CN102628063A - PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了PAlb-uPA慢病毒载体，该载体含有白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，白蛋白启动子PAlb的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2和调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的PTight启动子；还公开了PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用，其制备方法简单，制得的慢病毒载体能够用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，为临床研究人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物提供了有效的研究平台。

Description

PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及PAlb-uPA慢病毒载体，还涉及PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用。

背景技术

除人和灵长类动物外，人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主，这严重阻碍了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型，但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠，子代新生小鼠死亡率高、筛选难度大，大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。

因此，急需一种PAlb-uPA慢病毒载体，既能对体内组织，又能对体外培养细胞进行感染，可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，提供携带人肝组织的受体小鼠。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供PAlb-uPA慢病毒载体，白蛋白启动子PAlb调控四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2特异表达于肝脏中，四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2在含有四环素类化合物的条件下作用于含四环素操纵子的PTight启动子，最后通过PTight启动子调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达，由白蛋白启动子PAlb和四环素操纵子受双重控制，组织特异性高，调控方便，灵敏。

为实现上述发明目的，技术方案为：

所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2和启动尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2调控所述PTight启动子；

所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

进一步，所述PAlb-uPA慢病毒载体具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。

本发明目的之二在于提供PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其制备方法简单，其技术方案为：

PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，具体步骤如下：

a．从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游，得JGY-PLV-2载体；

b. 克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的上游，得JGY-PLV-1载体；

c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2^S-M2的片段，然后连入pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体；

d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒载体。

进一步，所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体，得JGY-PLV-2载体。

进一步，所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为：以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。 

进一步，所述步骤b中，将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切，连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体，得JGY-PLV-1载体。

进一步，所述步骤b中，所述白蛋白启动子PAlb的克隆，具体为：以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增，得白蛋白启动子PAlb。

进一步，所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-1载体用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体。

进一步，所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。

 

本发明目的之三在于提供PAlb-uPA慢病毒载体的应用，技术方案为：

所述PAlb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。

本发明有益效果在于：本发明公开了PAlb-uPA慢病毒载体，该载体能够用于构建尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，该载体白蛋白启动子PALb控制四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2表达，由四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2在四环素类抗生素诱导下与含有四环素操纵子的启动子PTight结合，启动下游尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达。白蛋白启动子PAlb特异性地表达于肝脏细胞中，从而能够选择性地表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2具有低反应背景，低诱导高反应特性，在无四环素类抗生素诱导时，表现出极低的“剩余”基因表达或无表达；而在有极微量的四环素类抗生素诱导时，运用的1μg的强力霉素能引起uPA mRNA极高的表达，调控方便，获得的转基因小鼠在无四环素类化合物条件下无尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达，获得的转基因子代新生小鼠死亡率低、筛选简单；本发明还公开了PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用，其制备方法简单，制得的PAlb-uPA慢病毒载体可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，可以用于制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。

附图说明

图1为本发明尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA和白蛋白启动子PAlb PCR扩增结果（M：表示marker；UPA表示尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA PCR扩增条带；PAlb表示白蛋白启动子PAlb PCR扩增条带）。

图2为本发明JGY-PLV-2载体图谱。

图3为本发明JGY-PLV-1载体图谱。

图4为本发明JGY-PLV载体图谱。

图5为本发明JGYPLV慢病毒感染H2.35小鼠肝细胞结果图(左图为未感染肝细胞，右图为感染后肝细胞)。

图6为本发明荧光定量PCR检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞中uPA基因的表达情况（强力霉素浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg）。

图7为本发明强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞的uPA蛋白表达结果图（强力霉素浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg）。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件。

实施例1、PAlb-uPA慢病毒载体构建

本发明使用的Lenti-X^TM Tet-on Advanced Inducible Expression System试剂盒购自Clontech公司（含有pLVX Tight Puro载体和pLVX-Tet-On载体）；pMD19-T Simple vocter载体、PCR反应试剂、逆转录试剂盒、in-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒和DNA 聚合酶 primeSTAR HS购自TaKaRa公司；RNA提取试剂盒RNAprep pure Tissue Kit和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司；Trizol抽提液、RNase H和FV膜购自Invitrogen公司；pLKO.1 克隆载体、凝聚胺 Ploybrene和胰酶购自Sigma公司；DMEM培养基、乙二胺四乙酸（EDTA）和Opti-MEM培养基购自GIBCO公司；293T细胞、P-eGFP质粒和H2.35小鼠肝细胞（ATCC）由本所保存。

