CN102628063A - PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了PAlb-uPA慢病毒载体,该载体含有白蛋白启动子PAlb和尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA,白蛋白启动子PAlb的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2和调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的PTight启动子;还公开了PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用,其制备方法简单,制得的慢病毒载体能够用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,为临床研究人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物提供了有效的研究平台。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域,特别涉及PAlb-uPA慢病毒载体,还涉及PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用。
背景技术
除人和灵长类动物外,人肝炎病毒并不存在天然的小动物感染宿主,这严重阻碍了对人肝炎病毒感染机制和抗病毒药物的研究。目前只有黑猩猩是研究人肝炎病毒感染最好的体内实验模型,但使用受保护的稀有灵长类动物受到伦理学及经费等诸多限制。因此建立廉价易得的小动物模型是亟待解决的难题。近年发展起来的能携带人肝组织的小鼠动物模型为肝炎病毒感染机制和抗病毒药物研究提供了良好的平台。经研究发现尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,是携带人肝组织的理想小鼠动物模型。但是通过转基因方法获得的尿激酶型纤溶蛋白酶转基因小鼠,子代新生小鼠死亡率高、筛选难度大,大大阻碍了人嵌合肝小鼠模型的构建、推广和使用。
因此,急需一种PAlb-uPA慢病毒载体,既能对体内组织,又能对体外培养细胞进行感染,可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,提供携带人肝组织的受体小鼠。
发明内容
有鉴于此,本发明的目的之一在于提供PAlb-uPA慢病毒载体,白蛋白启动子PAlb调控四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2特异表达于肝脏中,四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2在含有四环素类化合物的条件下作用于含四环素操纵子的PTight启动子,最后通过PTight启动子调控尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达,由白蛋白启动子PAlb和四环素操纵子受双重控制,组织特异性高,调控方便,灵敏。
为实现上述发明目的,技术方案为:
所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2和启动尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子,所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2调控所述PTight启动子;
所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示;PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
进一步,所述PAlb-uPA慢病毒载体具有如SEQ ID NO.7所示核苷酸序列。
本发明目的之二在于提供PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其制备方法简单,其技术方案为:
PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,具体步骤如下:
a.从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA,并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游,得JGY-PLV-2载体;
b. 克隆白蛋白启动子PAlb,并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的上游,得JGY-PLV-1载体;
c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2S-M2的片段,然后连入pLKO.1克隆载体,得JGY-PLV-A载体;
d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段,然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游,得PAlb-uPA慢病毒载体。
进一步,所述步骤a中,将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切,连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体,得JGY-PLV-2载体。
进一步,所述步骤a中,尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆,具体为:以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板,以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物,进行第一次PCR扩增;再以第一次PCR产物为模板,以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增,得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。
进一步,所述步骤b中,将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切,连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体,得JGY-PLV-1载体。
进一步,所述步骤b中,所述白蛋白启动子PAlb的克隆,具体为:以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板,以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增,得白蛋白启动子PAlb。
进一步,所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-1载体用AgeI和AvrII酶切,回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2片段,然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO.1克隆载体,得JGY-PLV-A载体。
进一步,所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2片段,然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。
本发明目的之三在于提供PAlb-uPA慢病毒载体的应用,技术方案为:
所述PAlb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。
