2013-03-15 2021-09-14 Takeda Vaccines Inc Composiciones y metodos de construcciones quimericas del virus del dengue en vacunas
BR112015031226A2 (pt) 2013-06-21 2017-08-29 Merck Sharp & Dohme Composição de vacina, e, uso da composição de vacina
CN103352029A (zh) * 2013-07-29 2013-10-16 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用
TW201620546A (zh) 2014-09-02 2016-06-16 賽諾菲巴斯德公司 疫苗組合物
EP3031923A1 (en) * 2014-12-11 2016-06-15 Institut Pasteur Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition
US10449243B2 (en) 2014-12-22 2019-10-22 Merck Sharp & Dohme Corp. Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof
EP3316905A1 (en) 2015-07-03 2018-05-09 Sanofi Pasteur Concomitant dengue and yellow fever vaccination
CN105400799B (zh) * 2015-12-22 2018-12-28 成都生物制品研究所有限责任公司 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用
WO2017109698A1 (en) 2015-12-22 2017-06-29 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic formulation
GB201716307D0 (en) * 2017-10-05 2017-11-22 Univ Leuven Kath Chimeric yellow fever zika virus strain
WO2019069130A1 (en) 2017-10-05 2019-04-11 Sanofi Pasteur COMPOSITIONS FOR RECALL VACCINATION AGAINST DENGUE
KR20190127605A (ko) * 2018-05-04 2019-11-13 에스케이바이오사이언스(주) 키메라 지카바이러스 백신
WO2020051328A1 (en) 2018-09-05 2020-03-12 Takeda Vaccines, Inc. Assay for determining antibody response to dengue virus
US11464815B2 (en) 2018-09-05 2022-10-11 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine unit dose and administration thereof
US11426461B2 (en) 2018-09-05 2022-08-30 Takeda Vaccines, Inc. Methods for preventing dengue and hepatitis A
MX2021002586A (es) 2018-09-05 2021-06-08 Takeda Vaccines Inc Dosis unitaria de vacuna contra el dengue y administracion de esta.
GB201814563D0 (en) * 2018-09-07 2018-10-24 Univ Leuven Kath Chimeric flavivirus lyssavirus vaccines
WO2021034349A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 Takeda Vaccines, Inc. Methods for preventing dengue and hepatitis a
WO2021174059A1 (en) 2020-02-27 2021-09-02 Takeda Vaccines, Inc. Method for removing host cell dna from virus preparation
CN113215116B (zh) * 2021-05-11 2022-07-19 中国科学院动物研究所 基于朝阳病毒载体的嵌合病毒、疫苗及其应用
JPWO2022249757A1 (hu) * 2021-05-27 2022-12-01
WO2023147342A2 (en) 2022-01-25 2023-08-03 Takeda Vaccines, Inc. Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture
WO2023158989A1 (en) 2022-02-15 2023-08-24 Takeda Vaccines, Inc. Dengue vaccine batch mixing process
WO2023215383A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Takeda Vaccines, Inc. Computer-based determination of flavivirus infectivity

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL91304A0 (en) * 1988-08-20 1990-03-19 Us Health Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus
ES2153223T3 (es) * 1991-09-19 2001-02-16 Us Health Flavivirus quimericos y/o flavivirus de crecimiento restringido.

Also Published As

Publication number Publication date
AU6443198A (en) 1998-09-18
EP1625852A1 (en) 2006-02-15
CA2282790C (en) 2011-04-19
EP1625852B1 (en) 2010-05-26
ES2345614T3 (es) 2010-09-28
NO994185L (no) 1999-10-27
IL193170A (en) 2015-08-31
CZ300172B6 (cs) 2009-03-04
IL207517A0 (en) 2010-12-30
PT977587E (pt) 2005-10-31
IL131600A0 (en) 2001-01-28
CZ306499A3 (cs) 2000-01-12
PL335481A1 (en) 2000-04-25
NO994185D0 (no) 1999-08-27
EP2251036A1 (en) 2010-11-17
JP2001514622A (ja) 2001-09-11
ATE468858T1 (de) 2010-06-15
DE69830579T2 (de) 2006-05-04
IL193170A0 (en) 2009-02-11
HUP0002139A2 (hu) 2000-10-28
CN1187088C (zh) 2005-02-02
HK1025743A1 (en) 2000-11-24
EP0977587B1 (en) 2005-06-15
PL192957B1 (pl) 2006-12-29
KR100517323B1 (ko) 2005-09-27
ES2244050T3 (es) 2005-12-01
HUP0002139A3 (en) 2001-10-29
BR9807873A (pt) 2000-03-21
WO1998037911A1 (en) 1998-09-03
NO329693B1 (no) 2010-12-06
ATE297757T1 (de) 2005-07-15
EP0977587A4 (en) 2000-08-02
KR20000075830A (ko) 2000-12-26
RU2209082C2 (ru) 2003-07-27
NZ337522A (en) 2001-02-23
CA2282790A1 (en) 1998-09-03
AU740961B2 (en) 2001-11-15
DK0977587T3 (da) 2005-10-17
IL207516A0 (en) 2010-12-30
PT1625852E (pt) 2010-08-27
CN1253506A (zh) 2000-05-17
DK1625852T3 (da) 2010-09-20
JP2010057496A (ja) 2010-03-18
DE69841690D1 (de) 2010-07-08
EP0977587A1 (en) 2000-02-09
JP4504464B2 (ja) 2010-07-14
DE69830579D1 (de) 2005-07-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU228705B1 (en) Chimeric flavivirus vaccines
US6962708B1 (en) Chimeric flavivirus vaccines
US8088391B2 (en) West nile virus vaccine
WO1998037911A9 (en) Chimeric flavivirus vaccines
KR20180137514A (ko) 어린이 및 젊은 성인에서 뎅기 바이러스에 대한 백신접종 조성물 및 방법
WO2001039802A9 (en) Chimeric flavivirus vaccines
WO2017136419A1 (en) Compositions and methods for generating an immune response to a flavivirus
EP1261701B1 (en) FULL-LENGTH INFECTIOUS cDNA CLONES OF TICK BORNE FLAVIVIRUS
MXPA99007949A (es) Vacunas de flavivirus quimerico