一、JGY-PLV-2载体构建

取C57小鼠肾脏并提取总RNA，将提取的总RNA用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。根据报道的尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinaseplasminogen activator，uPA）基因序列（Genbank：clone MGC:155950）设计引物，上游引物为5’-atctctagacggtcagcatgggaacaagtg-3’（SEQ ID NO.1），下游引物为5’-aatggatcctaccatgaaagtctggctggc-3’（SEQ ID NO.2）。以第一链cDNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行第一次PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃变性30秒，60℃退火30秒，68℃延伸90秒，共30个循环，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA片段。经测序验证，所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA长度为1414bp，与报道的序列相同，因此克隆所得序列为尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。根据扩增所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA设计第二次扩增引物，上游引物为5’- gcctggagaaggatccgccaccatgaaagtctggctggcg-3’ （SEQ ID NO.3），划线部分在uPA扩增产物片段的5’端添加15个碱基序列，为连接载体时片段重组做准备。下游引物为5’- gcgttcgcgatctagatcagaaggccagacctttct -3’ （SEQ ID NO.4），用上述PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增，PCR扩增条件为95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸90秒，共30个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，获得长度为1340bp的PCR产物。将第二次PCR扩增产物用XbaI和BamHI酶切，回收长度为1360bp的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA酶切产物；同时用XbaI和BamHI酶切pLVX Tight Puro载体，并回收约7800bp的载体骨架，将回收的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA与pLVX Tight Puro载体骨架用In-Fusion交换酶连接，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的含四环素操纵子的启动子PTight上游，连接条件为25℃反应15分钟，再42℃反应15分钟，然后 4℃保存，得JGY-PLV-2载体，如图2所示。

二、JGY-PLV-1载体构建

根据白蛋白启动子(albumin promoter，PAlb)设计引物，上游引物为5’- agatccagtttatcgatctcgagaaccaaccaccggtgcggccgctctagcttccttag-3’（SEQ ID NO.5），划线部分在PAlb扩增产物片段的5’端添加的15个碱基序列，为连接载体时片段重组做准备。下游引物为5’-tagacatggtggatcccggggttgatagga-3’ （SEQ ID NO.6），以本实验室保存的含PAlb启动子的pMD19质粒为模板进行PCR扩增，PCR扩增条件为98℃变性10秒，55℃退火15秒，72℃延伸2.5分钟，共30个循环，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果如图1所示，结果显示获得长度为2399bp的条带，经测序验证与公开的PAlb启动子序列相同，因此得PAlb启动子。将扩增所得PAlb启动子用ClaI和BamHI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收条带为2350bp的PAlb启动子；连接同样经ClaI和BamHI酶切pLVX-Tet-On载体，连接使用In-Fusion交换酶连接，使白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2 5’端，连接反应为25℃反应15分钟，再42℃反应15分钟，最后4℃保存，得JGY-PLV-1载体，如图3所示。

三、PALb-uPA慢病毒载体构建

取载体JGY-PLV-1 2μg用AgeI和AvrII酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收含PAlb启动子的3270bp片段；同时取pLKO.1克隆载体2μg用AgeI和AvrII酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收大小约为6400bp的载体骨架，将回收的PAlb启动子和pLKO.1克隆载体骨架用T4 连接酶连接，连接反应在温度为22℃条件下反应1小时，得重组载体命名为JGY-PLV-A载体。取JGY-PLV-2载体约2μg用AgeI和XhoI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收1780bp左右片段；同时取JGY-PLV-A载体 2μg用AgeI和XhoI酶切，经琼脂糖凝胶电泳鉴定，回收大小约为9120bp的载体骨架。将回收的产物用T4 连接酶连接，连接反应在温度为22℃条件下反应 1小时，得PALb-uPA慢病毒载体，命名为JGY-PLV载体，如图4所示，核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，SEQ ID NO.7所示核酸序列中，4411-6762位核苷酸为白蛋白启动子PAlb编码区，如SEQ ID NO.8所示；2965-4266位核苷酸为尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，如SEQ ID NO.9所示核酸序列；6766-7512位核苷酸为四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2编码区，如SEQ ID NO.10所示核酸序列；2629-2952位核苷酸为PTight启动子编码区，如SEQ ID NO.11所示。

