CN116355934A - mRNA加帽酶及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了mRNA加帽酶及其制备方法与应用。本发明提供了一种制备可溶性mRNA加帽酶的方法，包括：将融合了MBP标签的蓝舌病毒、浮病病毒、非洲猪瘟病毒或小球藻病毒来源的加帽酶编码基因导入大肠杆菌受体细胞，对所得重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体裂解，离心后从上清液中获得所述融合蛋白，即为可溶性mRNA加帽酶。本发明进一步构建了T7体外转录体系，进行加帽效果验证，结果发现来源于蓝舌病毒和浮病病毒的mRNA加帽酶被证明拥有比牛痘病毒加帽酶VCE更高的加帽活性。其中，来源于蓝舌病毒的mRNA加帽酶的活性要比VCE高出38％。本发明对于增强线形mRNA的稳定性并提高其在体内的翻译效率具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及mRNA加帽酶及其制备方法与应用。
背景技术
mRNA最早由Sydney Brenner和Francis Crick在1960年发现。与DNA的双链双螺旋结构不同，mRNA通常为一条单链的线型多核苷酸链，约占细胞总RNA的3％。由于A-U、G-C配对现象的存在，大多数mRNA均具有复杂的二级结构(发卡、茎-环等)。mRNA在生物细胞内通常由脱氧核糖核酸(DNA)转录而来。对于不同的生物细胞种类，对mRNA的转录后修饰均不相同。这也导致了mRNA在这些生物细胞中结构上的差异。一般来说，在非真核生物细胞中，mRNA几乎不需要转录后修饰。而在真核细胞中，mRNA前体通常要经历5’端加帽反应、3’端加尾反应以及除去内含子的剪接反应形成成熟mRNA。因此，对于真核细胞来说，完整的mRNA结构包括5’端的帽结构，5’端非翻译区域(Untranslated region，UTR)，蛋白质编码区域(Coding sequence，CDS)或开放阅读框(Open reading frame，ORF)，3’端非翻译区域和3’端多聚腺嘌呤尾巴。根据分子生物学中心法则，遗传信息的传递方式为由DNA作为模板转录得到RNA，再由RNA作为模板翻译得到蛋白质。因此mRNA的主要功能便是作为遗传信息传递的中间载体。这也导致了mRNA是细胞内最不稳定的一类RNA。其易降解的特性使得细胞能够很好的调控细胞内的mRNA水平，从而调控不同蛋白质的水平，维持细胞内的稳态。目前，mRNA被认为在医疗领域具有巨大的应用潜力。人们已经将mRNA应用在蛋白替代，基因编辑，核酸疫苗等领域。
目前，有化学合成和体外转录两种方式可以在体外得到mRNA。由于化学合成产量低且只能生产长度为50-70个核苷酸的mRNA，因此体外转录是目前主要的mRNA合成方式。体外转录一般只需要以下几个组分：DNA模板、反应缓冲液和噬菌体RNA聚合酶。体外转录所需的DNA模板一般为线性DNA模板。线性DNA模板可以通过线性化pDNA或者聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction，PCR)获得。线性DNA模板易于在体外转录反应结束后用DNase I(Deoxyribonuclease I)进行消化并且减少转录后mRNA二聚体的产生。而目前使用的噬菌体RNA聚合酶通常来源于T7、SP6或T3噬菌体。其中，T7RNA聚合酶是目前最常见、使用最多的噬菌体RNA聚合酶。体外转录可以以较低的成本合成较长的mRNA。
在mRNA的5’端加入帽结构可以在空间上保护mRNA免受核酸外切酶的降解并增强翻译过程的效率。5’端帽结构，也称为7-甲基鸟苷帽结构(7-methylguanosine cap，m7G)，常见于真核细胞的mRNA转录后修饰，可以与真核起始因子4F(Eukaryotic initiationfactor4F，eIF4F)复合物结合富集核糖体并促进翻译的开始。加帽反应机理如下：三磷酸酶(Triphosphatase，TPase)催化从5’三磷酸RNA中去除γ-磷酸，先生成一个5’二磷酸RNA和无机磷酸。此后，鸟苷转移酶(Guanylyltransferase，GTase)消耗一个GTP分子，并形成一个共价中间体。在5’二磷酸RNA存在的情况下，GTase将GMP转移到5’二磷酸上，从而在RNA的第一个碱基和帽碱基之间形成一个三磷酸键。在S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine，SAM)存在的情况下，鸟苷-N7-甲基转移酶(Guanine-N7methyltransferase，N7MTase)在鸟苷帽的N7胺上增加一个甲基，形成帽0结构。最后，2’-O-甲基转移酶在与帽0结构相邻的第一个核苷酸的2’-O位置增加一个甲基，形成帽1结构。通过噬菌体RNA聚合酶体外转录得到的mRNA不具有帽结构，需要进行额外的修饰。目前，体外加帽有两种通用的手段，一是化学合成帽结构类似物，二是酶催化反应进行5’端加帽。化学合成的帽结构类似物可以通过噬菌体RNA聚合酶的共转录反应添加到mRNA的5’端。这种共转录的方法能够大幅降低mRNA生产工艺难度。但是目前这种帽结构类似物过于昂贵，无法产生实际的商业价值。同时，部分帽结构类似物会反向定位到mRNA的3’端。因此酶催化反应被认为是更加有前景的mRNA在5’端加帽修饰的手段。其中，牛痘病毒加帽酶(Vaccinia virus capping enzyme，VCE)是第一个被纯化和表征的加帽酶，也是目前主要商用的加帽酶。VCE拥有D1和D12两个亚基。其中，D1亚基为主要的功能亚基，大小为844aa(氨基酸，amino acid)，包含TPase、GTase和N7MTase三种酶的活性，能够在体外实现帽0结构的合成。D12亚基为辅助亚基，大小为287aa，与D1亚基的N7MTase结构域结合。因为VCE只能合成帽0结构，所以在体外加帽反应中通常会加入2’-O-甲基转移酶，最终形成帽1结构。这种酶催化反应加帽的方法成本相对较低。但是，目前商用的加帽酶活性有限，需要通过加大加帽酶的使用量或者是延长反应时间来实现较高的加帽效率。
发明内容
本发明的目的是提供mRNA加帽酶及其制备方法与应用。
第一方面，本发明要求保护一种制备可溶性mRNA加帽酶的方法。
本发明要求保护的制备可溶性mRNA加帽酶的方法，可包括如下步骤：
(A1)将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合蛋白为将促溶标签MBP和来源于病毒的加帽酶通过连接肽融合而成；所述来源于病毒的加帽酶选自如下任一：来源于蓝舌病毒(Bluetongue virus)的加帽酶、来源于浮病病毒(Faustovirus)的加帽酶、来源于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)的加帽酶、来源于小球藻病毒(Chlorella virus)的加帽酶；
(A2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清液中获得所述融合蛋白，即为可溶性mRNA加帽酶。
进一步地，所述融合蛋白自N端到C端由所述促溶标签MBP、所述连接肽和所述源于病毒的加帽酶顺次连接而成。
进一步地，所述来源于蓝舌病毒(Bluetongue virus)的加帽酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.1的第1-644位或SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述来源于浮病病毒(Faustovirus)的加帽酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.2的第1-879位或SEQ ID No.2所示。
进一步地，所述来源于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-868位或SEQ ID No.3所示。
进一步地，所述来源于小球藻病毒(Chlorella virus)的加帽酶的氨基酸序列如SEQ IDNo.4的第1-330位或SEQ ID No.4所示。
进一步地，所述促溶标签MBP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地，所述连接肽为柔性连接肽；更进一步地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ IDNo.6所示。
更进一步地，所述融合蛋白的编码基因可为如下任一：
(B1)核苷酸序列如SEQ ID No.7的第1-3063位或SEQ ID No.7所示；
(B2)核苷酸序列如SEQ ID No.8的第1-3768位或SEQ ID No.8所示；
(B3)核苷酸序列如SEQ ID No.9的第1-3735位或SEQ ID No.9所示；
(B4)核苷酸序列如SEQ ID No.10的第1-2121位或SEQ ID No.10所示。
其中，SEQ ID No.7的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3081位为编码所述来源于蓝舌病毒(Bluetongue virus)的加帽酶(SEQ ID No.1，含His标签)的核苷酸序列。
SEQ ID No.8的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3786位为编码所述来源于浮病病毒(Faustovirus)的加帽酶(SEQ ID No.2，含His标签)的核苷酸序列。
SEQ ID No.9的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3753位为编码所述来源于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)的加帽酶(SEQ ID No.3，含His标签)的核苷酸序列。
SEQ ID No.10的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-2139位为编码所述来源于小球藻病毒(Chlorella virus)的加帽酶(SEQ ID No.4，含His标签)的核苷酸序列。
进一步地，在步骤(A1)中，所述融合蛋白的编码基因可通过重组载体的形式导入所述大肠杆菌受体细胞中。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因插入到pET-21a(+)的多克隆位点处所得(与下游His标签进行融合表达，His标签用于纯化)。
在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌受体细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
进一步地，在步骤(A2)中，所述诱导表达为非低温诱导表达。所述诱导表达的条件为：37℃条件下，1mM IPTG诱导表达2h。
第二方面，本发明要求保护利用前文第一方面中所述方法制备得到的可溶性mRNA加帽酶。
第三方面，本发明要求保护用于制备前文第二方面中所述可溶性mRNA加帽酶的成套产品。
本发明要求保护的用于制备前文第二方面中所述可溶性mRNA加帽酶的成套产品，可包括：
(C1)前文第一方面中所述的重组载体；
(C2)前文第一方面中所述的大肠杆菌受体细胞。
根据需要，所述成套产品还可包括IPTG。
第四方面，本发明要求保护前文第二方面中所述可溶性mRNA加帽酶在对mRNA进行5’端加帽修饰中的应用。
进一步地，进行5’端加帽修饰的所述mRNA为体外转录所得mRNA。
第五方面，本发明要求保护一种mRNA体外转录-加帽方法。
本发明要求保护的mRNA体外转录-加帽方法，可包括如下步骤：
S1、制备T7RNA聚合酶，按照包括如下步骤的方法进行：
(a1)将融合了纯化标签的T7RNA聚合酶的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合了纯化标签的T7RNA聚合酶为在T7RNA聚合酶的N端融合了6His标签或8His标签；
(a2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清中分离纯化获得T7RNA聚合酶；
其中，所述T7RNA聚合酶可保存于TSB溶液中，但注意不能保存于PBS溶液中。保存于PBS溶液会使其失活。
S2、按照前文第一方面中所述方法制备得到mRNA加帽酶；
S3、先采用S1制得的T7RNA聚合酶进行mRNA体外转录，然后采用S2制得的mRNA加帽酶对体外转录所得mRNA进行5’端加帽修饰。
进一步地，步骤(a1)中，所述融合了纯化标签的T7RNA聚合酶的编码基因是通过重组载体的形式导入大肠杆菌受体细胞的。
在本发明的具体实施方式中，所述重组载体具体为将6His标签或8His标签的编码序列插入到pAR1219中T7RNA聚合酶编码基因的上游进行融合表达所得。表达出的6His标签或8His标签融合于T7RNA聚合酶的N端。
第六方面，本发明要求保护一种用于mRNA体外转录-加帽的成套产品。
本发明要求保护的用于mRNA体外转录-加帽的成套产品，可包括：
(D1)前文第一方面中所述融合了纯化标签的T7RNA聚合酶；
(D2)前文第一方面中所述可溶性mRNA加帽酶。
本发明基于不同的蛋白表达体系，如毕赤酵母、大肠杆菌等，对不同病毒来源的mRNA加帽酶进行异源表达。在此基础上，引入促溶标签以提高异源表达的mRNA加帽酶的溶解度。此后，基于自主构建的体外转录体系得到mRNA并使用不同病毒来源的mRNA加帽酶进行加帽，在哺乳动物细胞中进行测试和筛选。结果发现，ASF、BLUE、CHL和FAU在融合了促溶标签MBP后能够在大肠杆菌中成功表达出一定量的可溶性mRNA加帽酶，并且进一步构建了T7体外转录体系，并筛选出基于HEK293T的哺乳动物细胞表达体系用于mRNA的翻译表达。来源于蓝舌病毒Bluetongue virus和浮病病毒Faustovirus的mRNA加帽酶被证明拥有比牛痘病毒加帽酶VCE更高的加帽活性。其中，来源于蓝舌病毒的mRNA加帽酶的活性要比VCE高出38％。本发明对于增强线形mRNA的稳定性并提高其在体内的翻译效率具有重要意义。
附图说明
图1为毕赤酵母中mRNA加帽酶的表达情况。(a)为不同来源的mRNA加帽酶在P.pastoris X33中分泌表达的SDS-PAGE结果。(b)为不同来源的mRNA加帽酶在P.pastorisX33中分泌表达的Western blot结果。(c)为不同来源的mRNA加帽酶在P.pastoris X33中胞内表达的SDS-PAGE结果。(d)为不同来源的mRNA加帽酶在(a)-(c)图中的编号及对应的分子量。
图2为大肠杆菌中mRNA加帽酶的表达情况。(a)为不同来源的mRNA加帽酶在BL21(DE3)中表达的SDS-PAGE结果。(b)为不同来源的mRNA加帽酶在BL21(DE3)中表达的Westernblot结果。(c)为不同来源的mRNA加帽酶在(a)和(b)中的编号及对应的分子量。
图3为mRNA加帽酶低温诱导实验结果。(a)为mRNA加帽酶低温诱导实验SDS-PAGE结果。图片上方“T”表示全蛋白样品，“S”表示上清样品。(b)为不同来源的mRNA加帽酶对应的分子量。
图4为mRNA加帽酶融合促溶标签后大肠杆菌胞内表达实验结果。图片上方“T”表示全蛋白样品，“S”表示上清样品。(a)为mRNA加帽酶ASF的SDS-PAGE结果。(b)为mRNA加帽酶BLUE的SDS-PAGE结果。(c)为mRNA加帽酶RICE的SDS-PAGE结果。(d)为mRNA加帽酶ROT的SDS-PAGE结果。(e)为mRNA加帽酶COW的SDS-PAGE结果。(f)为mRNA加帽酶CHL的SDS-PAGE结果。(g)为mRNA加帽酶FAU的SDS-PAGE结果。(h)为不同mRNA加帽酶融合促溶标签后的分子量。
图5为VCE的构建与表达。(a)为pRSFDuet-1质粒载体。(b)为纯化后mRNA加帽酶VCE的SDS-PAGE结果。
