JP2010119396A - 連続的invitro進化 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規なCIVE法の提供を可能にした。
【選択図】なし
Description
(c)工程(b)で得られた突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質/mRNA複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質/mRNA複合体を選択する工程;及び(d)任意に該複合体からmRNA分子を放出する工程。
第二の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する;
(b)工程(a)で得られた突然変異体mRNA分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするmRNA分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を形成する工程;
(c)工程(b)で得られた突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質/mRNA複合体を選択する工程;
(d)工程(a)で使用された複製可能なmRNA分子が、工程(c)で選択された複合体から得られたmRNAである条件で、工程(a)から(c)を一回以上繰り返す工程;
(e)標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程;及び(f)任意に複合体からmRNA分子を放出または回収する工程。
(i)該DNAのmRNAへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域;
(ii)標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム;並びに(iii)該オープンリーディングフレームの上流に位置するステム−ループ構造。
(i)該DNAのmRNAへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域;
(ii)非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位;並びに(iii)該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列。
(ii)セルフリー翻訳系;
(iii)DNA配向性RNAポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ;
(iv)リボヌクレオシド三リン酸;並びに(v)制限酵素。
興味ある遺伝子が、標準的な遺伝学的方法のいずれかによって非翻訳領域に結合され得ることは、当業者に予測されるであろう。興味ある遺伝子は、遺伝子3’末端までにオープンリーディングフレーム(停止コドンではない)を有するいずれかのヌクレオチド配列を含み、さらに本発明の目的のため、アンカー(スペーシング)配列の末端を含む。
組換えQβレプリカーゼ:発現と精製クローニング及び発現 Qβレプリカーゼコード配列を、T7 RNAポリメラーゼを使用するin vitroでの転写による感染性RNAの調製を可能にするようにデザインされた、つまりファージQβのRNAゲノムのcDNAコピーである、pBR322ベース構築物であるプラスミドpBRT7QβからPCRによって増幅した(Barrera等, 1993に略記されている)。pBRT7Qβの配列は、図6に示されている。ヌクレオチド番号1は、Qβレプリカーゼセンス鎖の第一のヌクレオチドである。Qβレプリカーゼを増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドは、酵素EcoRI及びNotIによる制限酵素切断のための部位をコードし、その配列は図11に示されている。
緩衝液B:0.05M HEPES.Na緩衝液(pH7.0)、1mMメルカプトエタノール、20%v/vグリセリン。
50gの回収された大腸菌を、100mlの0.05M Tris.HCl緩衝液(pH8.7)、1mMメルカプトエタノールで、高速ブレンダーでホモゲナイズした。リゾチーム及びEDTAを、それぞれ100μg/ml及び0.5mMの最終濃度で加え、該溶液を0℃で30分穏やかに攪拌した。12mlの8%デオキシコール酸ナトリウム、0.24mlのフェニルスルホニルフルオリド(プロパノール−2中に20mg/ml)、0.15mlのバシトラシン(10mg/ml)、0.15mlの0.1Mベンズアミジン、3.3mlの10%Triton−X−100を加え、溶液を10mMの最終濃度にMgCl2で調節した。高い粘性を高速度でブレンドすることによって減少した。固体のNaClを、0.5Mの最終濃度で加え、4.8mlの0.3%ポリエチレンイミド(pH8)を攪拌しながら加えた。0℃で20分の攪拌の後、懸濁液を10,000rpmで30分遠心分離した(GSAローター)。上清を5当量のTris.HCl(pH8.7)で希釈した後、1mMメルカプトエタノール、100mlDEAEセルローススラリー(緩衝液Aで平衡化されたWhatman DE52)を加え、0℃で20分ゆっくりと攪拌した。攪拌しないで40分のインキュベーションの後、上清を沈殿物からデキャントし、廃棄した。沈殿物を緩衝液A中に懸濁し、1cmの直径のガラスカラムに注ぎ、400mlのTris.HCl緩衝液(pH8.7)、1mMメルカプトエタノールで洗浄し、250mlの緩衝液A+180mMNaClで溶出し、分画を回収した。該分画を、次の結合アッセイで使用するQβレプリカーゼの存在についてアッセイした。
