CN101481703A - 禽源启动子表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。该禽源启动子表达载体是一种环状载体，包含原核复制起点、一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号；所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第1－607位；所述连接片段含有EcoRV识别序列。使用本发明的pAPP－Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。将在转基因动物研究中发挥重要作用。

Description

禽源启动子表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

真核表达载体是分子生物学研究中最常用的表达载体之一。目前最常用的是哺乳动物源启动子的蛋白表达载体，可以在哺乳动物细胞高效表达蛋白。我国是养禽业大国，养禽业的发展也促进了对禽类生产、疾病预防与控制等领域的研究，尤其是抗病育种逐渐被提到日程上来。由于目前尚缺少禽源启动子的蛋白表达载体，难以在禽类体内或细胞中进行高效表达外源基因。并且，目前使用的真核表达蛋白载体构建表达外源基因的载体的过程是通过传统的连接方法连接的，通过T₄DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐，成本高，连接效率较低等问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种禽源启动子表达载体及其构建方法与应用。

本发明所提供的禽源启动子表达载体，命名为pAPP-Vector，是一种环状载体，包含原核复制起点、一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号；所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述连接片段含有EcoRV识别序列。

其中，所述真核复制起点可为任何现已知的真核生物进行DNA复制的起始点，具体可为SV40病毒复制起点。所述多聚腺苷酸加尾信号可为具有终止转录作用的所有DNA片段，具体可为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。所述原核复制起始位点可为任何现已知的原核生物进行DNA复制的起始点，具体可为大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点。

pAPP-Vector的核苷酸序列具体可为序列表中的序列1。

用EcoRV酶切所述禽源启动子表达载体得到的线性载体也属于本发明的保护范围。

本发明的另一个目的是提供所述禽源启动子表达载体的构建方法。

本发明所提供的所述禽源启动子表达载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体pA；

4)以重组载体pA为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体pAP-SV40；

7)以REV病毒DNA为模板，用如下引物：5’GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC

3’和5’CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3’进行PCR扩增，得到片段F；

8)以重组载体pAP-SV40为模板，用如下引物：5’TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3’和5’GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3’进行PCR扩增，得到片段E；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，得到所述的载体。

本发明所述禽源启动子表达载体可作为出发载体，构建在禽类细胞或哺乳动物细胞中表达蛋白的重组表达载体。

以本发明的pAPP-Vector为出发载体构建的表达绿色荧光蛋白的重组表达载体，可以在禽类细胞或哺乳动物细胞中高效表达绿色荧光蛋白。以pAPP-Vector为出发载体利用同源重组构建重组表达载体，避免了传统的酶切，连接等环节，整个构建过程中不使用内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本发明的pAPP-Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。将在转基因动物研究中发挥重要作用。

附图说明

图1为pAPP-Vector的结构示意图。

图2为荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达结果。

具体实施方式

下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。

实施例1、pAPP-Vector的构建

1)pA的构建

设计引物pA Vector1上游和pA Vector1下游、pA Vector2上游和pA Vector2下游，引物pA Vector1上游和pA Vector1下游、pA Vector2上游和pA Vector2下游的序列如下：

pA Vector1上游：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3’；

pA Vector1下游：5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3’。

pA Vector2上游：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3’(划线部分为EcoR V酶识别位点)；

pA Vector2下游：5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3’。

以pEGFP-N1(Invitrogen)质粒为模板，用引物pA Vector1上游和pA Vector1下游PCR扩增片段A；以pCDNA3.0质粒为模板，用引物pA Vector2上游和pA Vector2下游PCR扩增片段B。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pA。

2)pAP-Vector的构建

设计引物SV(40)上游和SV(40)下游、pAP Vector(1)上游和pAP Vector(1)下游，序列如下：

SV(40)上游：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’；

SV(40)下游：5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’。

pAP Vector(1)上游：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’；

pAP Vector(1)下游：5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物SV(40)上游和SV(40)下游PCR扩增片段C；以pA质粒为模板，用引物pAP Vector(1)上游和pAP Vector(1)下游PCR扩增片段D。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pAP-SV40。

