KR20050058288A - 홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및면역학적 조성물로서의 용도 - Google Patents

홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및면역학적 조성물로서의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20050058288A
KR20050058288A KR1020047020803A KR20047020803A KR20050058288A KR 20050058288 A KR20050058288 A KR 20050058288A KR 1020047020803 A KR1020047020803 A KR 1020047020803A KR 20047020803 A KR20047020803 A KR 20047020803A KR 20050058288 A KR20050058288 A KR 20050058288A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
sequence
cdna
virus
nucleotide
artificial sequence
Prior art date
Application number
KR1020047020803A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101227128B1 (ko
Inventor
프레데릭 땅지
샹딸 꽁브르데
발레리 라브루쓰-나즈부르
미쉘 브라익
Original Assignee
앵스티띠 파스퇴르
상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄(씨엔알에스)
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=29716946&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20050058288(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 앵스티띠 파스퇴르, 상뜨르 나쇼날 드 라 러쉐르쉬 샹띠피끄(씨엔알에스) filed Critical 앵스티띠 파스퇴르
Publication of KR20050058288A publication Critical patent/KR20050058288A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101227128B1 publication Critical patent/KR101227128B1/ko

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A61K39/165—Mumps or measles virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C07K14/08—RNA viruses
    • C07K14/115—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • C07K14/12—Mumps virus; Measles virus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18421—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18422—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18434—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18411—Morbillivirus, e.g. Measles virus, canine distemper
    • C12N2760/18441—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2760/18443—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10211—Podoviridae
    • C12N2795/10241—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2795/10243—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

본 발명은 허가된 백신 균주로부터 유래하는 홍역 바이러스 (MV)의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 cDNA 분자에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 cDNA를 사용하는 면역원성 조성물의 제조에 관한 것이다.

