ES2330309T3 - Adnc infeccioso de una cepa de vacuna aprobada de virus del sarampion. uso para composiciones inmunogenicas. - Google Patents

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Abstract

Molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo de un virus del sarampión (MV) originario de la cepa Schwarz o la cepa Moraten, comprendiendo dicha molécula de ADNc la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15976 de las secuencias representadas en la figura 5.

Description

ADNc infeccioso de una cepa de vacuna aprobada de virus del sarampión. Uso para composiciones inmunogénicas.
El virus del sarampión es un miembro de la orden de mononegavirus, concretamente, virus con un genoma de ARN de cadena negativa no segmentado. El genoma no segmentado del virus del sarampión (MV) tiene una polaridad antimensaje que da como resultado un ARN genómico que no se traduce in vivo ni in vitro ni es infeccioso cuando se purifica.
La transcripción y replicación de virus de ARN de cadena (-) no segmentados y su ensamblaje como partículas víricas se han estudiado y reseñado especialmente en "Fields virology" (3a edición, vol. 1, 1996, Lippincott-Raven publishers- Fields BN y col.). La transcripción y replicación del virus del sarampión no implica al núcleo de las células infectadas, sino que tiene lugar en el citoplasma de dichas células infectadas. El genoma del virus del sarampión comprende genes que codifican seis proteínas estructurales principales de los seis genes (designados N, P, M, F, H y L) y dos proteínas no estructurales adicionales del gen P. El orden génico es el siguiente: 3', N, P (incluyendo C y V), M, F, H, y proteína polimerasa grande L en el extremo 5'. El genoma comprende además regiones no codificantes en la región intergénica M/F; esta región no codificante contiene aproximadamente 1.000 nucleótidos de ARN no traducido. Los genes citados codifican respectivamente el péptido líder (gen I), las proteínas de la nucleocápsida del virus, concretamente la nucleoproteína (N), la fosfoproteína (P) y la proteína grande (L) que se ensamblan alrededor del ARN genómico proporcionando la nucleocápsida. Los demás genes codifican las proteínas de cubierta vírica, incluyendo hemaglutinina (H), proteínas de fusión (F) y de matriz (M).
Se ha aislado el virus del sarampión y se han derivado vacunas vivas atenuadas del MV Edmonston aislado en 1954 (Enders, J. F. y T. C. Peebles. 1954. "Propagation in tissue cultures of cytopathogenic agents from patients with measles". Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86: 277-286.) mediante pases en serie efectuados en células de riñón humanas primarias o amnióticas. Las cepas usadas se adaptaron entonces a fibroblastos de embrión de pollo (CEF) para producir semillas de Edmonston A y B (Griffin, D. y W. Bellini. 1996. "Measles virus", pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), "Virology", vol. 2. Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia). La Edmonston B se autorizó en 1963 como la primera vacuna del MV. Pases adicionales de Edmonston A y B en CEF produjeron los virus más atenuados Schwarz y Moraten (Griffin, D. y W. Bellini. 1996. "Measles virus", pág. 1267-1312. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), "Virology", vol. 2. Lippincott-Raven Publishers, Filadelfia) cuyas secuencias se ha mostrado recientemente que son idénticas (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 910-920). Debido a que la vacuna de Edmonston B era reactogénica, se abandonó en 1975 y se reemplazó por la vacuna de Schwarz/Moraten, que es actualmente la vacuna del sarampión más ampliamente usada en el mundo (Hilleman, M. 2002. "Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications". Vaccine. 20: 651-665). Se usan también varias otras cepas de vacuna: AIK-C, Schwarz F88, CAM70, TD97 en Japón, Leningrad-16 en Rusia y Edmonston Zagreb. Las cepas chinas CAM70 y TD97 no derivaban de Edmonston. Las vacunas Schwarz/Moraten y AIK-C se producen en CEF. La vacuna Zagreb se produce en células diploides humanas (WI-38).
La vacuna atenuada viva derivada de la cepa Schwarz se comercializa por Aventis Pasteur (Lyon, Francia) con el nombre comercial Rouvax®.
En un trabajo notable y pionero, Martin Billeter y colaboradores clonaron un ADNc infeccioso correspondiente al antigenoma del MV Edmonston y establecieron un procedimiento genético inverso original y eficaz para recuperar el correspondiente virus (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dbtsch, G. Christiansen y M. Billeter., 1995. "Rescue of measles viruses from cloned DNA". EMBO Journal. 14: 5773-5784 y WO 97/06270 incorporados a la presente como referencia).
Sin embargo, la comparación de secuencia (véase a continuación) reveló que el genoma clonado en este vector divergía de la secuencia de Edmonston B. Estaba más cercana a Edmonston-wt, un pase temprano en células Vero de aislamientos de Edmonston (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 910-920) y tenía 10 sustituciones aminoacídicas no relacionadas con ningún subgrupo de Edmonston. Por lo tanto, este vector desarrollado a partir de una cepa de vacuna abandonada hace 25 años y cuya secuencia divergía tanto no parece adecuado como vector de vacunación, aunque ciertamente ayuda a comprender algunos aspectos de la replicación del MV.
Por estas razones, los inventores han decidido que necesita desarrollarse un vector del sarampión dirigido a niños a partir de una cepa de vacuna aprobada, y en consecuencia han clonado un ADNc infeccioso partiendo de partículas víricas de la cepa de virus del sarampión Schwarz/Moraten ampliamente usada. Este ADNc puede permitir la producción de provisiones de vacuna de Schwarz/Moraten sin tener que contar con la disponibilidad de provisiones de semilla. Puede usarse también como vector de vacunación recombinante basado en una cepa de vacuna aprobada y eficaz crecida en CEF por razones de seguridad y usada en todo el mundo.
Descripción de la invención
La invención se refiere a una molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico completo de un virus del sarampión (MV) originario de la cepa Schwarz o Moraten, comprendiendo dicha molécula de ADNc la secuencia nucleotídica que se extiende desde el nucleótido 83 al nucleótido 15976 de la secuencia representada en la figura 5.
La expresión "codifica" en la definición anterior comprende la capacidad del ADNc de permitir la transcripción de un ARN (+) antigenómico completo, sirviendo dicho ADNc especialmente como molde para la transcripción. En consecuencia, cuando el ADNc es una molécula bicatenaria, una de las cadenas tiene la misma secuencia nucleotídica que la cadena (+) de ARN antigenómico del virus del sarampión, excepto porque los nucleótidos "U" están sustituidos por "T" en el ADNc.