实施例2、PAlb-uPA慢病毒载体功能验证

一、PAlb-uPA慢病毒载体病毒包装

取生长良好的293T细胞，经消化、洗涤，并用Opti-MEM选择培养基制成细胞悬液，然后分传到不同的培养皿中继续培养，备用；然后取两支50mL无菌离心管，其中一支加入0.5 mL浓度为0.5mg/ mL的PAlb-uPA慢病毒载体JGY-PLV、1 mL浓度为 0.2mg/mL的病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G和0.5 mL浓度为0.2mg/ mL的病毒结构蛋白表达质粒psPAX2，再加入Opti-MEM培养基定容至18mL，备用；另一支加入0.5 mL Fran-EZ溶液和17.5 mL Opti-MEM培养基混匀，然后加入第一支试管中，边加边摇直到完全加入，得质粒转染液。然后将所得质粒转染液滴加到细胞培养皿中，培养6小时后换成完全培养基，培养48小时后收集病毒，得慢病毒JGYPLV，并于-80℃保存。

二、JGYPLV慢病毒感染

将制备的JGYPLV慢病毒感染用DMEM（低糖）培养基做适当稀释（终浓度3.0×10⁴），再加入1:2000稀释的凝聚胺(ploybrene)，共同感染H2.35小鼠肝细胞，在温度为33℃、10％的CO₂的条件下培养8-12小时后，更换新鲜培养基或含有强力霉素的培养基DMEM，强力霉素终浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg，在温度为37℃、5％ CO₂培养的条件下诱导48小时后，在荧光纤维镜下观察细胞形态，如图5所示。结果显示，经JGYPLV慢病毒感染后H2.35小鼠肝细胞细胞形态发生改变，不再贴壁生长，表明JGYPLV慢病毒感染的小鼠肝细胞能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。并用荧光定量PCR检测JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达情况，检测尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的荧光定量引物为，上游引物为uPAF：5’- tgaagtttgaggtggagcag-3’ （SEQ ID NO.12）；下游引物为uPAR:5’- caggcagatggtctgtatgg-3’（SEQ ID NO.13）；以小鼠GAPDH基因为内参，上游引物为5’-acaactttggcattgtggaa-3’ （SEQ ID NO.14），下游引物为5’-gatgcagggatgatgttctg-3’ （SEQ ID NO.15），结果如图6所示。结果表明，强力霉素诱导感染H2.35小鼠肝细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达存在量效关系，当强力霉素浓度低于5μg时，随着浓度升高尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达量升高，当强力霉素浓度高于5μg时，uPA基因的表达进入平台增长期，其浓度升高对uPA基因的表达量影响较小。同时检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞的尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA的表达，western blot分析结果如图7所示。结果显示，JGYPLV慢病毒感染H2.35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA表达随强力霉素诱导浓度的增加而升高，在强力霉素浓度10μg时uPA蛋白表达量最高。

由此可知，本发明构建的PAlb-uPA慢病毒载体经包装后感染H2.35小鼠肝细胞，在四环素类抗生素强力霉素诱导下能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA，可以用于制备PAlb-uPA转基因小鼠，获得制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型，为制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述，但本领域的普通技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。

<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院

<120>  PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用

<160>  15

 

<210>  1

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220> 

<223>  uPA 基因一扩上游引物

<400>  1

atctctagac ggtcagcatg ggaacaagtg  30

 

<210>  2

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  uPA 基因一扩下游引物

<400>  2

aatggatcct accatgaaag tctggctggc  30

 

<210>  3

<211>  40

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  uPA 基因二扩上游引物

<400>  3

gcctggagaa ggatccgcca ccatgaaagt ctggctggcg  40

 

<210>  4

<211>  36

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  uPA 基因二扩下游引物

<400>  4

gcgttcgcga tctagatcag aaggccagac ctttct   36

 

<210>  5

<211>  59

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  PAlb启动子上游引物

<400>  5

agatccagtt tatcgatctc gagaaccaac caccggtgcg gccgctctag cttccttag  59

 

<210>  6

<211>  30

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> PALb 启动子下游引物

<400>  6

tagacatggt ggatcccggg gttgatagga   30

 

<210>  7

<211>  10895

<212>  DNA

<213>  PALb-uPA慢病毒载体

 

 