本发明有益效果在于:本发明公开了PAlb-uPA慢病毒载体,该载体能够用于构建尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,该载体白蛋白启动子PALb控制四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2表达,由四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2在四环素类抗生素诱导下与含有四环素操纵子的启动子PTight结合,启动下游尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达。白蛋白启动子PAlb特异性地表达于肝脏细胞中,从而能够选择性地表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2具有低反应背景,低诱导高反应特性,在无四环素类抗生素诱导时,表现出极低的“剩余”基因表达或无表达;而在有极微量的四环素类抗生素诱导时,运用的1μg的强力霉素能引起uPA mRNA极高的表达,调控方便,获得的转基因小鼠在无四环素类化合物条件下无尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达,获得的转基因子代新生小鼠死亡率低、筛选简单;本发明还公开了PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法和应用,其制备方法简单,制得的PAlb-uPA慢病毒载体可以用于制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,可以用于制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。
附图说明
图1为本发明尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA和白蛋白启动子PAlb PCR扩增结果(M:表示marker;UPA表示尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA PCR扩增条带;PAlb表示白蛋白启动子PAlb PCR扩增条带)。
图2为本发明JGY-PLV-2载体图谱。
图3为本发明JGY-PLV-1载体图谱。
图4为本发明JGY-PLV载体图谱。
图5为本发明JGYPLV慢病毒感染H2.35小鼠肝细胞结果图(左图为未感染肝细胞,右图为感染后肝细胞)。
图6为本发明荧光定量PCR检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞中uPA基因的表达情况(强力霉素浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg)。
图7为本发明强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞的uPA蛋白表达结果图(强力霉素浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg)。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件。
实施例1、PAlb-uPA慢病毒载体构建
本发明使用的Lenti-XTM Tet-on Advanced Inducible Expression System试剂盒购自Clontech公司(含有pLVX Tight Puro载体和pLVX-Tet-On载体);pMD19-T Simple vocter载体、PCR反应试剂、逆转录试剂盒、in-Fusion Dry-Down PCR克隆试剂盒和DNA 聚合酶 primeSTAR HS购自TaKaRa公司;RNA提取试剂盒RNAprep pure Tissue Kit和胶回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司;质粒大抽试剂盒购自Qiagen公司;Trizol抽提液、RNase H和FV膜购自Invitrogen公司;pLKO.1 克隆载体、凝聚胺 Ploybrene和胰酶购自Sigma公司;DMEM培养基、乙二胺四乙酸(EDTA)和Opti-MEM培养基购自GIBCO公司;293T细胞、P-eGFP质粒和H2.35小鼠肝细胞(ATCC)由本所保存。
一、JGY-PLV-2载体构建
取C57小鼠肾脏并提取总RNA,将提取的总RNA用逆转录试剂盒合成第一链cDNA。根据报道的尿激酶型纤溶酶原激活剂(urokinaseplasminogen activator,uPA)基因序列(Genbank:clone MGC:155950)设计引物,上游引物为5’-atctctagacggtcagcatgggaacaagtg-3’(SEQ ID NO.1),下游引物为5’-aatggatcctaccatgaaagtctggctggc-3’(SEQ ID NO.2)。以第一链cDNA为模板,SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示序列为引物进行第一次PCR扩增,PCR扩增条件为:95℃变性30秒,60℃退火30秒,68℃延伸90秒,共30个循环,得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA片段。经测序验证,所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA长度为1414bp,与报道的序列相同,因此克隆所得序列为尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。根据扩增所得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA设计第二次扩增引物,上游引物为5’- gcctggagaaggatccgccaccatgaaagtctggctggcg-3’ (SEQ ID NO.3),划线部分在uPA扩增产物片段的5’端添加15个碱基序列,为连接载体时片段重组做准备。下游引物为5’- gcgttcgcgatctagatcagaaggccagacctttct -3’ (SEQ ID NO.4),用上述PCR扩增产物为模板进行第二次PCR扩增,PCR扩增条件为95℃变性30秒,55℃退火30秒,72℃延伸90秒,共30个循环,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果如图1所示,获得长度为1340bp的PCR产物。将第二次PCR扩增产物用XbaI和BamHI酶切,回收长度为1360bp的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA酶切产物;同时用XbaI和BamHI酶切pLVX Tight Puro载体,并回收约7800bp的载体骨架,将回收的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA与pLVX Tight Puro载体骨架用In-Fusion交换酶连接,尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的含四环素操纵子的启动子PTight上游,连接条件为25℃反应15分钟,再42℃反应15分钟,然后 4℃保存,得JGY-PLV-2载体,如图2所示。
二、JGY-PLV-1载体构建
根据白蛋白启动子(albumin promoter,PAlb)设计引物,上游引物为5’- agatccagtttatcgatctcgagaaccaaccaccggtgcggccgctctagcttccttag-3’(SEQ ID NO.5),划线部分在PAlb扩增产物片段的5’端添加的15个碱基序列,为连接载体时片段重组做准备。下游引物为5’-tagacatggtggatcccggggttgatagga-3’ (SEQ ID NO.6),以本实验室保存的含PAlb启动子的pMD19质粒为模板进行PCR扩增,PCR扩增条件为98℃变性10秒,55℃退火15秒,72℃延伸2.5分钟,共30个循环,PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定,结果如图1所示,结果显示获得长度为2399bp的条带,经测序验证与公开的PAlb启动子序列相同,因此得PAlb启动子。将扩增所得PAlb启动子用ClaI和BamHI酶切,经琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收条带为2350bp的PAlb启动子;连接同样经ClaI和BamHI酶切pLVX-Tet-On载体,连接使用In-Fusion交换酶连接,使白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2 5’端,连接反应为25℃反应15分钟,再42℃反应15分钟,最后4℃保存,得JGY-PLV-1载体,如图3所示。
三、PALb-uPA慢病毒载体构建
