ES2244050T3 - Vacunas quimericas de flavivirus. - Google Patents

Vacunas quimericas de flavivirus.

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Thomas P. Monath
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St Louis University
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Abstract

Una vacuna quimérica viva, infecciosa, atenuada, que contiene un virus de fiebre amarilla, en la que la secuencia nucleotídica asociada a una proteína prM-E ha sido suprimida, truncada o mutada, de manera que la proteína funcional prM-E no se expresa, e integrada al genoma del virus de la fiebre amarilla, una secuencia nucleotídica que codifica una proteína preM-E de un segundo virus diferente, de manera que se expresa la proteína prM-E del segundo flavivirus.

Description

Vacunas quiméricas de flavivirus.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a virus infecciosos atenuados, útiles como vacunas contra enfermedades causadas por flavivirus.
Varios miembros de la familia de los flavivirus representan amenazas habituales o potenciales para la salud pública global. Por ejemplo, la Encefalitis japonesa constituye un problema significativo de salud pública que afecta a millones de individuos que corren peligro en el Lejano Oriente. El virus del dengue, con una incidencia anual estimada de 100 millones de casos de fiebre primaria del dengue y más de 450.000 casos de fiebre hemorrágica del dengue en todo el mundo, ha surgido como la enfermedad humana más importante transmitida por artrópodos. Otros flavivirus continúan causando enfermedades endémicas de naturaleza variable y tienen el potencial de manifestarse en áreas nuevas como resultado de cambios en el clima, poblaciones vectoras y alteraciones del entorno provocadas por la actividad humana. Estos flavivirus incluyen, por ejemplo, el virus de la Encefalitis de San Luis, que causa una enfermedad esporádica pero aguda grave en el Medio Oeste, el Sudeste y Oeste de Estados Unidos; el virus del Oeste del Nilo, que causa una enfermedad febril, que se complica ocasionalmente por Encefalitis aguda, y se distribuye ampliamente a través de África, el Oriente Medio, la antigua Unión Soviética, y partes de Europa; el virus de la Encefalitis Murray Valley que causa una enfermedad endémica del sistema nervioso en Australia; y el virus de la Encefalitis transmitida por las garrapatas, que se distribuye a través de la antigua Unión Soviética y del Este de Europa, en la que su vector garrapata es habitual y responsable de una forma grave de Encefalitis en estas regiones.
El virus de la hepatitis C (HCV) es otro miembro de la familia flavivirus, con una organización genómica y estrategia de replicación que son similares, pero no idénticos, a las de los flavivirus mencionados anteriormente. El HCV se transmite principalmente mediante exposición parenteral, y se asocia con la hepatitis crónica que puede progresar a cirrosis y carcinoma hepatocelular, y es una causa principal de enfermedad hepática que requiere trasplante ortotópico en los Estados Unidos.
La familia Flaviviridae es diferente de los alfavirus (por ejemplo, WEE, VEE, EEE, SFV, etc.) y habitualmente contiene 3 géneros, los flavivirus, los pestivirus y los virus de la hepatitis C. Los viriones maduros completamente procesados de los flavivirus contienen tres proteínas estructurales, cubierta (E), cápside (C) y membrana (M), y siete proteínas no estructurales (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5). Los flaviviriones inmaduros que se encuentran en las células infectadas contienen la preproteína de membrana (prM), que es la precursora de la proteína M.
Después de la unión de los virus a los receptores de la célula huésped, la proteína E experimenta un cambio conformacional irreversible tras exponerse al pH ácido de los endosomas, provocando la fusión entre las bicapas de la envuelta de los viriones y las vesículas endocíticas, liberando de este modo el genoma vírico en el citosol del huésped. Los virus de la Encefalitis que se transmite por las garrapatas (TBE) que contienen prM no son competentes para la fusión, indicando que el procesamiento proteolítico de prM es necesario para generar viriones competentes para la fusión y enteramente infecciosos (Guirakhoo et al., J. Gen. Virol. 72 (Pt.2): 333-338, 1991). Utilizando cloruro amónico al final del ciclo de replicación del virus, se produjeron virus de la Encefalitis (MVE) de Murray Valley que contenían prM, mostrándose ser incompetentes para la fusión. Utilizando péptidos secuencia-específicos y anticuerpos monoclonales, se demostró que prM interacciona con los aminoácidos 200-327 de la proteína E. Esta interacción es necesaria para proteger la proteína E de los cambios conformacionales irreversibles causados por la maduración en las vesículas ácidas de la vía exocítica (Guirakhoo et al., Virology 191:921-931, 1992).
La división de prM a la proteína M tiene lugar poco antes de la liberación de los viriones mediante una proteasa celular del tipo furina (Stadler et al., J. Virol. 71:8475-8481, 1997), que es necesaria para activar la actividad hemaglutinante, la fusogénica y la infectividad de los viriones. La proteína M se divide a partir de su proteína precursora (prM) después de la secuencia de consenso R-X-R/K-R (X es variable), y se incorpora en la envuelta lipídica del virus, junto con la proteína E.
Las secuencias de división se han conservado no sólo en los flavivirus, sino también en las proteínas de otros virus no relacionados, tal como PE2 de los coronavirus murinos, PE2 de los alfavirus, HA de los virus de la influenza, y p160 de los retrovirus. La división de la proteína precursora es esencial para la infectividad del virus, pero no para la formación de las partículas. Se mostró que, en el caso de una quimera del dengue 4-TBE, un cambio en el sitio de división de prM dio lugar a una disminución en la neurovirulencia de esta quimera (Pletnev et al., J. Virol. 67:4956-4963, 1993), que está de acuerdo con la observación previa de que el procesamiento eficiente de prM es necesario para la infectividad total (Guirakhoo et al., 1991, supra, 1992, supra; Heinz et al., Virology 198:109-117, 1994). Los anticuerpos para la proteína prM pueden mediar inmunidad protectora, debido aparentemente a la neutralización de viriones liberados que contienen algunas prM no divididas. El sitio de división proteolítica de la PE2 de VEE (4 aminoácidos) se suprimió mediante mutagénesis dirigida del clon infeccioso (Smith et al., ASTMH meeting, 7 al 11 de diciembre, 1997). Los mutantes de deleción replicaron con una gran eficiencia y las proteínas PE2 se incorporaron a las partículas. Este mutante se evaluó en primates no humanos y se mostró que provocó una seroconversión del 100% y que protegió a todos los monos inmunizados de una estimulación letal.
Sumario de la invención
La invención se refiere a virus quiméricos, vivos, infecciosos y atenuados, estando compuesto cada uno de ellos por:
(a)
un primer virus de la fiebre amarilla (por ejemplo, la cepa 17D), que representa un virus vacunal vivo, atenuado, en el que la secuencia nucleótida para una proteína prM-E es suprimido, truncado o mutado, de forma que la proteína funcional prM-E del primer flavivirus no se expresa, y
(b)
una secuencia nucleótida integrada en el genoma del primer flavivirus, que codifica la envoltura vírica (proteínas prM-E) de un segundo y distinto flavivirus, de forma que la proteína prM-E del segundo flavivirus se expresa a partir del genoma alterado del primer flavivirus, en el que la secuencia señal en la unión C/prM del virus de la fiebre amarilla se mantiene.
El virus quimérico está pues compuesto por los genes y los productos génicos responsables de la replicación intracelular que pertenecen al primer flavivirus, y los genes y productos génicos de la envuelta del segundo flavivirus. Ya que la envuelta vírica contiene todos los determinantes antigénicos responsables de la inducción de anticuerpos neutralizantes, el resultado de la infección con el virus quimérico es que dichos anticuerpos se generan sólo contra el segundo flavivirus.
Un virus vivo preferido para utilizar como primer flavivirus en los virus quiméricos de las invención, es el virus de la fiebre amarilla. Por lo menos, una vacuna ya ha empleado este virus vivo y atenuado; la vacuna se conoce como YF17D y se ha utilizado para inmunización humana durante 50 años. La vacuna YF17D se describe en varias publicaciones, incluyendo las publicaciones de Smithburn et al., (Yellow Fever Vaccination'', World Health Org., p.238, 1956) y Freestone (en Plotkin et al., (Eds), Vaccines, 2ª edición, W.B. Saunders, Philadelphia, 1995). Además, el virus de la fiebre amarilla se ha estudiado a nivel genético (Rice et al., Science 229:726-733, 1985), y se ha establecido información que correlaciona el genotipo y el fenotipo (Marchevsky et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 52:75-80, 1995).
