CN114836443B

CN114836443B - 重组柯萨奇病毒a10 vlp及其用途

Info

Publication number: CN114836443B
Application number: CN202210494492.9A
Authority: CN
Inventors: 刘庆伟; 王晓黎; 刘艳; 石娜; 张玺; 边金; 秦松; 赵胜涛; 阮丽珠
Original assignee: Huasong Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Current assignee: Huasong Shanghai Biomedical Technology Co ltd
Priority date: 2022-05-07
Filing date: 2022-05-07
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-05-07
Also published as: CN114836443A; CN117187265A

Abstract

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A10VLP及其用途，所述重组柯萨奇病毒A10VLP由基因组中整合有编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的细胞系产生，或由基因组中整合有编码柯萨奇病毒A10的VP4、VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的细胞系产生。本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10VLP在制备预防手足口病产品中的用途。所述预防手足口病产品为药物组合物，例如为疫苗组合物。在免疫原性研究中发现本发明的柯萨奇病毒A10VLP可避免VP0的降解问题，可在小鼠体内诱导良好的免疫反应，提示该VLP可作为柯萨奇病毒A10的候选疫苗。

Description

重组柯萨奇病毒A10 VLP及其用途

技术领域

本发明涉及医药领域，特别是涉及重组柯萨奇病毒A10 VLP及其用途。

背景技术

手足口病是一种5岁以下儿童常见的婴幼儿传染病，主要临床表现为手、足和口等部位出现小疱疹或小溃疡，少数患儿可引起肺水肿、无菌性脑膜脑炎、心肌炎等一系列并发症甚至导致死亡。手足口病是由人肠道病毒属的柯萨奇病毒A组16、4、5、7、9、10，B组2、5型以及肠道病毒71型和埃可病毒30感染引起的，其中肠道病毒71和柯萨奇病毒A16是导致手足口病暴发的主要病原体。近年来由柯萨奇病毒A10感染的报道越来越常见。目前尚无针对柯萨奇病毒A10的特异性药物，因此疫苗就成为预防柯萨奇病毒A10感染的最有效的方法。柯萨奇病毒A10属于小RNA病毒科肠道病毒属，为无包膜的二十面立体对称球形颗粒，其基因组是单股正链RNA，两端为保守的非编码区，中间为一个开放阅读框的编码区，此编码区编码结构蛋白P1和非结构蛋白P2与P3，其中P1可被蛋白酶3CD切割为衣壳蛋白VP0、VP3和VP1，并组装成病毒的衣壳。这些衣壳蛋白与病毒RNA可进一步组装为真病毒，并伴随着VP0切割为VP4和VP2。病毒样颗粒(Virus-like particle，VLP)与病毒在形态与组成上相似，可诱导较好的免疫反应，为柯萨奇病毒A10疫苗的开发提供了一种方案。研究表明，共表达柯萨奇病毒A10结构蛋白P1和3CD后可切割为VP0、VP3和VP1衣壳蛋白，并进一步组装成柯萨奇病毒A10 VLP，且该VLP可以保护小鼠免受柯萨奇病毒A10致死性攻击。但制备的VLP的VP0会发生不同程度的降解，产生VP4和VP2，从而影响VLP的均一性。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供重组柯萨奇病毒A10 VLP及其用途，用于解决现有技术中的问题。

为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸为以下任一：

1)第一多核苷酸：包括编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸，不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸；

2)第二多核苷酸：包括编码柯萨奇病毒A10的VP4、VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸，不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸。

本发明还提供一种核酸构建体，所述核酸构建体包括任一所述多核苷酸。

本发明还提供一种细胞系，所述细胞系中包括所述核酸构建体，或基因组中整合有任一所述多核苷酸。

本发明还提供一种重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒选自以下任一：

1)包括VP2、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白；

包括VP4、VP2、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

1)培养所述细胞系，使其表达重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒；

2)分离出所述细胞系表达的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒。

本发明还提供所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病产品中的用途。

本发明还提供一种用于预防手足口病的药物组合物，所述药物组合物包括所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

如上所述，本发明的重组柯萨奇病毒A10 VLP及其用途，具有以下有益效果：柯萨奇病毒A10 VLP^-231和VLP^-4231解决了VP0降解的问题，进一步的免疫原性研究发现柯萨奇病毒A10 VLP^-231和VLP^-4231可在小鼠体内诱导良好的特异抗体水平，为柯萨奇病毒A10的疫苗研发提供了新思路。

附图说明

图1显示为本发明的pPink/HC-A10 VP^-231表达载体示意图，PAOX1为AOX1启动子，CYC1 TT为CYC1终止子，VP2、VP3和VP1为柯萨奇病毒A10衣壳蛋白序列。

图2显示为本发明的A10高表达株A10 VLP^-231的产量检测，将筛选得到的A10高表达株VLP^-231进行诱导表达，于诱导后24h和48h收集样品测定目的蛋白含量(VLP)和可溶性蛋白含量(TSP)，纵坐标为目的蛋白比可溶性蛋白，即VLP/TSP。

图3显示为本发明的柯萨奇病毒A10 VLP^-231粒径检测。

图4显示为本发明的柯萨奇病毒A10 VLP^-231免疫血清抗体滴度，图中为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

图5显示为本发明的pPink/HC-A10 VP^-4231表达载体示意图，P_AOX1为AOX1启动子，CYC1TT为CYC1终止子，VP4、VP2、VP3和VP1为柯萨奇病毒A10衣壳蛋白序列。

图6显示为本发明的A10高表达株A10 VLP^-4231的产量检测，将筛选得到的A10高表达株A10 VLP^-4231进行诱导表达，于诱导后24h和48h收集样品测定目的蛋白含量(VLP)和可溶性蛋白含量(TSP)，纵坐标为目的蛋白比可溶性蛋白，即VLP/TSP。

图7显示为本发明的柯萨奇病毒A10 VLP^-4231粒径检测。

图8显示为本发明的柯萨奇病毒A10 VLP^-4231免疫血清特异抗体滴度，为了方便统计，将OD450nm吸光值大于0.15的最高稀释倍数的倒数定位该样品的特异抗体滴度，横线显示为几何平均值。

具体实施方式

本发明提供一种多核苷酸，所述多核苷酸为以下任一：

如图1所示，所述第一多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸排列顺序为：VP2-VP3-VP1。

如图5所示，所述第二多核苷酸包括编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸排列顺序为：VP4-VP2-VP3-VP1。

所述多核苷酸中表达各衣壳蛋白的表达框在所述多核苷酸中串联。

在如图1所示的实施例中，具体的串联方式为启动子-VP2-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。当然，在其他实施方式中，三个表达框的串联方式也可以是以下中的任一种：启动子-VP2-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP1-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP2-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP2-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP3-终止子。在一种实施方式中，所述启动子为AOX1启动子，所述终止子为CYC1终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

在如图5所示的实施例中，具体的串联方式为启动子-VP4-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。当然，在其他实施方式中，四个表达框的串联方式也可以是任意排列组合，例如：启动子-VP4-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子、启动子-VP3-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP4-终止子、启动子-VP4-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子-启动子-VP2-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP4-终止子、启动子-VP1-终止子-启动子-VP2-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP4-终止子。在一种实施方式中，所述启动子为AOX1启动子，所述终止子为CYC1终止子。由于各蛋白均为独立的开放阅读框，因此不同的串联方式均能达到与实施例相同的效果。

所述编码柯萨奇病毒A10的VP4衣壳蛋白的核苷酸为VP4全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒A10的VP2衣壳蛋白的核苷酸为VP2全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP1衣壳蛋白的核苷酸为VP1全长核苷酸序列或截短的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒VP3衣壳蛋白的核苷酸为编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的全长核苷酸序列或截短的核苷酸序列。

在一种实施方式中，编码柯萨奇病毒A10的VP4衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ IDNO:7所示，编码柯萨奇病毒A10的VP2衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示。编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示。编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。

在一种实施方式中，与SEQ ID NO.7～10所示序列的同源性在95％以上的序列，或与SEQ ID NO.7～10所示序列互补的序列也能达到与本发明实施例相同的效果。

所述多核苷酸中不包括编码P1、3CD蛋白的核苷酸。

所述多核苷酸的序列为经过密码子优化后得到的序列。

在一种实施方式中，所述编码柯萨奇病毒A10的VP4衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的VP4衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP2衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP2衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VP3衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VP1衣壳蛋白。

术语“核酸构建体”是指可以被引入靶细胞或组织中的人工构建的核酸区段，所述核酸构建体包括载体骨架即表达载体与表达框，所述核酸构建体可以为质粒。

所述核酸构建体中VP4、VP2、VP3和VP1表达框可以是各自独立的单拷贝或多拷贝。较佳的，所述核酸构建体中VP4、VP2、VP3和VP1表达框均为单拷贝。

所述核酸构建体中除包括所述多核苷酸中所含的柯萨奇病毒A10的衣壳蛋白核苷酸外，不包括编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸。

在一种实施方式中，所述核酸构建体还包括表达载体。所述表达载体可以是现有技术中任意适于表达柯萨奇病毒的表达载体，例如为酵母表达载体。较佳的为毕赤酵母表达载体pPink-HC(厂家：Invitrogen)。

在如图1所示的实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

在如图5所示的实施方式中，所述核酸构建体核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示。

所述细胞系为真核细胞。在一种实施方式中，所述细胞系为将所述核酸构建体转导入毕赤酵母细胞得到。

2)包括VP4、VP2、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白。

所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒由所述细胞系产生。

重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的水合直径为35nm～45nm。所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒的大小均一。

