CN106701825A - 腺病毒疫苗Ad‑LIGHT‑HBsAg及其用于治疗慢性乙肝的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性DNA疫苗，所述DNA疫苗包含通过将乙肝表面抗原s‑HBsAg和免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列构建到5型腺病毒载体中获得的核酸构建体。本发明还提供一种用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含通过将乙肝表面抗原s‑HBsAg和免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列构建到5型腺病毒载体中获得的核酸构建体、重组乙肝表面抗原s‑HBsAg蛋白和佐剂。本发明所述疫苗对于慢性乙型肝炎病毒感染具有显著的治疗性效果，与抗‑HBsAg中和性抗体和抗‑PDL1阻断抗体联合使用具有更好的治疗效果。同时，过继转移经该疫苗活化的脾脏细胞也具有显著的治疗性效果。

Description

腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于治疗慢性乙肝的用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体地，涉及一种腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于诱导HBsAg特异性免疫反应，治疗慢性乙肝的用途。同时，本发明还涉及该疫苗联合抗-HBsAg抗体以及抗-PDL1阻断抗体治疗慢性HBV感染的用途。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)属嗜肝病毒科，是一种不完整双链DNA病毒。主要通过血液和体液感染人和少数灵长类动物。乙型病毒性肝炎是由HBV感染引起的以肝脏炎症和坏死病变为主的传染病，严重威胁着人类的健康，慢性HBV感染更是导致原发性肝癌(HCC)和肝硬化的重要因素。全球有约2.4亿人是慢性乙肝感染者，而在我国就有约9300万。由于HBV不能感染小鼠等模式动物，缺乏合适的小动物模型是研究慢性乙肝感染引起的免疫耐受和致病机制的主要障碍。而现有的慢性乙型肝炎的治疗方案主要是通过干扰素和核苷类似物来抑制病毒复制从而改善临床症状及预后，这种方案并不能有效的清除病毒，同时极易引起耐药性。因此研发针对慢性乙型肝炎的治疗性疫苗及免疫策略具有极为重要的意义。

慢性乙型肝炎诱导的免疫耐受机制至今仍没有被完全研究清楚。多种类型的细胞和分子参与了HBV诱导的免疫耐受。而最重要的一点原因在于HBV感染的靶器官是肝脏。肝脏既被认为是一个免疫器官，同时也被认为趋向于诱导免疫耐受，这使得打破嗜肝病毒引起的免疫耐受变得尤为困难。首先，肝脏中的多种抗原递呈细胞能够通过不同的机制来诱导免疫耐受。肝脏中的抗原递呈细胞主要有：髓系来源的DC(Myeloid DC)、浆样树突状细胞(Plasmacytoid DC)、Kupffer细胞、肝窦内皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)、肝实质细胞(Hepatocyte)和星形细胞(Stellate cell)。这些细胞可以通过分泌抑制性细胞因子如：IL10和TGFβ，或者表达共抑制分子如PD-L1和TIM-3来抑制T细胞免疫反应；也可以通过表达FasL和TRAIL来诱导抗原特异性T细胞凋亡；而MHC分子在肝脏细胞上的表达普遍较低，会导致TCR信号刺激不足而引起T细胞的耗竭和失能；同时，IL12产生的不足也会导致CD4细胞向Treg方向分化而不是Th1。而在慢性HBV感染过程中，其中的一些抑制已经被报道参与了HBV诱导的免疫耐受。

腺病毒(Adenovirus，Ad)是无囊膜的二十面体颗粒，是一种线状双链DNA病毒，其基因组长约36kb。人类腺病毒共有51个血清型，依其基因组和致癌性的不同可分为A-E的6个亚群。其基因组由5个早期(E1A、E1B、E2、E3和E4)、4个中期和1个晚期转录单位组成。近20年来，腺病毒作为一种优良的基因载体，已被广泛用于基因治疗和疫苗研究等各个领域。腺病毒能够被如此广泛的应用于基因工程等领域，是因为其具有以下一些优点：1、宿主范围广，对人致病性低，副作用小。2、腺病毒颗粒相对稳定，病毒基因组很少发生重排，外源基因片段在插入病毒基因组后，不会随着病毒的复制而丢失。3、安全性好，腺病毒进入宿主细胞核后，会保持线状，在染色体外独立稳定存在，不会插入到宿主染色体中，不会引起宿主基因组的插入突变。4、可以同时表达多个基因。5、腺病毒携带的外源基因表达效率较高。6、腺病毒的宿主范围广泛，可感染分裂和非分裂细胞，转导细胞种类多，如肺细胞、肝细胞、骨细胞、血管、肌肉、脑、中枢神经系统等。7、腺病毒可通过感染HEK293细胞大量扩增，通过CsCl密度梯度离心纯化，制备方便。8、嗜肝性：通过静脉感染5型腺病毒，90％以上的病毒特异性的进入了肝脏。这种嗜肝性并不是由萨科齐病毒受体(Coxsackie Adenovirus Receptor，CAR)介导的，而是先通过与凝血因子十结合，进而通过凝血因子十与肝实质细胞上的硫酸肝素蛋白聚糖的结合实现的。在静脉感染过程中，腺病毒主要被肝脏中的kupffer细胞通过清道夫受体捕获，而脾脏中的巨噬细胞和中性粒细胞吞噬的腺病毒数量很少。9、包装容量大：经改建的复制缺陷型腺病毒载体的克隆容量可达10kb，腺病毒基因完全缺失载体的克隆容量可高达37kb。

LIGHT是T细胞上可诱导表达的与单纯疱疹病毒的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(homologous to lymphotoxins,exhibits inducible expression,andcompetes with HSV glycoprotein D for HVEM,a receptor expressed by Tlymphocytes，LIGHT)的简称，是1988年发现的TNF超家族的第14个成员。LIGHT可以通过LTβR招募和激活多种固有和获得性免疫细胞(如DC、T细胞、NK细胞等)，上调趋化因子和粘附分子，并能激活NFκB，发挥诱导肿瘤细胞凋亡和刺激T细胞增殖的作用；还可作为一个共刺激分子，可通过CD28非依赖的信号传导途径刺激T细胞的生长和IFNγ的分泌。LIGHT的免疫活化功能主要是通过另一个受体HVEM直接活化T细胞和刺激NK细胞实现。

