CN103108886B - 抗il-23杂二聚体特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本公开提供一种分离或重组IL‑23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域特异地结合IL‑23，但在IL‑12p40亚基和IL‑23p19亚基都不是IL‑23的组分时，不显著地结合IL‑12p40亚基且不显著地结合IL‑23p19亚基。本公开还提供所述IL‑23结合蛋白的用途。

Description

抗IL-23杂二聚体特异性抗体
领域
本公开涉及特异地结合白细胞间介素(IL)-23的蛋白质及其用途。
背景
白细胞间介素(IL)-23通过检索具有白细胞间介素-6螺旋状细胞因子家族成员的计算得出的概况的序列数据库发现。所述检索引导发现了新的细胞因子亚基，其被命名为IL-23p19(p19)，其与IL-12p35亚基同源。所述IL-12p35亚基与IL-12p40亚基二聚以形成IL-12。具有IL-12p40的p19的表达导致分泌被称作IL-23的杂二聚蛋白质。
IL-23的p40亚基具有三个结构域，标记为D1、D2和D3。各个结构域为β-折叠结构，D2组构域含有C177链间双硫键。在D2上还存在N-连接的糖基化部位。
所述p19亚基与IL-12p35类似，因为其含有四螺旋束。然而，相对于IL-12p35来讲，在IL23p19中的截断的螺旋长度和‘tilt’与‘roll’产生改变的足迹。当与IL-12p35比较时，IL-23p19在与IL-12p40相互作用的方式方面也不同。
IL-23对其靶细胞类型的特异性作用由IL-23R复合物介导，所述IL-23R复合物包含IL-12Rβ1和IL-23R。与IL-23结合的IL-12Rβ1经由IL-12p40亚基介导。
IL-23的IL-23p19负责与IL-23R结合，由此赋予IL-23对IL-23R复合物的选择性。
IL-23由活化的人巨噬细胞以及树状细胞分泌。IL-23主要充当记忆T-细胞，且已经假定其经由IL-17A和IL-17F的调节来促进自身免疫疾病，如在鼠脾细胞响应IL-23分泌IL-17的能力中所证明。在人中，存在IL-23/IL-17途径，且已经显示IL-23为IL-21、IL-22、IFN-γ和TNF-α以及IL-17的良好诱导物，它们全部为前发炎性细胞因子。在活体外，IL-6和TGF-β1促进天然T细胞发展到TH17T细胞途径。这些细胞经由IL-21分泌以自分泌方式被进一步驱动。据信IL-23和/或IL-1β维持细胞处于所述TH17响应中。
因为IL-12和IL-23都含有常见的亚基，所以难以将疾病状态仅仅归咎于一种白细胞间介素或另一种白细胞间介素的超量产生。然而，研究指出IL-23失调在牛皮癣、克罗恩氏病(Crohn’s disease)和多发性硬化以及其它自体免疫疾病中牵涉到。
假定在各种病理学状况中涉及到IL-23，则需要对所述细胞因子具有特异性的拮抗剂。然而，难以证明特异性靶向所述细胞因子，因为IL-23的两种亚基与其它二聚细胞因子共用。例如，IL-12p40亚基也是IL-12的组分且IL-23p19也是如zcyto33f2的杂二聚细胞因子的组分，如在US7196172中所述。
概述
本公开的发明人已经生产了如下蛋白质，其特异地结合IL-23、但在其构成部分中的任何一个(IL-12p40或IL-23p19)不是IL-23的一部分时，例如分离形式的IL-12p40或IL-23p19或在其构成部分中的任何一个为另一细胞因子的一部分(例如，IL-12，IL-23和IL-12都包含IL-12p40；或zcyto33f2，其包含IL-23p19)时不特异地结合其构成部分中的任何一个。这种蛋白质不大可能导致抑制共用IL-12p40或IL-23p19亚基的细胞因子的活性的不想要的作用，且因此在治疗中不大可能有“脱靶”作用。此外，所述蛋白质提供例如在诊断/预后中用来检测IL-23的特异性试验的基础。
本公开提供分离或重组IL-23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19都不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。
技术人员从上述内容中将理解，在IL-23结合蛋白中包括所述抗原结合域意味着所述蛋白质也特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19不是IL-23的组分时，所述蛋白质不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。
在一个实施例中，所述抗原结合域特异地结合IL-23的杂二聚界面。
本公开另外或替换地提供分离或重组IL-23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23的杂二聚界面，但当IL-12p40亚基和IL-23p19都不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。
本公开另外或替换地提供分离或重组IL-23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域：
(i)特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基；
(ii)结合IL-23，其中在所述IL-23中的氢已经与氘交换；和
(iii)在与其中的氢已经与氘交换的IL-23结合时，减少在包含SEQ ID NO：2的残基112-144的区域中氘与氢的交换。
在一个实施例中，所述交换减少在统计学上显著。
在一个实施例中，所述交换减少通过测定在交换前后IL-23的区域中氘含量的改变百分数并识别具有比具有最低改变百分数的区域的平均改变大2或2.5或3标准偏差的改变的区域(例如，50％的所试验的区域具有最低改变百分数)来计算。
在一个实施例中，所述抗原结合域减少在包含SEQ ID NO：2的残基91-144的区域或包含包含SEQ ID NO：2的残基91-109和112-144的区域中的交换。
在一个实施例中，所述抗原结合域另外减少在包含SEQ ID NO：1的残基135-153中的交换。根据所述实施例，本公开另外或替换地提供包含抗体的抗原结合域的分离或重组IL-23结合蛋白，其中所述抗原结合域：
(i)特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基；
(ii)结合IL-23，其中在IL-23中的氢已经与氘交换；和
(iii)在与在其中的氢已经与氘交换的IL-23结合时，减少氘与氢在IL-12p40亚基的区域中和在IL-23p19亚基的区域中的交换。
在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白特异地结合IL-23，但不显著地结合分离的IL-12p40亚基且不显著地结合分离的IL-23p19亚基。
在一个实施例中，所述分离的IL-12p40亚基包含另外的序列，例如FLAG标签或抗体的Fc区域。例如，IL-12p40亚基包含与包含SEQ ID NO：17中列出的序列的FLAG标签融合或与抗体的Fc区域融合的在SEQ ID NO：1中列出的序列，所述Fc区域包含SEQ ID NO：16中列出的序列。
在一个实施例中，所述分离的IL-23p19亚基包含另外的序列，例如FLAG标签或抗体的Fc区域。例如，IL-23p19亚基包含与包含SEQ ID NO：17中列出的序列的FLAG标签融合或与抗体的Fc区域融合的在SEQ ID NO：2中列出的序列，所述Fc区域包含SEQ ID NO：16中列出的序列。
在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白特异地结合IL-23，其中IL-23的IL-12p40亚基和IL-23p19亚基包含另外的序列，例如如上所述的FLAG标签或抗体的Fc区域。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白减少IL-23与IL-23受体(IL-23R)的结合，其中IC50为1nM或更低，如750pM或更低，例如500pM或更低。在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白的IC50为400pM或更低。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白减少IL-23与IL-23R的结合，其中IC50在100nM至1nM之间，如在150pM至750pM之间，例如在150pM至500pM之间。在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白的IC50在160pM至400pM之间。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白减少IL-23与IL-23R的结合，其中EC50为1nM或更低，例如750pM或更低，例如500pM或更低，如400pM或更低。在一个实施例中，所述EC50为约300pM或更低。例如，所述EC50为约260pM。
用于测定IL-23与IL-23R的结合的方法对于技术人员将是显而易见的。例如，在一种方法中，固定分离或重组IL-23R或表达IL-23R的细胞。随后使标记的IL-23在存在或不存在疑似减少IL-23与IL-23R的结合的试验蛋白质的情况下与固定的受体或细胞接触并检测结合的标记物的量。当与不存在IL-23结合蛋白的情况相比较时，在存在IL-23结合蛋白的情况下结合的标记物的量的减少指出所述蛋白质减少或防止IL-23与IL-23R结合。通过试验多种浓度的IL-23结合蛋白，测定IC50和/或EC50。
在另一实施例中，本公开的IL-23结合蛋白减少由脾细胞进行的IL-23-诱导的IL-17分泌。在一种方法中，使培养的脾细胞(如小鼠脾细胞)在存在或不存在IL-23结合蛋白的情况下与IL-23接触。在历时使IL-17分泌发生的足够时间之后，例如使用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测IL-17水平。与在不存在所述蛋白质的情况下相比较，在存在所述蛋白质的情况下较低水平的所述细胞因子指出所述蛋白质中和IL-23活性。通过试验多种浓度的所述蛋白质，测定IC50和/或EC50。
在一个实施例中，所述IC50为1μM或更低，例如800μM或更低，例如750μM或更低，如500μM或更低。
在一个实施例中，所述IC50为约1nM或更低，例如800pM或更低。例如所述IC50为700pM或更低。在一个实施例中，所述IC50在约1pM至800pM之间，例如在约100pM至700pM之间，例如在约120pM至680pM之间。
在一个实施例中，所述EC50为1μM或更低，例如800μM或更低，例如750μM或更低，如500μM或更低。
在一个实施例中，所述EC50为1nM或更低，例如500pM或更低，如400pM或更低。在一个实施例中，所述EC50为约300pM或更低。例如，所述EC50为约290pM。
在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白能够特异地结合IL-23且竞争性抑制抗体与IL-23的结合，其中所述抗体包含以下中的任何一个：
(i)包含SEQ ID NO：7中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：12中列出的序列的VL；或
(ii)包含SEQ ID NO：49中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的VL。
用于测定对抗体与IL-23的结合的竞争性抑制的方法如在本文中所述且将加以必要的变更以适于本公开的所述实施例。
例如，IL-23结合蛋白结合与由包含以下中的任何一个的抗体结合的表位相同的表位或与由包含以下中的任何一个的抗体结合的表位重叠的表位：
(i)包含SEQ ID NO：7中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：12中列出的序列的VL；或
(ii)包含SEQ ID NO：49中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的VL。
在一个实施例中，当IL-23p19亚基为IL-23的组分时，本公开的IL-23结合蛋白的抗原结合域特异地结合IL-23的IL-23p19亚基。例如，当IL-23p19亚基为IL-23的在包含SEQ ID NO：2的氨基酸112-144的区域中的组分时，所述抗原结合域特异地结合IL-23的IL-23p19亚基。
在一个实施例中，当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基为IL-23的组分时，本公开的IL-23结合蛋白的抗原结合域特异地结合IL-12p40亚基与IL-23p19亚基两者。例如，所述抗原结合域结合包含彼此在约50埃内、如彼此在40埃内、例如彼此在30埃内的原子的IL-12p40亚基和IL-23p19亚基的区域。在一个实施例中，在所述区域内的原子彼此在约25埃内。例如，所述抗原结合域结合在包含SEQ ID NO：2的氨基酸112-144的区域中的IL-23p19亚基和在包含SEQ ID NO：1的氨基酸135-153的区域中的IL-12p40亚基。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白在至少约1×10-2、如至少约9×10-3、例如至少约8×10-3、例如至少约7×10-3的解离常数(kd)下结合IL-23。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白在至少约1×104、如至少约5×104、例如至少约1×105的缔合常数(ka)下结合IL-23。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白在至少约1×10-7、例如5×10-8、如至少约1×10-8的平衡常数(KD)下结合IL-23。在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白以在约1×10-7至约1×10-9之间、例如在约1×10-7至约1×10-9之间的平衡常数(KD)结合IL-23。
本公开另外或替换地提供包含抗体的抗原结合域的分离或重组IL-23结合蛋白，其包含SEQ ID NO：21至50中的任何一个中列出的氨基酸序列或与其具有至少约80％的同一性的序列或由包含SEQ IDNO：57至77中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度严格的条件下与其杂化的核酸编码的氨基酸序列。
本公开还提供包含抗体的抗原结合域的分离或重组IL-23结合蛋白，其包含SEQ ID NO：26至29、49、50中的任何一个中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO：20或30至33中的任何一个的氨基酸1至120或SEQ ID NO：45或46的氨基酸1-113或与其具有至少约80％的同一性的序列或由包含SEQ ID NO：6、11、57至60、72、73、76或77中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度严格的条件下杂化的核酸编码的氨基酸序列。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白的抗原结合域包含包含SEQ ID NO：7、12、26、27、28、29、49或50中的任何一个中列出的序列的可变区的互补决定区(CDR)3。用于决定CDR的示例性编号方案在本领域中已知且可使用那些系统中的任一种来决定本公开的IL-23结合蛋白的CDR。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含根据Kabat编号系统定义且包含SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：56中列出的序列的CDR3。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含根据加强的Chothia编号系统定义且包含在图7A至图7F中的任何一个中标记为“CDR3”并以粗体文字显示的序列的CDR3。
在本公开的一些实施例中，所述抗原结合域为包含抗体可变区，所述抗体可变区包含SEQ ID NO：26、27、28、29、49或50中的任何一个中列出的氨基酸序列的可变区的三个CDR。
例如，所述抗原结合域为包含SEQ ID NO：26、27、28、29或49中的任何一个中列出的氨基酸序列的三个CDR的VH。在一个实施例中，所述VH包含包含SEQ ID NO：7中列出的序列的可变区的三个CDR。在一个实施例中，所述VH包含包含SEQ ID NO：33中列出的序列的可变区的三个CDR。在一个实施例中，所述VH包含包含SEQ ID NO：49中列出的序列的可变区的三个CDR。在一个实施例中，所述CDR根据Kabat编号系统定义。例如，所述IL-23结合蛋白包含包括如下CDR的VH：
(i)包含SEQ ID NO：8或51中列出的氨基酸序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR1并加下划线的序列)的CDR1；
(ii)任选包含SEQ ID NO：9、22、24或52中的任何一个中列出的氨基酸序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR2并加下划线的序列)的CDR2，其中所述CDR2氨基酸序列的五个C-端氨基酸中的任何一个或多个被任何其它天然存在的氨基酸取代；和
(iii)包含SEQ ID NO：10或53中列出的氨基酸序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR3并加下划线的序列)的CDR3。
在另一实施例中，所述CDR根据加强的Chothia编号系统定义。例如，所述VH包括如下CDR：
(i)包含在图7A、图7B或图7E中标记为CDR1并以粗体文字显示的氨基酸序列或包含SEQ ID NO：23或25中列出的氨基酸序列的CDR1；
(ii)包含在图7A、图7B或图7E中标记为CDR2并以粗体文字显示的氨基酸序列的CDR2；和
(iii)包含在图7A、图7B或图7E中标记为CDR3并以粗体文字显示的氨基酸序列的CDR3。
在另一实施例中，所述抗原结合域为包含SEQ ID NO：27、29或50中的任何一个中列出的氨基酸序列的三个CDR的VL。在一个实施例中，所述VL包含包含SEQ ID NO：12中列出的序列的可变区的三个CDR。在一个实施例中，所述VL包含包含SEQ ID NO：50中列出的序列的可变区的三个CDR。
在一个实施例中，所述CDR根据Kabat编号系统定义。例如，所述IL-23结合蛋白包含包括如下CDR的VL：
(i)包含SEQ ID NO：13或54中列出的氨基酸序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR1并加下划线的序列)的CDR1；
(ii)包含SEQ ID NO：14或55中列出的氨基酸序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR2并加下划线的序列)的CDR2；和
(iii)包含SEQ ID NO：15或56中列出的氨基酸序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR3并加下划线的序列)的CDR3。
在另一实施例中，所述CDR根据加强的Chothia编号系统定义。例如，所述VL包括如下CDR：
(i)包含在图7C、图7D或图7F中标记为CDR1并以粗体文字显示的氨基酸序列的CDR1；