10μl 2mM ATP10μl 5mM ATP10μl 〜100ng/ml ソラレン−ビオチンラベル化プローブRNA50μl 水 反応混合物を37℃で1分インキュベーションした。
反応混合物を、ナイロン膜、例えばハイボンドNにドットブロットし(酵素Qβレプリカーゼに結合したRNAまたはDNAのみが、膜に維持されるであろう)、12mM MgCl2を含む50mM TrisHCl pH7.4で洗浄し、自動セットでStratalinker中でナイロン膜にUV架橋した。BrightStar Biodetectキットを、ナイロン膜上に付着したビオチニル化核酸の検出のために使用した。図12は、DE52カラムからの溶出分画のアッセイを示す。
真核生物発現ベクターpCDNA3.1中へのQβレプリカーゼのクローニング Qβレプリカーゼコード配列を、真核生物発現ベクターpCDNA3.1(図9)中にクローン化し、pCDNAQβと名付けられたベクターを生産した。このベクターを、結合転写/翻訳系及び付随する標的RNAの複製/突然変異におけるin situでのQβレプリカーゼの発現のために使用した。真核生物発現ベクターpCDNA3.1中のEcoRI及びNotI制限部位内へのクローニングのためのQβレプリカーゼのPCR増幅でのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は、以下のものであった:
No.5352 5'TCTGCAGAATTCGCCGCCACCATGTCTAAGACAGCATCTTCG
No.5350 5'TTTATAATCTGCGGCCGCTTACGCCTCGTGTAGAGACGC
転写のためのDNA鋳型のPCRによる構築 DNA配列を、FTS−1熱シークエンサー(Corbett Research)、PE2400(PerkinElmer)またはRobocylcer勾配96(Stratagene)のいずれかを使用して、製造者の説明書に従ってTaq、Tth、Tfl、PwoまたはPfuポリメラーゼを用いて、標準的かつ十分に記載された方法(特異的にデザインされたオリゴヌクレオチドプライマー、スプライスオーバーラップ伸長、制限酵素切断等を使用するポリメラーゼ連鎖反応(PCR))によって増幅した。使用されるオリゴヌクレオチドプライマーのリストは、図11に示されている。生産物をBresaClean(Bresa)を使用してゲル精製し、または結合転写及び翻訳反応に直接使用した。
a) GCGCGAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACCGCCATGGCC
b) GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGCC
ウサギ網状赤血球溶解物セルフリー系における結合転写/翻訳及びリボソームディスプレー 転写及び翻訳を、0.5mM酢酸マグネシウム、0.02mMメチオニン及び3mM酸化グルタチオン(GSSG)を含むTNT T7結合転写/翻訳系(Promega)を使用して、Siliconized Rnase-フリー0.5mlチューブ(Ambion)で実施し(以下の実施例6参照)、混合物を60℃で90分インキュベーションした。いくつかの反応においては、10mMまでの還元グルタチオンもまた加えた。Qβポリメラーゼを含む反応において、混合物はまた、0.5mMの最終濃度まで塩化マグネシウムを含んだ。転写及び翻訳の後、混合物をPBSで希釈し、DNアーゼIで処理していずれかの残存する開始DNA鋳型を除去した。これは、40mM Tris(pH7.5)、6mM MgCl2、10mM NaCl及びDNアーゼI(Promega)の添加、引き続き30℃でさらに20分のインキュベーションにより達成された。
Dynabeadを使用する抗原に対するリボソーム3成分複合体ディスプレータンパク質の選択 トシル活性化Magneticビーズ(Dynal)を、製造者の説明書に従ってグリコホリンA(GlyA;Sigma)、B型肝炎表面抗原(HepB SA;BiosPacific, Emeryville, CA USA)またはウシ血清アルブミン(BSA;Sigma)に結合した。ストレプタビジン磁性ビーズを使用する場合、これらは製造者の説明書に従って、EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)を使用してビオチニル化されている抗原(上述)に結合された(製造者の説明書に従って)。
酸化及び/または還元グルタチオンを加える効果 in vitro転写及び翻訳の間でより高い割合の正確にホールディングされた生産物を誘導する試みにおいて、各種の濃度の還元または酸化グルタチオンのそれぞれを反応混合物に加えた。これらの反応に使用される鋳型は、抗GlyA T7−scFvであり(上述の通り)、選択をGlyA結合磁性ビーズを使用して実施した。この実験は、回収された生産物の量が、5mMまで増大する濃度の酸化グルタチオンで増加することを示した。10mMまでのさらなる増加は、回収された生産物の収率に有害な効果を有した。約2mMの酸化グルタチオンの濃度が、ほとんどの転写及び翻訳において含まれた。
