CN115197964A - 一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用，本发明通过将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的Spe I酶切位点处添加SV40poly(A)signal，构建得到一种改进型pSFV1载体，与pSFV1载体相比，本发明的改进型pSFV1载体在体外合成RNA时可以使用T7RNA聚合酶，并且可在体外转录之前检测mRNA体外转录模板是否构建成功，应用于构建mRNA疫苗，不仅可以降低成本，而且使用起来更方便高效。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用。
技术背景
mRNA疫苗领域正在飞速发展，现阶段mRNA疫苗已经在流感病毒、埃博拉病毒、新型冠状肺炎病毒等传染病上取得了一定的研究成果，mRNA疫苗的作用机制是直接将mRNA递送进细胞，使宿主通过自身细胞，在体内表达目的蛋白，其过程与病毒蛋白表达过程类似，可以同时激活机体的细胞免疫及体液免疫系统。相比传统的灭活疫苗，mRNA疫苗的研发和生产速度更快，而且mRNA疫苗也表现出优秀的安全性，由于mRNA是非感染性、非整合性平台，因此没有感染或插入诱变的潜在风险。
pSFV1载体是基于塞姆利基森林病毒复制子的表达系统，该载体结构主要包含原核复制起始位点、氨苄抗生素抗性基因、SP6启动子和塞姆利基森林病毒4个非结构基因(pSFV1质粒图谱见图1)；当前，pSFV1载体被广泛应用于构建自扩增型mRNA疫苗，使用该载体为模板的mRNA疫苗在动物试验中取得了较好的结果，对比非自扩增mRNA疫苗，使用该载体构建模板体外合成的自扩增mRNA疫苗在免疫用量上更少，疫苗在体内表达时间更持久，对动物的保护效果更强。但是，该载体还存在两个缺点：第一是该载体使用了SP6启动子，由于RNA聚合酶对启动子识别的特异性，使用SP6启动子，使得以该载体为模板的体外RNA合成必须使用SP6 RNA聚合酶。然而，与SP6 RNA聚合酶相比，T7 RNA聚合酶在体外合成长片段RNA时更具有优势，而且在价格上，T7 RNA聚合酶更低廉。另一个是由pSFV载体构建的转录模板需要先转录成mRNA后才能通过体外转染鉴定模板是否可用，操作较繁琐。因此，有必要对pSFV载体进行改进，使其适用于T7 RNA聚合酶，且用于构建转录模板时可直接进行体外转染即可鉴定模板是否可用。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中的问题，提供一种改进型pSFV1载体及其制备方法与应用，使pSFV载体在用于构建mRNA疫苗时，成本更低廉，可直接通过体外转染鉴定模板是否可用，使用起来更方便高效。
本发明的目的通过以下技术方案予以实现：
本发明的第一个目的是提供一种改进型pSFV1质粒，所述质粒具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，所述质粒命名为pSFV1-CTS质粒，其结构图谱见图4。
本发明的第二个目的是提供上述改进型pSFV1质粒的构建方法，即将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的Spe I酶切位点处添加SV40 poly(A)信号，所述SV40 poly(A)信号(SV40 poly(A)signal)的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CMV真核启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述T7启动子的核苷酸序列包含在如SEQ ID NO:3所示和如SEQ ID NO:4所示的核苷酸片段内。
作为本发明的一个优选实施方式，上述改进型pSFV1质粒的构建方法包括以下步骤：
S1、分别扩增获得如SEQ ID NO:1所示的片段1(即SV40 poly(A)信号)，如SEQ IDNO:2所示的片段2，如SEQ ID NO:3所示的片段3(即CMV真核启动子)，如SEQ ID NO:4所示的片段4；
S2、对pSFV1载体进行酶切，使pSFV1载体线性化；
S3、将片段1连接到酶切后的pSFV1质粒上；
S4、将连接片段1后的pSFV1质粒转化进感受态细胞，并挑取单菌落进行菌液PCR鉴定获取转化成功的菌株，对菌株进行抽提质粒后获得包含片段1的质粒pSFV1-S；
S5、对pSFV1-S载体进行双酶切，使pSFV1-S载体线性化；
S6、将片段2、片段3、片段4连接到线性化的pSFV1-S质粒上，经转化、菌株鉴定、质粒抽提后得到改进型pSFV1质粒。
本发明通过将SP6启动子替换为T7启动子，使得体外转录合成mRNA时可以使用T7RNA聚合酶，相比SP6 RNA聚合酶，T7 RNA聚合酶在价格上更有优势；另外本发明添加CMV和SV40 poly(A)signal两个真核表达所需元件，使得pSFV1质粒在保持原有功能的条件下获得了在真核细胞中表达蛋白的能力，可以在体外转录之前检测mRNA体外转录模板构建是否成功。