早在90年代初，Daniel等人就提出了过继转移治疗HBV的概念。后来Lau等人通过系统的随访发现，将自限性乙肝感染者的骨髓移植给慢性乙肝患者，可以使患者发生表面抗原血清学转换并伴随着血清ALT的一过性升高。通过机制研究表明，治疗效果可能源于供者提供的记忆性T细胞的作用，尤其是HBcAg特异性的CD4+T细胞。该辅助性T细胞可以通过分泌细胞因子或帮助B细胞产生抗体来实现病毒的清除。同时，值得注意的是接种过预防性疫苗但没有感染过HBV的供体骨髓并不能清除慢性乙肝患者的HBV。这提示我们，HBV的清除有可能需要多种针对病毒抗原的CD4和CD8T细胞协同作用。

发明内容

本发明目的在于提供一种腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于治疗慢性乙肝的用途。

在一方面，本发明提供了一种针对慢性HBV感染的治疗性疫苗，该疫苗的免疫能够有效的清除低剂量慢性HBV的感染。

在一方面，本发明提供了一种续贯免疫方法，通过以CpG为佐剂的乙肝表面抗原疫苗与本发明所述疫苗的续贯免疫，能够有效的增强HBsAg特异性的免疫反应。

在一方面，本发明提供了一种针对慢性乙型肝炎的联合治疗方法，本发明所述疫苗与抗-HBsAg中和性抗体的联合使用能够有效的清除慢性HBV的感染。

在一方面，本发明提供了一种针对慢性乙型肝炎的联合治疗方法，本发明所述疫苗与抗-PDL1抗体的联合使用能够有效的清除慢性HBV的感染。

在一方面，基于本发明所述疫苗的脾脏细胞过继转移疗法，在与射线照射联合使用后能够有效的清除慢性HBV的感染。

在一个实施方案中，本发明构建一种乙型肝炎治疗性疫苗：利用5型腺病毒重组表达HBV表面抗原(S-HBsAg)和免疫共刺激分子LIGHT。

在一个实施方案中，本发明利用腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg皮下免疫野生型C57BL6/J小鼠，能够在小鼠的脾脏和肝脏诱导HBsAg特异性的CD4+和CD8+T细胞免疫反应。

在一个实施方案中，本发明利用Ad-LIGHT-HBsAg皮下免疫低剂量AAV/HBV1.3感染建立的慢性乙肝模型小鼠，能够打破免疫耐受，诱导HBsAg特异性的T细胞及B细胞免疫反应，清除HBV的感染。

在一个实施方案中，本发明利用腹腔注射HBsAg的中和性抗体4周(2mg/周/鼠)再免疫Ad-LIGHT-HBsAg的方法，能够在高剂量AAV/HBV感染建立的慢性HBV感染小鼠中打破免疫耐受，诱导T细胞及B细胞免疫反应，清除HBV的感染。

在一个实施方案中，本发明将重组乙肝表面抗原(2-10ug)与B型CpG(含有非甲基化的胞嘧啶和鸟嘌呤二核苷酸为核心序列的核苷酸序列)，CpG-1826(50ug)在PBS缓冲液中进行混合后皮下免疫野生型小鼠，在免疫后的第14-28天后腹腔免疫Ad-LIGHT-HBsAg。在二次免疫后的第8天，能够在外周血中检测到大量HBsAg特异性的CD8+T细胞。在二次免疫后的第14天，能够在脾脏和肝脏中检测到大量的HBsAg特异性CD4及CD8免疫反应，与此同时也能够在血清中检测到大量的抗-HBsAg抗体。

在一个实施方案中，HBsAg/CpG与Ad-LIGHT-HBsAg的续贯免疫能够诱导大量抗原特异性T及B细胞免疫反应的功能依赖于LIGHT-LTβR信号通路及在肝脏原位的免疫活化。

在一个实施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾脏细胞过继转移到AAV/HBV感染的Rag小鼠中能够清除HBV的感染。

在一个实施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾脏细胞过继转移到5Gy照射的AAV/HBV携带者小鼠中能够清除HBV的感染。

在一个实施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg活化14天后的脾脏细胞过继转移到HBV1.3转基因小鼠中能够清除HBV抗原的表达。

在一个实施方案中，Ad-LIHGT-HBsAg与3次抗-PDL1的抗体(100ug/鼠/次)联合使用能够在高剂量AAV/HBV感染的小鼠中诱导抗原特异性T细胞免疫反应并清除HBV的持续性感染。

具体地，本发明涉及以下方面：

1.核酸构建体，所述核酸构建体通过将乙肝表面抗原s-HBsAg和免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列构建到5型腺病毒载体中获得。

2.根据1所述的核酸构建体，其中所述乙肝表面抗原s-HBsAg的编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据1所述的核酸构建体，其中所述免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体的核酸序列如SEQID NO:3所示。

5.用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性DNA疫苗，所述DNA疫苗包含根据1-4中任一项所述的核酸构建体。

6.根据1-4中任一项所述的核酸构建体用于制备用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性DNA疫苗的用途。

7.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据1-4中任一项所述的核酸构建体或根据5所述的DNA疫苗、重组乙肝表面抗原s-HBsAg蛋白和佐剂。

8.根据7所述的试剂盒，其中所述佐剂是CpG。

9.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据1-4中任一项所述的核酸构建体或根据5所述的DNA疫苗以及抗-HBsAg抗体。

10.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据1-4中任一项所述的核酸构建体或根据5所述的DNA疫苗以及抗-PDL1抗体。

附图说明

图1：根据本发明的Ad-LIHGT-HBsAg在野生型小鼠中诱导的T细胞免疫反应。包括在外周血中诱导的抗原特异性CD8+T细胞数量以及在脾脏和肝脏中诱导的分泌IFNγ的抗原特异性细胞数量。

图2：本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中诱导的免疫反应及治疗效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的变化情况，肝脏中HBVgDNA的检测，以及肝脏中HBsAg特异性CTL的数量。

图3：根据本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg与HBsAg中和性抗体联合治疗在高剂量HBV携带者小鼠中诱导的免疫反应及治疗效果。包括治疗过程中血清中HBsAg和HBeAg的变化情况，外周血中HBsAg特异性T细胞的数量以及治疗后肝脏中HBcAg的表达情况。

图4：HBsAg/CpG与本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg续贯免疫诱导的免疫反应特点。包括HBsAg/CpG与Ad-LIGHT-HBsAg续贯免疫在脾脏和肝脏以及外周血中诱导的HBsAg特异性T细胞比例和抗体应答强度。

图5：HBsAg/CpG与本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg续贯免疫诱导的免疫反应依赖于LIGHT-LTβR信号通路。包括HBsAg/CpG与Ad-LIGHT-HBsAg续贯免疫在野生型小鼠、LTβR敲除小鼠、HVEM敲除小鼠的外周血、肝脏、脾脏中诱导的HBsAg特异性T细胞数量以及抗体应答强度；以及用LTβR-Ig阻断后HBsAg/CpG与Ad-LIGHT-HBsAg续贯免疫在野生型小鼠中诱导的免疫反应。

