CN114317536B

CN114317536B - 基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法

Info

Publication number: CN114317536B
Application number: CN202111472651.7A
Authority: CN
Inventors: 白家驷; 毛青
Original assignee: First Affiliated Hospital of Army Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Army Medical University
Priority date: 2021-11-30
Filing date: 2021-11-30
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2041-11-30
Also published as: CN114317536A

Abstract

本发明涉及一条能有效将该打靶质粒编辑至ROSA26基因的gRNA，利用该gRNA采用CRISPR/Cas9系统通过显微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵中，成功构建肝脏中限制表达uPA的小鼠模型，利用该限制表达uPA造成肝损伤的小鼠模式可进一步构建人源化肝脏小鼠模型，以及使用人源化肝脏小鼠模型为深入研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制及筛选抗病毒药物开发奠定基础。

Description

基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法，还涉及构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统。

背景技术

病毒性肝炎是危及全球公共卫生的主要问题之一，其传染性强、死亡率高。尤其以甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、丁型肝炎病毒(HDV)和戊型肝炎病毒(HEV)五种嗜肝性病毒引起的病毒性肝炎的流行呈现局部突发性增加之势。目前尽管拥有预防甲型和乙型肝炎病毒的疫苗及治疗乙肝、丙型肝炎病毒的一些方法，但病毒感染尚未得到完全控制。这是由于这些病原体对属主的取向性，严重限制了对它们的研究。

虽然对黑猩猩的研究一直是破译病原体致病机制和验证疫苗效率以及抗病毒药物筛选方面唯一的手段；但很低的慢性感染率和缺乏肝纤维化，成本高、队列规模小等因素和出于道德考虑限制了它们的使用。廉价小动物模型如小鼠是最适合于这些研究的选项。小鼠体内的某些组成部分与人类不尽相同，特别是其免疫系统。携带人肝细胞合并功能良好的人免疫系统小鼠模型是肝炎病毒研究亟需的模型。这种双系统重建的人源化小鼠可通过向免疫缺陷小鼠体内共同注射人CD34+造血干细胞(HSC)和成人肝细胞来实现重建，同时还能提高肝脏嵌合程度。最新的研究表明：共同移植有利于嵌合肝中人免疫系统的重建，包括Kupffer细胞，DC细胞和NK细胞在内的人免疫细胞与人肝细胞紧密共定位；人肝细胞可产生IL-3，IL-15，GM-CSF，M-CSF，MCP-1，CXCL-1和CXCL-10，这些因子对于人免疫细胞的迁移、发育、分化非常重要，并且这些细胞与小鼠之间没有交叉反应。这种具有肝脏中重建的人免疫系统非常适合于病毒性肝炎发病机理的研究。

现在可供选择的人源化小鼠构建模式包括：尿纤溶酶原激活剂(uPA+/+)小鼠模式、富马酰乙酰乙酸水解酶(Fah-/-)小鼠模式、TK-NOG转基因小鼠模式和AFC 8模式。白蛋白-尿纤溶酶原激活物(Alb-uPA)转基因小鼠是最早被用于构建人源化小鼠模式，可用于肝炎病毒感染研究，uPA在肝细胞中的表达可引起肝细胞损伤，从而允许小鼠或人肝细胞在移植后选择性扩增实现生长优势，但由于其肝损伤不受控制，限制了它的广泛应用。AFC 8模式建立的双嵌合小鼠(AFC8-Hu HSC/Hep)，该支持HCV在肝脏中的感染，并产生人T细胞对HCV的应答；HCV感染引发肝脏炎症，转化成慢性炎症后，星状细胞的活化诱发人成纤维基因的表达、肝脏纤维化。但该模型操作极为复杂，小鼠死亡率很高，也未见进一步的报道。

课题组前期首次成功构建具有生物学功能的慢病毒质粒；实现了在细胞水平上对Alb-uPA基因表达的有效控制。虽然取得了上述这些研究成果，但其实验数据主要来自于体外细胞培养模型，是否能用于动物模型尚待进一步的验证。我们曾尝试随机地用原核注射的方式将目的基因质粒注入小鼠受精卵中；也通过重新优化慢病毒质粒中目的基因与调控基因的排列顺序，再通过原核注射的方式注入到小鼠受精卵中。小鼠要么不表达，要么随机表达不受控制、更无法传代，都没有取得良好的效果。

本发明在继续深入研究创建一种全新的极大的实现人肝替代和无小鼠免疫成分的嵌合小鼠模型，以期为深入研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制及抗病毒药物开发奠定基础。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基于CRISPR/Cas9构建人源化小鼠的gRNA，还提供一种构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1.一种基于CRISPR/Cas9构建人源化小鼠的gRNA，所述gRNA由5’-3’的序列如SEQID No.7所示。

进一步，用于制备gRNA的引物对序列如SEQ ID No.8和SEQ ID No.9所示。

2.一种构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统，该系统由cas9 mRNA、gRNA和donorDNA重组质粒组成，所述gRNA由5’-3’的序列如SEQ ID No.7所示，所述donor DNA重组质粒为R26-e(CN362)-1，该重组质粒包含Rosa26位点5’同源臂、PTight启动子、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因、第一ployA、白蛋白启动子Alb promoter、四环素反式作用因子、第二ployA和Rosa26位点3’同源臂，具体结构见说明书附图的图5所示。

3.基于CRISPR/Cas9系统构建pTight-uPA-Alb-rtTA转基因小鼠的制备方法，所述制备方法的步骤如下：

a.分别在体外合成cas9 mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒；

b.再将cas9 mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒共同显微注射到C57BL/6J小鼠受精卵中，得到F0代小鼠；

c.将步骤b得到的F0代小鼠与NOD-SCID小鼠交配获得F1代小鼠即可。

进一步，b步骤还包括将得到F0代小鼠用PCR和测序的方法进行基因型鉴定。

进一步，PCR反应体系50μl：ddH₂O 31μl，PrimeStar GXL PCR Buffer 10μl，2.5mMdNTP 4μl，Forward Primer 1μl，Reverse Primer 1μl，PrimeStar GXL DNA Polymerase

2μl，genomic DNA 1μl。

进一步，5’同源臂扩增用Forward Primer如SEQ ID No.10所示，Reverse Primer如SEQ ID No.11所示；3’同源臂扩增用Forward Primer如SEQ ID No.12所示，ReversePrimer如SEQ ID No.13所示。

进一步，显微注射时按cas9 mRNA 5ng/μl、gRNA 2ng/μl和donor DNA重组质粒20ng/μl注射。

4.利用前述基于CRISPR/Cas9系统构建pTight-uPA-Alb-rtTA转基因小鼠的制备方法得到的小鼠模型。

5.利用前述基于CRISPR/Cas9系统构建pTight-uPA-Alb-rtTA转基因小鼠的制备方法得到的小鼠模型在筛选肝损伤药物中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明通过PCR和Infusion的技术将原有慢病毒质粒CN362中目的片段pTight-UPA-bgh ploya-ALB Promoter-Tet-on-WPRE-included-bghploya连接到Rosa26-Ins-Ins载体上，构建用于CRISPR/Cas9技术在Rosa26位点knockin小鼠的打靶质粒。该打靶质粒包含3.3kb 5’同源臂；3.3kb 3’同源臂，能实现Rosa26位点染色体两端序列的融合和稳定遗传。利用该打靶质粒，本发明还公开了制备ROSA26基因突变及富含tet-on调控ALB启动增强子限制表达的uPA表达动物的部分方法，可以在ROSA26位点上成功定点敲入uPA基因。本发明还公开了一条能有效将该打靶质粒编辑至ROSA26基因的gRNA，利用该gRNA采用CRISPR/Cas9系统通过显微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵中，成功构建肝脏中限制表达uPA的小鼠模型，利用该限制表达uPA造成肝损伤的小鼠模式可进一步构建人源化肝脏小鼠模型，以及使用人源化肝脏小鼠模型为深入研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制及筛选抗病毒药物开发奠定基础。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为载体CN362质粒图谱。

图2为重组后得到CN362-polyA1质粒图谱。

图3为重组后得到CN362-polyA2质粒图谱。

图4为Rosa26-Ins-Ins质粒图谱。

图5为重组后得到Rosa26-Ins-CN362-Ins质粒图谱。

图6为PCR扩增获得目的片段polyA1和polyA2的1％琼脂糖凝胶电泳图。

图7为CN362-polyA2目的片段PCR电泳图。

图8为NotI酶切CN362质粒结果电泳图。

图9为KpnI酶切CN362-polyA1质粒结果电泳图。

图10为XhoI酶切Rosa26-Ins-Ins质粒结果电泳图。

图11为uPA表达检测结果。

图12为ALT表达检测结果。

图13为ALb表达检测结果。

图14为F0代小鼠鉴定策略示意图。

图15为F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果。

图16为体外转录gRNA、Cas9电泳结果。

图17为小鼠强力霉素诱导以后，未经治疗的小鼠肝脏HE染色图片。

图18为小鼠强力霉素诱导以后，未经治疗的小鼠肝脏HE染色图片。

图19为移植人肝细胞后小鼠肝脏切片HE染色图。

图20为移植人肝细胞后小鼠肝脏切片HE染色图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

试剂：限制性内切酶NotI、XhoI、KpnI购自Takara公司；克隆重组试剂In-Fusion&reg；HD Cloning Kit User Manual购自TakaRa公司；PCR相关试剂购自TakaRa公司；常规化学试剂主要购自Sigma；通用Rosa位点载体Rosa26-Ins-Ins来源于上海南方模式生物科技股份有限公司；CN362质粒在本单位(陆军军医大学第一附属医院感染科)留存，为申请号201210102188.1中JGY-PLV载体。胶回收KitQIAquick胶回收试剂盒购买于上海玉博生物科技有限公司。引物：合成自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1、用CN36-NotI-PA-F和CN36-NotI-PA-R引物配对，以含bgh polyA元件的质粒为模板PCR扩增获得目的片段polyA1；用CN36-KpnI-PA-F和CN36-KpnI-PA-R引物配对，以含bgh polyA元件的质粒为模板PCR扩增获得目的片段polyA2，引物表如表1所示。

