CN101948872B - 猪源启动子蛋白表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了猪源启动子蛋白表达载体及其构建方法与应用。本发明表达载体为环状，包含原核复制起点、真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒，所述外源基因表达盒自上游至下游依次由转录启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述转录启动子是MLP6启动子。本发明表达载体可在猪类细胞中高效表达外源蛋白，因含有一个真核复制起点，可在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达水平。本发明利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，比传统的连接过程省略了2-3个步骤。使用本发明载体构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。

Description

猪源启动子蛋白表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种真核表达载体，尤其涉及一种猪源启动子蛋白表达载体及其构建方法，本发明还涉及该猪源启动子蛋白表达载体在猪类细胞中表达外源蛋白的应用，属于真核表达载体的构建领域。

背景技术

我国是养猪业大国，养猪业的发展也促进了对猪类生产、疾病预防与控制等领域的研究，尤其是抗病育种逐渐被提到日程上来。由于目前尚缺少猪源启动子的蛋白表达载体，难以在猪类体内或细胞中进行高效表达其它外源基因。

真核表达载体是分子生物学研究中最常用的表达载体之一。目前使用的真核表达蛋白质粒构建表达外源基因质粒的过程中，是通过传统的连接方法连接的，利用酶切位点，T₄DNA连接酶将载体与目的片段连接成一个完整的质粒。传统的这种酶切的连接方法存在步骤比较烦琐，成本高，连接效率较低等问题，PCR产物与载体都要通过反复的酶切，电泳，回收等步骤，才能进行进一步的连接。这样既耗费时间，而且连接的效率不是很理想，有待改进。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种猪源启动子蛋白表达载体；

本发明的目的之二是提供一种构建上述猪源启动子蛋白表达载体的方法；

本发明的目的之三是将上述猪源启动子蛋白表达载体应用于表达外源蛋白；

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一种猪源启动子蛋白表达载体(pSP-Vector)，其为环状载体，包含原核复制起点、真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒，所述外源基因表达盒自上游至下游依次由一个转录启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述连接片段含有EcoRV识别序列。

其中，所述真核复制起点优选为SV40病毒复制起点。

所述一个转录启动子优选为Myosin light polypeptide 6(MLP6)启动子；

所述多聚腺苷酸加尾信号优选为牛生长激素基因多聚腺苷酸加尾序列。

更优选的，所述猪源启动子蛋白表达载体的碱基为SEQ ID NO：1所示。

本发明还提供了一种线性的猪源启动子蛋白表达载体。

所述线性的载体是用EcoRV酶切猪源启动子蛋白表达载体(pSP-Vector)而得到的线性载体。

本发明的另一个目的是提供一种环状的猪源启动子蛋白表达载体的构建方法。

一种环状的猪源启动子蛋白表达载体(pSP-Vector)的构建方法，包括以下步骤：

(1)以pEGFP-N1质粒为模板，用SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3为引物进行PCR扩增，得到片段A；

(2)以pCDNA3.0质粒为模板，以pCDNA3.0质粒为模板，用SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5为引物进行PCR扩增，得到片段B；

(3)将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，获得重组载体I；

(4)以重组载体I为模板，用SEQ ID NO：6和SEQ ID NO：7为引物进行PCR扩增，得到片段D；

(5)以pEGFP-N1质粒为模板，用SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9为引物进行PCR扩增，得到片段C；

(6)将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，获得重组载体II；

(7)以重组载体II为模板，用SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13为引物进行PCR扩增，得到片段E；

(8)以猪血液cDNA为模板，用SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11为引物进行PCR扩增，得到片段F；

(9)将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，即得。

本发明的猪源启动子蛋白表达载体(pSP-Vector)可以在猪类细胞中高效表达外源蛋白，而且此载体可以利用同源重组构建表达外源基因的重组载体，避免了传统的酶切，连接等环节，可以直接将纯化的PCR产物与线性化的载体混均之后直接转化感受态细胞，然后挑菌鉴定阳性克隆。线性化的质粒末端含有与目的基因片段的PCR产物的末端同源互补的序列，这种序列会使这两个基因片段在感受态细胞中同源重组为一个完整的含有目的基因的质粒。这种质粒在大肠杆菌中可以大量复制，整个构建过程中不使用任何内切酶与连接酶，且比传统的连接过程省略了2-3个步骤，连接的效率也较理想。使用本发明的pSP-Vector构建表达外源基因的重组载体的过程简便、快速、经济、高效，可以快速完成大量外源基因的表达载体的构建。本发明的pSP-Vector含有一个真核复制起点，可以在表达T抗原的细胞中大量增值，从而提高蛋白表达的水平。