Los flavivirus preferidos para utilizar como segundo flavivirus en los virus quiméricos de la invención, y por esto, fuente de antígenos inmunizantes, incluyen los virus de la Encefalitis japonesa (JE), del Dengue (DEN, por ejemplo, cualquiera de los tipos 1 a 4 del dengue), del de la Encefalitis Murray Valley (MVE), del de la Encefalitis de San Luis (SLE), del Oeste del Nilo (WN), virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas (TBE), y los virus de la hepatitis C (HCV). Otros flavivirus para utilizar como el segundo flavivirus incluyen el virus de Kunjin, y los virus de la Encefalitis europea central, virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano, virus de Powassan, virus de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk. En un virus quimérico preferido de la invención, la secuencia del segundo flavivirus que codifica la proteína prM-E se sustituye en la secuencia del virus de la fiebre amarilla que codifica la proteína prM-E. En un virus quimérico preferido, la secuencia que codifica la proteína prM-E deriva de una cepa vírica atenuada, tal como una cepa vacunal. Asimismo, tal como se da a conocer además a continuación, la parte
prM de la proteína puede contener una mutación que evite la división para generar la proteína madura de la membrana.
Asimismo, se incluye en la invención la utilización de los flavivirus quiméricos de la invención en la preparación de medicamentos para prevenir o tratar la infección por flavivirus; moléculas de ácido nucleico que codifican los flavivirus quiméricos de la invención; y procedimientos para preparar los flavivirus quiméricos de la invención.
La invención proporciona varias ventajas. Por ejemplo, a causa de que están vivos y llevan a cabo la replicación, los virus quiméricos de la invención pueden utilizarse para producir una inmunidad protectora a largo plazo. Debido a que los virus poseen los genes de replicación de un virus atenuado (por ejemplo, el 17D de la fiebre amarilla), el virus quimérico resultante está atenuado hasta un grado que hace que su utilización sea segura en el hombre.
Otras características y ventajas de la invención se clarificarán a partir de la siguiente descripción detallada, de los dibujos y de las reivindicaciones.
Descripción breve de los dibujos
La Fig 1 es una representación esquemática de las etapas de la manipulación genética que se llevaron a cabo para construir un virus quimérico Fiebre amarilla-Encefalitis japonesa (YF/JE) de la invención.
La Fig 2 es un conjunto de curvas de crecimiento para virus quiméricos YF/JE de la invención, en cultivos celulares aceptables para preparar una vacuna humana.
La Fig 3 es un gráfico que muestra la comparación del crecimiento entre RMS (Sembrado principal de investigación, YF/JE SA_{14} -14-2) y YF-Vax en células MRC-5.
La Fig 4 es una gráfica y tabla que muestra los resultados de un análisis de la neurovirulencia del ratón llevado a cabo con un virus quimérico YF/JE de la invención.
La Fig 5 es una representación esquemática de un sistema de dos plásmidos para generar el virus quimérico YF/DEN-2. La estrategia es esencialmente tal como la que se describe para el virus quimérico YF/JE.
La Fig 6 es una representación esquemática de la estructura de clones YF modificados diseñados para eliminar partes de la proteína NS1 y/o expresar proteínas extrañas bajo el control de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES). La figura muestra sólo la región E/NS1 del genoma vírico. Un codón de detención traduccional se introduce en el extremo carboxilo de la proteína de la envuelta (E). La traducción corriente abajo se inicia en el interior de un marco de lectura abierto (ORF) intergénico mediante IRES-1, que gobierna la expresión de proteínas extrañas (por ejemplo, proteínas E1 y/o E2 de HCV). El segundo IRES (IRES-2) controla el inicio de la traducción de la región no estructural de YF, en la que se expresan proteínas NS1 truncadas anidadas (por ejemplo, NS1del-1, NS1del-2, o NS1del-3). El tamaño de la deleción de NS1 es inversamente proporcional al del ORF unido a
IRES-1.
La Fig 7 es un gráfico que muestra la respuesta neutralizante de los anticuerpos de ratones inmunizados con una vacuna quimérica YF/JE SA_{14}-14-2.
Descripción detallada
La invención proporciona flavivirus quiméricos que pueden utilizarse en procedimientos de vacunación contra las infecciones por flavivirus. La construcción y análisis de los flavivirus quiméricos de la invención, tales como quimeras del virus de la fiebre amarilla y del de la Encefalitis japonesa (JE), de cualquiera de los tipos 1 a 4 del Dengue (DEN 1-4), del de la Encefalitis Murray Valley (MVE), del de la Encefalitis de San Luis (SLE), del Oeste del Nilo (WN), del virus de la Encefalitis que se transmite por las garrapatas (TBE), y de los virus de la hepatitis C (HCV), se describen a continuación.
Las proteínas de los flavivirus se producen por la traducción de un único y largo marco abierto de lectura (que codifica, por ejemplo, las proteínas estructurales, la cápside (C), la premembrana (pr-M) y la envuelta (E), así como las proteínas no estructurales y una serie compleja de divisiones proteolíticas postraduccionales. Los flavivirus quiméricos de la invención, tal como se ha considerado anteriormente, incluyen aquéllos en los que las proteínas pr-M y E de un flavivirus se han reemplazado por las proteínas pr-M y E de otro flavivirus. Así, la creación de estos flavivirus quiméricos implica la generación de nuevas uniones entre la cápside y las proteínas premembrana, y las proteínas de la envuelta y la región no estructural (NS1) de los distintos flavivirus. La división entre cada uno de estos conjuntos de proteínas (C y pr-M, y E y NS1), tiene lugar durante el procesamiento proteolítico natural de las proteínas del flavivirus, y necesita la presencia de secuencias señal que franqueen las uniones de los sitios de división.
En los flavivirus quiméricos de la invención, es preferible que las secuencias señal de los virus de la fiebre amarilla que dan lugar a las quimeras se conserven, de manera que la división apropiada entre las proteínas C y pr-M y E y NS1 pueda llevarse acabo eficientemente. Una secuencia señal puede incluir como su último residuo un aminoácido con una cadena lateral pequeña no cargada, tal como la alanina, la glicina, la serina, la cisteína, la treonina o la
glutamina.
Construcción de matrices ADNc para generar virus quiméricos YF/JE
La derivación de matrices enteras de ADNc para quimeras YF/JE de la invención que se describe a continuación utilizó una estrategia similar a la que investigadores anteriores utilizaron para regenerar YF17D a partir de ADNc para el análisis genético molecular de la replicación de YF. La estrategia se describe, por ejemplo, por Nestorowicz et al., (Virology 199:114-123, 1994).
Brevemente, la derivación de las quimeras YF/JE de la invención, implica lo siguiente: secuencias genómicas de YF se propagan en dos plásmidos (YF5'3'IV y YFM5.2) que codifican las secuencias YF de los nucleótidos 1 a 2.276 y 8.279 a 10.861 (YF5'3'IV) y de 1.373 a 8.704 (YFM5.2) (Rice et al., The New Biologist 1:285-296, 1989). Las matrices completas de ADNc se generaron por la unión de fragmentos apropiados de restricción derivados de estos plásmidos. Este procedimiento ha sido el más .fiable para asegurar la expresión estable de las secuencias YF y de la generación de transcritos de ARN de infectividad altamente específica.
La estrategia de los inventores para la construcción de quimeras implica reemplazar las secuencias YF en el interior de los plásmidos YF5'3'TV e YFM5.2 por las secuencias correspondientes de JE, a partir del inicio de la proteínas prM (nucleótido 478, aminoácido 128) a través del sitio de división E/NS1 (nucleótido 2.452, aminoácido 817). Además de la clonación de JE ADNc, se necesitaron varias etapas para introducir o eliminar los sitios de restricción en las dos secuencias YF y JE, para dejar que la unión in vitro se llevara a cabo. La estructura de la matriz para la regeneración del virus quimérico YF (C)/JE (prM-E) se muestra en la Figura 1. Una segunda quimera, que codifica la región estructural completa JE (C-prM-E), se obtuvo empleando una estrategia similar.