リボソーム上での突然変異v−ドメイン(CTLA−4)ライブラリーのディスプレー リボソームディスプレーが、ポリペプチドライブラリーから結合エレメントを選択するために使用できることを示すため、CTLA4突然変異体のライブラリーを、定常重鎖ドメインの付加が可能であるプラスミドpGC CH(図7b)にライゲートし、次いでこのライブラリーをプライマーN5659とN5385を使用するPCRによって増幅した(図11)。プライマーN5659を、必要な上流転写及び翻訳開始配列を加えるために使用した。次いでこのPCR DNAを、実施例4に記載された方法を使用する結合セルフリー翻訳系における転写及び翻訳のための鋳型として使用した。突然変異体CTLAリボソーム複合体の結合を示すために、B型肝炎抗原(HBSA)、グリコホリンA(GlyA)及びウシ血清アルブミン(BSA)皮膜Dynabeadを使用してパンニングを実施した。次いで結合複合体に付着したRNAを、RT−PCRによって回収した。パンニング、選択及び回収のために使用された方法は、上記された(実施例5)。
結合転写及び翻訳中にQβレプリカーゼを含ませる効果 生産物の収率の増大、及びin vitro翻訳の間の生産物中の突然変異の速度の増大の両者を試みるために、Qβレプリカーゼ(二つの形態のいずれか)を、反応混合物に加えた。レプリカーゼは、精製レプリカーゼタンパク質、または結合転写/翻訳反応の間に同時に合成できるT7転写プロモーター(pCDNAQβ)の制御の下の遺伝子鋳型のそれぞれとして含まれた。この反応のために使用される鋳型は、再び抗GlyA T7−scFv(上述の通り)であり、選択はGlyA結合磁性ビーズを使用して実施された。これらの実験は、回収されたGlyA反応性生産物の量が、精製Qβレプリカーゼの付加により増大し(Qβレプリカーゼを含まないコントロールに対して)、より少ない量でQβレプリカーゼコードゲノム鋳型(pCDNAQβ)の付加により増大することを示した。
人工的Qβ配列の添加 Qβレプリカーゼ活性の効率を増大する試みにおいて、特異的Qβ結合部位を、PCRによって抗GlyA T7−scFv鋳型の5’および3’末端の両者に加えた。この新しい鋳型(プライマーN5904及びN5910(センス)並びにN5909(アンチセンス)で増幅された;図11)を、精製Qβレプリカーゼタンパク質、または結合転写/翻訳反応の間同時に合成できるT7転写プロモーターの制御の下での遺伝子鋳型としてのいずれかで、Qβレプリカーゼを含む結合転写/翻訳反応において使用した。HepB、GlyAまたはBSA結合磁性ビーズを使用する選択を実施し、生産物をRT−PCRの後に回収した。人工Qβステムループ配列の存在は、(i)結合転写、翻訳及び選択に対して負の影響を有さず、(ii)ほとんどの場合選択の後のRT−PCRによって回収された生産物の量を増大した。
結合転写/翻訳ウサギ網状赤血球系における、Qβレプリカーゼによる抗グリコホリンscFv転写産物の複製 リボソームディスプレーのためのT7−1C3及びT7−4C2 scFv鋳型を、実施例3に記載されたように構築し、以下の条件の下で結合転写/翻訳にかけた。標準的な結合転写/翻訳反応を、Qβレプリカーゼの添加によって修飾した(実施例1に記載されたように精製されたもの)。標準的な20μl反応物において、20μg/mlの酵素の1mlを加えた。以前に我々は、結合系において抗GlyA 1C3 scFvと抗Hepb 4C2 scFvの複製に対するQβレプリカーゼの効果を比較し、1mlのこのサンプルが最適な複製を提供することを観察した。塩化マグネシウムを、0.5mMの最終濃度で加え、これは転写/翻訳因子に対する必要性を減少することが印刷されたレポートに示されている。反応を37℃で2時間継続させた。30℃で20分での40mM Tris−HCl、pH7.5、6mM MgCl2、10mM NaCl中のDNAアーゼI切断によってDNA鋳型を除去した後、複製転写産物をRT−PCRによって分析した。DNAアーゼI及び他のタンパク質を除去するために、標準的なフェノール抽出を使用した。サンプルをエタノール沈降し、RNA沈降物をRNAアーゼを含まない水中に溶解した。各鋳型に特異的なプライマー(実施例3参照)を使用してRNAをRT−PCRでアッセイし、PCR生成物(DNA)をアガロースゲル電気泳動によって比較した。DNAバンドを、エチジウムブロマイドで染色することによって顕視化した。アガロースゲルを、ゲルプロ分析器の商業的なソフトウェアーでデジタル化したイメージをスキャンすることによってデンシトメトリーにかけた。図13は、アガロースゲルのデンシトメータートレースを示し、これから精製Qβレプリカーゼを含むサンプル中で、生産された鋳型の量の増大が存在することが示される。
T7ポリメラーゼ転写産物からの、Qβレプリカーゼによる抗グリコホリンscFv及び抗B型肝炎scFvの複製及び突然変異;Qβレプリカーゼは、RNA依存性RNA複製の間で転写産物を突然変異する。