<220> 

<223> PALb-uPA慢病毒载体序列

<400>  7

gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg    60  

atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt   120  

gcgcgagcaa aatttaagct acaacaaggc aaggcttgac cgacaattgc atgaagaatc   180  

tgcttagggt taggcgtttt gcgctgcttc gcgatgtacg ggccagatat acgcgttgac   240  

attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat   300  

atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg   360  

acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt   420  

tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag   480  

tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc   540  

attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag   600  

tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt   660  

ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc   720  

accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg   780  

gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata taagcagcgc gttttgcctg tactgggtct   840  

ctctggttag accagatctg agcctgggag ctctctggct aactagggaa cccactgctt   900  

aagcctcaat aaagcttgcc ttgagtgctt caagtagtgt gtgcccgtct gttgtgtgac   960  

tctggtaact agagatccct cagacccttt tagtcagtgt ggaaaatctc tagcagtggc  1020  

gcccgaacag ggacttgaaa gcgaaaggga aaccagagga gctctctcga cgcaggactc  1080  

ggcttgctga agcgcgcacg gcaagaggcg aggggcggcg actggtgagt acgccaaaaa  1140  

ttttgactag cggaggctag aaggagagag atgggtgcga gagcgtcagt attaagcggg  1200  

ggagaattag atcgcgatgg gaaaaaattc ggttaaggcc agggggaaag aaaaaatata  1260  

aattaaaaca tatagtatgg gcaagcaggg agctagaacg attcgcagtt aatcctggcc  1320  

tgttagaaac atcagaaggc tgtagacaaa tactgggaca gctacaacca tcccttcaga  1380  

caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc  1440  

aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca  1500  

aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga  1560  

tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt  1620  

aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg  1680  

aataggagct ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc  1740  

aatgacgctg acggtacagg ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa  1800  

tttgctgagg gctattgagg cgcaacagca tctgttgcaa ctcacagtct ggggcatcaa  1860  

gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg  1920  

gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg  1980  

gagtaataaa tctctggaac agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga  2040  

aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga  2100  

aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa  2160  

cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg  2220  

tttaagaata gtttttgctg tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc  2280  