(ii)包含在图7B中标记为CDR2并以粗体文字显示的氨基酸序列的CDR2；和
(iii)包含在图7B中标记为CDR3并以粗体文字显示的氨基酸序列的CDR3。
在一个实施例中，所述抗原结合域包含VH和VL，其各自包含例如如上所述的三个CDR。
在一个实施例中，所述抗原结合域包含以下可变区对之一的六个CDR：
(i)包含SEQ ID NO：26中列出的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：27中列出的序列的轻链可变区(VL)；
(ii)包含SEQ ID NO：28中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：29中列出的序列的VL；或
(iii)包含SEQ ID NO：49中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的VL。
例如，所述抗原结合域包含：
(i)包含SEQ ID NO：8或51中的任何一个中列出的序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR1并加下划线的序列)的重链CDR1；
(ii)任选包含SEQ ID NO：9、22或52中的任何一个中列出的序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR2的序列并加下划线的序列)的重链CDR2，其中所述CDR2氨基酸序列的五个C-端氨基酸中的任何一个或多个被任何其它天然存在的氨基酸取代；
(iii)包含SEQ ID NO：10或53中的任何一个中列出的序列(或在图7A、图7B或图7E中标记为CDR3并加下划线的序列)的重链CDR3；
(iv)包含SEQ ID NO：13或54中的任何一个中列出的序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR1并加下划线的序列)的轻链CDR1；
(v)包含SEQ ID NO：14或55中的任何一个中列出的序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR2并加下划线的序列)的轻链CDR2；和
(vi)和包含SEQ ID NO：15或56中的任何一个中列出的序列(或在图7C、图7D或图7F中标记为CDR3并加下划线的序列)的轻链CDR3。
本公开的示例性IL-23结合蛋白包含抗原结合域，所述抗原结合域包含包含SEQ ID NO：26、28或49中的任何一个中列出的氨基酸序列的VH。例如，所述VH包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：49中的任何一个中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO：30至44中任何一个的氨基酸1-120或与上述序列中的任何一个具有至少约80％的同一性的序列。在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：49中的任何一个中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO：30至33中任何一个的氨基酸1-120。
在另一实施例中，所述VH包含由包含SEQ ID NO：6、19、57至71、76中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度杂化条件下与其杂化的核酸编码的氨基酸序列。在一个实施例中，所述VH包含由包含SEQ ID NO：6、19、57至60、76中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度杂化条件下与其杂化的核酸编码的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：28中列出的序列。在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：30的氨基酸1-120中列出的序列。在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：31的氨基酸1-120中列出的序列。在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：32的氨基酸1-120中列出的序列。在一个实施例中，所述VH包含SEQ IDNO：33的氨基酸1-120中列出的序列。
在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：49中列出的序列。
在一个实施例中，所述VH包含SEQ ID NO：7中列出的序列或其人源化、脱免疫化或同人源化(synhumanized)形式。
本公开的示例性IL-23结合蛋白包含抗原结合域，所述抗原结合域包含包含SEQ ID NO：27、29或50中的任何一个中列出的氨基酸序列的VL。例如，所述VL包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：50中的任何一个中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO：45至48中任何一个的氨基酸1-113或与上述序列中的任何一个具有至少约80％的同一性的序列。例如，所述VL包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：50中的任何一个中列出的氨基酸序列或SEQ ID NO：45或46的氨基酸1-113或与上述序列中的任何一个具有至少约80％的同一性的序列。
在另一实施例中，所述VL包含由包含SEQ ID NO：11、18、72至75或77中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度杂化条件下与其杂化的核酸编码的氨基酸序列。在另一实施例中，所述VL包含由包含SEQ ID NO：11、18、72、73或77中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列的核酸或在中等至高度杂化条件下与其杂化的核酸编码的氨基酸序列。
在一个实施例中，所述VL包含SEQ ID NO：29中列出的序列。例如，所述VL包含SEQ ID NO：45中列出的序列。例如，所述VL包含SEQ ID NO：46中列出的序列。
在一个实施例中，所述VL包含SEQ ID NO：50中列出的序列。
在一个实施例中，所述VL包含SEQ ID NO：11中列出的序列或其人源化、脱免疫化或同人源化形式。
示例性IL-23结合蛋白包含VH和VL，其中所述VH与所述VL结合以形成包含所述抗原结合域的Fv。
示例性IL-23结合蛋白包含：
(i)包含包含SEQ ID NO：26中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VH和包含包含SEQ ID NO：27中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VL；
(ii)包含包含SEQ ID NO：28中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VH和包含包含SEQ ID NO：29中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VL；或
(iii)包含包含SEQ ID NO：49中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VH和包含包含SEQ ID NO：50中列出的序列的可变区的CDR1、CDR2和CDR3的VL。
根据Kabat编号系统或加强的Chothia编号系统定义的在这些序列中的CDR如在本文中所述且将加以必要的变更以适于本公开的所述实施例。
在本公开的一种示例性形式中，IL-23结合蛋白包含：
(i)包含具有在SEQ ID NO：8中列出的序列的CDR1、具有在SEQ ID NO：9或22中列出的序列CDR2和在SEQ ID NO：10中列出的序列的CDR3的VH；和
(ii)包含具有在SEQ ID NO：13中列出的序列的CDR1、具有在SEQ ID NO：14中列出的序列CDR2和在SEQ ID NO：15中列出的序列的CDR3的VL。
在本公开的另一示例性形式中，IL-23结合蛋白包含：
(i)包含具有在SEQ ID NO：51中列出的序列的CDR1、具有在SEQ ID NO：52中列出的序列CDR2和在SEQ ID NO：53中列出的序列的CDR3的VH；和
(ii)包含具有在SEQ ID NO：54中列出的序列的CDR1、具有在SEQ ID NO：55中列出的序列CDR2和在SEQ ID NO：56中列出的序列的CDR3的VL。
在一些IL-23结合蛋白中，所述VH和所述VL处于单一多肽链中。所述IL-23结合蛋白的示例性形式包括：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(di-scFv)；或
(iii)与恒定区、Fc或重链恒定域(CH)2和/或CH3连接的(i)和/或(ii)中的至少一种。
其它示例性IL-23结合蛋白包含处于单独多肽链中的VL和VH。所述IL-23结合蛋白的示例性形式包括：
(i)二抗；
(ii)三抗；
(iii)四抗；
(iV)Fab；
(V)F(ab’)2；
(vi)Fv；或
(iv)与恒定区、Fc或重链恒定域(CH)2和/或CH3连接的(i)-(iii)之一。
本公开的IL-23结合蛋白的实例为抗体。
本公开的一些示例性IL-23结合蛋白为嵌合的、脱免疫的、人源化的、灵长类化的、同人源化或人的。
在一个实施例中，本公开提供包含抗原结合域的抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗原结合域包含包含SEQ ID NO：26、28或49中列出的序列的VH和/或包含SEQ ID NO：27、29或50中的任何一个中列出的序列的VL。例如，所述抗体包含：
(i)包含SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：49中的任何一个中列出的序列或SEQ ID NO：30至44中任何一个的氨基酸1-120或与上述序列中的任何一个具有至少约80％的同一性的序列的VH；和/或
(ii)包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：50中的任何一个列出的序列或SEQ ID NO：45至48中任何一个的氨基酸1-113或与上述序列中的任何一个具有至少约80％的同一性的序列的VL。
在一个实施例中，本公开提供包含抗原结合域的抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗原结合域包含：
(i)包含SEQ ID NO：26中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：27中列出的序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO：28中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：29中列出的序列的VL；或
(iii)包含SEQ ID NO：49中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的VL。
在一个实施例中，本公开提供包含抗原结合域的人源化抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗原结合域包含包含SEQID NO：28中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：29中列出的序列的VL。
在一个实施例中，所述人源化抗体的抗原结合域包含：
(i)包含SEQ ID NO：30的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO：31的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO：32的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(iv)包含SEQ ID NO：33的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(v)包含SEQ ID NO：34的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(vi)包含SEQ ID NO：35的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(vii)包含SEQ ID NO：33的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(viii)包含SEQ ID NO：34的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(ix)包含SEQ ID NO：32的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(x)包含SEQ ID NO：36的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xi)包含SEQ ID NO：37的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xiii)包含SEQ ID NO：39的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xiv)包含SEQ ID NO：40的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xv)包含SEQ ID NO：41的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xvi)包含SEQ ID NO：42的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xvii)包含SEQ ID NO：43的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xviii)包含SEQ ID NO：38的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xix)包含SEQ ID NO：39的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xx)包含SEQ ID NO：44的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：47的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(xxi)包含SEQ ID NO：41的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL；或
(xxii)包含SEQ ID NO：42的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：48的氨基酸1-113中列出的序列的VL。
在一个实施例中，本公开提供包含抗原结合域的人源化抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基都不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗原结合域包含：
(i)包含SEQ ID NO：30的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(ii)包含SEQ ID NO：31的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：45的氨基酸1-113中列出的序列的VL；
(iii)包含SEQ ID NO：32的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL；或
(iv)包含SEQ ID NO：33的氨基酸1-120中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：46的氨基酸1-113中列出的序列的VL。
本公开还提供包含抗体的抗原结合域的人抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗体抗原结合域包含包含SEQ ID NO：49中列出的序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的轻链可变区(VL)。
本公开的IL-23结合蛋白的一种示例性形式为嵌合抗体，所述嵌合抗体包含与包含SEQ ID NO：3或16中列出的序列的恒定区连接的包含SEQ ID NO：7中列出的序列的VH和与包含SEQ ID NO：4中列出的序列的恒定区连接的包含SEQ ID NO：12中列出的序列的VL。在一个实施例中，所述嵌合抗体包含包含SEQ ID NO：20中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：21中列出的序列的轻链。
本公开另外提供包含抗原结合域的单克隆抗体，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，所述抗体抗原结合域包含包含SEQ ID NO：7中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：12中列出的序列的VL，或所述单克隆抗体的嵌合、脱免疫、同人源化或人源化形式。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含选自由IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgD、IgE和IgA组成的组的人或非人灵长类免疫球蛋白重链恒定区。示例性免疫球蛋白重链恒定区为IgG恒定区，例如IgGl恒定区。在一个实施例中，恒定区包含SEQ ID NO：3或16中列出的序列。
在另一实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含选自由κ或λ组成的组的人或非人灵长类免疫球蛋白轻链恒定区。在一个实施例中，κ轻链恒定区包含SEQ ID NO：4中列出的序列。在一个实施例中，λ轻链恒定区包含SEQ ID NO：83中列出的序列。
在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白中和IL-23活性。
在一个实施例中，所述IL-23结合蛋白与选自由以下各物组成的组的化合物偶联：放射性同位素、可检测的标记物、治疗化合物、胶体、毒素、核酸、肽、蛋白质、增加蛋白质在受试者中的半衰期的化合物及其混合物。
本公开还提供编码本公开的IL-23结合蛋白的核酸。在这方面，本公开不限于本文所述的具体例示的核酸，而是涵盖由于遗传密码的简并而编码本公开的IL-23结合蛋白的任何核酸。例如，所述核酸可被密码子优化以在特定的细胞类型中表达。
在一个实施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：6、11、18、19或57至77中的任何一个中列出的序列或与其具有至少约80％的同一性的序列或在中等至高度严格的条件下与其杂化的序列。在一个实施例中，所述核酸包含SEQ ID NO：6、11、18、19、57至60、72、73、76或77中的任何一个中列出的序列、与其具有至少约80％的同一性的序列或在中等至高度严格的条件下与其杂化的序列。