图6为T7RNA聚合酶体外转录结果。图中N8表示纯化标签N8xHis，N6表示纯化标签N6xHis，NS表示纯化标签NStrepII，C8表示纯化标签C8xHis，C6表示纯化标签C6xHis，CS表示纯化标签CStrepII。
图7为不同转染试剂对HEK293T和HEK293F的转染效率。(a)为不同转染试剂对HEK293T和HEK293F的转染效率对比图。阴性对照为未添加转染试剂的细胞。HEK293T使用的Thermo转染试剂为LipofectamineTM MessengerMAXTM Transfection Reagent。HEK293F使用的Thermo转染试剂为ExpiFectamineTM 293转染试剂盒。(b)为不同转染试剂对HEK293T转染后的流式细胞仪结果。(c)为不同转染试剂对HEK293F转染后的流式细胞仪结果。
图8为不同mRNA加帽酶加帽后的mRNA在细胞内的表达情况。(a)为不同mRNA加帽酶加帽后的mRNA在HEK293T内表达蛋白相对荧光值对比图。相对荧光值选择牛痘病毒加帽酶VCE的实验结果作为基准“1”。(b)为不同mRNA加帽酶加帽后的mRNA在HEK293T内表达的流式细胞仪结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、mRNA加帽酶的异源表达与筛选
一、mRNA加帽酶的异源表达
1、不同来源的mRNA加帽酶
mRNA加帽反应需要加帽酶同时具有TPase、GTase、MTase几种酶的活性。相比于真核细胞内的mRNA加帽酶，病毒来源的mRNA加帽酶在功能上具有更高的集成性，并且更利于在体外的环境中发挥活性。本发明从各个蛋白/酶数据库中寻找具有相似活性的病毒来源的mRNA加帽酶。这些数据库包括BRENDA酶数据库(http://www.brenda-enzymes.org)，RCSB蛋白数据库(http://www.pdbus.org)，美国国家生物技术信息中心NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)等。选取的不同病毒来源的mRNA加帽酶如表1所示。
表1、不同病毒来源的mRNA加帽酶
不同病毒来源的mRNA加帽酶可能存在序列相似度为99％的情况，因此只选择其中一种用于后续的筛选与验证。
2、基于毕赤酵母体系的mRNA加帽酶异源表达
酵母作为一类单细胞真核生物，具有较为完备的基因表达调控机制。除此之外，酵母细胞可以对翻译得到的蛋白质进行后续的加工修饰，例如糖基化等。而毕赤酵母是一类可以利用甲醇作为唯一碳源和能量来源的酵母，在工业上已经得到广泛的应用。因此，优先使用实验室储存的毕赤酵母(P.pastoris)X33菌株作为mRNA加帽酶异源表达的宿主细胞。P.pastoris X33具有AOX1启动子，能够严格调控目标蛋白的表达。除此之外，P.pastorisX33可以实现酵母细胞的高密度培养和外源蛋白的高效表达。
构建的不同来源的mRNA加帽酶基因序列基于P.pastoris宿主进行了密码子优化。具体序列如下：
ASF：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGCTTCTTTGGATAATTTGGTTGCTAGGTATCAAAGATGCTTTAATGATCAATCTTTGAAAAATTCTACAATTGAATTGGAGATCAGATTTCAACAAATTAACTTCTTATTATTTAAAACTGTTTATGAAGCTTTGGTTGCTCAAGAAATTCCATCTACTATTTCTCACTCTATTAGATGCATTAAAAAAGTTCATCACGAGAATCACTGTAGAGAAAAAATTTTGCCATCTGAAAATTTGTATTTCAAGAAACAACCATTGATGTTTTTTAAATTTTCTGAACCTGCTTCTTTGGGATGTAAAGTCTCATTAGCTATCGAGCAGCCTATTAGAAAATTTATTTTGGATTCTTCTGTTTTGGTTAGGTTGAAAAATAGGACTACTTTTAGGGTTTCTGAATTGTGGAAAATTGAATTGACAATTGTTAAACAATTGATGGGTTCTGAAGTTTCTGCTAAATTGGCTGCTTTCAAAACATTGTTGTTTGATACTCCTGAACAACAAACTACTAAGAATATGATGACATTAATCAATCCTGATGACGAGTATTTATATGAAATTGAGATTGAATATACTGGTAAACCTGAATCTTTGACAGCTGCTGATGTTATTAAAATTAAGAATACTGTTTTGACTTTGATTTCTCCAAATCATTTGATGTTGACTGCTTATCATCAAGCTATTGAATTTATTGCTTCTCATATTTTGTCTTCTGAAATTTTGTTGGCTAGAATTAAATCTGGTAAATGGGGTTTGAAAAGATTGTTGCCACAAGTTAAATCTATGACTAAAGCTGATTATATGAAATTTTATCCACCTGTTGGTTATTATGTTACTGATAAAGCTGATGGTATTAGAGGTATTGCTGTTATTCAAGATACTCAAATTTATGTTGTTGCTGATCAATTGTATTCTTTGGGTACTACTGGTATTGAACCATTGAAACCAACTATTTTGGATGGAGAGTTTATGCCAAAAAAAAAGGAGTTTTATGGATTTGATGTTATTATGTATGAAGGTAATTTGTTGACTCAACAAGGTTTTGAAACTAGAATTGAGTCATTGTCAAAAGGTATTAAGGTTTTGCAAGCATTTAACATTAAGGCTGAAATGAAACCATTTATTTCATTAACTTCTGCTGATCCTAATGTTTTGTTAAAAAATTTTGAATCTATTTTTAAAAAGAAAACTAGACCATATTCTATTGATGGTATTATCTTAGTTGAACCTGGTAACTCTTATTTAAATACAAACACTTTTAAGTGGAAACCAACTTGGGATAATACTTTGGATTTTTTGGTTAGAAAATGTCCTGAATCTTTAAACGTTCCTGAATATGCTCCAAAAAAAGGTTTTTCTTTGCACTTATTGTTTGTTGGTATTTCTGGTGAATTGTTTAAAAAATTGGCTTTGAATTGGTGTCCTGGTTACACTAAGTTATTTCCTGTTACACAAAGAAATCAGAATTATTTCCCTGTTCAATTTCAACCATCTGATTTTCCATTGGCTTTTTTGTATTACCACCCTGATACTTCTTCTTTTTCTAATATTGATGGTAAAGTTTTGGAAATGAGATGCTTGAAGAGAGAAATTAATTACGTTAGATGGGAGATTGTTAAAATCAGAGAAGATAGACAACAAGATTTGAAAACTGGTGGTTATTTCGGTAATGATTTTAAGACTGCTGAATTGACTTGGTTGAATTATATGGATCCATTTTCTTTTGAAGAATTGGCTAAAGGTCCATCTGGTATGTATTTTGCTGGTGCTAAAACTGGTATTTATAGAGCTCAAACAGCATTAATCTCTTTTATCAAACAAGAAATTATTCAGAAAATTTCTCATCAATCTTGGGTTATTGATTTGGGTATTGGTAAAGGTCAAGATTTGGGTAGATATTTGGATGCTGGTGTTAGACATTTGGTCGGTATTGATAAAGATCAGACTGCTTTGGCTGAGTTGGTTTACAGAAAATTTTCTCATGCTACTACTAGACAACATAAACATGCTACTAATATTTATGTTTTGCATCAAGATTTGGCTGAACCTGCTAAAGAAATTTCTGAGAAAGTTCACCAAATCTATGGTTTTCCAAAGGAAGGTGCTTCTTCAATTGTCTCTAACTTGTTTATCCATTATTTGATGAAAAACACTCAACAAGTTGAAAATTTGGCTGTTTTGTGTCATAAATTGTTGCAACCTGGTGGTATGGTTTGGTTTACTACTATGTTGGGTGAACAAGTTTTGGAATTGTTGCATGAAAATAGAATTGAATTGAATGAAGTCTGGGAAGCTAGAGAAAATGAGGTCGTTAAATTTGCTATTAAAAGATTGTTCAAAGAAGATATTTTGCAAGAAACTGGTCAAGAAATTGGAGTTTTGTTGCCATTCTCTAACGGTGATTTTTATAACGAGTATTTAGTCAACACAGCATTCTTGATTAAGATCTTCAAACATCATGGTTTCTCTTTGGTTCAAAAACAATCTTTTAAGGACTGGATTCCTGAATTTCAAAATTTTTCAAAATCTTTGTATAAAATTTTGACTGAAGCTGATAAGACTTGGACTTCTTTGTTTGGTTTTATTTGTTTGAGAAAAAACCATCACCATCACCATCATCACCATTAA
BLUE：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGCCTGAACCACATGCTGTTTTGTATGTCACTAATGAATTGTCTCATTTGGTTAAATCTGGTTATTTGCCAATTTGGCATTTGACTGGTGATGAATCTTTGAATGATTTGTGGTTGGAAAATGGTAAATATGCTACTGATGTTTATGCTTATGGTGATGTTTCTAAATGGACTATTAGACAATTAAGAGGTCACGGTTTTATTTTTATCTCTACTCATAAATCTGTTCAATTGGCTGATATCATTAAAACTGTCGATGTTAGAGTTTCAAGAGAAGTTGTTAAATCTCAAGATATGAAAATGTTGGAGAATGAGATTGGTAGAAGGAGAATTAGAATGAGAAAAGGTTTTGGTGATGCTTTGAGATCTTATGCTTTTAAAGTTGCTATTGAATTTCATGGTTCTGAAGCTGAAACTTTGAATGATGCTAATCCAAGATTGCATAAAGTTTATGGTATGCCTGAAACTCCACCATTGTATATGGAATATGCTGAAATTGGTAATAAATTTGATGATGAGCCAACAGATGAGAAGTTGGTCTCTATGTTAGATTATATTATTTACTCTGCTGAAGAAATTCATTATGTTGGTTGTGGTGATTTGAGAACTTTGATGCAATTTAAAAAAAGATCTCCTGGTAGATTTAAAAGAGTTTTGTGGCATGTTTATGATCCAATTGCTCCACAATGTCCTGATACTAACGTTATCGTCCATAACGTTATGGTTGATTCTAAAAAAGACATTTTGAAACATATTAATTTCTTAAAGAGGGTTGAAAGATTGTTTATTTGGGATGTTTCTTCTGATAGAAATCAAATGGATGACGATGAATGGGAATCTACTAGATTTGCTGAAGATAGATTGGGTGAAGAAATTGCTTATGAAATGGGTGGTGCTTTTTCTTCTGCTTTGATTAAACATAGAGTTCCTGCTAAAAGAGATGAATATCATTGTATTTCTACTTATTTGTTGCCACAACCTGGTGCTGATAAAGATATGTACGAGTTGAGAAATTTTATGAAATTGAAAGGTTATTCTCATGTTGATAGACATATGCATCCTGATGCTGCTGTTATGAAAGTTGTTTCAAGAGATGTTAGAAGAATGGTTGAAATGTTCCATGGTAAGGACAGAGGAAGATTTTTGAAGAAAAGAATTTTTGAACACTTACATATTATTAGAAAGAATGGTTTGTTTCATGAATCTGATGAACCAAGAGCTGATTTGTTTTACTTGACAAATAGATGCAATATGGGTTTGGAGCCATCTATTTACGAAGTTATGAAAAAATCTACTATTGCTACTGTTTGGGTTGGTAGAACTCCATTGTATGATTATGATGATTATTCTTTGCCAAGATCTACTGTTATGTTGAATGGTTCTTATAGAGATATTAGAGTTTTGGATGGTAATGGTGCTATTTTGTTTTTGATGTGGAAATATCCTGATATCATTAAAAAAGATTTGACTTATGATCCTGCTTGGGCTATGAATTTTGCTGTTTCTTTGAAAGAACCAATTCCTGATCCACCTGTTCCTGATATTTCTTTGTGTAGATTTATTGGTTTGAGAGTTGAATCTTCTGTTTTGAGAGTTAGAAATCCAACTTTGCATGAAACTGCTGATGAATTGAAAAGAATGGGTTTGGATTTGTCTGGTCATTTGTATGTTACTTTGATGTCTGGTGCTTATGTTACTGACTTGTTTTGGTGGTTTAAAATGATTTTGGAATGGTCTTCTCAAGGTAAAGAACAAAAAATTAGAGATTTGAAAAGATCTGCTGCTGAAGTTATTGAATGGAAAGAACAAATGGCTGAAAGACCATGGCATGTTAGAAATGATTTGATTGCTGCTTTGAGAGAATATAAAAGAAAAATGGGTACTAGAGAAGGTGCTTCTATTGATTCTTGGTTGGAATTGTTGAGACATTTGCATCACCATCATCACCACCATCATTAA
RICE：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGGAGGTTCAATGTCTAACCCTGACTATTGTATTCCAAATTTTTCTCAAACTGTCAATGAGAGGACTATTATTGATATTTTTACAATTTGTAGGTATAGATCTCCATTGGTTGTTTTTTGTTTGTCTCATAATGAATTGGCTAAAAAATATGCTCAAGATGTTTCTATGTCTTCTGGTACTCATGTTCATATTATTGATGGTTCTGTTGAAATTACTGTTTCTTTGTACAGAACTTTTAGAACTATTGCTACTCAATTGTTGGGTAGAATGCAAATTGTCGTTTTTGTTACTGTTGATAAATCTGTTGTTTCTACTCAAGTTATGAAATCTATTGCTTGGGCTTTTAGAGGTTCTTTCGTTGAATTAAGGAATCAGTCTGTTGATTCTTCAACTTTGGTTTCTAAATTGGAAAATTTGGTTTCTTTTGCTCCATTGTATAATGTTCCAAAATGTGGTCCTGATTATTATGGTCCAACTGTTTATTCTGAATTATTATCTTTGGCTACTAATGCTAGAACTCATTGGTATGCTACTATTGATTATTCTATGTTTACTAGATCTGTTTTGACTGGTTTTGTTGCTAAATATTTTAATGAGGAAGCTGTTCCAATTGATAAAAGAATTGTTTCTATTGTCGGTTATAATCCACCATATGTTTGGACTTGTTTGAGACATGGTATTAGACCAACTTATATTGAAAAATCTTTGCCAAATCCTGGTGGTAAAGGTCCATTCGGTTTGATTTTGCCTGTTATTAATGAATTGGTTTTGAAATCTAAGGTCAAGTATGTTATGCATAATCCACAAATTAAGTTGTTGTGTTTGGACACTTTTATGTTGTCAACATCTATGAATATTTTGTATATTGGTGCTTATCCTGCTACTCATTTGTTGTCTTTGCAATTGAATGGTTGGACTATTTTGGCTTTTGATCCAAAAATTACTTCTGATTGGACTGATGCTATGGCTAAAGCTACTGGTGCTAAGGTTATTGGTGTTTCTAAAGAGTTTGACTTTAAGTCTTTTTCTGTCCAAGCTAATCAATTGAACATGTTTCAAAATTCTAAATTGTCTGTTATTGATGATACTTGGGTCGAAACTGATTATGAAAAATTTCAATCTGAAAAACAAGCATATTTTGAATGGTTGATCGATAGAACTTCTATCGATGTTAGATTGATTTCTATGAAATGGAACAGATCTAAAGATACTTCTGTTTCTCATTTGTTGGCTTTGTTGCCACAACCATATGGTGCTTCTATTAGAGAAATGAGAGCTTTTTTTCATAAAAAAGGTGCTTCTGATATTAAAATTTTGGCTGCTGAGACTGAAAAGTATATGGATGACTTTACTGCTATGTCAGTTTCAGATCAGATCAACACTCAAAAATTTATGCATTGTATGATTACTACTGTTGGTGATGCTTTGAAAATGGATTTGGATGGTGGTAGAGCTGTCATTGCTTCTTATTCTTTGTCTAATTCTTCTAATTCTAAGGAAAGAGTTTTGAAGTTTTTGTCTGATGCTAATAAAGCTAAAGCTATGGTTGTTTTTGGTGCTCCAAATACTCATAGATTGGCTTATGCTAAAAAAGTTGGTTTGGTTTTGGATTCTGCTATTAAAATGTCTAAAGATTTGATTACTTTTTCTAATCCAACTGGTAGAAGATGGAGAGATTATGGTTATTCTCAATCTGAATTGTATGATGCTGGTTATGTTGAGATTACAATTGACCAAATGGTTGCTTATTCTTCTGATGTCTATAATGGTGTCGGATACTTCGCTAATTCTACTTACAACGATTTGTTTTCTTGGTATATCCCAAAATGGTATGTTCATAAAAGAATGTTGATGCAAGATATTAGATTGTCTCCTGCTGCATTGGTTAAATGTTTTACTACTTTGATTAGAAACATTTGTTATGTTCCACATGAGACATATTACAGATTTAGAGGTATTTTGGTTGACAAGTATTTGAGATCTAAAAATGTTGATCCATCTCAATATTCTATTGTTGGTTCTGGTTCTAAAACTTTTACTGTTTTGTCTCATTTTGAAGTTCCACATGAATGTGGTCCATTGGTTTTTGAAGCTTCTACTGATGTTAATATTTCTGGTCATTTATTGTCTTTGGCTATTGCTGCTCATTTTGTTGCTTCTCCAATGATTTTGTGGGCTGAACAAATGAAATATATGGCTGTTGATAGAATGTTGCCACCAAATTTGGATAAATCTTTGTTTTTTGATAATAAAGTTACTCCATCTGGTGCTTTGCAAAGATGGCATTCAAGAGAAGAAGTTTTGTTGGCTGCTGAAATTTGCGAGTCATATGCTGCTATGATGTTAAATAATAAACATTCTCCTGATATCATCGGTACTTTGAAATCTGCTATTAATTTGGTTTTTAAAATTCACCACCATCACCATCACCATCATTAA
ROT：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGAAAGTTTTGGCTTTGAGACATTCTGTTGCTCAAGTTTATGCTGATACTCAAGTTTATACACATGATGACTCAAAGGACGAATACGAAAATGCATTCTTGATCTCAAACTTGACTACACACAATATCTTGTATTTGAACTACAATGTTAAGACATTACAAATTTTGAATAAGTCTGGTATTGCTGCAATCGAGATCCAAAAAATCGATGAATTATTCACTTTAATCAGATGTAATTTTACTTACGATTATACAGATGATGTTGTTTACTTGCATGATTACTCATATTATACAAATAATGAAATTAGAACTGATCAGCATTGGATTACTAAAACTAATATTGAAGATTATTTGTTGCCTGGTTGGAAATTGACTTATGTCGGTTACAATGGTTCTGATACTAGAGGTCATTATAATTTCTCTTTTAGATGTCAAAACGCTGCTACTGATGACGATGCAATTATTGAGTATATTTACTCTGATGAATTAGATTTCCAATCTTTTATCTTGAAAAAGATTAAGGAAAGAATGACTACTTCTTTACCAATCGCTAGATTATCAAATAGAGTCTTTAGAGATAAGTTGTTTAAGACATTGTCTGCTAATCACGATAAAGTTGTCAATATTGGTCCAAGGAATGAATCTATGTTTACTTTTTTGGATTATCCATCTATCAGACAATTTTCAAACGGACCATATTTGGTTAAAGATACTATTAAATTGAAACAAGAAAGATGGTTGGGTAAAAGATTGTCTCAGTTTGATATCGGTCAATACAAAAACATGTTGAACGTTTTAACTACTTTGTATCAATACTATAATATTTACCATGAAAAACCAATTGTTTATATGATTGGATCTGCACCATCTTATTGGATTTATGATATCAAGCAGTATTCTAATTTGAAATTTGAAACTTGGGATCCATTAGATACTCCATATTCTAACTTGCATCACAAAGAGTTGTTTTACATTAATGACGTTAAAAAATTAAAAGACAATTCTATCTTGTACATTGATATTAGAACAGATAGAGGAACTGTTGATTGGAAAGAATGGAGAAAAATCGTCGAAAGACAAACAATTGATAATTTGCATATTGCTTATAAGTATTTGTCTACTGGTAAAGCAAAGGTTTGTTGTGTTAAAATGACTGCTATGGATTTGGAATTGCCAATTTCTGCTAAATTGTTACATCATCCAACTACTGAAATTAGATCTGAGTTTTACTTGGTTATGGACATTTGGGATTCTAAGAATATCAAAAGGTTCATTCCAAAGGGAGTTTTGTATTCTTACATTAATAATACTATTACTGAGAACGTTTTTATTCAACAGCCATTTAAGTTAAAAACTTTGAAAAACGAGTGTATTATTGCTTTGTATGCATTGTCTAATGATTTAAATAATAGAGAAGACGTTGTTAAATTGATCAATAATCAAAAAAAAGCATTGATGACTGTTAGAATTAACAACACTTTTAAGGATGAACCAAAAGTCGGATTCAAAAATATTTACGATTGGACTTTTTTGCCAACTGATTTTGAAACTAATGGTTCTATTATTACTTCTTATGATGGTTGTTTGGGTATTTTTGGTTTGTCTATTTCTTTGGCTTCTAAACCAACTGGAAATAATCATTTGTTCATCTTGTCTGGTACTGACAAATATTTTAAGTTGGATCAATTTGCAAACCATATGTCTATTTCAAGAAGATCTCATCAGATTAGATTTTCTGAATCTGCTACATCATATTCTGGTTATATTTTTAGAGACTTGTCTAACAATAACTTTAACTTGATTGGTACTAACGTTGAAAATTCTGTTTCTGGTCATGTCTATAACGCTTTAATTTACTATAGATATAATTACTCTTTTGATTTGAAAAGATGGATTTATTTGCATTCAACTGGTAAAGCTTCTATTGAAGGTGGTAAATATTATGAACATGCTCCAATTGAATTGATTTATGCTTGTAGATCTGCTAGAGAATTTGCAAAGTTGCAAGATGATTTAACTGTTTTGAGATACTCTAATGAAATCGAGAATTATATTAATAAAGTCTACTCTATCACTTATGCTGATGATCCTAACTATTTCATCGGTGTTAAATTTAAAAATATCCCATACAAGTATAACGTTAAAGTTCCACATTTGACTTTTGGTGTTTTGAATATCTCTGAACAAATGTTACCTGATGTTATCACTATTTTGAAAAGATTTAAAAACGAGTTGTTTGGTATGGAAATTACTACTTCATACACTTATATGTTGTCTGACGAGGTTTATGTTGCTAATATTTCTGGTGTTTTGTCTACATATTTCAAGATCTACAATGCTTTCTACAAGGAACAAATTACTTTTGGACAGTCAAGAATGTTTATTCCACATGTTACTTTGTCTTTTTCTAATGAGAAGACAGTCAGAATCGACACTACAAAGTTGTATATCGATTCTATTTACTTGAGAAAGATTAAAGGTGATACTGTTTTTGATATGACTGGTCACCATCACCATCACCATCACCATTAA
COW：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGATGCTAATGTTGTCTCATCTTCTACAATTGCTACTTATATTGATGCTTTGGCTAAAAATGCTTCTGAATTGGAACAAAGATCTACTGCTTATGAAATCAATAATGAATTGGAGTTGGTTTTTATTAAGCCACCATTGATCACTTTGACAAATGTCGTCAATATCTCAACTATTCAAGAATCTTTCATTAGGTTTACTGTTACAAATAAGGAAGGAGTTAAAATCAGAACTAAAATTCCATTGTCTAAAGTTCATGGTTTGGACGTCAAGAATGTCCAATTAGTTGATGCTATTGACAATATTGTTTGGGAAAAGAAATCTTTGGTTACTGAAAATAGATTGCATAAGGAATGTTTGTTGAGGTTATCTACTGAAGAGAGACATATTTTTTTGGATTACAAGAAATACGGTTCTTCAATCAGATTAGAATTGGTCAATTTGATCCAAGCAAAGACTAAGAACTTTACTATTGATTTCAAATTGAAGTATTTTTTGGGTTCTGGTGCTCAATCTAAATCTTCATTATTGCATGCTATTAATCATCCAAAATCAAGACCAAATACTTCTTTGGAAATTGAATTTACTCCAAGGGATAATGAAACAGTTCCATATGATGAGTTGATTAAAGAGTTGACTACTTTGTCAAGACATATTTTCATGGCATCTCCTGAAAATGTTATTTTGTCTCCTCCAATTAATGCTCCAATTAAAACTTTTATGTTACCAAAGCAAGACATTGTTGGTTTGGATTTGGAAAATTTGTATGCTGTTACTAAAACTGATGGTATCCCAATTACTATTAGAGTTACATCAAATGGTTTATATTGTTACTTTACTCATTTGGGTTATATCATCAGATATCCTGTTAAAAGAATTATTGATTCAGAGGTTGTCGTTTTCGGTGAAGCTGTTAAAGATAAAAATTGGACTGTCTATTTGATTAAATTGATTGAACCTGTTAACGCTATTAATGATAGATTGGAAGAATCTAAATACGTTGAATCTAAATTGGTCGACATCTGTGACAGAATCGTTTTTAAATCTAAAAAATACGAAGGTCCATTTACTACAACTTCTGAAGTTGTCGACATGTTGTCTACTTATTTGCCAAAACAACCTGAAGGTGTTATCTTATTTTATTCTAAGGGACCTAAATCTAATATCGACTTCAAAATCAAAAAAGAGAATACAATTGATCAGACTGCTAATGTCGTTTTTAGATACATGTCTTCTGAACCAATCATTTTCGGTGAATCTTCTATCTTTGTTGAATACAAAAAGTTCTCAAATGACAAAGGTTTCCCTAAAGAATATGGTTCTGGTAAAATTGTTTTGTATAATGGTGTTAACTACTTGAATAATATTTATTGCTTGGAATATATTAATACTCATAATGAAGTTGGTATTAAATCAGTCGTTGTCCCTATCAAATTTATTGCTGAATTTTTGGTTAATGGTGAGATCTTGAAACCAAGAATTGACAAAACTATGAAATATATCAACTCTGAAGATTATTACGGTAATCAACATAACATTATCGTTGAACACTTAAGGGATCAATCAATTAAAATTGGTGACATTTTTAATGAAGACAAATTGTCAGACGTTGGTCACCAATATGCTAATAACGATAAATTTAGATTGAACCCTGAAGTTTCTTATTTTACTAATAAAAGAACTAGAGGACCATTGGGAATTTTGTCTAATTACGTTAAAACATTGTTGATTTCTATGTATTGTTCAAAAACTTTTTTAGATGACTCAAATAAAAGAAAAGTTTTGGCTATTGATTTTGGTAATGGTGCTGATTTGGAAAAATATTTCTATGGAGAAATTGCTTTGTTGGTTGCTACTGATCCTGATGCTGATGCTATTGCAAGGGGAAATGAGAGATACAACAAATTAAATTCTGGTATTAAGACTAAGTATTACAAGTTCGACTATATTCAAGAAACTATTAGATCTGACACTTTTGTCTCATCTGTTAGAGAAGTTTTCTATTTCGGTAAGTTTAACATTATCGATTGGCAATTTGCTATTCATTATTCTTTTCATCCAAGACATTATGCTACTGTTATGAATAATTTGTCTGAATTGACTGCTTCTGGTGGTAAGGTCTTGATTACAACTATGGATGGTGATAAATTGTCTAAGTTGACAGATAAGAAAACTTTTATCATTCACAAAAACTTGCCATCTTCTGAAAATTATATGTCTGTCGAAAAAATTGCTGATGATAGAATTGTTGTCTACAATCCTTCAACAATGTCTACTCCTATGACTGAATATATTATCAAGAAAAATGATATTGTTAGGGTTTTTAATGAATATGGTTTCGTTTTGGTTGATAACGTCGATTTTGCAACTATCATTGAAAGATCAAAAAAATTCATTAATGGTGCTTCTACTATGGAAGATAGACCATCTACTAGAAATTTTTTTGAATTGAATAGAGGTGCTATTAAGTGCGAAGGTTTGGATGTTGAAGATTTGTTGTCTTACTACGTCGTTTATGTTTTCTCTAAAAGACATCACCATCATCACCATCACCATTAA