图6：利用本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾脏细胞过继转移到Rag-/-HBV慢性感染小鼠后的治疗效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的变化以及外周血、脾脏和肝脏中HBsAg特异性T细胞的数量。

图7：利用本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾脏细胞过继转移到5Gy射线照射的免疫健全HBV慢性感染小鼠后的治疗效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的变化以及外周血、脾脏和肝脏中HBsAg特异性T细胞的数量和肝脏中HBVgDNA的变化。

图8：利用本发明所述的Ad-LIHGT-HBsAg活化的脾脏细胞过继转移到5Gy射线照射的HBV1.3转基因小鼠后的治疗效果。

图9：根据本发明所述的Ad-LIGHT-HBsAg与抗-PDL1联合治疗在中剂量HBV慢性感染小鼠中诱导的免疫反应及治疗效果。包括血清中HBsAg和HBeAg的变化情况，以及脾脏和肝脏中HBsAg特异性T细胞的数量。

具体实施方式

下面的实施例仅用于进一步阐释本发明的内容，而不意欲在任何方面限制本发明。本领域技术人员将领会，可对下述具体实施方式进行修饰而仍不偏离所附的权利要求所要求保护的本发明的范围、精神和主旨。

在下面的所有实施例中，如无特别声明，均采用本领域技术人员惯常所用的方法、仪器、试剂和实验方案等。

实施例

实施例1：Ad-mLIGHT-HBsAg的制备

首先，利用分子克隆方法将s-HBsAg(ayw亚型)(核酸序列见SEQ ID NO:1)和LIGHT分子(核酸序列见SEQ ID NO:2)的核酸序列构建于pShuttle载体(该载体的详细信息可参见He,T.C.,et al.A simplified system for generating recombinantadenoviruses.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 95,2509-2514(1998))，通过质粒共转染的方式产生病毒(DNA病毒的全长序列见SEQ ID NO:3)。具体操作步骤严格按照Stratagene公司的AdEasy^TM XLAdenoviral Vector System进行，现简要描述如下：

一目的基因的克隆

1.选择适当的酶切位点(EcoRV和NotI)，进行酶切连接，将mLIGHT-HBsAg片段插入pshuttle-CMV质粒多克隆位点。

2.重组质粒鉴定：酶切鉴定或测序。

3.重组质粒扩增，纯化并准备适量含目的基因的穿梭质粒。

4.用PmeI单酶切线性化重组穿梭质粒，电泳鉴定质粒完全被切开。

5.胶回收线性化质粒，以备共转化使用。

二共转化

1大肠杆菌BJ5183电转感受态制备

①从新鲜琼脂板上挑取单个BJ5183细菌，接种于LB培养基中，37℃振摇过夜。

②接种25ml过夜培养物于500ml LB培养基，37℃振摇，至OD600达到0.4。

③迅速将培养物置于冰浴中30min，至充分冷却。

④将菌液转移至预冷的离心管中，4℃下以2500r/min离心15min，弃培养液，回收细胞。

⑤以10ml预冷的10％甘油洗涤沉淀，低温离心，共两次。

⑥加约1ml(适量)预冷的10％甘油重悬沉淀，稀释悬液100倍，测量OD600，至稀释浓度为2-3×10¹⁰个细胞/ml(1.0OD600约2.5×10¹⁰个细胞/ml)。分装，-80℃或液氮保存待用。

2病毒骨架质粒转化大肠杆菌，扩增，纯化。

3将1-5μl(约1μg)线性化的穿梭质粒及1μl(约100ng/μl)病毒骨架质粒pAdEasy-1(购自Stratagene公司)加入至含约40μl BJ5183电转感受态的EP管中混匀,冰上冷却。

4将混合物加入电转杯，电击(1250-1500V/mm,5ms)。

5电击结束取出样品，加入1ml SOC或LB培养液，37℃低速振荡40min。

6取适当体积的电击转化细胞液涂于数个卡那霉素抗性平板(25-50mg/ml)，37℃培养16-20hr。

7次日挑取平板上长出的菌落(选择最小的菌落)，接种于3ml含25-50mg/ml的LB培养基，37℃培养10-15hr。

8碱裂法提取质粒，0.8％琼脂糖凝胶电泳筛选，大质粒为可能阳性克隆，进一步酶切鉴定。以PacI单酶切，0.8％琼脂糖凝胶电泳如显示出一条大片段(约30kb)，及一条小片段(约3.0或4.5kb)(同时可进行其它酶切鉴定)，则基本确定为阳性克隆。

9取1-5μl阳性质粒转化至DH5α大肠杆菌细胞(BJ5183为recA+,质粒DNA易发生突变，DH5α或JM109，XL1-blue菌株为重组缺陷性菌株，可稳定扩增已鉴定的重组质粒)，扩增细菌并纯化质粒。

三重组病毒质粒转导293细胞

1 293细胞培养：转导24小时前，以方瓶为例，接种2×10⁶ 293细胞于25cm²方瓶，使生长密度约50-70％。(也可以使用6孔或96孔板)

2以PacI单酶切重组病毒质粒(转导25cm²方瓶约需4μgDNA)，完全线性化后，乙醇沉淀，再以20μl ddH2O溶解。

3脂质体包裹质粒(以Lipofectamine为例):每4μg PacI约需20μlLipofectamine包裹.质粒及脂质体分别稀释于500μl无血清培养基再混合，置于室温下15-30min。

4以无血清培养基轻轻洗涤培养瓶，另加2.5ml无血清培养基，37℃放置10min。

5将Lipofectamine-DNA混合物加入培养瓶，37℃孵箱放置4hr。

6 4hr后，弃Lipofectamine-DNA混合液，另加入6ml DMEM完全培养基(含10％FCS)。如有大量细胞漂浮，可不弃Lipofectamine-DNA液，加入6ml DMEM完全培养基，37℃孵育过夜，再换液。