上述の実施例において記載された結合転写/翻訳反応に、Qβレプリカーゼ精製酵素を補い、T7 DNA依存性RNAポリメラーゼにより転写された抗GlyA 1C3 scFv RNAを複製し突然変異した。転写/複製/突然変異/翻訳インキュベーションに引き続き、サンプルをDNAアーゼIで処理し、この酵素を実施例10に記載されたように除去した。次いで精製RNAを、実施例3に記載された反応において抗GlyA scFv特異的プライマーと共に、RT−PCR反応のための鋳型として使用した。これらの反応で使用された熱安定性ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用される高性能vent, pfuポリメラーゼ酵素の一つである。PCR反応生産物を、上述の商業的に入手可能なキットの一つで精製し、精製DNAを、商業的に入手可能なプラスミドpCRscriptにライゲートし、標準的な分子生物学的方法を使用してコンピーテント大腸菌XL1Blue細胞にトランスフォームした。トランスフォーメーション反応物を、X-galを含むYTアガープレート上に配置した。一晩のインキュベーションの後、コロニー(複数クローニング部位にDNA挿入物を含むプラスミドを有する大腸菌)を拾い、100μg/mlのアンピシリンを含むYTブロスの5ml中で37℃で一晩生育させた。DNAを、製造者の説明書に従って、商業的なキット(Quiagen)で培養物のそれぞれから抽出した。精製DNAを、DNAシークエンシングにより分析した:シークエンシングの結果が図16に記載されている。この表は、突然変異体の数分のサンプリングを表す配列のランダムなサンプル中の突然変異と、全体のQβレプリカーゼ複製/突然変異反応の配列変化を示す。
鋳型RNAの予測二次構造 RNA鋳型についてQβレプリカーゼによって好まれるRNA配列及び推定の二次構造が報告されている(Zamora等, 1995)。これらまたは関連する好ましい構造が、連続的in vitro進化のための鋳型中に存在するかどうかを測定するために、上流非翻訳配列、T7プロモーター配列、1C3遺伝子をコードする配列、定常軽鎖アンカー領域遺伝子、抗hepb 4C2 scFv遺伝子及びIgMヒト定常重鎖アンカー領域遺伝子を、Mfoldプログラムで分析し(Zucker等, 1991)、Qβレプリカーゼが好む構造と比較した(図8に示されている)。この比較から、1C3 scFvは、CLアンカー領域と同様に、QβレプリカーゼのM部位構造を模倣した内部RNA二次構造を有することが同定され、Zamora等, 1995によって報告された好ましい合成配列との類似性が示された。これは、Qβレプリカーゼによる抗Hepb 4C2 scFVCH3のものに対して、GlyA 1C3 scFv CL鋳型の好ましい複製を説明する(実施例3参照)。それ故、この領域をコードするRNAは、Qβレプリカーゼ複製、並びにこの領域とその遺伝学的融合物の関連する突然変異を促進し増大するために、CL領域遺伝子は、結合転写/翻訳ディスプレーといずれかの突然変異誘発のためのディスプレーされた分子に対するアンカー領域として提案される。
pLysN-NS5B(83kDa, pI〜9.05)のための発現プロトコール pLysN-NS5Bは、T7プロモーターを有する細菌(細胞質性)発現ベクターである。NS5Bは、非構造的HepC RNA依存性RNAポリメラーゼである。NS5Bを、Gly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカー、10のHis残基並びにAsp-Asp-Asp-Asp-Lysリンカーが引き続くもの(GSGSGH10D4K)によって分離されたN末端でLysN部分に融合する。
50mM Na-PO4 pH6.8 Na2HPO4 2.32ml
(またはTris pH6.8 NaH2PO4について置換 2.69ml)
100mM NaCl 0.5844g
10%グリセリン 10ml
10mM b−メルカプトエタノール 70μl
0.02% NaN3 80μl
0.25M ショ糖 8.56g
0.1% 界面活性剤(β−オクチルグルコピラノシド) 0.1g
1mM Pefe-Bloc 0.1g
Complete(商標)錠剤(No EDTA) 2錠
H2O 100mlまで
ATP(20mM) 10μl
CTP(20mM) 10μl
GTP(20mM) 10μl
UTP(20mM) 10μl
5×転写緩衝液(400mM HEPES pH7.5、 60mM MgCl2、50mM NaCl) 20μl
1M DTT(1M) 1μl
T7ポリメラーゼ(100U/ml) 1μl
HepC RdRp(NS5B) xμl
ヌクレアーゼを含まない水 yμl
真核生物発現ベクターpCDNA3.1中への、C型肝炎RNA依存性RNAポリメラーゼコード配列のクローニング C型肝炎RNA依存性RNAポリメラーゼコード配列(図10)を、結合転写/翻訳系におけるin situ発現、並びに標的RNAの同時的複製/突然変異のために、ベクターpCDNA3.1(図9)内にクローン化した。真核生物発現ベクターpCDNA3.1中のEcoRI及びNotI制限部位内へのクローニングのための、C型肝炎RNA依存性RNAポリメラーゼのPCR増幅におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下のものである:
5' GTGGTGGAATTCGCCGCCACCTCTATGTCGTACTCTTGGACC
5' GCACGGGCTTGGGCGATAATCCGCCGGCGAGCTCAGATC
Claims (45)
- (a)タンパク質をコードする複製可能なmRNA分子を、RNAのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とRNA配向性RNAポリメラーゼと共にインキュベーションし、RNA配向性RNAポリメラーゼが、突然変異を導入するようにmRNA分子を複製し、それによって突然変異体mRNA分子の集団を生産する工程;