CHL：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGTTCCACCAACTATTAATACTGGTAAAAATATTACTACTGAAAGAGCTGTTTTGACTTTGAATGGTTTGCAAATTAAATTGCATAAAGTTGTTGGTGAATCAAGAGATGATATTGTTGCTAAAATGAAAGATTTGGCTATGGATGATCATAAATTTCCAAGATTGCCTGGTCCTAATCCTGTTTCTATTGAAAGAAAAGACTTCGAAAAGTTAAAACAAAACAAATATGTCGTTTCTGAGAAAACAGATGGTATTAGGTTCATGATGTTTTTTACTAGGGTCTTTGGATTTAAAGTCTGTACTATTATTGATAGAGCAATGACTGTCTATTTGTTGCCATTTAAAAATATTCCAAGAGTTTTGTTTCAAGGTTCTATCTTCGATGGAGAATTGTGCGTTGATATTGTTGAAAAAAAATTCGCTTTTGTTTTGTTTGATGCTGTTGTCGTTTCTGGTGTTACTGTTTCTCAAATGGATTTGGCTTCAAGATTTTTTGCTATGAAAAGATCTTTGAAAGAATTTAAAAACGTTCCTGAAGATCCTGCTATTTTGAGATATAAAGAATGGATCCCATTGGAACATCCTACTATTATTAAAGACCACTTAAAAAAAGCAAACGCTATTTATCATACTGATGGTTTGATTATTATGTCAGTTGATGAACCTGTTATTTATGGTAGGAATTTTAATTTGTTCAAATTGAAACCTGGTACACATCATACTATTGATTTTATCATTATGTCTGAAGATGGTACTATTGGTATTTTTGATCCAAATTTGAGAAAAAATGTTCCTGTTGGTAAATTGGATGGATATTATAACAAAGGTTCTATTGTTGAATGTGGTTTTGCTGATGGTACTTGGAAGTACATTCAAGGAAGATCTGATAAAAACCAAGCTAATGATAGGTTAACTTACGAGAAAACATTGTTGAACATTGAGGAAAACATTACTATTGACGAATTGTTGGATTTGTTTAAGTGGGAGCATCACCATCACCATCACCATCATTAA
FAU：
ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCTGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTGAATTCATGGCTAAAAGATTACAAAGATGTCAAGATGTTAATCAAGTCTGTGAGATTTATAATTCTAAAGGTGGTATTGGTGAATTGGAATTGAGATTCGATAAATTGCCACAAAATTTGTTTGCTGGTGTTTTTGATAAATTGAAACCTGATGGTGAAATTCAAACTACTATGAGAGTTTCTAATAGAGATGGAGTTGCTAGAGAAATTACATTTGGTGGTGGAGTCAAAACAAATGAAATTTTTGTTAAGAAACAAAATATTTGTGTTTTTGATGTTGTTGATATTTTTTCTTACAAAGTTGCTGTTTCTACTGAAGAAACTGTTGTTGAAAAACCAACTATGGAAACTACTGCTGGTGTTAGATTTAAAATTAGATTGTCTGTTGAAGATGTTGTTAAAGATTGGAGAATTGATTTGACTGCTGTTAAAACTGCTGAATTGGGTAAAATTGCTCAACATACTGCTTCTATTGTTCAAAGAACTTTTCCTGATAATTTGTTGAAATTAACTGGTGCTGAAGTTGCTAAATTGGCTGCTGATTCTTATGAGTTGGAATTGGAGTATACTGGTAAATCTCCTGCTACTAATGAAAAAGTTAATGTTGCTGCTAAATATGCTGTTGAATTGTTGTCTTCTGTTAGAAATGCTAATTCTACTGCTGCAGCTTCTTTTGGTGAATCTGTTTCTGATTTGTGTAGAGTTGCTAAAATTATTCATACTCATGAATATGCTAATGTTGTTTGTAGAACTCCATCTTTTAAAATGTTGTTGCCACAAGTTGTTTCTTTGACTAAATCTTCTTATTATGGTGGTTTGTATCCACCTGAAAATTTGTGGTTGGCTGGTAAAACTGATGGTGTTAGAGCTTTGGTTGTTTGTGAAGATGGTGTTGCAAAAGTTATTACTGCTGAATCTGTTGATATTACTCATGGTGTTTGTTCTGCAACTACTATCTTGGATTGCGAATTAAATGTTGATGCTAAAATCTTGTATGTTTTCGATGTTATTATTTCTAATAATACTCAAGTTTATACTCAACCATTTTCTACTAGGATTACTACTGATATTTCTGATATTAAAATTGATGGATATAAGATTGAAATGAAGCCATTTGTTAAAGTTGTTAAAGCTGATGAAGCTACTTTTAAATCTGCTTATAAAGCTCCACATAATGAAGGTTTGATTATGATTGAAGATGGTGCTGCTTATGCTGCTACTAAGACTTACAAATGGAAACCATTGTCTCATAACACAATCGATTTTTTAATTAAGGCTTGTCCAAAGCAATTGATTAATGTTGATCCATATAAACCAAGAGCTGGTTATAAATTGTGGTTGTTGTTTACTACTATTTCTTTGGATCAACAAAGAGAATTGGGTATCGAGTTTATCCCTGCTTGGAAAATTTTGTTTACTGATATTAATATGTTTGGTTCAAGAGTTCCAATTCAATTTCAACCTGCTATTAATCCATTGGCTTATGTTTGTTATTTGCCTGAAGATGTTAATGTTAATGATGGTGATATTGTTGAAATGAGAGCTGTTGATGGTTATGATACTATTCCAAAATGGGAATTGGTTAGATCAAGAAATGACAGAAAAAATGAACCTGGTTTCTACGGAAATAATTATAAAATCGCATCTGATATCTACTTGAATTATATTGACGTTTTTCACTTCGAAGATTTGTATAAGTATAACCCTGGTTACTTCGAGAAAAATAAATCTGATATTTACGTCGCTCCAAATAAATATAGAAGGTACTTGATCAAATCTTTGTTTGGTAGATATTTGAGAGATGCTAAATGGGTTATTGATGCTGCAGCTGGTAGAGGTGCTGATTTGCATTTGTATAAAGCTGAATGTGTTGAACATTTGTTGGCTATTGATATTGATCCTACAGCAATTTCTGAATTGGTTAGGAGAAGAAATGAAATCACTGGTTATAATAAATCTCATAGGGGTGGTAGAAATATGCATTCACATAGGGGTCAATCTCATTGTGCTAAATCTACTTCTTTGCATGCTTTGGTTGCTGATTTGAGAGAAAATCCTGATGTTTTGATTCCAAAAATTATTCAATCAAGACCACATGAAAGATGCTATGACGCAATCGTTATCAACTTCGCAATTCATTACTTATGTGACACAGATGAACACATTAGAGATTTTTTGATTACTGTTTCAAGATTGTTGGCTCCAAATGGTGTTTTTATTTTTACTACTATGGATGGTGAATCTATTGTTAAATTGTTGGCTGATCATAAAGTTAGACCTGGTGAAGCTTGGACTATTCATACTGGTGATGTTAATTCTCCTGATTCTACTGTTCCTAAGTATTCTATTAGAAGATTGTATGATTCTGACAAATTGACTAAAACTGGTCAACAAATTGAAGTTTTGTTGCCAATGTCTGGTGAAATGAAAGCAGAACCATTGTGTAATATCAAAAATATCATTTCTATGGCTAGAAAAATGGGTTTGGATTTGGTTGAATCTGCTAATTTTTCTGTTTTGTATGAAGCTTATGCTAGAGATTATCCTGATATTTATGCTAGAATGACTCCTGATGATAAATTGTATAATGATTTGCATACTTACGCTGTTTTTAAAAGAAAAAAAGGTGCTTCTGCTACTTCTCATCACCATCACCATCATCACCATTAA
构建使用的载体为pPICZalpha A。用目标mRNA加帽酶基因序列替换MCS区域，不保留c-Myc。由于pPICZalpha A载体上的His-tag(组氨酸标签)仅为6×His，在后续蛋白表达和修饰过程中可能发生蛋白末端His的剪切，导致残留的His-tag无法与后续的亲和基团结合。因此，构建过程中不保留载体上的His-tag，而是引入自主设计的8×His标签用于后续验证。其中alpha-factor为分泌信号肽，用于分泌目标蛋白。由于P.pastoris X33体内无天然质粒，因此需要用SacI核酸内切酶将构建好的质粒线性化。通过电转化，将线性化的外源基因表达框架整合到P.pastoris X33基因组上，获得包含目标蛋白基因序列的毕赤酵母细胞。
将包含目标蛋白基因序列的毕赤酵母培养72h，离心收集上清液，用超滤管浓缩至1mL。将得到的样品进行SDS-PAGE验证(图1中(a))。从胶图上并未找到明显的目标蛋白条带。造成这种结果的可能原因是异源的mRNA加帽酶在P.pastoris X33中表达量低，即便通过超滤管浓缩后仍无法通过SDS-PAGE检出。由于在构建质粒时引入了自主设计的8×His标签，可以通过Western blot对样品进行进一步表征(图1中(b))。结果仍未发现目标蛋白条带，只有部分杂蛋白的条带。说明异源的mRNA加帽酶并未在P.pastoris X33中实现分泌表达。异源的mRNA加帽酶未成功实现分泌表达的原因可能在于mRNA加帽酶不适合分泌表达，无法成功穿过细胞膜从酵母细胞中分泌到胞外。基于上述猜想，通过PCR和Gibson组装去除已构建质粒中的alpha-factor，获得不包含分泌信号肽的目标质粒。再次用SacI核酸内切酶将构建好的质粒线性化，并通过电转化将其整合到P.pastoris X33基因组上，获得包含目标蛋白基因序列的毕赤酵母细胞。培养72h后离心收集上清液，用超滤管浓缩至1mL。将得到的样品进行SDS-PAGE验证(图1中(c))。分析图中的蛋白条带，并未找到目标mRNA加帽酶的蛋白条带，只有P.pastoris X33细胞内杂蛋白的条带。实验结果说明，在去除分泌信号肽后，异源的mRNA加帽酶仍未在P.pastoris X33细胞内成功表达。造成这一结果的可能原因有两点：一是异源的mRNA加帽酶不适合在P.pastoris X33细胞中进行表达；二是pPICZalpha A载体本身便不适合用于异源的mRNA加帽酶的表达。基于上述的实验结果与结论，异源的mRNA加帽酶需要寻找新的表达宿主进行异源表达。
3、基于大肠杆菌体系的mRNA加帽酶异源表达
细菌作为一类原核生物，具有结构简单、繁殖迅速、种类繁多等特点，目前已经广泛应用在工业生产之中。其中，大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)是目前应用最多最广泛的一种工程菌，常常被用于异源蛋白的表达。大肠杆菌遗传背景清晰，培养条件温和，并且可以简易地导入外源质粒进行扩增与表达。因此，选用实验室储存的BL21(DE3)菌株作为mRNA加帽酶异源表达的宿主细胞。BL21(DE3)菌株是BL21菌株的衍生菌株。BL21是目前应用最广泛的宿主细胞，缺乏lon和ompT蛋白酶，可以提高重组蛋白的产量，通常用于非毒性蛋白的表达。而BL21(DE3)菌株在BL21菌株的基础上整合了编码T7RNA聚合酶的基因，因此可以用于包含T7启动子的质粒载体的表达。
构建的不同来源的mRNA加帽酶基因基于E.coli宿主进行了密码子优化。具体序列如下：
ASF：SEQ ID No.9的第1132-3753位。
BLUE：SEQ ID No.7的第1132-3081位。
RICE：
ATGGGCGGCAGCATGAGCAACCCGGATTATTGCATTCCGAACTTTAGTCAGACCGTGAACGAACGCACCATTATTGATATTTTTACCATTTGCCGCTATCGCAGCCCGCTGGTGGTGTTTTGCCTGAGCCATAACGAACTGGCGAAAAAATATGCGCAAGATGTGAGCATGAGCAGCGGCACCCATGTGCATATTATTGATGGCAGCGTTGAAATTACCGTGAGTCTGTATCGCACCTTTCGCACCATTGCGACGCAGCTGCTGGGCCGCATGCAGATTGTGGTGTTTGTGACCGTGGATAAAAGCGTGGTGAGCACCCAAGTGATGAAAAGCATTGCGTGGGCGTTTCGCGGCAGCTTTGTGGAACTGCGCAATCAGAGCGTGGATAGCAGCACCCTGGTGAGCAAACTGGAAAACCTGGTGAGCTTTGCGCCGCTGTATAACGTGCCGAAATGCGGCCCGGATTATTATGGCCCGACCGTGTATAGCGAACTGCTGAGCTTAGCGACCAACGCGCGCACCCATTGGTATGCGACCATTGATTATAGCATGTTTACCCGCAGCGTGCTGACCGGCTTTGTGGCGAAATATTTTAACGAAGAAGCGGTGCCGATTGATAAACGCATTGTGAGCATTGTGGGCTATAACCCGCCGTATGTGTGGACCTGCCTGCGCCATGGCATTCGCCCGACCTATATTGAAAAAAGCCTGCCGAACCCGGGCGGCAAAGGCCCGTTTGGCCTGATTCTGCCGGTGATTAACGAACTGGTGCTGAAAAGCAAAGTGAAATATGTGATGCATAACCCGCAGATTAAACTGCTGTGCCTGGATACCTTTATGCTGAGCACGAGCATGAACATTCTGTATATTGGCGCGTATCCGGCGACCCATCTGCTGAGTCTGCAGCTGAACGGCTGGACCATTCTGGCGTTTGATCCGAAAATTACGAGCGATTGGACCGATGCGATGGCGAAAGCGACCGGCGCGAAAGTGATTGGCGTGAGCAAAGAATTTGATTTTAAAAGCTTTAGCGTGCAAGCGAATCAGCTGAACATGTTTCAGAACAGCAAACTGAGCGTGATTGATGATACCTGGGTGGAAACCGATTATGAAAAATTTCAGAGCGAAAAACAAGCGTATTTTGAATGGCTGATTGATCGCACGAGCATTGATGTGCGCCTGATTAGCATGAAATGGAACCGCAGCAAAGATACGAGCGTGAGCCATCTGCTGGCGCTGCTGCCGCAGCCGTATGGCGCGAGCATTCGCGAAATGCGCGCGTTTTTTCATAAAAAAGGCGCGAGCGATATTAAAATTCTGGCGGCGGAAACCGAAAAATATATGGATGATTTTACCGCGATGAGCGTGAGCGATCAGATTAACACGCAGAAATTTATGCATTGCATGATTACCACCGTGGGCGATGCGCTGAAAATGGATCTGGATGGCGGCCGCGCGGTGATTGCGAGCTATAGCCTGAGCAACAGCAGCAACAGCAAAGAACGCGTGCTGAAATTTCTGAGCGATGCGAACAAAGCGAAAGCGATGGTGGTGTTTGGCGCGCCGAACACCCATCGCCTGGCGTATGCGAAAAAAGTGGGCCTGGTGCTGGATAGCGCGATTAAAATGAGCAAAGATCTGATTACCTTTAGCAACCCGACCGGCCGCCGCTGGCGCGATTATGGCTATAGTCAGAGCGAACTGTATGATGCGGGCTATGTGGAAATCACGATTGATCAGATGGTGGCGTATAGCAGCGATGTGTATAACGGCGTGGGCTATTTTGCGAACAGCACCTATAACGATCTGTTTAGCTGGTATATTCCGAAATGGTATGTGCATAAACGCATGCTGATGCAAGATATTCGCCTGAGCCCGGCGGCGCTGGTGAAATGCTTTACCACCCTGATTCGCAACATTTGCTATGTGCCGCATGAAACCTATTATCGCTTTCGCGGCATTCTGGTGGATAAATATCTGCGCAGCAAAAACGTGGATCCGAGTCAGTATAGCATCGTGGGCAGTGGCAGCAAAACCTTTACCGTGCTGAGCCATTTTGAAGTGCCACATGAATGTGGTCCGCTGGTGTTTGAAGCGAGCACCGATGTGAACATTAGCGGCCACCTGCTGAGCCTGGCGATTGCGGCGCATTTTGTGGCGAGCCCGATGATTCTGTGGGCGGAACAGATGAAATATATGGCGGTGGATCGCATGCTGCCGCCGAACCTGGATAAAAGCCTGTTTTTTGATAACAAAGTGACCCCGAGCGGCGCGCTGCAGCGCTGGCATAGCCGCGAAGAAGTGCTGCTGGCGGCCGAAATTTGCGAAAGCTATGCGGCGATGATGCTGAACAACAAACATAGCCCGGATATTATTGGCACCCTGAAAAGCGCGATTAACCTGGTGTTTAAAATTCTCGAG