优选地，扩增片段1和片段3采用pCAGGS载体为模板，扩增片段2和片段4采用pSFV1载体为模板。
进一步地，扩增片段1所用的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；扩增片段2所用的引物如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示；扩增片段3所用的引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；扩增片段4所用的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
优选地，步骤S2为采用SpeⅠ酶对pSFV1载体进行酶切。
优选地，步骤S4所述感受态细胞为Stbl3感受态细胞。
优选地，步骤S5为用SphⅠ酶和EcoR V酶对pSFV1-S载体进行双酶切。
本发明的第三个目的是提供上述改进型pSFV1质粒在构建mRNA疫苗中的应用。
优选地，所述mRNA疫苗为具有体外转录功能的自扩增性mRNA疫苗。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
本发明通过将pSFV1载体上的SP6启动子更换为为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的Spe I酶切位点处添加SV40poly(A)signal，构建得到一种改进型pSFV1载体，该载体具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，其结构图谱如图4所示，与pSFV1载体相比，本发明的改进型pSFV1载体在体外合成RNA时可以使用T7 RNA聚合酶，并且可在体外转录之前检测mRNA体外转录模板是否构建成功(即可直接通过体外转染鉴定模板是否可用)，应用于构建mRNA疫苗，不仅可以降低成本，而且使用起来更方便高效。
附图说明
图1为pSFV1质粒的结构图谱(AmpR：氨苄青霉素抗性基因；ori：复制起始位点；MSC：多克隆位点；SP6 promoter：SP6启动子；nsp1-nsp4：赛姆利基森林病毒非结构基因)；
图2为改进型pSFV1质粒及含有EGFP基因的质粒的构建流程图；
图3为pSFV1-S质粒的结构图谱；
图4为pSFV1-CTS质粒的结构图谱(AmpR：氨苄青霉素抗性基因；ori：复制起始位点；MSC：多克隆位点；SP6 promoter：SP6启动子；nsp1-nsp4：赛姆利基森林病毒非结构基因；CMV enhancer：CMV真核启动子；T7 promoter：T7启动子)；
图5为pSFV1-CTS-EGFP质粒的结构图谱(AmpR：氨苄青霉素抗性基因；ori：复制起始位点；MSC：多克隆位点；SP6 promoter：SP6启动子；nsp1-nsp4：赛姆利基森林病毒非结构基因；CMV enhancer：CMV真核启动子；T7 promoter：T7启动子；EGFP：绿色荧光蛋白基因)；
图6为PSFV1-CTS-EGFP转染HEK293T细胞后48h的绿色荧光结果；
图7为mRNA转染HEK293T细胞后48h的绿色荧光结果。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
除特殊说明，本实施例、对比例以及实验例中所用的设备均为常规实验设备，所用的材料、试剂无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。
实施例1改进型pSFV1质粒的构建
按照图2所示的流程图进行改进型pSFV1质粒的构建，具体包括以下步骤：
步骤1：扩增改进型pSFV1载体所需的片段
分别用表1所示的引物扩增片段1(SEQ ID NO:1)、片段2(SEQ ID NO:2)、片段3(SEQ ID NO:3)和片段4(SEQ ID NO:4)，其中，片段1和片段3用pCAGGS载体(优宝生物)为模板进行扩增，片段2和片段4以pSFV1载体(优宝生物)为模板进行扩增，片段1为SV40 poly(A)signal，片段3为CMV真核启动子，片段1长度为177bp，片段2长度为443bp，片段3长度为411bp，片段4长度为313bp。反应体系如下：
反应程序如下：
表1扩增片段1-4所用的引物
注：P3-R引物划线部分为T7启动子反互补序列，P4-F引物划线部分为T7启动子序列。
扩增结束后，PCR产物通过凝胶电泳查看片段大小，将片段大小在正确位置的片段切下来放入1.5mL离心管进行回收，并使用Omega凝胶回收试剂盒对电泳凝胶进行回收，详细步骤如下：
(1)在离心管中加入等体积的Binding Buffer，在60℃水浴锅中水浴5min，直至凝胶完全融化；
(2)将上一步的液体转移进离心柱中，13000g/min离心1min；
