PL192957B1 - Chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, jego zastosowanie oraz cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus - Google Patents
Chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, jego zastosowanie oraz cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirusInfo
- Publication number
- PL192957B1 PL192957B1 PL335481A PL33548198A PL192957B1 PL 192957 B1 PL192957 B1 PL 192957B1 PL 335481 A PL335481 A PL 335481A PL 33548198 A PL33548198 A PL 33548198A PL 192957 B1 PL192957 B1 PL 192957B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- virus
- prm
- protein
- flavivirus
- chimeric
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 150
- 241000710831 Flavivirus Species 0.000 claims abstract description 104
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 97
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 80
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 60
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 60
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 36
- 241000710772 Yellow fever virus Species 0.000 claims abstract description 34
- 229940051021 yellow-fever virus Drugs 0.000 claims abstract description 33
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims abstract description 26
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 claims abstract description 22
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 5
- 241000710842 Japanese encephalitis virus Species 0.000 claims description 137
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 37
- 208000004006 Tick-borne encephalitis Diseases 0.000 claims description 33
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 33
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 24
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 24
- 208000003152 Yellow Fever Diseases 0.000 claims description 22
- 201000005805 Murray valley encephalitis Diseases 0.000 claims description 18
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 17
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 13
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 13
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 claims description 9
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 claims description 9
- 208000037404 Central European encephalitis Diseases 0.000 claims description 8
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 claims description 8
- 241000710912 Kunjin virus Species 0.000 claims description 8
- 241001466978 Kyasanur forest disease virus Species 0.000 claims description 8
- 241000725177 Omsk hemorrhagic fever virus Species 0.000 claims description 8
- 241000710884 Powassan virus Species 0.000 claims description 8
- 241000907329 Russian Spring-Summer encephalitis virus Species 0.000 claims description 8
- 206010057199 Flaviviral infections Diseases 0.000 claims description 7
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims description 4
- 101710204837 Envelope small membrane protein Proteins 0.000 abstract description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 6
- 101710088839 Replication initiation protein Proteins 0.000 abstract description 4
- 206010054261 Flavivirus infection Diseases 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 206010014596 Encephalitis Japanese B Diseases 0.000 description 116
- 201000005807 Japanese encephalitis Diseases 0.000 description 116
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 55
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 30
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 27
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 18
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 17
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 17
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 10
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 10
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 10
- XTEOJPUYZWEXFI-UHFFFAOYSA-N butyl n-[3-[4-(imidazol-1-ylmethyl)phenyl]-5-(2-methylpropyl)thiophen-2-yl]sulfonylcarbamate Chemical compound S1C(CC(C)C)=CC(C=2C=CC(CN3C=NC=C3)=CC=2)=C1S(=O)(=O)NC(=O)OCCCC XTEOJPUYZWEXFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 10
- 102100034349 Integrase Human genes 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 8
- 101710145006 Lysis protein Proteins 0.000 description 8
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 7
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 7
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 6
- 229940124928 YF-Vax Drugs 0.000 description 6
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 6
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 6
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 6
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 6
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 6
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 5
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 5
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- 229960001515 yellow fever vaccine Drugs 0.000 description 4
- 108700008783 Hepatitis C virus E1 Proteins 0.000 description 3
- 241000710908 Murray Valley encephalitis virus Species 0.000 description 3
- -1 NS2B Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- 241000710929 Alphavirus Species 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710125507 Integrase/recombinase Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101710144111 Non-structural protein 3 Proteins 0.000 description 2
- 101710144121 Non-structural protein 5 Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010003533 Viral Envelope Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 2
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 2
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 101100020619 Arabidopsis thaliana LATE gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238421 Arthropoda Species 0.000 description 1
- 101710117545 C protein Proteins 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 206010008909 Chronic Hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 241000710829 Dengue virus group Species 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- 101150013191 E gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 239000004398 Ethyl lauroyl arginate Substances 0.000 description 1
- 208000015220 Febrile disease Diseases 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 241000710781 Flaviviridae Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000711557 Hepacivirus Species 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 1
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241000008906 Murine coronavirus Species 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 101800001030 Non-structural protein 2A Proteins 0.000 description 1
- 101800001020 Non-structural protein 4A Proteins 0.000 description 1
- 101800001019 Non-structural protein 4B Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 241000710778 Pestivirus Species 0.000 description 1
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- 108010067390 Viral Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000710886 West Nile virus Species 0.000 description 1
- 239000004234 Yellow 2G Substances 0.000 description 1
- 241000710764 Yellow fever virus 17D Species 0.000 description 1
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 210000003567 ascitic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 229940031567 attenuated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000004294 calcium hydrogen sulphite Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 210000000172 cytosol Anatomy 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000001163 endosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000000799 fusogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003067 hemagglutinative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002008 hemorrhagic effect Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000004726 long-term protective immunity Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920002627 poly(phosphazenes) Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000011324 primary prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 230000009863 secondary prevention Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000003956 transport vesicle Anatomy 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/12—Viral antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/525—Virus
- A61K2039/5258—Virus-like particles
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2770/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/24011—Flaviviridae
- C12N2770/24111—Flavivirus, e.g. yellow fever virus, dengue, JEV
- C12N2770/24161—Methods of inactivation or attenuation
- C12N2770/24162—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Oncology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
1. Chimeryczny zywy, zaka zny, atenuowany wirus, znamienny tym, ze zawiera wirus zó ltej febry, w którym sekwencj e nukleotydow a, koduj ac a bia lka prM-E, poddano delecji, okroje- niu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne bia lko prM-E wirusa zó ltej febry nie ulega lo ekspresji, i zintegrowan a do genomu tego wirusa zó ltej febry sekwencj e nukleotydow a, koduj aca bia lko prM dru- giego, innego flawiwirusa, tak aby to bia lko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulega lo ekspresji. 9. Zastosowanie chimerycznego zywego, zaka znego, atenuowanego wirusa do wytwarzania leku do pro- filaktyki lub leczenia zaka zenia flawiwirusowego u pacjenta, znamienne tym, ze chimeryczny zywy, zaka zny, atenuowany wirus zawiera wirus zó ltej febry, w którym sekwencj e nukleotydow a, koduj ac a bia lka prM-E, poddano delecji, okroje- niu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne bia lko prM-E wirusa zó ltej febry nie ulega lo ekspresji, i zintegrowan a do genomu tego wirusa zó ltej febry sekwencj e nukleotydow a, koduj aca bia lko prM dru- giego, innego flawiwirusa, tak aby to bia lko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulega lo ekspresji. 17. Cz asteczka kwasu nukleinowego koduj aca chimeryczny zywy, zaka zny, atenuowany wirus, znamienna tym, ze wirus zawiera wirus zó ltej febry, w którym sekwencj e nukleotydow a, koduj aca bia lka prM- E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne bia lko prM-E wirusa zó ltej febry nie ulega lo ekspresji, i zintegrowan a do genomu tego wirusa zó ltej febry sekwencj e nukleotydow a, koduj aca bia lko prM dru- giego, innego flawiwirusa, tak aby to bia lko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulega lo ekspresji. PL PL PL
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, jego zastosowanie do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zakażenia flawiwirusowego u pacjenta oraz cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus.
Wirusy według wynalazku mogą być stosowane w szczepionkach przeciwko chorobom wywoływanym przez flawiwirusy.
Kilka wirusów z rodziny flawiwirusów stanowi obecnie lub potencjalnie zagrożenie dla zdrowia publicznego w skali ogólnoświatowej. Na przykład istotny problem zdrowia publicznego stanowi japońskie zapalenie mózgu, którym zagrożone są miliony mieszkańców Dalekiego Wschodu. Najważniejszym pojedynczym patogenem, wywołującym chorobę przenoszoną ze stawonogów na ludzi, jest wirus dengi - częstość występowania pierwotnej gorączki dengi ocenia się na 100 milionów przypadków rocznie, a krwotocznej gorączki dengi na ponad 450000. Inne flawiwirusy wciąż powodują różnego rodzaju choroby endemiczne i mogą przenosić się do innych obszarów w wyniku zmian klimatu, populacji wektorów i zmian środowiska, spowodowanych działaniem ludzi. Do tych flawiwirusów należy na przykład wirus zapalenia mózgu St. Louis, powodujący rzadką, lecz ciężką ostro przebiegającą chorobę w środkowo-zachodnich, południowo-wschodnich i zachodnich stanach Stanów Zjednoczonych; wirus Nilu Zachodniego, powodujący chorobę gorączkową, niekiedy powikłaną ostrym zapaleniem mózgu, rozpowszechnioną w całej Afryce, na Środkowym Wschodzie, w krajach byłego Związku Radzieckiego i w niektórych częściach Europy; wirus zapalenia mózgu Doliny Murray, powodujący endemiczną chorobę układu nerwowego w Australii, i kleszczowe zapalenie mózgu, występujące w krajach byłego Związku Radzieckiego i Europy Wschodniej, gdzie występuje wektor - kleszcz z rodzaju Ixodes; wirus ten wywołuje w tych rejonach ciężką postać zapalenia mózgu.
Innym członkiem rodziny flawiwirusów jest wirus zapalenia wątroby typu C (HCV) o organizacji genomu i strategii replikacji podobnej, choć nie identycznej, co flawiwirusy wymienione powyżej. HCV przenosi się głównie drogą pozajelitową i wywołuje przewlekłe zapalenie wątroby, które może prowadzić do powstania marskości i raka wątroby, a w Stanach Zjednoczonych jest najczęstszą przyczyną chorób wątroby wymagających przeszczepu ortotopowego.
Rodzina Flaviviridae jest odrębna od alfawirusów (na przykład WEE, VEE, EEE, SFV itd.) i obecnie znane są trzy jej rodzaje: flawiwirusy, pestiwirusy i wirusy zapalenia wątroby typu C. W pełni rozwinięte, dojrzałe wiriony flawiwirusów zawierają trzy białka strukturalne: białka otoczki (E), kapsydu (C) i błony (M), i siedem białek niestrukturalnych (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B i NS5). Flawiwiriony niedojrzałe, wykrywane w komórkach niedojrzałych, zawierają białko przedbłonowe (prM) (ang. pre-membrane protein), będące prekursorem białka M.
Po związaniu wirionów z receptorami komórki-gospodarza białko E ulega nieodwracalnej zmianie konformacji po ekspozycji na kwaśne pH endosomów, powodują fuzję między dwiema warstwami otoczki wirionów a pęcherzykami endocytarnymi, uwalniając genom wirusa do cytozolu gospodarza. Zawierające prM wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) są niekompetentne w odniesieniu do fuzji, co wskazuje, że dla wytworzenia kompetentnych w odniesieniu do fuzji i w pełni zakaźnych wirusów niezbędna jest proteolityczna obróbka prM (Guirakhoo i wsp., J. Gen. Virol. 72-(cz. 2): 333-338, 1991). Stosując chlorek amonowy w późnej fazie cyklu replikacji wirusa wytworzono zawierające prM wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray i wykazano, że są one niekompetentne w odniesieniu do fuzji. Stosując peptydy swoiste co do sekwencji udowodniono, że prM reaguje z aminokwasami 200-327 białka E. Interakcja ta jest niezbędna do ochrony białka E przed nieodwracalnymi zmianami konformacji, wywoływanymi przez dojrzewanie kwasowych pęcherzyków szlaku egzocytarnego (Guirakhoo i wsp., Virology 191:921-931, 1992).
Cięcie prM dla wytworzenia białka M ma miejsce na krótko przed uwolnieniem wirionów przez furynopodobne białko komórkowe (Stadler i wsp., J. Virol. 71:8475-8481, 1997), co jest niezbędne do pobudzenia aktywności hemaglutynacyjnej, fuzogennej i zakaźności wirionów. Białko M ulega odcięciu od białka prekursorowego (prM) za sekwencją konsensusową R-X-R/K-R (X jest zmienne) i włączeniu do otoczki lipidowej wirusa wraz z biał kiem E.