在一个实施例中，所述核酸包括在其中所述核酸操作性地连接到启动子的表达构建体中。所述表达构建体可在载体中，例如在质粒中。
在涉及单一多肽IL-23结合蛋白的本公开的实施例中，所述表达构建体可包含与编码多肽链的核酸连接的启动子。
在涉及形成IL-23结合蛋白的多种多肽的实施例中，本公开的表达构建体包含编码操作性地连接启动子的多肽(例如，包含VH)之一的核酸和编码操作性地连接启动子的另一种多肽(例如，包含VL)的核酸。
在另一实施例中，所述表达构建体为双顺反子表达构建体，例如，包含以5’至3’顺序的以下操作性地连接的组分：
(i)启动子；
(ii)编码第一多肽的核酸；
(iii)内部核糖体进入部位；和
(iv)编码第二多肽的核酸。
例如，所述第一多肽包含VH且所述第二多肽包含VL，或者所述第一多肽包含VL且所述第二多肽包含VH。
本公开还涵盖分离的表达构建体，其中的一种编码第一多肽(例如，包含VH)，且其中的另一种编码第二多肽(例如，包含VL)。例如，本公开还提供一种组合物，其包含：
(i)包含编码多肽(例如，包含操作性地连接启动子的VH)的核酸的第一表达构建体；和
(ii)包含编码多肽(例如，包含操作性地连接启动子的VL)的核酸的第二表达构建体，
其中所述第一多肽与所述第二多肽缔合以形成本公开的IL-23结合蛋白。
本公开还提供表达本公开的IL-23结合蛋白的离体细胞或被遗传修饰以表达本公开的IL-23结合蛋白的重组细胞。
在一个实施例中，所述细胞包含本公开的表达构建体或：
(i)包含编码操作性地连接启动子的多肽(例如，包含VH)的核酸的第一表达构建体；和
(ii)包含编码操作性地连接启动子的多肽(例如，包含VL)的核酸的第二表达构建体，
其中所述第一多肽与所述第二多肽缔合以形成本公开的IL-23结合蛋白。
本公开的细胞的实例包括细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
本公开另外提供生产本公开的IL-23结合蛋白的方法。例如，所述方法包括在足以制备所述IL-23结合蛋白的条件下维持本公开的表达构建体。
在一个实施例中，生产本公开的IL-23结合蛋白的方法包括在足以生产且任选分泌所述IL-23结合蛋白的条件下培养本公开的细胞。
在一个实施例中，用于生产本公开的IL-23结合蛋白的所述方法另外包括分离所述IL-23结合蛋白。
本公开还提供一种包含本公开的IL-23结合蛋白和合适的载体或稀释剂的组合物。在一个实施例中，所述载体或稀释剂为药学上可接受的。
本公开另外提供治疗或预防在细胞、组织、器官或受试者中的IL-23-介导的病状的症状的方法，所述方法包括向所述细胞、组织、器官或受试者施用本公开的IL-23结合蛋白或编码其的核酸或表达其的细胞或本公开的组合物。
本公开还提供本公开的IL-23结合蛋白或本公开的组合物在医学中的用途。
本公开另外或替换地提供本公开的IL-23结合蛋白在制造用于治疗IL-23-介导的病状的药物中的用途。
在一个实施例中，所述病状为TH17细胞介导的病状。
在一个实施例中，所述病状为炎性病状或自体免疫病状。
例如，所述病状为牛皮癣、克罗恩氏病或多发性硬化。在一种示例性形式中，所述病状为牛皮癣。
本公开还提供在牛皮癣或克罗恩氏病或多发性硬化的治疗中使用的本公开的IL-23结合蛋白、抗体、组合物。
本公开另外提供用于检测在样品中的IL-23的方法，所述方法包括使样品与本公开的IL-23结合蛋白接触以使得抗原-蛋白质复合物形成，和检测所述复合物，其中检测到所述复合物指示出在所述样品中的IL-23。
在一个实施例中，所述方法包括使样品与本公开的IL-23结合蛋白接触，本公开的IL-23结合蛋白固定在固态或半固态底物上以使得蛋白质-抗原复合物形成，和检测所述复合物。在一些实施例中，检测所述复合物包括使所述复合物与包含抗体的抗原结合域的第二蛋白质接触，所述第二蛋白质在与本公开的IL-23结合蛋白不同的部位处结合IL-23和/或IL-23p19和/或IL-12p40，和检测所述第二蛋白质。
例如，所述第二蛋白质用可检测的标记物标记。或者，使用结合所述第二蛋白质的另一标记的蛋白质。
在另一实施例中，所述方法包括：
(i)使样品与包含在与本公开的IL-23结合蛋白不同的部位处结合IL-23和/或IL-23p19和/或IL-12p40的抗体的抗原结合域的蛋白质接触，所述蛋白质固定在固态或半固态底物上以使得蛋白质-抗原复合物形成；和
(ii)通过使所述复合物与本公开的IL-23结合蛋白接触来检测所述复合物并检测本公开的IL-23结合蛋白。
例如，本公开的IL-23结合蛋白用可检测的标记物标记。或者，使用结合本公开的IL-23结合蛋白的另一标记的蛋白质。
本公开还提供诊断或预后受试者的病状的方法，所述方法包括进行本公开的方法以检测在来自所述受试者的样品中的IL-23，其中在所述样品中的IL-23的检测显示出所述病状。
在一个实施例中，所述方法包括测定在所述样品中IL-23的水平，其中与对照样品相比较，在所述样品中增加或降低的IL-23水平指示出所述病状。
示例性病状如在本文中所述且将加以必要的变更以适合本公开的所述实施例。
特异地结合IL-23的能力还容许成像应用，例如以诊断或预后病状。因此，本公开另外提供用于定位和/或检测在受试者中的IL-23的方法，所述方法包括体内检测与IL-23结合的本公开的IL-23结合蛋白或抗体(如果存在的话)，其中所述IL-23结合蛋白或抗体与可检测的标记物偶联。在一个实施例中，所述方法另外包括施用向所述受试者施用所述IL-23结合蛋白或抗体。
附图简述
图1包括显示嵌合抗体E11E7Chimera对IL-23的特异性的一系列示意图。画面A显示E11E7Chimera对人IL-23的反应性。画面B显示E11E7Chimera对人IL-23p19-Fc融合蛋白的反应性。画面C显示E11E7Chimera对人IL-12p40-Fc融合蛋白的反应性。画面D显示E11E7Chimera对小鼠IL-23的反应性。
图2为显示在氢/氘交换实验期间通过E11E7结合保护的IL-23的区域的位置的示意图。黑色原子代表在IL-23p19上的氨基酸，证明横跨重叠肽的高氘差异％。灰色原子代表在IL-12p40上的氨基酸，证明横跨重叠肽的高氘差异％。值(25.867为在IL-23p19和IL-12p40中的区域的一些原子之间的距离(埃))。
图3为显示如所指出通过E11E7Chimera或抗IL-12-p40抗体引起的对IL-23与IL-23受体(IL-23R)的结合的抑制的示意图。
图4为显示对由小鼠脾细胞进行的IL-23-诱导的IL-17分泌的E11E7或E11E7Chimera-介导的中和的示意图。值表示为与在缺乏抗体的情况下由小鼠脾细胞进行的IL-23-诱导的IL-17分泌相比较的抑制百分数。
图5A为显示在用E11E7Chimera、抗IL-23p19抗体或同种型对照抗体(如所指出的)治疗的动物中在IL-23-介导的小鼠牛皮癣模型中随时间的临床计分的示意图。
图5B为显示在用E11E7Chimera、抗IL-23p19抗体或同种型对照抗体(如所指出的)治疗的动物中在IL-23-介导的小鼠牛皮癣模型中的表皮厚度的示意图。
图6A和图6B为显示如使用ELISA测定的E11E7Chimera和人源化形式的E11E7与IL-23的结合的示意图。
图7A至图7F为显示抗体的可变区的序列和/或序列比对的示意图。图7A显示E11E7和其人源化形式的VH区域的比对。图7B显示所选择的人源化形式的E11E7的VH区域的比对。图7C显示E11E7和其人源化形式的VL区域的比对。图7D显示所选择的人源化形式的E11E7的VL区域的比对。图7E显示人抗体ST883/885的VH的氨基酸序列。图7F显示人抗体ST883/885的VL的氨基酸序列。在比对下面的符号有：“*”是指在比对中的残基相同；“：”是指在所述比对中的残基强烈保守(强烈保守的基团，STA；NEQK；NHQK；NDEQ；QHRK；MILV；MILF；HY；FYW)，和“.”是指残基弱保守(弱保存的基团，CSA；ATV；SAG；STNK；STPA；SGND；SNDEQK；NDEQHK；NEQHRK；FVLIM；HFY)。还显示了共有序列，其中“X”指示变化的部位。“X”的下面指出，所存在的所有氨基酸处于所分析序列中的部位。方框区域含有如由Kabat编号系统和加强的Chothia编号系统定义的CDR(如所指出的)。由Kabat编号系统定义的CDR被加下划线。由加强的Chothia编号系统定义的CDR以粗体显示。
图8包括显示人源化形式的E11E7结合IL-23、但不显著地结合IL-12p40或IL-23p19的一系列示意图。空白指示其中省略了涂布抗原的测定情况。
图9为显示完全人抗体ST883/885IgG结合IL-23、但不显著地结合IL-12p40或IL-23p19的示意图。空白指示其中省略了涂布抗原的测定情况。
图10A和图10B为显示如经由ELISA(A)进行的使用E11E7作为捕捉抗体的重组IL-23的检测和如通过ELISA(B)所测量通过在用商陆促分裂原(PWM)和脂多糖(LPS)激发时由细胞系产生的E11E7进行的天然IL-23的检测的示意图。
图11为显示用于通过使动物免疫生产抗IL-23抗体的方法的示意图。
图12为显示用于通过使噬菌体展示生产抗IL-23抗体的方法的示意图。
发明详述
概要
贯穿本说明书，除非另外具体陈述或除非上下文需要，否则提到单一步骤、物质组合物、步骤集合或物质组合物的集合将用以涵盖那些步骤、物质组合物、步骤集合或物质组合物集合中的一个(种)或多个(种)(即，一个(种)或多个(种))。因此，如在本文中使用，除非上下文另外明确指出，否则单数形式“一个(种)”和“所述”包括多方面。例如，提到“一个(种)”包括单一个(种)以及两个(种)或更多个(种)；提到“一个(种)”包括单一个(种)以及两个(种)或更多个(种)；提到“所述”包括单一个(种)以及两个(种)或更多个(种)等。
除非另外具体陈述，否则本公开的各实施例将加以必要的变更以适合每一个其它实施方案。
本公开的各实施例将加以必要的变更以适于包含抗体的抗原结合域的蛋白质，所述抗原结合域包含包含SEQ ID NO：49中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：50中列出的序列的VL。
本公开的各实施例将加以必要的变更以适于包含抗体的抗原结合域的蛋白质，所述抗原结合域包含包含SEQ ID NO：7中列出的序列的VH和包含SEQ ID NO：12中列出的序列的VL，或其人源化形式，例如，包含在表1的2-23行中的任一行中描述的抗体的VH和VL。
本公开的各实施例将加以必要的变更以适于包含抗体的抗原结合域的蛋白质，所述抗原结合域包含在表1的2、3、6或7行中的任一行中描述的抗体的VH和VL。
本领域的技术人员应理解本文中的本公开容许除具体描述的那些变化和改进以外的变化和改进。应理解本公开涵盖所有这类变化和改进。本公开还包括在本说明书中单个或集体地提到或指出的步骤、特征、组合物和化合物及所述步骤或特征的任何和所有组合或任何两个或更多个。
本公开在范围上不受本文所述的具体实施方案限制，所述具体实施方案仅用于例示的目的。功能上相当的产物、组合物和方法明确地在本公开的范围内。
除非另外指出，否则本文所述的物质组合物和方法在没有过度实验的情况下使用分子生物学、微生物学、病毒学、重组DNA技术、在溶液中的肽合成、固相肽合成和免疫学的常规技术来制备或进行。所述程序例如描述在以下文献中：Sambrook、Fritsch和Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratories，New York，第二版(1989)，整卷I、II和III；Benny K.C.Lo，Antibody Engineering：Methods and Protocols，(2004)Humana Press，第248卷；DNA Cloning：A Practical Approach，卷I和II(D.N.Glover编，1985)，IRL Press，Oxford，全部文档；Oligonucleotide Synthesis：APractical Approach(M.J.Gait编，1984)IRL Press，Oxford，全部文档，且特别是其中Gait的文章，第1-22页；Atkinson等，第35-81页；Sproat等，第83-115页；和Wu等，第135-151页；4.Nucleic AcidHybridization：A Practical Approach(B.D.Hames和S.J.Higgins编，1985)IRL Press，Oxford，整个文档；Immobilized Cells and Enzymes：APractical Approach(1986)IRL Press，Oxford，整个文档；Perbal，B.，APractical Guide to Molecular Cloning(1984)；Methods In Enzymology(S.Colowick和N.Kaplan编，Academic Press，Inc.)，全部系列；J.F.Ramalho Ortigao，“The Chemistry of Peptide Synthesis”，在通向VirtualLaboratory网址的资料数据库(Interactiva，Germany)中；Sakakibara，D.，Teichman，J.，Lien，E.L和Fenichel，R.L.(1976).Biochem.Biophys.Res.Commun.73336-342；Merrifield，R.B.(1963).J.Am.Chem.Soc.85，2149-2154；Barany，G.和Merrifield，R.B.(1979)，在The Peptides(Gross，E.和Meienhofer，J.编)，第2卷，第1-284页，Academic Press，New York；12.Wünsch，E.编，(1974)Synthese von Peptiden inHouben-Weyls Metoden der Organischen Chemie(Müler，E.编)，第15卷，第4版，第1部分和第2部分，Thieme，Stuttgart；Bodanszky，M.(1984)Principles of Peptide Synthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.&Bodanszky，A.(1984)The Practice of PeptideSynthesis，Springer-Verlag，Heidelberg；Bodanszky，M.(1985)Int.J.Peptide Protein Res.25，449-474；Handbook of ExperimentalImmunology，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell编，1986，Blackwell Scientific Publications)；和Animal Cell Culture：PracticalApproach，第三版(John R.W.Masters编，2000)，ISBN0199637970，整个文档。
术语“和/或”，例如“X和/或Y”应理解为是指“X和Y”或“X或Y”，且将用以对于两种含义或对于任一含义提供明确的支持。
如在本文中所用，在介于两个值之间的范围或在两种残基之间的蛋白质或多肽中的残基的上下文中，术语“在……之间”应该以包括的方式阅读，即，包括位于在这两个所列举值/残基之间的任何值/残基和这两个所列举的值/残基。例如，术语“在1至10之间”应该理解为包括1、2、3、4、5、6、7、8、9和10。
在本说明书提到“SEQ ID NO：XX-YY中的任何一个[或任何一个或多个]”的上下文中，应该理解其提供对于定义在所列举的SEQ IDNO之间(如在本文中定义)的序列中的任何一个(或一个或多个)的陈述或权利要求项的文字支持。
贯穿本说明书，词语“包含(comprise)”或变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”应理解为意味着包括所陈述的要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的集合，但不排除任何其它要素、整数或步骤或者要素、整数或步骤的集合。
序列表的关键点
SEQ ID NO：1为人IL-12p40亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO：2为人IL23p19亚基的氨基酸序列。
SEQ ID NO：3为人IgG1重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：4为人轻链κ恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：5为编码包含由柔性接头分隔的IL-12p40亚基和IL-23p19亚基的融合蛋白的核苷酸序列。
SEQ ID NO：6为编码抗体E11E7的VH的核苷酸序列。
SEQ ID NO：7为编码抗体E11E7的VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：8为抗体E11E7的VH的CDR1(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9为抗体E11E7的VH的CDR2(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：10为抗体E11E7的VH的CDR3(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：11为编码抗体E11E7的VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：12为编码抗体E11E7的VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：13为抗体E11E7的VL的CDR1(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：14为抗体E11E7的VL的CDR2(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：15为抗体E11E7的VL的CDR3(根据Kabat编号系统)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：16为人重链恒定区的氨基酸序列。
SEQ ID NO：17为FLAG标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO：18为编码E11E7嵌合抗体的VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：19为编码E11E7嵌合抗体的VH的核苷酸序列。
SEQ ID NO：20为包含E11E7VH和人恒定区的嵌合抗体(命名为E11E7Chimera)的重链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：21为包含E11E7VL和人恒定区的嵌合抗体(命名为E11E7Chimera)的轻链的氨基酸序列。