7培养过程中观察细胞生长情况。约2周后可观察到细胞病变(CPE)出现。

四重组病毒鉴定

1转导10-14d后，收集细胞沉淀，加入2ml灭菌的PBS混悬，冻融细胞，离心后收集上清保存于-80℃。

2取30-50％步骤1中上清，感染50-70％饱和度的25cm²方瓶中293细胞。2-3d后出现明显细胞病变。

3感染后3-5d，当1/3-1/2细胞漂浮时收集病毒。按步骤1收集细胞并准备病毒上清。通过Western blot和/或PCR鉴定重组腺病毒产生。

4PCR鉴定重组病毒。取5μl病毒上清加入10μl蛋白酶K，55℃孵育1hr，再煮沸5min，离心后取1-2μl作PCR。

用构建成功的重组病毒感染293cymr细胞实现病毒的扩增。通过MOI＝10的感染剂量，经过48小时的扩增，收取细胞进行裂解并收取上清，经过氯化铯的密度梯度离心，收取成熟的病毒带进行脱盐，脱盐缓冲液为A195(成分为：10mM Tris-HCL PH7.4、75mM NaCL、5％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)Polysorbate 80(Sigma)、1mM MgCL、100mM EDTA、0.5％EtOH、10mM His(L-histidine)(Sigma)、2％甘油，经0.22微米滤膜过滤后常温保存)。

Ad-mLIGHT-HBsAg的扩增方法：

(1)使用DMEM完全培养基将293cymr接种于直径为10厘米的细胞培养皿中，在37℃，5％二氧化碳培养箱中培养。

(2)当细胞密度为70-80％时，加入MOI＝10的病毒(以上方法制备的Ad-mLIGHT-HBsAg)感染细胞，培养36-48小时并随时观察是否出现细胞质病变效应(CPE)。

(3)当大部分细胞出现CPE效应时，用刮刀将细胞刮下，连同培养基一起转入50ml离心管，2500rpm离心10分钟后用1x10⁷/ml培养基重悬细胞冻于-80℃。

Ad-mLIGHT-HBsAg的纯化方法：

纯化腺病毒使用氯化铯密度梯度离心法，步骤如下：

(1)使用液氮和37℃反复冻融细胞悬液3次并充分震荡1分钟，4000rpm离心20分钟，收集上清。

(2)在4℃预冷SW28/Beckman转头。

(3)用10ml注射器吸取6ml 1.2g/ml的CsCl,缓慢加入到超离管中，同样吸取8ml1.4g/ml的CsCl，用注射器针头插到超离管的底部，不扰动上层液面，轻轻推入溶液。

(4)将20ml细胞裂解上清沿侧壁缓缓加到液面上(从小于10⁹被感染细胞中获得)。

(5)用1xTE补平至距离管口5mm，再加入液体石蜡至距管口2mm并配平。

(6)SW28转头23000rpm 4℃离心90分钟，加速度为慢，减速为0。

(7)小心取出超离管，用10ml注射器从液面上吸走大部分不含病毒层的溶液。可以看到液面中下部，有一条白色条带，即含腺病毒的溶液层。用2ml配备18G针头的注射器刺破超离管腺病毒液面处，细心的吸出该液体层置于15ml离心管中。

(8)用A195缓冲液平衡GE脱盐柱(NP-25)5次，每次5ml。

(9)将病毒粗纯液加入脱盐柱。

(10)加入A195缓冲液洗脱，并分装贮存于-80℃。

Ad-mLIGHT-HBsAg滴度的测定方法：

针对腺病毒的Hexon进行细胞免疫组化分析可以计算病毒滴度，方法如下：

(1)在12孔板中，每孔接种5×10⁵个293cymr细胞，加入100ul已稀释好的病毒(从10^-6到10^-8)放入培养箱中培养48小时。

(2)吸去培养基，室温干燥5分钟。

(3)沿管壁轻柔地加入预冷的甲醇，0.5ml/孔。将板至于-20℃，孵育10分钟。

(4)轻轻吸去甲醇，轻柔地用PBS洗涤，每次每孔0.5ml，洗3次。

(5)用PBS稀释一抗，稀释倍数为1:1000。

(6)轻轻吸去孔中洗涤液，每孔加入稀释好的一抗200ul，37℃孵育1小时。

(7)轻轻地吸去一抗，用PBS洗三次，每次5分钟。

(8)每孔加入即用型二抗(抗小鼠IgG-HRP)(购自中杉金桥)，37℃孵育1小时。

(9)轻轻吸去二抗，用PBS洗三次，每次5分钟。

(10)每孔加入已稀释好的DAB显色液，室温放置5分钟。

(11)吸去DAB溶液，每孔加入PBS溶液。在显微镜下观察。

(12)计算每孔感染单位(ifu/ml)＝(平均阳性细胞数/视野)×(视野数/孔)/(病毒体积×稀释倍数)

实施例2：Ad-mLIGHT-HBsAg在野生型小鼠中的免疫反应

C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)接受了1*10e9pfu的Ad-LIGHT-HBsAg以及对照疫苗的皮下免疫(用PBS将滴度调整为1*10e10pfu/ml,注射体积为100ul)。在免疫后的第8天，通过流式细胞仪检测了外周血中H2-KbENV190阳性的CD8+T 细胞比例(图1A-B)，在免疫后的第14天，肝脏中的淋巴细胞被分离出来并用ENV190和OT1刺激48小时，通过Elispot的方法检测了分泌IFNγ的抗原特异性CD8+T细胞数量(图1D-E)。通过与其他疫苗免疫的比较可以看出，Ad-LIGHT-HBsAg在淋巴结、脾脏和肝脏均有效的诱导了HBsAg特异性免疫反应(图1C)。

实施例3：Ad-mLIGHT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中的免疫反应及治疗效果

AAV/HBV1.3感染C57BL6/J小鼠建立慢性HBV感染模型的方法：

将AAV/HBV1.3病毒(购买自北京五加和分子医学研究所有限公司)按一定比例稀释于0.9％NaCl的生理盐水中，每次尾静脉注射的总体积为200ul。成年鼠(6-8周龄,雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)使用尾静脉注射的方法进行感染。在感染四周后按照实施例2所述的方法对HBV慢性感染小鼠进行了Ad-mLIGHT-HBsAg的免疫以及对照疫苗的免疫(Engerix-B，葛兰素史克公司，2ug/鼠，皮下免疫，体积为100ul)。通过Elisa的方法检测了血清中HBeAg的变化(图2A-B)。在免疫后的第32天，通过Elispot的方法检测了小鼠肝脏中抗原特异性T细胞分泌IFNγ的水平(图2C)，并检测了肝脏中HBV DNA的拷贝数(图2D)。