Sekwencje cięcia zachowały się nie tylko we flawiwirusach, lecz również w innych, nie spokrewnionych z nimi wirusach, jak na przykład PE2 koronawirusów mysich, PE2 alfawirusów, HA wirusów grypy i p160 retrowirusów. Odcięcie białka prekursorowego jest niezbędne dla zakaźności wirusa, lecz nie dla tworzenia się cząstek. Wykazano, że w przypadku chimery TBE-denga 4, zmiana w miejscu cięcia prM powoduje zmniejszenie neurowirulencji tej chimery (Pletnev i wsp., J. Virol. 67:4956-4963,
PL 192 957 B1
1993), co jest zgodne z uprzednimi obserwacjami, że dla pełnej zakaźności konieczna jest skuteczna obróbka prM (Guirakhoo i wsp., 1991, j.w., 1992, j.w.; Heinz i wsp., Virology 198:109-117, 1994). Mediatorami ochronnej odporności mogą być przeciwciała przeciwko białku prM, jak się wydaje, z uwagi na neutralizację uwolnionych wirionów, zawierających pewną ilość nierozciętego prM. Proteolityczne miejsca cięcia PE2 VEE (4 aminokwasy) usunięto przy użyciu mutagenezy ukierunkowanej klonu zakaźnego (Smith i wsp., zebranie ASTMH, 7-11 grudnia 1997).
Mutanty delecyjne, replikowały z dużą skutecznością, a białka PE2, włączane były do cząstek. Mutant ten oceniano u Naczelnych (jednak nie u człowieka) i wykazano 100% serokonwersji i ochronę wszystkich uodparnianych małp przed letalną ekspozycją na wirus.
Przedmiotem wynalazku jest chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, charakteryzujący się tym, że zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa tak, aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dengi, dobrany z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
Korzystnie sekwencję nukleotydów, kodującą białko prM-E wirusa żółtej febry zastąpiono sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
Korzystnie sekwencja nukleotydową kodująca białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
Korzystnie sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
Przedmiotem wynalazku jest ponadto zastosowanie chimerycznego żywego, zakaźnego, atenuowanego wirusa do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zakażenia flawiwirusowego u pacjenta, charakteryzujące się tym, że chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa, tak aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
W korzystnym zastosowaniu drugiego flawiwirusa stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
W korzystnym zastosowaniu drugiego flawiwirusa stanowi wirus dengi, dobranego z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
W korzystnym zastosowaniu drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.
W korzystnym zastosowaniu drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
W korzystnym zastosowaniu sekwencja nukleotydów, kodująca białko prM-E wirusa żółtej febry zastąpiona jest sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
Korzystnie sekwencja nukleotydową kodująca białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
Korzystnie sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
Przedmiotem wynalazku jest również cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, charakteryzująca tym, że wirus zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E,- poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki spo4
PL 192 957 B1 sób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa, tak aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dengi, dobrany z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.
Korzystnie drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
Korzystnie w tej cząsteczce kwasu nukleinowego sekwencję nukleotydów, kodującą białko prM-E wirusa żółtej febry jest zastąpiona sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
Korzystnie sekwencja nukleotydowa kodująca białko prM- E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
Korzystnie sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/-NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
Wirus chimeryczny składa się zatem z genów i produktów genów, odpowiedzialnych za replikację wewnątrzkomórkową pierwszego flawiwirusa oraz genów i produktów genów otoczki drugiego flawiwirusa. Jako że otoczka wirusowa zawiera wszystkie determinanty antygenowe odpowiedzialne za pobudzenie przeciwciał neutralizujących, w wyniku zakażenia wirusem chimerycznym dochodzi do wytworzenia przeciwciał jedynie przeciwko drugiemu flawiwirusowi.
Korzystnym żywym wirusem do zastosowania jako pierwszy flawiwirus w chimerycznych wirusach według niniejszego wynalazku jest wirus żółtej febry. Ten żywy, atenuowany wirus wykorzystywano już co najmniej w jednej szczepionce, znanej jako YF17D, stosowanej do uodparniania ludzi od ponad 50 lat. Szczepionkę YF17D opisano w wielu publikacjach, w tym w publikacjach Smithburn i wsp., (Yellow Fever Vaccination, World Health Org., str. 238, 1956) i Freestone (w pracy pod red. Plotkin i wsp. Vaccines, wydanie II, W.B. Saunders, Filadelfia 1995). Ponadto prowadzi się badania na poziomie genetycznym nad wirusem żółtej febry (Rice i wsp., Science 229:726-733, 1985) i ustalono informacje o korelacji genotypu i fenotypu (Marchevsky i wsp., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).
Do korzystnych flawiwirusów do zastosowania jako drugi flawiwirus w chimerycznych wirusach według niniejszego wynalazku, to znaczy jako źródła uodparniającego antygenu, należą wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE), dengi (DEN, na przykład dowolny wirus dengi typów 1-4), zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV). Do dodatkowych wirusów do zastosowania jako drugi flawiwirus należą wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorą czki krwotocznej. W korzystnym wirusie chimerycznym wedł ug niniejszego wynalazku sekwencję kodującą białko prM-E drugiego flawiwirusa podstawia się zamiast sekwencji kodującej białko prM-E wirusa żółtej febry. W korzystnym wirusie chimerycznym sekwencja kodująca białka prM-E pochodzi z atenuowanego szczepu wirusowego, na przykład szczepu szczepionkowego. Ponadto, jak to dokładniej opisano poniżej, część prM białka może zawierać mutację, uniemożliwiającą cięcie i co za tym idzie wytworzenie dojrzałego białka błonowego.
Wirusy według wynalazku, zastosowanie według wynalazku i cząsteczki kwasu nukleinowego według wynalazku mogą być zastosowane w sposobach profilaktyki lub leczenia zakażenia flawiwirusowego u ssaka, na przykład człowieka, poprzez podawanie chimerycznego flawiwirusa według niniejszego wynalazku, zastosowanie chimerycznych flawiwirusów według niniejszego wynalazku do wytwarzania leków do profilaktyki lub leczenia zakażenia flawiwirusowego, cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej chimerycznego flawiwirusa według niniejszego wynalazku.
Wynalazek ma kilka dogodnych cech. Na przykład, wirusy chimeryczne według niniejszego wynalazku, jako wirusy żywe i dzielące się, można stosować do uzyskiwania długotrwałej odporności ochronnej. Ponieważ wirusy zawierają geny replikacji wirusa atenuowanego (na przykład wirusa żółtej
PL 192 957 B1 febry 17D), powstały wirus chimeryczny jest atenuowany w stopniu umożliwiającym jego bezpieczne zastosowanie u ludzi.
Inne cechy i zalety wynalazku zawarte są w poniższym szczegółowym opisie, rysunkach i zastrzeżeniach.
Figura 1 jest schematycznym przedstawieniem etapów manipulacji genetycznej, przeprowadzonych dla wytworzenia chimerycznego wirusa żółtej febry/japońskiego zapalenia mózgu (YF/JE) według niniejszego wynalazku.
Figura 2 jest zbiorem krzywych wzrostu chimerycznych wirusów YF/JE według niniejszego wynalazku w hodowlach komórkowych, nadających się do wytwarzania szczepionki do zastosowania u ludzi.
Figura 3 jest wykresem przedstawiającym porównanie wzrostu RMS (Research Master Seed, YF/JE SA14-14-2) i YF-Vax w komórkach MRC-5.
Figura 4 stanowi wykres i tabela, przedstawiające wyniki analizy neurowirulencji u myszy, przeprowadzonej z użyciem wirusa chimerycznego YF/JE według niniejszego wynalazku.
Figura 5 jest schematycznym przedstawieniem układu dwóch plazmidów do wytwarzania wirusa chimerycznego YF/DEn-2. Sposób wytwarzania jest w zasadzie taki sam, jak dla wirusa chimerycznego YF/JE.
Figura 6 jest schematycznym przedstawieniem struktury zmodyfikowanych klonów YF, w których dokonano delecji części białka NS1 i/lub ekspresji obcych białek pod kontrolą wewnętrznego rybosomalnego miejsca wejścia (IRES). Fig. 25 ukazuje jedynie region E/NS1 genomu wirusowego. Na końcu karboksylowym białka otoczki (E) wprowadzono kodon stop dla translacji. IRES-1 zapoczątkowuje translację w kierunku końca 3' w obrębie intergenowej otwartej ramki odczytu (ORF), powodując ekspresję obcych białek (na przykład białek E1 i/lub E2 wirusa HCV). Drugie IRES (IRES-2) kontroluje zapoczątkowanie translacji niestrukturalnego regionu YF, w którym ulegają ekspresji zagnieżdżone okrojone białka NS1 (na przykład NS1del-1, NS1del-2 lub NS1del-3). Wielkość delecji NS1 jest odwrotnie proporcjonalna do wielkości ORF związanej z IRES-1.
Figura 7 stanowi wykres ukazujący reakcję przeciwciał neutralizujących u myszy uodpornionych szczepionką chimeryczną YF/JE Sa14-14-2.
Chimeryczne wirusy według wynalazku można stosować w sposobach szczepienia przeciwko zakażeniom flawiwirusowym. Poniżej opisano wytwarzanie i analizę chimerycznych wirusów według niniejszego wynalazku, takich jak chimera wirusa żółtej febry i japońskiego zapalenia mózgu (JE), wirusa dengi typów 1-4 (DEN 1-4), wirusa zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
Białka flawiwirusowe są wytwarzane poprzez translację pojedynczej, długiej otwartej ramki odczytu (kodującej m.in. białka strukturalne, kapsydowe (C), przedbłonowe (prM) i otoczkowe (E), jak również biała niestrukturalne) i złożoną serię proteolitycznych cięć posttranslacyjnych. Wirusy według niniejszego wynalazku, jak to omówiono powyżej, mogą obejmować takie wirusy, w których białka prM i E jednego flawiwirusa zastąpiono białkami prM i E innego flawiwirusa. Tak więc wytwarzanie tych flawiwirusów chimerycznych obejmuje wytwarzanie nowych połączeń pomiędzy białkami kapsydowym a przedbłonowym, oraz między białkiem otoczki a regionem niestrukturalnym (NS1), dwóch róż nych flawiwirusów. Cięcie między każdym z tych zestawów białek (C i prM oraz E i NS1) zachodzi w czasie naturalnej obróbki proteolitycznej białek flawiwirusowych i wymaga obecności sekwencji sygnałowych flankujących połączenia miejsc cięcia.
W wirusach chimerycznych według niniejszego wynalazku zalecane jest, aby sekwencje sygnałowe wirusów tworzących chimery były w zasadzie zachowane, tak aby mogło skutecznie zachodzić cięcie między białkami C a prM i E a NS1. W poniżej opisanych chimerach te sekwencje sygnałowe zostały zachowane. Zamiast tego do połączenia białek chimery C i prM lub E i NS1 można stosować dowolną z wielu znanych sekwencji sygnałowych (zob. na przykład von Heijne, Eur. J. Biochem. 133:17-21, 1983; von Heijne, J. Mol. Biol. 184:99-105, 1985) lub, na przykład, stosując znane sekwencje specjalista może dodawać dodatkowe sekwencje sygnałowe do wykorzystania w chimerycznych wirusach według niniejszego wynalazku. Typowo, na przykład, w skład sekwencji sygnałowych będzie, jako ostatnia reszta, wchodzić aminokwas o małym, pozbawionym ładunku łańcuchu bocznym, taki jak alanina, glicyna, seryna, cysteina, treonina lub glutamina. Inne wymagania odnośnie sekwencji sygnałowych są znane ze stanu techniki (zob. na przykład von Heijne, 1983, j.w.; von
PL 192 957 B1
Heijne, 1985, j.w.). Można również zachować lub w zasadzie zachować sekwencje sygnałowe dowolnego z wirusów tworzących chimerę, tak aby cięcie przebiegło prawidłowo.