Description

홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및 면역학적 조성물로서의 용도{INFECTIOUS cDNA OF AN APPROVED VACCINE STRAIN OF MEASLES VIRUS, USE FOR IMMUNOGENIC COMPOSITIONS}
홍역 바이러스는 모노네가바이랄레스(monoegaviirales) 목에 속하는 바이러스, 즉 비-절환성(non-segmented) 음성-쇄 RNA 게놈을 갖는 바이러스이다. 홍역 바이러스(MV)의 비-절환성 게놈은 게놈성 RNA가 되는 안티메시지 극성을 갖고 있어서 정제를 하더라도 생체내 및 시험관내에서 번역되거나 감염성을 갖지 않는다.
비-절환성(-)쇄 RNA 바이러스의 전사와 복제 그리고 이들을 바이러스 입자로 조립하는 것에 대해서는 연구되어 왔으며, 특히 필드 비롤로지라는 학술지를 통해 보고된 바 있다(Field Virology, 3rd edition, vol. 1, 1996, Lippincott - Raven publishers - Fields BN et al). 홍역 바이러스의 전사 및 복제는 감염된 세포의 핵에는 연관되지 않으며 차라리 그 감염된 세포의 세포질에 위치하게 된다. 홍역 바이러스의 게놈은 여섯 개의 유전자 (N, P, M, F, H 및 L이라고 명명됨)을 암호화하는 유전자들과 P 유전자로부터의 두개의 추가의 비구조 단백질로 이루어진다. 유전자 서열은 다음과 같다: 3', N, P(C 및 V를 포함), M, F, H 및 5’ 말단에 L 대형 폴리머라제 단백질. 이 게놈은 또한 유전자가 영역 M/F에 비암호화 영역을 갖고 있는데, 이들 비암호화 영역에는 약 1000개의 비번역 RNA의 뉴클레오티드들이 포함된다. 상기 유전자들은 각각 리더 펩티드 (I 유전자), 바이러스의 뉴클레오켑시드의 단백질, 즉 뉴클레오단벡질 (N), 포스포단백질 (P), 및 게놈 RNA 주위를 조립하여 노클레오캡시드를 만들게하는 대형 단백질 (L)을 암호화한다. 다른 유전자들은 헤마글루티닌 (H), 퓨전 (F), 및 매트릭스 (M) 단백질을 포함하는 바이러스 외피 단백질을 암호화한다.
홍역 바이러스는 1954년에 분리되어 이 분리된 에드몬스톤 (Edmonston) MV로부터 일차 인간 신장 또는 양막 세포에서 수행되는 연쇄 경로에 의해 생약독화 백신이 유도되었다(Enders, J.F., 및 T.C. Peebles. 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277-286). 이때 사용된 균주는 닭 태아 섬유아세포 (CEF)에 적용시켜 에드몬스톤 A 및 B 균주 (seeds)를 생산하였다(Griffin, D., 및 W. Bellini. 1996. Measles virus, p.1267-1312. In B. Fields, D. Knipe, et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia). 1963년에 에드몬드스톤 B가 최초의 MV 백신으로 등록되었다. 에드몬스톤 A 및 B에 대한 그후의 추이는 더욱 약독화된 슈왈쯔 (Schwarz) 및 모라텐 (Moraten) 바이러스를 생산하는 것이었고(Griffin, D., 및 W. Bellini. 1996. Measles virus, p. 1267-1312. In B. Fields, D. Knipe. et al. (ed.), Virology, vol. 2. Lippincott - Raven Publishers, Philadelphia) 최근 이들의 서열이 동일하다는 것이 밝혀졌다(Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920). 에드몬드 B 백신은 반응원성 (reactogenic)이기 때문에 1975년에 포기되었고 슈왈쯔/모라텐 백신으로 대체되었으며 이 백신이 홍역 백신으로는 세계에서 현재 가장 널리 사용되고 있다(Hilleman, M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications. Vaccine. 20:651-665). 여러 다른 백신 균주도 역시 사용되고 있다: 일본에서는 AIK-C, 슈왈쯔 F88, CAM70, TD97, 러시아에서는 레인그라드(Leningrad)-16 및 에드몬스톤 자그레브(Zagreb). CAM70 및 TD97 중국 균주는 에드몬스톤에서 유도하지 않았다. 슈왈쯔/모라텐 및 AIK-C 백신은 CEF에서 생산된다. 자그레그 백신은 인간 이배체 세포(WI-38)에서 생산된다.
슈왈쯔 균주로부터 유도되는 생 약독화 백신 아벤티스 파스퇴르사 (Aventis Pasteur, Lyon France)에서 Rouvax??라는 상표명으로 상업화되었다.
주목할 만한 획기적인 연구결과는, 마르틴 빌레터(Martin Billeter)와 그 동료들이 에드몬스톤 MV 의 안티게놈에 대응하는 감염성 cDNA를 클로닝하여 해당 바이러스를 구제하는 원초적이고 효율적인 역 유전학적 과정을 확립한 것이다(Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Doetsch, G. Christiansen, and M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14: 5773-5784 and WO 97/06270 incorporated herewith by reference).
그러나, 서열 비교(하기 참조)에서 이 벡터에서 클로닝된 게놈은 아드몬스톤 B 서열로부터 분지된 것임이 밝혀졌다. 이것은 에드몬스톤 분리체의 베로(Vero) 세포상에서의 초기 경로인 에드몬스톤-wt에 더 근접한 것이었고(Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J. Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920), 어느 에드몬스톤 서브그룹에도 관련되지 않는 10개의 아미노산 치환체를 갖고 있었다. 게다가, 이 벡터가 CD46을 발현하고 IFN 타입 I 수용체 (19)가 결여된 마우스에서 면역원성이라는 사실에도 불구하고, 발명자들은 하기와 같은 실험을 통해 104 TCID50의 표준 투여량을 접종할 경우에는 인간이 아닌 영장류에서 면역원성을 나타내지 않는다는 것을 보여준다. 그러므로, 이 벡터는 25년전에 포기된 백신 균주로부터 개발한 것이고 그 서열이 아주 분지된 것이어서 특히 인체에는 백신화 벡터로는 적합하지 않은 것으로 보이지만 MV 복제의 특정 부분을 이해하는 데에는 확실히 도움이 된다.
이러한 이유로, 본 발명자들은 어린이들을 대상으로 하는 홍역 벡터를 허가된 백신 균주로부터 개발할 필요성을 알았고, 따라서 널리 사용되는 홍역 바이러스의 슈왈쯔/모라텐 균주의 바이러스 입자에서 시작하여 감염성 cDNA를 클로닝하였다. 이 cDNA로 인해 종균의 입수가능성 여부에 의존할 필요없이 슈왈쯔/모라텐 백신 종균을 생산할 수 있다. 또한 안전성의 이유로 CEF에서 성장한 세계적으로 널리 사용되는 허가된 효율적인 백신 균주를 기초로 한 재조합 백신화 벡터로서 사용할 수도 있다. 이러한 벡터는 또한 특정 조건에서 성인에게 필요한 경우에도 사용할 수 있다.
하기 실시예와 도면은 본 발명의 추가의 특징을 설명하는 것이다.
도 1은 MV 게놈을 비교한 것이다. (A)에서는 각 암호화 영역 (상자안의 대문자들) 및 비암호화 영역 (소문자들)의 뉴클레오티드의 변화는 아래부분에 나타냈다. 아미노산의 변화는 상부 (한 글자 아미노산 기호)로 나타냈다. 격자 안의 노란색은 wt 치환체를 나타낸다. 청색은 루베오박스(Rubeovax)/슈왈츠/모라텐 백신형에 해당하는 치환체를 나타낸다. 적색은 EdB-태그 서열에만 있는 뉴클레오티드 및 아미노산 변화를 보여준다. EdB-태그의 1805 및 1806 위치의 뉴클레오티드 변화가 태그가 도입된 부분에 해당한다. (B)는 에드몬스톤 그룹 및 두 wt 분리체 중에서 EdB-태그를 보이는 계통수를 도시한 것이다(Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa, and Y. Nagai, 1998. Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins. J Virol. 72:8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune, and M. Tashiro. 2000. Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient. Virus Genes. 20:253-257). 서열은 크러스탈 W(Clustal W)를 사용하여 정렬하였다(Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673-4680). 뉴클레오티드 서열 거리는 필립(Phylip) 패키지 버전 3.5의 드내이스트 (Dnadist)로 측정하였다(Flesenstein, J. 1989. Cladistics. 5:164-166). 계통수는 글절된 뿌리를 생성하는 키무라 (Kimura) 두 파라미터법을포함하는 다양한 방법을 사용하여 산출된 페어와이즈 서열에 적용된 이웃-결합 분석에 의해 유도된다. 최종 결과는 트리비유로 생성하였다(Page, R. D. 1996. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appl Biosci. 12:357-358).
도 2는 pTMMVschw 플라스미드의 모식적 지도이다. 완전한 서열을 구축하기 위해 상부에 나타낸 6개의 단편들은 표시된 독특한 제한 부위를 이용하여 단계별로 생성 및 재조합시켰다. T7 = T7 프로모터; hh = 헤머헤드 리보자임; hδv = 간염 델타 리보자임; T7t = T7 RNA 폴리머라제 터미네이터. MV 슈왈츠 cDNA 및 이 cDNA로부터 구출된 슈왈츠 MV를 서열분석하기 위해 하기 올리고뉴클레오티드를 사용했다.
도 3은 베로(Vero) 및 CEF 세포상에서 슈왈츠 및 EdG-태그 바이러스를 구조하는 성장역학을 도시한 도면이다. 35mm 접시에서 세포를 pTM-MVSchw 플라스미드 (-■-), EdG-태그 (-○-), 및 산업 슈왈츠 바이러스 (-△-)로부터 상이한 MOI(상기한 바와 같이)에서 구제한 슈왈츠 MV로 감염시켰다. 일정시간에 세포를 수집하여 베로 세포상에서 TCID50 법을 이용하여 세포-결합(cell-associated) 바이러스 역가를 측정하였다. (A)는 베로 세포를 37℃에서 배양한 것이고, (B)는 CEF를 37℃에서 배양한 것이며, (C)는 CEF를 32℃에서 배양한 것이다.
도 4는 A: 추가 전사 유니트(ATU) 및 슈왈츠 MV 벡터 플라스미드을 도시한 도면이다. (AA)는 포스포프로테인 (P)와 메트릭스 (M) MV 오픈 리딩 프레임사이의 위치 2에 삽입된 ATUdml 시스-액팅 요소를 나타낸다. (AB)는 슈왈츠 MV 벡터 플라스미드에 ATU 삽입물의 3개의 위치를 나타낸다.
B: ATU 서열: 소문자는 추가의 서열 (홍역 바이러스의 N-P 유전자간 영역의 복제)과 클로닝 부위를 나타낸 것이다. 대문자는 삽입된 증강 GFP 서열에 해당한다. 이 서열은 ATU3에 대한 홍역 바이러스의 슈왈츠 균주의 cDNA 서열의 스펠(Spel) 부위 (위치 3373)과 ATU3에 대한 스펠 부위 (위치 9174)에 삽입된다. 정상 ATU를 bis (pTM-MVSchw20gfp 와 pTM-MVSchw2-GFPbis)와 차별시키는 돌연변이는 ATU 말단에 치환된 C (대문자)이다.
도 5는 pTM-MVSchw 플라스미드의 완젼한 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다. 서열은 뉴클레오티드의 위치를 참조하여 다음과 같이 나타낼 수 있다:
- 1-8 Notl 제한 부위
- 9-28 T7 프로모터
- 29-82 헤머헤드 리보자임
- 83-15976 MV 슈왈츠 안티게놈
- 15977-16202 HDV 리보자임 및 T7 터미네이터
- 16203-16210 Notl 제한 부위
- 16211-16216 Apal 제한 부위
- 16220-16226 Kpnl 제한 부위
- 16226-18967 pBluescript KS(+) 플라스미드 (Stratagene)
도 6은 상이한 MV 백신 균조로 면역화된 원숭이에서 항-MV 항체를 검출한 것이다. 항 -MV 항체는 슈왈츠 바이러스 (회색 막대), EdB-태그 바이러스 (흰색 막대) 및 루백스 (Rouvax) 백신 (검은색 막대)으로 히말라야 원숭이 (각군당 2마리)를 면역화시킨 다음 1개월 후에 ELISA 로 검출한 것이다. 재료 및 방법에 기재한데로 면역 상태 비율(Immune status ratio, ISR)를 산출하였다. 0.9 이상의 ISR치만을 긍정적인 값으로 판단했다(혈청 샘플의 1/20 희석한 것을 3번 반복 실험하여 측정하였으며 결과는 평균값±SD로 나타냈다).
도 7은 상이한 MV 백신 균주로 면역화시킨 마우스에서 MV를 측정한 것이다. CD46 (A) 및 CD46/IFNAR (B) 마우스를 EdG-태그 바이러스 (흰 막대), 슈왈츠 바이러스 (회색 막대) 및 루백스 백신 (흑색 막대) 104 TCID50 으로 면역화시킨 다음 1개월 후에 항-MV 항체를 ELISA로 측정하였다. 결과는 혈청 계대 희석으로 측정하여 평균 OD 값 ± SD (그룹당 4마리 마우스)로 나타냈다.
도 8은 상이한 슈왈츠 홍역 바이러스 제품으로 면역화시킨 원숭이에서 항-MV 항체를 검출한 것이다. 사이노몰거스 원숭이(cynomolgus macaques)(그룹당 2마리)를 산업용 대량 슈왈츠 바이러스 (흰 표시), pTM-MVSchw 플라스미드로부터 구하여 CEF에서 키운 (회색 막대) 및 베로 세포에서 키운 (흑색 막대) 슈왈츠 바이러스 104 TCID50 으로 면역화시키고 나서 상이한 시점에서 ELISA로 항-MV 항체를 검출하였다. 면역 상태율(immune status ratio, ISR)을 재료 및 방법에 기재한 대로 산출하였다.
도 9는 상이한 슈왈츠 MV 제품으로 면역화시킨 원숭이에서 백혈구 및 MV-특이적 T-세포의 수의 변화를 도시한 것이다. 시노몰거스 원숭이를 산업용 대량 슈왈츠 바이러스 (흰 표시), pTM-MVSchw 플라스미드에서 구해서 CEF (회색 막대)에서 성장시키거나 베로 세포 (흑색 막대)에서 성장시킨 슈왈츠 바이러스 104 TCID50 으로 면역화시킨 다음 상이한 시점에서 수집한 시노몰거스 원숭이의 PBMC에서 혈구 (A), 림프구 (B), 단핵백혈구 (C), 및 MV 헤마글루티닌-특이적 IFN-γ-ELISpots (D)를 측정했다. IFN-γ-ELISpots는 MV 헤마글루티닌을 발현하는 재조합 MVA로 PBMC를 24시간동안 자극시킨 다음에 측정하였다. MVA-wt 자극에의해 얻어진 백그라운드를 감하고 결과를 백만 PBMC당 HMV 특이적 γ-IFN 생산 세포로 나타냈다.
도 10은 pTM-MVSchw-ATU 플라스미드(A) 및 구조된 재조합 바이러스 (B)에 의해 감염된 베로 세포에서 GFP 발현을 도시한 것이다. 베로 세포는 위치 ATU2 (우측) 또는 위치 ATU3 (좌측)을 재조합 슈왈츠 MV-GFP로 감염시키고 GFP 형광을 합포체(syncytia)에서 관측하였다.
본 발명은 허가된 백신 균주로부터 유래하는 홍역 바이러스 (MV)의 완전한 길이의 안티게놈성 (+)RNA 균주의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 cDNA 분자에 관한 것이다.
상기의 ‘암호화하는’이라는 표현은 완전한 길이의 안티게놈성 (+)RNA를 전사할 수 있도록 하는 cDNA의 능력을 포함하며, 이때 cDNA는 특히 전사를 위한 주형(template)을 말한다. 따라서, cDNA가 이중쇄의 분자인 경우에는 그중 하나의 사슬은 "U" 뉴클레오티드가 cDNA에서 "T"로 대체된 경우를 제외하고는 홍역 바이러스의 안타게놈성 (+)쇄의 RNA 로서 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는다.
도 5는 본 발명의 DNA 분자 서열을 도시한 것으로서, 상기 정의한 cDNA서열을 포함하며, 나타난 cDNA 서열은 "U"를 "T"로 대체한 것을 제외하고는 MV 균주의 안티게놈성 (+)RNA 쇄와 동일하다.
상기 정의에 따르는 cDNA 분자는 적당한 조건이 되면 홍역 바이러스의 감염성 입자를 생산할 수 있는 감염성 안티게놈성 (+)RNA을 생산할 수 있게 해준다.
수득된 cDNA는 특히 바이러스성 RNA의 본래의 안티게놈성 (+)쇄의 원래의 5'- 및 3'-말단을 갖는다. 또한, 수득된 cDNA는 감염성 바이러스 입자를 발현하는데 필요한 6의 법칙에 따른다.
"6의 법칙"은 전체 뉴클레오티드의 수는 6의 배수의 양으로 cDNA에 존재한다는 것으로서 이 법칙으로 인해 홍역 바이러스의 게놈 RNA의 충분한 복제가 가능하다. 이러한 사실은 상기 인용 문헌 (Field Virology) 1197면에 기재되어 있다.
본 발명에 다르는 MV 허가된 백신 균주로부터 유도되는 cDNA 분자는 슈왈츠나 모라텐 균주로부터 얻을 수 있다.
이들 균주는 여러 문헌에 기재되어 있으며 현재 사용되고 있는 백신의 제조에 이용된다. 본 발명의 발명자는 아벤티스 파스퇴르사(프랑스)에서 입수할 수 있는 슈왈츠 균주를 사용할 것을 특히 제안한다.
본 발명의 또 다른 특정 실시예에 따르면 cDNA 분자가 이종성 발현 제어 서열의 제어를 받게 된다.
cDNA의 발현을 제어하는 서열을 삽입하는 것은 cDNA가 원래의 제어 서열로 완전 전사할 수 없는 세포 유형에서 cDNA를 발현시키려할 경우에 바람직하다.
본 발명의 실시예에 따르면 이종성 발현 제어 서열은 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 서열로 이루어진다. 이들 서열은 각각 MV의 완전한 길이의 안티게놈성 (+)RNA 쇄에 대한 암호화 서열의 5' 및 3', 및 이 암호화 서열 주위에 인접한 열로부터 위치한다.
본 발명의 실시예에 따르면 상기 정의된 cDNA 분자는 변형된 것이며, 즉 추가의 뉴클레오티드 서열이나 모티프(motifs)를 포함하거나 상기 cDNA 내에 결실 또는 치환부를 포함한다.
바람직한 실시예로는 본 발명의 cDNA 분자는 추가로 5'-말단에 MV 허가된 백신 균주의 완전한 길이의 안티게놈성 (+)RNA 쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 첫 번째 뉴클레오티드에 인접하여 해머헤드(hammerhead) 리보자임 서열이 뒤에오는 GGG 모티프를 포함하며, 그 3'-말단에 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열의 마지막 뉴클레오티드에 인접하여 리보자임 서열을 포함하고 있다. 간염 델타 바이러스 리보자임 (δ)는 본 발명을 수행하는 데에 적합하다.
5'-말단에, 상기 암호화 서열의 첫 번째 뉴클레오티드에 인접하여 위치하는 GGG 모티프는 상기 cDNA 암호화 서열의 전사의 효율을 개선한다. 홍역 바이러스 입자를 적절히 조립하는데 요구되는 것은 GGG 모티프가 추가되는 경우에 안티게놈성 (+)RNA를 암호화하는 cDNA가 6의 법칙에 따르는 것이기 때문에, MV의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄의 첫 번째 암호화 뉴클레오티드에 전사체를 절단할 수 있도록 리보자임 역시 cDNA의 암호화 서열읠 5'-말단에 GGG 모티프로부터 3'에 추가된다.
따라서, 전사 효율을 개선시키기 위해 GGG 모티프를 추가하는 경우에는 MV의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄에 대한 암호화 서열을 절단을 확보하기 위해 두개의 리보자임을 부가한다.
본 발명에 따르면 발현 "cDNA"는 RNA 분자의 역전사에 의해 얻어진 DNA 분자를 포함하며, mRNA 분자에 제한되지는 않는다.
본 발명에 개시된 재료로부터 출발하거나 본 발명의 cDNA에 관련된 개시된 특징을 사용하여 합성 또는 PCR과 관련된 기술을 포함하는 DNA를 제조하는 다른 기술을 사용할 수 있다.
그러므로, 본 발명의 분자의 뉴클레오티드 서열을 표현하기 위해 사용되는 발현 "cDNA"는 단지 원래 상기 분자가 홍역 바이러스의 바이러스 입자 게놈의 완전한 길이 게놈성 (-)RNA 쇄의 역전사에의해 얻어진 것이라는 사실과 관련된다. 이러한 사실은 그 제조를 위해 사용된 방법을 제한하는 것은 아니다. DNA를 포함하는 정제된 핵산은 따라서 본 발명에 따르는 cDNA 안에 포함되며, 단 상기 핵산, 특히 DNA는 상기 정의를 만족시킨다.
본 발명은 또한 복제할 수 있는 플라스미드에 포함된 상기 정의 중 하나에 따르는 cDNA 분자에 관한 것이다.
본 발명의 요건을 만족시키기는 많은 플라스미드가 제조될 수 있으며 본 발명은 특히 도 2에 도시된 플라스미드 pTM-MVSchw에 관한 것이다.
플라스미드 pTM-MVSchw는 2002년 6월 12일자로 CNCM(프랑스 파리)에 기탁번호 I-2889호로 기탁되었다. 이 플라스미드는 실시예 및 도면으로 후술한다. 이 플라스미드 벡터는 블루스크립트(Bluescript)로부터 유도하였으며, 홍역 바이러스, 슈왈츠 균주를 암호화하는 완전한 길이 서열을 포함하며, T7 RNA 폴리머라제의 프로모터에 의해 제어되고, 그 크기는 18967 뉴클레오티드이다.
본 발명은 또한 특히 MV 허가된 백신 균주의 감염성 바이러스 입자를 생산할 수 있고, 바람직하게는 293-3-46 헬퍼 세포(Radecke et al. and WO 97/06270)와 관련하여 보고된 적 있는 구출 시스템을 사용할 수 있는 cDNA 분자에 관한 것으로서, 293-3-46 헬퍼 세포는 상기 cDNA로부터 바이러스 입자를 조합할 수 있는 조건하에서 MV 의 RNA 게놈 서열의 전사, 복제에 필요한 단백질을 발현한다.
293-3-46 세포는 바이러스 입자를 제조하기 위한 예로서 인용된 것이다. 이들은 그러나 헬퍼 세포를 구성하는데 적합한 다른 적절한 세포로 대체할 수 있다.
이러한 감염성 입자를 제조하는 방법은 본 발명의 응용예로서 제시된 것이다.
특히 바람직한 본 발명에 따르는 cDNA 분자는 다음 서열 중에서 선택된 뉴클레오티드 서열을 갖는 분자이다:
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 83부터 뉴클레오티드 15977에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 29부터 뉴클레오티드 16202에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 26부터 뉴클레오티드 16202에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 9부터 뉴클레오티드 16202에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 29부터 뉴클레오티드 15977에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 26부터 뉴클레오티드 15977에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자,
- 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 9부터 뉴클레오티드 15977에 걸친 뉴클레오티드 서열을 포함하는 cDNA 분자.
본 발명은 상기한 특정 서열 각각에 관한 것이다.
본 발명을 수행하는데 바람직한 특정 cDNA 분자는 CNCM에 기탁번호 I-2889로 기탁된 플라스미드 pTMMVschw에 포함된 삽입부를 포함하는 분자이며, 상기 삽입부는 홍역 바이러스의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄의 뉴클레오티드 서열을 암호화한다. 특정 상입부는 하기 제한 부위에의해 정의되는 서열안에 포함된 것으로서 Notl(도 5의 위치 1에 위치함) 및 Notl(도 5의 위치 16203에 위치함)이다.
본 발명의 특정 실시예에서 cDNA 분자는 홍역 바이러스의 바이러스성 입자로부터 정제된 바이러스 RNA의 역전사 생성물이다.
바이러스성 정제 RNA로부터의 cDNA의 제조는 세포성 성분 및 특히 세포성 DNA 또는 RNA 의 존재가 제한되게 하며, 이들 세포성 DNA 및 RNA는 바이러스 배앙에 사용되는 세포내에 존재할 수 있다. 특히 불완전하거나 돌연변이되고 세포에 존재하는 바이러스 게놈성 RNA의 존재를 제한하고, 세포에서 대량으로 존재하는 바이러스성 mRNA의 존제를 제한한다.
본 발명은 또한 상기 정의된 특성을 갖는 cDNA 분자에 관한 것이며, 이 cDNA는 생체내에 투여할 경우 홍역 바이러스의 적어도 하나의 항체에 대한 면역 반응을 유발할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의된 어느 하나에 따르는 홍역 바이러스의 cDNA 분자 및 RNA 바이러스의 DNA 분자를 포함하는 재조합 모노네가바이랄레 (mononegavirales) 바이러스에 관한 것이며, 이 재조합 바이러스는 홍역 바이러스 또는 상기 RNA 바이러스에 대해, 또는 홍역 바이러스 및 RNA 바이러스 모드에 대해 생체에서 체액 및/또는 세포성 반응을 유발할 수 있다.
본 발명은 또한 상기 정의한 재조합 cDNA 분자에 관한 것으로, 추가로 이종성 아미노산 서열로서 발현할 수 있는 조건에서 클로닝된 이종성 DNA 서열을 포함하며, 상기 클로닝은 수득된 재조합 cDNA가 6의 법칙에 따르는 방식으로 수행된다.
이종성 암호화 서열 특히 DNA 서열은 바람직하게는 항원 또는 항원의 에피토프를 발현할 수 있는 서열 중에서 선택된 것이며, 면역원성을 갖고 특히 투여시 숙주에서 면역원성 반응을 유발하거나 촉진할 수 있다. 이러한 이종성 DNA 서열은 예를 들어 병원체의 항원으로부터 유도할 수 있다.
본 발명은 바람직하게는 이러한 이종성 DNA 서열을 추가 전사 단위 (ATU)로 명명하는 서열, 특히 WO 97/06270에서 빌레터 등(Billeter et al.)이 개시한 ATU에 삽입시킬 수 있다.
이 ATU는 특히 도 4에 나타냈다.
본 발명의 실시에 사용할 경우 ATU는 바람직하게는 MV의 안티게놈의 완전한 길이 (+)RNA 쇄를 암호화하는 cDNA 분자의 N-말단 서열에 위치하며 특히 이 바이러스의 P 및 M 유전자 사이 및 H 및 L 유전자 사이에 위치한다. MV의 바이러스 RNA의 전사는 5'에서 3'말단으로의 경사에 따라 이루어진다는 것이 관측되었다. 이는 cDNA를 암호화하는 서열의 5'말단에 ATU가 삽입될 경우 이를 포함하는 이종성 DNA 서열을 더욱 효율적으로 발현시킬 수 있을 것이라는 것을 설명해준다.
본 발명은 또한 재조합 cDNA를 포함하는 상기 정의된 cDNA 분자로 이루어진 벡터에 관한 것이다. 특정 벡터는 이 cDNA를 클로닝 및Ehsms 발현하는 벡터이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 따르면, 벡터는 플라스미드이며 특히 2002년 6월 12일에 CNCM에 기탁번호 I-2889로 기탁된 pTM-MVSchw이다.
2002년 6월 12일에 CNCM에 기탁번호 I-2890호로 기탁된 pTM-MVSchw2-gfp나 2003년 5월 26일 기탁번호 I-3034로 기탁되어 pTM-MVSchw2-GFPbis로 명명한 다른 벡터들도 본 발명에 포함된다.
이들 벡터는 pTM-MVSchw로부터 유래하며, 따라서 블루스크립트로부터 유래하는 플라스미드 벡터들이고, 홍역 바이러스, 슈왈츠 균주를 암호화하는 완전한 길이 서열을 포함하고, T7 RNA 폴리머라제의 프로모터에 의해 제어되며, 추가로 GFP 단백질에 대해 암호화하는 gfp 유전자를 포함하며, 이 유전자는 ATU의 위치 2(즉, MV의 N과 P 유전자 사이)에 삽입된다.
pTM-MVSchw의 크기는 18967 뉴클레오티드이다. pTM-MVSchw2-gfp의 크기는 19800 뉴클레오티드이다.
pTM-MVSchw2-gfp와 pTM-MVSchw2-GFPbis의 차이는 ATU 서열에 돌연변이에 해당하는데, pTM-MVSchw2-GFPbis를 만들기 위해서는 C 뉴클레오티드를 도 4B에 도시된 바와 같이 ATU의 말단에서 치환한다.
또한 본 발명은:
1) 상기 정의된 것 중의 하나에 따르는 본 발명의 cDNA 또는 이 cDNA 로부터 바이러스 성 입자를 조립할 수 있는 조건하에서 MV의 안티게놈성 (+)RNA 서열의 전사, 복제 및 인캡시데이션(encapsidation)에 필요한 단백질도 발현할 수 있는 헬퍼 세포주에 이러한 cDNA를 포함하는 벡터를 발현하는 단계 및
2) 발현된 바이러스성 입자를 회수하는 단계를 포함하는 감염성 홍역 바이러스 입자를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법의 특정 실시예에 따르면:
1) 상기 정의된 벡터를 갖는 상기 정의에 따르는 본 발명의 cDNA로 헬퍼 세포를 세포감염(transfecting)시키며, 이때 상기 헬퍼 세포는 RNA 폴리머라제를 발현하고 MV 바이러스의 N, P 및 L 단백질을 발현하도록 헬퍼 기능을 발현할 수 있는 단계;
2) 상기 1)단계의 세포감염된 헬퍼 세포를 cDNA가 유래하는 MV 백신 균주의 경로에 적합하도록 패시지시킨 세포 (passaged cell)과 공동배양하는 단계; 및
3) 생산된 감염성 MV 바이러스 입자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
바람직한 실시예에 따르면, 헬퍼 세포는 인간 배아 신장 세포주 293으로부터 유도되며, 세포주 293은 ATCC 에 기탁번호 CRL-1573으로 기탁하였다.
본 발명의 방법에 또 다른 실시예에 따르면, 경로(passage)에 적합한 세포주는 CEF 세포이다.
CEF 세포는 얼 모리조(EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, France) 이나 다른 닭 수정란 생산자로부터 입수한 닭 수정란으로부터 만들 수 있다.