(3)弃掉滤液，在离心柱加入300μL Binding Buffer，13000g/min离心1min；
(4)弃掉滤液，在离心柱加入700μL SPW Wash Buffer，13000g/min离心1min；
(5)弃掉滤液，在离心柱加入700μL SPW Wash Buffer，13000g/min离心1min；
(6)弃掉滤液，13000g/min离心1min；
(7)将离心柱放入一个新的1.5mL离心管中，空置两分钟；
(8)往柱子基质中加入30-100μL Elution Buffer，静置1min；
(9)13000g/min离心1min，洗脱DNA，放置在-20℃保存备用。
步骤2：用SpeⅠ酶酶切pSFV1载体，使其线性化
酶切的体系如下：
酶切反应体系在37℃水浴锅中水浴1h；
酶切结束后，酶切产物通过凝胶电泳鉴定片段大小，将片段大小在11000bp的片段切下来放入1.5mL离心管进行回收，并使用Omega凝胶回收试剂盒回收酶切、电泳后的pSFV1载体，详细步骤同步骤1。
步骤3：使用诺唯赞的无缝克隆试剂盒(货号C115)将片段1连接到酶切后的pSFV1质粒上
连接体系如下：
连接体系置于PCR仪中，50℃反应5min。
步骤4：将连接后的质粒转化进Stbl3感受态细胞(购自康体生命)
转化的详细步骤如下：
(1)将步骤3中的全部产物(10μL)缓慢加入到一管刚解冻的Stbl3感受态细胞中，并迅速将感受态细胞置于冰上，冰浴30min；
(2)将感受态细胞置于42℃水浴锅中水浴90s，迅速转移至冰上，冰浴2min；
(3)在感受态细胞中加入900μL无抗LB培养基，放入摇床在37℃、220r/min的条件下培养45-60min；
(5)将感受态细胞3000g/min离心5min，弃去900μL上清；
(6)用移液器将沉淀轻轻吹打重悬，加入到氨苄青霉素浓度为50ug/mL的LB培养皿中，涂抹均匀；
(7)放入37℃培养箱，培养12-16h。
步骤5：挑取单菌落进行菌液PCR鉴定
详细的步骤如下：
(1)在1.5mL EP管中加入1mL含氨苄青霉素的LB培养基(氨苄青霉素浓度为50ug/mL)；
(2)挑取步骤4中的单菌落到上一步的EP管中；
(3)放入摇床在37℃、220r/min的条件下培养3–4h；
(5)对菌液使用片段1的引物进行PCR鉴定，PCR反应体系如下：
反应程序如下：
反应结束后，对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳条带在177bp的为正确条带，对应菌株送上海生工进行测序，测序结果正确则为正确菌株(即转化成功的菌株)。
步骤6：抽提质粒。
使用Omega的无内毒素质粒小提试剂盒抽提质粒，详细步骤如下：
(1)将步骤5中获得的正确菌株接种到5mL含50ug/mL氨苄青霉素的LB培养液中，放入摇床在37℃、220r/min的条件下培养12-16h；
(2)收集菌液，在室温下13000g/min离心1min，弃去上清；
(3)加入250μL的Solution I/RNaseA混和液，将细胞重悬；
(4)往重悬混和液中加入250μL Solution II，轻轻颠倒混匀；
(5)加入125μL预冷的N3 Buffer，上下轻轻颠倒混匀，此时离心管中出现大量白色絮状物，在室温下13000g/min离心10min；
(6)取上清到新的离心管中，加入0.1倍体积的ETR Solution，上下轻轻颠倒混匀；
(7)将上一步混合液冰浴10min后42℃水浴5min；
(8)在室温下13000g/min离心5min，小心取上清到新的离心管中，在上清中加入0.5倍体积的无水乙醇，上下颠倒混匀，室温静置2min；
(9)将混合液转移进离心柱中，13000g/min离心1min，弃滤液(若混合液较多，请分多次转移，并重复本步骤直至全部混合液通过离心柱)；
(10)加入500μL HBC Buffer，13000g/min离心1min，弃滤液；
(11)加入700μL DNA Wash Buffer，13000g/min离心1min，弃滤液；
(12)重复上步骤1次；
(13)将空离心柱13000g/min离心2min；
(14)将离心柱转移进新1.5mL离心管，空置2min；
(15)在柱子基质中加入30-100μL Elution Buffer，静置1min；
(16)13000g/min离心1min，洗脱DNA，放置在-20℃保存备用。
(本步骤获得的质粒命名为pSFV1-S，质粒图谱见图3)
步骤7:用SphⅠ酶和EcoR V酶双酶切pSFV1-S载体，使pSFV1-S载体线性化
酶切体系如下：
将酶切体系置于37℃下水浴1h。
酶切结束后，对双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，将大小为10464bp大小的片段回收，回收步骤同步骤1。
步骤8：使用诺唯赞的无缝克隆试剂盒(货号C115)将片段2、片段3、片段4连接到线性化的pSFV1-S质粒上
反应体系如下：