Clonación molecular de la región estructural del virus JE
A partir de la cepa JE SA_{14}-14-2 (cepa vacunal atenuada y viva de JE), se generaron clones de genes de proteínas estructurales JE auténticas, porque las propiedades biológicas y la caracterización molecular de esta capa están bien documentadas (véase, por ejemplo., Eckels et al., Vaccine 6:513-518, 1988; el virus JE SA_{14}-14-2 está disponible en los Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado y en la Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut, que constituyen Centros de Referencia para los Arbovirus en los Estados Unidos, designados por la Organización Mundial de la Salud). En el nivel de paso PDK-5 se obtuvo el virus JE SA_{14}-14-2, que se hizo pasar por las células LLC-MK_{2} para obtener cantidades suficientes de virus para la clonación del ADNc. La estrategia que se ha utilizado implicó la clonación de la región estructural en dos fragmentos que se solaparon en un sitio NheI (nucleótido 1.125 de JE), que puede entonces utilizarse para la unión in vitro.
El ARN se extrajo de las monocapas de las células LLC-MK_{2} infectadas y la síntesis de la primera cadena de ADNc con sentido negativo se llevó a cabo utilizando la transcriptasa inversa con un iniciador de sentido negativo (secuencia nucleótida 2.456 a 2471 de JE) que contenía los sitios de restricción anidadas XbaI y NarI para realizar inicialmente la clonación en pBluescript II KS (+), y a continuación en YFM5.2 (NarI), respectivamente. La síntesis de la primera cadena de ADNc fue seguida por la amplificación PCR de la secuencia JE entre los nucleótidos 1.108 a 2.471, utilizando el mismo iniciador con sentido negativo y un iniciador con sentido positivo (secuencia nucleótida de JE entre 11.108 y 1.130) que contenía los sitios de restricción anidadas XbaI y NsiI para llevar a cabo la clonación en pBluescript e YFM5.2 (NarI), respectivamente. Las secuencias de JE se comprobaron mediante digestión enzimática de restricción y secuenciación nucleótida. La secuencia nucleótida de JE entre los nucleótidos 1 y 1130 se derivó mediante amplificación PCR de la cadena JE ADNc negativa, utilizando un iniciador de sentido negativo que corresponde a los nucleótidos JE 1.116 a 1.130, y un iniciador de sentido positivo que corresponde a los nucleótidos 1 a 18 de JE, conteniendo ambos un sitio de restricción EcoRI. Los fragmentos PCR se clonaron en pBluescript, y las secuencias de JE se comprobaron mediante secuenciación nucleótida. Conjuntamente, esto representa la clonación de la secuencia JE entre los nucleótidos 1 y 2.471 (aminoácidos 1-792).
Construcción de los derivados YF5'3'IV/JE e YFM5.2/JE
Para insertar el extremo C de la proteína JE de la envuelta en el sitio de división YF E/NS1, se introdujo un único sitio de restricción NarI en el plásmido YFM5.2 mediante mutagénesis oligonucleótido-dirigida de la secuencia señalasa en el sitio E/NS1 de división (nucleótidos 2.447 a 2.452 de YF, aminoácidos 816-817) para crear YFM5.2 (NarI). Los transcritos derivados de las matrices que incorporan este cambio se chequearon respecto a la infectividad y dieron lugar a una infectividad específica similar a las matrices parentales (100 unidades formadoras de calvas/250 nanogramos de transcritos, aproximadamente). La secuencia de JE entre los nucleótidos 1.108 y 2.471 se subclonó a partir de varios clones independientes derivados mediante PCR de pBluescript/JE en YFM5.2 (NarI), utilizando los únicos sitios de restricción NsiI y NarI. Los clones YF5'3'IV/JE que contienen la región no traducida YF5'(nucleótidos 1 a 118) adyacente a la región JE prM-E, se derivaron mediante amplificación PCR.
Para derivar secuencias que contuvieran la unión de la cápside YF y JE prM, se utilizó un iniciador quimérico de sentido negativo que abarcaba esta región, con un iniciador de sentido positivo que correspondía a los nucleótidos 6.625 a 6.639 de YF5'3'IV, para generar fragmentos PCR que se utilizaron entonces como iniciadores PCR de sentido negativo en conjunción con un iniciador de sentido positivo complementario a la secuencia del vector pBluescript corriente arriba del sitio EcoRI, para amplificar la secuencia JE (codificada en orientación inversa en el vector pBluescript) desde el nucleótido 477 (extremo N de la proteína prM), a través del sitio NheI en el nucleótido 1.125. Los fragmentos PCR resultantes se insertaron en el plásmido YF5'3'IV utilizando los sitios de restricción NotI y EcoRI. Este constructo contiene el promotor SP6 que precede a la región no traducida YF-5', seguido por la secuencia: YF(C)JE (prM-E). y contiene el sitio NheI (nucleótido 1.125 de JE) necesario para la unión in vitro.
Procedimientos de ingeniería genética para que YFM5.2 e YF5'2'IV contengan los sitios de restricción para llevar a cabo la unión in vitro
Para utilizar el sitio NheI dentro de la secuencia JE de la envuelta como un sitio 5' de unión in vitro, se eliminó un sitio NheI superfluo en el plásmido YFM5.2 (nucleótido 5.459). Esto se llevó a cabo mediante una mutación silenciosa de la secuencia YF en el nucleótido 5.461 (T\rightarrowC; alanina, aminoácido 1820). Este sitio se incorporó a YFM5.2 mediante la unión de fragmentos de restricción apropiados y la introducción en YFM5.2 (NarI)/JE intercambiando un fragmento NsiI/NarI que codifica la secuencia quimérica YF/JE.
Para crear un único sitio de restricción 3' para la unión in vitro, se construyó un sitio BspEI corriente abajo del sitio AatII utilizado normalmente para generar matrices completas a partir de YF5'3'IV e YFM5.2 (Múltiples sitios AatII se encuentran en la secuencia estructural JE, excluyendo la utilización de este sitio para la unión in vitro). El sitio BspEI se creó mediante la mutación silenciosa del nucleótido 8.581 de YF (A\rightarrowC; serina, aminoácido 2.860) y se introdujo en YFM5.2 mediante intercambio de fragmentos apropiados de restricción. El único sitio se incorporó en YFM5.2/JE mediante intercambio del fragmento XbaI/SphI y en los plásmidos YF5'3'IV/JE (prM-E) mediante la unión de 3 segmentos de fragmentos apropiados de restricción de estos plásmidos parentales y a partir de un derivado de YFM5.2 (BspEI), suprimiendo la secuencia de YF entre los sitios EcoRI, en los nucleótidos 1 y 6.912.
Intercambio del ADNc Nakayama de JE en los plásmidos quiméricos YF/JE
A causa de la incertidumbre respecto a la capacidad de la región estructural de JE SA_{14}-14-2 derivada de PCR para funcionar apropiadamente en el contexto del virus quimérico, se utilizan ADNc procedentes de un clon de la cepa JE Nakayama que se ha caracterizado ampliamente en experimentos de expresión y por su capacidad inducir inmunidad protectora (véase, por ejemplo, Mclda et al., Virology 158:348-360, 1987; la cepa JE Nakayama está disponible en los Centers for Disease Control, Fort Collins, Colorado y en la Yale Arbovirus Research Unit, Yale University, New Haven, Connecticut). El ADNc Nakayama se insertó en los plásmidos quiméricos YF/JE utilizando sitios de restricción disponibles (HindIII a PvuII y BpmI a MunI), para reemplazar la región prM-E completa en el sistema de dos plásmidos excepto para un único aminoácido, serina, en posición 49, que se dejó intacto con objeto de utilizar el sitio NheI para la unión in vitro. La región JE completa en el clon Nakayama se secuenció para comprobar que el ADNc que se había reemplazado era auténtico (Tabla 2).