表1.引物表

引物名称(编号)	序列	序列号
			CN36-NotI-PA-F(I)	tccaccggtgcggccctagagctcgctgatcagcc	SEQ ID No.1
CN36-NotI-PA-R(II)	gaagctagagcggcctccccagcatgcctgctatt	SEQ ID No.2
			CN36-KpnI-PA-F(III)	ccagtcacacctcagctagagctcgctgatcagcc	SEQ ID No.3
CN36-KpnI-PA-R(IV)	tcattggtcttaaagctcgagtccccagcatgcctgctatt	SEQ ID No.4
			Rosa26-CN362-P-F	ggggctgtccctcgaattacagggacagcagagatccagtttggttagta	SEQ ID No.5
Rosa26-CN362-P-R	gaggatggggctcgagtggctaagatctacagctgccttgtaagt	SEQ ID No.6

2、重组载体构建方法

DNA重组方法参考In-Fusion&reg；HD Cloning Kit试剂盒说明书，通过NotI酶切将载体CN362质粒切开产生粘性末端，将通过PCR扩增得到目的片段polyA1，通过In-Fusion&reg；HD Cloning Kit酶将所得目的片段和酶切后的载体进行重组。慢病毒载体CN362质粒示意图如图1所示。通过In-Fusion&reg；HD Cloning Kit酶将所得目的片段和酶切后的载体进行重组，重组后得到CN362-polyA1质粒图谱如图2所示。载体重组中所用到的NotI酶切体系(50μl)：5μl 10×H Buffer，3.0μl NotI，15μl CN362(约200ng/ul)，27μlddH₂O。PCR反应体系(20μl)：ddH₂O 11.4μl；5×PrimeStar GXL PCR Buffer 4μl，2.5mMdNTP2μl，Primer I(10pmol/μl)0.4μl，Primer II(10pmol/μl)0.4μl，PrimeStar GXL DNAPolymerase(TaKaRa，Code No：R050A)0.8μl，ES cell genomic DNA 1μl。PCR反应条件如表2所示。NotI酶切CN362质粒结果如图8所示。

按NotI酶切体系配制好后，在37℃水浴锅中酶切2.5小时后，加入5ul的10×Loading Buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳。

胶块纯化后测浓度，QIAquick胶回收试剂盒的使用。实验前准备：将120ml无水乙醇加入Buffer PE中混匀，做好标记。100mg胶块换算体积约为100ul，加入的溶胶液BufferQG的体积约为胶块体积的3倍，溶解后观察体系颜色，其颜色为pH指示剂，在合适范围内表示体系正常，若pH不符合则调整溶胶液用量。56℃水浴锅中溶胶后摇匀，过套有收集管的回收柱，短离心后弃收集管中液体，将剩余溶胶液体系按照此步骤直至全部过柱，接下来利用700ul的之前加入过无水乙醇的Buffer PE洗涤一次，弃收集管中液体后13000rpm空离心1min，离心后将收集柱放入新的EP管中，在柱子中的滤膜上方按需求量加入洗脱液(水)，13000rpm离心1min后弃回收柱，测EP管中液体浓度，胶回收完成。

表2 PCR反应条件：

Step#	Temp(℃)	Time	Note
				1	98	5min	-
2	98	20sec	-
				3	50-70	20sec	-
4	68	30sec	repeat steps 2-4for 35cycles
				5	68	5min	-
6	12	-	hold

In-Fusion&reg；HD Cloning Kit User Manual中In-Fusion体系(10ul)：NotI酶切CN362质粒(20ng/ul)4.0ul，polyA1(200ng/ul)0.4ul，5×In-Fusion 2ul，ddH₂O 3.6ul。将上述体系混匀后置入PCR仪中50℃反应15min，产物直接转化。

实施例2

再通过KpnI酶切将构建完成载体CN362-polyA1质粒切开产生粘性末端，通过PCR扩增得到目的片段polyA2，通过In-Fusion&reg；HD Cloning Kit酶将所得目的片段和酶切后的载体进行重组。重组后得到CN362-polyA2质粒图谱如图3所示。载体重组中所用到的KpnI酶切体系(50μl)：10×L Buffer 5μl，KpnI 3.0μl，CN362-polyA1质粒(约200ng/ul)15μl，ddH₂O 27μl。PCR反应体系(20μl)：ddH₂O 11.4μl；5×PrimeStar GXL PCR Buffer 4μl，2.5mMdNTP 2μl，Primer III(10pmol/μl)0.4μl，Primer IV(10pmol/μl)0.4μl，PrimeStarGXL DNA Polymerase(TaKaRa，Code No：R050A)0.8μl，ES cell genomic DNA 1μl。PCR反应条件同实施例1的表2所示。按表中所示配好体系后，在37℃水浴锅中酶切2.5小时后，加入5ul的10×Loading Buffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳。胶块纯化后测浓度：方法同上，不再赘述。PCR扩增获得目的片段polyA1和polyA2的1％琼脂糖凝胶电泳图如图6所示，试剂厂商提供的数据参考：0.5ug/lane,8cm length gel,1×TAE，7V/cm,45min，后同，也可以根据实际操作进行调整。CN362-polyA2目的片段PCR电泳结果如图7所示。KpnI酶切CN362-polyA1质粒电泳结果如图9所示。

In-Fusion&reg；HD Cloning Kit User Manual中In-Fusion体系(10ul)：KpnI酶切CN362质粒(25ng/ul)3.2ul，polyA2(200ng/ul)0.4ul，5×In-Fusion 2ul，ddH₂O 4.4ul。将上述体系混匀后置入PCR仪中50℃反应15min，产物直接转化。

实施例3

通过XhoI酶切将载体Rosa26-Ins-Ins质粒切开产生粘性末端，用Rosa26-CN362-P-F引物和Rosa26-CN362-P-R引物配对，通过PCR以构建完成的质粒CN362-polyA2为模板扩增得到目的片段CN362-polyA2，再通过In-Fusion&reg；HD Cloning Kit酶将所得目的片段和酶切后的载体进行重组。Rosa26-Ins-Ins质粒图谱如图4所示。载体重组中所用到的XhoI酶切体系(50μl)：5μl 10×H Buffer，3.0μl XhoI，15μl Rosa26-Ins-Ins(约200ng/ul)，27μl ddH₂O。PCR反应体系(20μl)：ddH₂O 11.4μl；5×PrimeStar GXL PCR Buffer 4μl，2.5mMdNTP 2μl，Rosa26-CN362-P-F(10pmol/μl)0.4μl，Rosa26-CN362-P-R(10pmol/μl)0.4μl，PrimeStar GXL DNA Polymerase(TaKaRa，Code No：R050A)0.8μl，ES cell genomicDNA 1μl。PCR反应条件同实施例1的表2所示。重组后得到Rosa26-Ins-CN362-Ins(R26-e(CN362)-1)质粒图谱如图5所示。XhoI酶切Rosa26-Ins-Ins质粒结果如图10所示。质粒序列如SEQ ID No.15所示，其中Location/Qualifiers：90..3389/note＝"5arm"；3390..3410/note＝"nRosa-test-r2"；3417..4620/note＝"Ins"；4625..4684/note＝"60"；4685..5008/vntifkey＝"21"/label＝pTight；5021..6322/vntifkey＝"21"/label＝UPA；6473..6704/note＝"bghploya"；6712..9054/vntifkey＝"21"；/label＝ALB\Promoter9058..9804/vntifkey＝"21"/label＝Tet-on；9973..10801/vntifkey＝"21"/label＝WPRE-included；11041..11041/note＝"KpnI-R"；11035..11040/note＝"XhoI"；11065..11084/note＝"1"；10803..11034/note＝"bghploya"；11089..12292/note＝"Ins"；12299..15598/note＝"3arm"；14086..15123/note＝"exon2"；20359..21219/note＝"Amp"。

按表中所示配好体系后，在37℃水浴锅中酶切2.5小时后，加入5ul的10×LoadingBuffer，进行1％琼脂糖凝胶电泳。胶块纯化后测浓度：方法同上，不再赘述。