SEQ ID NO：22为结合如本文所述的IL-23的抗体的VH的替换的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：23为抗IL-23抗体的VH的CDR1(根据加强的Chothia编号系统)的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：24为抗IL-23抗体的VH的CDR2(根据Kabat编号系统)的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：25为人源化抗IL-23抗体的VH的CDR1(根据加强的Chothia编号系统)的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：26为抗IL-23抗体的VH的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：27为抗IL-23抗体的VL的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：28为人源化抗IL-23抗体的VH的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：29为人源化抗IL-23抗体的VL的共有序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：30为人源化抗体重链号20的氨基酸序列。
SEQ ID NO：31为人源化抗体重链号21的氨基酸序列。
SEQ ID NO：32为人源化抗体重链号6的氨基酸序列。
SEQ ID NO：33为人源化抗体重链号8的氨基酸序列。
SEQ ID NO：34为人源化抗体重链号9的氨基酸序列。
SEQ ID NO：35为人源化抗体重链号16的氨基酸序列。
SEQ ID NO：36为人源化抗体重链号1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：37为人源化抗体重链号13的氨基酸序列。
SEQ ID NO：38为人源化抗体重链号7的氨基酸序列。
SEQ ID NO：39为人源化抗体重链号11的氨基酸序列。
SEQ ID NO：40为人源化抗体重链号18的氨基酸序列。
SEQ ID NO：41为人源化抗体重链号5的氨基酸序列。
SEQ ID NO：42为人源化抗体重链号10的氨基酸序列。
SEQ ID NO：43为人源化抗体重链号14的氨基酸序列。
SEQ ID NO：44为人源化抗体重链号15的氨基酸序列。
SEQ ID NO：45为人源化抗体轻链号4的氨基酸序列。
SEQ ID NO：46为人源化抗体轻链号22的氨基酸序列。
SEQ ID NO：47为人源化抗体轻链号12的氨基酸序列。
SEQ ID NO：48为人源化抗体轻链号23的氨基酸序列。
SEQ ID NO：49为人抗体号ST883/885的VH的氨基酸序列。
SEQ ID NO：50为人抗体号ST883/885的VL的氨基酸序列。
SEQ ID NO：51为人抗体号ST883/885的VH的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：52为人抗体号ST883/885的VH的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：53为人抗体号ST883/885的VH的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：54为人抗体号ST883/885的VL的CDR1的氨基酸序列。
SEQ ID NO：55为人抗体号ST883/885的VL的CDR2的氨基酸序列。
SEQ ID NO：56为人抗体号ST883/885的VL的CDR3的氨基酸序列。
SEQ ID NO：57为编码人源化抗体重链号20的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：58为编码人源化抗体重链号21的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：59为编码人源化抗体重链号6的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：60为编码人源化抗体重链号8的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：61为编码人源化抗体重链号9的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：62为编码人源化抗体重链号16的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：63为编码人源化抗体重链号1的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：64为编码人源化抗体重链号13的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：65为编码人源化抗体重链号7的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：66为编码人源化抗体重链号11的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：67为编码人源化抗体重链号18的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：68为编码人源化抗体重链号5的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：69为编码人源化抗体重链号10的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：70为编码人源化抗体重链号14的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：71为编码人源化抗体重链号15的VH的核苷酸序列。SEQ ID NO：72为编码人源化抗体轻链号4的VL的核苷酸序列。SEQ ID NO：73为编码人源化抗体轻链号22的VL的核苷酸序列。SEQ ID NO：74为编码人源化抗体轻链号12的VL的核苷酸序列。SEQ ID NO：75为编码人源化抗体轻链号23的VL的核苷酸序列。SEQ ID NO：76为人抗体号ST883/885的VH的核苷酸序列。
SEQ ID NO：77为人抗体号ST883/885的VL的核苷酸序列。
SEQ ID NO：78为包含以下连接组分：IL-12p40-接头-IL-23p19的融合蛋白的氨基酸序列。
SEQ ID NO：79为HIS标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO：80为AviHIS标签的氨基酸序列。
SEQ ID NO：81为抗体的重链的前导序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：82为抗体的轻链的前导序列的氨基酸序列。
SEQ ID NO：83为人轻链λ恒定区的氨基酸序列。
所选择的定义
术语“分离蛋白”或“分离多肽”为根据其来源或衍生源与伴随其处于天然状态的天然伴生组分不相关或大致上不含来自同一物种的其它蛋白质。蛋白质可通过使用本领域已知的蛋白质纯化技术分离而使得大致上不含天然的伴生组分。如在本文中使用的术语“回收”是指通过例如使用本领域已知的蛋白质纯化技术分离使如多肽的化学物质大致上不含天然伴生组分的方法。在一个实施例中，分离蛋白被大致上纯化。“大致上纯化”是指蛋白质大致上不含污染剂，例如至少约70％或75％或80％或85％或90％或95％或96％或97％或98％或99％的不含污染剂。
术语“重组体”应理解为是指人工遗传重组的产物。因此，在包含抗体抗原结合域的重组的上下文中，所述术语不涵盖作为在B细胞成熟期间出现的天然重组产物的在受试者体内天然存在的抗体。然而，如果这种抗体被分离，则将其视为包含抗体可变区的分离蛋白。类似地，如果编码所述蛋白质的核酸被分离并使用重组方法表达，则所得蛋白质为包含抗体抗原结合域的重组蛋白。重组蛋白还涵盖如下蛋白质，当所述蛋白质在细胞、组织或受试者内时通过人工重组方法表达的蛋白质，例如所述蛋白质在其中得以表达。
术语“IL-23结合蛋白”将用以包括能够以在本文中描述和/或要求的方式结合IL-23的单一多肽链(即，由肽键连接的一系列邻接氨基酸)或彼此共价或非共价连接的一系列多肽链(即，多肽复合物)。例如，所述系列多肽链可使用合适的化学或双硫键共价连接。非共价键的实例包括氢键、离子键、范德华力和疏水性相互作用。
来自上述段落的术语“多肽链”应理解为是指由肽键连接的一系列邻接氨基酸。
如在本文中使用，术语“抗原结合域”将用以指能够特异地结合抗原的抗体的区域，即，VH或VL或Fv。所述抗体结合域不需要在整个抗体的上下文内，例如，其可以分离形式(例如，域抗体)或以另一形式，例如，如在本文中所述，如scFv。
对于本公开的目的，术语“抗体”包括根据在Fv内包含的抗原结合部位能够特异地结合一种或几种密切相关的抗原(例如，IL-23)的蛋白质。所述术语包括四链抗体(例如，两个轻链和两个重链)、重组或修饰的抗体(例如，嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、CDR-接枝抗体、灵长类化抗体、脱免疫化抗体、同人源化抗体、半抗体、双特异性抗体)。抗体通常包含恒定域，其可配置到恒定区或恒定片段或可结晶片段(Fc)中。抗体的示例性形式包含作为其基本单元的四-链结构。全长抗体包含共价连接的两个重链(约50-70kDa)和两个轻链(各自约23kDa)。轻链通常包含可变区(如果存在的话)和恒定域，且在哺乳动物中，轻链为κ轻链或λ轻链。重链通常包含可变区和由铰链区连接到另外恒定域的一个或两个恒定域。哺乳动物的重链具有以下类型之一：α、δ、ε、γ或μ。各个轻链也共价连接到所述重链中的一个。例如，这两个重链和所述重链与所述轻链通过链间双硫键和通过非共价相互作用固持在一起。链间双硫键的数目在不同类型的抗体中可不同。各个链具有N-端可变区(VH或VL，其中各自的长度为约110个氨基酸)和在C-端的一个或多个恒定域。轻链的恒定域(CL，其长度为约110个氨基酸)与重链的第一恒定域(CH1，其长度为330-440个氨基酸)比对且以双硫键键结到重链的第一恒定域。轻链可变区与重链可变区比对。抗体重链可包含两个或更多个另外的CH域(如，CH2、CH3等)且可包含在CH1恒定域与CH2恒定域之间的铰链区。抗体可具有任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。在一个实施例中，所述抗体为鼠(小鼠或大鼠)抗体或灵长类(如，人)抗体。在一个实施例中，所述抗体为人源化、同人源化、嵌合、CDR-接枝或脱免疫化的。
如在本文中使用，“可变区”是指能够特异地结合抗原的如在本文中定义的抗体的轻链和/或重链的部分，且包括互补决定区(CDR)，即CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列和框架区(FR)。例如，所述可变区包含三个或四个FR(例如，FR1、FR2、FR3和任选FR4)以及三个CDR。在来源于IgNAR的蛋白质的情况下，所述蛋白质可能缺乏CDR2。VH是指重链可变区。VL是指轻链可变区。
如在本文中使用，术语“互补决定区”(同义词：CDR，即CDR1、CDR2和CDR3)是指抗体可变区的如下氨基酸残基，其存在主要促进特异性抗原结合。各个可变区通常具有三个确定为CDR1、CDR2和CDR3的CDR区域。在一个实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置根据Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest，National Institutes of Health，Bethesda，Md.，1987和1991(在本文中也称为“Kabat编号系统”定义。在另一实施例中，分配给CDR和FR的氨基酸位置根据加强的Chothia编号方案(http：//www.bioinfo.org.uk/mdex.html)定义。根据Kabat的编号系统，VH FR和CDR如下安置：残基1-30(FR1)、31-35(CDR1)、36-49(FR2)、50-65(CDR2)、66-94(FR3)、95-102(CDR3)和103-113(FR4)。根据Kabat的编号系统，VLFR和CDR如下安置：残基1-23(FR1)、24-34(CDR1)、35-49(FR2)、50-56(CDR2)、57-88(FR3)、89-97(CDR3)和98-107(FR4)。本公开不限于如由Kabat编号系统定义的FR和CDR，而是包括所有编号系统，包括Chotbia和Lesk J.Mol Biol.196：901-917，1987；Chothia等，Nature342，877-883，1989的正规编号系统；和/或Al-Lazikani等，J Mol Biol273，927-948，1997；Honnegher和Plükthun的编号系统，J.Mol.Biol.，309：657-670，2001；或在Giudicelli等，Nucleic Acids Res.，25：206-2111997中论述的IMGT系统。在一个实施例中，所述CDR根据Kabat编号系统定义。任选地，根据Kabat编号系统的重链CDR2不包含在本文中列举的五个C-端氨基酸或那些氨基酸中的任何一个或多个被另一天然存在的氨基酸取代。在另一或替换的选择中，轻链CDR1不包含在本文中列举的四个N-端氨基酸或那些氨基酸中的一个或多个被另一天然存在的氨基酸取代。在这方面，Padlan等，FASEB J.，9：133-139，1995确定重链CDR2的五个C-端氨基酸和/或轻链CDR1的四个N-端氨基酸通常不包括在抗原结合中。
“框架区”(FR)为不同于CDR残基的那些可变区残基。
如在本文中使用，术语“Fv”将用以指任何氨基酸，不管由多个多肽构成还是由单一多肽构成，其中VL和VH缔合且形成具有抗原结合部位、即能够特异地结合抗原的复合物。形成抗原结合部位的VH和VL可在单一多肽链中或在不同的多肽链中。另外，本公开的Fv(以及本公开的任何蛋白质)可具有可能或可能不结合相同抗原的多个抗原结合部位。所述术语应理解为涵盖直接来源于抗体以及所述蛋白质的重组形式的片段。在一些实施例中，VH不与重链恒定域CH1连接和/或VL不与轻链恒定域CL连接。示例性含有Fv的多肽或蛋白质包括Fab片段、Fab’片段、F(ab’)片段、scFv、双抗、三抗、四抗或高次复合物，或与其恒定区或域、例如CH2或CH3域连接的上述者中的任何一个，例如微抗体。“Fab片段”由免疫球蛋白的单价抗原结合片段组成，且可通过用酶木瓜蛋白酶消化全抗体以产生由完整轻链和一部分重链组成的片段来制备或可使用重组方法制备。抗体的“Fab’片段”可通过用胃蛋白酶处理全抗体、接着还原以产生由完整轻链和包含VH和单一恒定域的一部分重链组成的分子来获得。两个Fab’片段通过以此方式处理每个抗体来获得。Fab’片段也可通过重组方法制备。抗体的“F(ab’)2片段”由通过两个双硫键固持在一起的两个Fab’片段的二聚体组成的抗体，且通过用酶胃蛋白酶处理全抗体分子而不进行随后的还原来获得。“Fab2”片段为包含使用例如亮氨酸拉链或CH3域连接的两个Fab片段的重组片段。“单链Fv”或“scFv”为含有抗体的可变区片段(Fv)的重组分子，其中轻链可变区和重链可变区由合适的柔性多肽接头共价连接。属于所述术语的范围的示例性含有Fv的蛋白质的详细论述在下文中提供。
如在本文中使用，术语“特异地结合”或“特异性地结合”将用来指，与用替换的抗原或细胞的情况相比，本公开的IL-23结合蛋白以更久的持续时间和/或以更大的亲和力与特定抗原或表达所述特定抗原的细胞更频繁更迅速地反应或缔合。例如，“特异地结合”抗原的蛋白质与其结合其它抗原相比以更大的亲和力、活度、更容易地和/或以更久的持续时间结合所述抗原。通过阅读所述定义还应理解，例如，特异地结合第一抗原的蛋白质可能或可能不特异地结合第二抗原。照此，“特异地结合”未必需要另一抗原的排外的结合或不能检测的结合，这由术语“选择性结合”释义。在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白“特异地结合”抗原是指所述蛋白质以100nM或更低、如50nM或更低、例如20nM或更低、如1nM或更低的亲和力常数结合所述抗原。
如在本文中使用，术语“不显著地结合”将用以指，当在相同条件下试验时，本公开的IL-23结合蛋白显示，与其对IL-23的结合相比，当IL-23p19亚基和IL-12p40亚基不是IL-23的组分时，本公开的IL-23结合蛋白对IL-23p19亚基和对IL-12p40的结合小10倍或20倍或50倍或60倍或70倍或80倍或90倍或100倍。在一些实施例中，当IL-23p19亚基和IL-12p40亚基不是IL-23的组分时，本公开的IL-23结合蛋白对IL-23p19亚基和对IL-12p40亚基具有1×10-6或更低的平衡常数(KD)，且例如所述蛋白质对IL-23具有至少约1×10-8、如5×10-9的KD。所述降低的结合水平可通过ELISA或生物传感器分析(例如Biacore)测量。在一个实施例中，例如，如通过ELISA或Biacore或蛋白免疫印迹或FACS测量，当IL-23p19或IL-12p40不是IL-23的组分时，无法检测到本公开的IL-23结合蛋白与IL-23p19或IL-12p40的结合。在这方面，“无法检测到结合”将理解为指结合的水平不显著大于例如如使用同种型对照抗体所测定的背景。
术语“IL-12p40亚基和IL-23p19亚基在不是IL-23的组分时”涵盖以分离形式的IL-23p19亚基或IL-12p40亚基或当它们与另一多肽复合时(即，IL-12p40亚基可与除IL-23p19以外的多肽如IL-12p35复合)。
如在本文中使用的术语“IL-23”包括术语包括IL-12和IL-27的五种这样的杂二聚细胞因子的家族的杂二聚人细胞因子(Trinchieri，Pflanz等，2003Immunity19641-4)。所述术语包括包含例如用双硫键连接在一起的亚基IL-23p19和IL-12p40的杂二聚蛋白质。术语IL-23意图包括重组IL-23(rIL-23)，其可通过标准的重组表达方法来制备。在一些实施例中，本公开涵盖人IL-23(在本文中缩写为hIL-23或IL-23)，包括其重组形式(即，rhIL-23)。
如在本文中使用的术语“IL-12/23”通指IL-12和IL-23。
如在本文中使用的术语“IL-12p40”，等同于“IL-23p40”以及简称为“p40“和“p40亚基”或“IL-12p40亚基”，包括细胞因子IL-12的40kDa亚基和细胞因子IL-23的40kDa亚基(例如，人IL-12和/或IL-23的40kDa亚基)。出于命名但不限制的目的，IL-12p40亚基的氨基酸序列在SEQ ID NO：1中列出。在一个实施例中，如在本文中论述的IL-12p40亚基包含SEQ ID NO：1中列出的序列。
术语“分离的IL-12p40亚基”将用以指以其中其不例如与另一白细胞间介素蛋白质形成杂二聚体的组分的形式的如上定义的IL-12p40亚基。所述术语并不意味着“分离的IL-12p40亚基”不含其它蛋白质或多肽序列。例如，所述IL-12p40亚基可与另一多肽，例如FLAG标签或抗体的Fc区域融合。所述术语也不限于以单体形式的IL-12p40亚基(然而，这是由所述定义涵盖的“分离的IL-12p40亚基”的一个实例)，因为如果其与抗体的Fc区域融合，则可形成均二聚体。
如在本文中使用的术语“IL-23p19”，也简称为“p19”或“p19亚基”包括细胞因子IL-23(例如人IL-23)的19kDa亚基。出于命名但不限制的目的，IL-23p19亚基的氨基酸序列在SEQ ID NO：2中列出。在一个实施例中，如在本文中论述的IL-23p19亚基包含SEQ ID NO：2中列出的序列。
术语“分离的IL-23p19亚基”将用以指以其中其不例如与另一白细胞间介素蛋白质形成杂二聚体的组分的形式的如上定义的IL-23p19亚基。所述术语并不意味着“分离的IL-23p19亚基”不含其它蛋白质或多肽序列。例如，IL-23p19亚基可与另一多肽，例如FLAG标签或抗体的Fc区域融合。所述术语也不限于以单体形式的IL-23p19亚基(然而，这是由所述定义涵盖的“分离的IL-23p19亚基”的一个实例)，因为如果其与抗体的Fc区域融合，则可形成均二聚体。