attatcgttt cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga  2340  

agaagaaggt ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatcggcact  2400  

gcgtgcgcca attctgcaga caaatggcag tattcatcca caattttaaa agaaaagggg  2460  

ggattggggg gtacagtgca ggggaaagaa tagtagacat aatagcaaca gacatacaaa  2520  

ctaaagaatt acaaaaacaa attacaaaaa ttcaaaattt tcgggtttat tacagggaca  2580  

gcagagatcc agtttggtta gtaccgggcc catccgaatt cggaatcctc gagtttactc  2640  

cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgatgt  2700  

cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata  2760  

gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttatccc  2820  

tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc  2880  

gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga  2940  

tcgcctggag aaggatccgc caccatgaaa gtctggctgg cgagcctgtt cctctgcgcc  3000  

ttggtggtga aaaactctga aggtggcagt gtacttggag ctcctgatga atcaaactgt  3060  

ggctgtcaga acggaggtgt atgcgtgtcc tacaagtact tctccagaat tcgccgatgc  3120  

agctgcccaa ggaaattcca gggggagcac tgtgagatag atgcatcaaa aacctgctat  3180  

catggaaatg gtgactctta ccgaggaaag gccaacactg ataccaaagg tcggccctgc  3240  

ctggcctgga atgcgcctgc tgtccttcag aaaccctaca atgcccacag acctgatgct  3300  

attagcctag gcctggggaa acacaattac tgcaggaacc ctgacaacca gaagcgaccc  3360  

tggtgctatg tgcagattgg cctaaggcag tttgtccaag aatgcatggt gcatgactgc  3420  

tctcttagca aaaagccttc ttcgtctgta gaccaacaag gcttccagtg tggccagaag  3480  

gctctaaggc cccgctttaa gattgttggg ggagaattca ctgaggtgga gaaccagccc  3540  

tggttcgcag ccatctacca gaagaacaag ggaggaagtc ctccctcctt taaatgtggt  3600  

gggagtctca tcagtccttg ctgggtggcc agtgccgcac actgcttcat tcaactccca  3660  

aagaaggaaa actacgttgt ctacctgggt cagtcgaagg agagctccta taatcctgga  3720  

gagatgaagt ttgaggtgga gcagctcatc ttgcacgaat actacaggga agacagcctg  3780  

gcctaccata atgatattgc cttgctgaag atacgtacca gcacgggcca atgtgcacag  3840  

ccatccaggt ccatacagac catctgcctg cccccaaggt ttactgatgc tccgtttggt  3900  

tcagactgtg agatcactgg ctttggaaaa gagtctgaaa gtgactatct ctatccaaag  3960  

aacctgaaaa tgtccgtcgt aaagcttgtt tctcatgaac agtgtatgca gccccactac  4020  

tatggctctg aaattaatta taaaatgctg tgtgctgcgg acccagagtg gaaaacagat  4080  

tcctgcaagg gcgattctgg aggaccgctt atctgtaaca tcgaaggccg cccaactctg  4140  

agtgggattg tgagctgggg ccgaggatgt gcagagaaaa acaagcccgg tgtctacacg  4200  

agggtctcac acttcctgga ctggattcaa tcccacattg gagaagagaa aggtctggcc  4260  

ttctgatcta gatcgcgaac gcgtgaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg  4320  

cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc  4380  

tggcctcgca cacattccac atccaccggt gcggccgctc tagcttcctt agcatgacgt  4440  

tccacttttt tctaaggtgg agcttacttc tttgatttga tcttttgtga aacttttgga  4500  

aattacccat cttcctaagc ttctgcttct ctcagttttc tgcttgctca ttccactttt  4560  

ccagctgacc ctgcccccta ccaacattgc tccacaagca caaattcatc cagagaaaat  4620  

aaattctaag ttttatagtt gtttggatcg cataggtagc taaagaggtg gcaacccaca  4680  

catccttagg catgagcttg attttttttg atttagaacc ttcccctctc tgttcctaga  4740  

ctacactaca cattctgcaa gcatagcaca gagcaatgtt ctactttaat tactttcatt  4800  

ttcttgtatc ctcacagcct agaaaataac ctgcgttaca gcatccactc agtatccctt  4860  

gagcatgagg tgacactact taacataggg acgagatggt actttgtgtc tcctgctctg  4920  

tcagcagggc actgtacttg ctgataccag ggaatgtttg ttcttaaata ccatcattcc  4980  

ggacgtgttt gccttggcca gttttccatg tacatgcaga aagaagtttg gactgatcaa  5040  

tacagtcctc tgcctttaaa gcaataggaa aaggccaact tgtctacgtt tagtatgtgg  5100  

ctgtagaaag ggtatagata taaaaattaa aactaatgaa atggcagtct tacacatttt  5160  

tggcagctta tttaaagtct tggtgttaag tacgctggag ctgtcacagc taccaatcag  5220  

gcatgtctgg gaatgagtac acggggacca taagttactg acattcgttt cccattccat  5280  

ttgaatacac acttttgtca tggtattgct tgctgaaatt gttttgcaaa aaaaacccct  5340  

tcaaattcat atatattatt ttaataaatg aattttaatt tatctcaatg ttataaaaaa  5400  

gtcaatttta ataattaggt acttatatac ccaataatat ctaacaatca tttttaaaca  5460  

tttgtttatt gagcttatta tggatgaatc tatctctata tactctatat actctaaaaa  5520  

agaagaaaga ccatagacaa tcatctattt gatatgtgta aagtttacat gtgagtagac  5580  

atcagatgct ccatttctca ctgtaatacc atttatagtt acttgcaaaa ctaactggaa  5640  

ttctaggact taaatatttt aagttttagc tgggtgactg gttggaaaat tttaggtaag  5700  

tactgaaacc aagagattat aaaacaataa attctaaagt tttagaagtg atcataatca  5760  

aatattaccc tctaatgaaa atattccaaa gttgagctac agaaatttca acataagata  5820  

attttagctg taacaatgta atttgttgtc tattttcttt tgagatacag ttttttctgt  5880  

ctagctttgg ctgtcctgga ccttgctctg tagaccaggt tggtcttgaa ctcagagatc  5940  

tgcttgcctc tgccttgcaa gtgctaggat taaaagcatg tgccaccact gcctggctac  6000  

aatctatgtt ttataagaga ttataaagct ctggctttgt gacattaatc tttcagataa  6060  

taagtctttt ggattgtgtc tggagaacat acagactgtg agcagatgtt cagaggtata  6120  

tttgcttagg ggtgaattca atctgcagca ataattatga gcagaattac tgacacttcc  6180  

attttataca ttctacttgc tgatctatga aacatagata agcatgcagg cattcatcat  6240  

agttttcttt atctggaaaa acattaaata tgaaagaagc actttattaa tacagtttag  6300  

atgtgttttg ccatctttta atttcttaag aaatactaag ctgatgcaga gtgaagagtg  6360  

tgtgaaaagc agtggtgcag cttggcttga actcgttctc cagcttggga tcgacctgca  6420  

ggcatgcttc catgccaagg cccacactga aatgctcaaa tgggagacaa agagattaag  6480  

ctcttatgta aaatttgctg ttttacataa ctttaatgaa tggacaaagt cttgtgcatg  6540  

ggggtggggg tggggttaga ggggaacagc tccagatggc aaacatacgc aagggattta  6600  

gtcaaacaac tttttggcaa agatggtatg attttgtaat ggggtaggaa ccaatgaaat  6660  

gcgaggtaag tatggttaat gatctacagt tattggttaa agaagtatat tagagcgagt  6720  

ctttctgcac acagatcacc tttcctatca accccgggat ccaccatgtc tagactggac  6780  

aagagcaaag tcataaacgg cgctctggaa ttactcaatg gagtcggtat cgaaggcctg  6840  

acgacaagga aactcgctca aaagctggga gttgagcagc ctaccctgta ctggcacgtg  6900  

aagaacaagc gggccctgct cgatgccctg ccaatcgaga tgctggacag gcatcatacc  6960  

cacttctgcc ccctggaagg cgagtcatgg caagactttc tgcggaacaa cgccaagtca  7020  

ttccgctgtg ctctcctctc acatcgcgac ggggctaaag tgcatctcgg cacccgccca  7080  

acagagaaac agtacgaaac cctggaaaat cagctcgcgt tcctgtgtca gcaaggcttc  7140  

tccctggaga acgcactgta cgctctgtcc gccgtgggcc actttacact gggctgcgta  7200  

ttggaggaac aggagcatca agtagcaaaa gaggaaagag agacacctac caccgattct  7260  

atgcccccac ttctgagaca agcaattgag ctgttcgacc ggcagggagc cgaacctgcc  7320  

ttccttttcg gcctggaact aatcatatgt ggcctggaga aacagctaaa gtgcgaaagc  7380  

ggcgggccgg ccgacgccct tgacgatttt gacttagaca tgctcccagc cgatgccctt  7440  

gacgactttg accttgatat gctgcctgct gacgctcttg acgattttga ccttgacatg  7500  

ctccccgggt aactagaatt ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga  7560  

agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg  7620  

tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg  7680  

cgtcgaggga cctaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac atgtttaagg  7740  

gttccggttc cactaggtac aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta  7800  

caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg  7860  

atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc  7920  

ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca  7980  

acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac  8040  

cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact  8100  

catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc  8160  

cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg  8220  

gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc  8280  

ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac  8340  

gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc gatcgagacc  8400  

tagaaaaaca tggagcaatc acaagtagca atacagcagc taccaatgct gattgtgcct  8460  

ggctagaagc acaagaggag gaggaggtgg gttttccagt cacacctcag gtacctttaa  8520  

gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac  8580  

tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca  8640  

cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac  8700  

tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagca agagaaggta gaagaagcca  8760  

atgaaggaga gaacacccgc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg  8820  

agagagaagt attagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag  8880  

agctgcatcc ggactgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct  8940  

ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag  9000  

tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt  9060  

cagtgtggaa aatctctagc agcatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta  9120  

aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa  9180  

atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc  9240  

cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt  9300  

ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca  9360  

gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg  9420  

accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat  9480  

cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta  9540  

cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct  9600  

gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac  9660  

aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa  9720  

aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa  9780  

actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt  9840  

taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca  9900  

gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca  9960  

tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 10020  

ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 10080  

accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 10140  

agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 10200  

acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 10260  

tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 10320  

cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 10380  

tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 10440  

ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 10500  

gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 10560  

tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 10620  

ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 10680  

gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 10740  

cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 10800  

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 10860  

ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgac                            10895

 