取载体JGY-PLV-1 2μg用AgeI和AvrII酶切,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收含PAlb启动子的3270bp片段;同时取pLKO.1克隆载体2μg用AgeI和AvrII酶切,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收大小约为6400bp的载体骨架,将回收的PAlb启动子和pLKO.1克隆载体骨架用T4 连接酶连接,连接反应在温度为22℃条件下反应1小时,得重组载体命名为JGY-PLV-A载体。取JGY-PLV-2载体约2μg用AgeI和XhoI酶切,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收1780bp左右片段;同时取JGY-PLV-A载体 2μg用AgeI和XhoI酶切,经琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收大小约为9120bp的载体骨架。将回收的产物用T4 连接酶连接,连接反应在温度为22℃条件下反应 1小时,得PALb-uPA慢病毒载体,命名为JGY-PLV载体,如图4所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示,SEQ ID NO.7所示核酸序列中,4411-6762位核苷酸为白蛋白启动子PAlb编码区,如SEQ ID NO.8所示;2965-4266位核苷酸为尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA,如SEQ ID NO.9所示核酸序列;6766-7512位核苷酸为四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2编码区,如SEQ ID NO.10所示核酸序列;2629-2952位核苷酸为PTight启动子编码区,如SEQ ID NO.11所示。
实施例2、PAlb-uPA慢病毒载体功能验证
一、PAlb-uPA慢病毒载体病毒包装
取生长良好的293T细胞,经消化、洗涤,并用Opti-MEM选择培养基制成细胞悬液,然后分传到不同的培养皿中继续培养,备用;然后取两支50mL无菌离心管,其中一支加入0.5 mL浓度为0.5mg/ mL的PAlb-uPA慢病毒载体JGY-PLV、1 mL浓度为 0.2mg/mL的病毒包膜蛋白表达质粒pMD2.G和0.5 mL浓度为0.2mg/ mL的病毒结构蛋白表达质粒psPAX2,再加入Opti-MEM培养基定容至18mL,备用;另一支加入0.5 mL Fran-EZ溶液和17.5 mL Opti-MEM培养基混匀,然后加入第一支试管中,边加边摇直到完全加入,得质粒转染液。然后将所得质粒转染液滴加到细胞培养皿中,培养6小时后换成完全培养基,培养48小时后收集病毒,得慢病毒JGYPLV,并于-80℃保存。
二、JGYPLV慢病毒感染
将制备的JGYPLV慢病毒感染用DMEM(低糖)培养基做适当稀释(终浓度3.0×104),再加入1:2000稀释的凝聚胺(ploybrene),共同感染H2.35小鼠肝细胞,在温度为33℃、10%的CO2的条件下培养8-12小时后,更换新鲜培养基或含有强力霉素的培养基DMEM,强力霉素终浓度分别为0μg、1μg、3μg、5μg、7μg、10μg,在温度为37℃、5% CO2培养的条件下诱导48小时后,在荧光纤维镜下观察细胞形态,如图5所示。结果显示,经JGYPLV慢病毒感染后H2.35小鼠肝细胞细胞形态发生改变,不再贴壁生长,表明JGYPLV慢病毒感染的小鼠肝细胞能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。并用荧光定量PCR检测JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达情况,检测尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的荧光定量引物为,上游引物为uPAF:5’- tgaagtttgaggtggagcag-3’ (SEQ ID NO.12);下游引物为uPAR:5’- caggcagatggtctgtatgg-3’(SEQ ID NO.13);以小鼠GAPDH基因为内参,上游引物为5’-acaactttggcattgtggaa-3’ (SEQ ID NO.14),下游引物为5’-gatgcagggatgatgttctg-3’ (SEQ ID NO.15),结果如图6所示。结果表明,强力霉素诱导感染H2.35小鼠肝细胞尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达存在量效关系,当强力霉素浓度低于5μg时,随着浓度升高尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的表达量升高,当强力霉素浓度高于5μg时,uPA基因的表达进入平台增长期,其浓度升高对uPA基因的表达量影响较小。同时检测强力霉素诱导JGYPLV慢病毒感染的H2.35小鼠肝细胞的尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA的表达,western blot分析结果如图7所示。结果显示,JGYPLV慢病毒感染H2.35小鼠肝细胞中尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA表达随强力霉素诱导浓度的增加而升高,在强力霉素浓度10μg时uPA蛋白表达量最高。
由此可知,本发明构建的PAlb-uPA慢病毒载体经包装后感染H2.35小鼠肝细胞,在四环素类抗生素强力霉素诱导下能够过量表达尿激酶型纤溶酶原激活剂uPA,可以用于制备PAlb-uPA转基因小鼠,获得制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型,为制备携带人肝组织的动物模型提供小鼠受体。
最后说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管通过参照本发明的优选实施例已经对本发明进行了描述,但本领域的普通技术人员应当理解,可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变,而不偏离所附权利要求书所限定的本发明的精神和范围。
<110> 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
<120> PAlb-uPA慢病毒载体及其制备方法和应用
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<212> DNA
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<223> uPA 基因一扩上游引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> uPA 基因一扩下游引物
<400> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> uPA 基因二扩下游引物
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> PAlb启动子上游引物
<400> 5
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<210> 6
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> PALb 启动子下游引物
<400> 6
tagacatggt ggatcccggg gttgatagga 30
<210> 7
<211> 10895
<212> DNA
<213> PALb-uPA慢病毒载体
<220>
<223> PALb-uPA慢病毒载体序列
<400> 7
gtcgacggat cgggagatct cccgatcccc tatggtgcac tctcagtaca atctgctctg 60
atgccgcata gttaagccag tatctgctcc ctgcttgtgt gttggaggtc gctgagtagt 120
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caggatcaga agaacttaga tcattatata atacagtagc aaccctctat tgtgtgcatc 1440
aaaggataga gataaaagac accaaggaag ctttagacaa gatagaggaa gagcaaaaca 1500
aaagtaagac caccgcacag caagcggccg gccgctgatc ttcagacctg gaggaggaga 1560
tatgagggac aattggagaa gtgaattata taaatataaa gtagtaaaaa ttgaaccatt 1620
aggagtagca cccaccaagg caaagagaag agtggtgcag agagaaaaaa gagcagtggg 1680
aataggagct ttgttccttg ggttcttggg agcagcagga agcactatgg gcgcagcgtc 1740
aatgacgctg acggtacagg ccagacaatt attgtctggt atagtgcagc agcagaacaa 1800