La Figura 5 ilustra la secuencia de una molécula de ADN de la invención que comprende una secuencia de ADNc como se define anteriormente, especificándose que la cadena del ADNc que se representa es idéntica a la de la cadena (+) del ARN antigenómico de una cepa de MV excepto por la sustitución de "U" por "T".
La molécula de ADNc según la definición anterior permite la producción, cuando se dispone en condiciones apropiadas, de un ARN (+) antigenómico infeccioso capaz de producir partículas infecciosas del virus del sarampión.
El ADNc obtenido tiene especialmente los extremos 5' y 3' originales de la cadena (+) antigenómica nativa del ARN vírico. Además, el ADNc obtenido cumple la regla de 6 que es necesaria para expresar partículas víricas infecciosas.
La "regla de 6" que se expresa en el hecho de que el número total de nucleótidos presentes en el ADNc asciende a un múltiplo de 6, regla que permite una replicación suficiente de ARN genómico del virus del sarampión. Se ha descrito en la referencia citada anteriormente "Fields Virology" en la página 1197.
La molécula de ADNc de la invención que deriva de una cepa de vacuna de MV aprobada se obtiene a partir de la cepa Schwarz o Moraten.
Estas cepas se han dado a conocer en varias publicaciones y se usan para la preparación de las vacunas usadas actualmente. Los inventores proponen especialmente el uso de la cepa de Schwartz que está disponible en Aventis Pasteur (Francia).
Según otra realización particular de la invención, la molécula de ADNc se dispone bajo el control de una secuencia de control de la expresión heteróloga.
La inserción de dicho control para la expresión del ADNc es favorable cuando se busca la expresión de este ADNc en tipos celulares que no posibilitan una transcripción completa del ADNc con sus secuencias de control nativas.
Según una realización particular de la invención, la secuencia de control de la expresión heteróloga comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7. Estas secuencias están localizadas respectivamente 5' y 3' de la secuencia codificante de la cadena (+) de ARN antigenómico completo del MV y en las secuencias adyacentes alrededor de esta secuencia codificante.
En una realización preferida, la molécula de ADNc de la invención comprende además, en su extremo 5' adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena (+) de ARN antigenómico completo de la cepa de vacuna del MV aprobada, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3' adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena (+) de ARN antigenómico completo, la secuencia de una ribozima. La ribozima del virus de la hepatitis delta (\delta) es apropiada para llevar a cabo la invención.
El motivo GGG, dispuesto en el extremo 5' adyacente al primer nucleótido de la secuencia codificante anterior, mejora la eficacia de la transcripción de dicha secuencia codificante de ADNc. Como requisito para un ensamblaje apropiado de partículas del virus del sarampión, está el hecho de que el ADNc que codifica el ARN (+) antigenómico cumple la regla de 6, cuando se añade el motivo GGG, se añade también una ribozima en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, 3' del motivo GGG, para posibilitar la escisión del transcrito en el primer nucleótido codificante de la cadena (+) de ARN antigenómico completo del MV.
Por tanto, en caso de que el motivo GGG se añada para mejorar la eficacia de la transcripción, se añaden dos ribozimas para asegurar la escisión de la secuencia codificante de la cadena (+) de ARN antigenómico completo del MV.
Según la presente invención, la expresión "ADNc" comprende una molécula de ADN obtenida mediante transcripción inversa de una molécula de ARN, incluyendo pero sin limitación una molécula de ARNm.
\newpage
Puede usarse cualquier otra técnica para la preparación de ADN, partiendo del material dado a conocer en la presente invención o usando los rasgos dados a conocer respecto al ADNc de la invención, incluyendo técnicas que implican síntesis o PCR.
Por lo tanto, la expresión "ADNc" usada para la descripción de la secuencia nucleotídica de la molécula de la invención se refiere simplemente al hecho de que originalmente dicha molécula se obtiene mediante transcripción inversa de la cadena (-) de ARN genómico completo del genoma de partículas víricas del virus del sarampión. Esto no debe considerase una limitación para los procedimientos usados para su preparación. Los ácidos nucleicos purificados, incluyendo ADN, están por tanto comprendidos en el significado de ADNc según la invención, a condición de que dicho ácido nucleico, especialmente ADN, satisfaga las definiciones anteriormente dadas.
La invención se refiere también a una molécula de ADNc según una de las definiciones anteriores que está comprendida en un plásmido capaz de replicación.
Pueden prepararse muchos plásmidos para satisfacer los requisitos de la invención y la invención se refiere especialmente al plásmido pTM-MVSchw que se representa en la figura 2.
El plásmido pTM-MVSchw se ha depositado en la CNCM (París, Francia) el 12 de junio de 2002 con el número 1-2889. Este plásmido se describe en los ejemplos y figuras siguientes. Es un vector de plásmido derivado de Bluescript que comprende la secuencia completa que codifica el virus del sarampión, cepa Schwarz, dispuesta bajo el control del promotor de ARN polimerasa T7, su tamaño es de 18967 nucleótidos.
La invención se refiere especialmente también a una molécula de ADNc que es capaz de producir partículas víricas infecciosas de la cepa de vacuna aprobada del MV, usando preferiblemente el sistema de recuperación reseñado anteriormente que implica células auxiliares 293-3-46 (Radecke y col. y documento WO 97/06270), expresando las células auxiliares 293-3-46 las proteínas necesarias para la transcripción, replicación de la secuencia del genoma de ARN del MV de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas.
Las células 293-3-46 se citan como ejemplo para la preparación de partículas víricas. Sin embargo, pueden reemplazarse por cualquier otra línea celular apropiada adecuada para constituir células auxiliares.
Se dan procedimientos para la producción de dichas partículas infecciosas en los ejemplos de la presente solicitud.
Son moléculas de ADNc particularmente preferidas según la invención moléculas que tienen una secuencia nucleotídica seleccionada entre las siguientes secuencias:
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende de nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 26 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5,
-
la molécula de ADNc que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 9 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5.
La invención se refiere por supuesto a cada una de las secuencias particulares descritas anteriormente en la presente memoria.
Una molécula de ADNc particular que se prefiere para llevar a cabo la invención es la molécula que comprende el inserto contenido en el plásmido pTMMVschw depositado en la CNCM con el número 1-2889, en el que dicho inserto codifica una secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico completo del virus del sarampión. Es un inserto particular el comprendido en la secuencia definida por los siguientes sitios de restricción: NotI (localizado en la posición 1 de la figura 5) y NotI (localizado en la posición 16203 en la figura 5).
En una realización particular de la invención, la molécula de ADNc es el producto de la transcripción inversa del ARN vírico purificado a partir de partículas víricas del virus del sarampión.