Wytwarzanie matryc cDNA do wytwarzania wirusa chimerycznego YF/JE
Wytworzenia pełnej długości matryc cDNA wirusów chimerycznych YF/JE według niniejszego wynalazku, opisanych poniżej, dokonano z użyciem sposobu podobnego do stosowanych uprzednio przez innych badaczy w celu regeneracji YF17D z cDNA do molekularnej analizy genetycznej replikacji YF. Sposób ten opisali na przykład Nestorowicz i wsp. (Virology 199:114-123, 1994).
Pokrótce, wytworzenie wirusa chimerycznego YF/JE według niniejszego wynalazku obejmuje następujące etapy. Dokonuje się propagacji sekwencji genomowych YF w dwóch plazmidach (YF5'3'LV i YFM5,2), kodujących sekwencje YF z nukleotydów 1-2,276 i 8,279-10,861 (YF5'3'LV) i z 1,373-8,704 (YFM5.2) (Rice i wsp., The New Biologist 1:285-296, 1969). Wytwarza się matryce cDNA o pełnej długości poprzez ligację odpowiednich fragmentów restrykcyjnych pochodzących z tych plazmidów. Sposób ten jest najbardziej wiarygodny dla zapewnienia stabilnej ekspresji sekwencji YF i wytworzenia transkryptów RNA o wysokiej zakaźności swoistej.
Zastosowany przez twórców sposób wytwarzania chimer obejmuje zastąpienie sekwencji YF w obrę bie plazmidów YF5'3'LV i YFM5.2 odpowiadającymi im sekwencjami JE od początku białka prM (nukleotyd 478, aminokwas 128) przez miejsce cięcia E/NS1 (nukleotyd 2452, aminokwas 817). Oprócz klonowania cDNA JE niezbędne było przeprowadzenie kilku etapów dla wprowadzenia lub wyeliminowania miejsc restrykcyjnych w sekwencjach YF i JE w celu umożliwienia ligacji in vitro. Strukturę matrycy do regenerowania chimerycznego wirusa YF (C)/JE (prM-E) ukazano na fig. 4. Podobnie wytworzono drugą chimerę, kodującą cały region strukturalny JE (C-prM-E).
Klonowanie molekularne regionu strukturalnego wirusa JE
Ze szczepu JE SA14-14-2 (żywy, atenuowany szczep szczepionkowy JE) wytworzono klony autentycznych genów białek strukturalnych JE, ponieważ właściwości biologiczne i charakterystyka molekularna tego szczepu są dobrze udokumentowane (zob. na przykład Eckels i wsp., Vaccine 6:513-518, 1988; wirus JE SA14-14-2 jest do nabycia w Centers for Disease Control (Ośrodkach Zwalczania Chorób), Fort Collins, Kolorado, i w Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut, które są wyznaczonymi przez Światową Organizację Zdrowia ośrodkami referencyjnymi w kwestii arbowirusów w Stanach Zjednoczonych). Nabyto wirus JE SA14-14-2 na poziomie pasażu PDK-5 i pasażowano go w komórkach LLC-MK2 w celu uzyskania odpowiedniej ilości wirusa do klonowania cDNA. Zastosowany przez twórców sposób obejmował klonowanie regionu strukturalnego w dwóch częściach, nakładających się częściowo na miejsce Nhel (nukleotyd JE 1125), które można zastosować do ligacji in vitro.
Z pojedynczych warstw zakażonych komórek LLC-MK2 ekstrahowano RNA i przeprowadzono syntezę pierwszej nici antysensownej cDNA, stosując odwrotną transkryptazę ze starterem antysensownym (sekwencja nukleotydowa JE 2456-71), zawierającym zagnieżdżone miejsca restrykcyjne Xbal i NarI do klonowania, odpowiednio, początkowo do pBluescript II KS(+) i następnie do YFM5.2 (NarI). Po syntezie pierwszej nici cDNA przeprowadzono powielenie metodą PCR sekwencji JE z nukleotydów 1108-2471, stosują c ten sam starter antysensowny i starter sensowny (sekwencje nukleotydów JE 1108-1130, zawierający zagnieżdżone miejsca restrykcyjne Xbal i NsiI do klonowania, odpowiednio, do pBluescript II i do YFM5.2(NarI). Sekwencje JE zweryfikowano trawieniem enzymem restrykcyjnym i sekwencjonowaniem nukleotydów. Sekwencje nukleotydowe JE od nukleotydu 1 do 1130 wytworzono poprzez powielenie metodą PCR antysensownej nici cDNA JE z zastosowaniem startera antysensownego, odpowiadającego sekwencjom nukleotydowym JE 1116-1130 i startera sensownego odpowiadającego sekwencjom nukleotydowym JE 1-18, przy czym oba zawierały miejsce restrykcyjne EcoRI. Fragmenty PCR klonowano do pBluescript i weryfikowano sekwencje JE sekwencjonowaniem nukleotydów. Razem odpowiada to klonowaniu sekwencji JE od nukleotydu 1 do 1471 (aminokwasy 1-792).
Wytwarzanie pochodnych YF5'3'IV/JE i YFM5.2/JE
W celu insercji koń ca C biał ka otoczki JE w miejsce cię cia YF E/NS1, unikalne miejsce restrykcyjne NarI wprowadzono do plazmidu YFM5.2 poprzez ukierunkowaną na oligonukleotyd mutagenezę sekwencji sygnałowej w miejscu cięcia E/NS1 (nukleotydy YF 2447-2452, aminokwasy 816-817) w celu wytworzenia YFM5.2(NarI). Transkrypty pochodzące z matryc zawierających tę zmianę sprawdzono pod kątem zakaźności, uzyskując zakaźność swoistą podobną do matryc macierzystych (około 100 jednostek tworzących łysinki/250 ng transkryptu). Sekwencje JE z nukleotydów 1108-2471 subklonowano z kilku niezależnych pochodzących z PCR klonów pBluescript/JE do YFM5.2(Narl), stosuPL 192 957 B1 jąc unikalne miejsca restrykcyjne Nsil i NarI. Przez powielenie metodą PCR wytworzono klony
YF5'3'IV/JE, zawierające nie poddany translacji region YF5' (nukleotydy 1-118) przyległy do regionu
JE prM-E.
W celu wytworzenia sekwencji zawierają cych połączenie kapsydu YF i prM JE, zastosowano chimeryczny starter antysensowny, obejmujący ten region, wraz ze starterem antysensownym odpowiadającym nukleotydom YF5'3'IV 6625-6639 w celu wytworzenia fragmentów PCR, które stosowano następnie jako startery PCR antysensowne w połączeniu ze starterem sensownym, komplementarnym z sekwencją wektora pBluescript w kierunku koń ca 5' miejsca EcoRI w celu powielenia sekwencji JE (kodowanej w odwrotnej orientacji w wektorze pBluescript) od nukleotydu 477 (koniec N białka prM) przez miejsce Nhel na nukleotydzie 1125. Powstałe fragmenty PCR poddano insercji do plazmidu YF5'3'IV z zastosowaniem miejsc restrykcyjnych Notl i EcoRI. Struktura ta zawiera promotor SP6 poprzedzający nie poddany translacji region YF 5', po którym następuje sekwencja: YF (C) JE (prM-E), i zawiera również miejsce Nhel (nukleotyd JE 1125), niezbę dny do ligacji in vitro.
Obróbka YFM5.2 i YF5'3'IV tak, aby zawierały miejsca restrykcyjne do ligacji in vitro
W celu zastosowania miejsca Nhel w obrę bie sekwencji otoczki JE jako 5' miejsca ligacji in vitro, wyeliminowano zbędne miejsce Nhel w plazmidzie YFM5.2 (nukleotyd 5459). Dokonano tego przez cichą mutację sekwencji YF na nukleotydzie 5461 (T >C; alanina; aminokwas 1820). Miejsce to włączono do YFM5.2 poprzez ligację odpowiednich fragmentów restrykcyjnych i wprowadzono do YFM5.2(NarI)JE poprzez wymianę fragmentu Nsil/NarI, kodującego chimeryczną sekwencję YF/JE.
W celu wytworzenia unikalnego miejsca restrykcyjnego 3' do ligacji in vitro, w kierunku 3' od miejsca AatlI, zwykle używanego do wytwarzania matryc o pełnej długości z YF5'3'IV i YFM5.2, włączono miejsce BspEI (w sekwencji strukturalnej JE obecnych jest wiele miejsc AatlI, co wyklucza zastosowanie tego miejsca do ligacji in vitro). Miejsce BspEI wytworzono poprzez cichą mutację nukleotydu YF 8581 (A>C; seryna, aminokwas 1860) i wprowadzono do YFM5.2 poprzez wymianę odpowiednich fragmentów restrykcyjnych. Unikalne miejsce włączono do YFM5.2/JE poprzez wymianę fragmentu Xbal/SphI i do plazmidów YF5'3'IV/JE (prM-E) poprzez trzyczęściową ligację odpowiednich fragmentów restrykcyjnych z tych plazmidów macierzystych i z pochodnej YM5.2 (BspEI), dokonując delecji sekwencji YF z miejsc EcoRI na nukleotydach 1 i 6912.
Wymiana cDNA JE Nakayama do plazmidów chimerycznych YF/JE
Z uwagi na niepewność co do zdolności wytworzonego metodą PCR regionu strukturalnego SA1414-2 do prawidłowego funkcjonowania w kontekście wirusa chimerycznego, zastosowaliśmy cDNA z klonu szczepu JE Nakayama, którego charakterystykę dokładnie poznano w doświadczeniach nad ekspresją; znana jest jego zdolność do wywoływania ochronnej odporności (zob. na przykład Mclda i wsp., Virology 158:348-360, 1987; szczep JE Nakayama jest do nabycia w Centers for Disease Control (Ośrodkach Zwalczania Chorób), Fort Collins, Kolorado, i w Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut). Dokonano insercji cDNA Nakayama do plazmidów chimerycznych YF/JE, stosując dostępne miejsca restrykcyjne (Hindlll do PvuII i Bpml do Munl) w celu zastąpienia całego regionu prM-E w systemie dwóch plazmidów, z wyjątkiem jednego aminokwasu-seryny w pozycji 49 - którą pozostawiono nienaruszoną w celu zastosowania miejsca Nhel do ligacji in vitro. Dokonano sekwencjonowania całego regionu JE w klonie Nakayama w celu sprawdzenia autentyczności zastąpionego cDNA (tabela 2).