본 발명에 따르는 개시된 방법은 바람직하게는 백신 조성물로서의 용도에 적합한 감염성 홍역 바이러스 생산에 사용된다.
따라서, 본 발명은 그 활성 성분이 상기 개시한 방법에 따라 얻어진 감염 홍역 바이러스 입자로 이루어진 면역원성 조성물에 관한 것이다.
또한 본 발명은 백신 조성물에 관한 것이다. 이러한 백신 조성물은 바람직하게는 상기 정의된 벡터의 cDNA 로부터 얻은 홍역 바이러스 입자를 포함하는 활성 성분을 포함하며, 헬퍼 세포에 기초하는 구조계(rescue system)에서 발현된다.
바람직하게는 이러한 백신 조성물은 홍역 바이러스로부터 보호하는 데에 적합하다. cDNA를 면역원성 아미노산 서열을 암호화하는 이종성 DNA 서열로 재조합시킨 실시예에 따르면, 백신 조성물은 추가로 면역원성 DNA 서열을 유도하는 병원체로부터 보호하기에 적합할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명에 따르는 cDNA 분자나 상기 정의한 벡터로 재조합시킨 세포에 관한 것이다. 바람직한 세포는 이. 콜라이 (E. coli) 또는 살모넬라 (Salmonella)와 같은 원핵세포이다.
또 다른 바람직한 세포는 원핵 세포이며, 특히 사카로마이세스 세레비지에 (Saccharomyces Cerevisiae)와 같은 효모중에서 선택된 세포이다.
본 발명의 정의에 포함되는 세포는 특정 실시예에 따르면, RNA 폴리머라제의 발현 및 MV 바이러스의 N, P 및 L 단백질의 발현에 필요한 헬퍼 기능을 발현시키는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것이 특징이 될 수 있다. 이러한 세포는 따라서 바이러스 입자를 수득하는 데에 사용할 수 있다.
EdB-태그와 홍역 백신 균주 간의 서열 비교
이미 보고된 우수한 분석법(Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920)에서, 에드몬스톤-유래 백신 바이러스 균주의 암호화 및 비암호화 서열을 에드몬스톤 자연형 (wild-type) 홍역 바이러스의 저-패시지 (low-passage) 분리체와 비교하였다. 상기 문헌의 저자들은 거의 모든 백신 균주가 공유하고 있는 10개의 아미노산 치환체를 확인하였다. 본 발명자들은 이들 에드몬스톤-유래 백신 균주와 두 일차 분리체의 게놈 서열을 (Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa, and Y. Nagai, 1998. Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins. J Virol. 72:8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune, and M. Tashiro. 2000. Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient. Virus Genes. 20:253-257) 보고된 에드몬스톤 B 감염성 cDNA (EdB-태그)(Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Doetsch, G. Christiansen, and M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14: 5773-5784)와 비교하였다. 도 1은 EdB-태그의 뉴클레오티드 서열이 루베오박스 (Rubeovax)(에드몬스톤 B 백신)과 0.24% (38 돌연변이) 및 슈왈츠/모라텐과는 0.27% (44 돌연변이) 상이함을 보여준다. 슈왈츠/모라텐와 에드몬스톤 B (Rubeovax??) 서열은 0.1% (16 돌연변이)만 상이하다. EdB-태그와 루베오박스의 38개의 차이 가운데에서 17개는 암호화 부위의 아미노산 치환체이며 7개는 비-암호화 부위에 위치하였다. EdB-태그와 슈왈츠/모라텐의 44개의 차이 중에서 22개는 아미노산 치환체이고 9개는 비-암호화 부위에 위치했다. 거의 모든 에드몬스톤 백신 균주가 공유하고 있는 10개의 아미노산 치환체 (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920)는 EdB-태그 cDNA에 보존되었다. 그러나, 그 중 5개는 AIK-C 및 Zabreg 서브그룹 특이적이며, 이는 EdB-태그가 에드몬스톤 Bfhqnxj 분지되어 클로닝되지 않았고 어느 허가된 백신 서열에도 해당되지 않는다는 것을 나타낸다. 게다가 EdB-태그의 10개의 아미노산 치환체는 어느 에드몬스톤 서브그룹과도 관련되지 않으며, 아마도 HeLa 세포에서 성장하도록 적응되고 또는 클로닝 과정에서 오류가 발생했을 것이다. 이들 특이적 변화중에서 5개는 P/V/C 암호화 서열에 위치하며 3개는 L 폴리머라제 유전자에 위치하므로, 생체내에서 바이러스의 복제능력에 영항을 미칠 가능성이 있다. 이 변화와 시스-액팅(cis-acting) 서열에서의 다른 변화들은 EdB-태그 cDNA로부터 얻어진 바이러스의 면역원성 또는 병원성에 영향을 줄 수 있다. 정말로, 베로 세포에서의 성장에 MV의 적응은 병원성의 상실(Kobune, F., H. Sakata, and A. Sugiura. 1990. Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus. J. Virol. 64:700-705) 및 폴리머라제 (L) 및 악세서리 (P/V/C) 단백질에 위치하며 림프 세포에서 전사 감쇠를 일으키는 몇몇 아미노산 변화 연관되어 있다(Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa, and Y. Nagai, 1998. Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins. J Virol. 72:8690-8696; Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune, and M. Tashiro. 2000. Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a cell-isolated and vero cell-isolated measles viruses from the same patient. Virus Genes. 20:253-257).
홍역 바이러스의 슈왈츠 백신 균주의 안티게놈에 해당하는 cDNA의 구축
아벤티스 파스퇴르사 (Aventis Pasteur, Lyon, France)에서 제공해준 홍역 슈왈츠 백신 배치에서 바이러스 입자를 정제하였다. 이 벌크 백신 제조물 (50 ml, 3 104 TCID150/ml)은 감염된 CEF 세포을 박리 (scraping)하여, 세포 및 배지를 냉동-해동하고, 세포 잔류물을 여과함으로써 얻었다. 입자는 30% 수크로즈 쿠션을 통해 원심분리하여 입자를 농축시켰다. 실리카겔-베이스 막 (QIAmp, Qiagen)을 사용하여 용해된 (lysed) 입자로부터 바이러스 RNA를 정제하였다. 바이러스 RNA를 프라이머로서 MV 게놈의 32 첫 번째 뉴클레오티드를 나타내는 특이적 올리고뉴클레오티드 (MVSchwRT1 5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAATC-3', 10 μM) 및 무작위 헥사머라제 (pdN6, 1 μM)를 사용하여 cDNA로 역-전사시켰다. 역전사의 충실성 및 완전-길이 생성물의 수율을 보장하기위해, 수퍼스크립트(SuperScript) II DNA 폴리머라제를 사용하였다 (GibcoBRL). 완전한 바이러스 cDNA를 포괄하는 6 개의 중첩되는 단편 한 세트 (도 2의 1번에서 6번)를 Pfu Turbo DNA 폴리머라제 (Stratagene)과 특이한 제한 부위에 특이적인 한 세트의 프라이머를 사용하여 PCR로 생성시켰다. 바이러스 안티게놈의 5' 말단에 있는 단편 1을 완전한 효율을 갖는데 필요한 GGG 모티프를 갖는 T7 RNA 폴리머라제 프로모터를 갖도록 특이적 프라이머를 사용하여 PCR을 한 다음, T7 프로모터와 첫 번째 바이러스 뉴클레오티드 사이에 해머헤드 리보자임 서열을 삽입하여 만들었다. 이 단편을 생성시키기 위해서 두개의 중첩되는 올리고뉴클레오티드를 함께 어닐링(annealing)하였다: Notl 부위, T7 프로모터 (밑줄) 및 해머헤드 리보자임 서열의 19개의 첫 번째 뉴클레오티드를 갖고 있는 리더 1 (5'-TATGCGGCCGCTAATACGACT CACTATAGGGCCAACTTTGTTTGGTCTGA-3'), 및 Smal/Xmal 부위를 구비한 해머헤드 서열을 갖고 있는 리더 2 (5'-GGTGACCCGGGACTCCGGGTTCGTCCTCACGGACTCATCAGACCAAACA-3'). PCR 증폭 후에는, 얻어진 단편을 PCR 연장으로 헤머헤드 서열 (밑줄)과 중첩되고 MV 슈왈츠 게놈 1-15를 포함하는 올리고뉴클레오티드 MVSchw1 (5'-GAGTCCCGGGTCACCAA ACAAAGTTGGGTAAG-3'), 및 MVSchw160 (5'-GGTTTGTCCTTGTTTCTTTT-3', MV 슈왈츠 게놈 141-160)를 사용하여 슈왈츠 cDNA 로부터 PCR에 의해 생성된 두 번째 단편에 연결시켰다. 단편 2 (2173 뉴클레오티드 길이, 도 2 참조)는 MVSchwRT1 (5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGATAGTTCAAT C-3', MV 슈왈츠 게놈 1-32), 및 MVSchw2173 (5'-ATTCCCTTAACCGCTTCACC-3', MV 슈왈츠 게놈 2155-2174)를 사용하여 증폭시켰다. 단편 3 (3142 뉴클레오티드 길이)를 올리고뉴클레오티드 MV Schw1901 (5'-CTATGGCAGCATGGTCAGAAATA-3', MV 슈왈츠 게놈 1901-1924) 및 MVSch5043 (5'-ATGTCGATGGTTGGGTGCT-3', MV 슈왈츠 게놈 5024-5043)을 사용하여 증폭시켰다. 단편 4 (4349 뉴클레오티드 길이)를 올리고뉴클레오티드 MVSchw4869 (5'-AAACTTAGGGCCAAGGAACATAC-3', MV 슈왈츠 게놈 4869-4891) 및 MVSchw9218 (5'-GGACCCTACGTTTTTCTTAATTCTG-3', MV 게놈 9194-9218)을 사용하여 증폭시켰다. 단편 5 (6200 뉴클레오티드 길이)를 올리고뉴클레오티드 MVSchw9119 (5'-AGATAGGGCTGCTAGTGAACCAAT-3', MV 슈왈츠 게놈 9119-9142) 및 MVSchw15319 (5'-ATCAGCACCTGCTCTATAGGTGTAA-3', MV 슈왈츠 게놈 15295-15319)을 사용하여 증폭시켰다. 단편 6을 얻기 위해서는 PCR로 생성시킨 두개의 중첩 단편을 함께 어닐링하였다. 하기 올리고뉴클레오티드를 사용하였다: MVSchw15155 (5'-GCQGCAGAGATAATTGAATCATCTGTGAGGACTTCAC, MV 슈왈츠 게놈 15155-15190) 및 MVSchw15570 (5'-CCCGGAGTAAAGAAGAATGTGCCCCCAGAATTTGC-3', MV 슈왈츠 게놈 15535-15570). 이 단편을 올리고뉴클레오티드 MVSchw15547 (5'-GGCACATTCTTCTTTACTCCGGGAACAAAAAGTTG-3', MV 슈왈츠 게놈 15547-15581) 및 MVSchwEnd (T7 터미네이터의 마지막 뉴클레오티드에 연결된 Apal 제한 부위를 포함하는 5'-ATAGGGCCCGCGGCCGCATCCGGAGTTCCTCCTTTCA-3', MV 15295-15319)를 사용하여 p(MV+) 플라스미드 (M. Billeter로부터 증정받음)를 PCR 증폭하여 앞에서 얻은 T7 터미네이터에 연결된 간염 델타 바이러스 (HDV) 리보자임을 함유하는 단편에 어닐링하였다. 이렇게 얻은 6개의 단편을 pCR?2.1-TOPO?? 벡터(Invitrogen, Groningen, Netherlands)에서 클로닝하여 서열분석하였다. MV 슈왈츠 완전한 길이 DNAfmf 조합하기 위해 변형된 BlusScript KS (+) 플라스미드를 구축하였다: Notl, Kasl/Narl, Spel, Apal 폴리링커를 만드는 두개의 내부적으로 상보적인 올리고뉴클레오티드를 어닐링하여 T7 프로모터를 삭제시켜 Notl/Apal (pTM은 pBlueScript KS (+) (Stratagene)에서 유래함)으로 소화시킨 (digested) pTM 플라스미드에 삽입하였다. (Tangy, F., A. McAllister, and M. Brahic. 1989. Molecular cloning of the complete gemone of Theiler's virus, strain GDVII, and production of infectious transcripts. J. Virol. 63:1101-11066). 6 개의 MV 슈왈츠 cDNA 단편을 독특한 제한 부위를 이용하여 단계별로 조립하였다. 단편 1 및 2를 MV 서열에 있는 Blpl 부위 (도 2) 및 pCR?2.1-TOPO?? 벡터 골격에 있는 Bglll 부위를 사용하여 함께 조립하였다. 얻어진 플라스미드를 MV 서열에 있는 Sbfl 부위 및 pCR??2.1-TOPO?? 벡터 골격에 있는 Bglll 부위를 사용하여 조립하여 MV 슈왈츠 단편 1-3을 포함하는 pCR??2.1-TOPO??-MVSchw-1-2-3를 얻었다. 이 플라스미드를 Notl/Narl 소화시킨 후에, T7 프로모터, 해머헤드 리보자임 및 MV 슈왈cm 안티게놈의 4922 첫 번째 뉴클레오티드를 포함하는 단편을 Notl/Narl 소화된 pTM 벡터에 삽입하여 pTM-MVL을 얻었다. 동시에 단편 5 및 6을 MV 서열에 있는 BsmBl 부위 (도 2) 및 pCR??2.1-TOPO?? 벡터 골격에 있는 BssHll 부위를 사용하여 함께 조립하여 MV 슈왈츠 단편 5-6을 포함하는 플라스미드 pCR??2.1-TOPO??-MVSchw-5-6을 얻었다. 이 플라스미드를 Spel/Apal 소화 시킨 후, MV 슈왈츠 안티게놈 6720 마지막 뉴클레오티드를 포함하는 단편, HDV 리보자임 및 T7 터미네이터 서열을 Spel/Apal 소화 pTM 벡터에 삽입하여 pTM-MVT를 얻었다. 마지막 조립과정으로서 4개의 단편을 만들어 함께 결찰시켰다: 1) pTm 골격 일부를 포함하는 pTM-MVL의 Spel/Apal 단편 (4367 뉴클레오티드 길이), T7 터미네이터, 해머헤드 리보자임 및 MV 안티게놈의 1813 첫 번째 뉴클레오티드, 2) MV 슈왈츠 안티게놈으로부터 뉴클레오티드 1813-4923을 포함하는 pTM-MVL (3110 뉴클레오티드 길이)의 Spel/Apal 단편, 3) pCR??2.1-TOPO??-MVSchw-3의 Narl/Spel 단편 (4253 뉴클레오티드 길이), 및 4) MV 슈왈츠 안티게놈의 뉴클레오티드 12157-15894, HDV 리보자임, T7 터미네이터 및 pTM 벡터 골격의 일부를 포함하는 pTM-MVT의 Spel/Sapl 단편(7235 뉴클레오티드 길이). 결찰 및 클로닝 후에 여러개의 완전한 구조물을 얻었다. 얻어진 플라스미드는 pTM-MVSchw로 명명하고, 완전히 서열분석하였다(기탁번호 CNCM I-2889). 이 cDNA와 슈왈츠 게놈에 대해 전에 보고된 서열 사이에는 돌연변이가 관측되지 않았다. (Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921-933; Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910-920).
pTM-MVSchw 플라스미드로부터 감염 슈왈츠 바이러스의 재생
pTM-MVSchw cDNA 로부터 슈왈츠 바이러스를 재생하기 위해 라데케 등 (Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. D?tsch, G. Christiansen, and M. Billeter., 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14: 5773-5784)에 기재되고 파크 등(Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J. Virol. 73:3560-3566)에 의해 변형시킨 된 헬퍼-세포-기초 구조 시스템을 사용하였다. T7 RNA 폴리머라제 및 홍역 N 및 P 단백질을 안정적으로 발현하는 인간 헬퍼 세포(293-3-46 세포, Radecke 등 (17)에 개시됨)를 인산칼슘 과정을 사용하여 pTM-MVSchw 플라스미드 (5㎍) 및 MV 폴리머라제 L 유전자를 발현하는 플라스미드(pEMC-La, 20 ng, Radecke 등 (17)에 개시됨)을 사용하여 감염시켰다. 37℃에서 하룻밤 배양한 후, 감염 배지를 신선한 배지로 교체하고 열 쇼크를 주었다(43℃에서 2시간 동안) (12). 37℃에서 이틀간 배양한 다음, 원래 CEF 세포에서 선택되어 안전성 면에서 이들 세포에서 현재 자라고 있는 슈왈츠 백신이 적응하지 못하도록 감염된 세포를 CEF 세포층에 옮기고 32℃에서 배양하였다. 상기 닭 태아 섬유아세포(chicken embryo fibroblstic cell, CEF)을 다음과 같은 방법으로 제조하였다. 수정된 계란(EARL Morizeau, 8 rue Moulin, 28190 Dangers, France)을 38℃에서 9일간 배양하였다. 태아를 멸균으로 수집하였다. 머리, 다리 및 내장을 제거하고 태아를 분절하여 37℃에서 5-10분간 트립신처리 하였다(Trypsine/EDTA 2.5 g/L). 여과 (70㎛)한 다음 DMEM 고 글루코스/10% FCS에서 여러번 세척하고, 세포를 분주(5-7 106 세포/페트리 디시)하여 37℃에서 하룻밤동안 배양하였다. 감염 바이러스를 공동배양하여 3일과 7일 사이에 쉽게 회수할 수 있었다. 때때로 CEF에서 합포체 (syncytia)가 나타나지만 항상 그런 것은 아니었다. 슈왈츠 바이러스도 37℃에서 감염된 293-3-46 헬퍼 세포를 원숭이 베로 세포(아프리가 녹색 원숭이 신장)과 공동배양 한 후에 동일한 기술로 구조하였다. 이 경우, 공동 배양한지 2일 후에 모든 감염물에서 합포체가 규칙적으로 나타났다. 베로 세포에 대한 바이러스성 적응 시험을 하기 위해 베로 세포에서 구조한 클로닝한 슈왈츠 바이러스 제조를 베로세포에서 2회 패시지 시켰다. 바이러스 입자를 정제하여 바이러스 RNA를 상술한 것과 같이 클로닝 (상술한 내용 참조)에 사용된 프라이머로 역 전사시켰다. 바이러스 게놈을 완전히 서열분석하였다. 15894개중 두개의 뉴클레오티드를 구조/페시지시킨 바이러스와 감염에 사용한 cDNA 간에 발견하였다. 이들 돌연변이는 동일한 영역의 10개의 상이한 클론중 각각 7 및 8에서 발견되었으며, 이는 바이러스 집락 가운데 높은 돌연변이 퍼센트를 나타낸다. 또한, 두 돌연변이 모두 융합 단백질 (F)에 아미노산 변화를 초래하였다: 266위치에서 G-> R 이고 365 위치에서 Y->S.
반대로, CEF 세포에서 32℃에서 복구하고 패시지 시킨 바이러스의 게놈 서열은 원래 슈왈츠 바이러스와 동일하였다. 이 결과는 슈왈츠 바이러스의 호스트 세포를 변화시키는 것은 급속한 적응을 유발하여 백신의 특성에 영향을 줄 수도 있다는 것을 나타낸다.
구조된 바이러스의 성장능
cDNA로부터 구조한 슈왈츠 바이러스의 CEF와 베로 세포에서의 성장능을 분석하여 이들이 유래하는 산업용 벌크 슈왈츠 백신(Aventis Pasteur 로부터 입수함) 및 cDNA 로부터 구조한 EdB-태그 바이러스와 비교하였다. 6-웰 플레이트에 단일층의 베로 세포를 다양한 배수 감염 방식으로 바이러스 감염시켰다. 감염후 다양한 시간 (pi)에서 세포를 배양 배지에 긁어 넣었다. 냉동 및 해동 후, 베로 세포에서 TCID50을 측정하여 감염성을 측정하였다. 성장 곡선: 6-웰 플레이트에 단일층의 베로 세포를 다양한 배수 감염 방식으로 바이러스 감염시켰다 (MOI). 감염후 다양한 시간 (pi)에서 세포를 배양 배지에 긁어넣었다. 냉동 및 해동 후, 베로 세포에서 TCID50을 측정하여 감염성을 측정하였다.
TCID 50 적정: 베로 세포를 96-웰 플레이트 (7500 세포/웰)에 분주하여 DMEM/5% FCS에 바이러스 샘플을 1:10 계대희석하여 감염시켰다. 37℃에서 Ed-B 바이러스는 4-5일간, 슈왈츠 바이러스는 7일간 배앙한 후, 세포를 크리스탈 바이올렛으로 염색하여 바이러스 희석이 50%의 시험 단위에서 감염이 나타나는지 측정하였다. 조직 배양 감염 용량 (TCID50)으로 나타낸 50% 종말점을 카르버법으로 산출하였다(Karber, G. 1931. Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. Arch Exp Path Pharmak. 162:480-483). 베로 세포에서 측정한 결과 각각의 cDNA로부터 구조한 슈왈츠 및 EdB-태그 바이러스의 성장 속도론은 유사하였다(도 3). 베로 세포에서의 슈왈츠 바이러스 생산이 높은 수율에 도달하였다(0.01 배수 감염을 사용하여 감염 2일후 107-108 TCID50/ml). CEF 세포에서 측정한 결과 EdB-태그 와는 달리 슈왈츠 바이러스는 32℃ 뿐만 아니라 37℃에서도 잘 성장할 수 있었다(도 3). 이 결과는 EdB-태그가 클로닝된 바이러스는 ＣEF 세포에서 적응하지 못한다는 것을 확인시켜준다. CEF 상에서 슈왈츠 바이러스의 수율은 베로 세포에서의 것 보다 낮았다(0.05 배수 감염하여 4일 후 106 TCID50/ml). CEF 세포를 클로닝시키기 전의 원래의 슈왈츠 바이러스로 감염시켰을 때 유사한 성장 곡선 및 유사한 적정치를 나타냈다(도 3). 이들 결과는 cDNA 로부터 구조한 슈왈츠 바이러스가 크로닝시키기 전의 원 백신 배치와 동일한 성장 특성을 나타낸다는 것을 보여준다.
슈왈츠 cDNA에 추가 전사 단위의 도입
EdB-태그 바이러스의 클로닝을 보고한 종래의 작업 (17)에서, 저자들은 외래 트랜스유전자의 발현에 적합한 벡터로서 바이러스 cDNA를 채택하는 원래의 방법을 개발하였다. 그들은 바이러스 게놈의 다른 위치에서 추가 전사 단위 (ATU)를 삽입하였다. 이 ATU는 다양한 클로닝 부위 카세트에 삽입된 트랜스유전자의 MV-의존성 발현에 필요한 시스-액팅 서열을 포함하는 MV N-P 유전자간 영역의 복제이다. 저자들과 본 발명자들이 광범위하게 시험한 결과 이들 ATU에 삽입된 외래 트랜스유전자의 발현은 게놈의 삽입 위치에 따라 매우 효율적이었다. 게놈의 전사적 하향 구배에 따라 다른 MV 유전자가 발현되어 N 유전자의 발현이 높고 L 유전자의 발현이 낮았다(Lamb, R., and D. Kolakofsky. 1996. Paramyxoviridae: the viruses and their replication, p. 1177-1199. In B. Fileds, D. Knipe, et al. (ed.), Fields Virology. Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia).
ATU의 삽입은 이 구배를 이용하여 삽입 위치에 따라 높거나 낮은 트랜스유전자의 발현을 나타냈다. 또한, 이러한 면에서 외래 트랜스유전자는 진정한 MV 유전자와 동일한 제어 및 경로를 사용하여 발현하고 있다.
슈왈츠 cDNA를 벡터로 변형시키기 위해서 cDNA의 두개의 상이한 위치에 유사한 ATU를 삽입하였다(도 4). cDNA를 서열분석하였으나 돌연변이는 발견되지 않았다.
원숭이 cDNA로부터 회수한 슈왈츠 MV의 면역원성
제 1 실험: 슈왈츠 백신과 비교
pTM-MVSchw 플라스미드로부터 회수하여 CEF 세포에서 2회 패시지 시킨 바이러스의 면역원성을 시노몰거스(cynomolgus) 원숭이에서의 슈왈츠 백신의 면역원성과 비교하였다. 패시지 조건을 다음과 같다:
- 구조한 다음, 분리된 합포체를 293-3-46 헬퍼 세포와 공동배양한 CEF 세포로부터 골라내어 합포체 하나를 600 μl의 OptiMEM 1 (Gibco)로 희석시켜 교반하였다. 이 접종원을 35 mm 웰 또는 T-25 플라스크에서 신선한 CEF 세포(80-90% 융합성)를 감염시키는데 사용했다. 37℃에서 2시간 동안 적응시킨 다음 접종원을 DMEM/5% FCS로 대체하여 세포를 32℃에서 1-2일간 배양하였다. 작은 합포체가 나타나면 감염 세포를 T-75 플라스크에 넣고, 세포를 PBS로 세척하여 PBS/1 mM EDTA/0.25% 트립신으로 1분동안 분리시킨 다음, 신선한 CEF 세포와 함께 T-75 플라스크로 옮겼다(1/4의 융합성 T-75 플라스크 배양). DMEM/5% FCS에서 32℃에 4-7일간 배양한 다음, 바이러스 (패시지 1)를 모았다: 배양 배지를 제거하고 감염 세포를 3 ml의 OptiMEM 1 에 긁어모았다. 냉동 및 해동 한 사이클 후에 세포 잔류물을 원심분리 (1500 rpm, 5분, 실온)로 제거하였다. 이 스톡 균주를 -80℃에서 냉동시켜 신선한 CEF를 감염시키는데 동일한 방식으로 사용하여 패시지 2 스톡을 제조하였다.
아벤티스 파스퇴르로부터 입수한 패시지를 거치지 않은 벌크 제품 과 CEF 세포에서 두 번의 패시지를 거친 동일한 제조물 모두를 사용하여 상이한 제형의 백신을 시험하였다: CEF 세포 (닭 태아를 9일간 배양하여 얻음)를 0.05의 MOI에서 감염시켜 32℃에서 7일간 배양하였다. 감염 세포를 긁어모아 냉동/해동 및 세포 잔해물의 저속 세척을 통해 바이러스를 정제하였다. MV 백신의 제조에 사용한 안정화제는 아벤티스 파스퇴르사로부터 입수한 것이다. 안정화제를 넣거나 넣지 않은 상이한 벌크 백신 제품을 동결건조시킨 최종 제품에(Rouvax, Aventis Pasteur) 대해 동일한 용량으로 비교하였다. 모든 백신 제조물을 베로 세포에서 TCID50법을 사용하여 적정하였다. 원숭이에 피하주사하여 다른 시점에서 혈액 샘플을 취하였다. 체액성 및 세포성 반응 모두를 비교하기 위해 ELISA (Trinity Biotech, USA)에 의해 혈청에서의 항-MV 항체 존재를 관측하고 PBMCs에서 ELISPOT으로 혈청중의 항-MV T-세포의 존재를 관측하였다.
제 2 실험: EdB-태그 균주와 비교
원숭이 D형 레트로바이러스, 원숭이 T-세포 향백혈구성(lymphotropic) 바이러스, 원숭이 면역결핍 바이러스 및 홍역 바이러스에 혈청음성적인 콜로니-성장 붉은털 원숭이 (Macaca mulatta) 또는 시노말거스 (Macaca fascicularis) 원숭이를 미국 실험실 동물 보육 승인 협회 기준에 맞추어 길렀다. 원숭이에게 EdB-태그 또는 슈왈츠 MV를 OptiMEM (GibcoBRL)로 상이한 용량으로 희석 (103-105 TCID50 )하거나 동결건조시킨 루백스 MV 백신 (Aventis Pasteur, Marcy l'Etoile, France)를 공급자에게서 받은 용액으로 104 TCID50로 희석시켜 접종하였다. 혈액 샘플을 접종후 상이한 시점에서 채집하였다.
백신 주사 한달 후에 ELISA로 혈청에서의 항-MV 항체 존재를 관측하였다. 혈청 샘플을 1/20 희석하여 3회씩 실험하였다. 음성 대조군으로 음성반응의 원숭이로부터 5개의 샘플을 혼합하여 사용하였다. 각 샘플의 면역 상태 비 (immune status ratio, ISR)을 측정하기 위해 양성 샘플의 흡광도에서 음성 대조군의 흡광도를 빼고 그 결과를 공급자가 추천하는 대로 ELISA 키트에 있는 캘리브레이터의 흡광도로 나누었다. ISR값이 0.9보다 큰것만을 이 시험에서 양성인 것으로 보았다.
세포 면역 반응을 γ-IFN ELISpot 검출법으로 측정하였다. 냉동 PBMC를 해동하고 RPMI, 10% FCS 및 4 U/ml rh-IL2 (Boehringer Manneim)에서 하룻밤 배양하였다. 멀티스크린-HA 96-웰 플레이트를 PBS에서 4 ㎍/ml의 포획 (capture) 항-?-IFN (GZ-4, MAbTech)으로 4℃에서 하룻밤동안 코팅시키고, 세척한 다음 37℃에서 1시간 동안 100㎕ RPMI, 10%FCS로 배양했다. 배지를 5.105 PBMC 로 교체하여 100㎕의 RPMI-10% FCS 및 100㎕의 자극제 (stimulating agent)중에 현탁시켰다. 107 pfu 의 재조합 변형 백신 안카라(Ankara)(32) MVA-HMV 또는 MVA-wt를 대조 세포로 구성하고 있는 자극제를 37℃에서 24시간 자극시켰다. 파이토헤마글루티닌 A (2.5 ㎍/ml, Sigma)를 양성 대조군으로 사용하고 RPMI를 음성 대조군으로 사용하였다. 플레이트를 PBS로 2회, PBS, 0.05% Tween 20 (Sigma)로 4회, PBS로 다시 2회 세척하였다. 바이오티닐화된 항-γ-IFN 항체(7-B6-1, MabTech, 100㎕, PBS 중에 1㎍/ml)를 넣고 플레이트를 37℃에서 2-4시간 동안 배양하였다. 스트렙타비딘-알칼린 포스파타제 (AP) 콘주게이트(Roche, 100㎕, PBS 중에 1/2000희석)를 넣고 1M Tris pH 9.5, 1.5 M NaCl, 0.05 M MgCl2에서 BCIP/NBT (Promega)로 스폿을 전개시켰다. 실온에서 하룻밤 건조시킨 다음, 자동 영상 분석 시스템(ELISpot Reader, Bio-Sys)을 사용하여 스폿 수를 셌다. MVA-wt 자극후 얻은 저 백그라운드를 빼고 그 결과를 백만 PBMC 당 MVA-HMV 특이적 γ-IFN 생산 세포수로 나타냈다.
