CN102703474A

CN102703474A - 一种新布尼亚病毒np蛋白的编码序列及其应用

Info

Publication number: CN102703474A
Application number: CN2012101708102A
Authority: CN
Inventors: 陈金中; 沈琦
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2012-10-03

Abstract

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种全合成经密码子优化的新布尼亚病毒NP蛋白编码序列及其应用。新布尼亚病毒NP蛋白编码序列如SEQIDNo.1所示。将编码序列SEQIDNo.1克隆到pQE30表达质粒，使用EColi.M15表达重组蛋白，以Hitrap纯化重组新布尼亚病毒NP蛋白。本发明的优点在于通过对NP蛋白编码按EColi.密码子偏好重新设计，人工合成，提高了EColi.表达新布尼亚病毒NP蛋白的效率，降低了制备重组新布尼亚病毒NP蛋白的成本，提高了产品的纯度。

Description

一种新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列及其应用

技术领域

本发明属于生物制品技术领域，具体涉及一种新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列及其应用。

背景技术

新布尼亚病毒（Novel Bunyavirus，SFTS Bunyavirus），是发热伴血小板减少综合症（Fever with Throbocytopenia Associated Syndrome， SFTS）的病原，为布尼亚病毒科白蛉热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现。患者出现以发热、血小板减少、多器官功能紊乱等为特征的严重急性传染病。到目前为止，全国已有河南、江苏、湖北和辽宁等16个省发现1000多病例，造成50余人死亡。国家疾控中心已经成功的分离到该病病毒，并对其进行了病原学和临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，病毒蛋白已经鉴定，nucleocapsid protein （NP）蛋白约占病毒总蛋白90%，为鉴定病原最敏感的病毒抗原。但是研究发现从病毒直接分离NP蛋白成本高，且有潜在风险。使用源于病毒的编码序列直接构建大肠杆菌重组蛋白表达系统表达效率低下，难以低成本获得高纯度重组NP蛋白。

发明内容

本发明的目的在于提供一种依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列及其应用。

本发明提出的依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列，为SEQ ID No.1所示。

本发明提出的所述新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列的应用，是将上述新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列克隆到pQE表达质粒（Qiagen，德国），转化E Coli. M15菌株（Qiagen，德国），常规培养，诱导表达，Hitrap（Amersham Pharmacia，美国）纯化，即可以得到高产量、高纯度新布亚病毒重组NP蛋白。

本发明涉及一种依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列以及应用，具体就是制备重组新布尼亚病毒NP蛋白的方法，其步骤为：

1) 依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计以及合成的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列；

2) 密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌表达质粒pQE30，制备pQE30-rNP重组质粒，其DNA为SEQ ID No.2所示；编码的重组NP蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；

3) pQE30-rNP重组质粒转化 E Coli. M15菌；

4)常规培养诱导重组蛋白表达；以及

5)使用Hitrap纯化重组新布尼亚病毒NP蛋白。

本发明的优点在于使用依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列来制备表达质粒，进一步进行诱导表达纯化来制备重组新布尼亚病毒NP蛋白。与传统病毒源性蛋白制备比较，后续纯化制备工艺简单，有更大的安全性；与使用病毒源性编码序列比较，在细菌重组蛋白表达水平高，纯化效率高。密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列生产重组蛋白成本较低，更容易工业化生产。

附图说明

图1：合成密码子优化NP蛋白编码序列测序图。

图2：pQE30-rNP重组质粒测序图。其中，划线部分为pQE30质粒骨架序列，其他部分为密码子优化的NP蛋白编码序列；开放读框为796到23，其中796-760位pQE30骨架编码，其余部分插入的合成密码子优化NP蛋白编码序列。

图3：使用依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列表达纯化新布尼亚病毒NP蛋白的SDS-PAGE电泳图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。本实施例仅仅用于对本发明的说明，不构成对本发明的限制。

实施例1：依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列制备

依据Genbank公布的新布尼亚病毒NP蛋白序列（Genbank登录号：ADZ04472），按照通用遗传密码表和大肠杆菌密码子偏好合成新布尼亚病毒NP蛋白编码序列，其DNA如SEQ ID No.1所示，（图1）。

采用常规克隆方法（分子克隆3），将合成片段插入 pQE30表达质粒Bam HI 位点和Sal I位点之间，构建pQE30-rNP重组质粒，测序正确后作为重组NP蛋白表达质粒（图2）。重组NP蛋白表达质粒pQE30-rNP 的DNA序列为SEQ ID No.2所示。对应编码重组NP蛋白的编码序列位于151到888 nt，编码蛋白质氨基酸序列为SEQ ID No.3所示。

实施例2：重组新布尼亚病毒NP蛋白表达纯化

取测序正确的pQE30-rNP重组质粒常规转化E Coli. M15，选取一个克隆接种到3 mL含ampillin 50 ug/mL及kanamycin 25 ug/mL的LB培养基中，37℃ 250 rpm过夜培养。取培养物3 mL到30 mL相同培养基，37℃ 250 rpm培养约3 h至OD600=0.6，取出1 mL培养物到一1.5 mL的EP管并置于冰上，加2 M的IPTG 9 uL，继续培养并每小时取出1 mL培养物，至第5 h，其余的培养物转到50 mL离心管。4℃ 4000 rpm 5 min，去上清，1.5 mL EP管中的细菌各加H2O 50 uL及2倍蛋白质电泳上样缓冲液50 uL，100 ℃ 5 min，每管加样10 uL作SDS-PAGE，常规Coomassie brilliant blue染色判断是否表达。50 mL离心管中的细菌加1倍的磷酸缓冲液2 mL，超声破菌，15000 rpm离心25 min，上清移到另一个离心管，沉淀中加水2 mL并混匀。用前述的方法作SDS-PAGE判断表达产物是在上清还是在包涵体。