<210>  8

<211>  2344

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> 白蛋白启动子PALb编码区

<400>  8

tctagcttcc ttagcatgac gttccacttt tttctaaggt ggagcttact tctttgattt   60   

gatcttttgt gaaacttttg gaaattaccc atcttcctaa gcttctgctt ctctcagttt  120   

tctgcttgct cattccactt ttccagctga ccctgccccc taccaacatt gctccacaag  180   

cacaaattca tccagagaaa ataaattcta agttttatag ttgtttggat cgcataggta  240   

gctaaagagg tggcaaccca cacatcctta ggcatgagct tgattttttt tgatttagaa  300   

ccttcccctc tctgttccta gactacacta cacattctgc aagcatagca cagagcaatg  360   

ttctacttta attactttca ttttcttgta tcctcacagc ctagaaaata acctgcgtta  420   

cagcatccac tcagtatccc ttgagcatga ggtgacacta cttaacatag ggacgagatg  480   

gtactttgtg tctcctgctc tgtcagcagg gcactgtact tgctgatacc agggaatgtt  540   

tgttcttaaa taccatcatt ccggacgtgt ttgccttggc cagttttcca tgtacatgca  600   

gaaagaagtt tggactgatc aatacagtcc tctgccttta aagcaatagg aaaaggccaa  660   

cttgtctacg tttagtatgt ggctgtagaa agggtataga tataaaaatt aaaactaatg  720   

aaatggcagt cttacacatt tttggcagct tatttaaagt cttggtgtta agtacgctgg  780   

agctgtcaca gctaccaatc aggcatgtct gggaatgagt acacggggac cataagttac  840   

tgacattcgt ttcccattcc atttgaatac acacttttgt catggtattg cttgctgaaa  900   

ttgttttgca aaaaaaaccc cttcaaattc atatatatta ttttaataaa tgaattttaa  960   

tttatctcaa tgttataaaa aagtcaattt taataattag gtacttatat acccaataat 1020   

atctaacaat catttttaaa catttgttta ttgagcttat tatggatgaa tctatctcta 1080   

tatactctat atactctaaa aaagaagaaa gaccatagac aatcatctat ttgatatgtg 1140   

taaagtttac atgtgagtag acatcagatg ctccatttct cactgtaata ccatttatag 1200   

ttacttgcaa aactaactgg aattctagga cttaaatatt ttaagtttta gctgggtgac 1260   

tggttggaaa attttaggta agtactgaaa ccaagagatt ataaaacaat aaattctaaa 1320   

gttttagaag tgatcataat caaatattac cctctaatga aaatattcca aagttgagct 1380   

acagaaattt caacataaga taattttagc tgtaacaatg taatttgttg tctattttct 1440   

tttgagatac agttttttct gtctagcttt ggctgtcctg gaccttgctc tgtagaccag 1500   

gttggtcttg aactcagaga tctgcttgcc tctgccttgc aagtgctagg attaaaagca 1560   

tgtgccacca ctgcctggct acaatctatg ttttataaga gattataaag ctctggcttt 1620   

gtgacattaa tctttcagat aataagtctt ttggattgtg tctggagaac atacagactg 1680   

tgagcagatg ttcagaggta tatttgctta ggggtgaatt caatctgcag caataattat 1740   

gagcagaatt actgacactt ccattttata cattctactt gctgatctat gaaacataga 1800   

taagcatgca ggcattcatc atagttttct ttatctggaa aaacattaaa tatgaaagaa 1860   

gcactttatt aatacagttt agatgtgttt tgccatcttt taatttctta agaaatacta 1920   

agctgatgca gagtgaagag tgtgtgaaaa gcagtggtgc agcttggctt gaactcgttc 1980   

tccagcttgg gatcgacctg caggcatgct tccatgccaa ggcccacact gaaatgctca 2040   

aatgggagac aaagagatta agctcttatg taaaatttgc tgttttacat aactttaatg 2100   

aatggacaaa gtcttgtgca tgggggtggg ggtggggtta gaggggaaca gctccagatg 2160   

gcaaacatac gcaagggatt tagtcaaaca actttttggc aaagatggta tgattttgta 2220   

atggggtagg aaccaatgaa atgcgaggta agtatggtta atgatctaca gttattggtt 2280   

aaagaagtat attagagcga gtctttctgc acacagatca cctttcctat caaccccggg 2340

atcc                                                              2344

 

<210>  9

<211>  1302

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> 尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA编码区