In-Fusion&reg；HD Cloning Kit User Manual中In-Fusion体系(10ul)：XhoI酶切Rosa26-Ins-Ins质粒(25ng/ul)3.2ul，CN362-polyA2(100ng/ul)0.8ul，5×In-Fusion2ul，ddH₂O 4ul。将上述体系混匀后置入PCR仪中50℃反应15min，产物直接转化。

实施例4

质粒纯化：测序正确的克隆接种400ml LB，使用NucleoBond Xtra Midi Plus EFkit抽提质粒，溶于Nuclease-Free Water中，-30℃保存，NucleoBond Xtra Midi Plus EFkit大抽质粒步骤如下：

实验前准备：将棕色瓶的Rnase加入Buffer RES EF，做好标记4℃存放。

(1)400ml的菌液分装8管装入50ml的离心管中，4℃下4800rpm离心10min，弃干净上清液；(2)每管加入4ml配置好的RES EF溶液，用1ml移液枪吹打至无块状均匀体系，每4管溶液合并成一管，最后共两管，每管16ml；(3)每管加入16ml的Buffer Lys EF(蓝色)，及时的盖上盖子后缓慢颠倒摇晃约4至5次，静置，计时，从倒入Lys EF溶液至加入溶液NEU EF中间不得超过5分钟；(4)反应接近5分钟时，小心打开盖子，每管加入16ml的NEU EF溶液，缓慢颠倒直至体系全部变成白色絮状，放置冰上15分钟，同时将试剂盒中的XtraMidi Filter放入/>Xtra Midi Columns，放入架子，柱子中加入适量(加满)EQUEF溶液，润湿中间的棉芯；(5)待EQU滴净(棉芯未干)，将冰上的溶液取出，摇匀，倒入柱子，隔段时间上样一次，不可使棉芯变干；(6)待滴干后，向柱子加入5ml的FIL EF溶液，加液时均匀的滴在棉芯向上露出的位置，不可直接加入棉芯中间，滴干后弃棉芯；(7)柱子中加入35ml的ENDO EF溶液，滴干后加入15ml的WASH EF溶液；(8)滴干后每管中加入5ml的ELU EF洗脱，滴干后用枪吹打溶液，吹打时不可使溶液滴在壁上，反复吹打10次左右，每管平均分装成6管，约830ul/EP管；(9)每个EP管中加入0.7倍体积的异丙醇，约583ul/管，摇匀后12800rpm 4℃离心15分钟；(10)离心后会看到EP管底部有白色花瓣状物质即为质粒，小心(质粒略滑)弃净上清后，每管加入1ml的75％乙醇洗涤，常温13000rpm离心5min；(11)离心后弃净上清，盖好盖子后短离心20秒，平稳小心的取出，不可颠倒剧烈碰撞，打开盖子后用枪尽量吸去管底的残液，注意不可将质粒吸入枪头；(12)室温晾2min，每管加入20ul的Nuclease-free water，放入56℃烘箱溶解10分钟后取出，利用滤芯枪头合并为一管，吸取2ul定量，大抽质粒完成。

实施例5

在前期研究的基础上，多次用不同的方法将CN362(JGY-PLV)慢病毒载体构建人源化小鼠模式，以用于肝炎病毒感染研究，但都未取得成功效果。比如尝试随机地用原核注射的方式将目的基因质粒注入小鼠受精卵中；也通过重新优化慢病毒质粒中目的基因与调控基因的排列顺序，再通过原核注射的方式注入到小鼠受精卵中。小鼠要么不表达，要么随机表达不受控制、更无法传代，都没有取得良好的效果。因篇幅有限，在此不表，只记载与本发明相关的技术内容。

最终本发明采用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的方式，将CN362定点插入到Rosa26位点内，结构为Insulator-pTight-UPA-polyA-Alb promoter-M2rtTA-polyA-Insulator。如前所述先通过In-Fusion cloning的方法构建打靶载体，该载体包含3.3kb5’同源臂、pTight-UPA-polyA-Alb promoter-M2rtTA-polyA和3.3kb 3’同源臂。最后成功的将CN362慢病毒载体先构建小鼠肝损伤模型，再进一步构建人源化小鼠模式，以用于肝炎病毒感染研究。

·Knockin位点：Gt(ROSA)26Sor(ENSMUSG00000086429)

·基因在MGI网址的链接：http://www.informatics.jax.org/marker/MGI:104735

·Knocki方式：将CN362定点插入到Rosa26位点内，结构为Insulator-pTight-UPA-polyA1-Alb promoter-M2rtTA-polyA2-Insulator。

1.设计针对目的位点基因组的guideRNA(gRNA)靶序列，并根据序列将其进行体外转录获得针对该基因的gRNA；ggggacacactaagggagct(SEQ ID No.7，Sequence 5’-3’)

(1)gRNA的体外合成：gRNA支架被克隆到pmd19-T载体(TakaRa；cat#D102A)中(抗Amp)。使用下面的引物对用于特异性gRNA合成的双链DNA进行PCR扩增(Transgen；cat#AS211)。具体gRNA制备流程：

A.用于制备gRNA的引物序列如下：

Primer01：5’-gctaatacgactcactatagggggacacactaagggagctgttttagagctagaaatagcaag-3’(SEQ ID No.8)

Primer02:5’-aaaagcaccgactcggtgcc-3’(SEQ ID No.9)

B.Primer01和Primer02，13000rpm，离心1min。完成后Primer01管中加入75μLddH₂O，Primer02管中加入256μL ddH₂O，直接于常温静置备用。

按如下体系于PCR管中配制混合体系(150μL)：

PrimeSTAR MAX 75μL，Primer01 3μL，Primer02 3μL，vector 3μL，ddH2O 66μL。

Max DNA Polymerase货号：R045A

C.150μl体系分装六管，每管25μL，于PCR仪中进行PCR反应，程序如下：

98℃，2min变性后，98℃10s，55℃15s，72℃5s，34个循环，最后72℃20s，结束。

D.产物进行琼脂糖凝胶电泳，1％琼脂糖凝胶，200V跑10min

E.割胶，使用QIAquick Gel Extraction Kit(QIAGEN Cat：No.28706)回收。

凝胶提取后，用T7 RNA聚合酶(NEB；cat#M0251S)合成gRNA。然后用DNase I(NEB；cat#M0303S)消化gRNA 30分钟，并用TRIzol(Sigma；T9424)纯化至最终体积为5～10μl。

F.使用T7Transcription Kit(Thermo，货号：AM1334)转录。

G.使用MEGAclear^TM Transcription Clean-Up Kit(Thermo，货号：AM1908)纯化。保存于-80℃。

(2)Cas9 mRNA制备流程：

将人源化cas9 cDNAs全长克隆到pXT7载体(抗Amp)中，用XbaI(NEB；cat#R0145T)线性化。使用mMESSAGE mMACHINE mRNA转录合成试剂盒(Ambion；cat#AM1344)合成帽状的Cas9 mRNA。然后使用RNeasy迷你试剂盒(QIAGEN；cat#74106)纯化Cas9mRNA。具体Cas9mRNA制备流程：

A.将质粒pX-T7(Cas9)10μg，使用XbaI线性化。总体系100μl，酶加5μl，37℃反应2h。加10μl醋酸铵，混匀，加200μl无水乙醇，混匀，13000rpm离心5min；弃上清，13000rpm离心1min，吸干残液，加20μl无核酸酶水(DEPC)。体外mRNA转录(Ambion mMESSAGE mMACHINE试剂盒，包括10μL 2×NTP/安瓶，2μL 10×反应缓冲液，1μg线性模板DNA；2μl酶溶于20μl无核酸酶纯净水中。)

B.RNA纯化(QIAGEN RNeasy小试剂盒)：RPE缓冲液中加入4体积的乙醇(96–100％)作为工作溶液。

a)用不含核糖核酸酶的水调节样品至100μl。加入350μl缓冲液RLT，混匀。

b)向稀释的RNA中添加250μl乙醇(96–100％)，并通过移液管充分混合，不要离心，立即将样品(700μl)转移至置于2ml收集管(提供)中的RNeasy微型旋转柱，盖上盖子，在≥8000g的条件下，离心15s。丢弃通流管。

c)向RNeasy旋转柱中加入500μl缓冲RPE。盖上盖子。在≥8000g的条件下，离心15s，以清洗膜。丢弃通流管。

d)向RNeasy旋转柱中加入500μl缓冲RPE。盖上盖子。离心≥8000g 2分钟清洗膜。

e)可选：将RNeasy旋转柱放入新的2ml收集管(随附)中。盖上盖子，全速离心1分钟。

f)将RNeasy旋转柱放入新的1.5ml收集管(提供)中。直接向旋转柱膜中加入30–50μl不含RNase的水。盖上盖子，以≥8000×g离心1分钟以洗脱RNA。

g)如果预期的RNA产量大于30μg，则使用另外30–50μl的不含RNase的水重复步骤f；或者，使用步骤f中的洗脱液(如果需要高RNA浓度)，重复使用步骤f中的收集管。保存于-80℃。体外转录gRNA、Cas9电泳结果如图16所示。

2.构建用于目的片段重组的donor DNA重组质粒R26-e(CN362)-1；(具体操作参见实施例1-4)