实施例4：HBsAg中和性抗体与Ad-mLIGHT-HBsAg在HBV慢性感染小鼠中的联合治疗效果

首先，按照实施例3所述方法建立HBV慢性感染的小鼠模型。在感染四周后，开始为模型小鼠注射HBsAg的中和性抗体(H25B10，小鼠杂交瘤细胞产生，小鼠IgG1,2mg/鼠，注射体积为500-1000ul，每周2次，共4周)，之后按照实施例2所述的方法免疫Ad-mLIGHT-HBsAg。在免疫后的第8天用2的方法检测了外周血中HBsAg特异性的T细胞数量(图3B)，并通过Elisa的方法检测了血清中HBsAg和HBeAg的变化(图3A)，在治疗后的第49天，通过免疫组化的方法检测了肝脏中HBcAg的表达情况。

实施例5：HBsAg/CpG与Ad-mLIGHT-HBsAg的续贯免疫能够增强HBsAg特异性免疫反应

HBsAg/CpG的制备及免疫：

用PBS将CpG粉末(CpG1826，由生工生物公司合成，序列为TCCATGACGTTCCTGACGTT)溶解至500ug/ml的浓度，取100ul与5ug重组HBsAg进行充分混合后进行皮下免疫(免疫方法及所用动物与实施例2所述一致)。在免疫后第21天，按照实施例2所述方法进行Ad-mLIGHT-HBsAg的免疫。在二次免疫后的第7天，用流式的方法检测了外周血中HBsAg特异性T细胞的比例(图4A)。在二次免疫后的第21天，用流式的方法检测了脾脏和肝脏中HBsAg特异性T细胞的比例(图4B)，用Elisa的方法检测了血清中anti-HBsAg的滴度(图4C)。

实施例6：HBsAg/CpG与Ad-mLIHGT-HBsAg续贯免疫诱导的免疫反应依赖于LIGHT-LTβR信号通路

首先，对野生型C57BL6/J小鼠(6-8周龄,雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)，LTβR敲除小鼠以及HVEM敲除小鼠(以上2种敲除小鼠由本实验室保种)按照实施例5所述的方法进行续贯免疫。在二次免疫后的第7天检测了外周血中HBsAg特异性T细胞的比例(图5A,B)，在二次免疫后的第21天检测了脾脏和肝脏中HBsAg特异性T细胞的比例(图5A,B)以及分泌IFNγ的T细胞数量(图5D,E)。同时检测了二次免疫后第14和21天血清中抗-HBsAg的水平(图5C)。其次，在对野生型C57BL6/J小鼠(6-8周龄,雄性，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)按照实施例5所述的方法进行续贯免疫的同时用anti-LTβR抗体(免疫的第0,7,14天腹腔免疫三次，每次100ug/鼠)来阻断LIGHT-LTβR信号通路，在二次免疫后的第7天检测了外周血中HBsAg特异性的T细胞比例(图5F,G)以及血清中抗-HBsAg的水平(图5H)。

实施例7：HBsAg/CpG与Ad-mLIGHT-HBsAg的续贯免疫活化的脾脏细胞在Rag-/-HBV慢性感染小鼠中的治疗作用

首先，对野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)按照实施例5所述的方法进行续贯免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天处死小鼠，分离脾脏细胞过继转移给AAV/HBV1.3感染的Rag-/-小鼠(5*10e7脾脏细胞通过尾静脉注射的方式进行过继转移，体积为200-300ul)。过继转移后通过Elisa的方法检测了血清中HBsAg和HBeAg的变化情况(图6A)。在过继转移后的第7天检测了外周血中HBsAg特异性的CD8+T细胞比例(图6B)。在过继转移后第28天检测了脾脏和肝脏中分泌IFNγ的CD8+T细胞数量(图6C)。

实施例8：HBsAg/CpG与Ad-mLIGHT-HBsAg的续贯免疫活化的脾脏细胞在经射线照射的HBV慢性感染小鼠中的治疗作用

首先，对野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)按照实施例5所述的方法进行续贯免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天处死小鼠，分离脾脏细胞。与此同时，对AAV/HBV1.3感染的小鼠(按照实施例3所述操作进行)进行射线照射(小鼠在北京大学化学院沽源室进行5Gy剂量的全身射线照射)。并将分离到的脾脏细胞按实施例6所述方法进行过继转移。在过继转移后的不同时间点通过Elisa的方法检测了血清中HBsAg、HBeAg、anti-HBsAg的变化情况(图7A)。在过继转移后的第7天通过流式的方法检测了外周血中HBsAg特异性的T细胞比例(图7B)。在过继转移后的第28天，通过Elispot的方法检测了脾脏和肝脏中分泌IFNγ的细胞数量(图7C)并通过real-timePCR的方法检测了肝脏中HBVDNA的拷贝数(图7D)以及HBcAg的表达情况(图7E)。

实施例9：HBsAg/CpG与Ad-mLIGHT-HBsAg的续贯免疫活化的脾脏细胞在经射线照射的HBV1.3转基因小鼠中的治疗作用

首先，对野生型C57BL6/J小鼠(雄性，6-8周龄，购自北京维通利华实验动物技术有限公司)按照实施例5所述的方法进行续贯免疫。在Ad-mLIGHT-HBsAg免疫后的第14天处死小鼠，分离脾脏细胞。与此同时，对HBV1.3转基因小鼠(由解放军458医院刘光泽教授惠赠)进行射线照射(小鼠在北京大学化学院沽源室进行5Gy剂量的全身射线照射)。并将分离到的脾脏细胞按实施例6所述方法进行过继转移。在过继转移后的不同时间点通过Elisa的方法检测了血清中HBsAg、anti-HBsAg的变化情况(图8)。

实施例10：HBsAg/CpG与Ad-mLIGHT-HBsAg的续贯免疫联合PDL1的阻断在HBV慢性感染小鼠中的治疗作用

首先，按照实施例3所述方法建立HBV慢性感染的小鼠模型。在感染四周后，开始对HBV慢性感染小鼠注射PDL1阻断抗体(抗-PDL1，clone:10F.9G2,100ug/鼠/次，每5天一次，直到Ad-LIGHT-HBsAg免疫后的第7天为止)，与此同时按照实施例5所述的方法对同批小鼠进行续贯免疫。通过Elisa的方法检测血清中HBsAg和HBeAg的变化情况(图9A-B)，在二次免疫后的第28天，通过Elispot的方法检测脾脏和肝脏中分泌IFNγ的HBsAg特异性CD8+T细胞的数量(图9C-D)。