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gcagctccag gcaagaatcc tggctgtgga aagataccta aaggatcaac agctcctggg 1920
gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct gtgccttgga atgctagttg 1980
gagtaataaa tctctggaac agatttggaa tcacacgacc tggatggagt gggacagaga 2040
aattaacaat tacacaagct taatacactc cttaattgaa gaatcgcaaa accagcaaga 2100
aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca agtttgtgga attggtttaa 2160
cataacaaat tggctgtggt atataaaatt attcataatg atagtaggag gcttggtagg 2220
tttaagaata gtttttgctg tactttctat agtgaataga gttaggcagg gatattcacc 2280
attatcgttt cagacccacc tcccaacccc gaggggaccc gacaggcccg aaggaataga 2340
agaagaaggt ggagagagag acagagacag atccattcga ttagtgaacg gatcggcact 2400
gcgtgcgcca attctgcaga caaatggcag tattcatcca caattttaaa agaaaagggg 2460
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cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt ttactcccta tcagtgatag agaacgatgt 2700
cgagtttact ccctatcagt gatagagaac gtatgtcgag tttactccct atcagtgata 2760
gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga acgtatgtcg agtttatccc 2820
tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc agtgatagag aacgtatgtc 2880
gaggtaggcg tgtacggtgg gaggcctata taagcagagc tcgtttagtg aaccgtcaga 2940
tcgcctggag aaggatccgc caccatgaaa gtctggctgg cgagcctgtt cctctgcgcc 3000
ttggtggtga aaaactctga aggtggcagt gtacttggag ctcctgatga atcaaactgt 3060
ggctgtcaga acggaggtgt atgcgtgtcc tacaagtact tctccagaat tcgccgatgc 3120
agctgcccaa ggaaattcca gggggagcac tgtgagatag atgcatcaaa aacctgctat 3180
catggaaatg gtgactctta ccgaggaaag gccaacactg ataccaaagg tcggccctgc 3240
ctggcctgga atgcgcctgc tgtccttcag aaaccctaca atgcccacag acctgatgct 3300
attagcctag gcctggggaa acacaattac tgcaggaacc ctgacaacca gaagcgaccc 3360
tggtgctatg tgcagattgg cctaaggcag tttgtccaag aatgcatggt gcatgactgc 3420
tctcttagca aaaagccttc ttcgtctgta gaccaacaag gcttccagtg tggccagaag 3480
gctctaaggc cccgctttaa gattgttggg ggagaattca ctgaggtgga gaaccagccc 3540
tggttcgcag ccatctacca gaagaacaag ggaggaagtc ctccctcctt taaatgtggt 3600
gggagtctca tcagtccttg ctgggtggcc agtgccgcac actgcttcat tcaactccca 3660
aagaaggaaa actacgttgt ctacctgggt cagtcgaagg agagctccta taatcctgga 3720
gagatgaagt ttgaggtgga gcagctcatc ttgcacgaat actacaggga agacagcctg 3780
gcctaccata atgatattgc cttgctgaag atacgtacca gcacgggcca atgtgcacag 3840
ccatccaggt ccatacagac catctgcctg cccccaaggt ttactgatgc tccgtttggt 3900
tcagactgtg agatcactgg ctttggaaaa gagtctgaaa gtgactatct ctatccaaag 3960
aacctgaaaa tgtccgtcgt aaagcttgtt tctcatgaac agtgtatgca gccccactac 4020
tatggctctg aaattaatta taaaatgctg tgtgctgcgg acccagagtg gaaaacagat 4080
tcctgcaagg gcgattctgg aggaccgctt atctgtaaca tcgaaggccg cccaactctg 4140
agtgggattg tgagctgggg ccgaggatgt gcagagaaaa acaagcccgg tgtctacacg 4200
agggtctcac acttcctgga ctggattcaa tcccacattg gagaagagaa aggtctggcc 4260
ttctgatcta gatcgcgaac gcgtgaattc taccgggtag gggaggcgct tttcccaagg 4320
cagtctggag catgcgcttt agcagccccg ctgggcactt ggcgctacac aagtggcctc 4380
tggcctcgca cacattccac atccaccggt gcggccgctc tagcttcctt agcatgacgt 4440
tccacttttt tctaaggtgg agcttacttc tttgatttga tcttttgtga aacttttgga 4500
aattacccat cttcctaagc ttctgcttct ctcagttttc tgcttgctca ttccactttt 4560
ccagctgacc ctgcccccta ccaacattgc tccacaagca caaattcatc cagagaaaat 4620
aaattctaag ttttatagtt gtttggatcg cataggtagc taaagaggtg gcaacccaca 4680
catccttagg catgagcttg attttttttg atttagaacc ttcccctctc tgttcctaga 4740
ctacactaca cattctgcaa gcatagcaca gagcaatgtt ctactttaat tactttcatt 4800
ttcttgtatc ctcacagcct agaaaataac ctgcgttaca gcatccactc agtatccctt 4860
gagcatgagg tgacactact taacataggg acgagatggt actttgtgtc tcctgctctg 4920
tcagcagggc actgtacttg ctgataccag ggaatgtttg ttcttaaata ccatcattcc 4980
ggacgtgttt gccttggcca gttttccatg tacatgcaga aagaagtttg gactgatcaa 5040
tacagtcctc tgcctttaaa gcaataggaa aaggccaact tgtctacgtt tagtatgtgg 5100
ctgtagaaag ggtatagata taaaaattaa aactaatgaa atggcagtct tacacatttt 5160