重组新布尼亚病毒NP蛋白纯化：1000 mL诱导表达重组新布尼亚病毒NP蛋白的细菌，4000 rpm离心5 min，去上清，加1倍磷酸缓冲液20 mL，混匀，15瓦超声破菌1 min ，10次，15000 rpm离心25 min，上清通过0.4 μm的复合纤维膜，滤过液通过HIS-TRAP柱，以含20、40、80、160 mM咪唑的1倍磷酸缓冲液逐级洗脱，每个浓度4 mL，收集所有液体，作SDS-PAGE确定洗脱条件并保存含融合蛋白的洗脱液供进一步研究。如图3所示: 表达重组新布尼亚病毒NP蛋白蛋白的细菌有一个明显的分子量约为30 KDa表达条带，纯化时在160 mM米唑浓度下可以高纯度洗脱，基因工程人类重组新布尼亚病毒NP蛋白蛋白分子量约为30 KDa。

<110> 复旦大学

<120> 一种新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列及其应用

<130> 001

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213>

<400> 1

ggatccatgt ccgagtggtc ccgcattgct gttgaattcg gtgagcagca gctgaacctg 60

actgaactgg aagacttcgc gcgtgaactg gcttacgaag gcctggaccc ggctctgatc 120

atcaagaaac tgaaagaaac gggcggcgac gactgggtga aagacaccaa atttatcatt 180

gttttcgcac tgacccgcgg caacaaaatc gtgaaagcgt ctggcaaaat gtccaactct 240

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gcagctgcgt atcgcaatct gtaagtcgac 750

<210> 2

<211> 4177

<212> DNA

<213>

<400> 2

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cctagccgtg ctgccgaagt ggcggcagct gcgtatcgca atctgtaagt cgacctgcag 900

ccaagcttaa ttagctgagc ttggactcct gttgatagat ccagtaatga cctcagaact 960

ccatctggat ttgttcagaa cgctcggttg ccgccgggcg ttttttattg gtgagaatcc 1020

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gatataccac cgttgatata tcccaatggc atcgtaaaga acattttgag gcatttcagt 1140

cagttgctca atgtacctat aaccagaccg ttcagctgga tattacggcc tttttaaaga 1200

ccgtaaagaa aaataagcac aagttttatc cggcctttat tcacattctt gcccgcctga 1260

tgaatgctca tccggaattt cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata 1320

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gtgaatacca cgacgatttc cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt 1440

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agtaggacaa atccgccctc tagagctgcc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc 1920

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taaaaatagg cgtatcacga ggccctttcg tcttcac 4177

<210> 3

<211> 257

<212> PRT

<213>

<400> 3

Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Ser Met Ser Glu Trp

1 5 10 15

Ser Arg Ile Ala Val Glu Phe Gly Glu Gln Gln Leu Asn Leu Thr Glu

20 25 30

Leu Glu Asp Phe Ala Arg Glu Leu Ala Tyr Glu Gly Leu Asp Pro Ala

35 40 45

Leu Ile Ile Lys Lys Leu Lys Glu Thr Gly Gly Asp Asp Trp Val Lys

50 55 60

Asp Thr Lys Phe Ile Ile Val Phe Ala Leu Thr Arg Gly Asn Lys Ile

65 70 75 80

Val Lys Ala Ser Gly Lys Met Ser Asn Ser Gly Ser Lys Arg Leu Met

85 90 95

Ala Leu Gln Glu Lys Tyr Gly Leu Val Glu Arg Ala Glu Thr Arg Leu

100 105 110

Ser Ile Thr Pro Val Arg Val Ala Gln Ser Leu Pro Thr Trp Thr Cys

115 120 125

Ala Ala Ala Ala Ala Leu Lys Glu Tyr Leu Pro Val Gly Pro Ala Val

130 135 140

Met Asn Leu Lys Val Glu Asn Tyr Pro Pro Glu Met Met Cys Met Ala

145 150 155 160

Phe Gly Ser Leu Ile Pro Thr Ala Gly Val Ser Glu Ala Thr Thr Lys

165 170 175

Thr Leu Met Glu Ala Tyr Ser Leu Trp Gln Asp Ala Phe Thr Lys Thr

180 185 190

Ile Asn Val Lys Met Arg Gly Ala Ser Lys Thr Glu Val Tyr Asn Ser

195 200 205

Phe Arg Asp Pro Leu His Ala Ala Val Asn Ser Val Phe Phe Pro Asn

210 215 220

Asp Val Arg Val Lys Trp Leu Lys Ala Lys Gly Ile Leu Gly Pro Asp

225 230 235 240

Gly Val Pro Ser Arg Ala Ala Glu Val Ala Ala Ala Ala Tyr Arg Asn

245 250 255

Leu

Claims

1. 一种新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列，其特征在于依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计，其DNA序列为SEQ ID No.1所示。

2. 一种重组新布尼亚病毒NP蛋白的制备方法，其特征在于具体步骤为：

1) 依据E Coli.密码子偏好作密码子优化设计以及合成新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列，其DNA为SEQ ID No.1所示；

2) 将密码子优化设计的新布尼亚病毒NP蛋白的编码序列克隆到大肠杆菌表达质粒pQE30，制备pQE30-rNP重组质粒，其DNA为SEQ ID No.2所示；编码的重组NP蛋白氨基酸序列为SEQ ID No.3所示；

3) pQE30-rNP重组质粒转化 E Coli. M15菌；

4)常规培养诱导重组蛋白表达；以及

5)使用Hitrap纯化重组新布尼亚病毒NP蛋白。