La preparación del ADNc a partir de ARN purificado vírico limita ventajosamente la presencia de componentes celulares, y especialmente ADN o ARN celular, que podrían estar presentes en células usadas para el cultivo de virus. Limita especialmente la presencia de ARN genómico vírico que estaría incompleto o mutado y que está presente en células, y limita la presencia de ARNm vírico presente en grandes cantidades en las células.
La invención se refiere también a una molécula de ADNc recombinante como se define anteriormente, que comprende además una secuencia de ADN heteróloga clonada en la misma en condiciones que posibiliten su expresión como secuencia aminoacídica heteróloga, efectuándose dicha clonación de tal modo que el ADNc recombinante obtenido cumpla la regla de 6.
Las secuencias codificantes heterólogas, especialmente secuencias de ADN, se seleccionan ventajosamente entre secuencias capaces de expresar antígenos o epítopos de antígenos, tienen propiedades inmunogénicas y especialmente tienen la capacidad de desencadenar o favorecer una respuesta inmunogénica en un hospedador al que se administran. Dichas secuencias de ADN heterólogas pueden derivar, por ejemplo, de antígenos de patógenos.
La invención posibilita ventajosamente la inserción de dichas secuencias de ADN heterólogas en una secuencia que se designa como unidad de transcripción adicional (ATU), especialmente una ATU como se da a conocer por Billeter y col. en el documento WO 97/06270.
Esta ATU se representa especialmente en la Figura 4.
Cuando se usa para la ejecución de la invención, la ATU está localizada ventajosamente en la secuencia N-terminal de la molécula de ADNc que codifica la cadena (+) de ARN completa del antigenoma del MV y está localizada especialmente entre los genes P y M de este virus o entre los genes H y L. Se ha observado que la transcripción del ARN vírico de MV sigue un gradiente de extremo 5' a 3'. Esto explica porqué cuando se inserta en el extremo 5' de la secuencia codificante del ADNc, la ATU posibilitará una expresión más eficaz de la secuencia de ADN heteróloga que contiene.
La invención se refiere también a un vector que comprende un vector que comprende una molécula de ADNc como se define anteriormente, incluyendo un ADNc recombinante. Es un vector particular un vector para la clonación y/o expresión de este ADNc.
Según una realización preferida de la invención, el vector es un plásmido y es especialmente pTM-MVSchw, depositado en la CNCM el 12 de junio de 2002 con el número 1-2889.
Otro vector, designado pTM-MVSchw2-gfp, está depositado en la CNCM con el número 1-2890 el 12 de junio de 2002.
El vector deriva de pTM-MVSchw, y es en consecuencia un vector de plásmido derivado de Bluescript que comprende la secuencia completa que codifica el virus del sarampión, cepa Schwarz, dispuesto bajo el control del promotor de ARN polimerasa T7, y que contiene además el gen gfp que codifica la proteína GFP, estando insertado dicho gen en una ATU en posición 2 (concretamente, entre los genes N y P del MV). Su tamaño es de 19800 nucleótidos.
El tamaño de pTM-MvSchw es de 18967 nucleótidos. El tamaño de pTM-MVSchw2-gfp es de 19800 nucleótidos.
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La invención se refiere también a un proceso para la preparación de partículas víricas de sarampión infecciosas que comprende:
1)
expresar el ADNc de la invención según una de las definiciones anteriores o el vector que contiene dicho ADNc en una línea celular auxiliar que expresa también las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la secuencia de ARN (+) antigenómica del MV a partir de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas y
2)
recuperar las partículas víricas expresadas.
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Según una realización particular de este proceso, comprende:
1)
transfectar células auxiliares con un ADNc según la definición anterior con un vector definido anteriormente, siendo capaces dichas células auxiliares de expresar funcionales auxiliares para expresar una ARN polimerasa y de expresar las proteínas N, P y L del virus MV;
2)
cocultivar dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1) con células sometidas a pases adecuadas para el pase de la cepa de vacuna de MV de la que se origina el ADNc;
3)
recuperar las partículas víricas de MV producidas.
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Según una realización preferida, las células auxiliares derivan de la línea celular de riñón embriónico humano 293, estando depositada dicha línea celular en la ATCC con el número CRL-1573.
Según otro aspecto de este proceso, las células adecuadas para pase son células CEF.
Las células CEF pueden prepararse a partir de huevos de gallina fertilizados obtenidos de EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, Francia, o de cualquier otro productor de huevos de gallina fertilizados.
El proceso que se da a conocer según la invención se usa ventajosamente para la producción de virus del sarampión infeccioso apropiado para uso como composiciones de vacuna.
La solicitud da a conocer por tanto una composición inmunogénica cuyo principio activo comprende partículas del virus del sarampión infecciosas mediante el proceso dado a conocer anteriormente.
La solicitud da a conocer también una composición de vacuna. Dicha composición de vacuna tiene ventajosamente un principio activo que comprende partículas del virus del sarampión recuperadas del ADNc del vector que se ha definido anteriormente en la presente memoria, que se expresa en un sistema de recuperación basado en células auxiliares.
Ventajosamente, dicha composición de vacuna es adecuada para protección frente al virus del sarampión. Según la invención, cuando el ADNc se recombina con una secuencia de ADN heteróloga que codifica una secuencia aminoacídica inmunogénica, la composición de vacuna puede ser adecuada además para protección frente al patógeno del que deriva la secuencia de ADN inmunogénica.
La solicitud da a conocer también una célula que se recombina con una molécula de ADNc según la invención o con un vector como se define anteriormente. Es una célula preferida una célula procariótica tal como E. coli o Salmonella.
Es otra célula una célula eucariótica, especialmente una célula seleccionada entre levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae.
Una célula dada a conocer en la solicitud puede caracterizarse según una realización particular por el hecho de que ésta comprende secuencias nucleotídicas que expresan funciones auxiliares necesarias para expresar una ARN polimerasa y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV. Dicha célula puede usarse por tanto para la recuperación de partículas víricas.
Los ejemplos y figuras siguientes proporcionan rasgos adicionales para la caracterización de la invención.