2)分离出所述细胞系表达的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒。

在一种实施方式中，培养所述细胞系的条件为28℃-30℃，250-300rpm。

在一种实施方式中，所述细胞系通过将所述核酸构建体转导入宿主细胞得到。在一种实施方式中，所述宿主细胞为毕赤酵母细胞。

在一种实施方式中，所述核酸构建体的制备方法包括如下步骤：

1)将密码子优化后的表达柯萨奇病毒A10衣壳蛋白的核苷酸分别克隆入不同的表达载体中，获得中间构建体；

2)将步骤1)获得的中间构建体重组后获得所述核酸构建体。

在一种实施方式中，所述手足口病为柯萨奇病毒A10感染的手足口病。

所述预防手足口病产品为药物组合物。所述药物组合物例如为疫苗组合物。

所述药物组合物可以是单价的(仅含有一种病毒样颗粒)，也可以是多价的(含有多种病毒样颗粒)。

所述药物组合物可制备成各种常规剂型，例如：注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾剂等。

所述药物组合物包括预防或治疗有效量的本发明病毒样颗粒或多核苷酸。

术语“预防或治疗有效量”指药物组合物治疗、缓解或预防目标疾病或状况的量，或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。即病毒样颗粒的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗相关的疾病。该效果可通过例如抗原水平来检测。治疗效果也包括生理性症状的减少。对于某一对象的精确有效量取决于该对象的体型和健康状况、病症的性质和程度、以及选择给予的治疗剂和/或治疗剂的组合。因此，预先指定准确的有效量是没用的。然而，对于某给定的状况而言，可以用常规实验来确定该有效量。

在一种实施方式中，为了本发明的目的，有效的剂量为给予个体约0.001毫克/千克至1000毫克/千克，较佳地约0.01毫克/千克至100毫克/千克体重的病毒样颗粒。

药物组合物还可含有药学上可接受的载体。术语“药学上可接受的载体”指用于药物组合物(例如本发明的重组病毒样颗粒)给药的载体。该术语指这样一些药剂载体：它们本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体，且给药后没有过分的毒性。合适的载体可以是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸等。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。药学上可接受的载体可包括液体，如水、盐水、甘油和乙醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等。通常，可将组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。脂质体也包括在药学上可接受的载体的定义中。

一旦配成本发明的组合物，可将其直接给予对象。待治疗的对象可以是哺乳动物，尤其是人。

所述药物组合物例如为疫苗组合物。疫苗组合物可用已知的方法将本发明的病毒样颗粒直接施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。

给予本发明药物组合物的途径包括：肌内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要，可以组合给药途径，或根据疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。

实施例1柯萨奇病毒A10表达质粒pPink/HC-A10 VPN^-231的构建

为了使表达达到最优，将柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成。柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其中1-69为VP4氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，70-324为VP2氨基酸序列(SEQ ID NO:4)，325-564为VP3氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，565-862为VP1氨基酸序列(SEQ ID NO:6)。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。VP4的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，即SEQ ID NO:2中的1-207。VP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，即SEQ ID NO:2中208-972。VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，即SEQ ID NO:2中的973-1692。VP1的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，即SEQ ID NO:2中的1693-2586。

表达质粒的制备：根据优化后VP2、VP3、VP1的核苷酸序列及表达载体pPink-HC(购自Invitrogen)多克隆位点处序列设计合成重组引物(表1)，使用同源重组试剂盒(购自诺唯赞)利用同源重组酶将VP2、VP3、VP1通过重组的方式分别连接到载体pPinK-HC中分别得到中间质粒pPink/HC-A10 VP2、pPink/HC-A10 VP3、pPink/HC-A10 VP1；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法依次将中间质粒中A10 VP3表达框和A10 VP2表达框连入pPink/HC-A10 VP1中，分别得到终质粒pPink/HC-A10 VPN^-231(核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示)，示意图如图1所示。

表1同源重组引物序列

引物名称	序列号	引物序列
			A10VP2-F	SEQ ID NO:12	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgtctccttctgttgaggcttg-3’
A10VP2-R	SEQ ID NO:13	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgagaaacagcttgtctca-3’
			A10VP3-F	SEQ ID NO:14	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtattccagctgagttg-3’
A10VP3-R	SEQ ID NO:15	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgcaaaacagcttgttgag-3’
			A10VP1-F	SEQ ID NO:16	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcgaccgggtggccg-3’
A10VP1-R	SEQ ID NO:17	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattacagtgtggtgatggcggtc-3’

实施例2柯萨奇病毒A10高表达菌株的筛选、表达与纯化

高表达菌株的筛选

将实施例1制备的终质粒pPink/HC-A10 VPN^-231使用内切酶AflⅡ进行线性化，并用乙醇沉淀法进行纯化回收；利用电转的方法将线性化质粒分别导入不同的毕赤酵母中进行基因重组，涂布PAD平板与30℃进行培养；3天后，挑取大的白色菌落于24孔深孔板中使用BMMY培养基进行甲醇诱导表达(28℃，250rpm)，诱导表达48h后收取诱导菌体使用营养筛选法和夹心ELISA的方法进行表达检测，表达量高的作为高表达株A10 VLP^-23l，高表达菌株目的基因序列经测序分析与理论核苷酸序列一致。

夹心ELISA方法所用的兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清和柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗均为本公司自制，制备步骤如下：(1)兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清：将纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP(500μg/只)与弗氏佐剂1:1混合乳化后皮下多点注射成年的新西兰大白兔(1ml/只)，两次免疫间隔4周共免疫4次，第4次免疫2周后采取兔血清备用；(2)柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗：将纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)充分混合后，腹腔注射小鼠，两次免疫间隔2周共免疫4次，第4次免疫后2周取脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合后筛选得到柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗细胞株，将该细胞株腹腔注射小鼠后获得腹水，经protein G填料纯化后获得A10特异的鼠单抗备用。

夹心ELISA方法操作步骤如下：将兔抗柯萨奇病毒A10多抗血清按1:2000进行稀释包被于96孔酶标板中，50μl/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将菌体用PBS重悬，加入等体积玻璃珠后70HZ破碎120s，离心后取上清备用；破菌上清和柯萨奇病毒A10VLP自制标品用2％脱脂奶粉进行适当的稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入柯萨奇病毒A10特异的鼠单抗，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值，并根据标曲计算VLP含量。

表达与纯化

将筛选得到的高表达株A10 VLP^-231接种于BMGY培养基，培养24h(30℃，250rpm)后更换为BMMY培养基进行诱导表达(28℃，250rpm)，诱导24h、48h离心收获菌体。将菌体用PBS重悬后使用高压匀浆机1200bar进行破菌，离心后收集上清进行PEG沉降，复溶后的上清进行蔗糖梯度离心，最终获得目的VLPs，命名为A10 VLP^-231。测定目的蛋白含量(VLP)和可溶性蛋白含量(TSP)，结果如图2所示，48h的产量可达21μg/mg。

实施例3柯萨奇病毒A10 VLP的粒径研究

纯化后的柯萨奇病毒A10 VLP^-231用PBS稀释至50-200ng/μl，取1ml加入样品池中，避免产生气泡，将样品池放入Zetasizer设备中采用动态光散射的方法测定其水合直径并进行数据分析。A10 VLP^-231的水合直径为40nm左右，结果如图3所示，故A10 VLP^-231组装良好。

实施例4柯萨奇病毒A10 VLP的免疫原性

为了确定柯萨奇病毒A10 VLP^-231的免疫原性，将A10 VLP^--231免疫小鼠，具体步骤如下：6-8周龄雌性Balb/C小鼠，共分为2组，每组5只。将VLP^-231(5μg/只)与铝佐剂(500μg/只)室温振荡吸附1-2h，然后进行肌肉注射(100μL/只)，共免疫2次，两次免疫之间间隔4周。于第二次免疫后2周采取小鼠血清测定特异抗体滴度。

柯萨奇病毒A10 VLP特异抗体滴度测定

将兔抗柯萨奇病毒A10 VLP包被于96孔酶标板中，20ng/孔，4℃包被过夜后用5％脱脂奶粉进行封闭；将血清样品用2％脱脂奶粉进行倍比稀释后加到封闭后的酶标板中，于37℃进行孵育；2h后，加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗鼠二抗，37℃孵育1h后进行显色并读取450nm吸光值。如图4所示，VLP^-231可诱导良好的特异性抗体。

前述实施例为柯萨奇病毒A10 VLP^-231的实施例。以下实施例为柯萨奇病毒A10VLP^-4231的实施例。

实施例5柯萨奇病毒A10表达质粒pPink/HC-A10 VPN^-4231的制备及其免疫原性分析

为了使表达达到最优，将柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列根据毕赤酵母密码子偏好性进行优化合成。柯萨奇病毒A10结构蛋白P1氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。VP4的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，即SEQ IDNO:2中的1-207。VP2的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，即SEQ ID NO:2中208-972。VP3的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，即SEQ ID NO:2中的973-1692。VP1的核苷酸序列如SEQ IDNO:10所示，即SEQ ID NO:2中的1693-2586。

根据优化后VP4、VP2、VP3、VP1的核苷酸序列及表达载体pPink-HC(购自Invitrogen)多克隆位点处序列设计合成重组引物(表2)，使用同源重组试剂盒(购自诺唯赞)利用同源重组酶将VP4、VP2、VP3、VP1通过重组的方式分别连接到载体pPinK-HC中分别得到中间质粒pPink/HC-A10 VP4、pPink/HC-A10 VP2、pPink/HC-A10 VP3、pPink/HC-A10VP1；利用同尾酶BglⅡ和BamHⅠ以酶切连接的方法依次将中间质粒中A10 VP4表达框、A10VP3表达框和A10 VP2表达框连入pPink/HC-A10 VP1中，分别得到终质粒pPink/HC-A10VPN^-4231(核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)，示意图如图5所示。