3.将体外转录的gRNA及构建的donor DNA重组质粒、cas9mRNA进行受精卵注射(C57BL/6J小鼠受精卵)，获得F0代C57BL/6J小鼠；

受精卵显微注射：选择C57BL/6J雄性和超排卵C57BL/6J雌性(上海模式生物中心有限公司)作为原核胚胎的供体。选择6～8周大性成熟的雌性小鼠，间隔48h分别注射10IU的PMSG和hCG，并与雄性小鼠合笼，见栓小鼠采用输卵管灌流收集原核胚胎。随后采用原核注射方式将供体载体(donor vector，20ng/μl)、gRNA(2ng/μl)和cas9 mRNA(5ng/μl)的混合物注射到NOD/SCID小鼠的受精卵中。将受精卵注入假妊娠ICR雌性小鼠输卵管，获得活仔。所有小鼠发育正常，身体健康。小鼠被关在单独通风的笼子里，在一个特定的无病原体设施中，光/暗循环12小时，可以随意获得食物和水。所有动物实验均按照上海模式生物中心动物护理与使用委员会的指导原则进行。

将Cas9 mRNA、gRNA和donor vector显微注射到NOD/SCID小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。经长片段PCR鉴定，共获得2只正确同源重组的F0代小鼠；F0代小鼠与NOD/SCID小鼠交配获得3只阳性F1代小鼠。测序获得敲入位点上下游序列信息结果如SEQ ID No.14所示。

4.通过PCR及测序的方法对获得的F0代小鼠进行基因型鉴定；

1)同源重组阳性小鼠PCR鉴定方案，F0代小鼠鉴定策略示意图如图14所示：

5’同源臂重组阳性基因组应扩增出3.4kb和6.8kb片段，阴性基因组应扩增出6.8kb片段；3’同源臂重组阳性基因组应扩增出3.9kb片段，阴性基因组无产物。

2)5’同源臂重组阳性F0代小鼠PCR鉴定方法：

PCR反应体系(50μl)：ddH₂O 31μl，PrimeStar GXL PCR Buffer 10μl，2.5mM dNTP

4μl，Forward Primer(20pmol/μl)1μl，Reverse Primer(20pmol/μl)1μl，PrimeStar GXL DNA Polymerase 2μl，genomic DNA 1μl。

表3 PCR引物信息：

表4 PCR反应条件：

Step#	Temp℃	Time	Note
				1	98	5min	-
2	98	10sec	-
				3	68	15sec	-
4	68	5min	repeat steps 2-4for 34cycles
				5	68	5min	-
6	12	-	hold

5.F0代小鼠与NOD-scid小鼠繁殖，获得阳性F1代杂合子小鼠；

1)F1代小鼠获得及基因型鉴定

NOD/SCID小鼠是构建R26-e(CN362)IL2rg KO小鼠的中间过渡鼠(基础小鼠)，该鼠具有在非肥胖型糖尿病小鼠(NOD)背景品系的基础上引入Prkdc-敲出SCID的特点，然后再与NSG小鼠杂交，获得IL2rg基因的突变，以为人源细胞移植及双人化嵌合小鼠构建奠定基础。F0代阳性小鼠与野生型NOD-SCID小鼠交配，繁育获得F1代小鼠。

2)F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定

PCR鉴定策略及方法同F0代小鼠鉴定部分，F1代小鼠5’和3’同源臂PCR鉴定电泳结果如图15所示，其中泳道数字：F1代小鼠编号；M：1kb DNA ladder。PCR鉴定阳性小鼠为：5,9,12号；经测序确认均为阳性。(M：1kb DNA ladder，thermo，SM0311)

实施例6

阳性F1代小鼠培育6-10代后小鼠相关检测结果：

1.小鼠强力霉素诱导uPA表达检测：

uPA表达检测结果如图11所示，其中左图为标准曲线ng/L/OD值，右图为样本血清uPA表达值；血清稀释了20倍，uPA均值：118.58±16.49ng/ml(M±SD)。

2.小鼠强力霉素诱导后，转氨酶表达：

转氨酶表达检测结果如图12所示，其中左图为标准曲线IU/L/OD值，右图为样本血清ALT表达值；血清稀释了20倍，ALT均值：26.94±1.49(IU/ml)(M±SD)。

3.小鼠双人原细胞移植后，Alb检测结果如图13所示，其中左图为标准曲线ng/ml/OD值，右图为样本血清Alb表达值；血清稀释了20倍，均值：218.19±121.067ng/ml(M±SD)ng/ml，最高能到480ng/ml。

图17和图18是小鼠强力霉素诱导以后，未经治疗的小鼠肝脏HE染色图片。如图所示，小鼠肝组织急性肝衰竭，局部坏死、组织溶解、脱落；肝细胞核固化，细胞空泡变。充分说明本发明成功构建人源化小鼠模型。

4、小鼠肝脏切片HE染色：

如图19所示：移植人肝细胞后小鼠肝脏切片HE染色，从片中可以看出肝脏组织中，存在不同来源的两种细胞，这些细胞在数量、大小、分布和HE染色都完全不同。A图×20；B、C图×50；D图×100。

如图20所示，人肝细胞移植后，对损伤小鼠肝组织进行了修复，图A、B为HE染色中明现可见异质型人肝细胞充斥在小鼠肝组织，在组织结构上修复了肝组织。图A、B×100。图C、D为抗人CK18单抗染色，肝细胞表面有明现的橙黄色着色，为阳性染色。图C×50；图D×100。

利用该限制表达uPA造成肝损伤的小鼠模式可进一步构建人源化肝脏小鼠模型，以及使用人源化肝脏小鼠模型深入进行后续研究病毒性肝炎及嗜肝病毒感染的传染病发病机制，为开发抗病毒药物提供可靠的动物模型。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院

<120> 基于CRISPR/Cas9构建uPA转基因小鼠的制备方法

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tccaccggtg cggccctaga gctcgctgat cagcc 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaagctagag cggcctcccc agcatgcctg ctatt 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccagtcacac ctcagctaga gctcgctgat cagcc 35

<210> 4

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcattggtct taaagctcga gtccccagca tgcctgctat t 41

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggctgtcc ctcgaattac agggacagca gagatccagt ttggttagta 50

<210> 6

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gaggatgggg ctcgagtggc taagatctac agctgccttg taagt 45

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggggacacac taagggagct 20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gctaatacga ctcactatag ggggacacac taagggagct gttttagagc tagaaatagc 60