ROT:
ATGAAAGTGCTGGCGCTGCGCCATAGCGTGGCGCAAGTGTATGCGGATACCCAAGTGTATACCCATGATGATAGCAAAGATGAATATGAAAACGCGTTTCTGATTAGCAACCTGACCACCCATAACATTCTGTATCTGAACTATAACGTGAAAACCCTGCAGATTCTGAACAAAAGCGGCATTGCGGCGATTGAAATTCAGAAAATTGATGAACTGTTTACCCTGATTCGCTGCAACTTTACCTATGATTATACCGATGATGTGGTGTATCTGCATGATTATAGCTATTATACCAACAACGAAATCCGCACCGATCAGCATTGGATTACCAAAACCAACATTGAAGATTATCTGCTGCCGGGCTGGAAACTGACCTATGTGGGCTATAACGGCAGCGATACCCGCGGCCATTATAACTTTAGCTTTCGCTGTCAGAACGCGGCGACCGATGACGATGCGATTATTGAATATATTTATAGCGATGAACTGGATTTTCAGAGCTTTATTCTGAAAAAAATTAAAGAACGCATGACCACGAGCCTGCCGATTGCGCGCCTGAGCAACCGCGTGTTTCGCGATAAACTGTTTAAAACCCTGAGCGCGAACCATGATAAAGTGGTGAACATTGGCCCGCGCAACGAAAGCATGTTTACCTTTCTGGATTATCCGAGCATTCGTCAGTTTAGCAACGGCCCGTATCTGGTGAAAGATACCATTAAACTGAAACAAGAACGCTGGCTGGGCAAACGCCTGAGTCAGTTTGATATTGGTCAGTATAAAAACATGCTGAACGTGCTGACCACCCTGTATCAGTATTATAACATTTATCATGAAAAACCGATTGTGTATATGATTGGCAGCGCGCCGAGCTATTGGATTTATGATATTAAACAGTATAGTAACCTGAAATTTGAAACCTGGGATCCGCTGGATACCCCGTATAGCAACCTGCATCATAAGGAACTGTTCTACATCAACGATGTGAAAAAACTGAAAGATAACAGCATTCTGTATATTGATATTCGCACCGACCGCGGCACCGTGGATTGGAAAGAATGGCGCAAAATTGTGGAACGTCAGACCATTGATAACCTGCATATTGCGTATAAATATCTGAGCACCGGTAAAGCGAAAGTGTGCTGCGTGAAAATGACCGCGATGGATCTGGAACTGCCGATTAGCGCGAAACTGCTGCATCATCCGACCACCGAAATTCGCAGCGAATTTTATCTGGTGATGGATATTTGGGATAGCAAAAACATTAAACGCTTTATTCCGAAAGGCGTGCTGTATAGCTATATTAACAACACGATTACCGAAAACGTGTTTATTCAGCAGCCGTTTAAACTGAAAACCCTGAAAAACGAATGCATTATTGCGCTGTATGCGCTGAGCAACGATCTGAACAACCGCGAAGATGTGGTGAAACTGATTAACAATCAGAAAAAAGCGCTGATGACCGTTCGCATTAACAACACCTTTAAAGATGAACCGAAAGTGGGCTTTAAAAACATCTATGATTGGACCTTTCTGCCGACCGATTTTGAAACCAACGGCAGCATTATTACGAGCTATGATGGCTGCCTGGGCATTTTTGGCCTGAGTATCAGTCTGGCGAGCAAACCGACCGGCAACAACCATCTGTTTATTCTGAGCGGCACCGATAAATATTTTAAACTGGATCAGTTTGCGAACCACATGAGCATTAGCCGCCGCAGCCATCAGATTCGCTTTAGCGAAAGCGCGACGAGCTATAGCGGCTATATTTTTCGCGATCTGAGCAACAATAACTTTAACCTGATTGGCACCAACGTGGAAAACAGCGTGAGCGGCCATGTGTATAACGCGCTGATTTATTATCGCTATAACTATAGCTTTGATCTGAAACGCTGGATTTATCTGCATAGCACCGGCAAAGCGAGCATTGAAGGCGGCAAATATTATGAACATGCGCCGATTGAACTGATTTATGCGTGCCGCAGCGCGCGCGAATTTGCGAAACTGCAAGATGATCTGACCGTGCTGCGCTATAGCAACGAAATTGAAAACTATATTAATAAAGTGTATAGCATTACCTATGCGGATGATCCGAACTATTTTATTGGCGTGAAATTTAAAAACATTCCATATAAATATAACGTGAAGGTTCCGCATCTGACCTTTGGCGTGCTGAACATTAGCGAACAGATGCTGCCGGATGTGATTACCATTCTGAAACGCTTTAAAAACGAACTGTTTGGCATGGAAATTACCACGAGCTATACCTATATGCTGAGCGATGAAGTGTATGTGGCGAACATTAGCGGCGTGCTGAGCACCTATTTTAAAATTTATAACGCGTTTTATAAAGAACAGATTACCTTTGGTCAGAGCCGCATGTTTATTCCGCATGTGACCCTGAGCTTTAGCAACGAAAAAACCGTGCGCATTGATACCACCAAACTGTACATTGACAGCATTTATCTGCGCAAAATTAAAGGCGATACCGTGTTTGATATGACCGGCCTCGAG
COW:
ATGGATGCGAACGTGGTGAGCAGTAGCACCATTGCGACCTATATTGATGCGCTGGCGAAAAACGCGAGCGAACTGGAACAGCGCAGCACCGCGTATGAAATTAACAACGAATTAGAACTGGTTTTCATCAAACCGCCGCTGATTACCCTGACCAACGTGGTGAACATTAGCACCATTCAAGAAAGCTTTATTCGCTTTACCGTGACCAACAAAGAAGGCGTGAAAATTCGCACCAAAATTCCGCTGAGCAAAGTGCATGGCCTGGACGTGAAAAACGTGCAGCTGGTGGATGCGATTGATAACATTGTGTGGGAAAAAAAAAGCCTGGTGACCGAAAACCGCCTGCATAAAGAATGCCTGCTGCGCCTGAGCACCGAAGAACGCCATATTTTTCTGGATTATAAAAAATATGGCAGCAGCATTCGCCTGGAGCTGGTGAACCTGATTCAAGCGAAAACCAAAAACTTTACCATTGACTTTAAACTGAAATATTTTCTGGGCAGCGGCGCGCAGAGCAAAAGCAGCCTGCTGCATGCGATTAACCATCCGAAAAGCCGCCCGAACACGAGCCTGGAAATTGAATTTACCCCGCGCGATAACGAAACCGTGCCGTATGATGAACTGATTAAAGAACTGACCACCCTGAGCCGCCATATCTTTATGGCGAGCCCGGAAAACGTGATTCTGAGCCCGCCGATTAACGCGCCGATTAAAACCTTTATGCTGCCGAAACAAGATATTGTGGGCCTGGATCTGGAAAACCTGTATGCGGTGACCAAAACCGATGGCATTCCGATTACCATTCGCGTGACGAGCAACGGCCTGTATTGCTATTTTACCCATCTGGGCTATATTATTCGCTATCCGGTGAAACGCATTATTGATAGCGAAGTGGTTGTTTTCGGCGAAGCGGTGAAAGATAAAAACTGGACCGTGTATCTGATTAAACTGATTGAACCGGTGAACGCGATTAACGATCGCCTGGAAGAAAGCAAATATGTGGAAAGCAAACTGGTGGATATTTGCGATCGCATTGTGTTTAAAAGCAAAAAATATGAAGGCCCGTTTACCACGACGAGCGAAGTGGTGGATATGCTGAGCACCTATCTGCCAAAACAGCCGGAGGGCGTGATTCTGTTTTATAGCAAAGGCCCGAAAAGCAACATTGATTTTAAAATCAAAAAAGAAAACACCATTGATCAGACCGCGAATGTTGTGTTTCGTTATATGAGCAGCGAACCGATTATTTTTGGCGAAAGCAGCATTTTTGTGGAATATAAAAAATTTAGCAACGATAAAGGCTTTCCGAAAGAATATGGCAGCGGCAAAATTGTGCTGTATAACGGCGTGAACTATCTGAACAACATTTATTGCCTGGAGTATATTAACACCCATAACGAAGTGGGCATTAAAAGCGTGGTTGTGCCGATTAAATTTATTGCGGAATTTCTGGTGAACGGCGAAATTCTGAAACCGCGCATTGATAAAACCATGAAATATATTAATAGCGAGGATTATTATGGCAATCAGCATAACATTATTGTGGAACATCTGCGCGATCAGAGCATTAAAATTGGCGATATTTTTAACGAAGATAAACTGAGCGATGTTGGCCATCAGTATGCGAACAACGATAAATTTCGCCTGAACCCGGAAGTGAGCTATTTTACCAACAAACGCACCCGCGGCCCGCTGGGCATTCTGAGCAACTATGTGAAAACCCTGCTGATTAGCATGTATTGCAGCAAAACCTTTCTGGATGATAGCAACAAACGCAAAGTGCTGGCGATTGATTTTGGCAACGGCGCGGACCTGGAAAAATACTTTTATGGCGAAATTGCGCTGCTGGTGGCGACCGATCCGGATGCGGATGCGATTGCGCGCGGCAACGAACGCTATAACAAACTGAACAGCGGCATTAAAACCAAATATTATAAATTTGATTATATTCAAGAAACCATTCGCAGCGATACCTTTGTGAGCAGCGTGCGCGAAGTGTTTTATTTTGGCAAATTTAACATTATTGATTGGCAGTTTGCGATTCATTATAGCTTTCATCCGCGCCATTATGCGACCGTGATGAACAACCTGAGCGAACTGACCGCGAGCGGCGGCAAAGTGCTGATTACCACCATGGATGGCGATAAATTAAGTAAATTAACCGATAAAAAAACCTTTATTATTCATAAAAACCTGCCGAGCAGCGAAAACTATATGAGCGTGGAAAAAATTGCGGATGATCGTATTGTGGTGTATAACCCGAGCACCATGAGCACCCCGATGACCGAATATATTATTAAAAAAAACGATATTGTGCGCGTGTTTAACGAATATGGCTTTGTGCTGGTGGATAACGTGGATTTTGCGACCATTATTGAACGCAGCAAAAAATTTATTAACGGCGCGAGCACCATGGAAGATCGCCCGAGCACCCGCAACTTTTTTGAACTGAACCGCGGCGCGATTAAATGCGAAGGCTTAGATGTGGAAGATCTGCTGAGCTATTATGTGGTGTATGTGTTTAGCAAACGCCTCGAG
CHL：SEQ ID No.10的第1132-2139位。
FAU：SEQ ID No.8的第1132-3786位。
构建使用的载体为pET-21a(+)。用目标mRNA加帽酶基因序列替换MCS区域，5’端酶切位点保留Nde I，3’端酶切位点保留Xho I。保留载体上的His-tag，用于后续的表征与纯化。
将经测序验证正确的构建好的目标质粒(即将上述优化后的mRNA加帽酶基因插入到pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和Xho I之间后得到的重组质粒)化学转化至BL21(DE3)感受态中，并进行诱导表达(在37℃，1mM IPTG诱导2小时)。将诱导表达后的细胞裂解，分别将包含裂解物的全蛋白样品和离心后的上清样品进行SDS-PAGE验证(图2中(a))。从图中全蛋白样品的实验结果可以看出，所有的异源mRNA加帽酶均在BL21(DE3)中成功表达。其中ASF、BLUE、RICE和CHL的蛋白条带颜色较深，说明这四种mRNA加帽酶在BL21(DE3)细胞内表达量较高。ROT、COW和FAU的蛋白条带虽然颜色较浅，但也有一定的表达量。而上清样品的SDS-PAGE结果却显示，只有CHL的蛋白条带颜色较深，其余六种mRNA加帽酶均没有明显的蛋白条带。实验结果说明只有CHL的可溶性较好，其余异源表达的mRNA加帽酶可溶性均不佳。这可能是因为CHL蛋白分子量较小，更容易溶于上清之中。对可溶性不佳的六种mRNA加帽酶的上清样品进行了进一步Western blot验证(图2中b)。一抗为Anti-his TagMonoclonal antibody，EarthOx，LLC，货号：E022020。二抗为HRP AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)，EarthOx，LLC，货号：E030110。从Western blot的结果可以看出，六种mRNA加帽酶均有对应的蛋白条带。表明六种mRNA加帽酶均存在于上清样品中。其中ASF和FAU的蛋白条带较深，说明这两种mRNA加帽酶的溶解度要高于BLUE、RICE、ROT、COW这四种mRNA加帽酶。结合SDS-PAGE和Western blot的实验结果，可以得出以下两个结论：一是异源的mRNA加帽酶可以在BL21(DE3)中成功表达，BL21(DE3)可以作为mRNA加帽酶的异源表达宿主；二是除CHL外，异源表达的mRNA加帽酶虽有表达，但可溶性均不佳。基于上述实验结果，需要进一步提高异源表达的mRNA加帽酶的溶解度。
4、mRNA加帽酶溶解度提高的相关策略
在较低的温度下诱导蛋白表达是常用的提高异源表达蛋白溶解度的方法。因此，第一个使用的提高mRNA加帽酶异源表达溶解度的策略就是低温诱导。相比于原来的诱导条件，低温诱导的温度更低且需要更长的诱导表达时间。原本的诱导条件是在37℃条件下诱导表达2h。这里采用低温诱导的条件是在20℃条件下诱导表达6h。除了诱导温度和时间外，其他操作均同步骤3。将收集到的细胞裂解后对全蛋白样品和上清样品进行SDS-PAGE验证(图3)。图中ASF、BLUE、COW、CHL四种mRNA加帽酶的全蛋白样品有明显的目标蛋白条带，而RICE、ROT和FAU在全蛋白样品中没有出现可以区分的目标蛋白条带。同时，七种mRNA加帽酶的上清样品都没有出现明显的目标蛋白条带。上述实验结果说明，在低温诱导条件下，仅有ASF、BLUE、COW、CHL四种mRNA加帽酶在BL21(DE3)中实现了异源表达。低温诱导的策略并没有提高mRNA加帽酶在异源表达时的溶解度。不仅如此，低温诱导的策略反而抑制了mRNA加帽酶在BL21(DE3)中的表达。造成这一现象的可能原因是20℃条件下，BL21(DE3)中部分酶的活性被抑制，即使延长反应时间也无法实现mRNA加帽酶的异源表达。基于上述结果，需要寻找新的提高mRNA异源表达溶解度的策略。