序列表

<110> 中国科学院生物物理研究所

<120> 腺病毒疫苗Ad-LIGHT-HBsAg及其用于治疗慢性乙肝的用途

<130> IB168024

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 682

<212> DNA

<213> 乙肝病毒

<400> 1

atcaaatgta tacccaaaga caaaagaaaa ttggtaacag cggtaaaaag ggactcaaga 60

tgctgtacag acttggcccc caataccaca tcatccatat aactgaaagc caaacagtgg 120

gggaaagccc tacgaaccac tgaacaaatg gcactagtaa actgagccag gagaaacggg 180

ctgaggccca ctcccatagg aattttccga aagcccagga tgatgggatg ggaatacagg 240

tgcaatttcc gtccgaaggt ttggtacagc aacaggaggg atacatagag gttccttgag 300

cagtagtcat gcaggtccgg catggtcccg tgctggttgt tgaggatcct ggaattagag 360

gacaaacggg caacatacct tgatagtcca gaagaaccaa caagaagatg aggcatagca 420

gcaggatgaa gaggaagatg ataaaacgcc gcagacacat ccagcgataa ccaggacaag 480

ttggaggaca agaggttggt gagtgattgg aggttgggga ctgcgaattt tggccaagac 540

acacggtagt tccccctaga aaattgagag aagtccacca cgagtctaga ctctgcggta 600

ttgtgaggat tcttgtcaac aagaaaaacc ccgcctgtaa cacgagaagg ggtcctagga 660

atcctgatgt gatatctatc at 682

<210> 2

<211> 725

<212> DNA

<213> 小鼠

<400> 2

gcggccgctc atcacaccat gaaggcgccg aagtagctcc tggtgccgtc cctgggcctc 60

accagcctgt tgccgggcac cctcaccacc acctcctcgc cggcctccag gtgcaccacg 120

ccgcccagga agctgctgtc ccaccacact cggctgctgt tggccctgcc acaggggctc 180

cgcctggaga ccagcagctc cagctccttg gggtatctgc tggtcctctt gtacaggccg 240

tgggtgatgg gcaggccgtt ggccaggccc tgagggcagc ccactccgga cagctgcacc 300

ttgctgtaca cgtagtagta gccgggctcc atggtcacca gggcgccgtc gtggtaggtc 360

aggcccctca ggaaagccag gcccagcctg gtctcccaca gcaggggtcc gccgatgccg 420

atcaggctgg cgttggcgcc tgtcaggtgg gcggcagggt tggcctggtg gctcctctgg 480

tcctgccagc tgcccttgcc gccatcgggc aggtgggcca cgatgtcgcc cagcctctgg 540

tgcagcctca gcagaaacca gccctgggtg gccaggccag cgcccagcag cagcaccagg 600

gccagggaca cctgcacggt gccacatctc ctccgcctgt ggttctgctc cagcctcctg 660

aaggggatgt cggtctggcc gtccaccacg aacacgctgg gctgcaccac gctctccatg 720

gtggc 725

<210> 3

<211> 10164

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

taacatcatc aataatatac cttattttgg attgaagcca atatgataat gagggggtgg 60

agtttgtgac gtggcgcggg gcgtgggaac ggggcgggtg acgtagtagt gtggcggaag 120

tgtgatgttg caagtgtggc ggaacacatg taagcgacgg atgtggcaaa agtgacgttt 180

ttggtgtgcg ccggtgtaca caggaagtga caattttcgc gcggttttag gcggatgttg 240

tagtaaattt gggcgtaacc gagtaagatt tggccatttt cgcgggaaaa ctgaataaga 300

ggaagtgaaa tctgaataat tttgtgttac tcatagcgcg taatactgtc gagtctaggc 360

tcaagcagtg atccttatcg attttaccac atttgtagag gttttacttg ctttaaaaaa 420

cctcccacat ctccccctga acctgaaaca taaaatgaat gcaattgttg ttgttaactt 480

gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 540

agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttatca 600

tgtctgctcg aagcggccct agaggtacca cgcgtgaatt ctcgaggcta gagcttgtcg 660

aaatattgat atcatcaaat gtatacccaa agacaaaaga aaattggtaa cagcggtaaa 720

aagggactca agatgctgta cagacttggc ccccaatacc acatcatcca tataactgaa 780

agccaaacag tgggggaaag ccctacgaac cactgaacaa atggcactag taaactgagc 840

caggagaaac gggctgaggc ccactcccat aggaattttc cgaaagccca ggatgatggg 900

atgggaatac aggtgcaatt tccgtccgaa ggtttggtac agcaacagga gggatacata 960

gaggttcctt gagcagtagt catgcaggtc cggcatggtc ccgtgctggt tgttgaggat 1020

cctggaatta gaggacaaac gggcaacata ccttgatagt ccagaagaac caacaagaag 1080

atgaggcata gcagcaggat gaagaggaag atgataaaac gccgcagaca catccagcga 1140

taaccaggac aagttggagg acaagaggtt ggtgagtgat tggaggttgg ggactgcgaa 1200

ttttggccaa gacacacggt agttccccct agaaaattga gagaagtcca ccacgagtct 1260

agactctgcg gtattgtgag gattcttgtc aacaagaaaa accccgcctg taacacgaga 1320

aggggtccta ggaatcctga tgtgatatct atcatcgtgt ttttcaaagg aaaaccacgt 1380

ccccgtggtt cggggggcct agacgttttt ttaacctcga ctaaacacat gtaaagcatg 1440

tgcaccgagg ccccagatca gatcccatac aatggggtac cttctgggca tccttcagcc 1500

ccttgttgaa tacgcttgag gagagccatt tgactctttc cacaactatc caactcacaa 1560

cgtggcactg gggttgtgcc gcctttgcag gtgtatctta tacacgtggc ttttggccgc 1620

agaggcacct gtcgccaggt ggggggttcc gctgcctgca aagggtcgct acagacgttg 1680

tttgtcttca agaagcttcc agaggaactg cttccttcac gacattcaac agaccttgca 1740

ttcctttggc gagaggggaa agacccctag gaatgctcgt caagaagaca gggccaggtt 1800

tccgggccct cacattgcca aaagacggca atatggtgga aaataacata tagacaaacg 1860

cacaccggcc ttattccaag cggcttcggc cagtaacgtt aggggggggg gagggagagg 1920

ggcggaattg gcagatcttt atcacttatt caggcgtagc accaggcgtt taagggcacc 1980

aataactgcc ttgcggccgc tcatcacacc atgaaggcgc cgaagtagct cctggtgccg 2040

tccctgggcc tcaccagcct gttgccgggc accctcacca ccacctcctc gccggcctcc 2100

aggtgcacca cgccgcccag gaagctgctg tcccaccaca ctcggctgct gttggccctg 2160

ccacaggggc tccgcctgga gaccagcagc tccagctcct tggggtatct gctggtcctc 2220

ttgtacaggc cgtgggtgat gggcaggccg ttggccaggc cctgagggca gcccactccg 2280

gacagctgca ccttgctgta cacgtagtag tagccgggct ccatggtcac cagggcgccg 2340

tcgtggtagg tcaggcccct caggaaagcc aggcccagcc tggtctccca cagcaggggt 2400