aag 63

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

aaaagcaccg actcggtgcc 20

<210> 10

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gccgggcctc gtcgtct 17

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tttttggggg tgatggtggt c 21

<210> 12

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

acccaggccg ttctatgatt c 21

<210> 13

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

agttcttcct gcctgccttc t 21

<210> 14

<211> 344

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

actgtgaata taaaaatgat agcttttcct gagggutggt ctcactatgt atctctgcct 60

gatctgcaac aagatatgta gactaaagtt ctgcctgctt ttgtctcctg aatactaagg 120

ttaaaatgta gtaatacttt tggaacttgg utgtgutatt cttttatagg ggacacacta 180

agggagcttg ggtgatagtt ggtaaaatgt gtttcaagtg atgaaaactt gaattattat 240

caccgcaacc tactttttaa aaaaaaaagc gutgcctgtt agagcatgct taagggatcc 300

ctaggacttg ctgagcacac aagagtagtt acttgggutg ctcc 344

<210> 15

<211> 21426

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

gaattctcat gtttgacagc ttatcatcga taagctgcgg ccgcaaaggc cgcggtcgac 60

aagctgggga cacactaagg gagcttgggg ccagcggggg cggcgaggag gcgctcccag 120

gttccggccc tcccctcggc cccgcgccgc agagtctggc cgcgcgcccc tgcgcaacgt 180

ggcaggaagc gcgcgctggg ggcggggacg ggcagtaggg ctgagcggct gcggggcggg 240

tgcaagcacg tttccgactt gagttgcctc aagaggggcg tgctgagcca gacctccatc 300

gcgcactccg gggagtggag ggaaggagcg agggctcagt tgggctgttt tggaggcagg 360

aagcacttgc tctcccaaag tcgctctgag ttgttatcag taagggagct gcagtggagt 420

aggcggggag aaggccgcac ccttctccgg aggggggagg ggagtgttgc aatacctttc 480

tgggagttct ctgctgcctc ctggcttctg aggaccgccc tgggcctggg agaatccctt 540

ccccctcttc cctcgtgatc tgcaactcca gtctttctag aagatgggcg ggagtcttct 600

gggcaggctt aaaggctaac ctggtgtgtg ggcgttgtcc tgcaggggaa ttgaacaggt 660

gtaaaattgg agggacaaga cttcccacag attttcggtt ttgtcgggaa gttttttaat 720

aggggcaaat aaggaaaatg ggaggatagg tagtcatctg gggttttatg cagcaaaact 780

acaggttatt attgcttgtg atccgcctcg gagtattttc catcgaggta gattaaagac 840

atgctcaccc gagttttata ctctcctgct tgagatcctt actacagtat gaaattacag 900

tgtcgcgagt tagactatgt aagcagaatt ttaatcattt ttaaagagcc cagtacttca 960

tatccatttc tcccgctcct tctgcagcct tatcaaaagg tattttagaa cactcatttt 1020

agccccattt tcatttatta tactggctta tccaacccct agacagagca ttggcatttt 1080

ccctttcctg atcttagaag tctgatgact catgaaacca gacagattag ttacatacac 1140

cacaaatcga ggctgtagct ggggcctcaa cactgcagtt cttttataac tccttagtac 1200

actttttgtt gatcctttgc cttgatcctt aattttcagt gtctatcacc tctcccgtca 1260

ggtggtgttc cacatttggg cctattctca gtccagggag ttttacaaca atagatgtat 1320

tgagaatcca acctaaagct taactttcca ctcccatgaa tgcctctctc ctttttctcc 1380

atttataaac tgagctatta accattaatg gtttccaggt ggatgtctcc tcccccaata 1440

ttacctgatg tatcttacat attgccaggc tgatatttta agacattaaa aggtatattt 1500

cattattgag ccacatggta ttgattactg cttactaaaa ttttgtcatt gtacacatct 1560

gtaaaaggtg gttccttttg gaatgcaaag ttcaggtgtt tgttgtcttt cctgacctaa 1620

ggtcttgtga gcttgtattt tttctattta agcagtgctt tctcttggac tggcttgact 1680

catggcattc tacacgttat tgctggtcta aatgtgattt tgccaagctt cttcaggacc 1740

tataattttg cttgacttgt agccaaacac aagtaaaatg attaagcaac aaatgtattt 1800

gtgaagcttg gtttttaggt tgttgtgttg tgtgtgcttg tgctctataa taatactatc 1860

caggggctgg agaggtggct cggagttcaa gagcacagac tgctcttcca gaagtcctga 1920

gttcaattcc cagcaaccac atggtggctc acaaccatct gtaatgggat ctgatgccct 1980

cttctggtgt gtctgaagac cacaagtgta ttcacattaa ataaataaat cctccttctt 2040

cttctttttt ttttttttaa agagaatact gtctccagta gaatttactg aagtaatgaa 2100

atactttgtg tttgttccaa tatggtagcc aataatcaaa ttactcttta agcactggaa 2160

atgttaccaa ggaactaatt tttatttgaa gtgtaactgt ggacagagga gccataactg 2220

cagacttgtg ggatacagaa gaccaatgca gactttaatg tcttttctct tacactaagc 2280

aataaagaaa taaaaattga acttctagta tcctatttgt ttaaactgct agctttactt 2340

aacttttgtg cttcatctat acaaagctga aagctaagtc tgcagccatt actaaacatg 2400

aaagcaagta atgataattt tggatttcaa aaatgtaggg ccagagttta gccagccagt 2460

ggtggtgctt gcctttatgc ctttaatccc agcactctgg aggcagagac aggcagatct 2520

ctgagtttga gcccagcctg gtctacacat caagttctat ctaggatagc caggaataca 2580

cacagaaacc ctgttgggga ggggggctct gagatttcat aaaattataa ttgaagcatt 2640

ccctaatgag ccactatgga tgtggctaaa tccgtctacc tttctgatga gatttgggta 2700

ttattttttc tgtctctgct gttggttggg tcttttgaca ctgtgggctt tctttaaagc 2760

ctccttcctg ccatgtggtc tcttgtttgc tactaacttc ccatggctta aatggcatgg 2820

ctttttgcct tctaagggca gctgctgaga tttgcagcct gatttccagg gtggggttgg 2880

gaaatctttc aaacactaaa attgtccttt aatttttttt ttaaaaaatg ggttatataa 2940

taaacctcat aaaatagtta tgaggagtga ggtggactaa tattaaatga gtccctcccc 3000

tataaaagag ctattaaggc tttttgtctt atacttaact ttttttttaa atgtggtatc 3060

tttagaacca agggtcttag agttttagta tacagaaact gttgcatcgc ttaatcagat 3120

tttctagttt caaatccaga gaatccaaat tcttcacagc caaagtcaaa ttaagaattt 3180

ctgactttta atgttaattt gcttactgtg aatataaaaa tgatagcttt tcctgaggca 3240

gggtctcact atgtatctct gcctgatctg caacaagata tgtagactaa agttctgcct 3300

gcttttgtct cctgaatact aaggttaaaa tgtagtaata cttttggaac ttgcaggtca 3360

gattctttta taggggacac actaagggag accaccatca cccccaaaaa ctcgacgccc 3420

catcctcact gactccgtcc tggagttgga tgagagataa tggccttacg ttgtgccagg 3480

ggagggtcgg gctggattta gcaagattta ccttctccaa agagcggtgc tgcagtggca 3540

cagctgccca cggaggtggg ggggtcaccg tccctggagg tgatgaagaa ctgtggggat 3600

gtggcactga gggacatggc cagtgggcac ggtgggtggg ttggggttgg tcttggggat 3660

cttggagggc ttttccagcc ttcatgattt gacgattgta tgaacatcta catggcaatt 3720

ctccagctgc ctgtcccagt cctactgacc cagctgtatc tctccaggca agctcttcca 3780

ccccttctgc ttgcatccag acaccatcaa acatgcaggc tcagacacag ggaccagcag 3840

tgtctgtggc ctttttgtgc tcctctccat gctgggtttt aacttgctct ttgtccttct 3900

atcctatctt cttatcctta aggctgttct gaacgctgtg acttggagag tgtcccagag 3960

ccctcaacac ctgcatgtcc cacgtccatg ctgtcctgca cttccttatc cccaagatct 4020

gcctctccgt gatgcactga attggcaaac atgtgtcacc ccagaccaac aatgtcacag 4080

caaactcccc cttgatagga caagggggaa tggctttaca ctgagacagg ggaggtttgg 4140

gttggatatg aggaggcagt ttttccccca gagggtggtg acgcactgaa caggttgccc 4200

aaggaggctg tggatgcccc atccctgcag gcattcaagg ccaggctgga tgtggctctg 4260

ggcagcctgg gctgctggtt gatgaccctg cacatagcag ggggttggat ctggatgagc 4320

actgtgctcc tttgcaaccc aggccgttct atgattctgt cattctaaat ctctctttca 4380

gcctaaagct ttttccccgt atccccccag gtgtctgcag gctcaaagag cagcgagaag 4440

cgttcagagg aaagcgatcc cgtgccacct tccccgtgcc cgggctgtcc ccgcacgctg 4500

ccggctcggg gatgcggggg gagcgccgga ccggagcgga gccccgggcg gctcgctgct 4560

gccccctagc gggggaggga cgtaattaca tccctggggg ctttgggggg gggctgtccc 4620

tcgaattaca gggacagcag agatccagtt tggttagtac cgggcccatc cgaattcgga 4680

atcctcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgtatg tcgagtttac tccctatcag 4740

tgatagagaa cgatgtcgag tttactccct atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta 4800

ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttactcc ctatcagtga tagagaacgt 4860

atgtcgagtt tatccctatc agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg 4920

atagagaacg tatgtcgagg taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt 4980