(b)工程(a)で得られた突然変異体mRNA分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするmRNA分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を形成する工程;
(c)工程(b)で得られた突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を標的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質/mRNA複合体を回収することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質/mRNA複合体を選択する工程;及び
(d)任意に該複合体からmRNA分子を放出する工程;
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。 - (a)タンパク質をコードする複製可能なmRNA分子を、RNAのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とRNA配向性RNAポリメラーゼと共にインキュベーションし、RNA配向性RNAポリメラーゼが、突然変異を導入するようにmRNA分子を複製し、それによって突然変異体mRNA分子の集団を生産する工程;
(b)工程(a)で得られた突然変異体mRNA分子を、突然変異体タンパク質の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後に、突然変異体タンパク質をそれをコードするmRNA分子に結合させ、それによって突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を形成する工程;
(c)工程(b)で得られた突然変異体タンパク質/mRNA複合体の集団を標的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質/mRNA複合体を選択する工程;
(d)工程(a)で使用された複製可能なmRNA分子が、工程(c)で選択された複合体から得られたmRNAである条件で、工程(a)から(c)を一回以上繰り返す工程;
(e)標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程;及び
(f)任意に複合体からmRNA分子を放出または回収する工程;
を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法。 - 工程(d)が一回より多く繰り返される、請求項2記載の方法。
- 突然変異体タンパク質が、それをコードするmRNA分子にリボソーム複合体を経て結合される、請求項1から3のいずれか一項記載の方法。
- 工程(a)から(d)が、単一または複数の区画の容器のいずれかにおいて同時に実施され、複数の区画の容器が区画の間で液体の輸送を可能にする、請求項1から4のいずれか一項記載の方法。
- RNA配向性RNAポリメラーゼが、
(i)104塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたRNA分子中に突然変異を導入する;または
(ii)10-4の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する;
請求項1から5のいずれか一項記載の方法。 - RNA配向性RNAポリメラーゼが、
(i)103塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたRNA分子中に突然変異を導入する;または
(ii)10-3の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する;
請求項1から5のいずれか一項記載の方法。 - RNA配向性RNAポリメラーゼが、Qβレプリカーゼ、C型肝炎RNA配向性RNAポリメラーゼ、水疱性口内炎ウイルスRNA配向性RNAポリメラーゼ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ、並びにRNAバクテリオファージファイ6 RNA依存性RNAより成る群から選択される、請求項1から7のいずれか一項記載の方法。
- RNA配向性RNAポリメラーゼが、Qβレプリカーゼである、請求項1から8のいずれか一項記載の方法。
- 翻訳系が、セルフリー翻訳系である、請求項1から9のいずれか一項記載の方法。
- セルフリー翻訳系が、大腸菌由来のS−30抽出物を含む、請求項10記載の方法。
- セルフリー翻訳系が、網状赤血球溶解物を含む、請求項10記載の方法。
- 翻訳系が、0.1mMから10mMの間の全体の濃度で、酸化及び/または還元グルタチオンを含む、請求項1から12のいずれか一項記載の方法。
- グルタチオン濃度が、2mMから7mMの間である、請求項13記載の方法。
- 翻訳系が、約2mMの濃度で酸化グルタチオンを、0.5mMから5mMの間の濃度で還元グルタチオンを含む、請求項13記載の方法。
- 複製可能なmRNA分子が、RQ135 RNA、MDV−1 RNA、ミクロバリアントRNA、ナノバリアントRNA、CT−RNA、及びRQ120 RNAより成る群から選択された鋳型に由来する、請求項1から15のいずれか一項記載の方法。