表2同源重组引物序列

引物名称	序列号	引物序列
			A10VP4-F	SEQ ID NO:19	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtgctcaagtttctac-3’
A10VP4-R	SEQ ID NO:20	5’-tttaaatggccggccggtacctcattagttcaatggagcagacaattc-3’
			A10VP2-F	SEQ ID NO:21	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgtctccttctgttgaggcttg-3’
A10VP2-R	SEQ ID NO:22	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgagaaacagcttgtctca-3’
			A10VP3-F	SEQ ID NO:23	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggtattccagctgagttg-3’
A10VP3-R	SEQ ID NO:24	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattattgcaaaacagcttgttgag-3’
			A10VP1-F	SEQ ID NO:25	5’-caactaattattcgaaacggaattcaccatgggcgaccgggtggccg-3’
A10VP1-R	SEQ ID NO:26	5’-ctgtatttaaatggccggccggtacctcattacagtgtggtgatggcggtc-3’

将表达质粒pPink/HC-A10 VP^-4231线性化后导入毕赤酵母中进行基因重组，采用营养筛选与夹心ELISA方法进行筛选，最终获得高表达株A10 VLP^-4231。具体实验方法同实施例2。结果如图6所示，该高表达株产量可达5μg/mg。

将筛选获得的柯萨奇病毒A10高表达菌株A10 VLP^-4231进行发酵与纯化，蔗糖密度梯度离心样品纯化，最终获得了柯萨奇病毒A10 VLP^-4231，经动态光散射测定(实验步骤同实施例4)其水合直径约为40nm(图7)。

为了测定重组表达的柯萨奇病毒A10 VLP^-4231的免疫原性，将纯化后的柯萨奇病毒A10VLP^-4231通过肌肉注射的方式免疫小鼠，第二次免疫2周后采集小鼠血清进行抗体滴度的测定，实验步骤同实施例5。结果如图8所示，柯萨奇病毒A10 VLP^-4231可诱导良好的免疫反应。

本实施例利用毕赤酵母串联表达了柯萨奇病毒A10的VP4、VP2、VP3和VP1衣壳蛋白，并获得了成功组装为颗粒的柯萨奇病毒A10 VLP^-4231，解决了VP0降解引起的条带不均一问题，为肠道病毒VLP的制备提供的新的方法。进一步的免疫原性研究发现这种柯萨奇病毒A10 VLP^-4231可在小鼠体内诱导良好的抗体水平，提示该VLP可作为柯萨奇病毒A10的候选疫苗。

以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。

序列表

<110> 华淞（上海）生物医药科技有限公司

<120> 重组柯萨奇病毒A10 VLP及其用途

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 862

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Lys Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp

65 70 75 80

Arg Val Ala Gln Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu

85 90 95

Ala Ala Asn Ile Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro

100 105 110

Asp Thr Asp Ala Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser

115 120 125

Val Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser

130 135 140

Thr Gly Trp Tyr Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val

145 150 155 160

Phe Gly Gln Asn Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys

165 170 175

Leu His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu

180 185 190

Val Ala Val Ile Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Pro Asn Glu Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly

210 215 220

Thr Thr Gly Ala Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val

225 230 235 240

Pro Leu Ser Gln Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg

245 250 255

Thr Asn Asn Cys Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro

260 265 270

Phe Asp Ser Ala Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro

275 280 285

Val Ser Pro Leu Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile

290 295 300

Thr Ile Thr Ile Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln

305 310 315 320

Ala Val Ser Gln Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln

325 330 335

Phe Leu Thr Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe

340 345 350

Thr Pro Thr Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu

355 360 365

Glu Leu Cys Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu

370 375 380

Ala Thr Gly Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Arg

385 390 395 400

Ala Asp Glu Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly

405 410 415

Pro Trp Gln Ser Thr Leu Val Gly Gln Val Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln

420 425 430

Trp Ser Gly Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met

435 440 445

Ala Thr Gly Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln

450 455 460

Pro Ala Asn Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp

465 470 475 480

Phe Gly Leu Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn

485 490 495

Thr His Phe Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr

500 505 510

Ala Gly Val Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro

515 520 525

Glu Thr Pro Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp

530 535 540

Asn Phe Thr Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln

545 550 555 560

Ala Val Leu Gln Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu

565 570 575

Gly Asn Thr Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Thr Asn Val Glu Ser

580 585 590

Ala Ala Asn Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val

595 600 605

Pro Ala Leu Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp

610 615 620

Glu Asn Met Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu

625 630 635 640

Glu Thr Thr Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val

645 650 655

Val Asn Leu Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp

660 665 670

Asp Ile Asp Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met

675 680 685

Phe Thr Tyr Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr

690 695 700

Glu Asn Gly Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro

705 710 715 720

Pro Gly Ala Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr

725 730 735

Ala Thr Asn Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln

740 745 750

Val Ser Val Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr

755 760 765

Asp Gly Tyr Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr

770 775 780

Tyr Gly Leu Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val

785 790 795 800

Val Ser Arg Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met

805 810 815

Lys Leu Lys His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln

820 825 830

Pro Tyr Leu Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Ile Ala

835 840 845

Asn Ser Ala Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

850 855 860

<210> 2

<211> 2586

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtgctc aagtttctac tcaaaagtct ggttctcatg aaactggtaa cgttgctact 60

ggtggttcta ctattaattt cactaacatc aactactaca aggattctta cgctgcttct 120

gctactagac aagatttcac tcaagatcca aagaaattca ctcaacctgt tttggattct 180

attaaggaat tgtctgctcc attgaactct ccttctgttg aggcttgtgg ttattctgat 240

agagttgctc aattgactgt tggtaactct tctattacta ctcaagaagc tgctaatatt 300

gttttggctt acggtgaatg gccagagtat tgtcctgata ctgatgctac tgctgttgat 360

aagccaacta gacctgatgt ttctgttaac agattctaca ctttggattc taagatgtgg 420

caagaaaact ctactggttg gtattggaag ttcccagatg ttttgaacaa aactggtgtt 480

tttggtcaaa atgctcaatt ccactacttg tatagatccg gtttttgttt gcatgttcaa 540

tgtaatgctt ctaagttcca ccaaggtgct ttgttggttg ctgttattcc tgaatttgtt 600

attgctggta gaggttctaa cactaaacca aatgaggctc cacatcctgg ttttactact 660

actttccctg gtactactgg tgctactttc cacgatccat acgttttgga ttctggtgtt 720

cctttgtctc aagctttgat ctacccacat caatggatca acttgagaac taacaactgt 780

gctactgtta ttgttccata cattaatgct gttcctttcg attctgctat taaccactct 840

aacttcggtt tgatcgttat cccagtttct cctttgaaat actcttctgg tgctactact 900

gctatcccaa tcactatcac tatcgctcct ttgaactctg aatttggtgg tttgagacaa 960

gctgtttctc aaggtattcc agctgagttg agacctggta ctaaccaatt cttgactact 1020

gatgatgata ctgctgctcc aattttgcct ggtttcactc caactcctac tattcatatt 1080

ccaggtgaag ttcactcttt gttggagttg tgtagagttg aaactatctt ggaggttaac 1140

aacactactg aagctactgg tttgactaga ttgttgattc ctgtttcttc tcaaaacaga 1200

gctgatgagt tgtgtgctgc ttttatggtt gatccaggta gaattggtcc ttggcaatct 1260

actttggttg gtcaagtttg tagatactat actcaatggt ctggttcttt gaaggttact 1320

tttatgttca ctggttcttt catggctact ggtaaaatgt tggttgctta ctctccacct 1380

ggttctgctc aaccagctaa tagagaaact gctatgttgg gtactcatgt tatttgggat 1440

tttggtttgc aatcttctgt ttctttggtt attccttgga tttctaacac tcacttcaga 1500

actgctaaga ctggtggtaa ttacgattac tatactgctg gtgttgttac tttgtggtat 1560

caaactaact atgttgttcc acctgaaact ccaggagagg cttatattat tgctatgggt 1620

gctgctcaag ataacttcac tttgaagatt tgtaaggata ctgatgaagt tactcaacaa 1680

gctgttttgc aaggagatcc agttgaggat attattcatg atgctttggg taacactgct 1740

agaagagcta tttcttctgc tactaacgtt gaatctgctg ctaatactac tccttcttct 1800

cacagattgg aaactggtag agttccagct ttgcaagctg ctgagactgg tgctacttct 1860

aacgctactg atgaaaacat gatcgagact agatgtgttg ttaacagaaa tggtgttttg 1920

gaaactacta ttaaccattt cttttctaga tccggtttgg ttggtgttgt taatttgact 1980

gatggtggta ctgatactac tggttacgct acttgggata tcgatatcat gggtttcgtt 2040

caattgagaa gaaagtgtga aatgttcact tacatgagat tcaacgctga gtttactttc 2100

gttactacta ctgaaaatgg agaggctaga ccatatatgt tgcaatacat gtatgttcca 2160

cctggtgctc caaagcctac tggtagagat gcttttcaat ggcaaactgc tactaaccct 2220

tctgttttcg ttaaattgac tgatccacct gctcaagttt ctgttccatt catgtctcct 2280

gcttctgctt accaatggtt ttacgatggt tatccaactt tcggtcaaca tcctgaaact 2340

tctaatacta cttatggttt gtgtccaaac aatatgatgg gtactttcgc tgttagagtt 2400

gtttctagag aggcttctca attgaagttg caaactagag tttacatgaa gttgaaacac 2460

gttagagctt gggttccaag acctattaga tcccaaccat acttgttgaa gaacttccct 2520

aactacgatt cttctaagat cgctaactct gctagagata gatcctctat taaacaagct 2580

aacatg 2586

<210> 3

<211> 69

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Ser Gly Ser His Glu Thr Gly

1 5 10 15

Asn Val Ala Thr Gly Gly Ser Thr Ile Asn Phe Thr Asn Ile Asn Tyr

20 25 30

Tyr Lys Asp Ser Tyr Ala Ala Ser Ala Thr Arg Gln Asp Phe Thr Gln

35 40 45

Asp Pro Lys Lys Phe Thr Gln Pro Val Leu Asp Ser Ile Lys Glu Leu

50 55 60

Ser Ala Pro Leu Asn

65

<210> 4

<211> 256

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Pro Ser Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp Arg Val Ala Gln