Figura 1. Comparación de genomas de MV. (A) Se muestran en la parte inferior los cambios nucleotídicos para cada región codificante (letras mayúsculas en recuadros) y en regiones no codificantes (letras minúsculas). Se muestran los cambios aminoacídicos en la parte superior (símbolo de aminoácido de una letra). El color amarillo de la rejilla muestra las sustituciones wt. El color azul indica las sustituciones correspondientes al tipo de vacuna Rubeovax/Scwharz/Moraten. El color rojo muestra los cambios nucleotídicos y aminoacídicos que están presentes sólo en la secuencia EdB-tag. Los cambios nucleotídicos en las posiciones 1805 y 1806 EdB-tag corresponden al marcador introducido. (B) Árbol filogenético que muestra EdB-tag entre el grupo Edmonston y dos aislamientos wt (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. "Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins". J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. "Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient". Virus Genes. 20: 253-257). Se alinearon las secuencias usando Clustal W (Thompson, J. D., D. G. Higgins y T. J. Gibson. 1994. "CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice". Nucleic Acids Res. 22: 4673-4680). Se determinó la distancia de secuencia nucleotidica con Dnadist del paquete Phylip versión 3.5, Felsenstein, J. 1989. Cladistics. 5: 164-166. El árbol derivaba del análisis del vecino más próximo aplicado a distancias de secuencia por pares calculadas usando una variedad de procedimientos, incluyendo el procedimiento de dos parámetros de Kimura, para generar árboles no enraizados. Se generó el resultado final con Treeview (Page, R. D. 1996. "TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers". Comput. Appl. Biosci. 12: 357-358).
Figura 2. Mapa esquemático del plásmido pTM-MV Schw. Para construir la secuencia completa, se generaron los seis fragmentos representados en la parte superior y se recombinaron paso a paso usando los sitios de restricción únicos indicados. T7 = promotor T7; hh = ribozima de cabeza de martillo; h\deltav = ribozima de hepatitis delta; T7t = terminador de ARN polimerasa T7. Se usaron los siguientes oligonucleótidos para la secuenciación de la cepa Schwarz
de MV.
100
Figura 3. Cinética de crecimiento de virus Schwarz y EdB-tag en células Vero (A, B) y CEF (C, D, E). Se infectaron células en placas de 35 mm con virus Schwarz o EdB-tag a diferentes MOI (como se indica). En cada punto temporal, se recogieron las células y se determinaron los títulos víricos asociados a célula usando el procedimiento TCID_{50} en células Vero.
Figura 4. Representación esquemática de la unidad de transcripción adicional (ATU) y plásmido de vector de MV Schwarz. (A) Elementos de acción en cis de la ATU insertada en posición 2 entre los marcos abiertos de lectura de fosfoproteína (P) y matriz (M) del MV. (B) Representación de las tres posiciones de la inserción ATU en el plásmido de vector de MV Schwarz.
Figura 5. Secuencia nucleotídica completa del plásmido pTM-MVSchw. La secuencia puede describirse como sigue con referencia a la posición de los nucleótidos:
- 1-8
sitio de restricción NotI
- 9-28
promotor T7
- 29-82
ribozima de cabeza de martillo
- 83-15976
antigenoma de MV Schwarz
- 15977-16202
ribozima HDV y terminados T7
- 16203-16210
sitio de restricción NotI
- 16211-16216
sitio de restricción ApaI
- 16220-16226
sitio de restricción KpnI
- 16226-18967
plásmido pBluescript KS(+) (Stratagene)
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Ejemplos Comparación de secuencia entre cepas EdB-tag y de vacuna del sarampión
Se compararon en un buen análisis anteriormente reseñado (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 910-920) las secuencias codificantes y no codificantes de cepas de virus de vacuna derivados de Edmonston con las de un aislamiento de pocos pases del virus del sarampión de tipo silvestre de Edmonston. Los autores identificaron 10 sustituciones aminoacídicas compartidas por casi todas las cepas de vacuna. Se compararon las secuencias genómicas de estas cepas de vacuna derivadas de Edmonston y dos aislamientos primarios (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. "Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins". J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. "Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient". Virus Genes. 20: 253-257) con la del ADNc infeccioso de Edmonston B anteriormente reseñado (EdB-tag) (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen y M. Billeter. 1995. "Rescue of measles viruses from cloned DNA". EMBO Journal. 14: 5773-5784). La Figura 1 muestra que la secuencia nucleotídica de EdB-tag difería de la de Rubeovax (vacuna Edmonston B) por un 0,24% (38 mutaciones) y de la de Schwarz/Moraten por un 0,27% (44 mutaciones). Las secuencias de Schwarz/Moraten y Edmonston B (Rubeovax®) diferían sólo en un 0,1% (16 mutaciones). Entre las 38 diferencias entre EdB-tag y Rubeovax, 17 eran sustituciones aminoacídicas en las regiones codificantes y 7 estaban localizadas en regiones no codificantes. Entre las 44 diferencias entre EdB-tag y Schwarz/Moraten, 22 eran sustituciones aminoacídicas y 9 estaban en regiones no codificantes. Las 10 sustituciones aminoacídicas compartidas por casi todas las cepas de vacuna de Edmonston (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 910-920) se conservaban en ADNc de EdB-tag. Sin embargo, 5 de ellas eran específicas del subgrupo AIK-C y Zagreb, indicando que el virus del que se clonó EdB-tag divergía de Edmonston B y no correspondía a ninguna cepa de vacuna aprobada. Además, 10 sustituciones aminoacídicas en EdB-tag no estaban relacionadas con ningún subgrupo de Edmonston, reflejando probablemente la adaptación al crecimiento en células HeLa y/o errores introducidos durante el procedimiento de clonación. Entre estos cambios específicos, 5 estaban localizados en las secuencias codificantes de PN/C y 3 estaban localizados en el gen de polimerasa L, afectando por tanto posiblemente a la capacidad replicativa del virus in vivo. Estos cambios y otros en secuencias de acción en cis pueden influir en la inmunogenicidad o patogenicidad de los virus recuperados de ADNc de EdB-tag. Es más, la adaptación del MV al crecimiento en células Vero se ha mostrado que está asociada a la pérdida de potencial patogénico (Kobune, F., H. Sakata y A. Sugiura. 1990. "Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus". J. Virol. 64: 700-705) y con unos pocos cambios aminoacídicos localizados en la proteína polimerasa (L) y accesorias (PN/C), dando como resultado la atenuación transcripcional en células linfoides (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa y Y. Nagai. 1998. "Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins". J. Virol. 72: 8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune y M. Tashiro. 2000. "Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient". Virus Genes. 20: 253-257.