连接体系置于PCR仪中，50℃反应15min，之后经转化(同步骤4)、菌株鉴定(同步骤5，引物则采用表1中对应的引物)、质粒抽提(同步骤6)得到改进型pSFV1质粒，即pSFV1-CTS质粒，质粒的结构图谱见图4，质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示。
实施例2验证pSFV1-CTS质粒是否构建成功
按照图2所示的流程图验证pSFV1-CTS质粒是否构建成功，具体包括以下步骤：
步骤1：EGFP基因(绿色荧光蛋白基因)的扩增
使用本实验室保存的pCAGGS-EGFP质粒(BioVector)为模板扩增EGFP基因，扩增体系如下：
反应程序如下：
PCR产物通过凝胶电泳鉴定片段大小，将片段大小在768bp的片段切下来放入1.5mL离心管进行回收，并使用Omega凝胶回收试剂盒回收回收PCR产物，详细步骤同实施例1的步骤1，回收片段命名为片段EGFP(序列见SEQ ID NO:14)。
步骤2：用BamH I酶酶切pSFV1-CTS载体
反应体系如下：
酶切反应体系在37℃水浴锅中水浴1h；
酶切结束后，酶切产物通过凝胶电泳鉴定片段大小，将片段大小在11554bp的片段切下来放入1.5mL离心管回收，并使用Omega凝胶回收试剂盒回收PCR产物，详细步骤同实施例1的步骤1。
步骤3：使用诺唯赞的无缝克隆试剂盒(货号C115)将EGFP基因连接到BamH I酶切后的pSFV1-CTS质粒上
反应体系如下：
连接体系置于PCR仪中，50℃反应5min。
连接结束后，将连接后的质粒转化进Stbl3感受态细胞，具体操作同实施例1的步骤4，菌株鉴定具体操作步骤同实施例1的步骤5。
步骤4：抽提无内毒素pSFV1-CTS-EGFP质粒
具体操作步骤同实施例1的步骤6，本步骤获得的质粒命名pSFV1-CTS-EGFP，质粒图谱见图5，核苷酸序列如SEQ ID NO:15所示。
步骤5：转染重组质粒(pSFV1-CTS质粒和pSFV1-CTS-EGFP质粒)到HEK-293T细胞。
使用赛默飞公司的Lipofectamine 3000转染试剂进行转染，详细操作步骤如下：
(1)转染前一天将HEK293T细胞以每孔1×106个的细胞量接种于6孔板，接种后放入5％CO2的37℃培养箱中培养12-24h，待细胞汇合度达到80％-90％时，准备转染；
(2)使用750μL Opti-MEM培养基稀释22.5μL Lipofectamine 3000试剂；
(3)使用375μL Opti-MEM培养基稀释24μL P3000试剂，配置两管，其中一管加入12μg pSFV1-CTS质粒，另一管加入12μg pSFV1-CTS-EGFP质粒；
(4)将稀释好的Lipofectamine 3000试剂和稀释好的质粒DNA按照1:1比例混合均匀，孵育10-15min；
(5)将铺好的细胞板从培养箱取出，弃掉培养基，用无菌的PBS洗涤两次，每孔加入2mL Opti-MEM；
(6)将孵育好的DNA-脂质体复合物，以每孔250μL的量加入到6孔板中；
(7)将细胞放入5％CO2的37℃培养箱中培养24h；
(8)在荧光显微镜下观察细胞荧光，结果如图6所示。
由图6可以看出，在荧光显微镜下，用蓝色激发光可以激发出绿色荧光，说明转染的质粒可以在细胞中正确表达EGFP蛋白，证明pSFV1-CTS质粒可以在真核细胞中表达目的蛋白。
实施例3pSFV1-CTS质粒的体外转录功能验证
按照图2所示的流程图验证SFV1-CTS质粒的体外转录功能，具体包括以下步骤：
步骤1：Spe I酶酶切pSFV1-CTS-EGFP质粒将质粒线性化
酶切反应体系如下：
酶切反应体系置于37℃水浴锅中水浴1h；
酶切结束后，酶切产物通过凝胶电泳鉴定片段大小，将片段大小在7097bp的片段切下来放入1.5mL离心管回收，并使用Omega凝胶回收试剂盒回收PCR产物，详细步骤同实施例1的步骤1。
步骤2：体外转录及纯化
使用NEB的
T7 ARCA mRNA Kit(with tailing)(货号NEB#E2060S)对酶切后的pSFV1-CTS-EGFP质粒进行体外转录及纯化，详细步骤如下：
(1)按说明书加入各组分到反应液中，反应体系如下：
(2)充分混合并在微量离心机中瞬时离心，在37℃下孵育30min；
(3)加入2μL DNase I，充分混合并在37℃孵育15min；
(4)按说明书加入各组分，对上一步产物添加Poly(A)尾反应体系如下：
(5)彻底混合并在微量离心机中瞬时离心，在37℃下孵育30min；
(6)在上一步反应液中加入0.5倍体积LiCl溶液并充分混合；
(7)在–20℃下孵育30min；
(8)在4℃高速离心15min以沉淀RNA；
(9)小心除去上清液；
(10)加入500μL 70％冷乙醇冲洗沉淀，并在4℃离心10min；
(11)小心除去乙醇，瞬时离心试管，以使壁上的液体滴落下来；
(12)使用枪头尖端小心地清除残留的液体；
(13)风干沉淀，将mRNA重悬于50μL 0.1mM EDTA或合适的RNA储存溶液中；