마우스 면역화 및 체액성 면역 반응 특성관측. CD46 트랜스유전자(33)에 대한 FVB 마우스 이형접합군을 I형 인터페론 수용체 (30)를 결여한 129sv IFN-α/βR-/- 마우스와 교배하였다. F1 자손을 PCR로 스크린하여 CD46+/- 동물을 129sv IFN-α/βR-/- 마우스와 다시 교배하였다. IFN-α/βR-/- CD46+/- 동물을 선별하여 면역화 실험에 사용하였다. 이들 마우스는 MV에 감염되기 쉽다 (27, 29). 6주령의 웅성 CD46+/- 또는 CD46+/- IFN-α/βR-/- (IFNAR) 마우스에 상이한 백신 제조물 104 TCID50을 복강주사하였다 (그룹당 4마리 마우스). 백신주사 1개월 후에 혈청을 수집하여 ELISA (Trinity Biotech, USA)로 항-MV 항체의 존재를 관측하였다. 이 경우, 항 마우스 IgG Mab (Amersham)을 이차적 항체로 사용하였다. 각 실험은 3회 수행하였다. 양성 마우스에서 측정한 흡광도에서 음성 마우스 혈청의 혼합믈로부터 측정한 흡광도를 뺏다. 이 경우 샘플을 비교하기 위해 ISR을 사용하는 것이 불가능하므로, 마우스 혈청을 계대 희석하여 종말점 한계 양성 희석(endpoint limit positive dilution)을 결정하기 위해 시험하였다.
결과
원숭이와 마우스를 EdB-태그 및 슈왈츠 MV 백신으로 백신화한 후의 체액 면역 반응 비교.
EdB-태그 MV는 에드몬스톤 B 균주에서 유도된 분자 클로닝한 MV 이다 (16). 본 발명자들은 이것의 원숭이에서의 면역원성을 슈왈츠 상업 MV 백신과 비교하였다. EdB-태그 바이러스를 0.05 배율 감염 (MOI)로 감염시킨 베로 세포에서 제조하였다. 합포체가 배양물에 80-90% 발생하면 세포를 긁어, 세포 및 배지를 냉동/해동시키고 세포 잔류물을 저속 원심분리로 제거하였다. 아반티스 파스퇴르 (March l'Etoile, France)에서 입수한 슈왈츠 MV를 동일한 방법으로 이 균주가 CEF 에 적응한 온도인 32℃에서 성장한 감염된 닭 태아 섬유아세포 (CEF)로부터 제조하였다. 두 백신 제조물을 역가를 베로 세포에서 종말점 희석 측정법으로 측정하고 TCID50로 나타냈다. EdB-태그 및 슈왈츠 MV를 상이한 용량(103-105 TCID50)을 원숭이에게 피하 주사하였다(용량당 2마리 원숭이). 대조군으로 동결건조된 상업적 슈왈츠 백신 (Rouvax, Aventis Pasteur)을 동물에 주사하였다. 항-MV 항체 수준을 백신화하고 한달 후에 원숭이 혈청을 채집하여 ELISA 로 측정하였다. 슈왈츠 MV 103 및 104 TCID50을 접종한 원숭이에서 루백스 백신 표준 농두로 유도한 것과 유사한 항체 수준을 보였다(도 6). EdB-태그 바이러스 104 TCID50을 접종시킨 원숭이는 음성으로 나타났다(도시하지 않음). 10배 높은 용량의 주사 (105 TCID50)로약한 반응만을 유도했는데 이는 슈왈츠 MV 103 TCID50에서 관측된 것 보다 낮았다(도 6). 상업적 백신으로 면역화시킨 경우는 아마도 동결건조의 아주번트 효과로 인하여 최고 반응을 유도한 것이다.
유전학적으로 변형된 마우스를 재료 및 방법에 기술한 대로 얻어서 다른 백신 제조물 실험을 하였다. 두 유형의 마우스를 사용하였다: CD46 (33), MV 백신 균주에 대한 인간 수용체 (34)를 발현하는 마우스와 CD46 및 IFN I형 수용체 (29)를 발현하는 마우스. 6주령의 마우스에 상이한 백신 제조물 104 TCID50을 복강 접종하였다 (그룹당 4마리 마우스). 도 7은 면역화 한달후에 두 유형의 마우스 모두에서 채취한 혈청에서 항-MV 항체를 검출한 결과를 나타낸다. CD46 마우스에서 EdG-태그 바이러스가 슈왈츠 백신보다 면역원성이 낮았다. 전자에서 얻은 평균 역가는 1/80인 반면, 후자는 1/1280이었다. EdB-태그 바이러스는 또한 IFN I형 수용체가 결핍된 CD46 마우스에서도 낮은 면역원성을 나타냈으나 그 차이는 CD46 면역-능력을 갖는 마우스에서보다는 덜 현저한 것이며, 이는 아마도 두 바이러스 균주간의 IFN-α/β에 대한 민감성의 차이를 나타내는 것으로 보인다.
cDNA로부터 회수한 슈왈츠 MV의 면역원성.
pTM-MVSchw 플라스미드로부터 구조하여 CEF 또는 베로 세포에서 2회 패시지 시킨 바이러스의 시노몰거스 원숭이에 대한 면역원성을 산업적 슈왈츠 백신과 비교하였다. MV 음성인 붉은털 원숭이를 중국에서 입수하기 어렵기 때문에 시노몰거스 원숭이를 이 실험에 사용하였다. 이들 원숭이는 붉은털 원숭이처럼 MV에 민감하다는 것이 여러 연구를 통해 나타났다(28, 26). 원숭이(제조물당 2마리)에 아벤티스사로부터의 슈왈츠 MV 백신 및 pTM-MVSchw 플라스미드로부터 구조해서 CEF 또는 베로 세포에서 성장시킨 슈왈츠 MV 104 TCID50을 복강주사 하였다. 상이한 시점에서 채집한 혈청에서 항-MV 항체의 존재를 측정하였다(도 8). 면역화시킨 모든 원숭이가 양성을 나타냈다. 시험한 상이한 백신 제조물 사이에는 면역화 1 또는 2 개월후에 통계학적으로 유의적인 차이가 관측되지 않았다. 이 결과는 pTM-MVSchw 플라스미드로부터 구조한 바이러스는 모체인 슈왈츠 백신에서와 같이 인간이 아닌 영장류에서는 동일한 면역원성을 갖는다는 것을 보여준다. CEF나 베로 세포에서 성장시킨 구조 바이러스 간에는 상이점이 관측되지 않았으며 이는 베로 세포상의 패시지에 의해 F 단백질에서 발생한 두 돌연변이는 바이러스의 면역원성에 영향을 주지 않았다는 것을 나타낸다.
접종후 첫째달 동안에 총 백혈구 (WBC), 림프구 및 단핵구 수의 변화가 관찰되었다 (도 9). 앞에서 MV 면역화 후에 관찰된 바와 같이 첫 주 동안에는 가벼운 백혈구감소증이 있었다 (1). 둘째 주에는 순환 림프구 및 단핵구 수가 확실히 증가하였다. 이것은 γ-IFN ELISpot 검출법에서 검출된 바와 같이 MV-특이적 T-임파구의 수가 최대로 된 것과 일치하였다(도 9D). 플라스미드로부터 구조한 슈왈츠 MV 에 의해 유도된 특이적 세포성 면역 반응과 아벤티스사가 제조한 슈왈츠 백신 간에는 통계학적으로 유의적인 차이는 검출되지 않았다.
논의
이번에는 두개의 널리 사용되는 홍역 백신인 아테뉴백스(Merch and Co. Inc., West Point, USA) 및 루백스(Aventis Pasteur, March l'Etoile, France), 및 홍역, 이하선염 및 루벨라 혼합 백신(MMR)(35)의 구성분인 슈왈츠/모라텐 약독화 홍역 바이러스 균주를 클로닝 및 구조하는 것에 대하여 기술한다. 소아과 시험에 사용하기 위해서는 cDNA로부터 제조한 생 약독화 MV는 모체 백신 만큼 안전하고 효과적이어야 한다. 안전성 및 효능이 약독화 균주의 게놈 서열에 궁극적으로 의존한다고 가정하고 클로닝의 신뢰성을 최적화시킨 방법을 사용하여 산업적 배치의 백신으로부터 제조된 바이러스 입자로부터 MV 슈왈츠 cDNA를 클로닝 하였다. 결과적으로 수득한 클론의 서열은 모체 슈왈츠 MV 게놈과 동일하였다. 구조하는 동안의 수율을 최대화하기 위해 바이러스 안티게놈성 cDNA를 완전한 효율을 내기 위해 필요한 GGG 모티프를 갖는 T7 RNA 폴리머라제 프로머터로 제어하게 하였다. 해머헤드 리보자임을 이 GGG 모티프와 첫 번째 바이러스 뉴클레오티드 사이에 삽입하여 바이러스 RNA이 정확하게 절단되게 하였다. 구조하는 동안에 슈왈츠 백신이 보증되지 않은 세포에 적응하는 것을 방지하기 위해 유전자조작된 cDNA로 감염시킨 헬퍼 세포를 이 백신이 원래 선별되어 현재 제조된 CEF와 공동배양하였다. 구조된 바이러스를 CEF에서 2회 패시지 시키고 그 게놈을 완전히 서열 분석하였다. 서열을 원 바이러스와 비교한 결과 돌연변이가 발견되지 않았다. 또한, 구조된 바이러스와 원 슈왈츠 바이러스의 성장 역학 및 수율은 동일했다.
슈왈츠 바이러스를 또한 MV의 복제를 허용하는 베로 세포와 감염된 헬퍼 세포를 공동 배양한 다음에 구조하였다. 그러나 이 경우에는 베로 세포상에서 두 패시지를 거친 후 바이러스 융합 단백질 (F)에서 두개의 돌연변이가 발견되었다. 이 신속한 적응은 베로 세포상에서 훨씬 더 많은 퓨소제닉(fusogenic) 표현형과 상관 관계를 갖는다. 반대로, 구조된 슈왈츠 MV는 CEF상에서는 퓨소제닉이 아니었다(드물게 합포체만을 감염된 CEF에서 관찰할 수 있었다). F 단백질에서 두개의 돌연변이가 발생하였다 (266위치에서 G -> R, 365 위치에서 Y->S). 이들 돌연변이는 베로 세포에서 성장한 EdB-태그 바이러스에서 나타난다(도 6). 이들은 또한 할레 (Halle) 균주에서도 존재하며, 에드몬스톤 균주와 큰 관련을 가지며 CEF를 감염시키지 않는다(31). 따라서, 이들 두 돌연변이는 베로 세포에서 융합이 증가하는 것과 상관 관계를 갖는 것으로 보인다. 베로 세포에서 슈왈츠 바이러스의 단 두 패시지를 거친후에 F 단백질이 신속하게 적응하는 사실은 백신이 유전적 일체성을 유지하기 위해서는 CEF에서 성장시켜야 한다는 것을 보여준다.
pTM-MVSchw 플라스미드로부터 구조한 바이러스는 원숭이에서 모체인 슈왈츠 백신과 동일한 면역원성을 갖는다. 이 실험 원숭이가 인간 면역화에 사용하는 것보다 낮은 바이러스 용량을 접종하였다는 것을 주목할 만하다. 따라서, 이 바이러스로 인체 임상 실험을 수행하는 데에는 표준 백신 용량 (104 TCID50)을 사용할 수 있을 것이다. 반대로 상기 클로닝한 EdB-태그 MV는 클로닝한 슈왈츠 MV 와 동일한 용량을 사용했을 때 원숭이에서 면역원성이 없었고 CD46에 트랜스유전성인 마우스에서는 면역원성이 약했다.
슈왈츠 MV 균주가 높은 면역원성을 나타내는 이유는 무엇일까? 생 약독화 바이러스 백신으로 우수한 면역원성을 나타내기 위해서는 면역계를 적절히 개시시키기에 충분히 높은 농도로 조직에서 복제되어야 한다. 슈왈츠 및 EdB-태그 MV 게놈간의 여러 돌연변이는 P/V/C 및 L 유전자에 위치하며, 이는 복제 효율의 차이를 나타낸다. 슈왈츠 MV가 베로 세포에서는 동일한 속도로 복제되지만, 생체내 림프 세포에서는 EdB-태그 MV 보다 더 효율적으로 복제될 수 있다. 생체내에서 효율적으로 복제되기 위해서는 IFN-α/β 반응과 다른 회피 기전을 필요로 한다. EdB-태그 바이러스가 적응하는 베로 세포는 IFN-α/β 자극에 반응하지 않는다. 따라서 EdB-태그 MV가 IFN-α/β 반응 없이 선택되며, 이들은 숙주 방어 기전에 특히 민감할 수 있다. 정말로, 베로 세포에서 패시지를 거친 와일드 타입 MV은 비-IFN-유발체(inducer)에서 IFN-유발체로 바이러스의 표현형이 바뀌는 것을 보였다 (36). 또한 EdB-태그 MV가 CD46 수용체에 대한 트랜스제닉 마우스에서, IFN-α/β 수용체에 대해서도 녹아웃(knock-out)을 나타낼 경우 면역원성을 나타냈다는 사실은 이 바이러스가 특히 IFN-감수성임을 제시한다. 재미있게도, IFN-α/β 반응은 백신에대한 특이적 면역 반응을 개시하는 것을 도와준다. 따라서 우수한 생 백신은 IFN-α/β 반응을 유도하는 동시에 어느정도는 회피하여야 한다. 이러한 이유로 CEF와 같은 강한 IFN-α/β 반응을 나타내는 일차 세포에서 약독화 바이러스 백신을 선별하는 것은 좋은 전략일 수 있다.
IFN 저항성에 기여하는 MV 제품은 확인되지 않았다. 그러나, 센다이 (Sendai) 바이러스에 밀접하게 관련된 비구조적 C 단백질이 IFN-유도 항바이러스 상태에 대해 역작용하는 것으로 나타났다(37). EdB-태그 P/V/C 유전자에서 발견한 에드몬스톤 서브그룹과 무관한 5개의 돌연변이가 원숭이의 낮은 면역원성의 원인이 될 수 있다. 한편, 베로 세포에서 슈왈츠 바이러스를 패시지 시킴으로써 F 단백질에서 발생한 두 돌연변이는 면역능에 영향을 미치지 않았고, 이는 바이러스 외피 단백질의 퓨소제닉성은 면역원성에 현저한 역할을 하지 않을 수 있다는 것을 보여준다.
게놈의 상이한 위치에서 두 ATU를 도입하여 외래 유전자를 발현시키기 위해 pTM-MVSchw 플라스미드를 조작하였다. 구조된 슈왈츠 재조합 MV는 녹색발광 단백질을 발현했으며, 이는 이 새로운 홍역 백신이 벡터로 기능을 한다는 것을 보여준다. 결론적으로 이 분자 클론은 시드 스톡에 의존할 필요없이 MV 백신을 생산하게 해줄 것이다. ATU로 허가되고 효율적이며 널리 사용되는 백신 균주에 기초하여 재조합 백신을 생산하는 벡터로서 사용할 수 있을 것이다.
참고문헌
1. Andino, R., D. Silvera, S. D. Suggett, P. L. Achacoso, C. J. Miller, D. Baltimore, and M. B. Feinberg. 1994. Engineering poliovirus as a vaccine vector for the expression of diverse antigens. Science. 265:1448
2. Ballart, l., D. Eschle, R. Cattaneo, A. Schmid, M. Metzler, J. Chan, S. PifkoS. A. Udem, and M. A. Billeter. 1990. Infectious measles virus from cloned cDNA. Embo J. 9:379
3. Crotty, S., C. J. Miller, B. L. Lohman, M. R. Neagu, L. Compton, D. Lu, F. X. Lu, L. Fritts, J. D. Lifson, and R. Andino. 2001. Protection against simian immunodeficiency virus vaginal challenge by using Sabin poliovirus vectors. J Virol. 75:7435.
4. Enders, J. F., and T. C. Peebles, 1954. Propagation in tissue cultures od cytopathogenic agents from patients with measles. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 86:277
5. Felsenstein, J. 1989. Cladisties. 5:164
6. Griffin, D., and W. Bellini. 1996. Measles virus, p. 1267In B. Fields, D. Knipe, et al.(ed.), Virology, vol. 2. Lippincott Raven Publishers, Philadelphia.
7. Hilleman.. M. 2002. Current overview of the pathogenesis and prophylaxis of measles with focus on practical implications, Vaccine. 20:651-665.
8. Kobune, F., H. Sakata, and A. Sufiura. 1990. Marmoset lymphoblastoid cells as a sensitive host for isolation of measles virus. J Virol. 64:700
9. Lamb, R, and D. Kolakofsky. 1996. Paramyxoviridae: the viruses ans theb. replication, p.11771199. In B. Fileds, D. Knipe, et al. (ed.), Fields Virology. LippincottPublishers, Philadelphia
10. Page, R. D. 1996. TreeView: an application to display phylogenetic trees on personal computers. Comput Appi Biosci. 12:357~358.
11. Palese, P. 1998. RNA virus vectors: where are we and where do we need to go? Proc Natl Acad Sci U S A. 95:12750
12. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 1999. Enhanced measles virus cDNA rescue and gene expression after heat shock. J Virol. 73:3560
13. Parks, C. L., R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Analysis of the noncoding regions of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:921
14. Parks, C. L, R. A. Lerch, P. Walpita, H. P. Wang, M. S. Sidhu, and S. A. Udem. 2001. Comparison of predicted amino acid sequences of measles virus strains in the Edmonston vaccine lineage. J Virol. 75:910
15. Racaniello, V. R., and D. Baltimore. 1981. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214:916
16. Radecke, F., and M. Billeter. 1997. Reverse genetics meets the nonsegmented negativestrand RNA viruses. Reviews in Medical Virology. 7:49
17. Radecke, F., P. Spielhofer, H. Schneider, K. Kaelin, M. Huber, K. Dotsch, G. Christiansen, and M. Billeter. 1995. Rescue of measles viruses from cloned DNA. EMBO Journal. 14:5773
18. Singh, M., and M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing biologically active human interleukinJ. Gen. Virol. 80:101
19. Singh, M., R. Cattaneo, and M. Billeter. 1999. A recombinant measles virus expressing hepatitis B virus surface antigen induces humoral immune responses in genetically modified mice. J. Virol. 73:4823
20. Spielhofer, P., T. Bachi, T. Fehr, G. Christiansen, R. Cattaneo, K. Kaelin, M. Billeter, and H. Naim. 1998. Chimeric measles viruses with a foreign envelope. J. Virol. 72:2150
21. Takeda, M., A. Kato, F. Kobune, H. Sakata, Y. Li, T. Shioda, Y. Sakai, M. Asakawa, and Y. Nagai. 1998. Measles virus attenuation associated with transcriptional impediment and a few amino acid changes in the polymerase and accessory proteins. J Virol. 72:8690
22. Takeuchi, K., N. Miyajima, F. Kobune, and M. Tashiro. 2000. Comparative nucleotide sequence analyses of the entire genomes of B95a celland vero cellmeasles viruses from the same patient. Virus Genes. 20:253
23. Tangy, F., A. McAllister, and M. Brahic. 1989. Molecular cloning of the complete genome of Theiler's virus, strain GDVII, and production of infectious transcripts. J. Virol. 63:1101
24. Thompson, J. D., D. G. Higgins, and T. J. Gibson. 1994. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positiongap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res. 22:4673
25. Wang, Z., T. Hangartner, L. Cornu, A. Martin, M. Zuniga, M. Billeter, and H Naim. 2001. Recombinant measles viruses expressing heterologus antigens of mumps and simian immunodeficiency viruses. Vaccine. 19:2329
26. Van Binnendijk, R. S., R. W. J. van der Heijden, G. van Amerongen, F. UytdeHaag, and A. D. M. E. Osterhaus. 1994. Viral replication and development of specific immunity in macaques after infection with different measles virus strains. The Journal of infectious Diseases. 170:443
27. Mrkic, B., B. Odermatt, ryL Klein, M. Billeter, J. Pavlovic, and R. Cattaneo. 1999. Lymphatic dissemination and comparative pathology of recombinant measles viruses in genetically modified mice. Journal of Virology. 74:1364
28. Kobune, F., H. Takahashi, K. Terao, T. Ohkawa, Y. Ami, Y. Suzaki, N. Nagata, H. Sakata, K. Yamanouchi, and C. Kai. 1996. Nonhuman primate models if measles. Laboratory Animal Science. 46:315
29. Mrkic, B., J. Pavlovic, T. Rulicke, P. Volpe, C. J. Buchholz, D. Hourcade, J. P. Atkinson, A. Aguzzi, and R. Cattaneo. 1998. Measles virus spread and pathogenesis in genetically modified mice. J Virol. 72:7420
30. Muller, U., U. Steinboff, L. F. L. Reis, S. Hemmi, J. Pavlovic, R. M. Zinkernagel, and M. Aguet. 1994. Functional role of type 1 and type 11 interferons in antiviral defense. Science. 264:1918-
31.Escoffier, C., and D. Gerlier. 1999. Infection of chicken embryonic fibroblasts by measles virus: adaptation at the virus entry level. J Virol. 73:5220
32. Koert J. Stittelaar, Linda S. Wyatt, Rik L. de Swart, Helma W. Vos, Jan Groen, Geert van Arnerongen, Robert S. van Binnendijk, Shamuel Rozenblatt, Bernard Moss, and Albert D. M.E. Osterhaus. May 2000. Protective immunity in macaques vaccinated with a modified vaccinia virus ankarabased measles virus vaccine in the presence of passively acquired antibodies. Journal of Virology. Vol. 74, No. 9: 423 6
33. Yannoutsos, N., J. N. Ijzermans, C. Harkes, F. Bonthuis, C.Y. Zhou, D. White, R.L. Marquet and F. Grosveld. 1996. A membrane cofactor protein transgenic mouse model for the study of discordant xenograft rejection [published erratum appears in Genes Cells 1996 Aug; 1(8): 785]. Genes Cells. 1: 409419.
34. Naniche, D., C. VariorF. Cervoni, T.F. Wild, B. Rossi, C. Rabourdinand D. Gerlier. 1993. Human membrane cofactor protein (CD46) acts as a cellular receptor for measles virus. J. Virol. 67: 6025
35. Buynak, E., R. Weibel, W.J. JE, J. Stokes Jr, and M. Hillenian. 1969. Combined live measles, mumps, and rubella virus vaccines. J. Am. Med. Assoc. 207: 2259
36. Naniche, D., A. Yeh, D. Eto, M. Manchester, R.M. Friedman, and M.B.A. Oldstone. 2000. Evasion of host defenses by measles virus: wildmeasles virus infection interferes with induction of alpha/beta interferon.
37. Garcin, D., P. Latorre, and D. Kotakofsky. 1999. Sendai virus C proteins counteract the interferoninduction of an antiviral state. J. Virol. 73: 6559-6565.