ccgccgatgc cgatcaggct ggcgttggcg cctgtcaggt gggcggcagg gttggcctgg 2460

tggctcctct ggtcctgcca gctgcccttg ccgccatcgg gcaggtgggc cacgatgtcg 2520

cccagcctct ggtgcagcct cagcagaaac cagccctggg tggccaggcc agcgcccagc 2580

agcagcacca gggccaggga cacctgcacg gtgccacatc tcctccgcct gtggttctgc 2640

tccagcctcc tgaaggggat gtcggtctgg ccgtccacca cgaacacgct gggctgcacc 2700

acgctctcca tggtggcgcg gccgcagatc ttcgactcga agatcaaact tggacctggg 2760

agtggacacc tgtggagaga aaggcaaagt ggatgtcatt gtcactcaag tgtatggcca 2820

gatcgggcca ggtgaatatc aaatcctcct cgtttttgga aactgacaat cttagcgcag 2880

aagtaatgcc cgcttttgag agggagtact caccccaaca gctggatctc aagcctgcca 2940

cacctcacct cgaccatccg ccgtctcaag accgcctact ttaattacat catcagcagc 3000

acctccgcca gaaacaaccc cgaccgccac ccgctgccgc ccgccacggt gctcagccta 3060

ccttgcgact gtgactggtt agacgccttt ctcgagaggt tttccgatcc ggtcgatgcg 3120

gactcgctca ggtccctcgg tggcggagta ccgttcggag gccgacgggt ttccgatcca 3180

agagtactgg aaagaccgcg aagagtttgt cctcaaccgc gagcccaaca gctggccctc 3240

gcagacagcg atgcggaaga gagtgaccgc ggaggctgga tcggtcccgg tgtcttctat 3300

ggaggtcaaa acagcgtgga tggcgtctcc aggcgatatg aggcgcgccc ggttcactaa 3360

acaccggtaa caaacagaca atctggtctg tttgattata ccggttgctt atataggcct 3420

cccaccgtac acgcctacct cgacccggca agcttgccca tttgcgtcaa cggggcgggg 3480

gtattacgac attttggaaa gtcccgttga ttttggtgcc aaaacaaact cccattgacg 3540

tcaatggggt ggagacttgg aaatccccgt gagtcaaacc gctatccacg cccattggtg 3600

tactgccaaa accgcatcac catggtaata gcgatgacta atacgtagat gtactgccaa 3660

gtaggaaagt cccgtaaggt catgtactgg gcataatgcc aggcgggcca tttaccgtca 3720

ttgacgtcaa tagggggcgg acttggcata tgatacactt gatgtactgc caagtgggca 3780

gtttaccgta tatactccat ccattgacgt caatggaaag tccctattgg cgttactatg 3840

ggaacatacg tcattattga cgtcaatggg cgggggtcgt tgggcggtca gccaggcggg 3900

ccatttaccg taagttatgt aacgaagctt ctcgaggtcg agatcgatct gggcgtggtt 3960

aagggtggga aagaatatat aaggtggggg tcttatgtag ttttgtatct gttttgcagc 4020

agccgccgcc gccatgagca ccaactcgtt tgatggaagc attgtgagct catatttgac 4080

aacgcgcatg cccccatggg ccggggtgcg tcagaatgtg atgggctcca gcattgatgg 4140

tcgccccgtc ctgcccgcaa actctactac cttgacctac gagaccgtgt ctggaacgcc 4200

gttggagact gcagcctccg ccgccgcttc agccgctgca gccaccgccc gcgggattgt 4260

gactgacttt gctttcctga gcccgcttgc aagcagtgca gcttcccgtt catccgcccg 4320

cgatgacaag ttgacggctc ttttggcaca attggattct ttgacccggg aacttaatgt 4380

cgtttctcag cagctgttgg atctgcgcca gcaggtttct gccctgaagg cttcctcccc 4440

tcccaatgcg gtttaaaaca taaataaaaa accagactct gtttggattt ggatcaagca 4500

agtgtcttgc tgtctttatt taggggtttt gcgcgcgcgg taggcccggg accagcggtc 4560

tcggtcgttg agggtcctgt gtattttttc caggacgtgg taaaggtgac tctggatgtt 4620

cagatacatg ggcataagcc cgtctctggg gtggaggtag caccactgca gagcttcatg 4680

ctgcggggtg gtgttgtaga tgatccagtc gtagcaggag cgctgggcgt ggtgcctaaa 4740

aatgtctttc agtagcaagc tgattgccag gggcaggccc ttggtgtaag tgtttacaaa 4800

gcggttaagc tgggatgggt gcatacgtgg ggatatgaga tgcatcttgg actgtatttt 4860

taggttggct atgttcccag ccatatccct ccggggattc atgttgtgca gaaccaccag 4920

cacagtgtat ccggtgcact tgggaaattt gtcatgtagc ttagaaggaa atgcgtggaa 4980

gaacttggag acgcccttgt gacctccaag attttccatg cattcgtcca taatgatggc 5040

aatgggccca cgggcggcgg cctgggcgaa gatatttctg ggatcactaa cgtcatagtt 5100

gtgttccagg atgagatcgt cataggccat ttttacaaag cgcgggcgga gggtgccaga 5160

ctgcggtata atggttccat ccggcccagg ggcgtagtta ccctcacaga tttgcatttc 5220

ccacgctttg agttcagatg gggggatcat gtctacctgc ggggcgatga agaaaacggt 5280

ttccggggta ggggagatca gctgggaaga aagcaggttc ctgagcagct gcgacttacc 5340

gcagccggtg ggcccgtaaa tcacacctat taccgggtgc aactggtagt taagagagct 5400

gcagctgccg tcatccctga gcaggggggc cacttcgtta agcatgtccc tgactcgcat 5460

gttttccctg accaaatccg ccagaaggcg ctcgccgccc agcgatagca gttcttgcaa 5520

ggaagcaaag tttttcaacg gtttgagacc gtccgccgta ggcatgcttt tgagcgtttg 5580

accaagcagt tccaggcggt cccacagctc ggtcacctgc tctacggcat ctcgatccag 5640

catatctcct cgtttcgcgg gttggggcgg ctttcgctgt acggcagtag tcggtgctcg 5700

tccagacggg ccagggtcat gtctttccac gggcgcaggg tcctcgtcag cgtagtctgg 5760

gtcacggtga aggggtgcgc tccgggctgc gcgctggcca gggtgcgctt gaggctggtc 5820

ctgctggtgc tgaagcgctg ccggtcttcg ccctgcgcgt cggccaggta gcatttgacc 5880

atggtgtcat agtccagccc ctccgcggcg tggcccttgg cgcgcagctt gcccttggag 5940

gaggcgccgc acgaggggca gtgcagactt ttgagggcgt agagcttggg cgcgagaaat 6000

accgattccg gggagtaggc atccgcgccg caggccccgc agacggtctc gcattccacg 6060

agccaggtga gctctggccg ttcggggtca aaaaccaggt ttcccccatg ctttttgatg 6120

cgtttcttac ctctggtttc catgagccgg tgtccacgct cggtgacgaa aaggctgtcc 6180

gtgtccccgt atacagactt gagagggagt ttaaacgaat tcaatagctt gttgcatggg 6240

cggcgatata aaatgcaagg tgctgctcaa aaaatcaggc aaagcctcgc gcaaaaaaga 6300

aagcacatcg tagtcatgct catgcagata aaggcaggta agctccggaa ccaccacaga 6360

aaaagacacc atttttctct caaacatgtc tgcgggtttc tgcataaaca caaaataaaa 6420