Wytwarzanie pełnej długości matryc cDNA, transfekcja RNA i odzyskiwanie zakaźnego wirusa
Zastosowano sposoby wytwarzania pełnej długości matryc cDNA w zasadzie takie, jak to opisali Rice i wsp. (The New Biologist 1:285-96, 1989) (zob. fig. 1). W przypadku matryc chimerycznych, plazmidy YF5'3'IV/JE(prM-E) i YFM5.2/JE poddano trawieniu NheI/BspEI i przeprowadzono ligację in vitro, stosując 50 ng oczyszczonych fragmentów w obecności ligazy DNA T4. Produkty ligacji linearyzowano za pomocą XhoI dla umożliwienia transkrypcji typu run-off. Dokonano syntezy transkryptów Sp6, stosując 50 ng oczyszczonej matrycy, oznaczonej ilościowo poprzez wprowadzenie 3H-UTP, a integralność RNA zweryfikowano poprzez niedenaturującą elektroforezę na żelu agarozowym. Wydajność przy użyciu tego sposobu wynosiła od 5 do 10 mikrogramów RNA, z czego większość przypadała na transkrypty o pełnej długości. Transfekcję transkryptów RNA w obecności liposomów kationowych przeprowadzono sposobem opisanym przez Rice i wsp. (j.w.) dla YF17D. W początkowych doświadczeniach do transfekcji i ilościowego oznaczenia wirusa stosowano komórki LLC-MK2, ponieważ ustaliliśmy dopuszczalność replikacji i tworzenia łysinek szczepów macierzystych YF i JE. Tabela 1 ilustruje typowe wyniki doświadczeń z transfekcją z zastosowaniem Lipofectin (GIBCO/BRL) jako no8
PL 192 957 B1 śnika transfekcji. Rutynowo stosowano również linie komórkowe Vero do wytwarzania zapasu zakaźnego wirusa, charakteryzowania wyznakowanych białek i do testów neutralizacji.
Sekwencjonowanie nukleotydów chimerycznych matryc cDNA
Plazmidy zawierające chimeryczne cDNA YF/JE poddano analizie sekwencyjnej części JE klonów w celu zidentyfikowania prawidłowych sekwencji SA14-14-2 i białka otoczki wirusa Nakayama. Różnice w sekwencji nukleotydowej między tymi sekwencjami w porównaniu z opisywanymi sekwencjami (McAda i wsp., jw.) ukazano w tabeli 2.
Charakterystyka strukturalna i biologiczna chimerycznych wirusów YF/JE
Strukturę genomową chimerycznych wirusów YF/JE, uzyskanych po doświadczeniach z transfekcją, zweryfikowano przy użyciu opartej na RT/PCR analizie wirusowego RNA, zebranego z zakażonych pojedynczych warstw komórek. Doświadczenia te przeprowadzono w celu wyeliminowania możliwości zakażenia zapasów wirusa w czasie transfekcji. W tych doświadczeniach do zapoczątkowania cyklu zakażenia zastosowano wirus po pierwszym pasażowaniu, w celu wyeliminowania artefaktów, które mogłyby powstać w obecności resztkowego transfekowanego RNA wirusowego. Całość ekstraktów RNA z komórek zakażonych chimerami YF/JE(prM-E)-SA14-14-2 lub YF/JE(prM-E)-Nakayama poddano RT/PCR z zastosowaniem starterów swoistych dla YF i JE, umożliwiających odtworzenie całego regionu strukturalnego jako dwóch produktów PCR o wielkości około 1 kb. Produkty te analizowano następnie trawieniem enzymami restrykcyjnymi, stosując z góry ustalone miejsca w obrębie sekwencji SA14-14-2 lub Nakayama, umożliwiające różnicowanie tych wirusów. Tym sposobem udowodniono chimeryczność RNA wirusowego i potwierdzono, że odtworzone wirusy mają odpowiednie miejsca restrykcyjne. Potwierdzono rzeczywiste nienaruszenie granicy C-prM na poziomie sekwencji poprzez cykliczną analizę sekwencyjną w miejscu połączenia C-prM chimerycznego YF/JE.
Obecność białka otoczki JE w obu chimerach potwierdzono poprzez zarówno immunoprecypitację surowicami odpornościowymi, skierowanymi swoiście przeciwko JE, jak i testy neutralizacji redukcji łysinek z zastosowaniem surowic odpornościowych, skierowanych swoiście przeciwko YF i JE.
Immunoprecypitacja wyznakowanych 35S ekstraktów zakażonych chimerami komórek LLC-MK2 z zastosowaniem przeciwciał monoklonalnych przeciwko białku E JE wykazała, że moż na było odtworzyć białko otoczki JE jako białko 55 kD, natomiast te same surowice odpornościowe nie były zdolne do immunoprecypitacji białka z komórek zakażonych YF. Surowice o wysokim mianie przeciwciał, zarówno przeciwko JE, jak i YF, wykazywały reaktywność krzyżową z oboma białkami otoczki, jednak można było w powtarzalny sposób obserwować różnicę wielkości między oboma białkami (YF=53 kD, nieglikozylowane; JE=55 kD, glikozylowane). Zastosowanie przeciwciał monoklonalnych przeciwko YF nie było dostateczne w warunkach immunoprecypitacji, tak więc swoistość w tej analizie zależała od przeciwciał monoklonalnych przeciwko JE. Przeprowadzono testy neutralizacji redukcji łysinek (PRNT) na wirusach chimerycznych oraz wirusach YF i SA14-14-2 JE, stosując skierowany swoiście przeciwko YF i JE płyn puchlinowy o wysokim mianie przeciwciał (ATCC) i oczyszczoną IgG skierowaną swoiście przeciwko YF (przeciwciało monoklonalne 2E10). W tym doświadczeniu w przypadku chimer obserwowano istotne różnice w mianie redukcji łysinek o 50% przez te surowice odpornościowe, w porównaniu z wirusami kontrolnymi (tabela 3). Tak więc w zakaźnych chimerycznych wirusach YF/JE dochodziło do ekspresji epitopów niezbędnych do neutralizacji.
Właściwości wzrostu w hodowli komórkowej
Zdolności wzrostowe chimer badano ilościowo w liniach komórkowych, pochodzących od naczelnych i od komarów. Fig. 2 przedstawia kumulacyjne krzywe wzrostowe chimer na komórkach LLC-MK2 po zakażeniu niską wielokrotnością (0,5 jednostek tworzących łysinki na komórkę). W tym doświadczeniu do porównania stosowano wirusy YF5.IV (pochodna klonowana) i JE SA14-14-2 (nieklonowane). Oba wirusy chimeryczne osiągały maksymalną wydajność, w przybliżeniu jednokrotnie logarytmicznie wyższą, niż każdy z wirusów macierzystych. W przypadku chimery YF/JE SA14-14-2, szczyt wytwarzania wirusa nastąpił 12 godzin później, niż w przypadku chimery YF/JE Nakayama (50 godzin w stosunku do 38 godzin). Chimera YF/JE Nakayama wykazywał a w tej linii komórkowej znamiennie więcej działań cytopatycznych, niż chimera YF/JE SA14-14-2. Podobne doświadczenie wykonano na linii komórkowej C6/36 po infekcji z niską wielokrotnością infekcji (0,5 jednostek tworzących łysinki na komórkę). Fig. 2 ilustruje również kinetykę wzrostu wirusów w tej linii komórek bezkręgowców. We wszystkich punktach stosowanych do zbierania wirusa w tym doświadczeniu uzyskano podobną wydajność, co stanowi kolejne potwierdzenie, że wirusy chimeryczne nie wykazują upośledzenia skuteczności replikacji.
PL 192 957 B1
Porównanie kinetyki wzrostu RMS (YF/JE SA14-14-2) ze szczepionką YF 17D w komórkach MRC-5.
Przeprowadzono doświadczenie w celu oceny zdolności proponowanej szczepionki do propagacji w linii komórkowej, nadającej się do wytwarzania szczepionek do zastosowania u ludzi. Dopuszczoną na rynek szczepionkę przeciwko żółtej febrze (YF-Vax®) uzyskano z Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. MRC-5 (diploidalne ludzkie komórki płuc zarodka) nabyto w ATCC (171-CCL, partia F-14308, pasaż 18) i hodowano w EMEM, 2 mM L-Gln, BSS Earle'a zmodyfikowanego tak, aby zawierał 1,5 g/l dwuwęglanu sodowego, 0,1 mM nieniezbędnych aminokwasów i 10% FBS.
W celu porównania kinetyki wzrostu RMS (Research Master Seed, YF/JE SA14-14-2) z YF-Vax®, komórki hodowano do uzyskania 90% konfluencji i zakażano RMS lub YF-Vax® z MOI 0,1pfu. Ponieważ komórki MRC-5 na ogół wykazują powolny wzrost, komórki te utrzymywano po zakażeniu przez 10 dni. Przez 7-10 dni codziennie zamrażano próbki i oznaczano zakaźność poprzez test łysinkowy w komórkach Vero.
YF-Vax® i chimera YF/JE wykazywały w komórkach MRC-5 wzrost do średnich mian (fig. 3). Szczytowe miano wynosiło około 4,7 log10 pfu dla YF-Vax®, uzyskiwane w dniu drugim, i było nieco niższe - 4,5 log10 pfu - dla RMS po 6 dniach.
Badanie neurowirulencji u zdrowych dorosłych myszy
Właściwości wirulencji chimery YF/JE SA14-14-2 analizowano u młodych dorosłych myszy poprzez zakażenie drogą domózgową. Grupy po 10 myszy (samice i samce myszy ICR w wieku 4 tygodni, po 5 na grupę) zakażano 10000 jednostkami tworzącymi łysinki chimery YF/JE SA14-14-2, YF5.IV lub JE SA14-14-2 i obserwowano codziennie przez 3 tygodnie. Wyniki doświadczeń przedstawiono na fig. 4. Myszy, które otrzymały macierzysty YF5.IV, padły po około tygodniu. U myszy, które otrzymały macierzysty JE SA14-14-2 lub chimerę nie zaobserwowano zachorowań; żadne ze zwierząt nie padło. W momencie wstrzyknięcia oznaczano miano dawek zakażają cych i podgrupę myszy, które przeżyły, badano w kierunku obecności przeciwciał neutralizujących w celu potwierdzenia, że zakażenie miało miejsce. Miana przeciwciał przeciwko wirusowi JE SA14-14-2 były wśród badanych myszy podobne u zwierząt, które otrzymały ten szczep i tych, które otrzymały chimerę.
Wyniki dodatkowych doświadczeń nad neurowirulencją chimery YF/JE SA14-14-2 u myszy ukazano w tabeli 4. W tych doświadczeniach wszystkie myszy zakażone YF5.IV padły w ciągu 7-8 dni. Przeciwnie, w czasie dwutygodniowego okresu obserwacji po zakażeniu nie padła żadna z myszy zakażonych YF/JE SA14-14-2.
Wyniki doświadczeń nad neuroinwazyjnością i patogenezą chimer YF/JE przedstawiono w tabeli 5. W tych doświadczeniach wirusami chimerycznymi zakażano drogą dootrzewnową 3-tygodniowe myszy, w dawkach od 10000 do 1 miliona jednostek tworzących łysinki. W czasie trzytygodniowego okresu obserwacji po zakażeniu nie padła żadna z myszy zakażonych YF/JE Nakayama ani YF/JE SA14-14-2, co wskazuje, że wirus nie był w stanie spowodować choroby po zakażeniu obwodowym. Myszy zakażone YF/JE SA14-14-2 wytworzyły przeciwciała neutralizujące przeciwko wirusowi JE (fig. 7).
Wytwarzanie matryc cDNA do wytwarzania wirusów chimerycznych żółtej febry/dengi (YF/DEN)
Poniżej opisano sposób wytwarzania wirusów chimerycznych żółtej febry/dengi (YF/DEN), w zasadzie podobny do opisanego powyż ej sposobu wytwarzania chimer YF/JE. Podobnym sposobem można wytwarzać inne chimery flawiwirusów, stosując naturalne lub wytworzone metodami inżynierii genetycznej miejsca restrykcyjne i na przykład startery oligonukleotydowe, jak to ukazano w tabeli 6.