在目标蛋白端部融合促溶标签也是一种常用的提高蛋白溶解度的策略。这些促溶标签不仅能够提高目标蛋白的溶解度，也可以在后续蛋白纯化过程中作为纯化标签使用。促溶标签通常添加至目标蛋白的N端，通过linker与目标蛋白连接。目前人们已经开发出多种促溶标签用来提高蛋白的溶解度。但这种促溶标签对不同蛋白的促溶效果不尽相同，并且可能会对目标蛋白的活性产生一定的影响。因此，选取四种促溶标签用以探究它们对mRNA加帽酶异源表达的促溶效果(表2)。
表2、促溶标签
| 促溶标签 | 缩写 | 大小 | 来源 |
| Small ubiquitin modified | SUMO | 10.6kDa | Escherichia coli |
| Maltose-binding protein | MBP | 40.3kDa | Homo sapiens |
| Thioredoxin A | TrxA | 11.8kDa | Escherichia coli |
| Glutathione-S-transferase | GST | 25.5kDa | Schistosoma japonicum |
促溶标签的编码核酸序列基于E.coli宿主进行了密码子优化，优化后序列具体如下：
SUMO：
Atggccgacgaaaagcccaaggaaggagtcaagactgagaacaacgatcatattaatttgaaggtggcggggcaggatggttctgtggtgcagtttaagattaagaggcatacaccacttagtaaactaatgaaagcctattgtgaacgacagggattgtcaatgaggcagatcagattccgatttgacgggcaaccaatcaatgaaacagacacacctgcacagttggaaatggaggatgaagatacaattgatgtgttccaacagcagacgggaggt
MBP：
Atgaaaatcgaagaaggtaaactggtaatctggattaacggcgataaaggctataacggtctcgctgaagtcggtaagaaattcgagaaagataccggaattaaagtcaccgttgagcatccggataaactggaagagaaattcccacaggttgcggcaactggcgatggccctgacattatcttctgggcacacgaccgctttggtggctacgctcaatctggcctgttggctgaaatcaccccggacaaagcgttccaggacaagctgtatccgtttacctgggatgccgtacgttacaacggcaagctgattgcttacccgatcgctgttgaagcgttatcgctgatttataacaaagatctgctgccgaacccgccaaaaacctgggaagagatcccggcgctggataaagaactgaaagcgaaaggtaagagcgcgctgatgttcaacctgcaagaaccgtacttcacctggccgctgattgctgctgacgggggttatgcgttcaagtatgaaaacggcaagtacgacattaaagacgtgggcgtggataacgctggcgcgaaagcgggtctgaccttcctggttgacctgattaaaaacaaacacatgaatgcagacaccgattactccatcgcagaagctgcctttaataaaggcgaaacagcgatgaccatcaacggcccgtgggcatggtccaacatcgacaccagcaaagtgaattatggtgtaacggtactgccgaccttcaagggtcaaccatccaaaccgttcgttggcgtgctgagcgcaggtattaacgccgccagtccgaacaaagagctggcaaaagagttcctcgaaaactatctgctgactgatgaaggtctggaagcggttaataaagacaaaccgctgggtgccgtagcgctgaagtcttacgaggaagagttggcgaaagatccacgtattgccgccactatggaaaacgcccagaaaggtgaaatcatgccgaacatcccgcagatgtccgctttctggtatgccgtgcgtactgcggtgatcaacgccgccagcggtcgtcagactgtcgatgaagccctgaaagacgcgcagact
TrxA：
Atgagcgataaaattattcacctgactgacgacagttttgacacggatgtactcaaagcggacggggcgatcctcgtcgatttctgggcagagtggtgcggtccgtgcaaaatgatcgccccgattctggatgaaatcgctgacgaatatcagggcaaactgaccgttgcaaaactgaacatcgatcaaaaccctggcactgcgccgaaatatggcatccgtggtatcccgactctgctgctgttcaaaaacggtgaagtggcggcaaccaaagtgggtgcactgtctaaaggtcagttgaaagagttcctcgacgctaacctggcc
GST：
atgtcccctatactaggttattggaaaattaagggccttgtgcaacccactcgacttcttttggaatatcttgaagaaaaatatgaagagcatttgtatgagcgcgatgaaggtgataaatggcgaaacaaaaagtttgaattgggtttggagtttcccaatcttccttattatattgatggtgatgttaaattaacacagtctatggccatcatacgttatatagctgacaagcacaacatgttgggtggttgtccaaaagagcgtgcagagatttcaatgcttgaaggagcggttttggatattagatacggtgtttcgagaattgcatatagtaaagactttgaaactctcaaagttgattttcttagcaagctacctgaaatgctgaaaatgttcgaagatcgtttatgtcataaaacatatttaaatggtgatcatgtaacccatcctgacttcatgttgtatgacgctcttgatgttgttttatacatggacccaatgtgcctggatgcgttcccaaaattagtttgttttaaaaaacgtattgaagctatcccacaaattgataagtacttgaaatccagcaagtatatagcatggcctttgcagggctggcaagccacgtttggtggtggcgaccatcctccaaaa
促溶蛋白连接至目标蛋白的N端，和目标蛋白之间通过柔性linker(氨基酸序列：GGGGSGGGGS，即SEQ ID No.6；对应核苷酸序列：GGTGGAGGCGGTTCAGGCGGAGGTGGCTCT)连接。保留已构建目标蛋白C端的His-tag，用于后续的表征与纯化。
将经测序验证正确的构建好的质粒(即在pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和XhoI之间插入去掉终止密码子的“促溶标签-柔性linker-加帽酶”编码核苷酸序列后得到的重组质粒)化学转化至BL21(DE3)感受态中，并在37℃条件下，1mM IPTG诱导表达2h。将诱导表达后的细胞裂解，分别将包含裂解物的全蛋白样品和离心后的上清样品进行SDS-PAGE验证(图4)。
图4中(a)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶ASF在全蛋白样品中均有较高的表达量。但在上清样品中，仅有融合了促溶标签MBP的ASF样品出现了较深的蛋白条带，融合了促溶标签SUMO的ASF样品有较浅的蛋白条带，而融合了促溶标签TrxA和GST的ASF样品无明显的蛋白条带。实验结果说明，促溶标签MBP对ASF有较好的促溶效果，促溶标签SUMO对ASF有一定的促溶效果，而促溶标签TrxA和GST对于ASF的促溶效果不明显。
图4中(b)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶BLUE在全蛋白样品中均有较高的表达量。在上清样品中，融合了促溶标签MBP和GST的BLUE样品出现了较浅的蛋白条带，而融合了促溶标签SUMO和TrxA的BLUE样品无明显的蛋白条带。实验结果说明，促溶标签MBP和GST对BLUE有一定的促溶效果，而促溶标签SUMO和TrxA对于BLUE的促溶效果不明显。
图4中(c)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶RICE在全蛋白样品中均有较高的表达量。而在上清样品中，所有的RICE样品均没有明显的目标蛋白条带。实验结果说明，选取的四种促溶标签对RICE的促溶效果均不明显，没有实现RICE溶解度的显著提升。
图4中(d)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签MBP和GST后，mRNA加帽酶ROT的全蛋白样品出现了较浅的蛋白条带，而融合了促溶标签SUMO和TrxA的ROT全蛋白样品没有出现对应的蛋白条带。造成这种结果的可能原因是促溶标签和linker的引入使得翻译过程提前终止，无法获得全长的目标蛋白。也可能是翻译结束后linker断裂，无法获得融合了促溶标签的mRNA加帽酶。
图4中(e)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶COW在全蛋白样品中均有较高的表达量。而在上清样品中，所有的COW样品均没有明显的目标蛋白条带。实验结果说明，选取的四种促溶标签对COW的促溶效果均不明显，没有实现COW溶解度的显著提升。
图4中(f)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶CHL在全蛋白样品中均有较高的表达量。同时，在上清样品中，融合了促溶标签SUMO、MBP和TrxA的CHL样品出现了对应的目标蛋白条带，仅有融合了促溶标签GST的CHL样品无明显的蛋白条带。其中，融合了促溶标签MBP的CHL在上清样品中蛋白条带的灰度与全蛋白样品中蛋白条带的灰度相近，说明融合了促溶标签MBP之后，CHL在BL21(DE3)中已接近完全可溶。由于CHL在不融合促溶标签时的溶解度已经较高，对比之前的实验结果，发现CHL在融合了促溶标签SUMO、TrxA和GST之后溶解度反而下降。实验结果说明，对于分子量偏小的CHL，促溶标签MBP有较好的促溶效果，而促溶标签SUMO、TrxA和GST反而会抑制其溶解。
图4中(g)的SDS-PAGE结果表明，在融合了促溶标签后，mRNA加帽酶FAU在全蛋白样品中均有较高的表达量。而在上清样品中，仅有融合了促溶标签MBP的FAU样品有较浅的蛋白条带，其余上清样品均没有对应的蛋白条带。实验结果说明，仅有促溶标签MBP对FAU有一定的促溶效果，促溶标签SUMO、TrxA和GST对FAU的促溶效果不明显。
综合上述七种mRNA加帽酶的实验结果，可以得出以下结论：一是促溶标签对不同蛋白的促溶效果有较大的差异，并且在部分情况下可能抑制目标蛋白的溶解；二是在选取的四种促溶标签之中，虽然MBP的分子量最大，但其对mRNA加帽酶的促溶效果最好。因此，选取融合了促溶标签MBP(氨基酸序列如SEQ ID No.5所示)且有一定可溶性的mRNA加帽酶ASF、BLUE、CHL和FAU用于后续的加帽效率的测试。
对应四种mRNA加帽酶ASF、BLUE、CHL和FAU，前文构建好的用于表达相应可溶性mRNA加帽酶的重组质粒结构信息具体如下：
用于表达MBP-BLUE的重组质粒，其结构描述为：将SEQ ID No.7所示DNA片段插入到pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和Xho I之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.7的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3081位为编码所述来源于蓝舌病毒(Bluetongue virus)的加帽酶(SEQ IDNo.1)的核苷酸序列。
用于表达MBP-FAU的重组质粒，其结构描述为：将SEQ ID No.8所示DNA片段插入到pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和Xho I之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.8的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3786位为编码所述来源于浮病病毒(Faustovirus)的加帽酶(SEQ ID No.2)的核苷酸序列。
用于表达MBP-ASF的重组质粒，其结构描述为：将SEQ ID No.9所示DNA片段插入到pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和Xho I之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.9的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-3753位为编码所述来源于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)的加帽酶(SEQ ID No.3)的核苷酸序列。
用于表达MBP-CHL的重组质粒，其结构描述为：将SEQ ID No.10所示DNA片段插入到pET-21a(+)载体的酶切位点Nde I和Xho I之间后得到的重组质粒。SEQ ID No.10的第1-1101位为编码所述促溶标签MBP的核苷酸序列，第1102-1131位为编码所述连接肽的核苷酸序列，第1132-2139位为编码所述来源于小球藻病毒(Chlorella virus)的加帽酶(SEQ IDNo.4)的核苷酸序列。
5、野生型牛痘病毒加帽酶的异源表达
为了对比不同病毒来源的mRNA加帽酶的加帽效率，异源表达了目前市面上常用的牛痘病毒加帽酶，即VCE。基于之前的实验经验，选取大肠杆菌BL21(DE3)作为异源表达的宿主细胞。由于VCE由D1(844aa)和D12(287aa)两个亚基组成，使用pRSFDuet-1作为构建的载体(图5中(a))。VCE的编码核苷酸序列基于E.coli宿主进行了密码子优化，优化后的序列如下：
D1:
ATGAAACATCACCATCACCATCACCCCATGAGCGATTACGACATCCCCACTACTGAGAATCTTTATTTTCAGGGCGCCATGGACGCTAATGTCGTGTCTTCTTCTACCATCGCAACCTATATTGACGCTCTGGCAAAAAACGCCTCGGAACTGGAACAACGCTCAACCGCGTATGAAATCAACAATGAACTGGAACTGGTGTTTATCAAACCGCCGCTGATTACGCTGACCAACGTGGTTAATATCAGCACCATTCAGGAATCTTTTATTCGTTTCACGGTTACCAACAAAGAAGGCGTCAAAATCCGCACGAAAATTCCGCTGAGCAAAGTTCATGGTCTGGATGTGAAAAACGTTCAACTGGTCGACGCAATCGATAATATTGTGTGGGAAAAGAAAAGCCTGGTTACCGAAAATCGTCTGCATAAAGAATGCCTGCTGCGTCTGAGCACGGAAGAACGCCACATCTTTCTGGACTATAAAAAATACGGCAGCTCTATCCGCCTGGAACTGGTGAACCTGATCCAGGCTAAAACCAAAAACTTCACGATCGATTTCAAACTGAAATATTTTCTGGGCAGTGGTGCTCAATCCAAAAGTTCCCTGCTGCATGCGATCAACCACCCGAAAAGTCGTCCGAATACCTCCCTGGAAATTGAATTCACCCCGCGCGACAACGAAACGGTGCCGTACGATGAACTGATTAAAGAACTGACCACGCTGTCACGTCATATCTTTATGGCGTCGCCGGAAAACGTTATTCTGAGCCCGCCGATCAATGCCCCGATTAAAACCTTCATGCTGCCGAAACAGGACATTGTTGGCCTGGATCTGGAAAACCTGTATGCGGTCACGAAAACCGATGGTATTCCGATCACCATTCGCGTGACGTCGAATGGCCTGTATTGCTACTTTACCCACCTGGGTTATATTATCCGTTACCCGGTTAAACGCATTATCGACTCCGAAGTCGTGGTTTTCGGCGAAGCGGTCAAAGATAAAAATTGGACCGTGTATCTGATCAAACTGATTGAACCGGTGAACGCCATCAACGATCGTCTGGAAGAATCAAAATACGTGGAATCGAAACTGGTTGACATCTGTGATCGCATCGTTTTCAAAAGCAAAAAATACGAAGGTCCGTTCACCACGACCTCTGAAGTCGTGGATATGCTGAGTACCTATCTGCCGAAACAGCCGGAAGGCGTGATCCTGTTTTACAGCAAAGGTCCGAAATCTAACATCGACTTCAAAATCAAAAAAGAAAACACCATCGATCAAACGGCCAATGTTGTCTTTCGTTATATGTCATCGGAACCGATTATCTTTGGCGAAAGCTCTATCTTCGTGGAATACAAAAAATTCTCGAACGATAAAGGCTTCCCGAAAGAATACGGCAGCGGTAAAATTGTCCTGTATAACGGTGTGAATTACCTGAACAATATCTATTGCCTGGAATACATTAACACCCATAATGAAGTTGGCATTAAATCTGTGGTTGTCCCGATCAAATTTATTGCAGAATTCCTGGTCAACGGTGAAATCCTGAAACCGCGTATTGACAAAACCATGAAATACATCAACAGTGAAGATTACTACGGTAACCAGCATAACATCATCGTGGAACACCTGCGCGACCAATCTATCAAAATCGGCGATATCTTCAACGAAGACAAACTGAGTGATGTCGGTCACCAGTATGCGAACAATGATAAATTTCGTCTGAACCCGGAAGTGTCCTACTTCACCAATAAACGTACGCGCGGCCCGCTGGGTATCCTGTCAAATTATGTCAAAACCCTGCTGATTTCAATGTACTGTTCGAAAACGTTTCTGGATGACAGCAACAAACGCAAAGTTCTGGCCATTGACTTTGGCAATGGTGCAGATCTGGAAAAATATTTCTACGGCGAAATCGCTCTGCTGGTTGCGACCGATCCGGACGCGGATGCCATTGCACGTGGCAACGAACGCTATAACAAACTGAATTCTGGTATCAAAACCAAATACTACAAATTCGACTACATCCAGGAAACCATTCGTAGTGATACGTTCGTGAGTTCCGTTCGCGAAGTCTTTTATTTCGGCAAATTCAACATCATCGATTGGCAATTCGCCATCCATTATTCTTTCCATCCGCGTCACTACGCAACCGTGATGAACAATCTGAGTGAACTGACGGCTTCCGGCGGTAAAGTTCTGATTACGACGATGGATGGTGATAAACTGTCCAAACTGACCGATAAGAAAACCTTCATTATCCACAAAAACCTGCCGTCATCGGAAAACTACATGTCAGTGGAAAAAATCGCCGATGACCGCATTGTGGTTTATAACCCGAGCACGATGTCTACCCCGATGACGGAATACATCATTAAGAAAAACGATATCGTCCGTGTGTTTAATGAATACGGTTTCGTTCTGGTCGACAACGTTGATTTTGCAACCATTATCGAACGCAGCAAAAAATTCATCAATGGCGCTTCCACGATGGAAGATCGTCCGTCAACGCGCAACTTTTTCGAACTGAATCGCGGTGCAATTAAATGTGAAGGTCTGGATGTGGAAGATCTGCTGTCCTATTATGTCGTGTATGTGTTCTCTAAACGCTAA
D12:
ATGGATGAAATCGTCAAAAATATCCGCGAAGGCACGCACGTCCTGCTGCCGTTCTATGAAACCCTGCCGGAACTGAATCTGTCACTGGGCAAATCTCCGCTGCCGAGTCTGGAATATGGTGCAAACTACTTTCTGCAGATTTCTCGTGTGAACGATCTGAATCGCATGCCGACCGACATGCTGAAACTGTTCACGCATGATATCATGCTGCCGGAAAGCGATCTGGACAAAGTCTACGAAATCCTGAAAATCAACTCCGTTAAATACTACGGCCGTTCAACCAAAGCGGATGCCGTGGTTGCAGACCTGTCCGCTCGCAATAAACTGTTTAAACGTGAACGCGATGCTATTAAATCGAACAATCACCTGACCGAAAACAACCTGTACATCAGCGATTACAAAATGCTGACGTTTGACGTGTTCCGTCCGCTGTTCGATTTCGTTAACGAAAAATACTGCATCATCAAACTGCCGACCCTGTTTGGCCGTGGTGTGATTGATACGATGCGCATCTACTGCAGCCTGTTCAAAAATGTCCGCCTGCTGAAATGTGTGTCGGATAGCTGGCTGAAAGACTCTGCGATTATGGTGGCCAGTGACGTTTGTAAGAAAAACCTGGACCTGTTTATGTCCCATGTCAAATCAGTGACCAAAAGCTCTAGTTGGAAAGACGTTAATTCGGTCCAATTTAGCATTCTGAACAATCCGGTTGATACGGAATTCATCAACAAATTCCTGGAATTCTCTAACCGTGTTTACGAAGCACTGTATTACGTCCACAGTCTGCTGTACTCCTCAATGACCTCGGACTCCAAATCCATCGAAAATAAACATCAACGCCGCCTGGTGAAACTGCTGCTGTAA
用D1亚基序列替换MCS1区域，用D12亚基序列替换MCS2区域。保留载体上的His-tag，用于后续的表征与纯化。值得注意的是，不同于之前构建的mRNA加帽酶，这里的His-tag位于D1亚基的N端。这是因为D1亚基需要与D12亚基结合，形成二聚体。如果将His-tag添加至D1亚基C端，会影响二聚体的形成并导致His-tag位于二聚体内部，影响后续的纯化。将经测序验证正确的构建好的质粒化学转化至BL21(DE3)感受态中，并在37℃条件下，1mMIPTG诱导表达4h。将诱导表达后的细胞破碎，并用His-tag重力柱进行纯化。将纯化得到的VCE样品进行SDS-PAGE验证(图5中(b))。从实验结果可以看出，mRNA加帽酶VCE在BL21(DE3)中成功异源表达，且可溶性较好。同时，虽然在设计过程中没有在D12亚基中添加His-tag，但SDS-PAGE结果仍出现了D12亚基的蛋白条带。说明D1亚基与D12亚基成功形成二聚体，并且能够通过His-tag重力柱纯化得到完整的VCE。
二、mRNA加帽表征相关体系的构建
1、T7体外转录体系的构建
在对比mRNA加帽酶的加帽效率之前，需要先构建T7体外转录体系以在体外环境得到未加帽的mRNA。T7体外转录体系主要由T7RNA聚合酶、缓冲溶液和DNA模板组成。其中T7RNA聚合酶是构建T7体外转录体系的关键。实验室原有的制备方式是由大肠杆菌BL21(DE3)表达质粒pAR1219后裂解破碎后透析得到T7RNA聚合酶的粗提物，无法满足T7体外转录体系的需要。因此，需要在原有质粒的基础上添加纯化标签用以纯化T7RNA聚合酶。而His-tag和Strep II是目前较常用的纯化标签。纯化标签His-tag的优势在于能够很好地与纯化柱结合，能够得到大量的目标蛋白。而His-tag的劣势在于特异性较差，纯化后会存在部分杂蛋白残留的情况。纯化标签Strep II的优势在于特异性较好，能够得到纯度较高的目标蛋白。但Strep II劣势在于得到的目标蛋白浓度较低。实验中设计的六种标签如表3。
表3、纯化标签
| 纯化标签 | 连接位点 | 蛋白序列 |
| N8His | N端 | HHHHHHHH |
| N6xHis | N端 | HHHHHH |
| NStrepII | N端 | WSHPQFEK |
| C8xHis | C端 | HHHHHHHH |
| C6xHis | C端 | HHHHHH |
| CStrepII | C端 | WSHPQFEK |
将纯化标签分别设计在T7 RNA聚合酶的N端和C端，以对比纯化标签对T7 RNA聚合酶活性的影响。具体操作如下：
以质粒pAR1219为模板，用PCR将其线性化并引入纯化标签，最后通过Gibson连接反应重新连接，获得包含纯化标签的质粒。所用引物如下(5’-3’)：
N8xHis：
正向引物：5’-gcactaaATGCACCATcatcaccatcaccatcatAACACGATTAACATCGCTAAGAACGA CTTC-3’；
反向引物：5’-gatgATGGTGCATttagtgcctcttccagttagtaaatccggatca-3’。
N6xHis：
正向引物：5’-gcactaaATGcatcaccatcaccatcatAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTC-3’；
反向引物：5’-gatggtgatgCATttagtgcctcttccagttagtaaatccggatca-3’。
NStrepII：
正向引物：5’-TGGTCACATCCGCAATTTGAAAAGAACACGATTAACATCGCTAAGAACGACTTC-3’；
反向引物：5’-CTTTTCAAATTGCGGATGTGACCACATttagtgcctcttccagttagtaaatccg-3’。
C8xHis：
正向引物：5’-CTTCGCGTTCGCGCACCATcatcaccatcaccatcatTAAcgccaaatcaatacgactccgg atcc-3’；
反向引物：5’-ATGATGGTGCGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAG-3’。
C6xHis：
正向引物：5’-CTTCGCGTTCGCGcatcaccatcaccatcatTAAcgccaaatcaatacgactccggatc c-3’；
反向引物：5’-atggtgatgCGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAG-3’。
CStrepII：
正向引物：5’-TGGTCACATCCGCAATTTGAAAAGTAAcgccaaatcaatacgactccgga tcca-3’；
反向引物：5’-CTTTTCAAATTGCGGATGTGACCACGCGAACGCGAAGTCCGACTCTAAG-3’。
将经测序验证正确的构建好的质粒化学转化至BL21(DE3)感受态中进行表达。将收集到的细胞破碎，收集上清并纯化。实验中设计了两种溶液用以透析并储存T7RNA聚合酶(表4)。
表4、T7RNA聚合酶储存溶液组分
将得到的T7RNA聚合酶加入到T7体外转录体系中进行体外转录实验体外转录体系组分如表5所示。
表5、体外转录体系组分
所有组分均保存于-20℃冰箱中。其中5x Transcription Buffer的组分如下：50mM NaCl，40mM MgCl2，10mM spermidine，400mM Tris-HCl，pH 8.0。
模板DNA需在反应前先进行线性化，本发明利用PCR获取线性化的模板DNA。模板DNA需包含T7启动子序列。
模板sfGFP质粒序列：
TCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTCGAGCTCGGTACCTCGCGAATGCATCTAGATTAATACGACTCACTATAGGgttatgataaGCAATGAAAATAAATGTTTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAAGAGACACCGCCGCCACCATGAGAAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGAGTTGTGCCCATCCTGGTGGAACTGGACGGCGACGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTCAGAGGCGAGGGCGAGGGAGACGCCACCAACGGCAAGCTGACACTGAAATTCATCTGCACCACAGGCAAACTGCCAGTGCCTTGGCCTACCCTGGTCACAACACTGACCTACGGCGTGCAATGTTTTGCCAGATACCCTGATCACATGAAACAGCACGACTTCTTCAAGTCTGCCATGCCCGAGGGTTATGTGCAGGAGCGGACCATCAGCTTTAAAGACGACGGAACCTACAAGACCAGAGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAAGATGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAATACAACTTTAACAGCCACAACGTGTACATCACAGCTGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACAATGTGGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGATCACTACCAGCAGAACACCCCTATCGGCGACGGACCTGTGCTCCTGCCTGACAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGTGCTGTCTAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAATTCGTGACCGCCGCTGGCATTACACACGGCATGGACGAGCTGTACAAGCACCACCATCATCACCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAACGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGATCGGATCCCGGGCCCGTCGACTGCAGAGGCCTGCATGCAAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTC
线性化后DNA模板序列：