ttagtgaacc gtcagatcgc ctggagaagg atccgccacc atgaaagtct ggctggcgag 5040

cctgttcctc tgcgccttgg tggtgaaaaa ctctgaaggt ggcagtgtac ttggagctcc 5100

tgatgaatca aactgtggct gtcagaacgg aggtgtatgc gtgtcctaca agtacttctc 5160

cagaattcgc cgatgcagct gcccaaggaa attccagggg gagcactgtg agatagatgc 5220

atcaaaaacc tgctatcatg gaaatggtga ctcttaccga ggaaaggcca acactgatac 5280

caaaggtcgg ccctgcctgg cctggaatgc gcctgctgtc cttcagaaac cctacaatgc 5340

ccacagacct gatgctatta gcctaggcct ggggaaacac aattactgca ggaaccctga 5400

caaccagaag cgaccctggt gctatgtgca gattggccta aggcagtttg tccaagaatg 5460

catggtgcat gactgctctc ttagcaaaaa gccttcttcg tctgtagacc aacaaggctt 5520

ccagtgtggc cagaaggctc taaggccccg ctttaagatt gttgggggag aattcactga 5580

ggtggagaac cagccctggt tcgcagccat ctaccagaag aacaagggag gaagtcctcc 5640

ctcctttaaa tgtggtggga gtctcatcag tccttgctgg gtggccagtg ccgcacactg 5700

cttcattcaa ctcccaaaga aggaaaacta cgttgtctac ctgggtcagt cgaaggagag 5760

ctcctataat cctggagaga tgaagtttga ggtggagcag ctcatcttgc acgaatacta 5820

cagggaagac agcctggcct accataatga tattgccttg ctgaagatac gtaccagcac 5880

gggccaatgt gcacagccat ccaggtccat acagaccatc tgcctgcccc caaggtttac 5940

tgatgctccg tttggttcag actgtgagat cactggcttt ggaaaagagt ctgaaagtga 6000

ctatctctat ccaaagaacc tgaaaatgtc cgtcgtaaag cttgtttctc atgaacagtg 6060

tatgcagccc cactactatg gctctgaaat taattataaa atgctgtgtg ctgcggaccc 6120

agagtggaaa acagattcct gcaagggcga ttctggagga ccgcttatct gtaacatcga 6180

aggccgccca actctgagtg ggattgtgag ctggggccga ggatgtgcag agaaaaacaa 6240

gcccggtgtc tacacgaggg tctcacactt cctggactgg attcaatccc acattggaga 6300

agagaaaggt ctggccttct gatctagatc gcgaacgcgt gaattctacc gggtagggga 6360

ggcgcttttc ccaaggcagt ctggagcatg cgctttagca gccccgctgg gcacttggcg 6420

ctacacaagt ggcctctggc ctcgcacaca ttccacatcc accggtgcgg ccctagagct 6480

cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc 6540

gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa 6600

attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac 6660

agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggaggccgc tctagcttcc 6720

ttagcatgac gttccacttt tttctaaggt ggagcttact tctttgattt gatcttttgt 6780

gaaacttttg gaaattaccc atcttcctaa gcttctgctt ctctcagttt tctgcttgct 6840

cattccactt ttccagctga ccctgccccc taccaacatt gctccacaag cacaaattca 6900

tccagagaaa ataaattcta agttttatag ttgtttggat cgcataggta gctaaagagg 6960

tggcaaccca cacatcctta ggcatgagct tgattttttt tgatttagaa ccttcccctc 7020

tctgttccta gactacacta cacattctgc aagcatagca cagagcaatg ttctacttta 7080

attactttca ttttcttgta tcctcacagc ctagaaaata acctgcgtta cagcatccac 7140

tcagtatccc ttgagcatga ggtgacacta cttaacatag ggacgagatg gtactttgtg 7200

tctcctgctc tgtcagcagg gcactgtact tgctgatacc agggaatgtt tgttcttaaa 7260

taccatcatt ccggacgtgt ttgccttggc cagttttcca tgtacatgca gaaagaagtt 7320

tggactgatc aatacagtcc tctgccttta aagcaatagg aaaaggccaa cttgtctacg 7380

tttagtatgt ggctgtagaa agggtataga tataaaaatt aaaactaatg aaatggcagt 7440

cttacacatt tttggcagct tatttaaagt cttggtgtta agtacgctgg agctgtcaca 7500

gctaccaatc aggcatgtct gggaatgagt acacggggac cataagttac tgacattcgt 7560

ttcccattcc atttgaatac acacttttgt catggtattg cttgctgaaa ttgttttgca 7620

aaaaaaaccc cttcaaattc atatatatta ttttaataaa tgaattttaa tttatctcaa 7680

tgttataaaa aagtcaattt taataattag gtacttatat acccaataat atctaacaat 7740

catttttaaa catttgttta ttgagcttat tatggatgaa tctatctcta tatactctat 7800

atactctaaa aaagaagaaa gaccatagac aatcatctat ttgatatgtg taaagtttac 7860

atgtgagtag acatcagatg ctccatttct cactgtaata ccatttatag ttacttgcaa 7920

aactaactgg aattctagga cttaaatatt ttaagtttta gctgggtgac tggttggaaa 7980

attttaggta agtactgaaa ccaagagatt ataaaacaat aaattctaaa gttttagaag 8040

tgatcataat caaatattac cctctaatga aaatattcca aagttgagct acagaaattt 8100

caacataaga taattttagc tgtaacaatg taatttgttg tctattttct tttgagatac 8160

agttttttct gtctagcttt ggctgtcctg gaccttgctc tgtagaccag gttggtcttg 8220

aactcagaga tctgcttgcc tctgccttgc aagtgctagg attaaaagca tgtgccacca 8280

ctgcctggct acaatctatg ttttataaga gattataaag ctctggcttt gtgacattaa 8340

tctttcagat aataagtctt ttggattgtg tctggagaac atacagactg tgagcagatg 8400

ttcagaggta tatttgctta ggggtgaatt caatctgcag caataattat gagcagaatt 8460

actgacactt ccattttata cattctactt gctgatctat gaaacataga taagcatgca 8520

ggcattcatc atagttttct ttatctggaa aaacattaaa tatgaaagaa gcactttatt 8580

aatacagttt agatgtgttt tgccatcttt taatttctta agaaatacta agctgatgca 8640

gagtgaagag tgtgtgaaaa gcagtggtgc agcttggctt gaactcgttc tccagcttgg 8700

gatcgacctg caggcatgct tccatgccaa ggcccacact gaaatgctca aatgggagac 8760

aaagagatta agctcttatg taaaatttgc tgttttacat aactttaatg aatggacaaa 8820

gtcttgtgca tgggggtggg ggtggggtta gaggggaaca gctccagatg gcaaacatac 8880

gcaagggatt tagtcaaaca actttttggc aaagatggta tgattttgta atggggtagg 8940

aaccaatgaa atgcgaggta agtatggtta atgatctaca gttattggtt aaagaagtat 9000

attagagcga gtctttctgc acacagatca cctttcctat caaccccggg atccaccatg 9060

tctagactgg acaagagcaa agtcataaac ggcgctctgg aattactcaa tggagtcggt 9120

atcgaaggcc tgacgacaag gaaactcgct caaaagctgg gagttgagca gcctaccctg 9180

tactggcacg tgaagaacaa gcgggccctg ctcgatgccc tgccaatcga gatgctggac 9240

aggcatcata cccacttctg ccccctggaa ggcgagtcat ggcaagactt tctgcggaac 9300

aacgccaagt cattccgctg tgctctcctc tcacatcgcg acggggctaa agtgcatctc 9360

ggcacccgcc caacagagaa acagtacgaa accctggaaa atcagctcgc gttcctgtgt 9420

cagcaaggct tctccctgga gaacgcactg tacgctctgt ccgccgtggg ccactttaca 9480

ctgggctgcg tattggagga acaggagcat caagtagcaa aagaggaaag agagacacct 9540

accaccgatt ctatgccccc acttctgaga caagcaattg agctgttcga ccggcaggga 9600

gccgaacctg ccttcctttt cggcctggaa ctaatcatat gtggcctgga gaaacagcta 9660

aagtgcgaaa gcggcgggcc ggccgacgcc cttgacgatt ttgacttaga catgctccca 9720

gccgatgccc ttgacgactt tgaccttgat atgctgcctg ctgacgctct tgacgatttt 9780

gaccttgaca tgctccccgg gtaactagaa ttccgcccct ctccctcccc cccccctaac 9840

gttactggcc gaagccgctt ggaataaggc cggtgtgcgt ttgtctatat gttattttcc 9900

accatattgc cgtcttttgg caatgtgagg gcccggaaac ctggccctgt cttcttgacg 9960

agcattccta ggcgtcgagg gacctaataa cttcgtatag catacattat acgaagttat 10020

acatgtttaa gggttccggt tccactaggt acaattcgat atcaagctta tcgataatca 10080

acctctggat tacaaaattt gtgaaagatt gactggtatt cttaactatg ttgctccttt 10140

tacgctatgt ggatacgctg ctttaatgcc tttgtatcat gctattgctt cccgtatggc 10200

tttcattttc tcctccttgt ataaatcctg gttgctgtct ctttatgagg agttgtggcc 10260

cgttgtcagg caacgtggcg tggtgtgcac tgtgtttgct gacgcaaccc ccactggttg 10320

gggcattgcc accacctgtc agctcctttc cgggactttc gctttccccc tccctattgc 10380

cacggcggaa ctcatcgccg cctgccttgc ccgctgctgg acaggggctc ggctgttggg 10440

cactgacaat tccgtggtgt tgtcggggaa atcatcgtcc tttccttggc tgctcgcctg 10500

tgttgccacc tggattctgc gcgggacgtc cttctgctac gtcccttcgg ccctcaatcc 10560

agcggacctt ccttcccgcg gcctgctgcc ggctctgcgg cctcttccgc gtcttcgcct 10620

tcgccctcag acgagtcgga tctccctttg ggccgcctcc ccgcatcgat accgtcgacc 10680

tcgatcgaga cctagaaaaa catggagcaa tcacaagtag caatacagca gctaccaatg 10740

ctgattgtgc ctggctagaa gcacaagagg aggaggaggt gggttttcca gtcacacctc 10800

agctagagct cgctgatcag cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg 10860

cccctccccc gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata 10920

aaatgaggaa attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt 10980

ggggcaggac agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggactcgag 11040