Wytwarzanie wirusa chimerycznego YF/DEN
Jakkolwiek opracowano kilka klonów molekularnych wirusów dengi, często pojawiał się problem ze stabilnością wirusowego cDNA w systemach plazmidowych i ze skutecznością replikacji uzyskanego wirusa. Postanowiliśmy zastosować klon DEN-2, wytworzony przez dr. Petera Wrighta z oddziału mikrobiologii Monash University (Clayton, Australia), ponieważ system ten jest względnie skuteczny w regeneracji wirusa i wykorzystuje dwuplazmidowy system podobny do naszego sposobu. Dostępna jest pełna sekwencja tego klonu DEN-2, która umożliwiła wytwarzanie chimerycznych matryc YF/DEN, ponieważ niezbędne było tylko kilka modyfikacji klonu YF. Poniżej opisano istotne etapy.
Podobnie, jak w przypadku dwuplazmidowego systemu wirusów YF5.2IV i YF/JE, system YF/DEN wykorzystuje unikalne miejsce restrykcyjne w białku otoczkowym DEN-2 (E) jako punkt przełomowy w propagacji regionu strukturalnego (prM) w obu plazmidach, zwanych w dalszym ciągu niniejszego opisu YF5'3'IV/DEN (prM-E') i YFM5.2/DEN (E'-E) (zob. fig. 5). Dwa miejsca restrykcyjne do ligacji in vitro chimerycznej matrycy stanowią Aatll i SphI. Plazmid, do którego włączana jest część 3' sekwencji białka DEN E stanowi YFM5.2(NarI[+]Sph[-]). Plazmid ten zawiera miejsce NarI na połą10
PL 192 957 B1 czeniu E/NSI, stosowanym do inercji końca karboksylowego białka E JE. Poddano go dalszej modyfikacji poprzez wyeliminowanie dodatkowego miejsca SphI w regionie białka NS5 poprzez cichą mutagenezę ukierunkowaną. Umożliwiło to insercję sekwencji DEN-2 z unikalnego miejsca SphI do miejsca NarI poprzez proste klonowanie kierunkowe. Odpowiedni fragment cDNA DEN-2 wytworzono metodą PCR z klonu DEN-2 MON310, dostarczonego przez dr. Wrighta. Startery PCR stanowiły starter 5' flankujący miejsce SphI i starter 3' homologiczny do nukleotydów DEN-2 bezpośrednio za miejscem sygnalazy w kierunku końca 5' na połączeniu E/NSI, zastępujących miejsce sygnalazy przez podstawienia tworzące nowe miejsce, wprowadzające jednak również miejsce NarI. Powstały fragment PCR o dł ugoś ci 1170 par zasad włączono nastę pnie do YFM5.2(Narl[+]SphI[-]).
Część 5' klonu DEN-2, obejmującą prM i część od końca aminowego białka E włączono do plazmidu YF5'3'IV, stosując chimeryczny plazmid PCR. Chimeryczny plazmid, zawierający koniec 3' antysensownego białka C YF i koniec 5' białka prM DEN-2 zastosowano jako starter sensowny flankujący promotor SP6 plazmidu YF5'3'IV w celu wytworzenia produktu PCR o długości 771 par zasad z przedłuż eniem o długoś ci 20 zasad, odpowiadają cym sekwencji prM DEN-2. Ten produkt PCR stosowano następnie jako starter plazmidu DEN-2 w połączeniu ze starterem 3', odpowiadającym sekwencji DEN-2 1501-1522 i flankującym Sphl, w celu wytworzenia ostatecznego produktu PCR, o długości 1800 par zasad, obejmującego sekwencję YF z miejsca Notl poprzez promotor SP6, nie podlegający translacji region YF 5' i białko C YF, przylegającą do z sekwencją prM-E1522 DEN-2. Produkt PCR poddano ligacji do YF5'3'IV z zastosowaniem miejsc Notl i Sphl, uzyskując plazmid YF5'3'IV/DEN(prM-E).
Wytwarzanie matryc chimerycznych dla innych flawiwirusów
Sposoby wytwarzania pełnej długości matryc cDNA, kodujących chimeryczne wirusy YF/MVE, YF/SLE, YF/WN, YF/TBE są podobne do opisanych powyżej dla systemu YF/DEN-2. Tabela 6 ilustruje cechy strategii wytwarzania opartych na YF17D wirusów chimerycznych. Ukazano również unikalne miejsca restrykcyjne stosowane do ligacji in vitro i startery chimeryczne do wytwarzania połączeń C/prM i E/NSI. Źródła cDNA tych heterologicznych flawiwirusów są łatwo dostępne (MVE: Dalgarno i wsp., J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986; SLE: Trent i wsp., Virology 156:293-304, 1987; TBE: Mandl i wsp., Virology 166:197-205, 1988; dengi 1: Mason i wsp., Virology 161: 262-267, 1987; dengi 2: Deubel i wsp., Virology 155: 365-377, 1986; dengi 3: Hann i wsp., Virology 162: 167-180, 1988; dengi 4: Zhao i wsp., Virology 155: 77-88, 1986).
Innym sposobem wytworzenia dodatkowych wirusów chimerycznych jest wytworzenie połączenia C/prM poprzez ligację tępych końców fragmentów restrykcyjnych pochodzących z PCR, których końce stykają się na tym połączeniu, a końce 5' i 3' flankują odpowiednie miejsca restrykcyjne dla wprowadzenia do YF5'3'IV lub do plazmidu pośredniego, takiego jak pBS-KS(+). Możliwość zastosowania oligonukleotydu chimerycznego lub ligacji tępych końców zależy od zdolności unikalnych miejsc restrykcyjnych w regionie kodującym białko otoczki danego wirusa.
Wytwarzanie wirusów YF kodujących antygeny HCV
Ponieważ białka strukturalne E1 i E2 HCV nie są homologiczne z wyżej opisanymi białkami strukturalnymi flawiwirusów, strategia ekspresji tych białek obejmuje insercję do nieistotnego regionu genomu, tak aby wszystkie te białka uległy następnie koekspresji z białkami żółtej febry w czasie replikacji wirusa w zakażonych komórkach. Docelowym regionem insercji białek jest część N-końcowa białka NS, ponieważ do replikacji wirusa nie jest konieczne całe białko NS1. Z uwagi na potencjalne trudności ze stabilnością genomu YF w obecności sekwencji heterologicznej o wielkości przekraczającej normalną wielkość genomu (około 10000 nukleotydów) można stosować opisany poniżej sposób wykrywania. Ponadto w chimerycznych wirusach YF/flawiwirus, opisanych powyżej, dogodna może być delecja NS1, ponieważ częściowa delecja tego białka może przeciwdziałać odporności na YF, związanej z przeciwciałami przeciwko NS1, co pozwala uniknąć problemów z odpornością wektora, jeżeli u danego biorcy niezbędna jest więcej niż jedna szczepionka chimeryczna, lub jeśli szczepionkę YF podawano uprzednio lub będzie ona potrzeba w przyszłości.
Sposób obejmuje stworzenie serii delecji w ramce w obrębie regionu kodującego NS1 plazmidu YFM5.2 wraz z wytworzeniem translacyjnego kodonu terminacyjnego na końcu E, i serii dwóch IRES (wewnętrznych rybosomalnych miejsc wejścia). Jedno IRES znajduje się bezpośrednio za kodonem terminacyjnym, w kierunku końca 3', i umożliwia ekspresję otwartej ramki odczytu w obrębie regionu między E a NS1. Drugie IRES zapoczątkowuje translację z okrojonych białek NS1, zapewniając ekspresję pozostałości niestrukturalnej poliproteiny YF. Pochodne te bada się pod kątem odzyskiwania wirusa zakaźnego i strukturę o największej delecji stosuje się do insercji obcych sekwencji (na przyPL 192 957 B1 kład białek HCV) do pierwszego IRES. Ta konkretna struktura może również służyć jako podstawa do określenia, czy delecja NS1 wpłynie na odporność swoistą dla wektora w kontekście wirusów chimerycznych YF/flawiwirus wykazujących ekspresję prM-E, jak to opisano powyżej.
Insercja nukleotydów kodujących białka HCV E1, E2 i/lub E1 plus E2 jest ograniczona wielkością delecji tolerowanej w białku NS1. Z uwagi na to w celu zwiększenia stabilności zmodyfikowanego klonu YF można stosować okrojone białka HCV. Białka HCV są wytwarzane z N-końcową sekwencją sygnałową bezpośrednio po IRES i z kodonem terminacyjnym na końcu C. Struktura ta będzie kierować białka HCV do siateczki endoplazmatycznej do wydzielenia z komórki. Sposób wytwarzania takiej struktury ukazano schematycznie na fig. 6. Do takich struktur można stosować plazmidy kodujące białka HCV genotypu I, na przykład plazmidy HCV uzyskane od dr. Charlesa Rice'a z Washington University (Grakoui i wsp., J. Virology 67:1385-1395, 1993), który dokonał ekspresji tego regionu wirusa w systemach obróbki i w obrębie komplementarnego do replikacji klonu HCV pełnej długości.
Mutanty delecyjne cięcia prM jako proponowane szczepionki atenuowane przeciwko flawiwirusom
Dodatkowe wirusy chimeryczne, objęte zakresem niniejszego wynalazku, zawierają mutacje uniemożliwiające cięcie prM, takie jak mutacje w miejscu cięcia prM. Można na przykład dokonać mutacji miejsca cięcia prM w pewnych zakaźnych klonach flawiwirusów, takich jak na przykład wirus dengi, TBE, SLE i inne, poprzez mutagenezę ukierunkowaną. Można dokonać delecji lub podstawienia dowolnego aminokwasu, lub wszystkich aminokwasów, w miejscu cięcia, jak to opisano powyżej. Można następnie dokonać insercji fragmentu kwasu nukleinowego, zawierającego zmutowane geny prM-E, do wektora wirusa żółtej febry, sposobami opisanymi powyżej. Delecję prM można stosować z innymi mutacjami atenuującymi lub bez innych mutacji; na przykład do wirusa żółtej febry można wprowadzić mutację w białku E. Mutanty te są korzystne jako proponowane szczepionki w porównaniu z mutantami o jednym podstawieniu, poniewa ż niemal niemoż liwe jest ponowne dołączenie usunię tej sekwencji i przywrócenie wirulencji.
Następujące flawiwirusy chimeryczne według niniejszego wynalazku zdeponowano w Amerykańskim Zbiorze Hodowli Typowych (ATCC) w Rockville w stanie Maryland (Stany Zjednoczone), zgodnie z zasadami Traktatu Budapeszteńskiego, z datą złożenia 6 stycznia 1998: chimeryczny wirus żółtej febry 17D/dengi typu 2 (YF/DEN-2; nr ATCC VR-2593) i chimeryczny wirus żółtej febry 17D/japońskiego zapalenia mózgu SA14-14-2 (YF/JE A1.3; nr ATCC VR-2594).