<110> INSTITUT PASTEUR CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE <120> INFECTIOUS cDNA OF AN APPROVED VACCINE STRAIN OF MEASLES VIRUS, USE FOR IMMUNOGENIC COMPOSITIONS <130> IP2004507/FR <150> EP02291551.6 <151> 2002-06-20 <160> 83 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 1 atccgagatg gccacacttt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 2 aaagtgtggc catctcggat 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 3 tgattctggg taccatccta 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 4 taggatggta cccagaatca 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 5 tatgccatgg gagtaggagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 6 actcctactc ccatggcata 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 7 tggcaggaat ctcggaagaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 8 ttcttccgag attcctgcca 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 9 gcatcaagca ctgggttaca 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 10 tgtaacccag tgcttgatgc 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 11 tacaggagtg gacacccgaa 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 12 ttcgggtgtc cactcctgta 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 13 aggacagctg ctgaaggaat 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 14 attccttcag cagctgtcct 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 15 ttgttgagga cagcgattcc 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 16 ggaatcgctg tcctcaacaa 20 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 17 agagtgaagt ctactctgcc 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 18 ggcagagtag acttcactct 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 19 tgacacaagg ccaccaccag 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 20 ctggtggtgg ccttgtgtca 20 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 21 agctcccaga ctcggccatc 20 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 22 gatggccgag tctgggagct 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 23 ccagccatca atcattagtc 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 24 gactaatgat tgatggctgg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 25 agtttacggg accccatatc 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 26 gatatggggt cccgtaaact 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 27 ggaacctaat agccaattgt 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 28 acaattggct attaggttcc 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 29 ctcttcgtca tcaagcaacc 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 30 ggttgcttga tgacgaagag 20 <210> 31 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 31 tcacttggtg tatcaacccg 20 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 32 cgggttgata caccaagtga 20 <210> 33 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 33 aactgtatgg tggctttggg 20 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 34 cccaaagcca ccatacagtt 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 35 tgtgtattgg ctgactatcc 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 36 ggatagtcag ccaatacaca 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 37 atcaggcata cccactagtg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 38 cactagtggg tatgcctgat 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 39 gcacagctcc cagtggtttg 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 40 caaaccactg ggagctgtgc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 41 tcatgagtta actgaagctc 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 42 gagcttcagt taactcatga 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 43 gtcacggagg cttgtagatg 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 44 catctacaag cctccgtgac 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 45 gtactgcctt aattggagat 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 46 atctccaatt aaggcagtac 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 47 tgatgggcta cttgtgtccc 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 48 gggacacaag tagcccatca 20 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 49 acccttactc agcaaatctt 20 <210> 50 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 50 aagatttgct gagtaagggt 20 <210> 51 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 51 tctatgcgag gccaccttat 20 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 52 ataaggtggc ctcgcataga 20 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 53 ttgtccgagt ggcgaggtat 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 54 atacctcgcc actcggacaa 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 55 caattgggca tttgatgtac 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 56 gtacatcaaa tgcccaattg 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 57 gaggctatgt tatctccagc 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 58 gctggagata acatagcctc 20 <210> 59 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 59 agttggcctt gtcgaacaca 20 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 60 tgtgttcgac aaggccaact 20 <210> 61 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 61 ctggacttat aggtcacatc 20 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 62 gatgtgacct ataagtccag 20 <210> 63 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 63 ggtttgaaac gtgagtgggt 20 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 64 acccactcac gtttcaaacc 20 <210> 65 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 65 accaaacaaa gttgggtaag gatagttcaa tc 32 <210> 66 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 66 tatgcggccg ctaatacgac tcactatagg gccaactttg tttggtctga 50 <210> 67 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 67 ggtgacccgg gactccgggt ttcgtcctca cggactcatc agaccaaaca 50 <210> 68 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 68 gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta ag 32 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 69 ggtttgtcct tgtttctttt 20 <210> 70 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 70 accaaacaaa gttgggtaag gatagttcaa tc 32 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 71 attcccttaa ccgcttcacc 20 <210> 72 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 72 ctatggcagc atggtcagaa ata 23 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 73 attgtcgatg gttgggtgct 20 <210> 74 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 74 aaacttaggg ccaaggaaca tac 23 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 75 ggaccctacg tttttcttaa ttctg 25 <210> 76 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 76 agatagggct gctagtgaac caat 24 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 77 atcagcacct gctctatagg tgtaa 25 <210> 78 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 78 gcagcagata attgaatcat ctgtgaggac ttcac 35 <210> 79 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 79 cccggagtaa agaagaatgt gcccccagaa tttgc 35 <210> 80 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 80 ggcacattct tctttactcc gggaacaaaa agttg 35 <210> 81 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: oligonucleotide <400> 81 atagggcccg cggccgcatc cggatatagt tcctcctttc a 41 <210> 82 <211> 18967 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Complete nucleotide sequence of the pTM-MVSChw plasmid (CNCM I-2889) <400> 82 gcggccgcta atacgactca ctatagggcc aactttgttt ggtctgatga gtccgtgagg 60 acgaaacccg gagtcccggg tcaccaaaca aagttgggta aggatagttc aatcaatgat 120 catcttctag tgcacttagg attcaagatc ctattatcag ggacaagagc aggattaggg 180 atatccgaga tggccacact tttaaggagc ttagcattgt tcaaaagaaa caaggacaaa 240 ccacccatta catcaggatc cggtggagcc atcagaggaa tcaaacacat tattatagta 300 ccaatccctg gagattcctc aattaccact cgatccagac ttctggaccg gttggtgagg 360 ttaattggaa acccggatgt gagcgggccc aaactaacag gggcactaat aggtatatta 420 tccttatttg tggagtctcc aggtcaattg attcagagga tcaccgatga ccctgacgtt 480 agcataaggc tgttagaggt tgtccagagt gaccagtcac aatctggcct taccttcgca 540 tcaagaggta ccaacatgga ggatgaggcg gaccaatact tttcacatga tgatccaatt 600 agtagtgatc aatccaggtt cggatggttc gggaacaagg aaatctcaga tattgaagtg 660 caagaccctg agggattcaa catgattctg ggtaccatcc tagcccaaat ttgggtcttg 720 ctcgcaaagg cggttacggc cccagacacg gcagctgatt cggagctaag aaggtggata 780 aagtacaccc aacaaagaag ggtagttggt gaatttagat tggagagaaa atggttggat 840 gtggtgagga acaggattgc cgaggacctc tccttacgcc gattcatggt cgctctaatc 900 ctggatatca agagaacacc cggaaacaaa cccaggattg ctgaaatgat atgtgacatt 960 gatacatata tcgtagaggc aggattagcc agttttatcc tgactattaa gtttgggata 1020 gaaactatgt atcctgctct tggactgcat gaatttgctg gtgagttatc cacacttgag 1080 tccttgatga acctttacca gcaaatgggg gaaactgcac cctacatggt aatcctggag 1140 aactcaattc agaacaagtt cagtgcagga tcataccctc tgctctggag ctatgccatg 1200 ggagtaggag tggaacttga aaactccatg ggaggtttga actttggccg atcttacttt 1260 gatccagcat attttagatt agggcaagag atggtaagga ggtcagctgg aaaggtcagt 1320 tccacattgg catctgaact cggtatcact gccgaggatg caaggcttgt ttcagagatt 1380 gcaatgcata ctactgagga caagatcagt agagcggttg gacccagaca agcccaagta 1440 tcatttctac acggtgatca aagtgagaat gagctaccga gattgggggg caaggaagat 1500 aggagggtca aacagagtcg aggagaagcc agggagagct acagagaaac cgggcccagc 1560 agagcaagtg atgcgagagc tgcccatctt ccaaccggca cacccctaga cattgacact 1620 gcaacggagt ccagccaaga tccgcaggac agtcgaaggt cagctgacgc cctgcttagg 1680 ctgcaagcca tggcaggaat ctcggaagaa caaggctcag acacggacac ccctatagtg 1740 tacaatgaca gaaatcttct agactaggtg cgagaggccg agggccagaa caacatccgc 1800 ctaccatcca tcattgttat aaaaaactta ggaaccaggt ccacacagcc gccagcccat 1860 caaccatcca ctcccacgat tggagccaat ggcagaagag caggcacgcc atgtcaaaaa 1920 cggactggaa tgcatccggg ctctcaaggc cgagcccatc ggctcactgg ccatcgagga 1980 agctatggca gcatggtcag aaatatcaga caacccagga caggagcgag ccacctgcag 2040 ggaagagaag gcaggcagtt cgggtctcag caaaccatgc ctctcagcaa ttggatcaac 2100 tgaaggcggt gcacctcgca tccgcggtca gggacctgga gagagcgatg acgacgctga 2160 aactttggga atccccccaa gaaatctcca ggcatcaagc actgggttac agtgttatta 2220 cgtttatgat cacagcggtg aagcggttaa gggaatccaa gatgctgact ctatcatggt 2280 tcaatcaggc cttgatggtg atagcaccct ctcaggagga gacaatgaat ctgaaaacag 2340 cgatgtggat attggcgaac ctgataccga gggatatgct atcactgacc ggggatctgc 2400 tcccatctct atggggttca gggcttctga tgttgaaact gcagaaggag gggagatcca 2460 cgagctcctg agactccaat ccagaggcaa caactttccg aagcttggga aaactctcaa 2520 tgttcctccg cccccggacc ccggtagggc cagcacttcc gggacaccca ttaaaaaggg 2580 cacagacgcg agattagcct catttggaac ggagatcgcg tctttattga caggtggtgc 2640 aacccaatgt gctcgaaagt caccctcgga accatcaggg ccaggtgcac ctgcggggaa 2700 tgtccccgag tgtgtgagca atgccgcact gatacaggag tggacacccg aatctggtac 2760 cacaatctcc ccgagatccc agaataatga agaaggggga gactattatg atgatgagct 2820 gttctctgat gtccaagata ttaaaacagc cttggccaaa atacacgagg ataatcagaa 2880 gataatctcc aagctagaat cactgctgtt attgaaggga gaagttgagt caattaagaa 2940 gcagatcaac aggcaaaata tcagcatatc caccctggaa ggacacctct caagcatcat 3000 gatcgccatt cctggacttg ggaaggatcc caacgacccc actgcagatg tcgaaatcaa 3060 tcccgacttg aaacccatca taggcagaga ttcaggccga gcactggccg aagttctcaa 3120 gaaacccgtt gccagccgac aactccaagg aatgacaaat ggacggacca gttccagagg 3180 acagctgctg aaggaatttc agctaaagcc gatcgggaaa aagatgagct cagccgtcgg 3240 gtttgttcct gacaccggcc ctgcatcacg cagtgtaatc cgctccatta taaaatccag 3300 ccggctagag gaggatcgga agcgttacct gatgactctc cttgatgata tcaaaggagc 3360 caatgatctt gccaagttcc accagatgct gatgaagata ataatgaagt agctacagct 3420 caacttacct gccaacccca tgccagtcga cccaactagt acaacctaaa tccattataa 3480 aaaacttagg agcaaagtga ttgcctccca aggtccacaa tgacagagac ctacgacttc 3540 gacaagtcgg catgggacat caaagggtcg atcgctccga tacaacccac cacctacagt 3600 gatggcaggc tggtgcccca ggtcagagtc atagatcctg gtctaggcga caggaaggat 3660 gaatgcttta tgtacatgtt tctgctgggg gttgttgagg acagcgattc cctagggcct 3720 ccaatcgggc gagcatttgg gttcctgccc ttaggtgttg gcagatccac agcaaagccc 3780 gaaaaactcc tcaaagaggc cactgagctt gacatagttg ttagacgtac agcagggctc 3840 aatgaaaaac tggtgttcta caacaacacc ccactaactc tcctcacacc ttggagaaag 3900 gtcctaacaa cagggagtgt cttcaacgca aaccaagtgt gcaatgcggt taatctgata 3960 ccgctcgata ccccgcagag gttccgtgtt gtttatatga gcatcacccg tctttcggat 4020 aacgggtatt acaccgttcc tagaagaatg ctggaattca gatcggtcaa tgcagtggcc 4080 ttcaacctgc tggtgaccct taggattgac aaggcgatag gccctgggaa gatcatcgac 4140 aatacagagc aacttcctga ggcaacattt atggtccaca tcgggaactt caggagaaag 4200 aagagtgaag tctactctgc cgattattgc aaaatgaaaa tcgaaaagat gggcctggtt 4260 tttgcacttg gtgggatagg gggcaccagt cttcacatta gaagcacagg caaaatgagc 4320 aagactctcc atgcacaact cgggttcaag aagaccttat gttacccgct gatggatatc 4380 aatgaagacc ttaatcgatt actctggagg agcagatgca agatagtaag aatccaggca 4440 gttttgcagc catcagttcc tcaagaattc cgcatttacg acgacgtgat cataaatgat 4500 gaccaaggac tattcaaagt tctgtagacc gtagtgccca gcaatgcccg aaaacgaccc 4560 ccctcacaat gacagccaga aggcccggac aaaaaagccc cctccgaaag actccacgga 4620 ccaagcgaga ggccagccag cagccgacgg caagcgcgaa caccaggcgg ccccagcaca 4680 gaacagccct gacacaaggc caccaccagc caccccaatc tgcatcctcc tcgtgggacc 4740 cccgaggacc aacccccaag gctgcccccg atccaaacca ccaaccgcat ccccaccacc 4800 cccgggaaag aaacccccag caattggaag gcccctcccc ctcttcctca acacaagaac 4860 tccacaaccg aaccgcacaa gcgaccgagg tgacccaacc gcaggcatcc gactccctag 4920 acagatcctc tctccccggc aaactaaaca aaacttaggg ccaaggaaca tacacaccca 4980 acagaaccca gaccccggcc cacggcgccg cgcccccaac ccccgacaac cagagggagc 5040 ccccaaccaa tcccgccggc tcccccggtg cccacaggca gggacaccaa cccccgaaca 5100 gacccagcac ccaaccatcg acaatccaag acgggggggc ccccccaaaa aaaggccccc 5160 aggggccgac agccagcacc gcgaggaagc ccacccaccc cacacacgac cacggcaacc 5220 aaaccagaac ccagaccacc ctgggccacc agctcccaga ctcggccatc accccgcaga 5280 aaggaaaggc cacaacccgc gcaccccagc cccgatccgg cggggagcca cccaacccga 5340 accagcaccc aagagcgatc cccgaaggac ccccgaaccg caaaggacat cagtatccca 5400 cagcctctcc aagtcccccg gtctcctcct cttctcgaag ggaccaaaag atcaatccac 5460 cacacccgac gacactcaac tccccacccc taaaggagac accgggaatc ccagaatcaa 5520 gactcatcca atgtccatca tgggtctcaa ggtgaacgtc tctgccatat tcatggcagt 5580 actgttaact ctccaaacac ccaccggtca aatccattgg ggcaatctct ctaagatagg 5640 ggtggtagga ataggaagtg caagctacaa agttatgact cgttccagcc atcaatcatt 5700 agtcataaaa ttaatgccca atataactct cctcaataac tgcacgaggg tagagattgc 5760 agaatacagg agactactga gaacagtttt ggaaccaatt agagatgcac ttaatgcaat 5820 gacccagaat ataagaccgg ttcagagtgt agcttcaagt aggagacaca agagatttgc 5880 gggagtagtc ctggcaggtg cggccctagg cgttgccaca gctgctcaga taacagccgg 5940 cattgcactt caccagtcca tgctgaactc tcaagccatc gacaatctga gagcgagcct 6000 ggaaactact aatcaggcaa ttgagacaat cagacaagca gggcaggaga tgatattggc 6060 tgttcagggt gtccaagact acatcaataa tgagctgata ccgtctatga accaactatc 6120 ttgtgattta atcggccaga agctcgggct caaattgctc agatactata cagaaatcct 6180 gtcattattt ggccccagtt tacgggaccc catatctgcg gagatatcta tccaggcttt 6240 gagctatgcg cttggaggag acatcaataa ggtgttagaa aagctcggat acagtggagg 6300 tgatttactg ggcatcttag agagcggagg aataaaggcc cggataactc acgtcgacac 6360 agagtcctac ttcattgtcc tcagtatagc ctatccgacg ctgtccgaga ttaagggggt 6420 gattgtccac cggctagagg gggtctcgta caacataggc tctcaagagt ggtataccac 6480 tgtgcccaag tatgttgcaa cccaagggta ccttatctcg aattttgatg agtcatcgtg 6540 tactttcatg ccagagggga ctgtgtgcag ccaaaatgcc ttgtacccga tgagtcctct 6600 gctccaagaa tgcctccggg ggtacaccaa gtcctgtgct cgtacactcg tatccgggtc 6660 ttttgggaac cggttcattt tatcacaagg gaacctaata gccaattgtg catcaatcct 6720 ttgcaagtgt tacacaacag gaacgatcat taatcaagac cctgacaaga tcctaacata 6780 cattgctgcc gatcactgcc cggtagtcga ggtgaacggc gtgaccatcc aagtcgggag 6840 caggaggtat ccagacgctg tgtacttgca cagaattgac ctcggtcctc ccatatcatt 6900 ggagaggttg gacgtaggga caaatctggg gaatgcaatt gctaagttgg aggatgccaa 6960 ggaattgttg gagtcatcgg accagatatt gaggagtatg aaaggtttat cgagcactag 7020 catagtctac atcctgattg cagtgtgtct tggagggttg atagggatcc ccgctttaat 7080 atgttgctgc agggggcgtt gtaacaaaaa gggagaacaa gttggtatgt caagaccagg 7140 cctaaagcct gatcttacgg gaacatcaaa atcctatgta aggtcgctct gatcctctac 7200 aactcttgaa acacaaatgt cccacaagtc tcctcttcgt catcaagcaa ccaccgcacc 7260 cagcatcaag cccacctgaa attatctccg gcttccctct ggccgaacaa tatcggtagt 7320 taatcaaaac ttagggtgca agatcatcca caatgtcacc acaacgagac cggataaatg 7380 ccttctacaa agataacccc catcccaagg gaagtaggat agtcattaac agagaacatc 7440 ttatgattga tagaccttat gttttgctgg ctgttctgtt tgtcatgttt ctgagcttga 7500 tcgggttgct agccattgca ggcattagac ttcatcgggc agccatctac accgcagaga 7560 tccataaaag cctcagcacc aatctagatg taactaactc aatcgagcat caggtcaagg 7620 acgtgctgac accactcttc aaaatcatcg gtgatgaagt gggcctgagg acacctcaga 7680 gattcactga cctagtgaaa ttaatctctg acaagattaa attccttaat ccggataggg 7740 agtacgactt cagagatctc acttggtgta tcaacccgcc agagagaatc aaattggatt 7800 atgatcaata ctgtgcagat gtggctgctg aagagctcat gaatgcattg gtgaactcaa 7860 ctctactgga gaccagaaca accaatcagt tcctagctgt ctcaaaggga aactgctcag 7920 ggcccactac aatcagaggt caattctcaa acatgtcgct gtccctgtta gacttgtatt 7980 taggtcgagg ttacaatgtg tcatctatag tcactatgac atcccaggga atgtatgggg 8040 gaacttacct agtggaaaag cctaatctga gcagcaaaag gtcagagttg tcacaactga 