ctttaagacc aatgacttac aaggcagctg tagatcttag ccactcgagc cccatcctca 11100

ctgactccgt cctggagttg gatgagagat aatggcctta cgttgtgcca ggggagggtc 11160

gggctggatt tagcaagatt taccttctcc aaagagcggt gctgcagtgg cacagctgcc 11220

cacggaggtg ggggggtcac cgtccctgga ggtgatgaag aactgtgggg atgtggcact 11280

gagggacatg gccagtgggc acggtgggtg ggttggggtt ggtcttgggg atcttggagg 11340

gcttttccag ccttcatgat ttgacgattg tatgaacatc tacatggcaa ttctccagct 11400

gcctgtccca gtcctactga cccagctgta tctctccagg caagctcttc caccccttct 11460

gcttgcatcc agacaccatc aaacatgcag gctcagacac agggaccagc agtgtctgtg 11520

gcctttttgt gctcctctcc atgctgggtt ttaacttgct ctttgtcctt ctatcctatc 11580

ttcttatcct taaggctgtt ctgaacgctg tgacttggag agtgtcccag agccctcaac 11640

acctgcatgt cccacgtcca tgctgtcctg cacttcctta tccccaagat ctgcctctcc 11700

gtgatgcact gaattggcaa acatgtgtca ccccagacca acaatgtcac agcaaactcc 11760

cccttgatag gacaaggggg aatggcttta cactgagaca ggggaggttt gggttggata 11820

tgaggaggca gtttttcccc cagagggtgg tgacgcactg aacaggttgc ccaaggaggc 11880

tgtggatgcc ccatccctgc aggcattcaa ggccaggctg gatgtggctc tgggcagcct 11940

gggctgctgg ttgatgaccc tgcacatagc agggggttgg atctggatga gcactgtgct 12000

cctttgcaac ccaggccgtt ctatgattct gtcattctaa atctctcttt cagcctaaag 12060

ctttttcccc gtatcccccc aggtgtctgc aggctcaaag agcagcgaga agcgttcaga 12120

ggaaagcgat cccgtgccac cttccccgtg cccgggctgt ccccgcacgc tgccggctcg 12180

gggatgcggg gggagcgccg gaccggagcg gagccccggg cggctcgctg ctgcccccta 12240

gcgggggagg gacgtaatta catccctggg ggctttgggg gggggctgtc ccgtcgaggc 12300

ttgggtgata gttggtaaaa tgtgtttcaa gtgatgaaaa cttgaattat tatcaccgca 12360

acctactttt taaaaaaaaa agccaggcct gttagagcat gcttaaggga tccctaggac 12420

ttgctgagca cacaagagta gttacttggc aggctcctgg tgagagcata tttcaaaaaa 12480

caaggcagac aaccaagaaa ctacagttaa ggttacctgt ctttaaacca tctgcatata 12540

cacagggata ttaaaatatt ccaaataata tttcattcaa gttttccccc atcaaattgg 12600

gacatggatt tctccggtga ataggcagag ttggaaacta aacaaatgtt ggttttgtga 12660

tttgtgaaat tgttttcaag tgatagttaa agcccatgag atacagaaca aagctgctat 12720

ttcgaggtct cttggtttat actcagaagc acttctttgg gtttccctgc actatcctga 12780

tcatgtgcta ggcctacctt aggctgattg ttgttcaaat aaacttaagt ttcctgtcag 12840

gtgatgtcat atgatttcat atatcaaggc aaaacatgtt atatatgtta aacatttgta 12900

cttaatgtga aagttaggtc tttgtgggtt tgatttttaa ttttcaaaac ctgagctaaa 12960

taagtcattt ttacatgtct tacatttggt ggaattgtat aattgtggtt tgcaggcaag 13020

actctctgac ctagtaaccc tacctataga gcactttgct gggtcacaag tctaggagtc 13080

aagcatttca ccttgaagtt gagacgtttt gttagtgtat actagtttat atgttggagg 13140

acatgtttat ccagaagata ttcaggacta tttttgactg ggctaaggaa ttgattctga 13200

ttagcactgt tagtgagcat tgagtggcct ttaggcttga attggagtca cttgtatatc 13260

tcaaataatg ctggcctttt ttaaaaagcc cttgttcttt atcaccctgt tttctacata 13320

atttttgttc aaagaaatac ttgtttggat ctccttttga caacaatagc atgttttcaa 13380

gccatatttt ttttcctttt tttttttttt tttggttttt cgagacaggg tttctctgta 13440

tagccctggc tgtcctggaa ctcactttgt agaccaggct ggcctcgaac tcagaaatcc 13500

gcctgcctct gcctcctgag tgccgggatt aaaggcgtgc accaccacgc ctggctaagt 13560

tggatatttt gttatataac tataaccaat actaactcca ctgggtggat ttttaattca 13620

gtcagtagtc ttaagtggtc tttattggcc cttcattaaa atctactgtt cactctaaca 13680

gaggctgttg gtactagtgg cacttaagca acttcctacg gatatactag cagattaagg 13740

gtcagggata gaaactagtc tagcgttttg tatacctacc agctttatac taccttgttc 13800

tgatagaaat atttcaggac atctagagtg tactataagg ttgatggtaa gcttataagg 13860

aacttgaaag tggagtaact actccatttc tctgagggga gaattaaaat ttttgaccaa 13920

gtgttgttga gccactgaga atggtctcag aacataactt cttaaggaac cttcccagat 13980

tgccctcaac actgcaccac atttggtcct gcttgaacat tgccatggct cttaaagtct 14040

taattaagaa tattaattgt gtaattattg tttttcctcc tttagatcat tccttgagga 14100

caggacagtg cttgtttaag gctatatttc tgctgtctga gcagcaacag gtcttcgaga 14160

tcaacatgat gttcataatc ccaagatgtt gccatttatg ttctcagaag caagcagagg 14220

catgatggtc agtgacagta atgtcactgt gttaaatgtt gctatgcagt ttggattttt 14280

ctaatgtagt gtaggtagaa catatgtgtt ctgtatgaat taaactctta agttacacct 14340

tgtataatcc atgcaatgtg ttatgcaatt accattttaa gtattgtagc tttctttgta 14400

tgtgaggata aaggtgtttg tcataaaatg ttttgaacat ttccccaaag ttccaaatta 14460

taaaaccaca acgttagaac ttatttatga acaatggttg tagtttcatg cttttaaaat 14520

gcttaattat tcaattaaca ccgtttgtgt tataatatat ataaaactga catgtagaag 14580

tgtttgtcca gaacatttct taaatgtata ctgtctttag agagtttaat atagcatgtc 14640

ttttgcaaca tactaacttt tgtgttggtg cgagcaatat tgtgtagtca ttttgaaagg 14700

agtcatttca atgagtgtca gattgttttg aatgttattg aacattttaa atgcagactt 14760

gttcgtgttt tagaaagcaa aactgtcaga agctttgaac tagaaattaa aaagctgaag 14820

tatttcagaa gggaaataag ctacttgctg tattagttga aggaaagtgt aatagcttag 14880

aaaatttaaa accatatagt tgtcattgct gaatatctgg cagatgaaaa gaaatactca 14940

gtggttcttt tgagcaatat aacagcttgt tatattaaaa attttcccca cagatataaa 15000

ctctaatcta taactcataa atgttacaaa tggatgaagc ttacaaatgt ggcttgactt 15060

gtcactgtgc ttgttttagt tatgtgaaag tttggcaata aacctatgtc ctaaatagtc 15120

aaactgtgga atgacttttt aatctattgg tttgtctaga acagttatgt tgccatttgc 15180

cctaatggtg aaagaaaaag tggggagtgc cttggcactg ttcatttgtg gtgtgaacca 15240

aagagggggg catgcactta cacttcaaac atccttttga aagactgaca agtttgggtc 15300

ttcacagttg gaattgggca tcccttttgt cagggaggga gggagggagg gaggctggct 15360

tgttatgctg acaagtgtga ttaaattcaa actttgaggt aagttggagg aacttgtaca 15420

ttgttaggag tgtgacaatt tggactctta atgatttggt catacaaaat gaacctagac 15480

caacttctgg aagatgtata taataactcc atgttacatt gatttcacct gactaatact 15540

tatcccttat caattaaata cagaagatgc cagccatctg ggccttttaa cccagaaacc 15600

caagctccct tagtgtgtcc ccgatcctct agagtcgagc agtgtggttt tcaagaggaa 15660

gcaaaaagcc tctccaccca ggcctggaat gtttccaccc aatgtcgagc agtgtggttt 15720

tgcaagagga agcaaaaagc ctctccaccc aggcctggaa tgtttccacc caatgtcgag 15780

caaaccccgc ccagcgtctt gtcattggcg aattcgaaca cgcagatgca gtcggggcgg 15840

cgcggtccca ggtccacttc gcatattaag gtgacgcgtg tggcctcgaa caccgagcga 15900

ccctgcagcg acccgcttaa cagcgtcaac agcgtgccgc agatcttggt ggcgtgaaac 15960

tcccgcacct cttcggccag cgccttgtag aagcgcgtat ggcttcgtac cccggccatc 16020

agcacgcgtc tgcgttcgac caggctgcgc gttctcgcgg ccatagcaac cgacgtacgg 16080

cgttgcgccc tcgccggcag caagaagcca cggaagtccg cccggagcag aaaatgccca 16140

cgctactgcg ggtttatata gacggtcccc acgggatggg gaaaaccacc accacgcaac 16200

tgctggtggc cctgggttcg cgcgacgata tcgtctacgt acccgagccg atgacttact 16260

ggcgggtgct gggggcttcc gagacaatcg cgaacatcta caccacacaa caccgccttg 16320

accagggtga gatatcggcc ggggacgcgg cggtggtaat gacaagcgcc cagataacaa 16380

tgggcatgcc ttatgccgtg accgacgccg ttctggctcc tcatatcggg ggggaggctg 16440

ggagctcaca tgccccgccc ccggccctca ccctcatctt cgaccgccat cccatcgccg 16500

ccctcctgtg ctacccggcc gcgcgatacc ttatgggcag catgaccccc caggccgtgc 16560

tggcgttcgt ggccctcatc ccgccgacct tgcccggcac aaacatcgtg ttgggggccc 16620

ttccggagga cagacacatc gaccgcctgg ccaaacgcca gcgccccggc gagcggcttg 16680