Generación de matrices completas de ADNc, transfección del ARN y recuperación de virus infecciosos
Los procedimientos para generar matrices completas de ADNc, son esencialmente tal como se han descrito en Rice et al., (The New Biologist, 1:285-96, (1989) (véase la Fig 1). En el caso de matrices quiméricas, los plásmidos YF5'3'IV/JE (prM-E) e YFM5.2/JE se digirieron con NheI/BspEI, llevándose a cabo la unión in vitro utilizando 50 nanogramos de fragmentos purificados en presencia de la T4ADN ligasa. Los productos de la unión se linearizan con XhoI para permitir el procesamiento de la transcripción. Los transcritos SP6 se sintetizan utilizando 50 nanogramos de la matriz purificada, y se cuantifican por la incorporación de ^{3}H-UTP, comprobándose la integridad del ARN mediante electroforesis en gel de agarosa no desnaturalizante. Los rendimientos, utilizando este procedimiento, oscilan entre 5 y 10 microgramos de ARN por reacción, la mayoría de los cuales se encuentra como transcritos completos. La transfección de los transcritos de ARN en presencia de liposomas catiónicos se lleva a cabo tal como se describe por Rice et al., (supra), para YF17D. En los experimentos iniciales, se utilizaron las células LLC-MK_{2} para la transfección y cuantificación del virus, ya que se determinó la permisividad para la replicación y la formación de las calvas de las cepas parentales de YF y JE. La tabla 1 muestra resultados típicos de los experimentos de transfección, empleando Lipofectina (GIBCO/BRL) como vehículo de transfección. Asimismo, se han utilizado rutinariamente progenies celulares Vero, para la preparación de reservas de virus infecciosos, la caracterización de proteínas marcadas y ensayos de neutralización.
Secuenciación nucleótida de las matrices del ADNc quimérico
Los plásmidos que contenían el ADNc quimérico YF/JE se sometieron a análisis secuencial de la parte JE de los clones, para identificar las secuencias correctas de la SA_{14}-14-2 y de la proteína Nakagama de la envuelta. Las diferencias en la secuencia nucleótida entre estos constructos en comparación con las secuencias de las que se ha informado (McAda et al, supra), se muestran en la tabla 2.
Caracterización estructural y biológica de los virus quiméricos YF/JE
La estructura genómica de los virus quiméricos YF/JE recuperados a partir de los experimentos de transfección, se comprobó mediante análisis basado en RT/PCR del ARN vírico recogido de las monocapas celulares infectadas. Esto experimentos se llevaron a cabo para eliminar la posibilidad de que las reservas víricas se contaminaran durante los procedimientos de transfección. Para estos experimentos, se utilizó un primer paso del virus para iniciar un ciclo de infección, para eliminar cualesquiera posibles artefactos generados por la presencia del ARN vírico residual transfectado. Los extractos del ARN total de las células infectadas con las quimeras YF/JE (prM-E)-SA_{14}-14-2, o YF/JE (prM-E)-Nakayama, se sometieron a RT/PCR empleando iniciadores específicos para YF y JE que permitieron la recuperación de la región estructural completa como productos de PCR de 1 kilobase aproximadamente de tamaño. Estos productos se analizaron entonces mediante digestión enzimática de restricción, utilizando los sitios predichos en el interior de las secuencias JE SA_{14}-14-2 y Nakayama que permiten la diferenciación de estos virus. Utilizando este enfoque, se demostró que el ARN vírico era quimérico y se comprobó que los virus recuperados presentaban los sitios de restricción apropiados. El límite actual de C-prM se comprobó entonces que estaba intacto a nivel secuencial, mediante el análisis de la secuencia del ciclo a través de la unión quimérica YF/JE C-prM.
La presencia de la proteína JE de la envuelta en las dos quimeras se comprobó, tanto mediante inmunoprecipitación con antisuero JE específico, como mediante el ensayo de neutralización de reducción de la calva, utilizando antisueros YF y JE específicos. La inmunoprecipitación de extractos marcados con ^{35}S de células LLC-MK_{2} que se habían infectado con las quimeras, utilizando un anticuerpo monoclonal para la proteína E JE, mostró que la proteína JE de la envuelta podía recuperarse como una proteína de 55 kD, mientras que el mismo antisuero no fue capaz de llevar a cabo una inmunoprecipitación de una proteína de las células infectadas con YF. Tanto los sueros hiperinmunes JE como YF demostraron reactividad cruzada para las dos proteínas de la envuelta, pero la diferencia de tamaño entre las proteínas (YF=53 kD, no glicosilada; JE=55 kD, glicosilada) pudo observarse de forma reproducible. La utilización de anticuerpos monoclonales YF no fue satisfactoria bajo las condiciones de inmunoprecipitación, por lo que, la especificidad dependió de los anticuerpos monoclonales para JE en este análisis. El ensayo de neutralización de la reducción de las calvas (PRNT) se llevó a cabo sobre los virus quiméricos y los virus YF y JE SA_{14}-14-2 utilizando líquido ascítico hiperinmune específico para JE e YF (ATCC) e IgG purificada específica para YF (anticuerpo monoclonal 2E10). Se observaron diferencias significativas para las quimeras en el título de reducción del 50% de las calvas de estos antisueros, cuando se compararon con los virus de control en estos experimentos (Tabla 3). De este modo, los epítopos necesarios para la neutralización se expresan en los virus quiméricos YF/JE infecciosos.
Propiedades de crecimiento en cultivo celular
La capacidad de crecimiento de las quimeras se ha examinado cuantitativamente en progenies celulares con origen tanto en primates como en mosquitos. La Fig 2 muestra las curvas de crecimiento acumulativo de las quimeras en las células LLC-MK_{2} después de una infección de baja multiplicidad (0,5 unidades formadoras de calvas/célula). En este experimento, los virus YF5.2iv (derivado clonado) y JE SA_{14}-14-2 (no clonado) se utilizaron para comparar. Ambos virus quiméricos alcanzaron un rendimiento vírico máximo de aproximadamente 1 log más alto que el virus parental. En el caso de las quimeras YF/JE SA_{14}-14-2, el pico de producción vírica tuvo lugar 12 horas después que la quimera YF/JE Nakayama (50 horas respecto a 38 horas). Las quimeras YF/JE Nakayama mostraron considerablemente más efectos citopáticos que las quimeras YF/JE SA_{14}-14-2 sobre esta progenie celular. Un experimento similar se llevó a cabo en las células C6/36 después de una infección de baja multiplicidad (0,5 unidades formadoras de calvas/célula). La Fig 2 muestra asimismo la cinética del crecimiento de los virus en esta progenie celular invertebrada. Se obtuvieron rendimientos víricos similares en todos los puntos utilizados para la recuperación de los virus en este experimento, confirmando además la idea el hecho de que los virus quiméricos no se ven afectados en la eficiencia de la
replicación.
Comparación de la cinética de crecimiento de los RMS (YF/JE SA_{14}-14-2) con la vacuna YF 17D en las células MRC-5
Se llevó a cabo un experimento para evaluar la capacidad del candidato vacunal para multiplicarse en una progenie celular aceptable para las vacunas humanas. La vacuna comercial 17D de la fiebre amarilla (YF-Vax®) se obtuvo de Connaught Laboratories, Swiftwater, PA. Las MRC-5 (células embrionarias humanas diploides) se obtuvieron de la ATCC (171-CCL, Lote nº F-14308, pase 18) y se hicieron crecer en EMEM, 2 mM L-Gln, BSS (medio) de Earle ajustado para contener 1,5 g/l de bicarbonato sódico, 0,1 mM de aminoácidos no esenciales y FBS al
10%.
Para comparar la cinética de crecimiento de los RMS (Sembrado Principal de Investigación, YF/JE SA_{14}-14-2 con (YF-Vax®), se hicieron crecer las células hasta el 90% de confluencia y se infectaron con RMS o (YF-Vax®) con una MOI de 0,1 unidades formadoras de placa. Ya que las células MRC-5 crecen generalmente lentamente, estas células se conservaron durante 10 días después de la inoculación. Las muestras se congelaron diariamente entre 7 y 10 días y la infectividad se determinó mediante el ensayo en placa en las células Vero.
YF-Vax® y las quimeras YF/JE crecieron hasta títulos modestos en las células MRC-5 (Fig 3). El título máximo fue de aproximadamente 4,7 log_{10} unidades formadoras de calvas para YF-Vax® que se alcanzaron en el segundo día y fue ligeramente inferior, de 4,5 log_{10} unidades formadoras de calvas, para los RMS después de 6 días.