附图说明

图1为pSP-Vector图谱。

图2为绿色荧光蛋白的荧光显微镜观察结果(100x)；A为pSP-EGFP质粒转染ST细胞荧光结果B为阴性对照。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1、pSP-Vector的构建

1)pS1的构建

设计引物pS1 Vector1上游和pS1 Vector1下游、pS1 Vector2上游和pS1 Vector2下游，引物pS1 Vector1上游和pS1 Vector1下游、pS1 Vector2上游和pS1 Vector2下游的序列如下：

pS1 Vector1上游：5′ACATGTTCTTTCCTGCGCCGCTACAGGG 3′；

pS1 Vector1下游：5′GAATTCTGCAGATATCCTCGAGCATGCATCTAG 3′。

pS1 Vector2上游：5′CTCGAGGATATCTGCAGATATCCAGCACAC 3′(划线部分为

EcoR V酶识别位点)；

pS1 Vector2下游：5′CCCTGTAGCGGCGCAGGAAAGAACATGT 3′。

以pEGFP-N1(购自Invitrogen)质粒为模板，用引物pS1 Vector1上游和pS1 Vector1下游PCR扩增片段A，以pCDNA3.0质粒(购自invitrogen公司)为模板，用引物pS1 Vector2上游和pS1 Vector2下游PCR扩增片段B。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl2(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段A和B后混匀，片段A和B质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pA。

2)pS2-Vector的构建

设计引物SV(40)上游和SV(40)下游pS2 Vector(1)上游和pS2 Vector(1)下游，序列如下：

SV(40)上游：5’GTGCCACCTGACGTCCAAAAGCCTAGGCCTCC 3’；

SV(40)下游：5’CTAGTCAATAATCAATGTATCCCGCCCCTAACTC 3’。

pS2 Vector(1)上游：5’GGAGGCCTAGGCTTTTGGACGTCAGGTGGCAC 3’；

pS2 Vector(1)下游：5’GAGTTAGGGGCGGGATACATTGATTATTGACTAG 3’。

以pEGFP-N1质粒为模板，用引物SV(40)上游和SV(40)下游PCR扩增片段C；以pS1 Vector质粒为模板，用引物pS2 Vector(1)上游和pS2 Vector(1)下游PCR扩增片段D。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段C和D后混匀，片段C和D质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pAP-SV40。

3)pSP-Vector的构建

设计引物pSP上游和pSP下游、MLP6上游和MLP6下游，引物序列如下：

pSP上游：GAGCCAAGCAGTCAAGTACGACTCACTATAGG；

pSP下游：CCTATAGTGAGTCGTACTTGACTGCTTGGCTC。

MLP6上游：GGAGTTAGGGGCGGGAGAGACATACGTTTCC；

MLP6下游：CCTATAGTGAGTCGTACTTGACTGCTTGGCTC。

以pAP-SV40为模板，用引物pSP上游和pSP下游PCR扩增片段E；以猪血液REVDNA为模板，用引物MLP6上游和MLP6下游PCR扩增片段F。

PCR反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，53℃退火45s，72℃延伸6min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

50μl感受态细胞中加入片段E和F后混匀，片段C和D质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该载体命名为pSP-vector，pSP-vector图谱如图1所示。

挑取单克隆提取质粒，将pSP-vector测序，测序结果表明，pSP-vector的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO：1所示，SEQ ID NO：1自5′末端第1-543位为MLP 6启动子，自5′末端第628-634位为EcoR V酶的识别序列，自5′末端第606-969位为BGH Ploy A，自5′末端第960-1141位为SV40 Origin，自5′末端第1160-1779位为COIE1 Origin，自5′末端第1780-2937位为氨苄青霉素抗性基因。SEQ ID NO：1的自5′端第631-646位的核苷酸序列和SEQID NO：1的自5′端第647-662位的核苷酸序列为能与外源基因上的PCR扩增产物发生同源序列重组的序列。

试验例1 pSP-vector表达蛋白的能力

1)表达绿色荧光蛋白的pSP-EGFP-Vector的构建

设计引物EGFP上游和EGFP下游，引物序列如下：

EGFP上游：GGAATTCTGCAGATTCGCCACCATGGTGAG；

EGFP下游：ATGCATGCTCGAGGATTTACTTGTACAGCTCG。

以pEGFP-N1为模板，用引物EGFP上游和EGFP下游PCR扩增EGFP基因片段。

反应体系：10×PCR Buffer 5μL，上游、下游引物各1μL，DNA模板1μL，MgCl₂(25mM)3μL，dNTPs(各2.5mM)3μL，Pfu-Taq(5U/μL)0.5μL，最后补水至50μL。