T a b e l a 1
Charakterystyka chimer YF/JE
| Charakterystyka chimer YF/JE | |||||
| Klon | Wydajność ^g) | Zakaźność łysinek/100 ng LLC-MK2 | Miano logarytmiczne PBS VERO | Miano logarytmiczne RNAzy VERO | Miano logarytmiczne DNAzy VERO |
| YF5.2IV | 5,5 | 15 | 7,2 | 0 | 7 |
| YF/JE-S | 7,6 | 50 | 6,2 | 0 | 6,2 |
| YF/JE-N | 7 | 60 | 5 | 0 | 5,4 |
T a b e l a 2
Porównanie sekwencji szczepów JE i chimer YF/JE
| Wirus | E 107 | E 138 | E 176 | E 177 | E 227 | E 243 | E 244 | E 279 |
| JE SA1414-2 | F | K | V | T | S | K | G | M |
| YF/JE SAi4-14-2 | F | K | V | A | S | E | G | M |
| YF/JE NAK | L | E | I | T | P | E | E | K |
| JE NAK | L | E | I | T | P | E | E | K |
| JE SA14 | L | E | I | T | S | E | G | K |
PL 192 957 B1
T a b e l a 3
Miano neutralizacji redukcji łysinek w chimerach YF/JE
| Wirus | Płyn puchlinowy nieimmunologiczny | Płyn puchlinowy YF | Płyn puchlinowy JE | IgG nieimmunologicz- na | IgG YF |
| YF5.2IV | <1,3 | 3,7 | <1,3 | <2,2 | >4,3 |
| JE SA14I4-2 | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
| YF/JE Si4-14-2 | <1,3 | <1,3 | 3,1 | <2,2 | <1,9 |
| YF/JE Nakayama | <1,3 | <1,3 | 3,4 | <2,2 | <2,2 |
T a b e l a 4
Neurowirulencja chimery YF/JE SA14-14- 2 3-tygodniowe samce myszy ICR
| dawka logarytmiczna I.C. | % śmiertelności | |
| YF5.2IV | 4 | 100 (7/7) |
| YF/JE SA14-14-2 | 4 | 0 (0/7) |
| YF/JE SA14-14-2 | 5 | 0 (0/7) |
| YF/JE SA14-14-2 | 6 | 0 (0/8) |
T a b e l a 5
Neuroinwazyjność chimer YF/JE 3-tygodniowe samce myszy ICR
| dawka logarytmiczna (dootrzewnowo) | % śmiertelności | |
| YF/JE Nakayama | 4 | 0 (0/5) |
| YF/JE Nakayama | 5 | 0 (0/4) |
| YF/JE Nakayama | 6 | 0 (0/4) |
| YF/JE SA14-14-2 | 4 | 0 (0/5) |
| YF/JE SA14-14-2 | 5 | 0 (0/4) |
| YF/JE SA14-14-2 | 6 | 0 (0/4) |
T a b e l a 6
Wytwarzanie chimer YF/flawiwirus
| Wirus | Chimeryczne połączenie C/prM1 | Chimeryczne połączenie E/NS12 | Ligacja 5'3 | Ligacja 3'4 | Miejsca5 wyeliminowane lub (stworzone) |
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| YF/WN | X- cactgggagag cttgaaggtc (SEQ ID nr D | aaagccagttg cagccgcggtt taa (SEQ ID nr 2) | Aatll | Nsil | |
| YF/DEN-1 | X- aaggtagactg gtgggctccc (SEQ ID nr 3) | gatcctcagta ccaaccgcggt ttaa (SEQ ID nr 4} | Aatll | Sphl | Sphl w DEN |
| YF/DEN-2 | X- aaggtagattg gtgtgcattg (SEQ ID nr 5) | aaccctcagta ccacccgcggt ttaa (SEQ ID nr 6) | Aatll | Sphl |
PL 192 957 B1 cd. tabeli 6
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 |
| YF/DEN-3 | X- aaggtgaattg aagtgctcta (SEQ ID nr 7) | acccccagcac cacccgcggtt taa (SEQ ID nr 8) | Aatll | Sphl | Xhol w DEN (Sphl w DEN) |
| YF/DEN-4 | X- aaaaggaacagttgttctcta (SEQ ID nr 9) | acccgaagtgtc- accgcggtttaa (SEQ ID nr 10) | AatII | NsiI | |
| YF/SLE | X- aacgtgaatagttggatagtc (SEQ ID nr 11) | accgttggtcgca- acccgcggtttaa (SEQ ID nr 12) | AatII | SphI | AaII w SLE |
| YF/MVE | X- aatttcgaaaggtggaaggtc (SEQ ID nr 13) | gaaccggtgttta- cagccgcggtttaa (SEQ ID nr 14) | AatII | AgeI | (Agel w YF) |
| YF/TBE | X- tactgcgaacgacgt- tgccac (SEQ ID nr 15) | actgggacctcacccgcggtttaa (SEQ ID nr 16) | AatII | AgeI | (AgeI w YF) |
1,2: Kolumna ilustruje oligonukleotyd stosowany do wytworzenia starterów chimerycznego YF/flawiwirusa odpowiadających połączeniu C/prM lub E/NS1 (por. tekst). X - sekwencja kodująca koniec karboksylowy kapsydu YF. Region podkreślony odpowiada docelowej sekwencji heterologicznej bezpośrednio za miejscem Narl, w kierunku 5' (antysensownie - ccgcgg). Miejsce to umożliwia insercję produktów PCR do plazmidu YFM5.2 (Narl), konieczną do wytworzenia pełnej długości matryc cDNA. Inne nukleotydy są swoiste dla wirusa heterologicznego. Startery oligonukleotydowe wymieniono 5' do 3'.
3,4: Wymieniono unikalne miejsca restrykcyjne stosowane do wytworzenia fragmentów restrykcyjnych, które można izolować i poddać ligacji in vitro dla wytworzenia pełnej długości chimerycznych matryc cDNA. Ponieważ niektóre sekwencje nie zawierają korzystnych miejsc, w niektórych przypadkach konieczne jest dołączenie odpowiednich miejsc (stopka 5).
5: W nawiasach podano miejsca enzymów restrykcyjnych, które muszą być wytworzone w rdzeniu YF lub w wirusie heterologicznym w celu umożliwienia skutecznej ligacji in vitro. Należy wyeliminować miejsca nie ujęte w nawiasach. Wszystkie takie modyfikacje prowadzi się na drodze cichej mutagenezy cDNA dla odpowiedniego klonu. Puste miejsca wskazują, że nie jest konieczna modyfikacja klonów cDNA.
Inne wykonania
Inne wykonania objęte są załączonymi zastrzeżeniami.
Na przykład można wprowadzać do rdzenia szczepionki wirusa żółtej febry geny białka prM-E innych flawiwirusów o znaczeniu klinicznym, w celu wytworzenia szczepionek przeciwko innym flawiwirusom o znaczeniu klinicznym (zob. na przykład Monath i wsp., Flaviviruses, w: Virology, pod red. Fields, Raven-Lippincott, New York, 1995, t. I, 961-1034).
Przykłady dodatkowych flawiwirusów, których geny można wprowadzać do wektorów chimerycznych według niniejszego wynalazku, stanowią na przykład wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej. Ponadto do wirusa szczepionkowego żółtej febry można wprowadzać geny z nawet dalej spokrewnionych wirusów w celu wytworzenia nowych szczepionek.
PL 192 957 B1
Wytwarzanie i zastosowanie szczepionki
Przedmioty niniejszego wynalazku mogą być zastosowane w szczepionkach, które można podawać w dawkach i sposobami, które specjalista może z łatwością ustalić. Szczepionki można wytwarzać w postaciach i podawać w sposób taki sam, jak na przykład szczepionkę przeciwko żółtej febrze 17D, na przykład jako sklarowaną zawiesinę zakażonej kurzej tkanki zarodkowej, lub jako płyn zebrany z hodowli komórek zakażonych chimerycznym wirusem żółtej febry. Tak więc żywy, atenuowany wirus wytwarza się w postaci jałowego wodnego roztworu, zawierającego od 100 do 1000000 jednostek zakaźnych (na przykład jednostek tworzących łysinki lub dawek zakaźnych dla hodowli tkankowej) w objętości dawki wynoszącej od 0,1 do 1,0 ml, do podawania, na przykład, drogą domięśniową, podskórną lub śródskórną. Ponadto, ponieważ flawiwirusy mogą być zdolne do zakażania gospodarza-człowieka drogą śluzówek, na przykład drogą doustną (Gresikova i wsp. „Tick-borne Encephalitis, w: The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, pod red. Monath, CRC Press, Boca Raton, Floryda, 1988, t. IV, 177-201), wirus szczepionkowy można podawać drogą śluzówkową dla uzyskania ochronnej reakcji immunologicznej. Szczepionkę można podawać jako środek profilaktyki pierwotnej u dorosłych lub dzieci narażonych na zakażenie flawiwirusowe. Szczepionki można również stosować w prewencji wtórnej do leczenia chorych zakaż onych flawiwirusami, poprzez pobudzanie reakcji immunologicznej przeciwko flawiwirusowi.
Dogodne może być zastosowanie systemu wektorowego żółtej febry do uodpornienia gospodarza przeciwko jednemu wirusowi (na przykład wirusowi japońskiego zapalenia mózgu) i późniejszego ponownego uodpornienia tej samej osoby przeciwko drugiemu lub trzeciemu wirusowi, z zastosowaniem odmiennej struktury chimerycznej. Istotną dogodną cechą systemu chimerycznego żółtej febry jest to, że wektor nie wywołuje silnej reakcji immunologicznej na siebie samego. Ponadto uprzednie uodpornienie przeciwko wirusowi żółtej febry nie wyklucza zastosowania chimerycznej szczepionki jako wektora do heterologicznej ekspresji genu. Korzyści te są związane z usunięciem części genu E szczepionki żółtej febry, kodującego neutralizujące (ochronne) antygeny przeciwko wirusowi żółtej febry, i z zastąpieniem innym, heterologicznym genem, nie powodującym oporności krzyżowej przeciwko żółtej febrze. Jakkolwiek niestrukturalne białka wirusa YF17D mogą odgrywać rolę w ochronie, poprzez na przykład wywoływanie produkcji przeciwciał przeciwko NS1, co bierze udział w zależnej od dopełniacza lizie zakażonych komórek, której mediatorem są przeciwciała (Schlesinger i wsp., J. Immunology 135: 2805-2809, 1985) lub poprzez pobudzanie reakcji cytotoksycznych limfocytów T przeciwko NS3 lub innym białkom wirusa, jest mało prawdopodobne, aby reakcje te niekorzystnie wpłynęły na zdolność żywej szczepionki wirusowej do pobudzania przeciwciał neutralizujących. Potwierdzają to następujące fakty: (1) osoby uprzednio zakażone wirusem JE reagują na szczepienie YF17D podobnie, jak osoby bez uprzedniego zakażenia JE (2) osoby, które uprzednio otrzymały szczepionkę YF17D reagują na ponowne szczepienie wzrostem miana przeciwciał neutralizujących (Sweet i wsp., Am. J. Trop. Med. Hyg., 11: 562-569, 1962). Tak więc wektor chimeryczny można stosować w populacjach uodpornionych na żółtą febrę poprzez uprzednie naturalne zakażenie lub szczepienie i można go stosować wielokrotnie, lub uodparniać jednocześnie lub sekwencyjnie kilkoma różnymi strukturami, włączając w to chimery żółtej febry z insertami, na przykład, z wirusa japońskiego zapalenia mózgu, zapalenia mózgu St. Louis lub Zachodniego Nilu.
Do wytwarzania szczepionki można stosować adiuwanty znane specjalistom. Do adiuwantów, które można stosować w celu zwiększenia immunogenności szczepionek chimerycznych należą na przykład preparaty liposomowe, adiuwanty syntetyczne, takie jak saponiny (na przykład QS21), dipeptyd muramylowy, lipid monofosforylowy A lub polifosfazyna. Jakkolwiek te adiuwanty stosuje się typowo do zwiększenia reakcji immunologicznej na szczepionki unieczynnione, można stosować je także do szczepionek żywych. W przypadku chimerycznej szczepionki podawanej drogą śluzówkową, na przykład doustną, korzystne są adiuwanty śluzówkowe, takie jak termolabilne toksyny E. coli (LT) lub zmutowane pochodne LT. Do wektorów żółtej febry można ponadto wprowadzać geny kodujące cytokiny o właściwościach adiuwantów. Można zatem wprowadzać geny kodujące cytokiny, takie jak CM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 lub IL-5 wraz z heterologicznymi genami flawiwirusowymi w celu wytworzenia szczepionki powodującej nasilenie reakcji immunologicznych, lub w celu modulowania odporności skierowanej bardziej swoiście przeciwko reakcji komórkowej, humoralnej lub śluzówkowej. Oprócz zastosowania jako szczepionki, jak to łatwo dostrzeże specjalista, wektory według niniejszego wynalazku można stosować w metodach terapii genowej w celu wprowadzenia terapeutycznych produktów genu do komórek pacjenta. W sposobach tych do wektorów wprowadza się geny kodujące terapeutyczne produkty genowe, zamiast na przykład genu kodującego białko prM-E.