tggcagctta tttaaagtct tggtgttaag tacgctggag ctgtcacagc taccaatcag 5220
gcatgtctgg gaatgagtac acggggacca taagttactg acattcgttt cccattccat 5280
ttgaatacac acttttgtca tggtattgct tgctgaaatt gttttgcaaa aaaaacccct 5340
tcaaattcat atatattatt ttaataaatg aattttaatt tatctcaatg ttataaaaaa 5400
gtcaatttta ataattaggt acttatatac ccaataatat ctaacaatca tttttaaaca 5460
tttgtttatt gagcttatta tggatgaatc tatctctata tactctatat actctaaaaa 5520
agaagaaaga ccatagacaa tcatctattt gatatgtgta aagtttacat gtgagtagac 5580
atcagatgct ccatttctca ctgtaatacc atttatagtt acttgcaaaa ctaactggaa 5640
ttctaggact taaatatttt aagttttagc tgggtgactg gttggaaaat tttaggtaag 5700
tactgaaacc aagagattat aaaacaataa attctaaagt tttagaagtg atcataatca 5760
aatattaccc tctaatgaaa atattccaaa gttgagctac agaaatttca acataagata 5820
attttagctg taacaatgta atttgttgtc tattttcttt tgagatacag ttttttctgt 5880
ctagctttgg ctgtcctgga ccttgctctg tagaccaggt tggtcttgaa ctcagagatc 5940
tgcttgcctc tgccttgcaa gtgctaggat taaaagcatg tgccaccact gcctggctac 6000
aatctatgtt ttataagaga ttataaagct ctggctttgt gacattaatc tttcagataa 6060
taagtctttt ggattgtgtc tggagaacat acagactgtg agcagatgtt cagaggtata 6120
tttgcttagg ggtgaattca atctgcagca ataattatga gcagaattac tgacacttcc 6180
attttataca ttctacttgc tgatctatga aacatagata agcatgcagg cattcatcat 6240
agttttcttt atctggaaaa acattaaata tgaaagaagc actttattaa tacagtttag 6300
atgtgttttg ccatctttta atttcttaag aaatactaag ctgatgcaga gtgaagagtg 6360
tgtgaaaagc agtggtgcag cttggcttga actcgttctc cagcttggga tcgacctgca 6420
ggcatgcttc catgccaagg cccacactga aatgctcaaa tgggagacaa agagattaag 6480
ctcttatgta aaatttgctg ttttacataa ctttaatgaa tggacaaagt cttgtgcatg 6540
ggggtggggg tggggttaga ggggaacagc tccagatggc aaacatacgc aagggattta 6600
gtcaaacaac tttttggcaa agatggtatg attttgtaat ggggtaggaa ccaatgaaat 6660
gcgaggtaag tatggttaat gatctacagt tattggttaa agaagtatat tagagcgagt 6720
ctttctgcac acagatcacc tttcctatca accccgggat ccaccatgtc tagactggac 6780
aagagcaaag tcataaacgg cgctctggaa ttactcaatg gagtcggtat cgaaggcctg 6840
acgacaagga aactcgctca aaagctggga gttgagcagc ctaccctgta ctggcacgtg 6900
aagaacaagc gggccctgct cgatgccctg ccaatcgaga tgctggacag gcatcatacc 6960
cacttctgcc ccctggaagg cgagtcatgg caagactttc tgcggaacaa cgccaagtca 7020
ttccgctgtg ctctcctctc acatcgcgac ggggctaaag tgcatctcgg cacccgccca 7080
acagagaaac agtacgaaac cctggaaaat cagctcgcgt tcctgtgtca gcaaggcttc 7140
tccctggaga acgcactgta cgctctgtcc gccgtgggcc actttacact gggctgcgta 7200
ttggaggaac aggagcatca agtagcaaaa gaggaaagag agacacctac caccgattct 7260
atgcccccac ttctgagaca agcaattgag ctgttcgacc ggcagggagc cgaacctgcc 7320
ttccttttcg gcctggaact aatcatatgt ggcctggaga aacagctaaa gtgcgaaagc 7380
ggcgggccgg ccgacgccct tgacgatttt gacttagaca tgctcccagc cgatgccctt 7440
gacgactttg accttgatat gctgcctgct gacgctcttg acgattttga ccttgacatg 7500
ctccccgggt aactagaatt ccgcccctct ccctcccccc cccctaacgt tactggccga 7560
agccgcttgg aataaggccg gtgtgcgttt gtctatatgt tattttccac catattgccg 7620
tcttttggca atgtgagggc ccggaaacct ggccctgtct tcttgacgag cattcctagg 7680
cgtcgaggga cctaataact tcgtatagca tacattatac gaagttatac atgtttaagg 7740
gttccggttc cactaggtac aattcgatat caagcttatc gataatcaac ctctggatta 7800
caaaatttgt gaaagattga ctggtattct taactatgtt gctcctttta cgctatgtgg 7860
atacgctgct ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc 7920
ctccttgtat aaatcctggt tgctgtctct ttatgaggag ttgtggcccg ttgtcaggca 7980
acgtggcgtg gtgtgcactg tgtttgctga cgcaaccccc actggttggg gcattgccac 8040
cacctgtcag ctcctttccg ggactttcgc tttccccctc cctattgcca cggcggaact 8100
catcgccgcc tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc 8160
cgtggtgttg tcggggaaat catcgtcctt tccttggctg ctcgcctgtg ttgccacctg 8220
gattctgcgc gggacgtcct tctgctacgt cccttcggcc ctcaatccag cggaccttcc 8280
ttcccgcggc ctgctgccgg ctctgcggcc tcttccgcgt cttcgccttc gccctcagac 8340
gagtcggatc tccctttggg ccgcctcccc gcatcgatac cgtcgacctc gatcgagacc 8400