8100 gcatgtaccg agtgtttgaa gtaggtgtta tcagaaatcc gggtttgggg gctccggtgt 8160 tccatatgac aaactatctt gagcaaccag tcagtaatga tctcagcaac tgtatggtgg 8220 ctttggggga gctcaaactc gcagcccttt gtcacgggga agattctatc acaattccct 8280 atcagggatc agggaaaggt gtcagcttcc agctcgtcaa gctaggtgtc tggaaatccc 8340 caaccgacat gcaatcctgg gtccccttat caacggatga tccagtgata gacaggcttt 8400 acctctcatc tcacagaggt gttatcgctg acaatcaagc aaaatgggct gtcccgacaa 8460 cacgaacaga tgacaagttg cgaatggaga catgcttcca acaggcgtgt aagggtaaaa 8520 tccaagcact ctgcgagaat cccgagtggg caccattgaa ggataacagg attccttcat 8580 acggggtctt gtctgttgat ctgagtctga cagttgagct taaaatcaaa attgcttcgg 8640 gattcgggcc attgatcaca cacggttcag ggatggacct atacaaatcc aaccacaaca 8700 atgtgtattg gctgactatc ccgccaatga agaacctagc cttaggtgta atcaacacat 8760 tggagtggat accgagattc aaggttagtc cctacctctt cactgtccca attaaggaag 8820 caggcgaaga ctgccatgcc ccaacatacc tacctgcgga ggtggatggt gatgtcaaac 8880 tcagttccaa tctggtgatt ctacctggtc aagatctcca atatgttttg gcaacctacg 8940 atacttccag ggttgaacat gctgtggttt attacgttta cagcccaagc cgctcatttt 9000 cttactttta tccttttagg ttgcctataa agggggtccc catcgaatta caagtggaat 9060 gcttcacatg ggaccaaaaa ctctggtgcc gtcacttctg tgtgcttgcg gactcagaat 9120 ctggtggaca tatcactcac tctgggatgg tgggcatggg agtcagctgc acagtcaccc 9180 gggaagatgg aaccaatcgc agatagggct gctagtgaac caatcacatg atgtcaccca 9240 gacatcaggc atacccacta gtgtgaaata gacatcagaa ttaagaaaaa cgtagggtcc 9300 aagtggttcc ccgttatgga ctcgctatct gtcaaccaga tcttataccc tgaagttcac 9360 ctagatagcc cgatagttac caataagata gtagccatcc tggagtatgc tcgagtccct 9420 cacgcttaca gcctggagga ccctacactg tgtcagaaca tcaagcaccg cctaaaaaac 9480 ggattttcca accaaatgat tataaacaat gtggaagttg ggaatgtcat caagtccaag 9540 cttaggagtt atccggccca ctctcatatt ccatatccaa attgtaatca ggatttattt 9600 aacatagaag acaaagagtc aacgaggaag atccgtgaac tcctcaaaaa ggggaattcg 9660 ctgtactcca aagtcagtga taaggttttc caatgcttaa gggacactaa ctcacggctt 9720 ggcctaggct ccgaattgag ggaggacatc aaggagaaag ttattaactt gggagtttac 9780 atgcacagct cccagtggtt tgagcccttt ctgttttggt ttacagtcaa gactgagatg 9840 aggtcagtga ttaaatcaca aacccatact tgccatagga ggagacacac acctgtattc 9900 ttcactggta gttcagttga gttgctaatc tctcgtgacc ttgttgctat aatcagtaaa 9960 gagtctcaac atgtatatta cctgacattt gaactggttt tgatgtattg tgatgtcata 10020 gaggggaggt taatgacaga gaccgctatg actattgatg ctaggtatac agagcttcta 10080 ggaagagtca gatacatgtg gaaactgata gatggtttct tccctgcact cgggaatcca 10140 acttatcaaa ttgtagccat gctggagcct ctttcacttg cttacctgca gctgagggat 10200 ataacagtag aactcagagg tgctttcctt aaccactgct ttactgaaat acatgatgtt 10260 cttgaccaaa acgggttttc tgatgaaggt acttatcatg agttaactga agctctagat 10320 tacattttca taactgatga catacatctg acaggggaga ttttctcatt tttcagaagt 10380 ttcggccacc ccagacttga agcagtaacg gctgctgaaa atgttaggaa atacatgaat 10440 cagcctaaag tcattgtgta tgagactctg atgaaaggtc atgccatatt ttgtggaatc 10500 ataatcaacg gctatcgtga caggcacgga ggcagttggc caccgctgac cctccccctg 10560 catgctgcag acacaatccg gaatgctcaa gcttcaggtg aagggttaac acatgagcag 10620 tgcgttgata actggaaatc ttttgctgga gtgaaatttg gctgctttat gcctcttagc 10680 ctggatagtg atctgacaat gtacctaaag gacaaggcac ttgctgctct ccaaagggaa 10740 tgggattcag tttacccgaa agagttcctg cgttacgacc ctcccaaggg aaccgggtca 10800 cggaggcttg tagatgtttt ccttaatgat tcgagctttg acccatatga tgtgataatg 10860 tatgttgtaa gtggagctta cctccatgac cctgagttca acctgtctta cagcctgaaa 10920 gaaaaggaga tcaaggaaac aggtagactt tttgctaaaa tgacttacaa aatgagggca 10980 tgccaagtga ttgctgaaaa tctaatctca aacgggattg gcaaatattt taaggacaat 11040 gggatggcca aggatgagca cgatttgact aaggcactcc acactctagc tgtctcagga 11100 gtccccaaag atctcaaaga aagtcacagg ggggggccag tcttaaaaac ctactcccga 11160 agcccagtcc acacaagtac caggaacgtg agagcagcaa aagggtttat agggttccct 11220 caagtaattc ggcaggacca agacactgat catccggaga atatggaagc ttacgagaca 11280 gtcagtgcat ttatcacgac tgatctcaag aagtactgcc ttaattggag atatgagacc 11340 atcagcttgt ttgcacagag gctaaatgag atttacggat tgccctcatt tttccagtgg 11400 ctgcataaga ggcttgagac ctctgtcctg tatgtaagtg accctcattg cccccccgac 11460 cttgacgccc atatcccgtt atataaagtc cccaatgatc aaatcttcat taagtaccct 11520 atgggaggta tagaagggta ttgtcagaag ctgtggacca tcagcaccat tccctatcta 11580 tacctggctg cttatgagag cggagtaagg attgcttcgt tagtgcaagg ggacaatcag 11640 accatagccg taacaaaaag ggtacccagc acatggccct acaaccttaa gaaacgggaa 11700 gctgctagag taactagaga ttactttgta attcttaggc aaaggctaca tgatattggc 11760 catcacctca aggcaaatga gacaattgtt tcatcacatt tttttgtcta ttcaaaagga 11820 atatattatg atgggctact tgtgtcccaa tcactcaaga gcatcgcaag atgtgtattc 11880 tggtcagaga ctatagttga tgaaacaagg gcagcatgca gtaatattgc tacaacaatg 11940 gctaaaagca tcgagagagg ttatgaccgt taccttgcat attccctgaa cgtcctaaaa 12000 gtgatacagc aaattctgat ctctcttggc ttcacaatca attcaaccat gacccgggat 12060 gtagtcatac ccctcctcac aaacaacgac ctcttaataa ggatggcact gttgcccgct 12120 cctattgggg ggatgaatta tctgaatatg agcaggctgt ttgtcagaaa catcggtgat 12180 ccagtaacat catcaattgc tgatctcaag agaatgattc tcgcctcact aatgcctgaa 12240 gagaccctcc atcaagtaat gacacaacaa ccgggggact cttcattcct agactgggct 12300 agcgaccctt actcagcaaa tcttgtatgt gtccagagca tcactagact cctcaagaac 12360 ataactgcaa ggtttgtcct gatccatagt ccaaacccaa tgttaaaagg attattccat 12420 gatgacagta aagaagagga cgagggactg gcggcattcc tcatggacag gcatattata 12480 gtacctaggg cagctcatga aatcctggat catagtgtca caggggcaag agagtctatt 12540 gcaggcatgc tggataccac aaaaggcttg attcgagcca gcatgaggaa gggggggtta 12600 acctctcgag tgataaccag attgtccaat tatgactatg aacaattcag agcagggatg 12660 gtgctattga caggaagaaa gagaaatgtc ctcattgaca aagagtcatg ttcagtgcag 12720 ctggcgagag ctctaagaag ccatatgtgg gcgaggctag ctcgaggacg gcctatttac 12780 ggccttgagg tccctgatgt actagaatct atgcgaggcc accttattcg gcgtcatgag 12840 acatgtgtca tctgcgagtg tggatcagtc aactacggat ggttttttgt cccctcgggt 12900 tgccaactgg atgatattga caaggaaaca tcatccttga gagtcccata tattggttct 12960 accactgatg agagaacaga catgaagctt gccttcgtaa gagccccaag tcgatccttg 13020 cgatctgctg ttagaatagc aacagtgtac tcatgggctt acggtgatga tgatagctct 13080 tggaacgaag cctggttgtt ggctaggcaa agggccaatg tgagcctgga ggagctaagg 13140 gtgatcactc ccatctcaac ttcgactaat ttagcgcata ggttgaggga tcgtagcact 13200 caagtgaaat actcaggtac atcccttgtc cgagtggcga ggtataccac aatctccaac 13260 gacaatctct catttgtcat atcagataag aaggttgata ctaactttat ataccaacaa 13320 ggaatgcttc tagggttggg tgttttagaa acattgtttc gactcgagaa agataccgga 13380 tcatctaaca cggtattaca tcttcacgtc gaaacagatt gttgcgtgat cccgatgata 13440 gatcatccca ggatacccag ctcccgcaag ctagagctga gggcagagct atgtaccaac 13500 ccattgatat atgataatgc acctttaatt gacagagatg caacaaggct atacacccag 13560 agccatagga ggcaccttgt ggaatttgtt acatggtcca caccccaact atatcacatt 13620 ttagctaagt ccacagcact atctatgatt gacctggtaa caaaatttga gaaggaccat 13680 atgaatgaaa tttcagctct cataggggat gacgatatca atagtttcat aactgagttt 13740 ctgctcatag agccaagatt attcactatc tacttgggcc agtgtgcggc catcaattgg 13800 gcatttgatg tacattatca tagaccatca gggaaatatc agatgggtga gctgttgtca 13860 tcgttccttt ctagaatgag caaaggagtg tttaaggtgc ttgtcaatgc tctaagccac 13920 ccaaagatct acaagaaatt ctggcattgt ggtattatag agcctatcca tggtccttca 13980 cttgatgctc aaaacttgca cacaactgtg tgcaacatgg tttacacatg ctatatgacc 14040 tacctcgacc tgttgttgaa tgaagagtta gaagagttca catttctctt gtgtgaaagc 14100 gacgaggatg tagtaccgga cagattcgac aacatccagg caaaacactt atgtgttctg 14160 gcagatttgt actgtcaacc agggacctgc ccaccaattc gaggtctaag accggtagag 14220 aaatgtgcag ttctaaccga ccatatcaag gcagaggcta tgttatctcc agcaggatct 14280 tcgtggaaca taaatccaat tattgtagac cattactcat gctctctgac ttatctccgg 14340 cgaggatcga tcaaacagat aagattgaga gttgatccag gattcatttt cgacgccctc 14400 gctgaggtaa atgtcagtca gccaaagatc ggcagcaaca acatctcaaa tatgagcatc 14460 aaggctttca gacccccaca cgatgatgtt gcaaaattgc tcaaagatat caacacaagc 14520 aagcacaatc ttcccatttc agggggcaat ctcgccaatt atgaaatcca tgctttccgc 14580 agaatcgggt tgaactcatc tgcttgctac aaagctgttg agatatcaac attaattagg 14640 agatgccttg agccagggga ggacggcttg ttcttgggtg agggatcggg ttctatgttg 14700 atcacttata aagagatact taaactaaac aagtgcttct ataatagtgg ggtttccgcc 14760 aattctagat ctggtcaaag ggaattagca ccctatccct ccgaagttgg ccttgtcgaa 14820 cacagaatgg gagtaggtaa tattgtcaaa gtgctcttta acgggaggcc cgaagtcacg 14880 tgggtaggca gtgtagattg cttcaatttc atagttagta atatccctac ctctagtgtg 14940 gggtttatcc attcagatat agagaccttg cctgacaaag atactataga gaagctagag 15000 gaattggcag ccatcttatc gatggctctg ctcctgggca aaataggatc aatactggtg 15060 attaagctta tgcctttcag cggggatttt gttcagggat ttataagtta tgtagggtct 15120 cattatagag aagtgaacct tgtataccct agatacagca acttcatctc tactgaatct 15180 tatttggtta tgacagatct caaggctaac cggctaatga atcctgaaaa gattaagcag 15240 cagataattg aatcatctgt gaggacttca cctggactta taggtcacat cctatccatt 15300 aagcaactaa gctgcataca agcaattgtg ggagacgcag ttagtagagg tgatatcaat 15360 cctactctga aaaaacttac acctatagag caggtgctga tcaattgcgg gttggcaatt 15420 aacggaccta agctgtgcaa agaattgatc caccatgatg ttgcctcagg gcaagatgga 15480 ttgcttaatt ctatactcat cctctacagg gagttggcaa gattcaaaga caaccaaaga 15540 agtcaacaag ggatgttcca cgcttacccc gtattggtaa gtagcaggca acgagaactt 15600 atatctagga tcacccgcaa attctggggg cacattcttc tttactccgg gaacaaaaag 15660 ttgataaata agtttatcca gaatctcaag tccggctatc tgatactaga cttacaccag 15720 aatatcttcg ttaagaatct atccaagtca gagaaacaga ttattatgac ggggggtttg 15780 aaacgtgagt gggtttttaa ggtaacagtc aaggagacca aagaatggta taagttagtc 15840 ggatacagtg ccctgattaa ggactaattg gttgaactcc ggaaccctaa tcctgcccta 15900 ggtggttagg cattatttgc aatatattaa agaaaacttt gaaaatacga agtttctatt 15960 cccagctttg tctggtggcc ggcatggtcc cagcctcctc gctggcgccg gctgggcaac 16020 attccgaggg gaccgtcccc tcggtaatgg cgaatgggac gcggccgatc cggctgctaa 16080 caaagcccga aaggaagctg agttggctgc tgccaccgct gagcaataac tagcataacc 16140 ccttggggcc tctaaacggg tcttgagggg ttttttgctg aaaggaggaa ctatatccgg 16200 atgcggccgc gggccctatg gtacccagct tttgttccct ttagtgaggg ttaattccga 16260 gcttggcgta atcatggtca tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc 16320 cacacaacat aggagccgga agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgaggt 16380 aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc 16440 agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt 16500 ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag 16560 ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca 16620 tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt 16680 tccataggct cggcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc 16740 gaaacccgac aggactataa agataccagg cgttcccccc tggaagctcc ctcgtgcgct 16800 ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg 16860 tggcgctttc tcaatgctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca 16920 agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact 16980 atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta 17040 acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta 17100 actacggcta cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct 17160 tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt 17220 tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga 17280 tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca 17340 tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat 17400 caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg 17460 cacctatctc agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactg cccgtcgtgt 17520 agataactac gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag 17580 acccacgctc accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc 17640 gcagaagtgg tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag 17700 ctagagtaag tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca 17760 tcgtggtgtc acgctcgtcg tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa 17820 ggcgagttac atgatccccc atgttgtgaa aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga 17880 tcgttgtcag aagtaagttg gccgcagtgt tatcactcat gcttatggca gcactgcata 17940 attctcttac tgtcatgcca tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca 18000 agtcattctg agaatagtgt atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg 18060 ataataccgc gccacatagc agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg 18120 ggcgaaaact ctcaaggatc ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg 18180 cacccaactg atcttcagca tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag 18240 gaaggcaaaa tgccgcaaaa aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac 18300 tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 18360 tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag 18420 tgccacctga aattgtaaac gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa 18480 tcagctcatt ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat 18540 agaccgagat agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg 18600 tggactccaa cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac 18660 catcacccta atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta 18720 aagggagccc ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag 18780 ggaagaaagc gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg 18840 taaccaccac acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcccat tcgccattca 18900 ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagccac 18960 cgcggtg 18967 <210> 83 <211> 843 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: ATU sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(85) <223> additional sequence (copy of the N-P intergenic region of measles virus) plus cloning sites <220> <221> misc_feature <222> (806)..(843) <223> additional sequence (copy of the N-P intergenic region of measles virus) plus cloning site <220> <221> misc_feature <222> (834) <223> substituted C represents the mutation which distinguishes normal ATU from bis (in pTM-MVSchw2-gfp and pTM-MVSchw2-GFPbis) <220> <221> misc_feature <222> (86)..(805) <223> inserted enhanced GFP sequence <400> 83 actagcctac cctccatcat tgttataaaa aacttaggaa ccaggtccac acagccgcca 60 gcccatcaac gcgtacgtag cgcgcatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt 120 ggtgcccatc ctggtcgagc tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg 180 cgagggcgag ggcgatgcca cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg 240 caagctgccc gtgccctggc ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt 300 cagccgctac cccgaccaca tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg 360 ctacgtccag gagcgcacca tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga 420 ggtgaagttc gagggcgaca ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa 480 ggaggacggc aacatcctgg ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta 540 tatcatggcc gacaagcaga agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat 600 cgaggacggc agcgtgcagc tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg 660 ccccgtgctg ctgcccgaca accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc 720 caacgagaag cgcgatcaca tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct 780 cggcatggac gagctgtaca agtagtgagc gcgcagcgct gacgtctcgc gatcgatgct 840 agc 843