1 5 10 15

Leu Thr Val Gly Asn Ser Ser Ile Thr Thr Gln Glu Ala Ala Asn Ile

20 25 30

Val Leu Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Glu Tyr Cys Pro Asp Thr Asp Ala

35 40 45

Thr Ala Val Asp Lys Pro Thr Arg Pro Asp Val Ser Val Asn Arg Phe

50 55 60

Tyr Thr Leu Asp Ser Lys Met Trp Gln Glu Asn Ser Thr Gly Trp Tyr

65 70 75 80

Trp Lys Phe Pro Asp Val Leu Asn Lys Thr Gly Val Phe Gly Gln Asn

85 90 95

Ala Gln Phe His Tyr Leu Tyr Arg Ser Gly Phe Cys Leu His Val Gln

100 105 110

Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Leu Val Ala Val Ile

115 120 125

Pro Glu Phe Val Ile Ala Gly Arg Gly Ser Asn Thr Lys Pro Asn Glu

130 135 140

Ala Pro His Pro Gly Phe Thr Thr Thr Phe Pro Gly Thr Thr Gly Ala

145 150 155 160

Thr Phe His Asp Pro Tyr Val Leu Asp Ser Gly Val Pro Leu Ser Gln

165 170 175

Ala Leu Ile Tyr Pro His Gln Trp Ile Asn Leu Arg Thr Asn Asn Cys

180 185 190

Ala Thr Val Ile Val Pro Tyr Ile Asn Ala Val Pro Phe Asp Ser Ala

195 200 205

Ile Asn His Ser Asn Phe Gly Leu Ile Val Ile Pro Val Ser Pro Leu

210 215 220

Lys Tyr Ser Ser Gly Ala Thr Thr Ala Ile Pro Ile Thr Ile Thr Ile

225 230 235 240

Ala Pro Leu Asn Ser Glu Phe Gly Gly Leu Arg Gln Ala Val Ser Gln

245 250 255

<210> 5

<211> 241

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Met Gly Ile Pro Ala Glu Leu Arg Pro Gly Thr Asn Gln Phe Leu Thr

1 5 10 15

Thr Asp Asp Asp Thr Ala Ala Pro Ile Leu Pro Gly Phe Thr Pro Thr

20 25 30

Pro Thr Ile His Ile Pro Gly Glu Val His Ser Leu Leu Glu Leu Cys

35 40 45

Arg Val Glu Thr Ile Leu Glu Val Asn Asn Thr Thr Glu Ala Thr Gly

50 55 60

Leu Thr Arg Leu Leu Ile Pro Val Ser Ser Gln Asn Arg Ala Asp Glu

65 70 75 80

Leu Cys Ala Ala Phe Met Val Asp Pro Gly Arg Ile Gly Pro Trp Gln

85 90 95

Ser Thr Leu Val Gly Gln Val Cys Arg Tyr Tyr Thr Gln Trp Ser Gly

100 105 110

Ser Leu Lys Val Thr Phe Met Phe Thr Gly Ser Phe Met Ala Thr Gly

115 120 125

Lys Met Leu Val Ala Tyr Ser Pro Pro Gly Ser Ala Gln Pro Ala Asn

130 135 140

Arg Glu Thr Ala Met Leu Gly Thr His Val Ile Trp Asp Phe Gly Leu

145 150 155 160

Gln Ser Ser Val Ser Leu Val Ile Pro Trp Ile Ser Asn Thr His Phe

165 170 175

Arg Thr Ala Lys Thr Gly Gly Asn Tyr Asp Tyr Tyr Thr Ala Gly Val

180 185 190

Val Thr Leu Trp Tyr Gln Thr Asn Tyr Val Val Pro Pro Glu Thr Pro

195 200 205

Gly Glu Ala Tyr Ile Ile Ala Met Gly Ala Ala Gln Asp Asn Phe Thr

210 215 220

Leu Lys Ile Cys Lys Asp Thr Asp Glu Val Thr Gln Gln Ala Val Leu

225 230 235 240

Gln

<210> 6

<211> 299

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Gly Asp Pro Val Glu Asp Ile Ile His Asp Ala Leu Gly Asn Thr

1 5 10 15

Ala Arg Arg Ala Ile Ser Ser Ala Thr Asn Val Glu Ser Ala Ala Asn

20 25 30

Thr Thr Pro Ser Ser His Arg Leu Glu Thr Gly Arg Val Pro Ala Leu

35 40 45

Gln Ala Ala Glu Thr Gly Ala Thr Ser Asn Ala Thr Asp Glu Asn Met

50 55 60

Ile Glu Thr Arg Cys Val Val Asn Arg Asn Gly Val Leu Glu Thr Thr

65 70 75 80

Ile Asn His Phe Phe Ser Arg Ser Gly Leu Val Gly Val Val Asn Leu

85 90 95

Thr Asp Gly Gly Thr Asp Thr Thr Gly Tyr Ala Thr Trp Asp Ile Asp

100 105 110

Ile Met Gly Phe Val Gln Leu Arg Arg Lys Cys Glu Met Phe Thr Tyr

115 120 125

Met Arg Phe Asn Ala Glu Phe Thr Phe Val Thr Thr Thr Glu Asn Gly

130 135 140

Glu Ala Arg Pro Tyr Met Leu Gln Tyr Met Tyr Val Pro Pro Gly Ala

145 150 155 160

Pro Lys Pro Thr Gly Arg Asp Ala Phe Gln Trp Gln Thr Ala Thr Asn

165 170 175

Pro Ser Val Phe Val Lys Leu Thr Asp Pro Pro Ala Gln Val Ser Val

180 185 190

Pro Phe Met Ser Pro Ala Ser Ala Tyr Gln Trp Phe Tyr Asp Gly Tyr

195 200 205

Pro Thr Phe Gly Gln His Pro Glu Thr Ser Asn Thr Thr Tyr Gly Leu

210 215 220

Cys Pro Asn Asn Met Met Gly Thr Phe Ala Val Arg Val Val Ser Arg

225 230 235 240

Glu Ala Ser Gln Leu Lys Leu Gln Thr Arg Val Tyr Met Lys Leu Lys

245 250 255

His Val Arg Ala Trp Val Pro Arg Pro Ile Arg Ser Gln Pro Tyr Leu

260 265 270

Leu Lys Asn Phe Pro Asn Tyr Asp Ser Ser Lys Ile Ala Asn Ser Ala

275 280 285

Arg Asp Arg Ser Ser Ile Lys Gln Ala Asn Met

290 295

<210> 7

<211> 207

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgggtgctc aagtttctac tcaaaagtct ggttctcatg aaactggtaa cgttgctact 60

ggtggttcta ctattaattt cactaacatc aactactaca aggattctta cgctgcttct 120

gctactagac aagatttcac tcaagatcca aagaaattca ctcaacctgt tttggattct 180

attaaggaat tgtctgctcc attgaac 207

<210> 8

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgtctcctt ctgttgaggc ttgtggttat tctgatagag ttgctcaatt gactgttggt 60

aactcttcta ttactactca agaagctgct aatattgttt tggcttacgg tgaatggcca 120

gagtattgtc ctgatactga tgctactgct gttgataagc caactagacc tgatgtttct 180

gttaacagat tctacacttt ggattctaag atgtggcaag aaaactctac tggttggtat 240

tggaagttcc cagatgtttt gaacaaaact ggtgtttttg gtcaaaatgc tcaattccac 300

tacttgtata gatccggttt ttgtttgcat gttcaatgta atgcttctaa gttccaccaa 360

ggtgctttgt tggttgctgt tattcctgaa tttgttattg ctggtagagg ttctaacact 420

aaaccaaatg aggctccaca tcctggtttt actactactt tccctggtac tactggtgct 480

actttccacg atccatacgt tttggattct ggtgttcctt tgtctcaagc tttgatctac 540

ccacatcaat ggatcaactt gagaactaac aactgtgcta ctgttattgt tccatacatt 600

aatgctgttc ctttcgattc tgctattaac cactctaact tcggtttgat cgttatccca 660

gtttctcctt tgaaatactc ttctggtgct actactgcta tcccaatcac tatcactatc 720

gctcctttga actctgaatt tggtggtttg agacaagctg tttctcaa 768

<210> 9

<211> 723

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgggtattc cagctgagtt gagacctggt actaaccaat tcttgactac tgatgatgat 60