PL 192 957 B1
Dodatkową korzystną cechą systemu wirusa żółtej febry jest to, że flawiwirusy ulegają replikacji w cytoplazmie komórek, tak ż e strategia replikacji wirusa nie obejmuje integracji genomu wirusa do komórki gospodarza (Chambers i wsp., (1990) Flavivirus Genome Organization, Expression and Replication, w: Annual Review of Microbiology 44: 649-688), co stanowi istotny element bezpieczeństwa.
Wszystkie cytowane pozycje piśmiennictwa włącza się do niniejszego opisu przez przywołanie. SPIS SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Acambis, Inc. i St. Louis University.
(ii) TYTUŁ: Chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, jego zastosowanie oraz cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus (iii) LICZBA SEKWENCJI: 16 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
(A) ADRESAT: Clark & Elbing LLP (B) ULICA: 176 Federal Street (C) MIASTO: Boston (D) STAN: MA (E) PAŃSTWO: Stany Zjednoczone Ameryki Północnej (F) KOD POCZTOWY: 02110 (v) FORMA KOMPUTEROWA:
(A) RODZAJ NOŚNIKA: dyskietka (B) KOMPUTER: Kompatybilny z IBM (C) SYSTEM OPERACYJNY: DOS (D) OPROGRAMOWANLE: FastSEQ for Windows Version 2.0 (vi) DANE DOTYCZĄCE BLEŻĄCEGO ZGŁOSZENIA:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA:
(B) DATA ZŁOŻENIA: 02-MAR-98 (C) KLASYFLKACJA:
(vii) DANE ODNOŚNIE POPRZEDNICH ZGŁOSZEŃ:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: 08/807,445 (B) DATA ZŁOŻENIA: 28-FEB-1997 (viii) DANE ODNOŚNIE POPRZEDNICH ZGŁOSZEŃ:
(A) NUMER ZGŁOSZENIA: nieznany (B) DATA ZŁOŻENIA: 15-STY-98 40 (ix) INFORMACJA O RZECZNIKU/AGENCIE:
(A) NAZWISKO: Clark, Paul T (B) NUMER LICENCJI: 30,162 (C) NUMER AKT: 06132/033W02 (x) INFORMACJA TELEKOMUNIKACYJNA:
(A) TELEFON: 617-428-0200 (B) TELEFAKS: 617-428-7045 (C) TELEKS:
(2) INFORMACJA O SEQ ID NO:1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:1:
CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:2:
PL 192 957 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:2:
AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA 25 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:3;
AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:4
GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA 26 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NLCL: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:5:
AAGGTAGATT GGTGTGCATT G 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:6:
AACCCTCAGT ACCACCCGCG GTTTAA 26 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa
PL 192 957 B1 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:7
AAGGTGAATT GAAGTGCTCT A 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:8:
ACCCCCAGCA CCACCCGCGG TTTAA 25 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:9:
AAAAGGAACA GTTGTTCTCT A 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B)TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:10:
ACCCGAAGTG TCAACCGCGG TTTAA 25 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa 45 (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:11
AACGTGAATA GTTGGATAGT C 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGLA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:12:
ACCGTTGGTC GCACCCGCGG TTTAA 25 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:13:
PL 192 957 B1 (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:13:
AATTTCGAAA GGTGGAAGGT C 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 26 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:14:
GACCGGTGTT TACAGCCGCG GTTTAA 26 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:15:
TACTGCGAAC GACGTTGCCA C 21 (2) INFORMACJA O SEQ ID NO:16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 25 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) LICZBA NICI: jedna (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: SEQ ID NO:16:
ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA 25
Claims (24)
- Zastrzeżenia patentowe1. Chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, znamienny tym, że zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa, tak aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
- 2. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
- 3. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dengi, dobrany z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
- 4. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St.Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu,PL 192 957 B1 wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.
- 5. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
- 6. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencję nukleotydów, kodującą białko prM-E wirusa żółtej febry zastąpiono sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
- 7. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
- 8. Wirus chimeryczny według zastrz. 1, znamienny tym, że sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
- 9. Zastosowanie chimerycznego żywego, zakaźnego, atenuowanego wirusa do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia zakażenia flawiwirusowego u pacjenta, znamienne tym, że chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa, tak aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
- 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
- 11. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dengi, dobrany z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
- 12. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.
- 13. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że drugiego flawiwirusa stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
- 14. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że sekwencja nukleotydów, kodująca białko prM-E wirusa żółtej febry zastąpiona jest sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
- 15. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
- 16. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
- 17. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, znamienna tym, że wirus zawiera wirus żółtej febry, w którym sekwencję nukleotydową, kodującą białka prM-E, poddano delecji, okrojeniu lub mutacji, w taki sposób, aby funkcjonalne białko prM-E wirusa żółtej febry nie ulegało ekspresji, i zintegrowaną do genomu tego wirusa żółtej febry sekwencję nukleotydową, kodującą białko prM drugiego, innego flawiwirusa, tak aby to białko prM-E tego drugiego flawiwirusa ulegało ekspresji.
- 18. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że drugi flawiwirus stanowi wirus japońskiego zapalenia mózgu (JE).
- 19. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że drugi flawiwirus stanowi wirus dengi, dobrany z grupy, do której należą wirusy dengi typów 1-4.
- 20. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że drugi flawiwirus stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy zapalenia mózgu Doliny Murray (MVE), zapalenia mózgu St. Louis (SLE), Zachodniego Nilu (WN), wirus Kunjin, wirus środkowoeuropejskiego zapalenia mózgu, wirus rosyjskiego wiosenno-letniego zapalenia mózgu, wirus Powassan, wirus choroby lasów Kyasanur i wirus omskiej gorączki krwotocznej.PL 192 957 B1
- 21. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że drugi flawiwirus stanowi wirus dobrany z grupy, do której należą wirusy kleszczowego zapalenia mózgu (TBE) i zapalenia wątroby typu C (HCV).
- 22. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że sekwencję nukleotydów, kodującą białko prM-E wirusa żółtej febry jest zastąpiona sekwencją nukleotydową kodującą białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa.
- 23. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca białko prM-E drugiego, innego flawiwirusa zawiera mutację uniemożliwiającą przecięcie prM i wytworzenie białka M.
- 24. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 17, znamienna tym, że sekwencje sygnałowe na połączeniach C/prM i E/NS1 utrzymuje się w strukturze flawiwirusa chimerycznego.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US80744597A | 1997-02-28 | 1997-02-28 | |
| US766498A | 1998-01-15 | 1998-01-15 | |
| PCT/US1998/003894 WO1998037911A1 (en) | 1997-02-28 | 1998-03-02 | Chimeric flavivirus vaccines |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL335481A1 PL335481A1 (en) | 2000-04-25 |
| PL192957B1 true PL192957B1 (pl) | 2006-12-29 |
Family
ID=26677253
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL335481A PL192957B1 (pl) | 1997-02-28 | 1998-03-02 | Chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus, jego zastosowanie oraz cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca chimeryczny żywy, zakaźny, atenuowany wirus |
Country Status (21)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP2251036A1 (pl) |
| JP (2) | JP4504464B2 (pl) |
| KR (1) | KR100517323B1 (pl) |
| CN (1) | CN1187088C (pl) |
| AT (2) | ATE468858T1 (pl) |
| AU (1) | AU740961B2 (pl) |
| BR (1) | BR9807873A (pl) |
| CA (1) | CA2282790C (pl) |
| CZ (1) | CZ300172B6 (pl) |
| DE (2) | DE69841690D1 (pl) |
| DK (2) | DK0977587T3 (pl) |
| ES (2) | ES2345614T3 (pl) |
| HK (1) | HK1025743A1 (pl) |
| HU (1) | HU228705B1 (pl) |
| IL (4) | IL131600A0 (pl) |
| NO (1) | NO329693B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ337522A (pl) |
| PL (1) | PL192957B1 (pl) |
| PT (2) | PT1625852E (pl) |
| RU (1) | RU2209082C2 (pl) |
| WO (1) | WO1998037911A1 (pl) |
Families Citing this family (72)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6962708B1 (en) | 1997-02-28 | 2005-11-08 | Acambis, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| AU778988B2 (en) | 1998-06-04 | 2004-12-23 | Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7227011B2 (en) * | 1998-06-04 | 2007-06-05 | United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, Centers For Disease Control And Prevention | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| US7009044B1 (en) * | 1999-06-04 | 2006-03-07 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | HCV/BVDV chimeric genomes and uses thereof |
| US7425437B2 (en) | 1999-11-26 | 2008-09-16 | Crucell Holland B.V. | Vaccines against West Nile Virus |
| WO2001039802A1 (en) * | 1999-12-01 | 2001-06-07 | Oravax, Inc. | Chimeric flavivirus vaccines |
| US6589531B1 (en) * | 2000-01-21 | 2003-07-08 | The Regents Of The University Of California | Recombinant yellow fever virus and method of use thereof |
| DE60137491D1 (de) * | 2000-02-10 | 2009-03-12 | Us Gov Nat Inst Health | Vollständiger, infektiöser cdna klon des tick borne flavivirus |
| AU3844101A (en) | 2000-02-16 | 2001-08-27 | Us Health | Avirulent, immunogenic flavivirus chimeras |
| AU2007202304B2 (en) * | 2001-04-04 | 2010-03-18 | THE GOVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES, CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION | Nucleic acid vaccines for prevention of flavivirus infection |
| FR2823222B1 (fr) * | 2001-04-06 | 2004-02-06 | Merial Sas | Vaccin contre le virus de la fievre du nil |
| US7740863B2 (en) | 2001-04-06 | 2010-06-22 | Merial | Recombinant vaccine against West Nile Virus |
| EP2305299B1 (en) | 2001-05-31 | 2017-03-01 | GlaxoSmithKline Biologicals SA | Chimeric alphavirus replicon particles |
| US20030232324A1 (en) | 2001-05-31 | 2003-12-18 | Chiron Corporation | Chimeric alphavirus replicon particles |
| CN1551782A (zh) | 2001-06-01 | 2004-12-01 | ��������ķ������ | 嵌合黄病毒载体 |
| US6682883B1 (en) * | 2001-07-19 | 2004-01-27 | Acambis, Inc. | Diagnosis of flavivirus infection |