Claims (41)

  1. 허가된 백신 균주로부터 유래하는 홍역 바이러스 (MV)의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 cDNA 분자.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 허가된 MV 백신 균주는 슈왈츠 균주 또는 모라텐 균주임을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  3. 제1항 또는 2항 중 어느 한 항에 있어서,
    cDNA 분자로부터 시작하는 안티게놈성 (+) RNA 쇄의 전사에 적합한 이종성 발현 제어 서열에 의해 제허되는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 cDNA의 상기 이종성 발현 제어 서열은 T7 프로모터 및 T7 터미네이터 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  5. 제1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 5'-말단에는, 허가된 MV 백신 균주의 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 첫 번째 뉴클레오티드에 인접하여 해머헤드 리보자임 서열이 뒤따라오는 GGG 모티프를 포함하며, 3'-말단에는, 완전한 길이 안티게놈성 (+)RNA 쇄를 암호화하는 상기 뉴클레오티드 서열의 마지막 뉴클레오티드에 인접하여 간염 델타 바이러스 리보자임 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  6. 제1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 허가된 MV 백신 균주의 감염 바이러스 입자를 생산할 수 있고, 헬퍼 세포에서 전사에 필요한 단백질을 발현할 수 있으며, 바이러스 입자 조립을 할 수 있는 조건 하에서 상기 cDNA로부터 홍역 바이러스의 RNA 게놈-서열을 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  7. 제1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드에서 복제할 수 있는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  8. 제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서,
    2002년 6월 12일에 기탁번호 I-2889로 CNCM에 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw 에 포함되는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  9. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    도 5에 도시된 뉴클레오티드 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  10. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 83에서 뉴클레오티드 15977까지의 연장된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  11. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 29에서 뉴클레오티드 16202까지 또는 도 5에 도시된 서열의 뉴클레오티드 29에서 뉴클레오티드 15977까지의 연장된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  12. 제1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드 pTM-MVSchw 서열의 뉴클레오티드 26에서 뉴클레오티드 16202까지의 연장된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  13. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    플라스미드 pTM-MVSchw 서열의 뉴클레오티드 9에서 뉴클레오티드 16202까지의 연장된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  14. 제1항에 있어서,
    2002년 6월 12일에 기탁번호 I-2889로 CNCM에 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw 에 포함된 삽입체로서, 완전한 길이의 안티게놈성 (+)RNA 쇄의 뉴클레오티드 서열을 암호화하는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  15. 제1항 내지 14항 중 어느 한 항에 있어서,
    홍역 바이러스의 바이러스성 입자로부터 정제한 바이러스성 RNA의 역전사 제조물인 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  16. 제1항 내지 15항 중 어느 한 항에 있어서,
    생성된 cDNA가 6의 법칙에 부합될 경우, 허가된 MV 백신 균주의 (+)RNA 쇄에 대한 수 개의 뉴클레오티드를 삭제함으로써 변형되는 것을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  17. 제1항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서,
    생체에 투여할 경우, 적어도 하나의 홍역 바이러스 항원에 대한 면역 반응을 유발할 수 있는 것임을 특징으로 하는 cDNA 분자.
  18. 제1항 내지 17항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 분자를 포함하고,
    추가로 재조합 cDNA가 추가로 6의 법칙에 부합되는 이종성 아미노산 서열을 발현할 수 있는 이종성 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 cDNA 분자.
  19. 제18항에 있어서,
    추가로 이종성 DNA 서열을 클로닝하는데 사용하는 추가 전사 단위 (ATU)를 포함하는 것을 특징으로 하는 재조합 cDNA 분자.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 추가 전사 단위는 홍역 바이러스의 N 유전자의 업스트림 또는 홍역 바이러스의 P와 M 유전자 사이, 또는 H와 L 유전자 사이에서 클로닝되는 것을 특징으로 하는 재조합 cDNA 분자.
  21. 제19항 또는 20항에 있어서,
    상기 이종성 DNA 서열은 병원체의 면역원성 서열에 대해서 암호화하는 것을 특징으로 하는 재조합 cDNA 분자.
  22. 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 분자를 포함하는 벡터.
  23. 제22항에 있어서,
    2002년 6월 12일에 기탁번호 I-2889로 CNCM에 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw 인 것을 특징으로 하는 벡터.
  24. 제22항에 있어서,
    재조합 cDNA가 추가로 6의 법칙에 부합되도록 삽입된 이종성 DNA 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
  25. 제24항에 있어서,
    상기 cDNA 및 이종성 DNA 서열이 레플리콘 안에 포함되며 상기 레플리콘은 6의 법칙에 부합되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  26. 제24항 또는 25항에 있어서,
    상기 이종성 DNA 서열이 상기 cDNA 분자로 클로닝되는 추가 전사 단위 (ATU)안에 삽입되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 ATU는 cDNA 분자의 5' 영역 안에서 클로닝되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  28. 제26항 또는 27항에 있어서,
    상기 ATU는 cDNA 분자안에 포함된 홍역 바이러스의 M 유전자로부터 업스트림에 클로닝되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  29. 제26항 또는 27항에 있어서,
    상기 ATU는 cDNA 분자안에 포함된 홍역 바이러스의 N과 P 유전자 사이에 클로닝되는 것을 특징으로 하는 벡터.
  30. 제29항에 있어서,
    CNCM에 기탁번호 I-2890로 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw2-gfp 또는 CNCM에 기탁번호 I-3034로 기탁된 플라스미드 pTM-MVSchw2-GFPbis인 것을 특징으로 하는 벡터.
  31. 1) 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 또는 상기 cDNA로부터 시작하여 바이러스성 입자 조립을 할 수 있는 조건 하에서 홍역 바이러스의 안티게놈성 (+)RNA 서열의 전사, 복제 및 인켑시데이션에 필요한 단백질도 발현할 수 있는 헬퍼 세포주에서 제22항 내지 29항 중 어느 한 항에 따르는 벡터를 발현하는 단계; 및
    2) 상기 발현된 바이러스 입자를 회수하는 단계를 포함하는 감염성 홍역 바이러스 입자의 제조 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    1) 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 또는 제22항 내지 30항 중 어느 한 항에 따르는 벡터로 헬퍼 세포를 감염시키며, 상기 헬퍼 세포는 RNA 폴리머라제를 발현하고 MV 바이러스의 N, P 및 L 단백질을 발현하도록 헬퍼 기능을 발현할 수 있는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 상기 감염된 헬퍼 세포를 cDNA 이 유래하는 MV 백신 균주의 패시지에 적합한 패시지 거친 세포와 공동배양하는 단계; 및
    3) 생성된 감염성 MV 바이러스성 입자를 회수하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  33. 제31항 또는 32항에 있어서,
    상기 감염 단계 다음에 신선한 배지로 감염 배지를 교체하고 배양전에 열 쇼크를 주는 것을 특징으로 하는 방법.
  34. 제31항 또는 32항에 있어서,
    상기 헬퍼 세포는 인간 태아 신장 세포주 293 (ATCC CRL-1573)로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
  35. 제31항 또는 32항에 있어서,
    패시지에 적합한 세포는 CEF 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  36. 제31항 내지 35항 중 어느 한항에 있어서,
    백신 조성물에 활성 주성분으로서 사용하기에 적합한 감염성 홍역 바이러스의 생산에 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
  37. 활성 주성분이 상기 청구항중 한 항에 따르는 방법으로 얻어진 감염성 홍역 바이러스성 입자를 포함하는 면역원성 조성물.
  38. 활성 주성분이 제1항 내지 21항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 분자 또는 제23항 내지 30항 중 어느 한 항에 따르는 벡터로부터 헬퍼-세포-기초 구조 시스템에서 구조한 홍역 바이러스성 입자를 포함하는 백신 조성물.
  39. 제37항 또는 38항에 있어서,
    홍역 바이러스에 대하여 보호하는 데에 적합한 것을 특징으로 하는 면역원성 조성물.
  40. 제37항에 있어서,
    홍역 바이러스 및 면역원성 서열이 유래한 병원체에 대하여 보호하는 데에 적합한 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제1항 내지30항 중 어느 한 항에 따르는 cDNA 분자 및 RNA 바이러스의 DNA 서열을 포함하며, 홍역 바이러스나 상기 RNA 바이러스에 대해서, 또는 홍역 바이러스 및 RNA 바이러스 모두에 대해서 생체내 체액성 및/또는 세포성 반응을 유발할 수 있는 재조합 모노네가비랄레스(mononegavirales) 바이러스.
KR1020047020803A 2002-06-20 2003-06-20 홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및면역학적 조성물로서의 용도 KR101227128B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP02291551A EP1375512B1 (en) 2002-06-20 2002-06-20 Infectious cDNA of an approved vaccine strain of measles virus. Use for immunogenic compositions
EP02291551.6 2002-06-20
PCT/EP2003/007145 WO2004000876A1 (en) 2002-06-20 2003-06-20 INFECTIOUS cDNA OF AN APPROVED VACCINE STRAIN OF MEASLES VIRUS, USE FOR IMMUNOGENIC COMPOSITIONS