Ensayos de neurovirulencia en ratones adultos normales
Las propiedades de virulencia de las quimeras YF/JE SA_{14}-14-2 se analizaron en ratones adultos jóvenes mediante inoculación intracerebral. A grupos de 10 ratones (machos de 4 semanas de edad y ratones ICR hembras, 5 por grupo) se les inoculó con 10.000 unidades formadoras de calvas de las quimeras YF/JE SA_{14}-14-2, YF5.2iv, o JE SA_{14}-14-2, observándose diariamente durante tres semanas. Los resultados de estos experimentos se muestran en la Fig 4. Los ratones que recibieron la cepa YF5.2iv parental sucumbieron a la semana aproximadamente después de la inoculación. Entre los ratones que recibieron la cepa JE SA_{14}-14-2 parental o la quimera, no se observó mortalidad o enfermedad. Los inóculos que se utilizaron para los experimentos se titularon en el momento de la inyección y un subgrupo de los ratones supervivientes se ensayaron respecto a la presencia de anticuerpos neutralizantes para confirmar que la infección había tenido lugar. Entre los ensayados, los títulos contra los virus JE SA_{14}-14-2, fueron similares para los animales que recibieron esta cepa o la quimera.
Los resultados de otros experimentos que investigaban la neurovirulencia de las quimeras YF/JE SA_{14}-14-2 se muestran en la Tabla 4. En estos experimentos, todos los ratones a los que se había inoculado con YF5.2iv murieron entre los 7 y los 8 días. Al contrario, ninguno de los ratones a los que se inoculó con YF/JE SA_{14}-14-2 murió durante dos semanas después de observar la post-inoculación.
Los resultados de experimentos que investigaban la neuroinvasividad y la patogénesis de las quimeras YF/JE se muestran en la Tabla 5. En estos experimentos, los virus quiméricos se inocularon en ratones de 3 semanas de edad a dosis que variaban entre 10.000 y 1 millón de unidades formadoras de calvas a través de la vía intraperitoneal. Ninguno de los ratones que había sido inoculado con YF/JE Nakayama o YF/JE SA_{14}-14-2, murió durante tres semanas de observación de la post-inoculación, indicando que los virus fueron incapaces de provocar enfermedad después de la inoculación periférica. Los ratones a los que se inoculó con YF/JE SA_{14}-14-2, desarrollaron anticuerpos neutralizantes contra el virus JE (Fig 7).
Construcción de matrices de ADNc para la generación de virus quiméricos de fiebre amarilla/dengue (YF/DEN)
La derivación de los virus quiméricos de fiebre amarilla/dengue (YF/DEN) se describe a continuación, la cual, en principio, se lleva a cabo de la misma manera que la construcción de las quimeras YF/JE descritas anteriormente. Otras quimeras de flavivirus pueden obtenerse con una estrategia similar, utilizando sitios de restricción naturales u obtenidos mediante ingeniería genética y, por ejemplo, en la Tabla 6 se muestran iniciadores oligonucleó-
tidos.
Construcción del virus quimérico YF/DEN
Aunque se han desarrollado varios clones moleculares para los virus del dengue, se han encontrado habitualmente problemas relacionados con la estabilidad del ADNc vírico en los sistemas plasmídicos, y con la eficiencia de la replicación del virus recuperado. Se escogió utilizar un clon de DEN-2 desarrollado por el Dr. Peter Wright, del Departamento de Microbiología de la Universidad Monash, Clayton, Australia, porque este sistema es relativamente eficiente para regenerar los virus y utiliza un sistema biplasmídico similar a la propia metodología de los inventores. La secuencia completa de este clon DEN-2 está disponible y facilitó la construcción de matrices quiméricas YF/DEN, porque sólo fueron necesarias algunas modificaciones del clon YF. Las etapas importantes se dan a conocer a
continuación.
De forma similar al sistema biplasmídico para los virus YF5.2iv e YF/JE, el sistema YF/DEN utiliza un único sitio de restricción en el interior de la proteína (E) de la envuelta de DEN-2 como un límite para la propagación de la región estructural (prM-E) en el interior de los dos plásmidos, a los que se hará alusión en lo sucesivo en la presente memoria como YFS'3'IV/DEN (prM-E) e YFM5.2/DEN (E'-E) (véase la Fig 5). Los dos sitios de restricción para la unión in vitro de la matriz quimérica son AatII y SphI. El plásmido receptor para la parte del extremo 3' de la secuencia de la proteína E de DEN es YFM5.2 (NarI[+]SphI[-]). Este plásmido contiene el sitio NarI y la unión E/NSI, que se utilizó para la inserción del extremo carboxilo de la proteína E de JE. Se modificó posteriormente por eliminación de un sitio SphI extra en la región NS5 de la proteína mediante mutagénesis silenciosa sitio-dirigida. Esto permitió la inserción de la secuencia de DEN-2 desde el único sitio SphI al sitio NarI mediante clonación única direccional. El fragmento apropiado de ADNc DEN-2 se derivó mediante PCR a partir del clon MON310 de DEN-2 proporcionado por el Dr. Wright. Los iniciadores PCR incluyeron un iniciador 5' que franqueaba el sitio SphI y un iniciador 3' homólogo para los nucleótidos de DEN-2 inmediatamente corriente arriba del sitio señalasa en la unión E/NSI, y reemplazando el sitio señalasa mediante sustituciones que crean un nuevo sitio, pero que introducen asimismo un sitio NarI. El fragmento PCR resultante de 1.170 pares de bases se introdujo entonces en YFM5.2 (NarI[+]
SphI[-]).
La parte 5' del clon DEN-2 que incluye la prM y la parte terminal amino de la proteína E, se construyó en el plásmido YF5'3'IV utilizando un iniciador PCR quimérico. El iniciador quimérico, que incorpora el extremo 3' de la proteína YF C de sentido negativo y el extremo 5' de la proteína prM de DEN-2, se utilizó con un iniciador de sentido positivo que franqueaba el promotor SP6 del plásmido YF5'3'IV, para generar un producto PCR de 771 pares de bases con una extensión de 20 bases que representaban la secuencia prM de DEN-2. Este producto PCR se utilizó entonces para cebar el plásmido DEN-2 conjuntamente con un iniciador 3' que representa la secuencia DEN-2 de 1.501 a 1.522 y que franqueaba el SphI, para generar un producto PCR final de 1.800 pares de bases que incluye la secuencia YF desde el sitio NotI a través del promotor SP6, la región no traducida YF 5', y la proteína C de YF, contigua a la secuencia DEN-2 prM-E1522. El producto PCR se unió a YF5'3'IV utilizando los sitios NotI y SphI para dar lugar al plásmido YF5'3'IV/DEN(prM-E).
Construcción de matrices quiméricas para otros flavivirus
Los procedimientos para generar matrices de ADNc completo que codifiquen virus quiméricos YF/MVE, YF/SLE, YF/WN e YF/TBE son similares a los descritos anteriormente para el sistema YF/DEN-2. La Tabla 6 muestra las características de la estrategia para generar virus quiméricos basados en YF17D. Los únicos sitios de restricción utilizados para la unión in vitro, y los iniciadores quiméricos para construir las uniones C/prM y E/NSI son asimismo conocidos. Fuentes de ADNc para estos flavivirus heterólogos están fácilmente disponibles (MVE: Dalgarno et al., J. Mol. Biol. 187:309-323, 1986; SLE: Trent et al., Virology 156:293-304, 1987; TBE: Mandl et al., Virology 166:197-205, 1988; Dengue 1: Mason et al., Virology 161:262-267, 1987; Dengue 2: Deubel et al., Virology 155:365-377, 1986; Dengue 3: Hahn et al., Virology 162:167-180, 1988; Dengue 4: Zhao et al., Virology 155:77-88, 1986). Bray et al. (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88:10342-10346 describe la construcción de virus quiméricos intertípicos del dengue sustituyendo los genes de las proteínas estructurales. Además, un constructo de ADN recombinante que contiene un ácido nucleico derivado de por lo menos dos flavivirus se da a conocer en WO 93/06214. En este constructo, no se incluyen más que dos proteínas estructurales del virus de la Encefalitis transmitido por las garrapatas
(TBEV).