如在本文中使用，术语“杂二聚体”将理解为指包含两种不同的细胞因子亚基的蛋白质复合物，例如IL-23p19和IL-12p40形成IL-23杂二聚体；和IL-12p40和IL-12p35形成IL-12杂二聚体。
如在本文中使用，术语“单体”将用以指IL-12的亚基不与另一细胞因子亚基直接接触。
如在本文中使用的“生物活性”是指IL-23的一种或多种生物性质。IL-23的生物性质包括但不限于结合在细胞上的IL-12Rβ1和/或在细胞上的IL-23R，在与细胞结合之后诱导IFN-γ生产，在与细胞结合之后诱导IL-17生产，在与细胞结合之后诱导IL-21生产，在与细胞结合之后诱导IL-22生产，诱导TH17细胞分化和激活树状细胞的抗原展示功能及选择性地诱导记忆T细胞增殖。
如在本文中使用，术语“杂二聚界面”将用以指围绕如下部位的IL-23的区域：在所述部位处，IL-12p40与IL-23p19彼此接触和/或彼此连接和/或充分靠近以容许蛋白质结合使得其与IL-23结合而当IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基不是IL-23的组分时不显著地结合IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基。在这方面，所述术语不仅仅限于在彼此实际接触的IL-12p40和IL-23p19中的那些残基。更确切地讲，所述残基仅需要在杂二聚所涉及的蛋白质的区域内(例如，如在图2中所描绘)且被暴露与容许蛋白质结合且容许特异地结合IL-23杂二聚体。在一个实施例中，“杂二聚界面”为通过蛋白质的二聚产生的表位，例如，包含IL-12p40和IL-23p19的氨基酸。
如在本文中使用，术语“表位”(同义词“抗原决定子”)将理解为指包含抗体的抗原结合域的蛋白质与其结合的IL-23的区域。所述术语未必限于蛋白质与其接触的特定残基或结构。例如，所述术语意图涵盖包括由蛋白质接触的氨基酸的区域和在所述区域外的10个或更多个或5-10个或2-5个或1-3个氨基酸。在一些实施例中，所述表位为在IL-12p40和IL-23p19的二聚时产生的氨基酸线性序列。然而，表位还可包含一系列不连续的氨基酸，当IL-23被折叠时，所述系列不连续的氨基酸彼此靠近地安置(例如，彼此在50埃内，如彼此在40埃内，例如彼此在30埃内，如彼此在约25埃内)，即“构象表位”。技术人员还将意识到术语“表位”不限于肽或多肽。例如，术语“表位”包括如糖侧链、磷酰基侧链或磺酰基侧链的分子的化学活性表面集合，且，在某些实施方案中，可具有特定的三维结构特性和/或特定的电荷特性。表位或包含其的肽或多肽可施用给动物以产生抵抗所述表位的抗体。
术语“竞争性抑制”应理解为指本公开的IL-23结合蛋白减少或防止包含包含SEQ ID NO：7中列出的序列的重链可变区和包含SEQ IDNO：12中列出的序列的轻链可变区的抗体与IL-23的结合。从上述内容中将显而易见所述蛋白质不必完全抑制抗体的结合，而是其仅需要使结合减少统计学上显著的量，例如至少约10％或20％或30％或40％或50％或60％或70％或80％或90％或95％。用于测定对结合的竞争性抑制的方法在本领域中已知和/或在本文中描述。例如，在存在或不存在蛋白质的情况下，使抗体暴露于IL-23。如果与在不存在所述蛋白质的情况下相比较，在存在所述蛋白质的情况下较少抗体结合，则将所述蛋白质认为是竞争性抑制所述抗体的结合。例如，使所述蛋白质和所述抗体同时暴露于IL-23。在一个实施例中，对结合的竞争性抑制由与抗体的抗原结合域重叠的在IL-23上的蛋白质的抗原结合域引起。
在两种表位的上下文中的“重叠”将用以指两种表位共用足够数量的氨基酸残基以容许与一种表位结合的蛋白质竞争性抑制与另一表位结合的蛋白质的结合。例如，本公开涵盖蛋白质，所述蛋白质结合共用足够数量的残基的表位以防止包含包含SEQ ID NO：7中列出的序列的重链可变区和在SEQ ID NO：12中列出的序列的轻链可变区的抗体与其表位结合。
“中等严格”在本文中定义为在2×SSC缓冲剂、0.1％(w/v)SDS中在45℃-65℃的温度或等价条件下进行的杂化和/或洗涤。“高度严格”在本文中定义为在0.1×SSC缓冲剂、0.1％(w/v)SDS中或较低盐浓度下且在至少65℃的温度或等价条件下进行的杂化和/或洗涤。在本文中提到特定水平的严格涵盖使用除本领域技术人员已知的SSC外的洗涤/杂化溶液的等价条件。例如，用于计算双股核酸的各股将分解的温度(也称作熔融温度或Tm)的方法在本领域中已知。类似于(例如，在5℃内或在10℃内)或等于核酸的Tm的温度被认为是高度严格。中等严格被认为是在所计算的核酸的Tm的10℃-20℃或10℃-15℃内。
如在本文中使用，“病状”为破坏或干扰正常功能，且不限于任何特定病状且将包括疾病或病征。
如在本文中使用，术语“预防(preventing)”、“预防(prevent)”或“预防(prevention)”包括施用治疗有效量的本公开的IL-23结合蛋白以足以中止或阻止所说明的疾病或病状的至少一种症状的发展。
如在本文中使用，术语“治疗(treating)”、“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”包括施用治疗有效量的本文所述的蛋白质以足以减少或消除所说明的疾病或病状的至少一种症状。
如在本文中使用，术语“受试者”将用以指任何动物，如哺乳动物。在一个实施例中，所述哺乳动物为人或非人灵长类动物。例如，所述哺乳动物为人。
在本文中提到“样品”应理解为指来源于受试者的任何样品，如但不限于体液(例如，血液或滑膜液或脑脊髓液)、多孔材料(例如，组织吸出物)、组织活检试样或手术试样。“样品”包括所述样品的提取物和/或衍生物和/或部分，例如血清、血浆、周边血液单核细胞(PBMC)或血沉棕黄层部分。
如在本文中使用，术语“诊断”及其变体，如但不限于“诊断(diagnose)”、“诊断(diagnosed)”或“诊断(diagnosing)”，包括临床病况的任何初步诊断或复发疾病的诊断。
如在本文中使用的“预后(Prognosis)”、“预后(prognosing)”及其变体是指疾病的可能结果或进程，包括恢复或复发的机会或治疗的结果。
包含抗体可变区的蛋白质
抗体
基于免疫的方法
为了产生抗体，将任选用任何合适或有用的载体、助剂或药学上可接受的载体配制的IL-23或其修饰形式(例如，包含与IL-23p19亚基融合的IL12p40亚基的融合蛋白)或编码其的核酸以可注射组合物形式方便地施用到受试者(如，非人受试者，如小鼠、大鼠、小鸡等)。注射可经鼻内、肌肉内、皮下、静脉内、皮内、腹膜内或其它已知路径。任选地，IL-23或编码其的DNA多次施用。用于制备和表征抗体的方法在本领域中已知。(参见，例如Antibodies：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratory，1988)。
多株抗体的生产可通过在免疫之后在多个点对免疫的动物的血液取样来监测。如果需要，可给予第二加强注射以获得所要的抗体滴度。重复加强和滴定的过程，直至获得合适的滴度。当获得所要水平的免疫原性时，将免疫的动物放血且分离并保存血清，和/或使用所述动物来产生单克隆抗体(Mabs)。
单克隆抗体为由本公开涵盖的示例性抗体。一般来讲，所述方法包括在足以激发抗体产生细胞的条件下用IL-23或编码其的核酸使受试者(例如，啮齿动物，例如小鼠或大鼠)免疫。在一些实施例中，使经遗传设计以表达人免疫球蛋白蛋白质但不表达鼠科免疫球蛋白蛋白质的小鼠免疫以产生抗体(例如，如在PCT/US2007/008231和/或Lonberg等，Nature368(1994)：856-859中描述)。在免疫之后，使抗体产生体细胞(例如，B淋巴细胞)与例如永生骨髓瘤细胞的永生细胞融合。用于产生所述融合细胞(杂交瘤)的各种方法在本领域中已知且例如描述在Kohler和Milstein，Nature256，495-497，1975中。随后可将所述杂交瘤细胞在足以产生抗体的条件下培养。
本公开涵盖用于制备抗体的其它方法，例如ABL-MYC技术(如例如在Largaespada等，Curr.Top.Microbiol.Immunol，166，91-96.1990中描述)。
基于文库的方法
本公开还涵盖筛选抗体或包含其可变区的蛋白质的文库以识别本公开的IL-23结合蛋白。
本公开的实例包括天然文库(来自无异议的受试者)、免疫的文库(来自用抗原免疫的受试者)或合成文库。编码抗体或其区域(例如，可变区)的核酸通过常规方法(例如，如在Sambrook和Russell编，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，第三版，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory Press，2001中所揭露)克隆且用以使用本领域已知的方法编码和展示蛋白质。用于制备蛋白质文库的其它技术例如描述在US6300064(例如，Morphosys AG的HuCAL文库)；US5885793；US6204023；US6291158或US6248516中。
根据本公开的IL-23结合蛋白可为可溶性分泌蛋白且可展示为在细胞的表面上的融合蛋白，或粒子(例如，噬菌体或其它病毒、核糖体或孢子)。在本领域中已知各种展示文库格式。例如，所述文库为活体外展示文库(例如，核糖体展示文库、共价展示文库或mRNA展示文库，例如如在US7270969中所述)。在又一实施例中，所述展示文库为噬菌体展示文库，其中包含抗体的抗原结合域的蛋白质在噬菌体上表达，例如如在US6300064；US5885793；US6204023；US6291158；或US6248516中所述。其它噬菌体展示方法在本领域中已知且由本公开所涵盖。类似地，细胞展示的方法也由本公开所涵盖，例如，细菌展示文库，例如如在US5516637中所述；酵母菌展示文库，例如如在US6423538中所述；或哺乳动物展示文库。
用于筛选展示文库的方法在本领域中已知。在一个实施例中，本公开的展示文库使用亲和力纯化来筛选，例如如在Scopes(在Proteinpurification：principles and practice，第三版，Springer Verlag，1994中)中所述。亲和力纯化的方法通常包括使包含由所述文库展示的抗原结合域的蛋白质与目标抗原(例如，IL-23)接触且在洗涤之后，洗脱保持与所述抗原结合的那些域。
如果需要，则通过筛选识别的任何可变区或scFvs容易地修饰成为完全抗体。用于将可变区或scFvs修饰或格式变换成完全抗体的示例性方法例如描述在Jones等，J Immunol Methods.354：85-90，2010；或Jostock等，J Immunol Methods，289：65-80，2004中。替换地或另外，使用标准的克隆方法，例如，如在Ausubel等(在Current Protocols inMolecular Biology.Wiley Interscience，ISBN047150338，1987中)和/或Sambrook等(在Molecular Cloning：Molecular Cloning：A LaboratoryManual，Cold Spring Harbor Laboratories，New York，第三版，2001中)中所述。
特异地结合IL-23的蛋白质的选择
本领域的技术人员可以采用用于选择包含特异地结合IL-23的抗体结合域的蛋白质的合适方法。
例如，可进行筛选以识别能够结合本公开的IL-23的蛋白质。随后筛选结合IL-23的任何蛋白质以识别当IL-23p19或IL-12p40不是IL-23的组分(例如，以分离形式或作为另一细胞因子如IL-12的一部分)时不能结合IL-23p19或IL-12p40的那些蛋白质。当然，这些筛选的顺序也可以逆转。
所述类型筛选的一个实施例描绘在图11中和/或例示在本文中。在向小鼠重复施用重组IL-23或表达IL-23的载体的遗传免疫后，进行鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合，产生杂交瘤细胞。随后在第一轮中相对于天然IL-23筛选由这些杂交瘤细胞分泌的抗体。随后在第二轮中相对于FLAG-标签化的IL-23、IL-23p19和IL-12p40试验阳性杂交瘤。对于IL-23结合为阳性、而对于IL-23p19和IL-12p40不为阳性的抗体为杂二聚特异性抗体。
在所展示的蛋白质的情况下，可使用淘选以减去不特异地结合IL-23的那些蛋白质。例如，随后将结合IL-23的噬菌体展示蛋白质暴露于不是IL-23的组分(例如，以分离形式或作为另一细胞因子的一部分)的IL-23p19或IL-12p40，由此除去谨慎地结合IL-12p40或IL-23p19的结合蛋白，即，可交叉反应的蛋白质。
所述类型方法的一个实施例描绘在图12中和/或例示在本文中。在所述实施例中，首先筛选(或淘选)与IL-23结合的噬菌体，除去未结合的噬菌体且保留结合的噬菌体。随后试验结合的噬菌体与IL-12p40亚基和IL-23p19亚基的结合，其中除去结合的噬菌体且保留未结合的噬菌体。在多轮淘选之后，获得对IL-23具有必要的特异性的抗体片段。
另一方法包括识别在IL-23p19与IL-12p40未二聚时不存在或未暴露而在IL-23p19与IL-12p40二聚时形成或暴露的表位且使用包含所述表位作为抗原的肽或多肽以制备本公开的蛋白质。
脱免疫化、嵌合、人源化、同人源化、灵长类化和人蛋白质
本公开的IL-23结合蛋白可为可为人源化蛋白质。
术语“人源化蛋白质”将理解为指包含包括接枝到或插入来自人抗体的FR中的得自来自非人物种(例如，小鼠或大鼠或非人灵长类动物)的抗体的CDR的类似人的可变区的蛋白质(所述类型的抗体也被称为“CDR-接枝的抗体”)。如在本文中例示，人源化蛋白质还包括其中人蛋白质的一个或多个残基通过一次或多次氨基酸取代修饰和/或人蛋白质的一个或多个FR残基被相应非人残基置换的蛋白质。人源化蛋白质还可包含在人抗体中或在非人抗体中都见不到的残基。所述蛋白质的任何另外的区域(例如，Fc区域)通常为人的。人源化可使用本领域已知的方法进行，例如US5225539、US6054297、US7566771或US5585089。术语“人源化蛋白质”还涵盖超人源化蛋白质，例如，如在US7732578中所述。
在一个实施例中，本公开提供包含以下链的人源化抗体：
(i)包含SEQ ID NO：30中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：45中列出的序列的轻链；
(ii)包含SEQ ID NO：31中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：45中列出的序列的轻链；
(iii)包含SEQ ID NO：32中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；
(iv)包含SEQ ID NO：33中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：46中列出的序列的轻链；
(v)包含SEQ ID NO：34中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：46中列出的序列的轻链；
(vi)包含SEQ ID NO：35中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：47中列出的序列的轻链；
(vii)包含SEQ ID NO：33中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链；
(viii)包含SEQ ID NO：34中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链；
(ix)包含SEQ ID NO：32中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：48中列出的序列的轻链；
(x)包含SEQ ID NO：36中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：45中列出的序列的轻链；
(xi)包含SEQ ID NO：37中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：47中列出的序列的轻链；
(xii)包含SEQ ID NO：38中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；
(xiii)包含SEQ ID NO：39中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；
(xiv)包含SEQ ID NO：40中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：45中列出的序列的轻链；
(xv)包含SEQ ID NO：41中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；
(xvi)包含SEQ ID NO：42中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；
(xvii)包含SEQ ID NO：43中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：47中列出的序列的轻链；
(xviii)包含SEQ ID NO：38中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链；
(xix)包含SEQ ID NO：39中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链；
(xx)包含SEQ ID NO：44中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：47中列出的序列的轻链；
(xxi)包含SEQ ID NO：41中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链；或
(xxii)包含SEQ ID NO：42中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：48中列出的序列的轻链。
(i)包含SEQ ID NO：30中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：45中列出的序列的轻链；
(ii)包含SEQ ID NO：31中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：45中列出的序列的轻链；
(iii)包含SEQ ID NO：32中列出的序列的重链和包含SEQ IDNO：46中列出的序列的轻链；或
(iv)包含SEQ ID NO：33中列出的序列的重链和包含SEQ ID NO：46中列出的序列的轻链。
在一个实施例中，人源化蛋白质包含在本文中公开的轻链序列中在27d至34之间、在50至55之间和在89至96之间的区域；和在本文中公开的重链序列中在31至35b之间、在50至58之间和在95至101之间的区域。在这方面，Padlan等，FASEB J.，9：133-139，1995呈现了这些区域是很可能结合或接触抗原的区域的证据。
本公开的IL-23结合蛋白可为人蛋白质。如在本文中使用的术语“人蛋白质”是指具有来源于人或相当于在人中、例如在人胚系或体细胞中见到的序列的可变且任选恒定的抗体区的蛋白质。“人”抗体可包括并非由人序列编码的氨基酸残基，例如通过体外无规或部位定向突变引入的突变(尤其是包括保守取代的突变或在蛋白质的少量残基中的突变，例如在蛋白质的1、2、3、4或5个残基中突变)。这些“人抗体”未必需要通过人的免疫反应产生，更确切地讲，它们可使用重组方法(例如，筛选噬菌体展示文库)和/或通过包含编码人抗体恒定和/或可变区的核酸的转基因动物(例如，小鼠)和/或使用引导选择(例如，如在或US5565332中所述)来产生。所述术语还涵盖所述抗体的亲和力力成熟形式。人蛋白质还将被认为包括包含来自人抗体的FR或包含来自人FR的共有序列的序列的FR的蛋白质，且其中CDR中的一个或多个为无规或半无规的，例如，如在US6300064和/或US6248516中所述。