- 複製可能なmRNA分子が、MDV−1 RNA及びRQ135 RNAから選択された鋳型を含むベクターに由来する、請求項1から16のいずれか一項記載の方法。
- DNA鋳型を転写して、複製可能なmRNAを生産する工程をさらに含む、請求項1から17のいずれか一項記載の方法。
- DNA鋳型が、直線状DNA分子である、請求項18記載の方法。
- DNA鋳型が:
(i)DNAのmRNAへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域;
(ii)標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレーム;並びに
(iii)オープンリーディングフレームの上流に位置するステムループ構造;を含む、請求項18または19記載の方法。 - ステムループ構造が、レプリカーゼ結合配列である、請求項20記載の方法。
- レプリカーゼ結合配列が、15から50ヌクレオチドの長さである、請求項21記載の方法。
- レプリカーゼ結合配列が、20から40ヌクレオチドの長さである、請求項21記載の方法。
- レプリカーゼ結合配列が、Qβレプリカーゼによって認識される、請求項21から23のいずれか一項記載の方法。
- レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項21から24のいずれか一項記載の方法。
- 第二のステムループ構造が、オープンリーディングフレームの下流に含まれる、請求項20から24のいずれか一項記載の方法。
- リボソーム結合部位が、MS2ウイルスから由来する、請求項20から26のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドをコードする配列が、オープンリーディングフレームの3’及びフレーム中に融合される、請求項20から27のいずれか一項記載の方法。
- ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項28記載の方法。
- イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体1C3の定常軽鎖ドメインである、請求項29記載の方法。
- 標的分子が、DNA分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスから選択される、請求項1から30のいずれか一項記載の方法。
- 標的分子が、マトリックスに結合する、請求項1から31のいずれか一項記載の方法。
- マトリックスが、磁性ビーズを含む、請求項32記載の方法。
- (i)DNAのmRNAへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域;
(ii)非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位;並びに
(iii)該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列;
を含む、DNA構築物。 - レプリカーゼ結合配列が、15から50ヌクレオチドの長さである、請求項34記載のDNA構築物。
- レプリカーゼ結合配列が、20から40ヌクレオチドの長さである、請求項35記載のDNA構築物。
- レプリカーゼ結合配列が、Qβレプリカーゼによって認識される、請求項34から36のいずれか一項記載のDNA構築物。
- レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCGの配列を含む、請求項37記載のDNA構築物。
- 第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流に含まれる、請求項34から38のいずれか一項記載のDNA構築物。
- リボソーム結合部位が、MS2ウイルスから由来する、請求項34から39のいずれか一項記載のDNA構築物。
- ポリペプチドをコードする配列が、クローニング部位に対して3’に位置する、請求項34から40のいずれか一項記載のDNA構築物。
- ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求項41記載のDNA構築物。
- イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体1C3の定常軽鎖ドメインである、請求項42記載のDNA構築物。
- 請求項34から43のいずれか一項記載のDNA構築物を含む、複製可能なmRNA転写産物を生産するためのキット。
- (i)RNA配向性RNAポリメラーゼ、好ましくはQβレプリカーゼ、またはRNA配向性RNAポリメラーゼをコードするDNA若しくはRNA鋳型;
(ii)セルフリー翻訳系;
(iii)DNA配向性RNAポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポリメラーゼ;
(iv)リボヌクレオシド三リン酸;並びに
(v)一つ以上の制限酵素;
より成る群から選択される少なくとも一つの構成成分をさらに含む、請求項44記載のキット。
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