Construcción de un ADNc correspondiente al antigenoma de la cepa de vacuna de Schwarz del virus del sarampión
Se purificaron partículas víricas de un lote de vacuna Schwarz del sarampión amablemente proporcionado por Aventis Pasteur (Lyon, Francia). Se obtuvo esta preparación de vacuna en bruto (50 ml, 3 x 10^{4} TCID_{50}/ml) mediante raspado de células CEF infectadas, congelación-descongelación de células y medio y filtración del desecho celular. Se concentraron las partículas mediante centrifugación a través de un colchón de sacarosa al 30%. Se purificó el ARN vírico a partir de partículas lisadas usando una membrana basada en gel de sílice (QIAmp, Qiagen). Se transcribió de forma inversa el ARN vírico en ADNc usando una mezcla de hexámeros aleatorios (pdN6, 1 \muM) y un oligonucleótido específico que representa los 32 primeros nucleótidos del genoma del MV (MVSchwRT1 5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAATC-3', 10 \muM) como cebadores. Para asegurar la fidelidad de la transcripción inversa y el rendimiento de productos completos, se usó la ADN polimerasa II Superscript (GibcoBRL). Se generó un conjunto de 6 fragmentos superpuestos que cubren el ADNc vírico completo (numerados 1 a 6 en la Fig. 2) mediante PCR usando ADN polimerasa PfuTurbo (Stratagene) y un conjunto de cebadores específicos cercanos a sitios de restricción únicos. El fragmento 1 en el extremo 5' del antigenoma vírico estaba modificado por ingeniería genética con cebadores específicos para contener un promotor de ARN polimerasa T7 con el motivo GGG necesario para una eficacia completa y una secuencia de ribozima de cabeza de martillo insertada entre el promotor T7 y el primer nucleótido vírico. Para generar este fragmento, se asociaron conjuntamente dos oligonucleótidos superpuestos: líder 1 (5'-TATGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGCCAACTTTGTTTGGTCTGA-3') que contiene un sitio NotI, el promotor T7 (subrayado) y los 19 primeros nucleótidos de la secuencia de ribozima de cabeza de martillo, y líder 2 (5'-GGTGACCCGGGACTCCGGGTTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCAAACA-3') que contiene la secuencia de cabeza de martillo con un sitio SmaI/XmaI. Después de amplificación por PCR, se ligó el fragmento resultante mediante extensión por PCR con un segundo fragmento también generado por PCR a partir de ADNc de Schwarz usando los oligonucleótidos MVSchw1 (5'-GAGTCCCGGGTCACCAAACAAAGTTGGGTAAG-3') que se superpone con la secuencia de cabeza de martillo (subrayada) y que cubre el genoma de MV Schwarz 1-15, y MVSchw160 (5'-GGTTTGTCCTTGTTTCTTTT-3', genoma de MV Schwarz 141-160). Se amplificó el fragmento 2 (2173 nucleótidos de longitud, véase la fig. 2) usando los oligonucleótidos MVSchwRT1 (5'-ACCAAACAAAGTTGGG
TAAGGATAGTTCAATC-3', genoma de MV Schwarz 1-32) y MVSchw2173 (5'-ATTCCCTTAACCGCTTCACC-3', genoma de MV Schwarz 2155-2174). Se amplificó el fragmento 3 (3142 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw1901 (5'-CTATGGCAGCATGGTCAGAAATA-3', genoma de MV Schwarz 1901-1924) y MVSch5043 (5'-ATTGTCGATGGTTGGGTGCT-3', genoma de MV Schwarz 5024-5043). Se amplificó el fragmento 4 (4349 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw4869 (5'-AAACTTAGGGCCAAG
GAACATAC-3', genoma de MV Schwarz 4869-4891) y MVSchw9218 (5'-GGACCCTACGTTTTTCTTAATTCTG-3', genoma de MV Schwarz 9194-9218). Se amplificó el fragmento 5 (6200 nucleótidos de longitud) usando los oligonucleótidos MVSchw9119 (5'-AGATAGGGCTGCTAGTGAACCAAT-3', genoma de MV Schwarz 9119-9142) y MVSchw15319 (5'-ATCAGCACCTGCTCTATAGGTGTAA-3', genoma de MV Schwarz 15295-15319). Para obtener el fragmento 6, se asociaron conjuntamente dos fragmentos superpuestos generados mediante PCR. Se usaron los siguientes oligonucleótidos: MVSchw1 5155 (5'-GCAGCAGATAATTGAATCATCTGTGAGGACTTCAC, genoma de MV Schwarz 15155-15190) y MVSchw15570 (5'-CCCGGAGTAAAGAAGAATGTGCCCCCAGAATTTGC-3', genoma de MV Schwarz 15535-15570). Se asoció este fragmento con un fragmento que contenía la ribozima del virus de la hepatitis delta (HDV) ligada al terminador T7 que se obtuvo anteriormente mediante amplificación por PCR del plásmido p(MV+) (un amable obsequio de M. Billeter) usando los oligonucleótidos MVSchw1 5547 (5'-GGCACATTCTTCTTTACTCCGGGAACAAAAAGTTG-3', genoma de MV Schwarz 15547-15581) y MVSchwEnd (5'-ATAGGGCCCGCGGCCGCATCCGGATATAGTTCCTCCTTTCA-3' que contiene un sitio de restricción ApaI ligado a los últimos nucleótidos del terminador T7. Se clonaron los 6 fragmentos así generados en el vector pCR®2.1-TOPO® vector (Invitrogen, Groningen, Holanda) y se secuenciaron. Para ensamblar el ADN completo de MV Schwarz, se construyó un plásmido BlueScript KS (+) modificado: se asociaron dos oligonucleótidos internamente complementarios que proporcionan un poliligador NotI, KasI/NarI, SpeI, ApaI y se insertaron en plásmido pTM digerido con NotI/ApaI (pTM derivaba de pBluescript KS (+) (Stratagene) mediante deleción del promotor T7 (Tangy, F., A. McAllister y M. Brahic. 1989. "Molecular cloning of the complete genome of Theiler's virus, strain GDVII, and production of infectious transcripts". J. Virol. 63: 1101-11066). Se ensamblaron conjuntamente los 6 fragmentos de ADN de MV Schwarz paso a paso usando sitios de restricción únicos. Se ensamblaron conjuntamente los fragmentos 1 y 2 usando el sitio BlpI en la secuencia de MV (Fig. 2) y el sitio BglII en la cadena principal del vector pCR®2.1-TOPO®. Se ensambló el plásmido resultante con el fragmento 3 usando el sitio SbfI en la secuencia de MV y el sitio BglII en la cadena principal del vector pCR®2.1-TOPO®, proporcionando el plásmido pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-1-2-3 que contenía los fragmentos de MV Schwarz 1-3. Después de digestión con NotI/NarI de este plásmido, se insertó el fragmento que contenía el promotor T7, ribozima de cabeza de martillo y los 4922 primeros nucleótidos del antigenoma de MV Schwarz en el vector pTM digerido con NotI/NarI, proporcionando pTM-MVL. Al mismo tiempo, se ensamblaron conjuntamente los fragmentos 5 y 6 usando el sitio BsmBI en la secuencia de MV (Fig. 2) y el sitio BssHII en la cadena principal del vector pCR®2.1-TOPO®, proporcionando el plásmido pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-5-6 que contenía los fragmentos de MV Schwarz 5-6. Después de digestión con SpeI/ApaI de este plásmido, se insertó el fragmento que contiene los 6720 últimos nucleótidos del antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV y secuencias terminadoras de T7 en el vector pTM digerido con SpeI/ApaI, proporcionando pTM-MVT. Para el ensamblaje final, se prepararon 4 fragmentos y se ligaron conjuntamente: 1) un fragmento SapI/SapI de pTM-MVL (4367 nucleótidos de longitud) que contiene una parte de la cadena principal de pTM, el promotor T7, ribozima de cabeza de martillo y los 1813 primeros nucleótidos del antigenoma de MV, 2) un fragmento SapI/NarI de pTM-MVL (3110 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 1813-4923 del antigenoma de MV Schwarz, 3) un fragmento NarI/SpeI de pCR®2.1-TOPO®-MVSchw-3 (4253 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 4923-12157 del antigenoma de MV Schwarz, y 4) un fragmento SpeI/SapI de pTM-MVT (7235 nucleótidos de longitud) que contiene los nucleótidos 12157-15894 del antigenoma de MV Schwarz, ribozima HDV, terminador T7 y una parte de la cadena principal del vector pTM. Después del ligamiento y clonación, se obtuvieron varios constructos enteros. Se secuenció completamente el plásmido resultante, denominado pTM-MVSchw, (Nº acceso). No se encontraron mutaciones entre este ADNc y la secuencia anteriormente reseñada de genoma Schwarz (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001."Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 921-933; Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 2001. "Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage". J. Virol. 75: 910-920).