actgctgctc caattttgcc tggtttcact ccaactccta ctattcatat tccaggtgaa 120

gttcactctt tgttggagtt gtgtagagtt gaaactatct tggaggttaa caacactact 180

gaagctactg gtttgactag attgttgatt cctgtttctt ctcaaaacag agctgatgag 240

ttgtgtgctg cttttatggt tgatccaggt agaattggtc cttggcaatc tactttggtt 300

ggtcaagttt gtagatacta tactcaatgg tctggttctt tgaaggttac ttttatgttc 360

actggttctt tcatggctac tggtaaaatg ttggttgctt actctccacc tggttctgct 420

caaccagcta atagagaaac tgctatgttg ggtactcatg ttatttggga ttttggtttg 480

caatcttctg tttctttggt tattccttgg atttctaaca ctcacttcag aactgctaag 540

actggtggta attacgatta ctatactgct ggtgttgtta ctttgtggta tcaaactaac 600

tatgttgttc cacctgaaac tccaggagag gcttatatta ttgctatggg tgctgctcaa 660

gataacttca ctttgaagat ttgtaaggat actgatgaag ttactcaaca agctgttttg 720

caa 723

<210> 10

<211> 897

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

atgggagatc cagttgagga tattattcat gatgctttgg gtaacactgc tagaagagct 60

atttcttctg ctactaacgt tgaatctgct gctaatacta ctccttcttc tcacagattg 120

gaaactggta gagttccagc tttgcaagct gctgagactg gtgctacttc taacgctact 180

gatgaaaaca tgatcgagac tagatgtgtt gttaacagaa atggtgtttt ggaaactact 240

attaaccatt tcttttctag atccggtttg gttggtgttg ttaatttgac tgatggtggt 300

actgatacta ctggttacgc tacttgggat atcgatatca tgggtttcgt tcaattgaga 360

agaaagtgtg aaatgttcac ttacatgaga ttcaacgctg agtttacttt cgttactact 420

actgaaaatg gagaggctag accatatatg ttgcaataca tgtatgttcc acctggtgct 480

ccaaagccta ctggtagaga tgcttttcaa tggcaaactg ctactaaccc ttctgttttc 540

gttaaattga ctgatccacc tgctcaagtt tctgttccat tcatgtctcc tgcttctgct 600

taccaatggt tttacgatgg ttatccaact ttcggtcaac atcctgaaac ttctaatact 660

acttatggtt tgtgtccaaa caatatgatg ggtactttcg ctgttagagt tgtttctaga 720

gaggcttctc aattgaagtt gcaaactaga gtttacatga agttgaaaca cgttagagct 780

tgggttccaa gacctattag atcccaacca tacttgttga agaacttccc taactacgat 840

tcttctaaga tcgctaactc tgctagagat agatcctcta ttaaacaagc taacatg 897

<210> 11

<211> 12555

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgtctccttc 960

tgttgaggct tgtggttatt ctgatagagt tgctcaattg actgttggta actcttctat 1020

tactactcaa gaagctgcta atattgtttt ggcttacggt gaatggccag agtattgtcc 1080

tgatactgat gctactgctg ttgataagcc aactagacct gatgtttctg ttaacagatt 1140

ctacactttg gattctaaga tgtggcaaga aaactctact ggttggtatt ggaagttccc 1200

agatgttttg aacaaaactg gtgtttttgg tcaaaatgct caattccact acttgtatag 1260

atccggtttt tgtttgcatg ttcaatgtaa tgcttctaag ttccaccaag gtgctttgtt 1320

ggttgctgtt attcctgaat ttgttattgc tggtagaggt tctaacacta aaccaaatga 1380

ggctccacat cctggtttta ctactacttt ccctggtact actggtgcta ctttccacga 1440

tccatacgtt ttggattctg gtgttccttt gtctcaagct ttgatctacc cacatcaatg 1500

gatcaacttg agaactaaca actgtgctac tgttattgtt ccatacatta atgctgttcc 1560

tttcgattct gctattaacc actctaactt cggtttgatc gttatcccag tttctccttt 1620

gaaatactct tctggtgcta ctactgctat cccaatcact atcactatcg ctcctttgaa 1680

ctctgaattt ggtggtttga gacaagctgt ttctcaataa tgaggtaccg gccggccatt 1740

taaatacagg ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt 1800

cacgccctcc tcccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 1860

aggtccctat ttattttttt taatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 1920

aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt 1980

gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc aagctggatc taacatccaa 2040

agacgaaagg ttgaatgaaa cctttttgcc atccgacatc cacaggtcca ttctcacaca 2100

taagtgccaa acgcaacagg aggggataca ctagcagcag accgttgcaa acgcaggacc 2160

tccactcctc ttctcctcaa cacccacttt tgccatcgaa aaaccagccc agttattggg 2220

cttgattgga gctcgctcat tccaattcct tctattaggc tactaacacc atgactttat 2280

tagcctgtct atcctggccc ccctggcgag gttcatgttt gtttatttcc gaatgcaaca 2340

agctccgcat tacacccgaa catcactcca gatgagggct ttctgagtgt ggggtcaaat 2400

agtttcatgt tccccaaatg gcccaaaact gacagtttaa acgctgtctt ggaacctaat 2460

atgacaaaag cgtgatctca tccaagatga actaagtttg gttcgttgaa atgctaacgg 2520

ccagttggtc aaaaagaaac ttccaaaagt cggcataccg tttgtcttgt ttggtattga 2580

ttgacgaatg ctcaaaaata atctcattaa tgcttagcgc agtctctcta tcgcttctga 2640

accccggtgc acctgtgccg aaacgcaaat ggggaaacac ccgctttttg gatgattatg 2700

cattgtctcc acattgtatg cttccaagat tctggtggga atactgctga tagcctaacg 2760

ttcatgatca aaatttaact gttctaaccc ctacttgaca gcaatatata aacagaagga 2820

agctgccctg tcttaaacct ttttttttat catcattatt agcttacttt cataattgcg 2880

actggttcca attgacaagc ttttgatttt aacgactttt aacgacaact tgagaagatc 2940

aaaaaacaac taattattcg aaacggaatt caccatgggt attccagctg agttgagacc 3000

tggtactaac caattcttga ctactgatga tgatactgct gctccaattt tgcctggttt 3060

cactccaact cctactattc atattccagg tgaagttcac tctttgttgg agttgtgtag 3120

agttgaaact atcttggagg ttaacaacac tactgaagct actggtttga ctagattgtt 3180

gattcctgtt tcttctcaaa acagagctga tgagttgtgt gctgctttta tggttgatcc 3240

aggtagaatt ggtccttggc aatctacttt ggttggtcaa gtttgtagat actatactca 3300

atggtctggt tctttgaagg ttacttttat gttcactggt tctttcatgg ctactggtaa 3360

aatgttggtt gcttactctc cacctggttc tgctcaacca gctaatagag aaactgctat 3420

gttgggtact catgttattt gggattttgg tttgcaatct tctgtttctt tggttattcc 3480

ttggatttct aacactcact tcagaactgc taagactggt ggtaattacg attactatac 3540

tgctggtgtt gttactttgt ggtatcaaac taactatgtt gttccacctg aaactccagg 3600

agaggcttat attattgcta tgggtgctgc tcaagataac ttcactttga agatttgtaa 3660

ggatactgat gaagttactc aacaagctgt tttgcaataa tgaggtaccg gccggccatt 3720

taaatacagg ccccttttcc tttgtcgata tcatgtaatt agttatgtca cgcttacatt 3780

cacgccctcc tcccacatcc gctctaaccg aaaaggaagg agttagacaa cctgaagtct 3840

aggtccctat ttattttttt taatagttat gttagtatta agaacgttat ttatatttca 3900

aatttttctt ttttttctgt acaaacgcgt gtacgcatgt aacattatac tgaaaacctt 3960

gcttgagaag gttttgggac gctcgaaggc tttaatttgc aagctggatc taacatccaa 4020

agacgaaagg ttgaatgaaa cctttttgcc atccgacatc cacaggtcca ttctcacaca 4080

taagtgccaa acgcaacagg aggggataca ctagcagcag accgttgcaa acgcaggacc 4140

tccactcctc ttctcctcaa cacccacttt tgccatcgaa aaaccagccc agttattggg 4200

cttgattgga gctcgctcat tccaattcct tctattaggc tactaacacc atgactttat 4260

tagcctgtct atcctggccc ccctggcgag gttcatgttt gtttatttcc gaatgcaaca 4320

agctccgcat tacacccgaa catcactcca gatgagggct ttctgagtgt ggggtcaaat 4380

agtttcatgt tccccaaatg gcccaaaact gacagtttaa acgctgtctt ggaacctaat 4440

atgacaaaag cgtgatctca tccaagatga actaagtttg gttcgttgaa atgctaacgg 4500

ccagttggtc aaaaagaaac ttccaaaagt cggcataccg tttgtcttgt ttggtattga 4560

ttgacgaatg ctcaaaaata atctcattaa tgcttagcgc agtctctcta tcgcttctga 4620

accccggtgc acctgtgccg aaacgcaaat ggggaaacac ccgctttttg gatgattatg 4680

cattgtctcc acattgtatg cttccaagat tctggtggga atactgctga tagcctaacg 4740

ttcatgatca aaatttaact gttctaaccc ctacttgaca gcaatatata aacagaagga 4800

agctgccctg tcttaaacct ttttttttat catcattatt agcttacttt cataattgcg 4860

actggttcca attgacaagc ttttgatttt aacgactttt aacgacaact tgagaagatc 4920

aaaaaacaac taattattcg aaacggaatt caccatggga gatccagttg aggatattat 4980

tcatgatgct ttgggtaaca ctgctagaag agctatttct tctgctacta acgttgaatc 5040

tgctgctaat actactcctt cttctcacag attggaaact ggtagagttc cagctttgca 5100

agctgctgag actggtgcta cttctaacgc tactgatgaa aacatgatcg agactagatg 5160

tgttgttaac agaaatggtg ttttggaaac tactattaac catttctttt ctagatccgg 5220

tttggttggt gttgttaatt tgactgatgg tggtactgat actactggtt acgctacttg 5280

ggatatcgat atcatgggtt tcgttcaatt gagaagaaag tgtgaaatgt tcacttacat 5340

gagattcaac gctgagttta ctttcgttac tactactgaa aatggagagg ctagaccata 5400

tatgttgcaa tacatgtatg ttccacctgg tgctccaaag cctactggta gagatgcttt 5460

tcaatggcaa actgctacta acccttctgt tttcgttaaa ttgactgatc cacctgctca 5520

agtttctgtt ccattcatgt ctcctgcttc tgcttaccaa tggttttacg atggttatcc 5580

aactttcggt caacatcctg aaacttctaa tactacttat ggtttgtgtc caaacaatat 5640

gatgggtact ttcgctgtta gagttgtttc tagagaggct tctcaattga agttgcaaac 5700

tagagtttac atgaagttga aacacgttag agcttgggtt ccaagaccta ttagatccca 5760

accatacttg ttgaagaact tccctaacta cgattcttct aagatcgcta actctgctag 5820

agatagatcc tctattaaac aagctaacat gtaatgaggt accggccggc catttaaata 5880

caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt aattagttat gtcacgctta cattcacgcc 5940

ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc 6000

ctatttattt tttttaatag ttatgttagt attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt 6060

tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga 6120

gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat ttgcaagctg gatccgcggc cgccttccaa 6180

actctcatgg attctcaggt aataggtatt ctaggaggag gccagctagg ccgaatgatt 6240

gttgaggccg ctagcaggct caatatcaag accgtgattc ttgatgatgg tttttcacct 6300

gctaagcaca ttaatgctgc gcaagaccac atcgacggat cattcaaaga tgaggaggct 6360

atcgccaagt tagctgccaa atgtgatgtt ctcactgtag agattgagca tgtcaacaca 6420

gatgctctaa agagagttca agacagaact ggaatcaaga tatatccttt accagagaca 6480

atcgaactaa tcaaggataa gtacttgcaa aaggaacatt tgatcaagca caacatttcg 6540

gtgacaaagt ctcagggtat agaatctaat gaaaaggcgc tgcttttgtt tggagaagag 6600

aatggatttc catatctgtt gaagtcccgg actatggctt atgatggaag aggcaatttt 6660

gtagtggagt ctaaagagga catcagtaag gcattagagt tcttgaaaga tcgtccattg 6720

tatgccgaga agtttgctcc ttttgttaaa gaattagcgg taatggttgt gagatcactg 6780

gaaggcgaag tattctccta cccaaccgta gaaactgtgc acaaggacaa tatctgtcat 6840

attgtgtatg ctccggccag agttaatgac accatccaaa agaaagctca aatattagct 6900

gaaaacactg tgaagacttt cccaggcgct ggaatcttcg gagttgagat gttcctattg 6960

tctgatggag aacttcttgt aaatgagatt gctccaaggc cccacaattc tggtcactat 7020

acaatcgatg catgtgtaac atctcagttc gaagcacatg taagagccat aactggtctg 7080

ccaatgccac tagatttcac caaactatct acttccaaca ccaacgctat tatgctcaat 7140

gttttgggtg ctgaaaaatc tcacggggaa ttagagtttt gtagaagagc cttagaaaca 7200

cccggtgctt ctgtatatct gtacggaaag accacccgat tggctcgtaa gatgggtcat 7260

atcaacataa taggatcttc catgttggaa gcagaacaaa agttagagta cattctagaa 7320

gaatcaaccc acttaccatc cagtactgta tcagctgaca ctaaaccgtt ggttggagtt 7380

atcatgggtt cagactctga tctacctgtg atttcgaaag gttgcgatat tttaaaacag 7440

tttggtgttc cattcgaagt tactattgtc tctgctcata gaacaccaca gagaatgacc 7500

agatatgcct ttgaagccgc tagtagaggt atcaaggcta tcattgcagg tgctggtggt 7560

gctgctcatc ttccaggaat ggttgctgcc atgactccgt tgccagtcat tggtgttcct 7620

gtcaagggct ctacgttgga tggtgtagac tcgctacact cgattgtcca aatgcctaga 7680

ggtgttcctg tggctacggt tgctatcaac aacgccacca atgccgctct gttggccatc 7740

aggattttag gtacaattga ccacaaatgg caaaaggaaa tgtccaagta tatgaatgca 7800

atggagaccg aagtgttggg gaaggcatcc aacttggaat ctgaagggta tgaatcctat 7860

ttgaagaatc gtctttgaat ttagtattgt tttttaatag atgtatatat aatagtacac 7920

gtaacttatc tattccattc ataattttat tttaaaggtt cggtagaaat ttgtcctcca 7980

aaaagttggt tagagcctgg cagttttgat aggcattatt atagattggg taatatttac 8040

cctgcacctg gaggaacttt gcaaagagcc tcatgtgcgg cgcgccaggc cataatggcc 8100

aaacggtttc tcaattacta tatactacta accatttacc tgtagcgtat ttcttttccc 8160

tcttcgcgaa agctcaaggg catcttcttg actcatgaaa aatatctgga tttcttctga 8220

cagatcatca cccttgagcc caactctcta gcctatgagt gtaagtgata gtcatcttgc 8280

aacagattat tttggaacgc aactaacaaa gcagatacac ccttcagcag aatcctttct 8340

ggatattgtg aagaatgatc gccaaagtca cagtcctgag acagttccta atctttaccc 8400

catttacaag ttcatccaat cagacttctt aacgcctcat ctggcttata tcaagcttac 8460

caacagttca gaaactccca gtccaagttt cttgcttgaa agtgcgaaga atggtgacac 8520

cgttgacagg tacaccttta tgggacattc ccccagaaaa ataatcaaga ctgggccttt 8580

agagggtgct gaagttgacc ccttggtgct tctggaaaaa gaactgaagg gcaccagaca 8640

agcgcaactt cctggtattc ctcgtctaag tggtggtgcc ataggataca tctcgtacga 8700

ttgtattaag tactttgaac caaaaactga aagaaaactg aaagatgttt tgcaacttcc 8760

ggaagcagct ttgatgttgt tcgacacgat cgtggctttt gacaatgttt atcaaagatt 8820

ccaggtaatt ggaaacgttt ctctatccgt tgatgactcg gacgaagcta ttcttgagaa 8880

atattataag acaagagaag aagtggaaaa gatcagtaaa gtggtatttg acaataaaac 8940

tgttccctac tatgaacaga aagatattat tcaaggccaa acgttcacct ctaatattgg 9000

tcaggaaggg tatgaaaacc atgttcgcaa gctgaaagaa catattctga aaggagacat 9060

cttccaagct gttccctctc aaagggtagc caggccgacc tcattgcacc ctttcaacat 9120

ctatcgtcat ttgagaactg tcaatccttc tccatacatg ttctatattg actatctaga 9180

cttccaagtt gttggtgctt cacctgaatt actagttaaa tccgacaaca acaacaaaat 9240

catcacacat cctattgctg gaactcttcc cagaggtaaa actatcgaag aggacgacaa 9300

ttatgctaag caattgaagt cgtctttgaa agacagggcc gagcacgtca tgctggtaga 9360

tttggccaga aatgatatta accgtgtgtg tgagcccacc agtaccacgg ttgatcgttt 9420

attgactgtg gagagatttt ctcatgtgat gcatcttgtg tcagaagtca gtggaacatt 9480

gagaccaaac aagactcgct tcgatgcttt cagatccatt ttcccagcag gaaccgtctc 9540

cggtgctccg aaggtaagag caatgcaact cataggagaa ttggaaggag aaaagagagg 9600

tgtttatgcg ggggccgtag gacactggtc gtacgatgga aaatcgatgg acacatgtat 9660

tgccttaaga acaatggtcg tcaaggacgg tgtcgcttac cttcaagccg gaggtggaat 9720

tgtctacgat tctgacccct atgacgagta catcgaaacc atgaacaaaa tgagatccaa 9780

caataacacc atcttggagg ctgagaaaat ctggaccgat aggttggcca gagacgagaa 9840

tcaaagtgaa tccgaagaaa acgatcaatg aacggaggac gtaagtagga atttatggtt 9900

tggccataat ggcctagctt ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt 9960

tatccgctca caattccaca caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt 10020

gcctaatgag tgagctaact cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg 10080

ggaaacctgt cgtgccagct gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg 10140

cgtattgggc gctcttccgc ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg 10200

cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat 10260

aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc 10320

gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc 10380

tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga 10440

agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt 10500

ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg 10560

taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc 10620

gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg 10680

gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc 10740

ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg 10800

ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc 10860

gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct 10920

caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt 10980

taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa 11040

aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa 11100

tgcttaatca gtgaggcacc tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc 11160

tgactccccg tcgtgtagat aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct 11220

gcaatgatac cgcgagaccc acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca 11280

gccggaaggg ccgagcgcag aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt 11340

aattgttgcc gggaagctag agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt 11400

gccattgcta caggcatcgt ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc 11460

ggttcccaac gatcaaggcg agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc 11520

tccttcggtc ctccgatcgt tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt 11580

atggcagcac tgcataattc tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact 11640

ggtgagtact caaccaagtc attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc 11700

ccggcgtcaa tacgggataa taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt 11760

ggaaaacgtt cttcggggcg aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg 11820

atgtaaccca ctcgtgcacc caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct 11880

gggtgagcaa aaacaggaag gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa 11940

tgttgaatac tcatactctt cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt 12000

ctcatgagcg gatacatatt tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc 12060

acatttcccc gaaaagtgcc acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc 12120

tataaaaata ggcgtatcac gaggcccttt cgtctcgcgc gtttcggtga tgacggtgaa 12180

aacctctgac acatgcagct cccggagacg gtcacagctt gtctgtaagc ggatgccggg 12240

agcagacaag cccgtcaggg cgcgtcagcg ggtgttggcg ggtgtcgggg ctggcttaac 12300

tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac 12360

agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg cgccattcgc cattcaggct gcgcaactgt 12420

tgggaagggc gatcggtgcg ggcctcttcg ctattacgcc agctggcgaa agggggatgt 12480

gctgcaaggc gattaagttg ggtaacgcca gggttttccc agtcacgacg ttgtaaaacg 12540

acggccagtg aattg 12555

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gtctccttct gttgaggctt g 51

<210> 13

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgagaaa cagcttgtct ca 52

<210> 14

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtattcca gctgagttg 49

<210> 15

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgcaaaa cagcttgttg ag 52

<210> 16

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcgaccgg gtggccg 47

<210> 17

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tacagtgtgg tgatggcggt c 51

<210> 18

<211> 14019

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcggca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780

atataaacag aaggaagctg ccctgtctta aacctttttt tttatcatca ttattagctt 840

actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900

caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaaacg gaattcacca tgggtgctca 960