El documento Vacuna 12:966-975, de Venugopal & Gould (1994), revisa las vacunas de los flavivirus. Pletnev et al. (1992), Proc. Natl. Acad. Sci 89:10532-10536 describe la construcción y caracterización de los virus quiméricos de la Encefalitis transmitida por las garrapatas/dengue tipo 4.
Se construyeron ADNc completos quiméricos TBEV/DEN4 sustituyendo los genes TBEV que codifican proteínas tales como la de la cápside (C), la premembranosa (pre-M), la de la envuelta (E), o la proteína NS1 no estructural, por las correspondientes secuencias DEN4.
Un enfoque alternativo para construir otros virus quiméricos es crear la unión C/prM uniendo el extremo romo de fragmentos de restricción derivados de PCR que tienen extremos que se encuentran en esta unión, y extremos 5' y 3' que franquean sitios apropiados de restricción, para la introducción en YF5'3'IV o en un plásmido intermediario tal como pBS-KS (+). La opción de utilizar un oligonucleótido quimérico o una unión del extremo romo variará, dependiendo de la disponibilidad de sitios únicos de restricción en el interior de la región que codifica la proteína de la envuelta del virus en cuestión.
Construcción de virus YF que codifican antígenos HCV
Debido a que las proteínas estructurales E1 y E2 de HCV no son homólogas respecto a las proteínas estructurales de los flavivirus descritos anteriormente, la estrategia para la expresión de estas proteínas implica la inserción dentro de una región no esencial del genoma, de forma que la totalidad de estas proteínas se coexpresan entonces con proteínas (del virus de) la fiebre amarilla durante la replicación vírica en las células infectadas. La región diana para la inserción de las proteínas es la parte terminal N de la proteína NS1, ya que la proteína NS1 entera no es necesaria para la replicación vírica. Debido a los problemas potenciales relacionados con la estabilidad del genoma de YF (que se producen) en presencia de secuencias heterólogas que exceden al tamaño normal del genoma (10.000 nucleótidos aproximadamente), puede utilizarse la estrategia de detección que se describe a continuación. Además, la deleción de NS1 puede ser ventajosa en los sistemas quiméricos YF/Flavivirus que se han descrito anteriormente, porque la deleción parcial de esta proteína puede abrogar la inmunidad para YF asociada con los anticuerpos contra NS1, y evitar de este modo problemas con la inmunidad vectorial si se requiriera en un receptor dado más de una vacuna quimérica, o si una vacuna YF se hubiera administrado previamente o se hubiera necesitado en un punto
futuro.
La estrategia implica la creación de una serie de deleciones en el interior del marco de lectura dentro de la región codificante de NS1 del plásmido YFM5.2, en conjunción con la construcción de un codón de finalización traduccional en el extremo de E, y una serie de dos IRES (sitios internos de entrada ribosómica). Un IRES se encuentra inmediatamente corriente abajo del codón de finalización, y permite la expresión de un marco abierto de lectura dentro de la región comprendida entre E y NS1. El segundo IRES inicia la traducción a partir de las proteínas truncadas NS1, proporcionando la expresión del resto de la poliproteína YF no estructural. Estos derivados se ensayan respecto a la recuperación de los virus infecciosos y el constructo con la deleción más amplia se utiliza para insertar secuencias extrañas (por ejemplo, proteínas HCV) en el primer IRES. Este constructo particular puede asimismo servir como base para determinar si la deleción de NS1 afectará a la inmunidad vector-específica en el contexto de los virus quiméricos YF/Flavivirus que expresan prM-E, tal como se ha descrito anteriormente.
La inserción de nucleótidos que codifican las proteínas E1, E2, y/o E1 más E2 HCV está limitada por el tamaño de la deleción permitida en la proteína NS1. Debido a esto, las proteínas HCV truncadas pueden utilizarse para potenciar la estabilidad en el interior del clon YF modificado. Las proteínas HCV se construyen con una secuencia señal N-terminal que sigue inmediatamente al IRES y con un codón de finalización en el extremo C. Esta construcción dirigirá a las proteínas HCV al retículo endoplásmico para la secreción a partir de la célula. La estrategia para esta construcción se muestra esquemáticamente en la Fig 6. Plásmidos que codifican proteínas HCV de genotipo l pueden utilizarse para estas construcciones, por ejemplo. Los plásmidos HCV obtenidos a partir del Dr. Charles Rice en la Washington University (Grakoui et al., J. Virology 67: 1385-1395, 1993), que han expresado esta región del virus en sistemas de procesamiento y en el interior de un clon HCV completo de replicación-complemento.
Mutantes de deleción de la división de PrM como candidatos para la atenuación de la vacuna para los flavivirus
Otros virus quiméricos adicionales de la invención contienen mutaciones que evitan la división de prM, tales como las mutaciones en el sitio de división de prM. Por ejemplo, el sitio de división de prM en los clones infecciosos de flavivirus de interés, tales como el dengue, TBE, SLE y otros, puede mutarse mediante la mutagénesis sitio-dirigida. Cualquiera o todos los aminoácidos en el sitio de división, como se ha expuesto anteriormente, pueden suprimirse o sustituirse. Un fragmento de ácido nucleico que contiene los genes mutados de prM-E puede entonces insertarse en un vector del virus de la fiebre amarilla utilizando los procedimientos que se han descrito anteriormente. La deleción de prM puede utilizarse con o sin otras mutaciones atenuantes, por ejemplo, mutaciones en la proteína E, para ser insertadas en el virus de la fiebre amarilla. Estos mutantes tienen ventajas respecto a los mutantes de sustitución única como candidatos vacunales, porque es casi imposible invertir la secuencia suprimida y restaurar la
virulencia.
Los siguientes flavivirus quiméricos de la invención fueron depositados en el American Type Culture Collection (ATTC) en Rockville, Maryland, U.S.A, bajo los términos del tratado de Budapest, garantizándose una fecha de depósito del 6 de enero de 1998: Virus quimérico de la fiebre amarilla 17D/tipo 2 del dengue (YF/DEN-2; número de registro en ATCC VR-2593), y virus quimérico de la fiebre amarilla 17D/Encefalitis japonesa SA_{14} 14- 2 (YF/JE A1.3; número de registro ATCC Vr-2594).
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 1
Caracterización de las quimeras YF/JE
Clon Rendimiento (\mug) Infectividad de placas/ PBS log título ARNasa log ADNasa log
100ng LLC-MK_{2} VERO título VERO título VERO
YF5.21v 5,5 15 7,2 0 7
YF/JE-S 7,6 50 6,2 0 6,2
YF/JE-N 7 60 5 0 5,4
TABLA 2
Comparación de la secuencia de las cepas JE y las quimeras YF/JR
Virus E 107 E 138 E 176 E 177 E 227 E 243 E 244 E 279
JE SA14-14-2 F K V T S K G M
YF/JE SA14-14-2 F K V A S E G M
YF/JE NAK L E I T P E E K
JE NAK L E I T P E E K
JE SA14 L E I T S E G K 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 3
Títulos de neutralización de reducción de la calva en las quimeras YF/JE
Virus líquido ascítico no líquido ascítico líquido ascítico JE IgG no inmune IgG de YF
inmune YF
YFS.2iv <1,3 3,7 <1,3 <2,2 >4,3
JE SA14-14-2 <1,3 <1,3 3,4 <2,2 <2,2
YF/JE SA 14-14-2 <1,3 <1,3 3,1 <2,2 <1,9
YF/JE Nakayama <1,3 <1,3 3,4 <2,2 <2,2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 4
Neurovirulencia de las quimeras YF/JE SA14-14-2 en ratones ICR machos de 3 semanas de edad
log dosis (I.C.) % mortalidad
YF5.2iv 4 100 (7/7)
YF/JE SA 14-14-2 4 0 (0/7)
YF/JE SA 14-14-2 5 0 (0/7)
YF/JE SA 14-14-2 6 0 (9/8) 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 5
Neurovirulencia de las quimeras YE/JE en machos de 3 semanas de edad
log dosis (intraperitoneal) % mortalidad
YF/JE Nakayama 4 0 (0/5)
YF/JE Nakayama 5 0 (0/4)
YF/JE Nakayama 6 0 (0/4)
YF/JE SA 14-14-2 4 0 (0/5)
YF/JE SA 14-14-2 5 0 (0/4)
YF/TE SA 14-14-2 6 0 (0/4)
TABLA 6 Construcción de quimeras YF/flavivirus
1 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  \begin{minipage}[t]{140mm}1, 2: La columna ilustra el
oligonucleótido utilizado para generar los iniciadores quiméricos
YF/Flavivirus que corresponden a la unión C/prM o E/NS1 (véase el
texto). X= secuencia codificante carboxiterminal de la cápside YF.