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20050058288A true KR20050058288A (ko) 2005-06-16
KR101227128B1 KR101227128B1 (ko) 2013-01-29

Family

ID=29716946

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020047020803A KR101227128B1 (ko) 2002-06-20 2003-06-20 홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및면역학적 조성물로서의 용도

Country Status (15)

Country Link
US (3) US9005961B2 (ko)
EP (5) EP2110382A1 (ko)
KR (1) KR101227128B1 (ko)
CN (1) CN100577683C (ko)
AT (1) ATE437175T1 (ko)
AU (1) AU2003266950A1 (ko)
BR (1) BRPI0312173B8 (ko)
CA (1) CA2489052C (ko)
CY (1) CY1109506T1 (ko)
DE (1) DE60233038D1 (ko)
DK (2) DK1375512T3 (ko)
ES (2) ES2330309T3 (ko)
HK (1) HK1061568A1 (ko)
PT (1) PT1375512E (ko)
WO (1) WO2004000876A1 (ko)

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1201750A1 (en) 2000-10-26 2002-05-02 Genopoietic Synthetic viruses and uses thereof
ATE437175T1 (de) * 2002-06-20 2009-08-15 Pasteur Institut Infektiöse cdna eines zugelassenen impfstammes des masern virus. verwendung in immunogenen zusammensetzungen
ES2427139T3 (es) * 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
WO2009005917A2 (en) * 2007-05-29 2009-01-08 Vical Incorporated Methods of treating measles infectious disease in mammals
EP3037526B1 (en) * 2007-11-26 2018-03-14 London School of Hygiene and Tropical Medicine Method for producing vaccinal viral strain of a virus of the reoviridae family
EP2085479A1 (en) * 2008-01-31 2009-08-05 Institut Pasteur Reverse genetics of negative-strand rna viruses in yeast
EP2420242A1 (en) 2010-08-20 2012-02-22 Lauer, Ulrich M. Oncolytic measles virus
US20130122038A1 (en) 2011-11-14 2013-05-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Heterologous prime-boost immunization using measles virus-based vaccines
EP2712871A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Institut Pasteur Recombinant Measles virus expressing Chikungunya virus polypeptides and their applications
EP2759301A1 (en) 2013-01-24 2014-07-30 Institut Pasteur Use of a genetically modified infectious measles virus with enhanced pro-apoptotic properties (MV-DeltaC virus)
WO2015092710A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Glaxosmithkline Biologicals, S.A. Contralateral co-administration of vaccines
EP2959915A1 (en) 2014-06-23 2015-12-30 Institut Pasteur A dengue virus chimeric polyepitope composed of fragments of non-structural proteins and its use in an immunogenic composition against dengue virus infection
EP3103474A1 (en) * 2015-06-12 2016-12-14 Institut Pasteur Live recombinant measles-m2 virus and its use in eliciting immunity against influenza viruses
EP3184119A1 (en) 2015-12-23 2017-06-28 Themis Bioscience GmbH Chromatography based purification strategies for measles scaffold based viruses
JP6949468B2 (ja) * 2016-10-17 2021-10-13 ルプレヒト−カールス−ウニベルジテート ハイデルベルク 腫瘍抗原をコードする麻疹ウイルス
WO2018206512A1 (en) * 2017-05-09 2018-11-15 Invectys Recombinant measles vaccine expressing htert
EP3412307A1 (en) 2017-06-07 2018-12-12 Institut Pasteur Recombinant measles virus expressing zika virus proteins and their applications
EP3707154A1 (en) 2017-11-09 2020-09-16 Institut Pasteur A zika virus chimeric polyepitope comprising non-structural proteins and its use in an immunogenic composition
SG11202004899SA (en) * 2017-12-21 2020-06-29 Pasteur Institut Lassa vaccine
CN111218475A (zh) * 2018-11-23 2020-06-02 成都生物制品研究所有限责任公司 一种拯救麻疹Schwarz/Moraten疫苗株的系统和方法
KR20220141332A (ko) * 2020-02-13 2022-10-19 앵스티띠 파스퇴르 홍역-벡터화된 covid-19 면역원성 조성물 및 백신
EP3865180A1 (en) * 2020-02-13 2021-08-18 Institut Pasteur Live recombinant measles virus expressing coronavirus antigens - its use in eliciting immunity against coronaviruses
EP3936517A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Institut Pasteur An improved measles virus vaccine vector based on multiple tandem additional transcription units
AU2022208199A1 (en) 2021-01-13 2023-07-13 Centre National De La Recherche Scientifique Measles-hiv or measles-htlv vaccine
CN113293148B (zh) * 2021-03-10 2022-10-25 上海青赛生物科技有限公司 一种h基因替换的嵌合麻疹减毒株的构建
WO2022195900A1 (ja) * 2021-03-15 2022-09-22 国立大学法人東京大学 組換え麻疹ウイルス

Family Cites Families (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU7007491A (en) 1990-02-02 1991-08-08 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Cdna corresponding to the genome of negative-strand rna viruses, and process for the production of infectious negative-strand rna viruses
JP3045581B2 (ja) 1991-10-14 2000-05-29 社団法人北里研究所 麻疹ワクチンウイルス株同定方法
DE69510207T3 (de) * 1995-08-09 2007-02-15 Schweiz. Serum- & Impfinstitut Bern Verfahren zur Herstellung von infektiösen minussträngigen RNA-Viren
CA2265554A1 (en) * 1996-09-27 1998-04-02 American Cyanamid Company 3' genomic promoter region and polymerase gene mutations responsible for attenuation in viruses of the order designated mononegavirales
JP4504464B2 (ja) 1997-02-28 2010-07-14 サノフィ パスツール バイオロジクス カンパニー キメラフラビウイルスワクチン
BRPI9701774B8 (pt) * 1997-04-11 2015-09-29 Fundação Oswaldo Cruz Fiocruz cdna mutante e infeccioso do vírus da febre amarela, constructo de dna, vírus recombinante de febre amarela e vacina para humanos contra infecções de febre amarela.
US6410023B1 (en) * 1997-05-23 2002-06-25 United States Of America Recombinant parainfluenza virus vaccines attenuated by deletion or ablation of a non-essential gene
KR20010080863A (ko) * 1998-03-26 2001-08-25 윌리암 에이취 캘넌, 에곤 이 버그 마진 바이러스 또는 인간 호흡기 합포체 바이러스서브그룹 비에서 감쇠 담당 돌연변이
WO1999063064A1 (en) * 1998-06-03 1999-12-09 American Cyanamid Company Novel methods for rescue of rna viruses
US6146642A (en) 1998-09-14 2000-11-14 Mount Sinai School Of Medicine, Of The City University Of New York Recombinant new castle disease virus RNA expression systems and vaccines
KR100884673B1 (ko) 1999-08-02 2009-02-18 와이어쓰 씨디엔에이로부터 멈프스 바이러스의 구제
HU229101B1 (en) * 2000-04-28 2013-07-29 St Jude Childrens Res Hospital Dna transfection system for the generation of infectious influenza virus
ES2427139T3 (es) 2002-06-20 2013-10-29 Institut Pasteur Virus recombinantes del sarampión que expresan epítopos de antígenos de virus de ARN y uso de los virus recombinantes para la preparación de composiciones de vacuna
ATE437175T1 (de) * 2002-06-20 2009-08-15 Pasteur Institut Infektiöse cdna eines zugelassenen impfstammes des masern virus. verwendung in immunogenen zusammensetzungen
CA2432738A1 (en) 2003-02-26 2004-08-26 Philippe Despres New dengue and west nile viruses proteins and genes coding the foregoing, and their use in vaccinal, therapeutic and diagnostic applications
CA2508266A1 (fr) 2005-06-20 2006-12-20 Institut Pasteur Polypeptides chimeriques et leurs applications therapeutiques contre une infection a flaviviridae
DK1939214T3 (da) 2006-12-22 2013-10-14 Pasteur Institut Celler og metodik til at generere ikke-segmenterede negativstrengede RNA-vira
EA027784B1 (ru) * 2008-05-26 2017-09-29 Кадила Хелзкэр Лимитед Комбинированная вакцина против кори и вируса папилломы человека
UA104180C2 (uk) * 2009-05-05 2014-01-10 Каділа Хелткере Лімітед Комбінована вакцина проти кору та малярії

Also Published As

Publication number Publication date
EP1375512A1 (en) 2004-01-02
BR0312173A (pt) 2005-04-05
EP1513872A1 (en) 2005-03-16
EP2311853A1 (en) 2011-04-20
HK1061568A1 (en) 2004-09-24
US9701944B2 (en) 2017-07-11
EP1375512B1 (en) 2009-07-22
US20150275184A1 (en) 2015-10-01
WO2004000876A8 (en) 2005-03-03
US20050227224A1 (en) 2005-10-13
BRPI0312173B1 (pt) 2019-05-07
DE60233038D1 (de) 2009-09-03
CA2489052C (en) 2014-07-29
AU2003266950A1 (en) 2004-01-06
KR101227128B1 (ko) 2013-01-29
CY1109506T1 (el) 2014-08-13
ES2330309T3 (es) 2009-12-09
CN1662553A (zh) 2005-08-31
US20130296541A1 (en) 2013-11-07
US9005925B2 (en) 2015-04-14
EP2110382A1 (en) 2009-10-21
EP2065393A1 (en) 2009-06-03
ES2663224T3 (es) 2018-04-11
PT1375512E (pt) 2009-09-23
WO2004000876A1 (en) 2003-12-31
US9005961B2 (en) 2015-04-14
CA2489052A1 (en) 2003-12-31
DK1375512T3 (da) 2009-10-26
CN100577683C (zh) 2010-01-06
DK2311853T3 (en) 2018-04-16
EP2311853B1 (en) 2017-12-27
AU2003266950A8 (en) 2004-01-06
BRPI0312173B8 (pt) 2021-05-25
ATE437175T1 (de) 2009-08-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101227128B1 (ko) 홍역 바이러스의 허가된 백신 종의 감염성 ｃＤＮＡ 및면역학적 조성물로서의 용도
KR102077131B1 (ko) 치쿤구니야 바이러스 폴리펩티드를 발현하는 재조합 홍역 바이러스 및 이의 사용
KR101241423B1 (ko) 알엔에이 바이러스 항원의 에피토프를 발현하는 재조합홍역 바이러스-백신 제제의 제조에 사용하기 위한 용도
US6168943B1 (en) Methods for making modified recombinant vesiculoviruses
AU2017202195B2 (en) Production of heterologous polypeptides in microalgae, microalgal extracellular bodies, compositions, and methods of making and uses thereof
Guild et al. Development of retrovirus vectors useful for expressing genes in cultured murine embryonal cells and hematopoietic cells in vivo
KR102070217B1 (ko) 다가 재조합 조류 헤르페스 바이러스 및 조류 종을 면역화하기 위한 백신
WO1996034625A9 (en) Recombinant vesiculoviruses and their uses
KR101522217B1 (ko) Ｆｓｈ 제조 세포 클론
CN112048484A (zh) 一株表达传染性法氏囊强毒株vp2蛋白的基因ⅶ型新城疫重组病毒和疫苗
KR20200100126A (ko) 알파바이러스 레플리콘 입자
KR101616572B1 (ko) 홍역-말라리아 조합 백신
CN114196705A (zh) 一种重组腺相关病毒包装质粒、重组腺相关病毒及其应用
KR20200104343A (ko) 라싸 백신
KR102511472B1 (ko) 양성 가닥 rna 바이러스에 의해 유발되는 감염성 질환에 대한 백신
JP2002539836A (ja) 原生動物発現系
KR20190056658A (ko) 구제역 taw97 주의 방어 항원이 발현되는 재조합 바이러스
US20030182668A1 (en) Transgenic non-human mammals expressing constitutively activated tyrosine kinase receptors
CN112094822A (zh) 基于EV71毒株的感染性cDNA克隆及其应用
CN112626029B (zh) 一种转基因修饰的Daudi细胞及其制备方法、应用
CN114231566B (zh) 一种R26-e(CN362-1)载体及其制备方法
CN114317536B (zh) 基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法
CN114181939B (zh) 一种表达na4蛋白和荧光标签的重组球虫载体及其检测方法
CN106701825A (zh) 腺病毒疫苗Ad‑LIGHT‑HBsAg及其用于治疗慢性乙肝的用途
CN112553255A (zh) 一种表达传染性法氏囊病毒vp2抗原的重组病毒及制备与应用

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151228

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161226

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181226

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20191226

Year of fee payment: 8