agtttctact caaaagtctg gttctcatga aactggtaac gttgctactg gtggttctac 1020

tattaatttc actaacatca actactacaa ggattcttac gctgcttctg ctactagaca 1080

agatttcact caagatccaa agaaattcac tcaacctgtt ttggattcta ttaaggaatt 1140

gtctgctcca ttgaactaat gaggtaccgg ccggccattt aaatacaggc cccttttcct 1200

ttgtcgatat catgtaatta gttatgtcac gcttacattc acgccctcct cccacatccg 1260

ctctaaccga aaaggaagga gttagacaac ctgaagtcta ggtccctatt tatttttttt 1320

aatagttatg ttagtattaa gaacgttatt tatatttcaa atttttcttt tttttctgta 1380

caaacgcgtg tacgcatgta acattatact gaaaaccttg cttgagaagg ttttgggacg 1440

ctcgaaggct ttaatttgca agctggatct aacatccaaa gacgaaaggt tgaatgaaac 1500

ctttttgcca tccgacatcc acaggtccat tctcacacat aagtgccaaa cgcaacagga 1560

ggggatacac tagcagcaga ccgttgcaaa cgcaggacct ccactcctct tctcctcaac 1620

acccactttt gccatcgaaa aaccagccca gttattgggc ttgattggag ctcgctcatt 1680

ccaattcctt ctattaggct actaacacca tgactttatt agcctgtcta tcctggcccc 1740

cctggcgagg ttcatgtttg tttatttccg aatgcaacaa gctccgcatt acacccgaac 1800

atcactccag atgagggctt tctgagtgtg gggtcaaata gtttcatgtt ccccaaatgg 1860

cccaaaactg acagtttaaa cgctgtcttg gaacctaata tgacaaaagc gtgatctcat 1920

ccaagatgaa ctaagtttgg ttcgttgaaa tgctaacggc cagttggtca aaaagaaact 1980

tccaaaagtc ggcataccgt ttgtcttgtt tggtattgat tgacgaatgc tcaaaaataa 2040

tctcattaat gcttagcgca gtctctctat cgcttctgaa ccccggtgca cctgtgccga 2100

aacgcaaatg gggaaacacc cgctttttgg atgattatgc attgtctcca cattgtatgc 2160

ttccaagatt ctggtgggaa tactgctgat agcctaacgt tcatgatcaa aatttaactg 2220

ttctaacccc tacttgacag caatatataa acagaaggaa gctgccctgt cttaaacctt 2280

tttttttatc atcattatta gcttactttc ataattgcga ctggttccaa ttgacaagct 2340

tttgatttta acgactttta acgacaactt gagaagatca aaaaacaact aattattcga 2400

aacggaattc accatgtctc cttctgttga ggcttgtggt tattctgata gagttgctca 2460

attgactgtt ggtaactctt ctattactac tcaagaagct gctaatattg ttttggctta 2520

cggtgaatgg ccagagtatt gtcctgatac tgatgctact gctgttgata agccaactag 2580

acctgatgtt tctgttaaca gattctacac tttggattct aagatgtggc aagaaaactc 2640

tactggttgg tattggaagt tcccagatgt tttgaacaaa actggtgttt ttggtcaaaa 2700

tgctcaattc cactacttgt atagatccgg tttttgtttg catgttcaat gtaatgcttc 2760

taagttccac caaggtgctt tgttggttgc tgttattcct gaatttgtta ttgctggtag 2820

aggttctaac actaaaccaa atgaggctcc acatcctggt tttactacta ctttccctgg 2880

tactactggt gctactttcc acgatccata cgttttggat tctggtgttc ctttgtctca 2940

agctttgatc tacccacatc aatggatcaa cttgagaact aacaactgtg ctactgttat 3000

tgttccatac attaatgctg ttcctttcga ttctgctatt aaccactcta acttcggttt 3060

gatcgttatc ccagtttctc ctttgaaata ctcttctggt gctactactg ctatcccaat 3120

cactatcact atcgctcctt tgaactctga atttggtggt ttgagacaag ctgtttctca 3180

ataatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 3240

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 3300

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 3360

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 3420

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 3480

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 3540

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 3600

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 3660

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 3720

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 3780

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 3840

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 3900

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 3960

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 4020

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 4080

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 4140

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 4200

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 4260

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 4320

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 4380

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 4440

gggtattcca gctgagttga gacctggtac taaccaattc ttgactactg atgatgatac 4500

tgctgctcca attttgcctg gtttcactcc aactcctact attcatattc caggtgaagt 4560

tcactctttg ttggagttgt gtagagttga aactatcttg gaggttaaca acactactga 4620

agctactggt ttgactagat tgttgattcc tgtttcttct caaaacagag ctgatgagtt 4680

gtgtgctgct tttatggttg atccaggtag aattggtcct tggcaatcta ctttggttgg 4740

tcaagtttgt agatactata ctcaatggtc tggttctttg aaggttactt ttatgttcac 4800

tggttctttc atggctactg gtaaaatgtt ggttgcttac tctccacctg gttctgctca 4860

accagctaat agagaaactg ctatgttggg tactcatgtt atttgggatt ttggtttgca 4920

atcttctgtt tctttggtta ttccttggat ttctaacact cacttcagaa ctgctaagac 4980

tggtggtaat tacgattact atactgctgg tgttgttact ttgtggtatc aaactaacta 5040

tgttgttcca cctgaaactc caggagaggc ttatattatt gctatgggtg ctgctcaaga 5100

taacttcact ttgaagattt gtaaggatac tgatgaagtt actcaacaag ctgttttgca 5160

ataatgaggt accggccggc catttaaata caggcccctt ttcctttgtc gatatcatgt 5220

aattagttat gtcacgctta cattcacgcc ctcctcccac atccgctcta accgaaaagg 5280

aaggagttag acaacctgaa gtctaggtcc ctatttattt tttttaatag ttatgttagt 5340

attaagaacg ttatttatat ttcaaatttt tctttttttt ctgtacaaac gcgtgtacgc 5400

atgtaacatt atactgaaaa ccttgcttga gaaggttttg ggacgctcga aggctttaat 5460

ttgcaagctg gatctaacat ccaaagacga aaggttgaat gaaacctttt tgccatccga 5520

catccacagg tccattctca cacataagtg ccaaacgcaa caggagggga tacactagca 5580

gcagaccgtt gcaaacgcag gacctccact cctcttctcc tcaacaccca cttttgccat 5640

cgaaaaacca gcccagttat tgggcttgat tggagctcgc tcattccaat tccttctatt 5700

aggctactaa caccatgact ttattagcct gtctatcctg gcccccctgg cgaggttcat 5760

gtttgtttat ttccgaatgc aacaagctcc gcattacacc cgaacatcac tccagatgag 5820

ggctttctga gtgtggggtc aaatagtttc atgttcccca aatggcccaa aactgacagt 5880

ttaaacgctg tcttggaacc taatatgaca aaagcgtgat ctcatccaag atgaactaag 5940

tttggttcgt tgaaatgcta acggccagtt ggtcaaaaag aaacttccaa aagtcggcat 6000

accgtttgtc ttgtttggta ttgattgacg aatgctcaaa aataatctca ttaatgctta 6060

gcgcagtctc tctatcgctt ctgaaccccg gtgcacctgt gccgaaacgc aaatggggaa 6120

acacccgctt tttggatgat tatgcattgt ctccacattg tatgcttcca agattctggt 6180

gggaatactg ctgatagcct aacgttcatg atcaaaattt aactgttcta acccctactt 6240

gacagcaata tataaacaga aggaagctgc cctgtcttaa accttttttt ttatcatcat 6300

tattagctta ctttcataat tgcgactggt tccaattgac aagcttttga ttttaacgac 6360

ttttaacgac aacttgagaa gatcaaaaaa caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat 6420