| RU2313367C2 (ru) * | 2001-10-19 | 2007-12-27 | Экэмбис, Инк. | Способы профилактики и лечения инфекции, вызываемой флавивирусами у животных |
| EP1461441A4 (en) * | 2001-11-26 | 2006-02-22 | Univ Queensland | FEEDING SYSTEM FOR FLAVIVIRUS VACCINES |
| EP1471873A4 (en) | 2002-01-15 | 2005-03-16 | Acambis Inc | VACCINES AGAINST FLAVIVIRUS |
| DE60233038D1 (de) | 2002-06-20 | 2009-09-03 | Pasteur Institut | Infektiöse cDNA eines zugelassenen Impfstammes des Masern Virus. Verwendung in immunogenen Zusammensetzungen |
| ES2427139T3 (es) | 2002-06-20 | 2013-10-29 | Institut Pasteur | Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna |
| WO2004009764A2 (en) * | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Methods and compositions concerning altered yellow fever virus strains |
| DE60330708D1 (de) | 2002-11-15 | 2010-02-04 | Sanofi Pasteur Biologics Co | Impfstoff gegen das west-nile-virus |
| CA2432738A1 (en) | 2003-02-26 | 2004-08-26 | Philippe Despres | New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications |
| WO2005040390A1 (fr) * | 2003-07-21 | 2005-05-06 | Shanghai Tengen Biomedical Co., Ltd. | Vaccin recombine utilisant le virus de la fievre jaune comme vecteur |
| CN1304579C (zh) * | 2003-07-21 | 2007-03-14 | 上海天甲生物医药有限公司 | 重组的以黄热病病毒为载体的疫苗 |
| CN103088038B (zh) * | 2004-07-12 | 2015-06-24 | 美国天甲生物医药有限公司 | 黄病毒疫苗 |
| EA015907B1 (ru) * | 2004-10-20 | 2011-12-30 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. | Рекомбинантный флавивирус и его применение |
| CA2591665C (en) | 2004-12-20 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Binding molecules capable of neutralizing west nile virus and uses thereof |
| AU2005320001B2 (en) | 2004-12-24 | 2011-05-19 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Attenuated chimeric flavivirus bearing attenuated Japanese encephalitis virus gene as backbone |
| BRPI0609949A2 (pt) | 2005-04-24 | 2010-05-11 | Acambis Inc | flavivìrus recombinante, seu uso na preparação de vacina, composição farmacêutica compreendendo o mesmo, molécula de ácido nucléico e método para atenuar candidato a vacina de flavivìrus |
| AU2006245734C1 (en) | 2005-05-12 | 2012-05-24 | Crucell Holland B.V. | Host cell specific binding molecules capable of neutralizing viruses and uses thereof |
| BRPI0504945B8 (pt) | 2005-10-31 | 2022-08-02 | Fundacao Oswaldo Cruz | Método para a produção de flavivirus recombinante contendo sequências de nucleotídeos codificantes de uma proteína heteróloga, constructo de dna, flavivirus, e, composição vacinal para imunizar contra flavivirus e/ou outros patógenos. |
| CU23586A1 (es) | 2005-11-22 | 2010-10-30 | Ct Ingenieria Genetica Biotech | Métodos y proteínas para el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de los cuatro serotipos del virus de dengue y otros flavivirus |
| CA2654712C (en) | 2006-06-06 | 2015-05-05 | Crucell Holland B.V. | Human binding molecules having killing activity against staphylococci and uses thereof |
| RU2009105099A (ru) | 2006-07-14 | 2010-08-27 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. (Us) | Конструирование рекомбинантных вирусных вакцин путем прямой транспозон-опосредованной инсерции чужеродных иммунологических детерминант в белки векторного вируса |
| FR2906724B1 (fr) | 2006-10-04 | 2009-03-20 | Sanofi Pasteur Sa | Methode d'immunisation contre les 4 serotypes de la dengue. |
| RU2541784C2 (ru) | 2006-11-07 | 2015-02-20 | Санофи Пастер Байолоджикс Ко. | Лиофилизированная композиция для индукции иммунного ответа на флавивирус, композиция и способ для ее получения |
| CA2676689C (en) * | 2007-01-31 | 2014-12-16 | Sanofi Pasteur Biologics Co. | Recombinant bicistronic flavivirus vectors |
| US20110003884A1 (en) * | 2007-02-09 | 2011-01-06 | Pugachev Konstantin V | Viral Vectors and Methods of Use |
| EP2589392B1 (en) | 2008-03-05 | 2016-11-30 | Sanofi Pasteur | Process for stabilizing an adjuvant containing vaccine composition |
| BRPI0908936A2 (pt) * | 2008-03-14 | 2017-03-28 | Sanofi Pasteur Biologics Co | vacinas de flavivírus de replicação defeituosa e vetores de vacina |
| EP2143440A1 (fr) | 2008-07-09 | 2010-01-13 | Sanofi Pasteur | Agent stabilisant et composition vaccinale comprenant un ou plusieurs flavivirus vivants atténués |
| EP2353609A1 (en) | 2010-02-04 | 2011-08-10 | Sanofi Pasteur | Immunization compositions and methods |
| SG11201500412TA (en) | 2012-07-24 | 2015-02-27 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions |
| US20150265695A1 (en) | 2012-07-24 | 2015-09-24 | Sanofi Pasteur | Vaccine compositions for prevention against dengue virus infection |
| KR20150072411A (ko) | 2012-10-03 | 2015-06-29 | 사노피 파스퇴르 | 일본 뇌염, 홍역, 유행성 이하선염, 및 풍진에 대한 백신접종 |
| BR112015012515B1 (pt) | 2012-11-30 | 2023-04-11 | Sanofi Pasteur | Uso de antígenos, construções de ácido nucleico ou vetores virais capazes de expressar uma partícula do tipo vírus (vlp) da dengue e de uma vacina contra sarampo, uma vacina contra caxumba e uma vacina contra rubéola |
| PE20211814A1 (es) | 2013-03-15 | 2021-09-14 | Takeda Vaccines Inc | Composiciones y metodos de construcciones quimericas del virus del dengue en vacunas |
| BR112015031226A2 (pt) | 2013-06-21 | 2017-08-29 | Merck Sharp & Dohme | Composição de vacina, e, uso da composição de vacina |
| CN103352029A (zh) * | 2013-07-29 | 2013-10-16 | 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 | 一种乙脑/森林脑炎嵌合病毒及其应用 |
| TW201620546A (zh) | 2014-09-02 | 2016-06-16 | 賽諾菲巴斯德公司 | 疫苗組合物 |
| EP3031923A1 (en) * | 2014-12-11 | 2016-06-15 | Institut Pasteur | Lentiviral vector-based japanese encephalitis immunogenic composition |
| US10449243B2 (en) | 2014-12-22 | 2019-10-22 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Dengue virus vaccine compositions and methods of use thereof |
| EP3316905A1 (en) | 2015-07-03 | 2018-05-09 | Sanofi Pasteur | Concomitant dengue and yellow fever vaccination |
| CN105400799B (zh) * | 2015-12-22 | 2018-12-28 | 成都生物制品研究所有限责任公司 | 一种乙脑/黄热嵌合病毒及其制备方法和应用 |
| WO2017109698A1 (en) | 2015-12-22 | 2017-06-29 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Immunogenic formulation |
| GB201716307D0 (en) * | 2017-10-05 | 2017-11-22 | Univ Leuven Kath | Chimeric yellow fever zika virus strain |
| WO2019069130A1 (en) | 2017-10-05 | 2019-04-11 | Sanofi Pasteur | COMPOSITIONS FOR RECALL VACCINATION AGAINST DENGUE |
| KR20190127605A (ko) * | 2018-05-04 | 2019-11-13 | 에스케이바이오사이언스(주) | 키메라 지카바이러스 백신 |
| WO2020051328A1 (en) | 2018-09-05 | 2020-03-12 | Takeda Vaccines, Inc. | Assay for determining antibody response to dengue virus |
| US11464815B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-10-11 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine unit dose and administration thereof |
| US11426461B2 (en) | 2018-09-05 | 2022-08-30 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis A |
| MX2021002586A (es) | 2018-09-05 | 2021-06-08 | Takeda Vaccines Inc | Dosis unitaria de vacuna contra el dengue y administracion de esta. |
| GB201814563D0 (en) * | 2018-09-07 | 2018-10-24 | Univ Leuven Kath | Chimeric flavivirus lyssavirus vaccines |
| WO2021034349A1 (en) | 2019-08-16 | 2021-02-25 | Takeda Vaccines, Inc. | Methods for preventing dengue and hepatitis a |
| WO2021174059A1 (en) | 2020-02-27 | 2021-09-02 | Takeda Vaccines, Inc. | Method for removing host cell dna from virus preparation |
| CN113215116B (zh) * | 2021-05-11 | 2022-07-19 | 中国科学院动物研究所 | 基于朝阳病毒载体的嵌合病毒、疫苗及其应用 |
| JPWO2022249757A1 (pl) * | 2021-05-27 | 2022-12-01 | ||
| WO2023147342A2 (en) | 2022-01-25 | 2023-08-03 | Takeda Vaccines, Inc. | Large-scale flaviviral vaccine production and manufacture |
| WO2023158989A1 (en) | 2022-02-15 | 2023-08-24 | Takeda Vaccines, Inc. | Dengue vaccine batch mixing process |
| WO2023215383A1 (en) | 2022-05-04 | 2023-11-09 | Takeda Vaccines, Inc. | Computer-based determination of flavivirus infectivity |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL91304A0 (en) * | 1988-08-20 | 1990-03-19 | Us Health | Recombinant vaccinia virus for prevention of disease caused by flavivirus |
| ES2153223T3 (es) * | 1991-09-19 | 2001-02-16 | Us Health | Flavivirus quimericos y/o flavivirus de crecimiento restringido. |
-
1998
- 1998-03-02 DE DE69841690T patent/DE69841690D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 JP JP53790798A patent/JP4504464B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK98910103T patent/DK0977587T3/da active
- 1998-03-02 PT PT05012770T patent/PT1625852E/pt unknown
- 1998-03-02 AU AU64431/98A patent/AU740961B2/en not_active Expired
- 1998-03-02 BR BR9807873A patent/BR9807873A/pt not_active Application Discontinuation
- 1998-03-02 PL PL335481A patent/PL192957B1/pl unknown
- 1998-03-02 ES ES05012770T patent/ES2345614T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 EP EP10005372A patent/EP2251036A1/en not_active Withdrawn
- 1998-03-02 IL IL13160098A patent/IL131600A0/xx not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 ES ES98910103T patent/ES2244050T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 KR KR10-1999-7007904A patent/KR100517323B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 AT AT05012770T patent/ATE468858T1/de active
- 1998-03-02 EP EP98910103A patent/EP0977587B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 HU HU0002139A patent/HU228705B1/hu unknown
- 1998-03-02 PT PT98910103T patent/PT977587E/pt unknown
- 1998-03-02 CN CNB988045567A patent/CN1187088C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 DK DK05012770.3T patent/DK1625852T3/da active
- 1998-03-02 CZ CZ0306499A patent/CZ300172B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 EP EP05012770A patent/EP1625852B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 RU RU99120696/14A patent/RU2209082C2/ru active
- 1998-03-02 DE DE69830579T patent/DE69830579T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 NZ NZ337522A patent/NZ337522A/en not_active IP Right Cessation
- 1998-03-02 CA CA2282790A patent/CA2282790C/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-03-02 AT AT98910103T patent/ATE297757T1/de active
- 1998-03-02 WO PCT/US1998/003894 patent/WO1998037911A1/en active Application Filing
-
1999
- 1999-08-27 NO NO19994185A patent/NO329693B1/no not_active IP Right Cessation
-
2000
- 2000-08-09 HK HK00104982A patent/HK1025743A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2008
- 2008-07-31 IL IL193170A patent/IL193170A/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-10-28 JP JP2009247641A patent/JP2010057496A/ja active Pending
-
2010
- 2010-08-10 IL IL207516A patent/IL207516A0/en unknown
- 2010-08-10 IL IL207517A patent/IL207517A0/en unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CA2282790C (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| US6962708B1 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| WO1998037911A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| JP3681369B2 (ja) | キメラおよび／または増殖制限されたフラビウイルス | |
| AU2005295438B2 (en) | Vaccines against Japanese encephalitis virus and West Nile virus | |
| JP5469336B2 (ja) | 組換えフラビウイルスワクチン | |
| KR100921592B1 (ko) | 키메라 플라비바이러스 벡터 | |
| CA2432370C (en) | Attenuated flaviviral live vaccine comprising a capsid protein deletion | |
| WO2001039802A9 (en) | Chimeric flavivirus vaccines | |
| MXPA99007949A (es) | Vacunas de flavivirus quimerico |