本公开的IL-23结合蛋白可为同人源化蛋白质。术语“同人源化蛋白质”是指通过在WO2007/019620中描述的方法制备的蛋白质。同人源化IL-23结合蛋白包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的FR和得自非新世界灵长类抗体可变区的CDR。例如，同人源化IL-23结合蛋白包括抗体的可变区，其中所述可变区包含来自新世界灵长类抗体可变区的FR和来自小鼠大鼠抗体、例如如在本文中所述的E11E7的CDR。在一个实施例中，所述同人源化IL-23结合蛋白为IL-23结合抗体，其中所述可变区中的一个或两个为同人源化的。
本公开的IL-23结合蛋白可为灵长类化蛋白质。“灵长类化蛋白质”包含来自在使非人灵长类动物(例如，食蟹猴)免疫之后产生的抗体的可变区。任选地，所述非人灵长类动物抗体的可变区与人恒定区连接以制备灵长类化抗体。生产灵长类化抗体的示例性方法描述在US6113898中。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白为嵌合蛋白质。术语“嵌合蛋白质”是指如下蛋白质：其中抗原结合域来自特定物种(例如，鼠科，如小鼠或大鼠)或属于特定抗体类别或亚类，而蛋白质的剩余部分来自来源于另一物种(如，人或非人灵长类动物)的蛋白质或属于另一抗体类别或亚类。在一个实施例中，嵌合蛋白质为包含来自非人抗体(例如，鼠科抗体)的VH和VL的嵌合抗体，且所述抗体的剩余区域来自人抗体。所述嵌合蛋白质的生产在本领域中已知，且可通过标准方法(如，例如在US6331415；US5807715；US4816567和US4816397中所述)来实现。
本公开还涵盖脱免疫化蛋白质，例如，如在WO2000/34317和WO2004/108158中描述。脱免疫化抗体和蛋白质具有一个或多个被除去(即，突变)的表位，例如B细胞表位或T细胞表位，由此减少受试者将产生对于所述抗体或蛋白质的免疫反应的可能性。例如，分析本公开的IL-23结合蛋白以识别一个或多个B或T细胞表位且使在所述表位内的一个或多个氨基酸残基突变，由此降低IL-23结合蛋白的免疫原性。
包含抗原结合域的其它IL-23结合蛋白
本公开还涵盖其它含有抗原结合域的蛋白质，如：
(i)单域抗体，其为包含抗体的VH或VL的全部或一部分的单一多肽链(参见，例如US6248516)；
(ii)二抗、三抗和四抗，例如，如在US5844094和/或US2008152586中所述；
(iii)scFvs，例如，如在US5260203中所述；
(iv)微抗体，例如，如在US5837821中所述；
(v)“键(key)和臼(hole)”双特异性蛋白质，如在US5731168中所述；
(vi)杂偶联蛋白质，例如如在US4676980中所述；
(vii)使用化学交联剂制备的杂偶联蛋白质，例如，如在US4676980中所述；
(viii)Fab′-SH片段，例如，如在Shalaby等，J.Exp.Med.，175：217-2251992中所述；或
(ix)Fab3(例如，如在EP19930302894中所述)。
恒定域融合
本公开涵盖包含抗体的抗原结合域和恒定区(例如，Fc)或其域如CH2和/或CH3域的蛋白质。合适的恒定区和/或域对技术人员将是显而易见的和/或所述多肽的序列易于自可公开利用的数据库得到，如自生物技术信息国家中心得到。Kabat等还提供了一些合适的恒定区/域的描述。在一些实施例中，所述IL-23结合蛋白的恒定区或其部分来源于人抗体。所述恒定区或其部分可来源于任何抗体类别，包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE；和任何抗体同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。恒定区的示例性序列包括在US20070148167中。
恒定区和/或其域可用于提供或修饰或加强生物活性，如二聚化、延长的血清半衰期(例如，通过结合FcRn)、抗原依赖细胞细胞毒性(ADCC)、补体依赖细胞毒性(CDC)和/或抗原依赖细胞噬菌作用(ADCP)。
本公开还涵盖包含突变恒定区或域的蛋白质，例如，如在US7217797；US7217798；或US20090041770(具有增加的半衰期)或US2005037000(增加的ADCC)中所述。
例如，所述IL-23结合蛋白包含增加蛋白质的半衰期的一处或多处氨基酸取代。例如，所述IL-23结合蛋白包含包含使恒定区对新生Fc区(FcRn)的亲和力增加的一处或多处氨基酸取代的恒定区。例如，所述恒定区在较低pH，例如约pH6.0下对FcRn具有增加的亲和力，以促进在核内体中的Fc/FcRn结合。在一个实施例中，与在约pH7.4下的亲和力相比，所述恒定区在约pH6下对FcRn具有增加的亲和力，这促进在细胞循环之后将Fc再释放到血液中。这些氨基酸取代可通过减少自血液的清除率而延长蛋白质的半衰期。
根据EU编号系统，示例性氨基酸取代包括T250Q和/或M428L或T252A、T254S和T266F或M252Y、S254T和T256E或H433K和N434F。另外或替换的氨基酸取代例如描述在US20070135620或US7083784中。
本公开的中和蛋白质可包含IgG4恒定区或稳定的IgG4恒定区。术语“稳定的IgG4恒定区”将理解为指已经被修饰以减少Fab臂交换或经历Fab臂交换或形成半抗体的倾向或形成半抗体的倾向的IgG4恒定区。“Fab臂交换”是指对人IgG4的一类蛋白质修饰，其中IgG4重链和连接的轻链(半分子)交换成来自另一IgG4分子的重-轻链对。因此，IgG4分子可获得辨别两种不同的抗原的两个不同的Fab臂(产生双特异性分子)。Fab臂交换在体内自然地发生且可由纯化的血细胞或如被还原的谷胱甘肽的还原剂在体外诱导。“半抗体”在IgG4抗体分解以形成各自含有单一重链和单一轻链的两个分子时形成。
在一个实施例中，稳定的IgG4恒定区包含根据Kabat的系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological Interest WashingtonDC United States Department of Health and Human Services，1987和/或1991)在铰链区的位置241处的脯氨酸。所述位置对应于根据EU编号系统(Kabat等，Sequences of Proteins of Immunological InterestWashington DC United States Department of Health and Human Services，2001和Edelman等，Proc.Natl.Acad.USA，63，78-85，1969)的铰链区的位置228。在人IgG4中，所述残基通常为丝氨酸。在丝氨酸取代脯氨酸之后，IgG4绞链区包含序列CPPC。在这方面，技术人员将知道“铰链区”为赋予抗体的两个Fab臂移动性的连接Fc区和Fab区的抗体重链恒定区的富脯氨酸部分。所述铰链区包括半胱氨酸残基，其在重链间双硫键中涉及到。根据Kabat的编号系统，其通常被定义为自人IgG1的Glu226至Pro243的一段。其它IgG同种型的绞链区可通过放置在相同位置形成重链间双硫(S-S)键的第一半胱氨酸残基和最后的半胱氨酸残基来与IgG1序列比对(参见，例如WO2010/080538)。
突变蛋白质
如在本文中论述，本公开提供与本公开的序列具有至少80％同一性的蛋白质或核酸。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含包含与在SEQ IDNO：7中或在SEQ ID NO：30至44中任何一个的氨基酸1-120或SEQID NO：49中列出的序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列的VH，其中所述蛋白质能够特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，其不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。替换地或另外，所述蛋白质包含与如在本文中根据任何实施例所述的VH的CDR(s)至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的CDR(例如，三个CDR)，且能够特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述蛋白质不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。用于测定蛋白质与IL-23、IL-23p19和IL-12p40的结合的方法在本文中描述。
例如，本发明人已经制备了在约30％的残基处具有变化的一系列VH区域。因此，蛋白质可包含包含与在本文中公开的VH序列至少约70％相同的序列的VH。在一个实施例中，所述序列至少85％或95％相同。
本发明人还制备了在约11％的残基处具有变化的一系列人源化VH区域。因此，蛋白质可包含包含与在本文中公开的VH序列至少约89％相同的序列的VH。在一个实施例中，所述序列至少90％或95％相同。
本发明人已经识别了在根据Kabat编号系统的重链CDR2中的残基，其可突变，同时保持特异地结合IL-23，而在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。例如，16个残基中的两个可突变(12.5％的残基)。因此，蛋白质可包含与在本文中公开的重链CDR2序列具有至少约87.5％同一性的CDR2。
如在本文中论述，在本领域中还已知重链CDR2的五个C-端残基可突变成保守或非保守氨基酸取代(31％的残基)(Padlan等，FASEBJ.，9：133-139，1995)。因此，蛋白质可包含与在本文中公开的重链CDR2序列具有至少约69％同一性的CDR2。
本发明人还已经识别了在根据加强的Chothia编号系统的重链CDR1中的残基，其可突变，同时保持特异地结合IL-23，而在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。例如，七个残基中的两个可突变(28％或43％的残基)或七个残基中的三个可突变(43％的残基)。因此，蛋白质可包含与在本文中公开的重链CDR1序列具有至少约72％同一性的CDR2。
在另一实施例中，本公开的核酸包含与在SEQ ID NO：6、19、57至71或76中的任何一个中列出的序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列。本公开还涵盖编码包含SEQID NO：SEQ ID NO：7、26、28中或在SEQ ID NO：30至44中任何一个的氨基酸1-120或SEQ ID NO：49中列出的序列的蛋白质的核酸，其不同于由于遗传密码的简并产生的在本文中例示的序列。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白包含包含与在SEQ IDNO：12中或在SEQ ID NO：45至48中任何一个的氨基酸1-113或SEQID NO：50中列出的序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列的VL，其中所述蛋白质能够特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，其不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。替换地或另外，所述蛋白质包含与如在本文中根据任何实施例所述的VL的CDR(s)至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的CDR(例如，三个CDR)，且能够特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，所述蛋白质不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基。
例如，本发明人已经制备了在约32％的残基处具有变化的一系列VL区域。因此，蛋白质可包含包含与在本文中公开的VL序列至少约68％相同的序列的VL。在一个实施例中，所述序列至少85％或95％相同。
本发明人还制备了在约14％的残基处具有变化的一系列人源化VL区域。因此，蛋白质可包含包含与在本文中公开的VH序列至少约86％相同的序列的VH。在一个实施例中，所述序列至少90％或95％相同。
在另一实施例中，本公开的核酸包含与在SEQ ID NO：11、18、72至75或77中的任何一个中列出的序列至少约80％或85％或90％或95％或97％或98％或99％相同的序列。本公开还涵盖编码包含SEQID NO：12、27、29中的任何一个中或在SEQ ID NO：45至48中任何一个的氨基酸1-113或SEQ ID NO：50中列出的序列的蛋白质的核酸，其不同于由于遗传密码的简并产生的在本文中例示的序列。
核酸或多肽的％同一性通过GAP(Needleman和Wunsch.Mol.Biol.48，443-453，1970)分析(GCG程序)在间距产生罚分(gap creationpenalty)＝5和间距延长罚分(gap extension penalty)＝0.3下测定。询问序列的长度为至少50个残基，且GAP分析在至少50个残基的区域上比对这两个序列。例如，询问序列的长度为至少100个残基，且GAP分析在至少100个残基的区域上比对这两个序列。在一个实施例中，这两个序列在其整个长度上比对。
本公开涵盖本公开的IL-23结合蛋白的突变形式。例如，与在本文中列出的序列相比较，这种突变蛋白质包含一处或多处保守氨基酸取代。在一些实施例中，所述IL-23结合蛋白包含10处或更少、例如9或8或7或6或5或4或3或2或1处保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有类似侧链和/或亲水性(hydropathicity)和/或亲水性(hydrophilicity)的氨基酸残基置换的情况。
在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组胺酸)。亲水(hydropathic)指数例如描述在Kyte和Doolittle J.Mol.Biol.，157：105-132，1982中且亲水(hydrophylic)指数描述在例如US4554101中。
本公开还涵盖非保守氨基酸替换。例如，特别值得注意的是带电的氨基酸被另一带电的氨基酸和被中性或带正电的氨基酸取代。在一些实施例中，所述蛋白质包含10处或更少、例如9或8或7或6或5或4或3或2或1处非保守氨基酸取代。
在本文中根据任何实施例描述的蛋白质的突变形式保留特异地结合IL-23、而在IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基不是IL-23的组分时不显著地结合IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基的能力。用于测定与IL-23的特异地结合的方法在本文中描述。例如，使标记的蛋白质与固定的IL-23或IL-12p40亚基或IL-23p19亚基接触。在洗涤之后，检测结合的标记物。还使标记的蛋白质与固定的IL-23p19和/或IL-12p40接触，且在洗涤之后，检测结合的标记物。检测到标记物与IL-23结合、而不与IL-23p19或IL-12p40结合，指示突变蛋白质保留特异地结合IL-23的能力。在上述方法中的任选另外步骤包括检测与IL-23p19亚基或/和IL-12p40亚基结合的标记物。如果检测到标记物与IL-23结合，但不与IL-12p40和/或IL-23p19显著地结合，则认为所述蛋白质特异地结合IL-23，而在IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基不是IL-23的组分时，不显著地结合IL-12p40亚基和/或IL-23p19亚基。
在一个实施例中，突变发生在本公开的IL-23结合蛋白的FR内。在另一实施例中，突变发生在本公开的IL-23结合蛋白的CDR内。
用于制备蛋白质的突变形式的示例性方法包括：
●DNA的诱变(Thie等，Methods Mol Biol.525：309-22，2009)或RNA的诱变(Kopsidas等，Immunol.Lett.107(2)：163-8，2006；WO1999/058661)；
●向例如XL-1Red、XL-mutS和XL-mutS-Kanr细菌细胞(Stratagene)的突变基因细胞中引入编码多肽的核酸；
●DNA改组，例如，如在Stemmer，Nature370：389-91，1994中所公开；和
●定点突变，例如，如在Dieffenbach(编)和Dveksler(编)(在PCRPrimer：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NY，1995中)中所述。
用于测定本公开的突变蛋白质的生物活性的示例性方法对于技术人员是显而易见的和/或在本文中描述。例如，用于测定抗原结合、结合的竞争性抑制、亲和力、缔合、分解和治疗效能的方法在本文中描述。
在一个实施例中，突变蛋白质通过亲和力成熟或遵循亲和力成熟来生产。
示例性蛋白质
由本发明人生产的示例性含有可变区的蛋白质及其编码核酸描述在表1中。
表1：蛋白质和编码核酸的序列
1仅可变区序列。
用于生产蛋白质的方法
重组表达
如在本文中论述，将编码本公开的IL-23结合蛋白(和/或在所述蛋白质中包括的多肽)的核酸引入表达构建体中，使得其操作性地连接到启动子，由此促机其表达。用于生产表达构建体(例如，克隆成表达构建体/载体)的方法在本领域中已知和/或描述在Ausubel等(在Current Protocols in Molecular Biology.Wiley Interscience，ISBN047150338，1987中)和(Sambrook等，(在Molecular Cloning：MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratories，NewYork，第三版，2001中)和US7270969中。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白表达在细菌细胞中。适合在细菌细胞中表达的典型启动子包括但不限于如下启动子，如lacz、Ipp、温度敏感(L或(R启动子、T7、T3、SP6或半人工启动子，如IPTG可诱导的tac启动子或lacUV5启动子，所述细菌细胞选自包含大肠杆菌、葡萄球菌属、棒状杆菌属、沙门氏菌属、芽胞杆菌属和假单胞菌属。
在另一实施例中，所述IL-23结合蛋白表达在酵母细胞中。适合在如巴斯德毕赤氏酵母(Pichia pastoris)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)和非洲粟酒酵母(S.pombe)的酵母细胞中表达的典型启动子包括但不限于来自以下基因ADH1、GAL1、GAL4、CUP1、PHO5、nmt、RPR1或TEF1的启动子。
在另一实施例中，所述IL-23结合蛋白表达在昆虫细胞中。适合在昆虫细胞中或在昆虫中表达的典型启动子包括但不限于OPEI2启动子、从家蚕(Bombyx muri)中分离的昆虫肌动蛋白启动子、果蝇属dsh启动子(Marsh等，Hum.Mol.Genet.9，13-25，2000)。