gggagatcca gttgaggata ttattcatga tgctttgggt aacactgcta gaagagctat 6480

ttcttctgct actaacgttg aatctgctgc taatactact ccttcttctc acagattgga 6540

aactggtaga gttccagctt tgcaagctgc tgagactggt gctacttcta acgctactga 6600

tgaaaacatg atcgagacta gatgtgttgt taacagaaat ggtgttttgg aaactactat 6660

taaccatttc ttttctagat ccggtttggt tggtgttgtt aatttgactg atggtggtac 6720

tgatactact ggttacgcta cttgggatat cgatatcatg ggtttcgttc aattgagaag 6780

aaagtgtgaa atgttcactt acatgagatt caacgctgag tttactttcg ttactactac 6840

tgaaaatgga gaggctagac catatatgtt gcaatacatg tatgttccac ctggtgctcc 6900

aaagcctact ggtagagatg cttttcaatg gcaaactgct actaaccctt ctgttttcgt 6960

taaattgact gatccacctg ctcaagtttc tgttccattc atgtctcctg cttctgctta 7020

ccaatggttt tacgatggtt atccaacttt cggtcaacat cctgaaactt ctaatactac 7080

ttatggtttg tgtccaaaca atatgatggg tactttcgct gttagagttg tttctagaga 7140

ggcttctcaa ttgaagttgc aaactagagt ttacatgaag ttgaaacacg ttagagcttg 7200

ggttccaaga cctattagat cccaaccata cttgttgaag aacttcccta actacgattc 7260

ttctaagatc gctaactctg ctagagatag atcctctatt aaacaagcta acatgtaatg 7320

aggtaccggc cggccattta aatacaggcc ccttttcctt tgtcgatatc atgtaattag 7380

ttatgtcacg cttacattca cgccctcctc ccacatccgc tctaaccgaa aaggaaggag 7440

ttagacaacc tgaagtctag gtccctattt atttttttta atagttatgt tagtattaag 7500

aacgttattt atatttcaaa tttttctttt ttttctgtac aaacgcgtgt acgcatgtaa 7560

cattatactg aaaaccttgc ttgagaaggt tttgggacgc tcgaaggctt taatttgcaa 7620

gctggatccg cggccgcctt ccaaactctc atggattctc aggtaatagg tattctagga 7680

ggaggccagc taggccgaat gattgttgag gccgctagca ggctcaatat caagaccgtg 7740

attcttgatg atggtttttc acctgctaag cacattaatg ctgcgcaaga ccacatcgac 7800

ggatcattca aagatgagga ggctatcgcc aagttagctg ccaaatgtga tgttctcact 7860

gtagagattg agcatgtcaa cacagatgct ctaaagagag ttcaagacag aactggaatc 7920

aagatatatc ctttaccaga gacaatcgaa ctaatcaagg ataagtactt gcaaaaggaa 7980

catttgatca agcacaacat ttcggtgaca aagtctcagg gtatagaatc taatgaaaag 8040

gcgctgcttt tgtttggaga agagaatgga tttccatatc tgttgaagtc ccggactatg 8100

gcttatgatg gaagaggcaa ttttgtagtg gagtctaaag aggacatcag taaggcatta 8160

gagttcttga aagatcgtcc attgtatgcc gagaagtttg ctccttttgt taaagaatta 8220

gcggtaatgg ttgtgagatc actggaaggc gaagtattct cctacccaac cgtagaaact 8280

gtgcacaagg acaatatctg tcatattgtg tatgctccgg ccagagttaa tgacaccatc 8340

caaaagaaag ctcaaatatt agctgaaaac actgtgaaga ctttcccagg cgctggaatc 8400

ttcggagttg agatgttcct attgtctgat ggagaacttc ttgtaaatga gattgctcca 8460

aggccccaca attctggtca ctatacaatc gatgcatgtg taacatctca gttcgaagca 8520

catgtaagag ccataactgg tctgccaatg ccactagatt tcaccaaact atctacttcc 8580

aacaccaacg ctattatgct caatgttttg ggtgctgaaa aatctcacgg ggaattagag 8640

ttttgtagaa gagccttaga aacacccggt gcttctgtat atctgtacgg aaagaccacc 8700

cgattggctc gtaagatggg tcatatcaac ataataggat cttccatgtt ggaagcagaa 8760

caaaagttag agtacattct agaagaatca acccacttac catccagtac tgtatcagct 8820

gacactaaac cgttggttgg agttatcatg ggttcagact ctgatctacc tgtgatttcg 8880

aaaggttgcg atattttaaa acagtttggt gttccattcg aagttactat tgtctctgct 8940

catagaacac cacagagaat gaccagatat gcctttgaag ccgctagtag aggtatcaag 9000

gctatcattg caggtgctgg tggtgctgct catcttccag gaatggttgc tgccatgact 9060

ccgttgccag tcattggtgt tcctgtcaag ggctctacgt tggatggtgt agactcgcta 9120

cactcgattg tccaaatgcc tagaggtgtt cctgtggcta cggttgctat caacaacgcc 9180

accaatgccg ctctgttggc catcaggatt ttaggtacaa ttgaccacaa atggcaaaag 9240

gaaatgtcca agtatatgaa tgcaatggag accgaagtgt tggggaaggc atccaacttg 9300

gaatctgaag ggtatgaatc ctatttgaag aatcgtcttt gaatttagta ttgtttttta 9360

atagatgtat atataatagt acacgtaact tatctattcc attcataatt ttattttaaa 9420

ggttcggtag aaatttgtcc tccaaaaagt tggttagagc ctggcagttt tgataggcat 9480

tattatagat tgggtaatat ttaccctgca cctggaggaa ctttgcaaag agcctcatgt 9540

gcggcgcgcc aggccataat ggccaaacgg tttctcaatt actatatact actaaccatt 9600

tacctgtagc gtatttcttt tccctcttcg cgaaagctca agggcatctt cttgactcat 9660

gaaaaatatc tggatttctt ctgacagatc atcacccttg agcccaactc tctagcctat 9720

gagtgtaagt gatagtcatc ttgcaacaga ttattttgga acgcaactaa caaagcagat 9780

acacccttca gcagaatcct ttctggatat tgtgaagaat gatcgccaaa gtcacagtcc 9840

tgagacagtt cctaatcttt accccattta caagttcatc caatcagact tcttaacgcc 9900

tcatctggct tatatcaagc ttaccaacag ttcagaaact cccagtccaa gtttcttgct 9960

tgaaagtgcg aagaatggtg acaccgttga caggtacacc tttatgggac attcccccag 10020

aaaaataatc aagactgggc ctttagaggg tgctgaagtt gaccccttgg tgcttctgga 10080

aaaagaactg aagggcacca gacaagcgca acttcctggt attcctcgtc taagtggtgg 10140

tgccatagga tacatctcgt acgattgtat taagtacttt gaaccaaaaa ctgaaagaaa 10200

actgaaagat gttttgcaac ttccggaagc agctttgatg ttgttcgaca cgatcgtggc 10260

ttttgacaat gtttatcaaa gattccaggt aattggaaac gtttctctat ccgttgatga 10320

ctcggacgaa gctattcttg agaaatatta taagacaaga gaagaagtgg aaaagatcag 10380

taaagtggta tttgacaata aaactgttcc ctactatgaa cagaaagata ttattcaagg 10440

ccaaacgttc acctctaata ttggtcagga agggtatgaa aaccatgttc gcaagctgaa 10500

agaacatatt ctgaaaggag acatcttcca agctgttccc tctcaaaggg tagccaggcc 10560

gacctcattg caccctttca acatctatcg tcatttgaga actgtcaatc cttctccata 10620

catgttctat attgactatc tagacttcca agttgttggt gcttcacctg aattactagt 10680

taaatccgac aacaacaaca aaatcatcac acatcctatt gctggaactc ttcccagagg 10740

taaaactatc gaagaggacg acaattatgc taagcaattg aagtcgtctt tgaaagacag 10800

ggccgagcac gtcatgctgg tagatttggc cagaaatgat attaaccgtg tgtgtgagcc 10860

caccagtacc acggttgatc gtttattgac tgtggagaga ttttctcatg tgatgcatct 10920

tgtgtcagaa gtcagtggaa cattgagacc aaacaagact cgcttcgatg ctttcagatc 10980

cattttccca gcaggaaccg tctccggtgc tccgaaggta agagcaatgc aactcatagg 11040

agaattggaa ggagaaaaga gaggtgttta tgcgggggcc gtaggacact ggtcgtacga 11100

tggaaaatcg atggacacat gtattgcctt aagaacaatg gtcgtcaagg acggtgtcgc 11160

ttaccttcaa gccggaggtg gaattgtcta cgattctgac ccctatgacg agtacatcga 11220

aaccatgaac aaaatgagat ccaacaataa caccatcttg gaggctgaga aaatctggac 11280

cgataggttg gccagagacg agaatcaaag tgaatccgaa gaaaacgatc aatgaacgga 11340

ggacgtaagt aggaatttat ggtttggcca taatggccta gcttggcgta atcatggtca 11400

tagctgtttc ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga 11460

agcataaagt gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg 11520

cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc 11580

caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 11640

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 11700

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 11760

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 11820

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 11880

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 11940

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 12000

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 12060

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 12120

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 12180

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 12240

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 12300

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 12360

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 12420

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 12480

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 12540

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 12600

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 12660

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 12720

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 12780

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 12840

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctacaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 12900

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 12960

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 13020

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 13080

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 13140

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaatacggg ataataccgc gccacatagc 13200

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 13260

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 13320

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 13380

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 13440

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 13500

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 13560

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc 13620

gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 13680

gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 13740

ggcgggtgtc ggggctggct taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac 13800

catatgcggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat 13860

tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta 13920

cgccagctgg cgaaaggggg atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt 13980

tcccagtcac gacgttgtaa aacgacggcc agtgaattg 14019

<210> 19

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtgctcaa gtttctac 48

<210> 20

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

tttaaatggc cggccggtac ctcattagtt caatggagca gacaattc 48

<210> 21

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gtctccttct gttgaggctt g 51

<210> 22

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgagaaa cagcttgtct ca 52

<210> 23

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggtattcca gctgagttg 49

<210> 24

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tattgcaaaa cagcttgttg ag 52

<210> 25

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

caactaatta ttcgaaacgg aattcaccat gggcgaccgg gtggccg 47

<210> 26

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

ctgtatttaa atggccggcc ggtacctcat tacagtgtgg tgatggcggt c 51

Claims

1.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸为第一多核苷酸：包括编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸，所述多核苷酸不包括RBS序列和编码柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白的核苷酸，所述编码柯萨奇病毒A10的VP2衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的VP2衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的VP3衣壳蛋白；所述编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸编码氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的VP1衣壳蛋白，第一多核苷酸中，编码柯萨奇病毒A10的VP2、VP3和VP1衣壳蛋白的核苷酸的排列顺序为：VP2-VP3 -VP1。

2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸中各核苷酸的排列顺序为：启动子-VP2-终止子-启动子-VP3-终止子-启动子-VP1-终止子。

3.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，还包括以下中的一项或几项：

1）编码柯萨奇病毒A10的VP2衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:8所示；

2）编码柯萨奇病毒A10的VP3衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:9所示；

3）编码柯萨奇病毒A10的VP1衣壳蛋白的核苷酸的序列如SEQ ID NO:10所示。

4.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体包括权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

5.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的表达载体为酵母表达载体。

6.根据权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体的核苷酸序列如SEQ ID NO:11所示。

7.一种细胞系，其特征在于，所述细胞系中包括权利要求4-6任一所述的核酸构建体，或基因组中整合有权利要求1-3任一所述的多核苷酸。

8.根据权利要求7所述的细胞系，其特征在于，所述细胞系为毕赤酵母细胞系。

9.一种重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒，其特征在于，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒包括VP2、VP3和VP1衣壳蛋白，不包括柯萨奇病毒A10其他衣壳蛋白，所述重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒由权利要求8所述的细胞系产生。

10.权利要求9所述的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒在制备预防手足口病药品中的用途。

11.一种用于预防手足口病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求9所述的重组柯萨奇病毒A10病毒样颗粒和药学上可接受的载体。

12.根据权利要求11所述的药物组合物，所述药物组合物为疫苗组合物。