taacaaaaaa acatttaaac attagaagcc tgtcttacaa caggaaaaac aacccttata 6480

agcataagac ggactacggc catgccggcg tgaccgtaaa aaaactggtc accgtgatta 6540

aaaagcacca ccgacagctc ctcggtcatg tccggagtca taatgtaaga ctcggtaaac 6600

acatcaggtt gattcatcgg tcagtgctaa aaagcgaccg aaatagcccg ggggaataca 6660

tacccgcagg cgtagagaca acattacagc ccccatagga ggtataacaa aattaatagg 6720

agagaaaaac acataaacac ctgaaaaacc ctcctgccta ggcaaaatag caccctcccg 6780

ctccagaaca acatacagcg cttcacagcg gcagcctaac agtcagcctt accagtaaaa 6840

aagaaaacct attaaaaaaa caccactcga cacggcacca gctcaatcag tcacagtgta 6900

aaaaagggcc aagtgcagag cgagtatata taggactaaa aaatgacgta acggttaaag 6960

tccacaaaaa acacccagaa aaccgcacgc gaacctacgc ccagaaacga aagccaaaaa 7020

acccacaact tcctcaaatc gtcacttccg ttttcccacg ttacgtaact tcccatttta 7080

agaaaactac aattcccaac acatacaagt tactccgccc taaaacctac gtcacccgcc 7140

ccgttcccac gccccgcgcc acgtcacaaa ctccaccccc tcattatcat attggcttca 7200

atccaaaata aggtatatta ttgatgatgt taattaacat gcatggatcc atatgcggtg 7260

tgaaataccg cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc 7320

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 7380

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 7440

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 7500

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 7560

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 7620

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 7680

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 7740

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 7800

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 7860

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 7920

cactagaagg acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 7980

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 8040

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 8100

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 8160

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 8220

tatatatgag taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc 8280

agcgatctgt ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac 8340

gatacgggag ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc 8400

accggctcca gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg 8460

tcctgcaact ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag 8520

tagttcgcca gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcagcca tgagattatc 8580

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttcac gtagaaagcc agtccgcaga aacggtgctg 8640

accccggatg aatgtcagct actgggctat ctggacaagg gaaaacgcaa gcgcaaagag 8700

aaagcaggta gcttgcagtg ggcttacatg gcgatagcta gactgggcgg ttttatggac 8760

agcaagcgaa ccggaattgc cagctggggc gccctctggt aaggttggga agccctgcaa 8820

agtaaactgg atggctttct cgccgccaag gatctgatgg cgcaggggat caagctctga 8880

tcaagagaca ggatgaggat cgtttcgcat gattgaacaa gatggattgc acgcaggttc 8940

tccggccgct tgggtggaga ggctattcgg ctatgactgg gcacaacaga caatcggctg 9000

ctctgatgcc gccgtgttcc ggctgtcagc gcaggggcgc ccggttcttt ttgtcaagac 9060

cgacctgtcc ggtgccctga atgaactgca agacgaggca gcgcggctat cgtggctggc 9120

cacgacgggc gttccttgcg cagctgtgct cgacgttgtc actgaagcgg gaagggactg 9180

gctgctattg ggcgaagtgc cggggcagga tctcctgtca tctcaccttg ctcctgccga 9240

gaaagtatcc atcatggctg atgcaatgcg gcggctgcat acgcttgatc cggctacctg 9300

cccattcgac caccaagcga aacatcgcat cgagcgagca cgtactcgga tggaagccgg 9360

tcttgtcgat caggatgatc tggacgaaga gcatcagggg ctcgcgccag ccgaactgtt 9420

cgccaggctc aaggcgagca tgcccgacgg cgaggatctc gtcgtgaccc atggcgatgc 9480

ctgcttgccg aatatcatgg tggaaaatgg ccgcttttct ggattcatcg actgtggccg 9540

gctgggtgtg gcggaccgct atcaggacat agcgttggct acccgtgata ttgctgaaga 9600

gcttggcggc gaatgggctg accgcttcct cgtgctttac ggtatcgccg ctcccgattc 9660

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ttcaggatcg aattaattct taat 10164

Claims (10)

1.核酸构建体，所述核酸构建体通过将乙肝表面抗原s-HBsAg和免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列构建到5型腺病毒载体中获得。

2.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述乙肝表面抗原s-HBsAg的编码核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

3.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述免疫共刺激分子LIGHT的编码核酸序列如SEQ ID NO:2所示。

4.根据权利要求1所述的核酸构建体，其中所述核酸构建体的核酸序列如SEQ ID NO:3所示。

5.用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性DNA疫苗，所述DNA疫苗包含根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体。

6.根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体用于制备用于慢性乙型肝炎病毒感染的治疗性DNA疫苗的用途。

7.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体或根据权利要求5所述的DNA疫苗、重组乙肝表面抗原s-HBsAg蛋白和佐剂。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述佐剂是CpG。

9.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体或根据权利要求5所述的DNA疫苗以及抗-HBsAg抗体。

10.用于治疗慢性乙型肝炎病毒感染的试剂盒，所述试剂盒包含根据权利要求1-4中任一项所述的核酸构建体或根据权利要求5所述的DNA疫苗以及抗-PDL1抗体。