<400>  9

atgaaagtct ggctggcgag cctgttcctc tgcgccttgg tggtgaaaaa ctctgaaggt   60   

ggcagtgtac ttggagctcc tgatgaatca aactgtggct gtcagaacgg aggtgtatgc  120   

gtgtcctaca agtacttctc cagaattcgc cgatgcagct gcccaaggaa attccagggg  180   

gagcactgtg agatagatgc atcaaaaacc tgctatcatg gaaatggtga ctcttaccga  240   

ggaaaggcca acactgatac caaaggtcgg ccctgcctgg cctggaatgc gcctgctgtc  300   

cttcagaaac cctacaatgc ccacagacct gatgctatta gcctaggcct ggggaaacac  360   

aattactgca ggaaccctga caaccagaag cgaccctggt gctatgtgca gattggccta  420   

aggcagtttg tccaagaatg catggtgcat gactgctctc ttagcaaaaa gccttcttcg  480   

tctgtagacc aacaaggctt ccagtgtggc cagaaggctc taaggccccg ctttaagatt  540   

gttgggggag aattcactga ggtggagaac cagccctggt tcgcagccat ctaccagaag  600   

aacaagggag gaagtcctcc ctcctttaaa tgtggtggga gtctcatcag tccttgctgg  660   

gtggccagtg ccgcacactg cttcattcaa ctcccaaaga aggaaaacta cgttgtctac  720   

ctgggtcagt cgaaggagag ctcctataat cctggagaga tgaagtttga ggtggagcag  780   

ctcatcttgc acgaatacta cagggaagac agcctggcct accataatga tattgccttg  840   

ctgaagatac gtaccagcac gggccaatgt gcacagccat ccaggtccat acagaccatc  900   

tgcctgcccc caaggtttac tgatgctccg tttggttcag actgtgagat cactggcttt  960   

ggaaaagagt ctgaaagtga ctatctctat ccaaagaacc tgaaaatgtc cgtcgtaaag 1020   

cttgtttctc atgaacagtg tatgcagccc cactactatg gctctgaaat taattataaa 1080   

atgctgtgtg ctgcggaccc agagtggaaa acagattcct gcaagggcga ttctggagga 1140   

ccgcttatct gtaacatcga aggccgccca actctgagtg ggattgtgag ctggggccga 1200   

ggatgtgcag agaaaaacaa gcccggtgtc tacacgaggg tctcacactt cctggactgg 1260   

attcaatccc acattggaga agagaaaggt ctggccttct ga                    1302

 

<210>  10

<211>  747

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> 四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2编码区

<400>  10

atgtctagac tggacaagag caaagtcata aacggcgctc tggaattact caatggagtc   61 

ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc  121 

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg  181 

gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg  241 

aacaacgcca agtcattccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat  301 

ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg  361 

tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt  421 

acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca  481 

cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag  541 

ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag  601 

ctaaagtgcg aaagcggcgg gccggccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc  661 

ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat  721 

tttgaccttg acatgctccc cgggtaa                                      747

 

<210>  11

<211>  319

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223>  启动子PTight编码区

<400>  11

tttactccct atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga   60   

acgatgtcga gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc  120   

agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt  180   

ttatccctat cagtgataga gaacgtatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac  240   

gtatgtcgag gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac  300   

cgtcagatcg cctggagaa                                               319

 

<210>  12

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> uPA基因荧光定量上游引物uPAF

<400>  12

tgaagtttga ggtggagcag

 

<210>  13

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> uPA基因荧光定量下游引物uPAR

<400> 13

caggcagatg gtctgtatgg   20

 

<210>  14

<211>  21

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> GAPDH基因荧光定量上游引物

<400>  14

acaactttgg cattgtggaa   21

 

<210>  15

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<220> 

<223> GAPDH基因荧光定量下游引物

<400>  15

gatgcaggga tgatgttctg   20

Claims (10)

1.PAlb-uPA慢病毒载体，其特征在于：所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2和启动所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子，所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2调控PTight启动子；

所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示；PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。

2.根据权利要求1所述的PAlb-uPA慢病毒载体，其特征在于：所述PAlb-uPA慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1或2所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

a．从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA，并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游，得JGY-PLV-2载体；

b. 克隆白蛋白启动子PAlb，并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2的上游，得JGY-PLV-1载体；

c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2^S-M2的片段，然后连入pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体；

d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段，然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游，得PAlb-uPA慢病毒载体。

4.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切，连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体，得JGY-PLV-2载体。

5.根据权利要求4所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆，具体为：以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物，进行第一次PCR扩增；再以第一次PCR产物为模板，以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增，得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。

6.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切，连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体，得JGY-PLV-1载体。

7.根据权利要求6所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤b中，所述白蛋白启动子PAlb的克隆，具体为：以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板，以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增，得白蛋白启动子PAlb。

8.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-1载体用AgeI和AvrII酶切，回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO.1克隆载体，得JGY-PLV-A载体。

9.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法，其特征在于：所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2^S-M2片段，然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。

10.权利要求1所述PAlb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。

Images