反应条件：94℃热变性5min；94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃最后延伸10min。

PCR产物用DNA回收试剂盒回收，方法参考其说明书。

pSP-Vector用EcorV内切酶酶切线性化，回收线性化的pSP-Vector。

酶切体系如下：

10×D buffer 10μl，BSA 1μl，EcoR V 2μl(20U PROMEGA公司购买)，pSP-Vector 50μl，补水至100μl，37℃酶切过夜。

酶切产物在1×TAE配制的琼脂糖凝胶中电泳，120v，电泳30分钟，DNA回收试剂盒回收目的片段。回收产物-80℃保存备用。

50μl感受态细胞中加入线性化的pSP-Vector和HA基因片段后混匀，线性化的pSP-Vector和HA基因片段质量比为100ng∶500ng。混匀后体系冰浴30min。42℃水浴热激90秒，然后冰上放置3min，加入预热的LB培养基900μl，置于37℃下，180-200rpm振摇90min，收集菌体，用LB液体培养基重悬菌体，取200μl重悬液涂布LB板上(含有氨苄青霉素)，37℃培养12-16h。挑取单克隆提取质粒，该质粒命名为pSP-EGFP-Vector。

2)绿色荧光蛋白的的检测

取10ul lipofectamine 2000(Invitrogen公司)加入到250ul的OPTI-MEMI培养基(Invitrogen公司)中，室温放置5分钟，获得溶液1；将5ug pSP-EGFP-Vector质粒加入到250ul的OPTI-MEMI培养基中，获得溶液2；将溶液1和2混合，室温孵育20分钟，再加入500ul的OPTI-MEMI培养基，得到溶液3。

将ST细胞置于6孔细胞板中培养，等待细胞长至60-80％时将细胞用PBS洗涤两次，然后加入溶液3，37℃孵育5个小时，吸出溶液3，加入新鲜的OPTI-MEMI培养基，继续培养。培养24h后，在荧光显微镜下观察荧光蛋白的表达情况。

荧光显微镜结果如图2所示，表明pSP-Vector转染后24小时ST细胞有较强的荧光信号，而阴性对照组没有荧光，说明pSP-Vector质粒可以在ST表达绿色荧光蛋白，具有良好的蛋白表达能力，也说明MLP 6是一种良好的猪源启动子，可以在猪类细胞中高效表达外源蛋白。

Claims (5)

1.一种环状的猪源启动子蛋白表达载体，包含原核复制起点、真核复制起点、筛选标记基因和外源基因表达盒，所述外源基因表达盒自上游至下游依次由一个转录启动子、连接片段和多聚腺苷酸加尾信号组成；所述转录启动子是Myosin light polypeptide 6启动子；所述的猪源启动子蛋白表达载体其碱基为SEQ ID NO:1所示。

2.一种线性的猪源启动子蛋白表达载体，其特征在于：将权利要求1所述环状的猪源启动子蛋白表达载体线性化而得到。

3.一种构建权利要求1所述的猪源启动子蛋白表达载体的方法，包括以下步骤：

（1）以pEGFP-N1质粒为模板，用SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3为引物进行PCR扩增，得到片段A；

（2）以pCDNA3.0质粒为模板，以pCDNA3.0质粒为模板，用SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5为引物进行PCR扩增，得到片段B；

（3）将片段A和片段B导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段A和片段B连接，使用氨苄青霉素进行筛选，获得重组载体I；

（4）以重组载体I为模板，用SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7为引物进行PCR扩增，得到片段D；

（5）以pEGFP-N1质粒为模板，用SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9为引物进行PCR扩增，得到片段C；

（6）将片段C和片段D导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段C和片段D连接，使用氨苄青霉素进行筛选，获得重组载体II；

（7）以重组载体II为模板,用SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13为引物进行PCR扩增，得到片段E；

（8）以猪血液cDNA为模板，用SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11为引物进行PCR扩增，得到片段F；

（9）将片段E和片段F导入大肠杆菌感受态细胞中，通过同源重组将片段E和片段F连接，使用氨苄青霉素进行筛选，即得。

4.权利要求1所述的猪源启动子蛋白表达载体在表达外源蛋白中的应用。

5.权利要求2所述的猪源启动子蛋白表达载体在表达外源蛋白中的应用。

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