La región subrayada corresponde a la secuencia heteróloga diana
situada inmediatamente corriente arriba del sitio  Nar I 
(antisentido-ccgcgg). Este sitio permite la
inserción de los productos PCR en el plásmido Yfm5.2 ( Nar I)
que se requiere para generar las matrices del ADNc completo. Otros
nucleótidos son específicos para los virus heterólogos. Los
iniciadores oligonucleótidos se listan de 5' a
3'.\end{minipage} \cr   \begin{minipage}[t]{140mm}3, 4: Se
listan los únicos sitios de restricción utilizados para crear
fragmentos de restricción que pueden ser aislados y unidos  in
vitro  para producir las matrices del ADNc quimérico completo.
Debido a que algunas secuencias no contienen sitios convenientes, es
necesaria la construcción de sitios apropiados en algunos casos
(nota al pie 5).\end{minipage} \cr 
 \begin{minipage}[t]{140mm}5: Entre paréntesis se encuentran los
sitios enzimáticos de restricción que deben crearse, bien en la
estructura YF o el virus heterólogo que permitan una unión eficiente
 in vitro . Los sitios que no están entre paréntesis deben
eliminarse. La totalidad de dichas modificaciones se lleva a cabo
mediante mutagénesis silenciosa del ADNc para el clon respectivo.
Los espacios en blanco indican que no es necesaria ninguna
modificación de los clones del
ADNc.\end{minipage} \cr}
Otras formas de realización
Otras formas de realización se encuentran en las reivindicaciones siguientes. Por ejemplo, los genes de la proteína prM-E de otros flavivirus de importancia médica pueden insertarse en la estructura del virus de la vacuna de la fiebre amarilla para producir vacunas contra otros flavivirus médicamente importantes (véase, por ejemplo, Monath et al., "Flaviviruses", en Virology, Fields, editor, Raven-Lippincott, New York, 1995, volumen 1, 961-1034).
Ejemplos de otros flavivirus, a partir de los cuales pueden obtenerse genes para insertarse en los vectores quiméricos de la invención, incluyen, por ejemplo, los virus de Kunjin, de la Encefalitis europea central, de la Encefalitis rusa de primavera-verano, de Powassan, de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y de la Fiebre hemorrágica de Omsk. Además, genes de virus relacionados incluso de modo más distante, pueden insertarse en el virus de la vacuna de la fiebre amarilla para construir nuevas vacunas.
Producción y utilización de las vacunas
Las vacunas de la invención se administran en cantidades y utilizando procedimientos, que pueden determinarse fácilmente por los expertos en la materia. Las vacunas pueden administrarse y formularse, por ejemplo, de la misma forma que la vacuna 17D de la fiebre amarilla, por ejemplo, como una suspensión transparente de tejido infectado de embrión de pollo, o como un líquido recuperado a partir de cultivos celulares infectados con el virus quimérico de la fiebre amarilla. De este modo, el virus quimérico vivo y atenuado puede formularse como una solución acuosa estéril que contiene entre 100 y 1.000.000 de unidades infecciosas (por ejemplo, unidades formadoras de calvas o dosis infecciosas de cultivo tisular) en un volumen de dosis de 0,1 a 1,0 ml, para ser administradas, por ejemplo, por vía intramuscular, subcutánea, o intradérmica. Además, debido a que los flavivirus pueden infectar al huésped humano a través de las vías mucosas, tales como la vía oral (Gresikova et al., "Tick-borne Encephalitis", o en The Arboviruses, Ecology and Epidemiology, Monath (ed, ) CRC Press, Boca Raton, Florida, 1988, Volumen IV, 177-203), el virus vacunal puede administrarse por una vía mucosa para alcanzar una respuesta inmune protectora. La vacuna puede administrarse como un agente profiláctico primario en adultos o niños con riesgo de infección por flavivirus. Las vacunas pueden también utilizarse como agentes secundarios para tratar pacientes infectados con flavivirus, estimulando una respuesta inmunitaria contra el flavivirus.
Puede ser deseable utilizar el sistema vectorial de la vacuna de la fiebre amarilla para inmunizar un huésped contra un virus (por ejemplo, el virus de la Encefalitis japonesa) y volver a inmunizar posteriormente al mismo individuo contra un segundo o tercer virus, utilizando un constructo quimérico diferente. Una ventaja significativa del sistema quimérico de la fiebre amarilla es que el vector no provocará una inmunidad intensa para él mismo. Ni una inmunidad previa al virus de la fiebre amarilla excluye la utilización de la vacuna quimérica como un vector para la expresión génica heteróloga. Estas ventajas se deben a la eliminación de la parte del gen E de la vacuna de la fiebre amarilla que codifica antígenos neutralizantes (protectores) para la fiebre amarilla, y el reemplazo con otro gen heterólogo que no proporciona protección cruzada contra la fiebre amarilla. Aunque las proteínas no estructurales del virus YF17D pueden jugar un papel en la protección, provocando, por ejemplo, anticuerpos contra NS1, que está implicado en la lisis de las células infectadas mediada por el anticuerpo dependiente del complemento (Schlesinger et al, J. Immunology 135:2805-2809, 1985), o induciendo respuestas citotóxicas de las células T para NS3 u otras proteínas del virus, es improbable que estas respuestas abroguen la capacidad de una vacuna de virus vivos para estimular a los anticuerpos neutralizantes. Esto se apoya en el hecho de que (1) individuos que se habían infectado previamente con el virus JE responden a la vacunación con YF17D de modo similar a las personas sin previa infección por JE, y (2) individuos que habían recibido previamente la vacuna YF17D responden a la revacunación con un aumento en los títulos de anticuerpos neutralizantes (Sweet et al., Am. J. Trop. Med. Hyg. 11:562-569, 1962). Así, el vector quimérico puede utilizarse en poblaciones que son inmunes a la fiebre amarilla a causa de una infección natural previa o de una vacunación, pudiéndose utilizar repetidamente, o para inmunizar simultáneamente o secuencialmente con varios constructos distintos, que incluyen quimeras de la fiebre amarilla con insertos de, por ejemplo, la Encefalitis japonesa, la Encefalitis de San Luis o los virus del Oeste del Nilo.
Para las aplicaciones de la vacuna, pueden utilizarse los adyuvantes que son conocidos por lo expertos en la materia. Los adyuvantes que pueden utilizarse para potenciar la inmunogenicidad de las vacunas quiméricas incluyen, por ejemplo, formulaciones liposómicas, adyuvantes sintéticos tales como saponinas (por ejemplo QS21), el muramil dipéptido, el lípido A monofosforilo, o la polifosfazina. Aunque estos adyuvantes se utilizan típicamente para potenciar las respuestas inmunes a las vacunas inactivadas, pueden sólo utilizarse con vacunas vivas. En el caso de una vacuna quimérica suministrada a través de una vía mucosa, por ejemplo, oralmente, los adyuvantes mucosos tales como la toxina termolábil de E. coli (LT) o las derivaciones mutantes de LT, constituyen adyuvantes útiles. Además, los genes que codifican citoquinas que tienen actividades adyuvantes, pueden insertarse en los vectores de la fiebre amarilla. De este modo, los genes que codifican citoquinas, tales como GM-CSF, IL-2, IL-12, IL-13 o IL-5, pueden insertarse junto con genes heterólogos de flavivirus para producir una vacuna que dé lugar a respuestas inmunitarias potenciadas, o para modular la inmunidad dirigida más específicamente hacia respuestas celulares, humorales o mucosas. Además de las aplicaciones vacunales, como el experto en la materia puede comprender fácilmente, los vectores de la invención pueden utilizarse en procedimientos de terapia génica para introducir productos génicos terapéuticos en las células del paciente. En estos procedimientos, los genes que codifican productos génicos terapéuticos se insertan en los vectores, por ejemplo, en lugar del gen que codifica la proteína prM-E.