tagaaaaaca tggagcaatc acaagtagca atacagcagc taccaatgct gattgtgcct 8460
ggctagaagc acaagaggag gaggaggtgg gttttccagt cacacctcag gtacctttaa 8520
gaccaatgac ttacaaggca gctgtagatc ttagccactt tttaaaagaa aaggggggac 8580
tggaagggct aattcactcc caacgaagac aagatatcct tgatctgtgg atctaccaca 8640
cacaaggcta cttccctgat tggcagaact acacaccagg gccagggatc agatatccac 8700
tgacctttgg atggtgctac aagctagtac cagttgagca agagaaggta gaagaagcca 8760
atgaaggaga gaacacccgc ttgttacacc ctgtgagcct gcatgggatg gatgacccgg 8820
agagagaagt attagagtgg aggtttgaca gccgcctagc atttcatcac atggcccgag 8880
agctgcatcc ggactgtact gggtctctct ggttagacca gatctgagcc tgggagctct 8940
ctggctaact agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag cttgccttga gtgcttcaag 9000
tagtgtgtgc ccgtctgttg tgtgactctg gtaactagag atccctcaga cccttttagt 9060
cagtgtggaa aatctctagc agcatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta 9120
aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa 9180
atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc 9240
cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt 9300
ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag ctcacgctgt aggtatctca 9360
gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg 9420
accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat 9480
cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta 9540
cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aagaacagta tttggtatct 9600
gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 9660
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 9720
aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa 9780
actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt 9840
taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca 9900
gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 9960
tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc 10020
ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa 10080
accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc 10140
agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca 10200
acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat 10260
tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag 10320
cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac 10380
tcatggttat ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt 10440
ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt 10500
gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc 10560
tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat 10620
ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca 10680
gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga 10740
cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg 10800
gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg 10860
ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac ctgac 10895
<210> 8
<211> 2344
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 白蛋白启动子PALb编码区
<400> 8
tctagcttcc ttagcatgac gttccacttt tttctaaggt ggagcttact tctttgattt 60
gatcttttgt gaaacttttg gaaattaccc atcttcctaa gcttctgctt ctctcagttt 120
tctgcttgct cattccactt ttccagctga ccctgccccc taccaacatt gctccacaag 180
cacaaattca tccagagaaa ataaattcta agttttatag ttgtttggat cgcataggta 240
gctaaagagg tggcaaccca cacatcctta ggcatgagct tgattttttt tgatttagaa 300
ccttcccctc tctgttccta gactacacta cacattctgc aagcatagca cagagcaatg 360
ttctacttta attactttca ttttcttgta tcctcacagc ctagaaaata acctgcgtta 420
cagcatccac tcagtatccc ttgagcatga ggtgacacta cttaacatag ggacgagatg 480
gtactttgtg tctcctgctc tgtcagcagg gcactgtact tgctgatacc agggaatgtt 540
tgttcttaaa taccatcatt ccggacgtgt ttgccttggc cagttttcca tgtacatgca 600
gaaagaagtt tggactgatc aatacagtcc tctgccttta aagcaatagg aaaaggccaa 660
cttgtctacg tttagtatgt ggctgtagaa agggtataga tataaaaatt aaaactaatg 720
aaatggcagt cttacacatt tttggcagct tatttaaagt cttggtgtta agtacgctgg 780
agctgtcaca gctaccaatc aggcatgtct gggaatgagt acacggggac cataagttac 840