3)pAPP-Vector的构建

设计引物PAPP上游和PAPP下游、LTR上游和LTR下游，引物序列如下：

pAPP上游：5’TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3’；

pAPP下游：5’GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3’。

LTR上游：5’GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3’；

LTR下游：5’CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3’。

以pAP-SV40质粒为模板，用引物pAPP上游和pAPP下游PCR扩增片段E；以REV病毒(Reticuloendotheliosis.In：Saif，Y.M.，Barnes，J.，Glisson，J.，Macdougal，L.，Swayne，D.(Eds.)，Diseases of Poultry，11th ed.Iowa StatePress，Ames，pp.517-535.)(中国农业大学)的DNA为模板，用引物LTR上游和LTR下游PCR扩增片段F。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段E和F后混匀，片段E和F质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该载体命名为pAPP-vector，pAPP-vector图谱如图1所示。

挑取单克隆提取质粒，将pAPP-vector测序，测序结果表明，pAPP-vector的核苷酸序列如序列表中的序列1，序列1自5′末端第1-607位为LTR启动子，自5′末端第692-698位为EcoR V酶的识别序列，自5′末端第670-1023位为BGH PloyA，，自5′末端第1024-1205位为SV40 Origin，自5′末端第1224-1843位为大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点，自5′末端第1844-3001位为氨苄青霉素抗性基因。序列1的自5′端第695-710位的核苷酸序列和序列1的自5′端第711-726位的核苷酸序列为能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。

实施例2、pAPP-vector表达蛋白的能力

1)表达绿色荧光蛋白的pAPP-EGFP-Vector的构建

设计引物EGFP上游和EGFP下游，引物序列如下：

EGFP上游：GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG；

EGFP下游：ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。

引物中GGAATTCTGCAGAT和ATGCATGCTCGAGGAT序列为能与序列1的自5′端第695-710位的核苷酸序列和序列1的自5′端第711-726位的核苷酸序列发生同源重组的序列。

以pEGFP-N1为模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR扩增EGFP基因片段。

反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

pAPP-Vector用EcorV内切酶酶切线性化，回收线性化的pAPP-Vector。

酶切体系如下：

10×D buffer 10μl，BSA 1μl，EcoR V 2μl(20U PROMEGA公司)，pAPP-Vector50μl，补水至100μl，37℃酶切过夜。

酶切产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收试剂盒回收目的片段。

50μl感受态细胞中加入线性化的pAPP-Vector和上述PCR扩增的EGFP基因片段后混匀，线性化的pAPP-Vector和EGFP基因片段质量比为100ng：500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pAPP-EGFP-Vector。

2)绿色荧光蛋白的的检测

取10ul lipofectamine 2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1；将5ugpAPP-EGFP-Vector质粒加入到250ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2；将溶液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液3。

将鸡胚成纤维细胞(CEF细胞)(北京实验动物研究中心)和293T细胞分别置于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60％时将细胞用PBS洗涤两次，然后分别加入溶液3，37℃孵育5个小时，分别吸出溶液3，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

以转染pAPP-Vector质粒的CEF细胞作为对照。

荧光显微镜结果如图2所示，表明pAPP-EGFP-Vector转染后24小时的CEF细胞和293T细胞有较强的荧光信号，而对照没有荧光，说明pAPP-EGFP-Vector质粒可以在CEF细胞与293T表达绿色荧光蛋白。