本公开的IL-23结合蛋白也可表达在植物细胞中。用于在植物细胞中表达肽的启动子在本领域中已知，且包括但不限于大麦淀粉酶基因启动子、花椰菜花叶病毒35S启动子、胭脂氨酸合酶(NOS)基因启动子和茁长素可诱导的植物启动子P1和P2。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白表达在哺乳动物细胞中或在哺乳动物中。适合在哺乳动物细胞中表达的典型启动子包括例如选自由逆转录病毒LTR成分、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、CMV IE(巨细胞病毒即刻早期)启动子、EF1(启动子(来自人延伸因子1)、EM7启动子、UbC启动子(来自人泛素C)组成的组的启动子。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例包括由SV40转变的猴肾CV1系(COS-7)；人胚肾系(HEK-293细胞)；幼仓鼠肾细胞(BHK)；中国仓鼠卵巢细胞(CHO)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76)；或骨髓瘤细胞(例如，NS/0细胞)。在一个实施例中，所述细胞为CHO细胞。
表达构建体/载体的其它成分在本领域中已知且包括例如增强子、转录终止子、聚腺苷酸化序列、编码可选择或可检测的标志物的核酸和复制起点。
在一个实施例中，表达构建体为双顺反子表达构建体。“双顺反子”是指能够编码来自核酸的不同区域的两种不同的多肽的单一核酸分子，例如，能够编码含有多肽的VH和含有作为不同多肽的多肽的VL的单一核酸。一般来讲，编码各种不同多肽的区域由内部核糖体进入部位(IRES)隔开且IRES的区域5’不包含转录终止序列。示例性IRESs例如描述在US20090247455中。
在制备合适的表达构建体之后，使用本领域已知的任何方法将其引入合适的细胞中。示例性方法尤其包括微量注射；由DEAE-葡聚糖介导的转染；由脂质体介导的转染，如通过使用lipofectamine(Gibco，MD，USA)和/或cellfectin(Gibco，MD，USA)介导的转染；PEG介导的DNA吸收；如通过使用DNA涂布的钨或金粒子进行的电穿孔和微粒轰击(Agracetus Inc.，WI，USA)。
随后将用以制备本公开的IL-23结合蛋白的细胞在本领域已知的条件下培养以制备本公开的IL-23结合蛋白。
本公开还涵盖无细胞表达系统，例如TNT T7和TNT T3系统(Promega)、pEXP1-DEST和pEXP2-DEST载体(Invitrogen)。
蛋白质纯化
在生产/表达之后，本公开的IL-23结合蛋白使用本领域已知的方法纯化。所述纯化通常提供大致上不含非特异性蛋白、酸、脂质、碳水化合物等的本公开的IL-23结合蛋白。例如，所述IL-23结合蛋白将以如下制剂形式，其中在所述制剂中大于约90％(例如95％、98％或99％)的蛋白质为本公开的IL-23结合蛋白。
使用肽纯化的标准方法来获得本公开的分离蛋白，其包括但不限于各种高压(或高效)液相色谱(HPLC)和非HPLC多肽分离方案，如尺寸排阻色谱、离子交换色谱、相分离方法、电泳分离、沉淀法、盐溶/盐析法、免疫色谱和/或其它方法。
替换地，可使用亲和力纯化以分离包含标记物的融合蛋白。使用亲和力色谱分离蛋白质的方法在本领域中已知且例如描述在Scopes(在Protein purification：principles and practice，第三版，SpringerVerlag，1994中)中。例如，与标记物(在多组氨酸标签的情况下，其可为例如镍-NTA)结合的抗体或化合物可固定在固体载体上。随后使包含蛋白质的样品与固定的抗体或化合物在足以发生结合的条件下接触历时足以发生结合的时间。在洗涤以除去任何未结合或非特异地结合的蛋白质之后，洗脱出蛋白质。
在包含抗体的Fc区的蛋白质的情况下，可使用蛋白质A或蛋白质G或其修饰形式来亲和力纯化。可使用蛋白质A来分离包含人γ1、γ2或γ4重链Fc区的纯化的蛋白质。蛋白质G被推荐用于所有小鼠Fc同种型和人γ3。
偶联物
本公开还提供与另一化合物、例如偶联物(或免疫偶联物)偶联的本公开的IL-23结合蛋白。所述另一化合物可与所述IL-23结合蛋白直接或间接地结合(例如，在间接结合的情况下，可包含接头)。所述化合物可共价或非共价连接所述IL-23结合蛋白。化合物的实例包括放射性同位素(例如，碘-131、钇-90或铟-111)、可检测的标记物(例如，荧光团或荧光纳米晶体)、治疗化合物(例如，化学治疗化合物或消炎化合物)、胶体(例如，金)、毒素(例如，蓖麻毒或破伤风类毒素)、核酸、肽(例如，血清白蛋白结合肽)、蛋白质(例如，包含抗体的抗原结合域的蛋白质或血清白蛋白)、增加蛋白质在受试者中的半衰期的化合物(例如，聚乙二醇或具有所述活性的其它水溶性聚合物)及其混合物。可与本公开的IL-23结合蛋白偶联的示例性化合物及用于所述偶联的方法在本领域中已知且例如描述在WO2010/059821中。
抗独特型抗体
除了特异地结合IL-23的本公开的IL-23结合蛋白以外，本公开还提供对本公开的蛋白质具有特异性的抗独特型(抗Id)抗体。抗Id抗体为辨认通常与本公开的IL-23结合蛋白的抗原结合域相关的独特决定子的抗体。所述抗Id可通过用本公开的蛋白质或其抗原结合域使动物免疫来制备。所述免疫的动物将辨认并响应免疫蛋白质的独特决定子且制备抗Id抗体。所述抗Id抗体还可用作“免疫原”以诱导在又一动物中的免疫响应，制备所谓的抗抗Id抗体。
筛选测定
可容易地筛选本公开的包含抗体可变区的蛋白质的生物活性，例如，如下文中所述。
结合测定
所述测定的一种形式是抗原结合测定，例如，如在Scopes(在Protein purification：principles and practice，第三版，Springer Verlag，1994中)中所述。所述方法通常包括标记IL-23结合蛋白且使其与固定的抗原接触。在洗涤以除去非特异地结合的蛋白质之后，检测标记物的量，且因此检测结合的蛋白质的量。当然，所述IL-23结合蛋白可被固定且所述抗原可被标记。还可使用淘选型测定，例如，如在本文中描述并例示。
中和测定
用于测定本公开的IL-23结合蛋白的作用(或中和活性)的示例性活体外方法是使IL-23与包含IL-23对其起作用的免疫细胞的细胞群在存在或不存在本公开的IL-23结合蛋白的情况下接触。随后使用例如13H胸腺嘧啶核苷并入或5，6-羧基荧光素二乙酸酯琥珀酰亚胺基酯(CFSE)标记和/或细胞因子分泌的标准方法测量细胞增殖。与在不存在所述蛋白质的情况下孵育的样品相比较，细胞增殖和/或细胞因子分泌的增加或降低指出IL-23结合蛋白调节IL-23活性。所述方法在本文中例示。
用于测定本公开的IL-23结合蛋白中和IL-23活性的能力的另一方法是受体结合测定。在这种方法中，将IL-23受体或表达其的细胞固定。随后使标记的IL-23(例如，在50ng/ml与150ng/ml之间，如100ng/ml)与固定的受体或细胞在存在或不存在试验蛋白质的情况下接触并检测结合的标记物的量。所述IL-23结合蛋白和所述IL-23可在接触受体之前彼此接触或可大致上同时与受体接触。与在不存在IL-23结合蛋白的情况相比较，在存在IL-23结合蛋白的情况下结合的标记物的量减少指出蛋白质减少或防止IL-23与IL-23R的结合。
通过试验多种浓度的IL-23结合蛋白，测定IC50，即减少与IL-23R结合的IL-23的量的蛋白质的浓度。在一个实施例中，所述IC50为约1nM或更低，如750pM或更低，例如500pM或更低。例如，所述IC50为400pM或更低。在一个实施例中，所述IC50在约1pM至500pM之间，例如在约50pM至450pM之间。例如，所述IC50在约100pM至400pM之间，例如在约150pM至400pM之间。
类似地，可测定EC50，即实现由所述蛋白质实现的对IL-23与IL-23R的结合的最大抑制作用的50％的蛋白质的浓度。在一个实施例中，所述EC50为1nM或更低，例如750pM或更低，例如500pM或更低，如400pM或更低。在一个实施例中，所述EC50为约300pM或更低。例如，所述EC50为约260pM。
用于测定本公开的IL-23结合蛋白中和IL-23活性的能力的另一方法是使脾细胞与IL-23在存在或不存在IL-23结合蛋白的情况下接触和检测如IL-17的细胞因子的分泌。与在不存在所述蛋白质的情况下相比较，在存在所述蛋白质的情况下较低水平的所述细胞因子指出所述蛋白质中和IL-23活性。通过试验多种浓度的所述蛋白质，测定IC50，即，发生细胞因子分泌的最大抑制作用的50％的浓度。
通过试验多种浓度的IL-23结合蛋白，测定IC50，即减少分泌的细胞因子(例如IL-17)的量的蛋白质的浓度。在一个实施例中，所述IC50为约1nM或更低，如900pM或更低，例如800pM或更低。例如，所述IC50为700pM或更低。在一个实施例中，所述IC50在约1pM至800pM之间，例如在约50pM至700pM之间。例如，所述IC50在约100pM至700pM之间，例如在约120pM至680pM之间。
类似地，可测定EC50，即实现由所述蛋白质实现的对细胞因子(例如，IL-17)分泌的最大抑制作用的50％的蛋白质的浓度。在一个实施例中，所述EC50为1nM或更低，例如500pM或更低，如400pM或更低。在一个实施例中，所述EC50为约300pM或更低。例如，所述EC50为约290pM。
细胞杀死测定
在另一实施例中，本公开的IL-23结合蛋白(例如，连接毒性化合物或恒定区)的能力通过测定其诱导细胞死亡的能力来评定。在Fc连接的蛋白质的情况下，希望在存在免疫效应细胞和/或补体(例如，以促进ADCC/CDC)的情况下进行所述测定。
体内治疗效能测定
在另一实施例中，本公开的IL-23结合蛋白的活性通过向动物模型施用所述IL-23结合蛋白来测定。例如，将所述IL-23结合蛋白施用到NOD小鼠以试验其抑制、预防、治疗或延迟糖尿病(例如，如在Tang等，J.Exp.Med.，199：1455-1465，2004中所述)的能力和/或施用到GVHD小鼠模型(例如，如在Trenado等，J.Clin.Invest.，112：1688-1696，2002中所述)和/或牛皮癣小鼠模型(例如Wang等，J ClinInvest.118(7)：2629-2639，2008)和/或类风湿性关节炎模型，例如小鼠的SKG株(Sakaguchi等，Nature，426：454-460，1995)、大鼠II型胶原关节炎模型、小鼠II型胶原关节炎模型或在多种物种中的抗原诱导的关节炎模型(Bendele J Musculoskel Neuron Interact；1(4).：377-385，2001)和/或多发性硬化模型(例如，实验性自体免疫性脑脊髓炎(EAE)和/或炎性气管疾病(例如，OVA激发或蟑螂抗原激发)。
在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白的活性在IL-23诱导的牛皮癣动物模型中测定，例如，如在本文中例示。例如，非人哺乳动物(例如，小鼠)经皮下施用IL-23以便诱导局部化炎性响应。在施用IL-23之前和之后测试蛋白质通过施用来预防或治疗炎性响应的能力。随后评定动物的红斑和/或硬化和/或自各小鼠收集皮肤样品并固定以便组织评定。
竞争性结合测定
本公开的用于测定竞争性抑制抗体的结合的蛋白质的测定对于本领域的技术人员是显而易见的。例如，使本公开的抗体与例如荧光标记物或放射性标记物的可检测的标记物偶联。随后将所述标记的抗体与试验蛋白质混合且使其与IL-23或其表位接触。随后测定标记的抗体的水平且将其与在不存在所述蛋白质的情况下使标记的抗体与IL-23或表位接触时测定的水平相比较。如果与在不存在试验蛋白质的情况下相比较，标记的抗体的水平在存在试验蛋白质的情况下降低，所述蛋白质则竞争性抑制所述抗体的结合。
任选地，使试验蛋白质与除所述抗体以外的不同的标记物偶联。这容许检测试验蛋白质与所述蛋白质或表位结合的水平。
在另一实施例中，容许试验蛋白质在使IL-23与如本文所述的抗体接触之前结合IL-23或其区域。与在不存在所述蛋白质的情况相比较，在存在所述蛋白质的情况下结合的抗体的量减少指出所述蛋白质竞争性抑制所述抗体与IL-23的结合。交互测定还可使用标记的蛋白质且首先允许抗体与IL-23结合来进行。在这种情况下，与在不存在抗体的情况相比较，在存在所述抗体的情况下与IL-23结合的标记的蛋白质的量减少指出所述蛋白质竞争性抑制所述抗体与IL-23的结合。
表位定位测定
在另一实施例中，将由本文所述的蛋白质结合的表位定位。表位定位方法对于本领域的技术人员将是显而易见的。例如，生产一系列跨越包含目标表位的IL-23序列或其区域的重叠肽，例如，包含10-15个氨基酸的肽。随后使所述IL-23结合蛋白与各种肽或其组合接触且测定其所结合的肽。这容许测定包含所述IL-23结合蛋白结合的表位的肽。如果多个非邻近肽由蛋白质结合，则所述蛋白质可结合构象表位。
替换地或另外，在IL-23内的氨基酸残基例如通过丙氨酸扫描诱变而突变，且测定减少或防止蛋白质结合的突变。减少或防止所述IL-23结合蛋白的结合的任何突变很可能在由所述蛋白质结合的表位内。
又一方法包括使IL-23或其区域与本公开的固定的蛋白质结合且用蛋白酶消化所得复合物。随后分离保持与固定的蛋白质结合的肽且例如使用质谱分析以测定其序列。
又一方法包括将在IL-23或其区域中的氢转化成氘原子且使所得蛋白质与本公开的固定的蛋白质结合。随后使氘原子变回氢，分离IL-23或其区域，用酶消化并例如使用质谱分析以识别包含氘的那些区域，其可能已经通过本文所述的蛋白质的结合而被保护而没有转化成氢。所述方法的一种形式在本文中例示。
亲和力测定
任选地，测定蛋白质对IL-23或其表位的解离常数(Kd)或缔合常数(Ka)或亲和力常数(KD)。IL-23结合蛋白的这些常数在一个实施例中通过放射性标记或荧光标记的IL-23结合测定来测量。所述测定使得在存在滴定系列的未标记的IL-23的情况下蛋白质与极低浓度的标记的IL-23平衡。在洗涤以除去未结合的IL-23之后，测定标记物的量。
亲和力测量可通过对于抗体反应的标准方法学、例如免疫测定、表面等离子体共振(SPR)(Rich和Myszka Curr.Opin.Biotechnol11：54，2000；Englebienne Analyst.123：1599，1998)、等温滴定热量测定法(ITC)或本领域已知的其它动力学相互作用测定来测定。
在一个实施例中，所述常数使用表面等离子体共振测定，例如使用BIAcore表面等离子共振(BIAcore，Inc.，Piscataway，NJ)用固定的IL-23或其区域来测量。示例性SPR方法描述在US7229619中。
半衰期测定
由本公开涵盖的一些蛋白质具有改善的半衰期，例如被修饰以与未被修饰的蛋白质相比较延长其半衰期。用于测定具有改善的半衰期的蛋白质的方法对于技术人员将是显而易见的。例如，评定蛋白质结合新生Fc受体(FcRn)的能力。在这方面，对于FcRn的结合亲和力增加使得分子的血清半衰期增加(参见，例如Kim等，Eur J Immunol.，24：2429，1994)。
本公开的IL-23结合蛋白的半衰期还可以通过药物动力学研究，例如根据Kim等，Eur J of Immunol24：542，1994描述的方法来测量。根据所述方法，将放射性标记的蛋白质静脉内注射到小鼠中且在注射之后作为时间的函数，例如在3分钟至72小时定期测量其血浆浓度。这样得到的清除曲线应该为双相性的，即α相和β相。对于蛋白质的体内半衰期的测定，计算在β相中的清除率且将其与野生型或未修饰的蛋白质的清除率相比较。
稳定性测定
本公开的IL-23结合蛋白的稳定性可通过多种测定中的任一种来评定。例如，将蛋白质暴露于一种条件，例如热或酸或在室温下储存一段时间(例如，1个月)。蛋白质的聚结因此可通过测定混浊度(在暴露于所述条件之后混浊度增加指出不稳定性)、尺寸排阻色谱、非还原凝胶电泳或如在本文中描述的结合或中和研究来评定。
药物组合物
本公开的IL-23结合蛋白或编码其的核酸或表达其的细胞(同义词：活性成分)可用于肠胃外、局部(topical)、口服或局部(local)施用、气溶胶施用或经皮施用、预防或治疗。在一个实施例中，本公开的IL-23结合蛋白或编码其的核酸或表达其的细胞用于肠胃外施用，如静脉内或皮下施用。
欲施用的蛋白质或编码其的核酸或表达其的细胞的配制可根据施用途径和所选择的制剂(例如，溶液、乳液、胶囊)而不同。包含欲施用的蛋白质或编码其的核酸或表达其的细胞的适当药物组合物可在生理学上可接受的载体中制备。还可使用蛋白质的混合物。对于溶液或乳液来讲，合适的载体包括例如水性或醇/水溶液、乳液或悬浮液，包括盐水和缓冲介质。肠胃外媒剂可包括氯化钠溶液、林格氏右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格氏或固定油。本领域的技术人员已知多种适当的水性载体，包括水、缓冲的水、缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)、右旋糖溶液和甘氨酸。静脉内媒剂可包括各种添加剂、防腐剂或流体、营养素或电解质补充剂(参见，通常，Remington′s Pharmaceutical Science，第16版，Mack，Ed.1980)。所述组合物任选可含有根据需要以接近生理条件的药学上可接受的助剂物质，如pH调节和缓冲剂和毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙和乳酸钠。本公开的IL-23结合蛋白可根据本领域已知的冻干法和重构技术来冻干以便储存和在使用前在合适的载体中重构。
活性成分在所选择的介质中最优浓度可根据技术人员熟知的程序凭经验测定，且将取决于所要的最终药物制剂。
用于施用本公开的IL-23结合蛋白的剂量范围为足够大以产生所要的作用的那些剂量范围。例如，所述组合物包含治疗或预防有效量的IL-23结合蛋白或编码其的核酸或表达其的细胞。
如在本文中使用，术语“有效量”将用以指诱导/增加或抑制/减少/防止IL-23在受试者中发出信号的足够量的IL-23结合蛋白、核酸或细胞。技术人员将知道所述量将视例如蛋白质、核酸或细胞和/或特定的受试者和/或欲治疗的病状的类型或严重性而不同。因此，所述术语并不被解释为限制本公开于具体的量，例如蛋白质、核酸或细胞的重量或数量。
如在本文中使用，术语“治疗有效量”将用以指减少或抑制病状的一种或多种症状的足够量的蛋白质、核酸或细胞。
如在本文中使用，术语“预防有效量”将用以指防止或抑制或延迟病状的一种或多种可检测的症状的起始的足够量的蛋白质、核酸或细胞。
所述剂量不应该大到导致不良的副作用，如高黏滞综合征、肺水肿、充血性心力衰竭等。一般来讲，所述剂量将随着患者的年龄、病状、性别和疾病程度而变化且可由本领域的技术人员来测定。如果有任何并发症，则所述剂量可由单个医师调节。剂量可自约0.1mg/kg至约300mg/kg变化，例如自0.2mg/kg至约200mg/kg变化，如自约0.5mg/kg至约20mg/kg变化，每日施用一剂或多剂历时1天或数天。
本公开的一种或多种蛋白质可通过适当路径单独地或与另一药物或药剂组合(在之前、同时或在之后)施用到个体。例如，本公开的IL-23结合蛋白还可与例如TNF拮抗剂、抗IL-12/23抗体、消炎或止痛药的蛋白质组合使用。本公开的IL-23结合蛋白可作为结合抗生素和/或抗微生物剂给出的单独施用的组合物使用。
本领域的技术人员应了解本公开的IL-23结合蛋白可通过施用本公开的表达构建体或表达本公开的IL-23结合蛋白的细胞而引入受试者中。可使用多种方法来将编码抗体的核酸体内引入靶细胞中。例如，可将裸核酸在目标部位注射，可包封到脂质体中或者可通过病毒载体引入。
诊断测定
以下测定可用本公开的IL-23结合蛋白进行。
免疫测定是用于诊断受试者中的病状或检测在样品中的IL-23的示例性测定格式。本公开涵盖任何形式的免疫测定，包括西方印迹、酶联免疫吸附测定(ELISA)、荧光联合的免疫吸附测定(FLISA)、竞争测定、放射免疫测定、侧流免疫测定、溢流免疫测定、电致化学发光测定、基于浊度(nephelometric)的测定、基于浊度(turbidometric)的测定和基于荧光活化细胞拣选(FACS)的测定。
合适免疫测定的一种形式例如为ELISA或FLISA。