tgacattcgt ttcccattcc atttgaatac acacttttgt catggtattg cttgctgaaa 900
ttgttttgca aaaaaaaccc cttcaaattc atatatatta ttttaataaa tgaattttaa 960
tttatctcaa tgttataaaa aagtcaattt taataattag gtacttatat acccaataat 1020
atctaacaat catttttaaa catttgttta ttgagcttat tatggatgaa tctatctcta 1080
tatactctat atactctaaa aaagaagaaa gaccatagac aatcatctat ttgatatgtg 1140
taaagtttac atgtgagtag acatcagatg ctccatttct cactgtaata ccatttatag 1200
ttacttgcaa aactaactgg aattctagga cttaaatatt ttaagtttta gctgggtgac 1260
tggttggaaa attttaggta agtactgaaa ccaagagatt ataaaacaat aaattctaaa 1320
gttttagaag tgatcataat caaatattac cctctaatga aaatattcca aagttgagct 1380
acagaaattt caacataaga taattttagc tgtaacaatg taatttgttg tctattttct 1440
tttgagatac agttttttct gtctagcttt ggctgtcctg gaccttgctc tgtagaccag 1500
gttggtcttg aactcagaga tctgcttgcc tctgccttgc aagtgctagg attaaaagca 1560
tgtgccacca ctgcctggct acaatctatg ttttataaga gattataaag ctctggcttt 1620
gtgacattaa tctttcagat aataagtctt ttggattgtg tctggagaac atacagactg 1680
tgagcagatg ttcagaggta tatttgctta ggggtgaatt caatctgcag caataattat 1740
gagcagaatt actgacactt ccattttata cattctactt gctgatctat gaaacataga 1800
taagcatgca ggcattcatc atagttttct ttatctggaa aaacattaaa tatgaaagaa 1860
gcactttatt aatacagttt agatgtgttt tgccatcttt taatttctta agaaatacta 1920
agctgatgca gagtgaagag tgtgtgaaaa gcagtggtgc agcttggctt gaactcgttc 1980
tccagcttgg gatcgacctg caggcatgct tccatgccaa ggcccacact gaaatgctca 2040
aatgggagac aaagagatta agctcttatg taaaatttgc tgttttacat aactttaatg 2100
aatggacaaa gtcttgtgca tgggggtggg ggtggggtta gaggggaaca gctccagatg 2160
gcaaacatac gcaagggatt tagtcaaaca actttttggc aaagatggta tgattttgta 2220
atggggtagg aaccaatgaa atgcgaggta agtatggtta atgatctaca gttattggtt 2280
aaagaagtat attagagcga gtctttctgc acacagatca cctttcctat caaccccggg 2340
atcc 2344
<210> 9
<211> 1302
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA编码区
<400> 9
atgaaagtct ggctggcgag cctgttcctc tgcgccttgg tggtgaaaaa ctctgaaggt 60
ggcagtgtac ttggagctcc tgatgaatca aactgtggct gtcagaacgg aggtgtatgc 120
gtgtcctaca agtacttctc cagaattcgc cgatgcagct gcccaaggaa attccagggg 180
gagcactgtg agatagatgc atcaaaaacc tgctatcatg gaaatggtga ctcttaccga 240
ggaaaggcca acactgatac caaaggtcgg ccctgcctgg cctggaatgc gcctgctgtc 300
cttcagaaac cctacaatgc ccacagacct gatgctatta gcctaggcct ggggaaacac 360
aattactgca ggaaccctga caaccagaag cgaccctggt gctatgtgca gattggccta 420
aggcagtttg tccaagaatg catggtgcat gactgctctc ttagcaaaaa gccttcttcg 480
tctgtagacc aacaaggctt ccagtgtggc cagaaggctc taaggccccg ctttaagatt 540
gttgggggag aattcactga ggtggagaac cagccctggt tcgcagccat ctaccagaag 600
aacaagggag gaagtcctcc ctcctttaaa tgtggtggga gtctcatcag tccttgctgg 660
gtggccagtg ccgcacactg cttcattcaa ctcccaaaga aggaaaacta cgttgtctac 720
ctgggtcagt cgaaggagag ctcctataat cctggagaga tgaagtttga ggtggagcag 780
ctcatcttgc acgaatacta cagggaagac agcctggcct accataatga tattgccttg 840
ctgaagatac gtaccagcac gggccaatgt gcacagccat ccaggtccat acagaccatc 900
tgcctgcccc caaggtttac tgatgctccg tttggttcag actgtgagat cactggcttt 960
ggaaaagagt ctgaaagtga ctatctctat ccaaagaacc tgaaaatgtc cgtcgtaaag 1020
cttgtttctc atgaacagtg tatgcagccc cactactatg gctctgaaat taattataaa 1080
atgctgtgtg ctgcggaccc agagtggaaa acagattcct gcaagggcga ttctggagga 1140
ccgcttatct gtaacatcga aggccgccca actctgagtg ggattgtgag ctggggccga 1200
ggatgtgcag agaaaaacaa gcccggtgtc tacacgaggg tctcacactt cctggactgg 1260
attcaatccc acattggaga agagaaaggt ctggccttct ga 1302
<210> 10
<211> 747
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2编码区
<400> 10
atgtctagac tggacaagag caaagtcata aacggcgctc tggaattact caatggagtc 61
ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 121
ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 181
gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 241
aacaacgcca agtcattccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 301
ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 361
tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 421
acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 481
cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 541
ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 601
ctaaagtgcg aaagcggcgg gccggccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 661
ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat 721
tttgaccttg acatgctccc cgggtaa 747
<210> 11
<211> 319
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子PTight编码区
<400> 11
tttactccct atcagtgata gagaacgtat gtcgagttta ctccctatca gtgatagaga 60
acgatgtcga gtttactccc tatcagtgat agagaacgta tgtcgagttt actccctatc 120
agtgatagag aacgtatgtc gagtttactc cctatcagtg atagagaacg tatgtcgagt 180
ttatccctat cagtgataga gaacgtatgt cgagtttact ccctatcagt gatagagaac 240
gtatgtcgag gtaggcgtgt acggtgggag gcctatataa gcagagctcg tttagtgaac 300
cgtcagatcg cctggagaa 319
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> uPA基因荧光定量上游引物uPAF
<400> 12
tgaagtttga ggtggagcag
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> uPA基因荧光定量下游引物uPAR
<400> 13
caggcagatg gtctgtatgg 20
<210> 14
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH基因荧光定量上游引物
<400> 14
acaactttgg cattgtggaa 21
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH基因荧光定量下游引物
<400> 15
gatgcaggga tgatgttctg 20
Claims (10)
1.PAlb-uPA慢病毒载体,其特征在于:所述PAlb-uPA慢病毒载体含有白蛋白启动子PAlb、尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA、白蛋白启动子PAlb启动的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2和启动所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA表达的PTight启动子,所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2调控PTight启动子;
所述白蛋白启动子PAlb的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示;所述尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示;编码所述四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的核酸序列如SEQ ID NO.10所示;PTight启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
2.根据权利要求1所述的PAlb-uPA慢病毒载体,其特征在于:所述PAlb-uPA慢病毒载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
3.权利要求1或2所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
a.从小鼠肾脏克隆尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA,并将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA连入pLVX Tight Puro载体的PTight 启动子下游,得JGY-PLV-2载体;
b. 克隆白蛋白启动子PAlb,并将克隆的白蛋白启动子PAlb连入pLVX-Tet-On载体的四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的上游,得JGY-PLV-1载体;
c.从步骤b所得JGY-PLV-1载体上切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用子rtTA/rtTA2S-M2的片段,然后连入pLKO.1克隆载体,得JGY-PLV-A载体;
d.从步骤c所得JGY-PLV-A载体切下含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2的片段,然后连入步骤a所得JGY-PLV-2载体的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA下游,得PAlb-uPA慢病毒载体。
4.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤a中,将克隆的尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA用XbaI和BamHI酶切,连入同样经XbaI和BamHI酶切的pLVX Tight Puro载体,得JGY-PLV-2载体。
5.根据权利要求4所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤a中,尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA的克隆,具体为:以C57小鼠肾脏第一链cDNA为模板,以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示核苷酸序列为引物,进行第一次PCR扩增;再以第一次PCR产物为模板,以SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示核苷酸序列为引物进行第二次PCR扩增,得尿激酶型纤溶酶原激活剂基因uPA。
6.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤b中,将克隆的白蛋白启动子PAlb用ClaI和BamHI酶切,连入同样经ClaI和BamHI酶切的pLVX-Tet-On载体,得JGY-PLV-1载体。
7.根据权利要求6所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤b中,所述白蛋白启动子PAlb的克隆,具体为:以含白蛋白启动子PAlb的质粒为模板,以SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示序列为引物进行PCR扩增,得白蛋白启动子PAlb。
8.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤c为将步骤b所得JGY-PLV-1载体用AgeI和AvrII酶切,回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2片段,然后连入同样经AgeI和AvrII酶切的pLKO.1克隆载体,得JGY-PLV-A载体。
9.根据权利要求3所述PAlb-uPA慢病毒载体的制备方法,其特征在于:所述步骤d为将步骤a所得JGY-PLV-A载体用AgeI和XhoI酶切并回收含白蛋白启动子PAlb和四环素反式作用因子rtTA/rtTA2S-M2片段,然后连入同样经AgeI和XhoI酶切的JGY-PLV-2载体中。
10.权利要求1所述PAlb-uPA慢病毒载体在制备尿激酶型纤溶蛋白酶小鼠肝损伤模型中的应用。
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