Otra ventaja del sistema vectorial de la fiebre amarilla es que los flavivirus experimentan la replicación en el citoplasma de las células, de forma que la estrategia de replicación vírica no implica la integración del genoma vírico en la célula huésped (Chambers et al, (1990) "Flavivirus Genome Organization, Expression and replication", en Annual Review of Microbiology 44: 649-688), proporcionando una importante medida de seguridad.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: OraVax, Inc., et al.
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacunas quiméricas de flavivirus
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 16
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE LA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DIRECCIÓN: Clark & Elbing LLP
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
DIRECCIÓN: 176 Federal Street
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: Boston
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
ESTADO: MA
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CP: 02110
\vskip0.800000\baselineskip
(v)
MEDIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR PC: compatible IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: FastSEQ para Windows Versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
INFORMACIÓN DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 02 MARZO 98
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
(vii)
INFORMACIÓN DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: 08/807.445
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN: 28 FEBRERO 1997
\vskip0.800000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN DE SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD: desconocido
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FECHA PRESENTACIÓN: 15 ENERO 98
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
DATOS DE ABOGADO/AGENTE DE INFORMACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Clark, Paul T
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO: 30.162
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
REFERENCIA/NÚMERO DE DOCUMENTO: 06132/033W02
\vskip0.800000\baselineskip
(x)
INFORMACIÓN DE CONTACTO:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: 617-428-0200
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
FAX: 617-428-7045
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TELEX:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CACTGGGAGA GCTTGAAGGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAGCCAGTT GCAGCCGCGG TTTAA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGTAGACT GGTGGGCTCC C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA SEC. ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GATCCTCAGT ACCAACCGCG GTTTAA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID.. nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGTAGATT GGTGTGCATT G 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACCCTCAGT ACCACCCGCG GTTTAA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAGGTGAATT GAAGTGCTCT A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC. ID. nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCCCAGCA CCACCCGCGG TTTAA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC. ID. nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AAAAGGAACA GTTGTTCTCT A 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCCGAAGTG TCAACCGCGG TTTAA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AACGTGAATA GTTGGATAGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACCGTTGGTC GCACCCGCGG TTTAA 
\hfill
25 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AATTTCGAAA GGTGGAAGGT C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GACCGGTGTT TACAGCCGCG GTTTAA 
\hfill
26 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TACTGCGAAC GACGTTGCCA C 
\hfill
21 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID. nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
TIPO DE FILAMENTO: sencillo
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO MOLECULAR: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID. nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
ACTGGGAACC TCACCCGCGG TTTAA 
\hfill
25

Claims (21)

1. Virus quimérico vivo, infeccioso, atenuado, que comprende:
un virus de la fiebre amarilla en el que la secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E es suprimida, truncada, o mutada de forma que la proteína prM-E funcional del virus de la fiebre amarilla no se expresa, y es integrada en el genoma de dicho virus de la fiebre amarilla, una secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E de un segundo flavivirus distinto, de forma que dicha proteína prM-E de dicho segundo flavivirus se expresa, en el que la secuencia señal en la unión C/prM de dicho virus de la fiebre amarilla, se conserva.
2. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que dicho segundo flavivirus es un virus de la Encefalitis japonesa (JE).
3. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que dicho segundo flavivirus es un virus Dengue, seleccionado de entre el grupo formado por los tipos de Dengue 1 a 4.
4. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que dicho segundo flavivirus es seleccionado de entre el grupo formado por un virus de la Encefalitis Murray Valley, un virus de la Encefalitis de San Luis, un virus del Oeste del Nilo, un virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas, un virus de la hepatitis C, un virus de Kunjin, un virus de la Encefalitis europea central, un virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano, un virus de Powassan, un virus de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y un virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk.
5. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, reemplaza a la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho virus de la fiebre amarilla.
6. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que dicha secuencia nucleótida que codifica dicha proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, comprende una mutación que evita la división de prM para producir la proteína M.
7. Virus quimérico según la reivindicación 1, en el que las secuencias señal en las uniones C/prM y E/NS 1 de dicho virus de la fiebre amarilla se conservan en la construcción de dicho flavivirus quimérico.
8. Utilización de un virus quimérico vivo, infeccioso, atenuado, en la preparación de un medicamento para evitar o tratar la infección por flavivirus en un paciente, en el que el virus quimérico, vivo, infeccioso, atenuado, comprende
un virus de la fiebre amarilla en el que la secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E es suprimida, truncada, o mutada de forma que la proteína prM-E funcional del virus de la fiebre amarilla no se expresa, y es integrada en el genoma de dicho virus de la fiebre amarilla, una secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E de un segundo flavivirus distinto, de forma que dicha proteína prM-E de un segundo flavivirus se expresa, en el que la secuencia señal en la unión C/prM de dicho virus de la fiebre amarilla se conserva.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho segundo flavivirus es un virus de la Encefalitis japonesa (JE).
10. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho segundo flavivirus es un virus del Dengue, seleccionado de entre el grupo formado por los tipos de Dengue 1 a 4.
11. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicho segundo flavivirus es seleccionado de entre el grupo formado por un virus de la Encefalitis Murray Valley, un virus de la Encefalitis de San Luis, un virus del Oeste del Nilo, un virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas, un virus de la hepatitis C, un virus de Kunjin, un virus de la Encefalitis europea central, un virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano, un virus de Powassan, un virus de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y un virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk.
12. Utilización según la reivindicación 8, en la que la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, reemplaza a la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho virus de la fiebre amarilla.
13. Utilización según la reivindicación 8, en la que dicha secuencia nucleótida que codifica dicha proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, comprende una mutación que evita la división de prM para producir la proteína M.
14. Utilización según la reivindicación 8, en la que las secuencias señal en las uniones C/prM y E/NS 1 de dicho virus de la fiebre amarilla se conservan en la construcción de dicho flavivirus quimérico.
15. Molécula ácido nucleica que codifica un virus quimérico vivo, infeccioso, atenuado, que comprende:
un virus de la fiebre amarilla en el que la secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E es suprimida, truncada, o mutada de forma que la proteína prM-E funcional del virus de la fiebre amarilla no se expresa, y es integrada en el genoma de dicho virus de la fiebre amarilla, una secuencia nucleótida que codifica una proteína prM-E de un segundo flavivirus distinto, de forma que dicha proteína prM-E de dicho segundo flavivirus se expresa, en el que la secuencia señal en la unión C/prM de dicho virus de la fiebre amarilla se conserva.
16. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que dicho segundo flavivirus es un virus de la Encefalitis japonesa (JE).
17. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que dicho segundo flavivirus es un virus del Dengue, seleccionado de entre el grupo formado por los tipos de Dengue 1 a 4.
18. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que dicho segundo flavivirus es seleccionado de entre el grupo formado por un virus de la Encefalitis Murray Valley, un virus de la Encefalitis de San Luis, un virus del Oeste del Nilo, un virus de la Encefalitis transmitida por garrapatas, un virus de la hepatitis C, un virus de Kunjin, un virus de la Encefalitis europea central, un virus de la Encefalitis rusa de primavera-verano, un virus de Powassan, un virus de la Enfermedad de Kyasanur Forest, y un virus de la Fiebre hemorrágica de Omsk.
19. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, reemplaza a la secuencia nucleótida que codifica la proteína prM-E de dicho virus de la fiebre amarilla.
20. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que dicha secuencia nucleótida que codifica dicha proteína prM-E de dicho segundo y distinto flavivirus, comprende una mutación que evita la división de prM para producir la proteína M.
21. Molécula ácido nucleica según la reivindicación 15, en la que las secuencias señal en las uniones C/prM y E/NS 1 de dicho virus de la fiebre amarilla se conservan en la construcción de dicho flavivirus quimérico.
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