(14)将RNA在65℃加热5-10min以完全溶解RNA；
(15)将RNA储存在–20℃或更低的温度下。
步骤3：转染mRNA到HEK-293T细胞
详细转染步骤同实施例2的步骤5，孵育48h后在荧光显微镜下观察荧光，结果如图7所示。
由图7可以看出，本发明构建的pSFV1-CTS质粒在体外可以正常转录为mRNA，并且在使用mRNA转染细胞之后可以在细胞中正确表达绿色荧光蛋白。
综合上述实施例可以看出，与pSFV1载体相比，本发明的改进型pSFV1载体在体外合成RNA时可以使用T7 RNA聚合酶，并且可在体外转录之前检测mRNA体外转录模板是否构建成功(可直接通过体外转染鉴定模板是否可用)，可应用于构建具有体外转录功能的自扩增型mRNA疫苗。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.一种改进型pSFV1质粒，其特征在于，所述质粒具有如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
2.权利要求1所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，将pSFV1载体上的SP6启动子更换为T7启动子，并在T7启动子之前添加了CMV真核启动子，同时在载体上的SpeI酶切位点处添加SV40 poly(A)信号，所述SV40 poly(A)信号的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述CMV真核启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述T7启动子的核苷酸序列包含在如SEQ ID NO:3所示和如SEQ ID NO:4所示的核苷酸片段内。
3.根据权利要求2所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、分别扩增获得如SEQ ID NO:1所示的片段1，如SEQ ID NO:2所示的片段2，如SEQ IDNO:3所示的片段3，如SEQ ID NO:4所示的片段4；
S2、对pSFV1载体进行酶切，使pSFV1载体线性化；
S3、将片段1连接到酶切后的pSFV1质粒上；
S4、将连接片段1后的pSFV1质粒转化进感受态细胞，并挑取单菌落进行菌液PCR鉴定获取转化成功的菌株，对菌株进行抽提质粒后获得包含片段1的质粒pSFV1-S；
S5、对pSFV1-S载体进行双酶切，使pSFV1-S载体线性化；
S6、将片段2、片段3、片段4连接到线性化的pSFV1-S质粒上，经转化、菌株鉴定、质粒抽提后得到改进型pSFV1质粒。
4.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，扩增片段1和片段3采用pCAGGS载体为模板，扩增片段2和片段4采用pSFV1载体为模板。
5.根据权利要求4所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，扩增片段1所用的引物如SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示；扩增片段2所用的引物如SEQ ID NO:7和SEQID NO:8所示；扩增片段3所用的引物如SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示；扩增片段4所用的引物如SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
6.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S2为采用SpeⅠ酶对pSFV1载体进行酶切。
7.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S4所述感受态细胞为Stbl3感受态细胞。
8.根据权利要求3所述的一种改进型pSFV1质粒的构建方法，其特征在于，步骤S5为用SphⅠ酶和EcoR V酶对pSFV1-S载体进行双酶切。
9.权利要求1所述的改进型pSFV1质粒在构建mRNA疫苗中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述mRNA疫苗为具有体外转录功能的自扩增性mRNA疫苗。
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| CN103266121A (zh) * | 2013-05-15 | 2013-08-28 | 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 | 一种复制子dna疫苗载体及其构建方法与应用 |
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