Recuperación de virus Schwarz infeccioso del plásmido pTM-MVSchw
Para recuperar el virus Schwarz del ADNc de pTM-MVSchw, se usó el sistema de recuperación basado en células auxiliares descrito por Radecke y col. (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dötsch, G. Christiansen y M. Billeter. 1995. "Rescue of measles viruses from cloned DNA". EMBO Journal. 14: 5773-5784) y modificado por Parks y col. (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu y S. A. Udem. 1999. "Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock". J. Virol. 73: 3560-3566). Se transfectaron células auxiliares humanas que expresaban establemente ARN polimerasa T7 y proteínas N y P del sarampión (células 293-3-46, dadas a conocer por Radecke y col. (17) usando el procedimiento de fosfato de calcio con plásmido pTM-MVSchw (5 \mug) y un plásmido que expresa el gen L polimerasa de MV (pEMC-La, 20 ng, dado a conocer por Radecke y col. (17). Después de cultivo durante una noche a 37ºC, se reemplazó el medio de transfección por medio reciente y se aplicó un choque térmico (43ºC durante 2 horas) (12). Después de 2 días de incubación a 37ºC, se transfirieron las células transfectadas a una capa de células CEF y se incubaron a 32ºC para evitar cualquier adaptación de la vacuna Schwarz que se seleccionó originalmente en células CEF y se cultiva actualmente en estas células por consideraciones de seguridad. Se prepararon las células fibroblásticas embrionarias de pollo (CEF) anteriores del modo siguiente. Se incubaron huevos de gallina fertilizados (EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, Francia) a 38ºC durante 9 días. Se recogieron de forma estéril los embriones. Se retiraron cabeza, miembros y vísceras, se seccionaron los embriones y se tripsinaron durante 5-10 minutos a 37ºC (tripsina/EDTA 2,5 g/I). Después de la filtración (70 \mum) y de varios lavados con DMEM rico en glucosa/10% de FCS, se sembraron las células (5-7 x 10^{6} células/placa Petri) y se incubaron durante una noche a 37ºC. Se recuperó fácilmente el virus infeccioso entre 3 y 7 días después del cocultivo. Aparecieron ocasionalmente sincicios en las CEF, pero no sistemáticamente. Se recuperó también el virus Schwarz mediante la misma técnica después del cocultivo de células auxiliares 293-3-46 transfectadas a 37ºC con células Vero de primate (riñón de mono verde africano). En este caso, aparecieron sistemáticamente sincicios en todas las transfecciones después de 2 días de cocultivo. Para ensayar la adaptación vírica a células Vero, se pasó una preparación de virus Schwarz clonado recuperado en células Vero dos veces por células Vero. Se purificaron las partículas víricas y se transcribió de forma inversa el ARN vírico como se describe anteriormente con los cebadores usados para la clonación (véase anteriormente). Se secuenció completamente el genoma vírico. Se encontraron dos cambios nucleotídicos de 15894 entre el virus recuperado/sometido a pase y el ADNc usado para transfección. Se encontraron estas mutaciones en 7 y 8 respectivamente de 10 clones diferentes de la misma región, indicando un alto porcentaje de mutación entre la población vírica. Además, ambas mutaciones dieron como resultado cambios aminoacídicos en la proteína de fusión (F): G\ding{212}R en la posición 265 e Y\ding{212}S en la posición
365.
En contraposición, la secuencia genómica del virus recuperado y sometido a pase en células CEF a 32ºC era idéntica a la del virus Schwarz original. Esta observación indica que cambiar la célula hospedadora del virus Schwarz conduce a una rápida adaptación que puede afectar a las propiedades de la vacuna.
Capacidad de crecimiento del virus recuperado
Se analizó la capacidad del virus Schwarz recuperado de ADNc de crecer en células CEF y Vero y se comparó con la vacuna Schwarz en bruto industrial de la que derivaba (obtenida de Aventis Pasteur) y con el virus EdB-tag recuperado de su ADNc. Se infectaron monocapas de células Vero en placas de 6 pocillos con virus a diferentes multiplicidades de infección. Se rasparon las células en medio de cultivo en diversos puntos temporales post-infección (pi). Después de congelar y descongelar, se determinaron los títulos de infectividad midiendo el TCID_{50} en células Vero. Curvas de crecimiento: se infectaron monocapas de células Vero en placas de 6 pocillos con virus a diferentes multiplicidades de infección (MOI). En diversos puntos temporales post-infección (pi), se rasparon las células en medio de cultivo. Después de congelar y descongelar, se determinaron los títulos de infectividad midiendo el TCID_{50} en células Vero.