图2中，A为pAPP-EGFP-Vector转染的293T细胞，B为pAPP-EGFP-Vector转染的CEF细胞，C为对照。

上述实验结果说明，pAPP-Vector载体可作为出发载体，构建在禽类细胞或哺乳动物细胞中表达蛋白的重组表达载体。

<110>中国农业大学

<120>禽源启动子表达载体及其构建方法与应用

<130>CGGNARW92030

<160>1

<210>1

<211>3060

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>

<401>

aatgtgggag ggagctccgg gggggggaat agcgctggct cgctaactgc cgtattagct 60

tctgtaatca tgcttgcttg ccttagccgc cattgtactt gatatatttc gctgatatca 120

tttctcggaa tcagcatcat ttctcggaat cggcatcaag agcaggctca tagaccataa 180

aaggaaatgt ttgttgaagg caagcatcag gccacttgcg ccatccaatc acgagcaaac 240

acgagatcga actatcatac tgagccaatg gttgtaaagg gcagatgcta tcctccaatg 300

agggaaaatg tcatgcaaca tcctgtcctg taagcggcta tataagccag gtgcacctct 360

tgctcggggt cgccgtccta cacattgttg tgacgtgcgg cccagattcg aatctgtaat 420

aaaagttttc ttttcttcta tatcctcaga ttggcagtga gaggagattt tgttcgtggt 480

gtaggctggc ctactgggtg gggttgggat ccggactgaa tccgtagaat ttctgtacaa 540

catttggggg ctcgtccggg attcctcccc atcggcagag gtgcctactg tttcttcgaa 600

ctccggcaat acgactcact atagggagac ccaagcttgg taccgagctc ggatccacta 660

gtaacggccg ccagtgtgct ggaattctgc agatatcctc gagcatgcat ctagagggcc 720

ctattctata gtgtcaccta aatgctagag ctcgctgatc agcctcgact gtgccttcta 780

gttgccagcc atctgttgtt tgcccctccc ccgtgccttc cttgaccctg gaaggtgcca 840

ctcccactgt cctttcctaa taaaatgagg aaattgcatc gcattgtctg agtaggtgtc 900

attctattct ggggggtggg gtggggcagg acagcaaggg ggaggattgg gaagacaata 960

gcaggcatgc tggggatgcg gtgggctcta tggcttctga ggcggaaaga accagctggg 1020

gctctagggg gtatccccac gcgccctgta gcggcgatcc cgcccctaac tccgcccagt 1080

tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 1140

gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 1200

tgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc 1260

gttgctggcg tttttccata ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc 1320

aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact ataaagatac caggcgtttc cccctggaag 1380

ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct 1440

cccttcggga agcgtggcgc tttctcaatg ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta 1500

ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc 1560

cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa cccggtaaga cacgacttat cgccactggc 1620

agcagccact ggtaacagga ttagcagagc gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt 1680

gaagtggtgg cctaactacg gctacactag aaggacagta tttggtatct gcgctctgct 1740

gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc 1800

tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca 1860

agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta 1920

agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa 1980

atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg 2040

cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg 2100

actccccgtc gtgtagataa ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc 2160

aatgataccg cgagacccac gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc 2220

cggaagggcc gagcgcagaa gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa 2280

ttgttgccgg gaagctagag taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc 2340

cattgctaca ggcatcgtgg tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg 2400

ttcccaacga tcaaggcgag ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc 2460

cttcggtcct ccgatcgttg tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat 2520

ggcagcactg cataattctc ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg 2580

tgagtactca accaagtcat tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc 2640

ggcgtcaata cgggataata ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg 2700

aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat 2760

gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg 2820

gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg 2880

ttgaatactc atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct 2940

catgagcgga tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac 3000

atttccccga aaagtgccac ctgacgtcca aaagcctagg cctccaaaaa agcctcctca 3060

Claims (8)

1、一种环状载体，包含原核复制起点、一个真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒；所述外源基因表达盒自上游至下游依次含有LTR启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号；所述LTR启动子的核苷酸序列为序列表中序列1自5′末端第1-607位；所述连接片段含有EcoRV识别序列。

2、根据权利要求1所述的载体，其特征在于：所述真核复制起点为SV40病毒复制起点。

3、根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：所述多聚腺苷酸加尾信号为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。

4、根据权利要求3所述的载体，其特征在于：所述原核复制起始位点为大肠杆菌质粒CoIE1复制起始位点。

5、根据权利要求4所述的载体，其特征在于：所述载体的核苷酸序列为序列表中的序列1。

6、一种线性的载体，是用EcoRV酶切权利要求1至5中任一所述的载体得到的线性载体。

7、权利要求5所述载体的构建方法，包括如下步骤：

1)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG3’和5’GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG3’进行PCR扩增，得到片段A；

2)以pCDNA3.0质粒为模板，用如下引物：5’CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC3’和5’CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT3’进行PCR扩增，得到片段B；

3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体pA；

4)以重组载体pA为模板，用如下引物：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC3’和5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG3’进行PCR扩增，得到片段D；

5)以pEGFP-N1质粒为模板，用如下引物：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC3’或5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’进行PCR扩增，得到片段C；

6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体pAP-SV40；

7)以REV病毒DNA为模板，用如下引物：5’

GGAGTTAGGGGCGGGATAATGTGGGAGGGAGCTC3’和5’

CCTATAGTGAGTCGTATTGCCGGAGTTCGAAGAAA3’进行PCR扩增，得到片段F；

8)以重组载体pAP-SV40为模板，用如下引物：5’

TTTCTTCGAACTCCGGCAATACGACTCACTATAGG3’和5’

GAGCTCCCTCCCACATTATCCCGCCCCTAACTCC3’进行PCR扩增，得到片段E；

9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，得到权利要求5中所述的载体。

8、权利要求1至5中任一所述的载体在禽类细胞或哺乳动物细胞中表达蛋白的应用。

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