TAATACGACTCACTATAGGgttatgataaGCAATGAAAATAAATGTTTTACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAAGAGACACCGCCGCCACCATGAGAAAGGGCGAGGAACTGTTCACCGGAGTTGTGCCCATCCTGGTGGAACTGGACGGCGACGTGAATGGCCACAAGTTCAGCGTCAGAGGCGAGGGCGAGGGAGACGCCACCAACGGCAAGCTGACACTGAAATTCATCTGCACCACAGGCAAACTGCCAGTGCCTTGGCCTACCCTGGTCACAACACTGACCTACGGCGTGCAATGTTTTGCCAGATACCCTGATCACATGAAACAGCACGACTTCTTCAAGTCTGCCATGCCCGAGGGTTATGTGCAGGAGCGGACCATCAGCTTTAAAGACGACGGAACCTACAAGACCAGAGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGATACCCTGGTGAATAGAATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAAGATGGCAACATCCTGGGCCACAAGCTGGAATACAACTTTAACAGCCACAACGTGTACATCACAGCTGATAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGCCAACTTCAAGATCCGGCACAATGTGGAAGATGGCAGCGTGCAGCTGGCCGATCACTACCAGCAGAACACCCCTATCGGCGACGGACCTGTGCTCCTGCCTGACAACCACTACCTGTCCACCCAGAGCGTGCTGTCTAAGGACCCCAACGAGAAGCGGGACCACATGGTGCTGCTGGAATTCGTGACCGCCGCTGGCATTACACACGGCATGGACGAGCTGTACAAGCACCACCATCATCACCACTAAGCTCGCTTTCTTGCTGTCCAATTTCTATTAACGGTTCCTTTGTTCCCTAAGTCCAACTACTAAACTGGGGGATATTATGAAGGGCCTTGAGCATCTGGATTCTGCCTAATAAAAAACATTTATTTTCATTGCCTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG
体外转录的具体操作如下。
1)将除T7RNA聚合酶外的组分置于冰上解冻。
2)在RNase-free环境中，按表5混合所有组分。可以根据实验要求适当增加反应体系的规模。
3)静置于37℃中反应2h。若目标mRNA短于300nt，则可将反应时间延长至4h或
16h。
4)在RNase-free环境中，往反应后的25μL溶液中加入1μL DNase I(NEB，货号：
M0303)以降解Template DNA。静置于37℃中反应10～15min。
5)使用试剂盒或者氯化锂沉淀法纯化mRNA，并用Nanodrop测定回收后的浓度。保存在-80℃冰箱中备用。
将转录得到的mRNA进行琼脂糖凝胶电泳(图6)。从琼脂糖凝胶电泳的结果可以看出，溶于PBS溶液的T7RNA聚合酶全部失去了活性，没有转录出目标mRNA。图中残留的条带应为没有被DNase I完全降解的DNA模板。在溶于TSB溶液的几种T7RNA聚合酶之中，仅有融合了纯化标签N8xHis和N6xHis的T7RNA聚合酶表现出了转录活性，在琼脂糖凝胶电泳中出现了对应的mRNA核酸条带。融合了纯化标签NStrepII的T7RNA聚合酶可能是由于浓度过低，经浓缩后仍无法转录出目标mRNA。而融合在T7RNA聚合酶C端的几种纯化标签可能阻碍了T7RNA聚合酶的活性位点，导致T7RNA聚合酶丧失活性。基于上述实验结果，可以得出如下结论：一是PBS溶液不适合于储存T7RNA聚合酶，会导致其活性丧失；二是T7RNA聚合酶的活性位点位于蛋白C端，在C端融合纯化标签会导致其活性丧失。用ImageJ分析N8xHis和N6xHis这两组T7RNA聚合酶转录得到的mRNA核酸条带的灰度，以N8xHis组的灰度为基准，即100％。得到N6xHis组的灰度为108％。说明融合了纯化标签N6xHis的T7RNA聚合酶的活性要略高于融合了纯化标签N8xHis的T7RNA聚合酶。因此，后续实验将在T7体外转录体系中使用融合了纯化标签N6xHis的T7RNA聚合酶。
2、哺乳动物细胞和转染试剂的选择
将含帽结构的mRNA传染进入哺乳动物细胞进行表达，可以通过目标蛋白的表达量反映mRNA的稳定性，从而侧面表征mRNA的加帽效率。因此，需要选择有效的哺乳动物细胞表达体系。人胚胎肾细胞293(HEK293)是目前使用较为广泛的一种哺乳动物细胞，具有易于培养、转染效率高等优势。实验中选取HEK293T和HEK293F用于表达体外转录得到的mRNA。HEK293T和HEK293F均为HEK293的衍生株。其中，HEK293T为半贴壁细胞，用于静置培养；HEK293F为悬浮细胞，用于悬浮培养。实验中使用LipofectamineTM MessengerMAXTMTransfection Reagent(Thermo)，ExpiFectamineTM 293转染试剂盒(Thermo)，Lipo293TM转染试剂(Beyotime)和Sinofection Transfection Reagent(SinoBiological)作为mRNA进入哺乳动物细胞的转染试剂，并测试对比了这些试剂的转染效率(图7中(a))。实验中选择pCMV-C-EGFP作为转染使用的质粒，利用EGFP的荧光特性可以较为容易地观察质粒的转染和表达情况。
对比HEK293T和HEK293F的转染结果(图7中(a))，发现pCMV-C-EGFP在HEK293T中的转染效率要远高于在HEK293F中的转染效率。说明悬浮培养的方式虽然拥有更高的传质效率，但是并没有增强核酸的转染效率。这可能是由于高速振荡的环境不利于转染试剂与细胞膜融合，包裹核酸样品的转染试剂没有足够的反应时间递送进细胞便与细胞分离。因此，贴壁培养的HEK293T更适合用于核酸的转染。从不同转染试剂对HEK293T转染后的流式细胞仪结果(图7中(b))可以看出，Thermo和SinoBiological的转染试剂效果较好，Beyotime的转染试剂效果最差但也有可观的转染效率。而从转染试剂对HEK293F转染后的流式细胞仪结果(图7中(c))可以看出，三种转染试剂的效果均不佳，且SinoBiological的阳离子交换转染试剂几乎没有转染效果。说明基于脂质体递送原理的转染试剂更适合于转染HEK293系列的细胞，而脂质体也是目前市面上最常用的递送试剂。基于上述实验结果，后续将使用HEK293T作为加帽后mRNA的细胞表达体系，并用于对比不同mRNA加帽酶的加帽效率。
三、不同mRNA加帽酶加帽后的mRNA在细胞内的表达量
mRNA翻译的目的蛋白选择超折叠绿色荧光蛋白(Superfolder GreenFluorescent Protein，sfGFP)。因为sfGFP的荧光特性使其在细胞内表达后可以较为容易的观测到表达情况。根据前文构建的T7体外转录体系体外转录得到mRNA。使用纯化后的mRNA加帽酶对mRNA进行加帽。其中，模板sfGFP质粒序列参见前文。
其中，体外转录的具体方法参见前文步骤二1。
体外加帽体系组分如表6所示。
表6、体外加帽体系组分
所有组分均保存于-20℃冰箱中。其中10x Capping Buffer的组分如下：5mM KCl，1mM MgCl2，1mM DTT，40mM Tris-HCl，pH 8.0。
上表的体外加帽体系可以形成帽0结构，若需要形成帽1结构，只需要在上述反应体系中额外加入1μL 2’-O-甲基转移酶(NEB，货号：M0366)。
体外加帽的具体操作如下：
1)将除加帽酶外的组分置于冰上解冻。同时将mRNA样品在65℃下加热5min。加热结束后，将mRNA样品置于冰上5min。
2)在RNase-free环境中，按表2.11混合所有组分。可以根据实验要求适当增加反应体系的规模。
3)静置于37℃中反应30h。若目标mRNA短于300nt，则可将反应时间延长至2h。
4)使用试剂盒或者氯化锂沉淀法纯化mRNA，并用Nanodrop测定回收后的浓度。保存在-80℃冰箱中备用。
根据前文获得的HEK293T细胞表达体系，将加帽后的mRNA转染进细胞进行表达(图8中(a)和(b))。其中，流式细胞仪检测中所使用到的流式细胞仪有BIO-RAD S3eTM CellSorter和BD FACSCalibur。由于流式细胞仪操作均类似，在此仅介绍BD FACSCalibur的具体操作：
1)接通BD FACSCalibur的电源，直至“STNDBY”按钮亮起。查看鞘液槽是否装有足够鞘液，若鞘液不足，需要将鞘液加至鞘液槽容积2/3以上。查看废液槽是否有过多废液，若废液过多，需要将废液倒入实验室流式废液回收桶中。
2)将压力调节杆调至加压状态。观察管路中是否有气泡，若无气泡，可以进行下一步实验。
3)按下“PRIME”按钮预运行流式细胞仪，此时“PRIME”按钮会亮起。结束后“STNDBY”
按钮会自动亮起，“PRIME”按钮自动熄灭。再次按下“PRIME”按钮预运行流式细胞仪重复上述操作。
4)接通电脑电源，启动电脑，打开CELLQuest软件。根据实验需要设定相关参数。在Acquire命令栏中选择Connect to Cytometer。等待流式细胞仪稳定3～5min后
5)放上待检测的样品，按下“RUN”按钮运行流式细胞仪。在软件中选择Aquire收集数据。收集完成后，在软件中选择Save保存数据，并按下流式细胞仪上的“STNDBY”
按钮。
6)若有其它样品，则重复上一步操作。
7)当所有样品均检测完毕，放上75％乙醇，按下“RUN”按钮运行流式细胞仪。10min后，按下“STNDBY”按钮。放上流式洗液，按下“RUN”按钮运行流式细胞仪。10min后，按下“STNDBY”按钮。将压力调节杆调至减压状态。关闭BD FACSCalibur的电源和电脑电源。
8)后续使用FlowJo软件对实验数据进行分析。
图8中(b)为流式结果，将数据处理为柱状图后即为图8中(a)。从图8中(a)可以看出相比于未加帽的mRNA，加帽后的mRNA的表达量有了显著的提升。通过VCE加帽后的mRNA的表达量约为未加帽的mRNA的3倍。说明帽结构能够显著提升mRNA的稳定性和翻译效率，提高mRNA在HEK293T内的蛋白表达量。此外，对比目前通用的VCE与其它mRNA加帽酶的实验结果，可以发现BLUE和FAU在HEK293T内的表达量要高于VCE，约为VCE的1.3倍；而ASF在HEK293T内的表达量与VCE持平；CHL在HEK293T内的表达量要略低于VCE。从实验结果可以得出，BLUE和FAU在体外环境的加帽效果要优于VCE，而ASF和CHL在体外环境的加帽效果与VCE相近。
综合上述实施例结果，可见，本发明从不同病毒来源中筛选了有体内加帽活性的mRNA加帽酶用于体外加帽反应，将这些筛选出的加帽酶在毕赤酵母P.pastoris X33和大肠杆菌BL21(DE3)中尝试了异源表达，并且在大肠杆菌BL21(DE3)中实现了成功表达。为了解决异源表达的mRNA加帽酶溶解度较差的问题，测试了低温诱导表达和融合促溶标签这两种方法。MBP被证明是一种促溶效果较为优秀的促溶标签。与促溶标签MBP融合的mRNA加帽酶成功实现了溶解度的提高。并且，本发明构建了T7体外转录体系，并筛选出基于HEK293T的哺乳动物细胞表达体系用于mRNA的翻译表达。基于上述体系，本发明证明了帽结构能够显著提高mRNA的稳定性和翻译效率。同时，来源于蓝舌病毒Bluetongue virus和浮病病毒Faustovirus的mRNA加帽酶被证明拥有比牛痘病毒加帽酶VCE更高的加帽活性。其中，来源于蓝舌病毒的mRNA加帽酶的活性要比VCE高出38％。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (10)
1.一种制备可溶性mRNA加帽酶的方法，包括如下步骤：
(A1)将融合蛋白的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合蛋白为将促溶标签MBP和来源于病毒的加帽酶通过连接肽融合而成；所述来源于病毒的加帽酶选自如下任一：来源于蓝舌病毒的加帽酶、来源于浮病病毒的加帽酶、来源于非洲猪瘟病毒的加帽酶、来源于小球藻病毒的加帽酶；
(A2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清液中获得所述融合蛋白，即为可溶性mRNA加帽酶。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述融合蛋白自N端到C端由所述促溶标签MBP、所述连接肽和所述源于病毒的加帽酶顺次连接而成；和/或
所述来源于蓝舌病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1的第1-644位或SEQ IDNo.1所示；和/或
所述来源于浮病病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2的第1-879位或SEQ IDNo.2所示；和/或
所述来源于非洲猪瘟病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.3的第1-868位或SEQIDNo.3所示；和/或
所述来源于小球藻病毒的加帽酶的氨基酸序列如SEQ ID No.4的第1-330位或SEQIDNo.4所示；和/或
所述促溶标签MBP的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示；和/或
所述连接肽为柔性连接肽；进一步地，所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述融合蛋白的编码基因为如下任一：
(B1)核苷酸序列如SEQ ID No.7的第1-3063位或SEQ ID No.7所示；
(B2)核苷酸序列如SEQ ID No.8的第1-3768位或SEQ ID No.8所示；
(B3)核苷酸序列如SEQ ID No.9的第1-3735位或SEQ ID No.9所示；
(B4)核苷酸序列如SEQ ID No.10的第1-2121位或SEQ ID No.10所示。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A1)中，所述融合蛋白的编码基因是通过重组载体的形式导入所述大肠杆菌受体细胞中的；
进一步地，所述重组载体为将所述融合蛋白的编码基因插入到pET-21a(+)的多克隆位点处所得；
和/或
所述大肠杆菌受体细胞为大肠杆菌BL21(DE3)。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步骤(A2)中，所述诱导表达的条件为：37℃条件下，1mM IPTG诱导表达2h。
6.利用权利要求1-5中任一所述方法制备得到的可溶性mRNA加帽酶。
7.用于制备权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶的成套产品，包括：
(C1)权利要求4中所述的重组载体；
(C2)权利要求1-4任一中所述的大肠杆菌受体细胞。
8.权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶在对mRNA进行5’端加帽修饰中的应用。
9.一种mRNA体外转录-加帽方法，包括如下步骤：
S1、制备T7 RNA聚合酶，按照包括如下步骤的方法进行：
(a1)将融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶的编码基因导入大肠杆菌受体细胞，得到重组大肠杆菌；所述融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶为在T7 RNA聚合酶的N端融合了6His标签或8His标签；
(a2)对所述重组大肠杆菌进行诱导表达，收集菌体进行裂解，离心后从上清中分离纯化获得T7 RNA聚合酶；
S2、按照权利要求1-5中任一所述方法制备得到mRNA加帽酶；
S3、先采用S1制得的T7 RNA聚合酶进行mRNA体外转录，然后采用S2制得的mRNA加帽酶对体外转录所得mRNA进行5’端加帽修饰。
10.一种用于mRNA体外转录-加帽的成套产品，包括：
(D1)权利要求9中所述融合了纯化标签的T7 RNA聚合酶；
(D2)权利要求6所述可溶性mRNA加帽酶。
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