Titulo de TCID_{50}: Se sembraron células Vero en placas de 96 pocillos (7500 células/pocillo) y se infectaron mediante diluciones en serie 1:10 de muestra de virus en DMEM/5% de FCS. Después de la incubación a 37ºC durante 4-5 días para virus Ed-B y 7 días para virus Schwarz, se tiñeron las células con violeta cristal y se determinó la dilución vírica que daba como resultado infección en un 50% de las unidades de ensayo. Se calculó el punto final de 50% como dosis infectiva en cultivo de tejido (TCID_{50}) mediante el procedimiento de Kärber (Kärber, G. 1931. "Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche". Arch. Exp. Path. Pharmak. 162: 480-483). Ensayados en células Vero, las cinéticas de crecimiento de virus Schwarz y EdB-tag recuperados de sus ADNc respectivos eran similares (Fig. 3 A, B). La producción vírica de Schwarz en células Vero alcanzó altos rendimientos (10^{7}-10^{8} TCID_{50}/ml después de 2 días de infección usando una multiplicidad de infección de 0,01). Ensayados en células CEF, el virus Schwarz fue capaz de crecer tanto a 32ºC como a 37ºC, mientras que EdB-tag no (Fig. 3 C, D). Esta observación confirma que el virus del que se clonó EdB-tag no estaba adaptado a células CEF. El rendimiento de virus Schwarz en CEF era menor que en células Vero (10^{6} TCID_{50}/ml después de 4 días de infección usando una multiplicidad de infección de 0,05). Se observaron curvas de crecimiento similar y títulos similares cuando se infectaron células CEF con el virus Schwarz original del que se clonó (Fig. 3E). Estas observaciones demuestran que el virus Schwarz recuperado de su ADNc tiene las mismas características de crecimiento que el lote de vacuna original del que se clonó.
Introducción de una unidad de transcripción adicional en ADNc de Schwarz
En el trabajo anterior que reseña la clonación de virus EdB-tag (17), los autores desarrollaron un procedimiento original para adaptar el ADNc vírico como vector adecuado para la expresión de transgenes extraños. Insertaron una unidad de transcripción adicional (ATU) en diferentes posiciones del genoma vírico. Esta ATU es una copia de la región intergénica N-P de MV que contiene las secuencias de acción en cis necesarias para la expresión dependiente de MV de un transgén insertado en un módulo de sitios de clonación múltiples. Ensayada en gran medida por los autores y nosotros mismos, la expresión de transgenes extraños insertados en esta ATU era muy eficaz, dependiendo de la posición de inserción en el genoma. Los diferentes genes de MV se expresan según un gradiente transcripcional en el genoma, conduciendo desde una alta expresión del gen N a una baja expresión del gen L (Lamb, R. y D. Kolakofsky. 1996. "Paramyxoviridae: the viruses and their replication", pág. 1177-1199. En B. Fields, D. Knipe, y col. (ed.), "Fields Virology". Lippincott-Raven Publishers, Filadefia).
La inserción de la ATU aprovecha este gradiente, permitiendo una alta o baja expresión del transgén dependiendo de la posición de inserción. Además, en este contexto, los transgenes extraños se expresan usando los mismos controles y rutas que los genes de MV auténticos.
Para transformar el ADNc de Schwarz como vector, se construyó una ATU similar que se insertó en dos posiciones diferentes del ADNc (Figura 4). Se secuenció el ADNc y no se encontraron mutaciones.
Inmunogenicidad de MV Schwarz recuperado de ADNc
Se comparó la inmunogenicidad del virus recuperado del plásmido pTM-MVSchw y sometido dos veces a pase en células CEF con la inmunogenicidad de la vacuna Schwarz en macacos cinomolgos. Las condiciones de pase fueron las siguientes:
-
Después de la recuperación, se seleccionaron sincicios aislados de las células CEF cocultivadas con células auxiliares 293-3-46 y se diluyó un solo sincicio en 600 \mul de OptiMEM 1 (Gibco) y vórtex. Se usó el inóculo para infectar células CEF recientes (80-90% confluentes) en un pocillo de 35 mm o un matraz T-25. Después de 2 horas de adsorción a 37ºC, se reemplazó el inóculo por DMEM/5% de FCS y se incubaron las células a 32ºC durante 1-2 días. Cuando aparecieron sincicios pequeños, se expandieron las células infectadas a matraces T-75: se lavaron las células con PBS y se desprendieron con PBS/EDTA 1 mM/0,25% de tripsina durante 1 minuto, se transfirieron después a matraces T-75 junto con células CEF recientes (1/4 de un cultivo de matraz T-75 confluente). Después de 4-7 días de incubación a 32ºC en DMEM/5% de FCS, se recogió el virus (pase 1): se retiró el medio de cultivo y se rasparon las células infectadas en 3 ml de OptiMEM 1. Después de un ciclo de congelación y descongelación, se desecharon los desechos celulares mediante centrifugación (1500 rpm, 5 minutos, temperatura ambiente). Se mantuvo congelada esta provisión de semillas a -80ºC y se usó para infectar CEF recientes del mismo modo que se prepara la provisión de 2 pases.
Se ensayaron diferentes formulaciones de la vacuna usando tanto la preparación en bruto sin pases de Aventis Pasteur como la misma preparación sometida a dos pases en células CEF. Se prepararon los virus del modo siguiente: se infectaron células CEF (obtenidas a partir de embriones de pollo incubados durante 9 días) a una MOI de 0,05 y se incubaron a 32ºC durante 7 días. Se purificaron los virus mediante raspado de células infectadas, congelación/descongelación y clasificación a baja velocidad de los desechos celulares. Se obtuvieron de Aventis Pasteur los agentes estabilizantes en la preparación de vacuna de MV. Se compararon diferentes preparaciones de vacuna en bruto con y sin agentes estabilizantes a la misma dosis con el producto final liofilizado (Rouvax, Aventis Pasteur). Se titularon todas las preparaciones de vacuna usando el procedimiento TCID_{50} en células Vero. Se inyectó por vía subcutánea a monos y se tomaron muestras de sangre a diferentes puntos temporales. Para comparar las respuestas tanto humoral como celular, se buscó la presencia de anticuerpos anti-MV en sueros mediante ELISA (Trinity Biotech, EE.UU.) y se buscó la presencia de linfocitos T anti-MV mediante ELISPOT en PBMC.
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Referencias citadas en la descripción
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Documentos de patentes citados en la descripción
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Claims (37)

1. Molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo de un virus del sarampión (MV) originario de la cepa Schwarz o la cepa Moraten, comprendiendo dicha molécula de ADNc la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15976 de las secuencias representadas en la figura 5.
2. Molécula de ADNc que codifica la secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo de un virus del sarampión (MV) originario de la cepa Schwarz o la cepa Moraten, estando comprendida dicha molécula de ADNc en un plásmido pTM-MVSchw depositado en la CNCM el 12 de junio de 2002 con el número 1-2889.
3. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, que se dispone bajo el control de una secuencia de control de la expresión heteróloga apropiada para la transcripción de la cadena (+) de ARN antigenómico partiendo de la molécula de ADNc.
4. Moléculas de ADNc según la reivindicación 3, en las que la secuencia de control de la expresión heteróloga de dicho ADNc comprende las secuencias promotora T7 y terminadora T7.
5. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente en su extremo 5', adyacente al primer nucleótido de la secuencia nucleotídica que codifica la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo de la cepa Schwarz o de la cepa Moraten, un motivo GGG seguido por una secuencia de ribozima de cabeza de martillo y que comprende, en su extremo 3', adyacente al último nucleótido de dicha secuencia nucleotídica que codifica la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo, la secuencia de una ribozima de virus de la hepatitis delta.
6. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es capaz de producir partículas víricas infecciosas de la cepa Schwarz o de la cepa Moraten en una célula auxiliar capaz de expresar proteínas necesarias para la transcripción o replicación de la secuencia del genoma de ARN del virus del sarampión de dicho ADNc y en condiciones que posibiliten el ensamblaje de partículas víricas.
7. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que está comprendida en un plásmido capaz de replicación.
8. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que tiene la secuencia nucleotídica representada en la figura 5.
9. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 83 al nucleótido 15976 ó 15977 de la secuencia representada en la figura 5.
10. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 29 al nucleótido 16202 de la secuencia representada en la figura 5 o del nucleótido 29 al nucleótido 15977 de la secuencia representada en la figura 5.
11. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 26 al nucleótido 16202 de la secuencia del plásmido pTM-MV Schw.
12. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende la secuencia nucleotídica que se extiende del nucleótido 9 al nucleótido 16202 de la secuencia del plásmido pTM-MVSchw.
13. Molécula de ADNc según la reivindicación 1 ó 2, que es el inserto contenido en el plásmido pTM-MVSchw depositado en la CNCM el 12 de junio de 2002 con el número 1-2889, en la que dicho inserto codifica la secuencia nucleotídica de la cadena (+) de ARN antigenómico infeccioso completo del virus del sarampión.
14. Molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, que es el producto de la transcripción inversa del ARN vírico purificado de partículas víricas del virus del sarampión.
15. Una molécula de ADNc recombinante que comprende una molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 y que comprende además una secuencia de ADN heteróloga capaz de expresar una secuencia aminoacídica heteróloga, cumpliendo dicho ADNc recombinante con la regla de 6.
16. Una molécula de ADNc recombinante según la reivindicación 15, que comprende además una unidad de transcripción adicional usada para clonar la secuencia de ADN heterólogo.
17. Una secuencia de ADNc recombinante según la reivindicación 16, en la que la unidad de transcripción adicional se clona cadena arriba del gen N del virus del sarampión o entre los genes P y M del virus del sarampión, o entre los genes H y L.
18. Un ADNc según la reivindicación 16 ó 17, en el que la secuencia de ADN heterólogo codifica una secuencia inmunogénica de un patógeno.
19. Un vector que comprende una molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18.
20. El vector de la reivindicación 19, que es el plásmido pTM-MVSchw depositado en la CNCM el día 12 de junio de 2002 con el número 1-2889.
21. Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20, que comprende una secuencia de ADN heterólogo insertada en el mismo, a condición de que la molécula de ADNc recombinante obtenida cumpla la regla de 6.
22. Un vector según la reivindicación 21, en el que la molécula de ADNc y la secuencia de ADN heterólogo están contenidas en un replicón y dicho replicón cumple la regla de 6.
23. Un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 21 ó 22, en el que la secuencia de ADN heterólogo se inserta en una unidad de transcripción adicional (ATU) clonada en dicha molécula de ADNc.
24. Un vector según la reivindicación 23, en el que la ATU se clona en el segmento 5' de la molécula de ADNc.
25. Un vector según la reivindicación 23 ó 24, en el que la ATU se clona cadena arriba del gen M del virus del sarampión contenido en la molécula de ADNc.
26. Un vector según la reivindicación 23 ó 24, en el que la ATU se clona entre los genes N y P del virus del sarampión contenidos en la molécula de ADNc.
27. El vector de la reivindicación 26, que es el plásmido pTM-MV Schw2-gfp depositado en la CNCM con el número 1-2890.
28. Un proceso para la preparación de partículas del virus del sarampión infecciosas que comprende:
1)
expresar el ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27 en una línea de células auxiliares que expresa también las proteínas necesarias para la transcripción, replicación y encapsidación de la cadena (+) de ARN antigenómico del virus del sarampión, partiendo de dicho ADNc y en condiciones que posibilitan el ensamblaje de partículas víricas y
2)
recuperar las partículas víricas expresadas.
29. Un proceso según la reivindicación 28, que comprende:
1)
transfectar células auxiliares con un ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18 o con un vector según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a 27, en el que dichas células auxiliares son capaces de expresar funciones auxiliares para expresar una ARN polimerasa y para expresar las proteínas N, P y L del virus MV;
2)
cocultivar dichas células auxiliares transfectadas de la etapa 1) con células sometidas a pases adecuadas para el paso de la cepa de vacuna de MV de la que se origina el ADNc;
3)
recuperar las partículas víricas de MV infecciosas producidas.
30. Un proceso según la reivindicación 29, en el que la etapa de transfección es seguida por el reemplazo del medio de transfección por medio reciente y la aplicación de un choque térmico antes de la incubación.
31. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 30, en el que las células auxiliares derivan de la línea de células de riñón embriónico humano 293 (ATCC CRL-1573).
32. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 29 ó 30, en el que las células adecuadas para el pase son células CEF.
33. Un proceso según una cualquiera de las reivindicaciones 28 a 32, que se usa para la producción de virus de sarampión infeccioso apropiado para uso como principio activo en una composición de vacuna.
34. Una composición de vacuna cuyo principio activo comprende partículas víricas de sarampión recuperadas de una molécula de ADNc según una cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, o del vector según una cualquiera de las reivindicaciones 21 a 27, en un sistema de recuperación basado en células auxiliares.
35. Una composición de vacuna según la reivindicación 34, que es adecuada para la protección frente al virus del sarampión.
36. Una composición de vacuna según la reivindicación 34, que es adecuada para la protección frente al virus del sarampión y frente al patógeno del que deriva la secuencia inmunogénica.
37. Un procedimiento para la preparación de una molécula de ADNc como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, que comprende las siguientes etapas:
-
purificar el ARN vírico de partículas víricas de la cepa Schwarz o de la cepa Moraten; y
-
obtener la molécula de ADNc mediante transcripción inversa del ARN vírico purificado.
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