acctggctat gctggccgcg attcgccgcg tttacgggct gcttgccaat acggtgcggt 16740

atctgcaggg cggcgggtcg tggcgggagg attggggaca gctttcgggg acggccgtgc 16800

cgccccaggg tgccgagccc cagagcaacg cgggcccacg accccatatc ggggacacgt 16860

tatttaccct gtttcgggcc cccgagttgc tggcccccaa cggcgacctg tacaacgtgt 16920

ttgcctgggc cttggacgtc ttggccaaac gcctccgtcc catgcacgtc tttatcctgg 16980

attacgacca atcgcccgcc ggctgccggg acgccctgct gcaacttacc tccgggatga 17040

tccagaccca cgtcaccacc ccaggctcca taccgacgat ctgcgacctg gcgcgcacgt 17100

ttgcccggga gatgggggag gctaactgaa acacggaagg agacaatacc ggaaggaacc 17160

cgcgctatga cggcaataaa aagacagaat aaaacgcacg ggtgttgggt cgtttgttca 17220

taaacgcggg gttcggtccc agggctggca ctctgtcgat accccaccga gaccccattg 17280

gggccaatac gcccgcgttt cttccttttc cccaccccac cccccaagtt cgggtgaagg 17340

cccagggctc gcagccaacg tcggggcggc aggccctgcc atagccacgg gccccgtggg 17400

ttagggacgg ggtcccccat ggggaatggt ttatggttcg tgggggttat tattttgggc 17460

gttgcgtggg gtcagtccac gactggactg agcagacaga cccatggttt ttggatggcc 17520

tgggcatgga ccgcatgtac tggcgcgaca cgaacaccgg gcgtctgtgg ctgccaaaca 17580

cccccgaccc ccaaaaacca ccgcgcggat ttctggcgcc gccggacgaa ctaaacctga 17640

ctacggcatc tctgcccctt cttcgctggt acgaggagcg cttttgtttt gtattggtca 17700

ccacggccga gtttcctcga ccgatgccct tgagagcctt caacccagtc agctccttcc 17760

ggtgggcgcg gggcatgact atcgtcgccg cacttatgac tgtcttcttt atcatgcaac 17820

tcgtaggaca ggtgccggca gcgctctggg tcattttcgg cgaggaccgc tttcgctgga 17880

gcgcgacgat gatcggcctg tcgcttgcgg tattcggaat cttgcacgcc ctcgctcaag 17940

ccttcgtcac tggtcccgcc accaaacgtt tcggcgagaa gcaggccatt atcgccggca 18000

tggcggccga cgcgctgggc tacgtcttgc tggcgttcgc gacgcgaggc tggatggcct 18060

tccccattat gattcttctc gcttccggcg gcatcgggat gcccgcgttg caggccatgc 18120

tgtccaggca ggtagatgac gaccatcagg gacagcttca aggatcgctc gcggctctta 18180

ccagcctaac ttcgatcact ggaccgctga tcgtcacggc gatttatgcc gcctcggcga 18240

gcacatggaa cgggttggca tggattgtag gcgccgccct ataccttgtc tgcctccccg 18300

cgttgcgtcg cggtgcatgg agccgggcca cctcgacctg aatggaagcc ggcggcacct 18360

cgctaacgga ttcaccactc caagaattgg agccaatcaa ttcttgcgga gaactgtgaa 18420

tgcgcaaacc aacccttggc agaacatatc catcgcgtcc gccatctcca gcagccgcac 18480

gcggcgcatc tcgggcagcg ttgggtcctg gccacgggtg cgcatgatcg tgctcctgtc 18540

gttgaggacc cggctaggct ggcggggttg ccttactggt tagcagaatg aatcaccgat 18600

acgcgagcga acgtgaagcg actgctgctg caaaacgtct gcgacctgag caacaacatg 18660

aatggtcttc ggtttccgtg tttcgtaaag tctggaaacg cggaagtcag cgccctgcac 18720

cattatgttc cggatctgca tcgcaggatg ctgctggcta ccctgtggaa cacctacatc 18780

tgtattaacg aagcgctggc attgaccctg agtgattttt ctctggtccc gccgcatcca 18840

taccgccagt tgtttaccct cacaacgttc cagtaaccgg gcatgttcat catcagtaac 18900

ccgtatcgtg agcatcctct ctcgtttcat cggtatcatt acccccatga acagaaatcc 18960

cccttacacg gaggcatcag tgaccaaaca ggaaaaaacc gcccttaaca tggcccgctt 19020

tatcagaagc cagacattaa cgcttctgga gaaactcaac gagctggacg cggatgaaca 19080

ggcagacatc tgtgaatcgc ttcacgacca cgctgatgag ctttaccgca gctgcctcgc 19140

gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc 19200

ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg 19260

cgggtgtcgg ggcgcagcca tgacccagtc acgtagcgat agcggagtgt atactggctt 19320

aactatgcgg catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg 19380

cacagatgcg taaggagaaa ataccgcatc aggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac 19440

tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata 19500

cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa 19560

aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct 19620

gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa 19680

agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg 19740

cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca 19800

cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa 19860

ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg 19920

gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg 19980

tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaagg 20040

acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc 20100

tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag 20160

attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac 20220

gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc 20280

ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag 20340

taaacttggt ctgacagtta ccaatgctta atcagtgagg cacctatctc agcgatctgt 20400

ctatttcgtt catccatagt tgcctgactc cccgtcgtgt agataactac gatacgggag 20460

ggcttaccat ctggccccag tgctgcaatg ataccgcgag acccacgctc accggctcca 20520

gatttatcag caataaacca gccagccgga agggccgagc gcagaagtgg tcctgcaact 20580

ttatccgcct ccatccagtc tattaattgt tgccgggaag ctagagtaag tagttcgcca 20640

gttaatagtt tgcgcaacgt tgttgccatt gctgcaggca tcgtggtgtc acgctcgtcg 20700

tttggtatgg cttcattcag ctccggttcc caacgatcaa ggcgagttac atgatccccc 20760

atgttgtgca aaaaagcggt tagctccttc ggtcctccga tcgttgtcag aagtaagttg 20820

gccgcagtgt tatcactcat ggttatggca gcactgcata attctcttac tgtcatgcca 20880

tccgtaagat gcttttctgt gactggtgag tactcaacca agtcattctg agaatagtgt 20940

atgcggcgac cgagttgctc ttgcccggcg tcaacacggg ataataccgc gccacatagc 21000

agaactttaa aagtgctcat cattggaaaa cgttcttcgg ggcgaaaact ctcaaggatc 21060

ttaccgctgt tgagatccag ttcgatgtaa cccactcgtg cacccaactg atcttcagca 21120

tcttttactt tcaccagcgt ttctgggtga gcaaaaacag gaaggcaaaa tgccgcaaaa 21180

aagggaataa gggcgacacg gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat 21240

tgaagcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa 21300

aataaacaaa taggggttcc gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa 21360

accattatta tcatgacatt aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctt 21420

caagaa 21426

Claims

1.一种构建人源化小鼠的CRISPR/Cas9系统，其特征在于，该系统由cas9mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒组成，所述gRNA由5’-3’的序列如SEQ ID No.7所示，所述donor DNA重组质粒为R26-e(CN362)-1，具体序列如SEQ ID No.15所示。

2.基于权利要求1所述CRISPR/Cas9系统构建pTight-uPA-Alb-rtTA转基因小鼠的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤如下：

a.分别在体外合成cas9mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒；

b.再将cas9mRNA、gRNA和donor DNA重组质粒共同显微注射到NOD/SCID小鼠受精卵中，得到F0代小鼠；

c.将步骤b得到的F0代小鼠与NOD/SCID小鼠交配获得F1代小鼠即可。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，b步骤还包括将得到F0代小鼠用PCR和测序的方法进行基因型鉴定。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，PCR反应体系50μl：

ddH₂O 31μl，PrimeStar GXL PCR Buffer 10μl，2.5mM dNTP 4μl，Forward

Primer 1μl，Reverse Primer 1μl，PrimeStar GXL DNA Polymerase 2μl，

genomic DNA 1μl。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，5’同源臂扩增用Forward Primer如SEQ ID No.10所示，Reverse Primer如SEQ ID No.11所示；3’同源臂扩增用ForwardPrimer如SEQ ID No.12所示，Reverse Primer如SEQ IDNo.13所示。

6.根据权利要求2-5任一项所述的制备方法，其特征在于，显微注射时按cas9mRNA5ng/μl、gRNA 2ng/μl和donor DNA重组质粒20ng/μl注射。

7.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法得到的小鼠模型。

8.根据权利要求2-6任一项所述的制备方法得到的小鼠模型在筛选肝损伤药物中的应用。