在一种形式中，所述测定包括将本公开的IL-23结合蛋白固定到如聚苯乙烯或聚碳酸酯微孔或量杆、膜或玻璃载体(例如，载玻片)的固体基质上。随后使试验样品与IL-23结合蛋白直接接触且结合或捕捉在样品中的任何抗原。在洗涤以除去在样品中的任何未结合的蛋白质之后，使在不同表位结合IL-23(例如，结合IL-23p19或IL-12p40)的蛋白质与捕捉的抗原直接接触。所述检测子蛋白质通常用如酶(例如，辣根过氧化物酶(HRP))、碱性磷酸酶(AP)或β-半乳糖苷酶的可检测的报道分子标记。替换地，可使用结合检测子蛋白质的第二标记的蛋白质。在洗涤以除去任何未结合的蛋白质之后，可检测的标志物通过加入如过氧化氢、TMB或甲苯胺或5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(x-gal)的底物来检测。当然，可以相反的方式使用固定(捕捉)的蛋白质和检测子蛋白质。
在样品中抗原的水平随后使用已经使用已知量的标志物制备的标准曲线或通过与对照样品相比较来测定。
在FLISA的情况下，使用荧光标记物而不是酶来测定在样品中标记的蛋白质的水平。
上述测定被容易地改进以使用化学发光或电致化学发光作为检测的基出。
如技术人员将显而易见的，在本公开的实行中可使用基于免疫吸附测定的其它检测方法。例如，免疫吸附方法基于上述使用用于检测的放射性标记物或用于检测的金标记物(例如，胶态金)，或用于检测的例如包封NAD+的脂质体或吖啶酯联合的免疫吸附测定。
在本公开的一些实施例中，IL-23的水平使用表面等离子体共振检测器(例如，BIAcoreTM，GE Healthcare，Piscataway，N.J.)、溢流装置，(例如，如在US7205159中所述)；微或纳米-免疫测定装置(例如，如在US20030124619中所述)；测流装置(例如，如在US20040228761或US20040265926中所述)；荧光偏振免疫测定(FPIA，例如，如在US4593089或US4751190中所述)；或免疫浊度测定(例如，如在US5571728或US6248597中所述)测定。
成像方法
如技术人员将从上述内容中了解到，本公开还涵盖使用本公开的IL-23结合蛋白的成像方法。对于成像，蛋白质通常与可检测的标记物偶联，所述可检测的标记物可为可发射可通过成像检测的信号的任何分子或试剂。然而，还可使用特异地结合本公开的IL-23结合蛋白的第二标记的化合物。示例性可检测的标记物包括蛋白质、放射性同位素、荧光团、发射可见光的荧光团、发射红外光的荧光团、金属、铁磁物质、电磁发射物质、具有特定的磁共振(MR)光谱图象的物质、吸收或反射X射线的物质或改变声音的物质。
本公开的IL-23结合蛋白(和，如果使用的话，标记的第二化合物)可在成像程序之前全身或局部地施用到欲成像的器官或组织(或者在癌症的情况下，肿瘤)。一般来讲，所述IL-23结合蛋白以有效获得肿瘤、组织或器官的光学图像的剂量施用。所述剂量可视所使用的特定蛋白质、欲成像的条件、经受成像程序的组织或器官、使用的成像设备等而广泛变化。
在本公开的一些实施例中，所述IL-23结合蛋白作为组织和器官的体内光学成像剂用于各种生物医学应用中，所述生物医学应用包括但不限于肿瘤的成像、器官的断层摄影成像、器官功能的监测、冠状血管造影、荧光内腔镜检查、激光引导手术、光声和声致荧光法等。
成像方法的实例包括磁共振成像(MRI)、MR光谱学、射线照相法、计算机化断层摄影(CT)、超声波、平面γ照相机成像、单光子发射计算机断层摄影(SPECT)、正电子发射断层摄影(PET)、其它基于核医学的成像、使用可见光的光学成像、使用荧光素酶的光学成像、使用荧光团的光学成像、其它光学成像、使用近红外光的成像或使用红外光的成像。
在一些实施例中，成像剂在于人中使用前使用活体外或体内测定，例如使用本文所述的模型来试验。
样品和对照样品
如技术人员将显而易见的，本文所述的一些实施例需要一定程度的量化以测定IL-23的水平。所述量化可通过在本公开的测定中包括合适的对照样品来测定。
在一个实施例中，合适的对照样品是来源于健康受试者或正常受试者的样品。
在本公开的上下文中，术语“健康的受试者”将用以指已知不遭受例如炎性病状的与IL-23相关的病状的个体。
术语“正常受试者”将用以指与个体群相比较在样品中具有正常水平的IL-23的个体。
本公开还涵盖作为从正常和/或健康受试者或正常和/或健康受试者群中获得的数据组的对照样品。
在一个实施例中，本公开的方法另外包括例如使用本文所述的方法测定在对照样品中IL-23的水平。
在一个实施例中，来自受试者的样品和对照样品大约或大致上同时测定。
在一个实施例中，来自受试者的样品和对照样品使用如在本文中在任何一个或多个实施方案中所述的本公开的相同方法测定以允许比较结果。
病状
可通过进行本公开的方法治疗/预防/诊断/预后的示例性病状包括炎性疾病、GVHD、感染和癌症。
示例性炎性病状包括炎性肠病(IBD)、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、少年慢性关节炎、脊柱关节病、系统性硬化(硬皮病)、特发性炎性肌病(皮肌炎、多肌炎)、修格兰氏综合征(Sogren′s syndrome)、全身性血管炎、结节病、自身免疫性溶血性贫血(免疫全血细胞减少症、阵发性睡眠性血红蛋白尿)、自体免疫血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜、免疫介导的血小板减少)、甲状腺炎、Grave′s病、桥本氏甲状腺炎(Hashimoto′s thyroiditis)、少年淋巴细胞性甲状腺炎、萎缩性甲状腺炎)、糖尿病、免疫介导的肾病(肾小球性肾炎、小管间质性肾炎)、中枢和周围神经系统的脱髓鞘疾病，如多发性硬化、特发性多神经病，肝胆疾病，如传染性肝炎(A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎、D型肝炎、E型肝炎及其它非嗜肝病毒)、自体免疫慢性活动型肝炎、原发性胆汁性肝硬化、肉芽肿肝炎和硬化性胆管炎、炎性和纤维化肺病(例如，囊性纤维变性)、谷蛋白敏感性肠病、惠普尔氏疾病(Whipple′s disease)、自体免疫或免疫介导的皮肤病，包括大疱性皮肤病、多形性红斑和接触性皮炎、牛皮癣，肺的变应性疾病，如嗜酸细胞性肺炎、特发性肺纤维变性和过敏性肺炎。
例如，所述炎性疾病为炎性关节炎，例如RA或少年慢性关节炎。
在另一实施例中，所述炎性疾病为炎性神经病学病状例如髓鞘质相关病状，例如多发性硬化。
在另一实施例中，所述炎性疾病为炎性皮肤病(例如，自体免疫或免疫介导的皮肤病)，例如大疱性皮肤病、多形性红斑、接触性皮炎。替换地，所述皮肤病为牛皮癣。
在另一实施例中，所述炎性疾病为炎性粘膜病状，例如肠的炎性疾病(例如，炎性肠病、克罗恩氏病或溃疡性结肠炎)或肺的炎性疾病(例如，气管机能亢进或哮喘)。
在一个实施例中，病状为TH17细胞介导的病状。如在本文中使用，术语“TH17细胞介导的病状”将用以指由TH17细胞的过度数量或活性表征或引起的任何病状。技术人员将知道TH17细胞为表达IL-17的CD4+T细胞。示例性TH17细胞介导的病状包括自体免疫/炎性病状(例如，牛皮癣、炎性肠病、关节炎(例如，类风湿性关节炎)、多发性硬化和炎性肠病(例如，克罗恩氏病))和移植物对宿主疾病。
在一个实施例中，病状为牛皮癣。
在另一实施例中，病状为克罗恩氏病。
在又一实施例中，病状为多发性硬化。
在一个实施例中，所述多发性硬化为复发缓解型多发性硬化，且所述IL-23结合蛋白或抗体在所述病状处于恢复期时施用，由此防止复发。
试剂盒
本公开另外包含包含以下中的一个或多个的试剂盒：
(i)本公开的IL-23结合蛋白或编码其的表达构建体；
(ii)本公开的细胞；或
(iii)本公开的药物组合物。
在用于检测IL-23的试剂盒的情况下，所述试剂盒可另外包含检测工具，例如与本公开的IL-23结合蛋白连接的检测工具。
在用于治疗/预防用途的试剂盒的情况下，所述试剂盒可另外包含药学上可接受的载体或稀释剂。
任选地，本公开的试剂盒用在本文中根据任何实施方案描述的方法中使用的说明书包装。
本公开在以下非限制性实施例中进一步描述。
通用方法
HEK293/pTT5表达系统
对于包括HEK293E/pTT5表达系统的所有转染，将HEK293E细胞在全细胞生长培养基(1L的F17培养基(InvitrogenTM)、9ml的Pluronic F68(InvitrogenTM)、2mM具有Geneticin(50mg/ml，InvitrogenTM)的含有20％(w/v)Tryptone NI(OrganotechnieTM)的谷氨酰胺，在50μl/100ml培养物下)培养。简要地讲，在转染的前一天，将细胞通过离心分离收获并再悬浮在没有Geneticin的新鲜培养基中。在下一天，细胞通过逐滴加入包含DNA和FuGENE(Roche)的转染混合物根据制造商的说明书转染。将转染的培养物在37℃、5％CO2下在温和振荡(120rpm)下孵育过夜，之后加入Tryptone和Geneticin(每500mL培养物体积分别12.5mL和250μL)。下一天，每500ml培养物加入12.5ml Tryptone和250μl遗传霉素。将培养物在37℃、5％CO2和120rpm下孵育7天，随后收获上清液并纯化。
IL-23蛋白质
购买(Ebiosciences或RnD Systems)共价连接IL-23p19(SEQ IDNO：2)的人IL-23(包含IL-12p40(SEQ ID NO：1)。替换地，通过如先前所述的转染DNA表达构建体在哺乳动物HEK293E/pTT5表达系统中制备IL-23、IL-12p40和IL-23p19。制备以下蛋白质：
表2：在这些实验中使用的IL-23蛋白质的列表。
含有分泌的蛋白质的培养物上清液通过在2000×g下离心分离10分钟以除去细胞来收获。含有HIS Tag的蛋白质使用HisTrapTMHP管柱(GE Healthcare)经由His8亲和力标签自上清液纯化。含有Fc区域的蛋白质使用如下文对于抗体的纯化描述的蛋白质A色谱法纯化。洗脱的蛋白质使用浓缩器(Amicon)或经由脱盐或经由尺寸排阻色谱法缓冲剂交换到PBS中。
对于噬菌体展示，重组人IL-23AviHIS的AvitagTM序列使用酶BirA生物素化。这在AviTag序列中的含有氨基酸的单一胺处产生特异性生物素化。游离的生物素通过使用具有3.5kDa截留分子量的Slide-A-Lyzer渗析盒(Pierce)相对于PBS渗析或脱盐管柱(GEHealthcare)自蛋白质制剂除去。
表达抗体的载体的构建
重链可变区(VH)氨基酸序列电子格式化到包含CH1、铰链、CH2和CH3域的人IgG1恒定区上(参见，例如NCBI登录号P01857.1)。类似地，轻链可变区序列根据亲本可变区的同种型电子格式化到人κ或λ恒定区(参见，例如NCBI登录号AAI10395(κ)和AAI07853(λ))。氨基酸序列随后反转译成DNA序列(GeneArt，Germany)。所得基因通过组合合成低聚核苷酸从头合成(GeneArt，Germany)。重链基因和轻链基因随后分别克隆到含有重链前导序列(SEQ ID NO：81)或轻链前导序列(SEQ ID NO：82)的表达载体pTT5的变异体中(Durocher等，Nucleic A cids Research30，E9，2002)。
抗体的表达和纯化
抗体通过使用如上所述的转染试剂FuGENE(Roche)将含重链的pTT5质粒和含轻链的pTT5质粒共同转染到细胞系HEK293E中而制备。在7天之后，上清液通过离心分离收获且调节到pH7.4，之后装载到HiTrapTM蛋白质A管柱(5ml，GE Healthcare)中。将管柱用50ml1X PBS(pH7.4)洗涤。使用0.1M柠檬酸pH2.5进行洗脱。洗脱的抗体使用Zeba脱盐管柱(Pierce)脱盐到1X PBS(pH7.4)中。抗体使用SDS-PAGE分析。抗体的浓度使用BCA测定试剂盒(Pierce)根据制造商的说明书来测定。
通过ELISA检测抗体与IL-23的结合
将NuncMaxisorp96-孔板用在碳酸盐涂布缓冲液中稀释到1μg/ml的人IL-23涂布且在4℃下孵育过夜。将板洗涤(三次，在1×PBS-Tween20(0.05％)中)，随后在室温下用在PBS中的1％BSA阻断1小时。生物素化抗体由10μg/ml开始产生且进行连续半对数稀释，随后将100μl加到板中并孵育1小时。将板洗涤且将处于1：2000稀释度下的Streptavidin-HRP加到所有孔中并进一步孵育1小时。将板洗涤且随后使用TMB(Sigma)显影。显色反应通过加入相等体积的1M HC1来终止。所得反应物的吸收率使用基于板的分光光度计测定。
IL-23结合抗体的表面等离子体共振(SPR)分析
使用Biacore3000，使用胺偶合化学将蛋白质A(Pierce)固定在CM5芯片上以给出3000应答单元(RU)。抗体捕捉在流动池2或4中的芯片的表面上且在流动池1或3中的对照表面上。随后使人IL-23经过两种流动池且测量应答单元。随后将表面用10mM甘氨酸pH2.5再生。对于动力学操作，用5倍稀释的IL-23重复所述过程。数据使用操作缓冲液的注入在使用1∶1兰格缪尔方程式拟合之前双重提及，以测定ka、kd和KD。
对在鼠脾细胞中IL-23-诱导的IL-17产生的抗体抑制作用
脾自C57BL/6小鼠获得且通过首先使脾均质化、接着使用NH4Cl溶解红血球来制备。随后脾细胞通过再悬浮和离心分离而在培养基(RPMI、10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U Pen/Strep)中洗涤。将抗体在培养基中稀释到足以在整个96-孔板上产生滴定曲线。将100ng/mL人IL-23(EBiosciences)加到各孔中并在37℃下在5％CO2湿度下孵育1小时。将细胞加到孔中，以200μl/孔的总体积给出5×106个细胞/mL的细胞浓度。将培养物在37℃下用5％CO2湿度下孵育4天。在孵育结束时收获上清液且使用Duoset ELISA鼠科IL-17试剂盒(R&D Systems)来检测所产生的鼠科IL-17。
实施例1：制备特异地结合IL-23的单克隆抗体
杂交瘤产生
对抗杂二聚IL-23的单克隆抗体通过遗传免疫用大鼠的相应常规蛋白质免疫而产生。对于遗传免疫，使用限制酶技术将人IL-23的DNA序列(含有GS接头以促进分子自一种启动子表达；SEQ ID NO：5)克隆到质粒中以便遗传免疫。所得质粒允许分泌在N-或C-端由c-myc表位标签化的可溶性IL-23。使用c-myc表位来证实可溶性IL-23的表达。
随后根据公布的程序(Kilpatrick等，Hybridoma17：569-576，1998)使用Helios基因枪(Bio-Rad，Germany)将大鼠用所述质粒免疫6次。在最后应用免疫质粒之后一周，各个大鼠通过皮内注射重组人IL-23蛋白质(Ebiosciences)加强。
四天后，将大鼠杀死且使用聚乙二醇(HybriMaxTM；Sigma-Aldrich，Germany)将其淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，在96-孔微量滴定板中以100，000个细胞/孔播种且在补充有10％胎牛血清和HAT添加剂的DMEM培养基生长以便杂交瘤选择((Kilpatrick等，1998，上文))。
用于抗体特异性的杂交瘤的筛选
将全长天然IL-23(Ebioscience)涂布到96-孔板(Maxisorp，Nunc)上。将来自各种杂交瘤的杂交瘤上清液加到IL-23涂布的孔中且在存在便于显色反应的HRP偶联物下使用对鼠科(大鼠)抗体具有特异性的第二抗体检测结合的抗体。对于IL-23显示阳性结合的杂交瘤经由极限稀释亚克隆，其中将细胞在培养基中稀释且以小于1个细胞/孔的比率沉积到新鲜的96-孔板中。在重新获得纯系之后，对杂交瘤上清液进行另外的ELISA。
将抗FLAG M2抗体(Sigma-Aldrich)涂布到ELISA板上过夜。随后使用这些板来单个地捕捉：FLAG-标签化的IL-23p19、FLAG-标签化的IL-12p40和FLAG-标签化的IL-23。加入来自纯系的杂交瘤上清液且使对于IL-23的结合为阳性而对于IL-12p40或IL-23p19的结合为阴性的杂交瘤扩张。
具有IL-23杂二聚体特异性的大鼠抗体E11E7的识别和分子表征
使用上述免疫和筛选的方法，出自所筛选的约83种杂交瘤中的一种大鼠杂交瘤分泌强烈结合IL-23、但不显著地结合IL-12p40或IL-23p19的抗体。称为E11E7的所述抗体使用自E11E7-表达杂交瘤细胞分离的RNA通过反转录酶聚合酶链式反应定序。简要地讲，RNA使用TRI试剂(Sigma)根据制造商的方案来制备。随后将使用高保真第一股cDNA合成试剂盒(Stratagene)自100-200ng RNA合成的cDNA用作PCR的模板。基本上根据制造商的说明书(Stratagene)使用来自Novagen小鼠IgG引物组的引物来使用聚合酶UltraPfuII-HS扩增来自cDNA的推定E11E7重链序列和轻链序列。热循环使用Eppendorf Mastercycler和以下循环参数进行：
(94℃2min)循环1次；接着
(94℃30sec，60℃30sec，72℃45sec)30次循环；接着
(72℃5min)循环1次。
在于琼脂糖凝胶(0.7-1.0％)上电泳之后，PCR产物使用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)切开并清洁。加尾经由在72℃下孵育Taq-聚合酶(InvitrogenTM)和dATP15分钟来进行。加尾的PCR产物随后连接到pGEM-T Easy(Promega)中并根据制造商的说明书转变成TOP10感受态细胞(InvitrogenTM)。使用载体特异性引物的转化体的PCR筛选识别具有含有约500bp的插入物的质粒的纯系。质粒DNA随后使用QIAprep质粒小提试剂盒(QIAgen)自含有插入物的纯系分离并定序(AGRF，Brisbane)。随后将用于可变重链(SEQ ID NO：6)和可变轻链(SEQ ID NO：11)的核苷酸序列转译成基本氨基酸序列(对于VH，SEQ ID NO：7；和对于VL，SEQ ID NO：12)。
大鼠-人嵌合抗体经由将大鼠E11E7重链和轻链可变区氨基酸序列格式化到人恒定区来产生。基因在反转译之后合成且随后如在通用方法中描述克隆到表达载体pTT5中。VH的核苷酸序列包含SEQ IDNO：19中列出的序列。VL的核苷酸序列包含SEQ ID NO：18中列出的序列。这些全长重链和轻链的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21中给出。
使E11E7Chimera生物素化(Pierce EZ-Link Su1fo-NHS)且使用在通用方法中描述的ELISA技术对于与IL-23Fc、IL-23p19Fc、IL-12p40Fc和鼠科IL-23(Ebiosciences)的结合进行筛选。生物素化E11E7Chimera强烈结合IL-23且显示对单个亚基或鼠科IL-23很少或不结合(图1)。这证明E11E7Chimera对人IL-23复合物具有特异性，而对单个亚基没有特异性。
E11E7的表位的定位
表位定位对E11E7Chimera进行以测定抗体结合IL-23的位置。使用氢/氘交换实验(基本上如在US06797482B2中所述)，识别在与E11E7的结合中涉及到的在IL-23上的临界区域。氢在溶液中交换为在IL-23上的氘。随后所述氘化的IL-23在溶液中由E11E7Chimera的FAb片段结合。将所述复合物交换回氢，除了与抗体接触的在IL-23上的区域，且因此防止其交换。随后将IL-23：抗体复合物消化且经由质谱分析以识别含有氘的区域。获得以下结果：
表3：在用E11E7孵育之前和之后IL-23肽的氘差异
用于所述分析的序列对于IL-12p40亚基，对应于SEQ ID NO：1，且对于IL-23p19亚基，对应于SEQ ID NO：2。
对于各种单个亚基，在最低氘含量下计算跨越50％的肽的平均值±标准偏差(S.D.)％氘差异。显著考虑大于平均值+3S.D.的值。跨越p40亚基的平均值(50％)+3S.D.％氘差异为10.2％。跨越p19亚基的平均值(50％)+3S.D.％氘差异为18.1％。其中％氘差异大于平均值(50％)±3S.D.的重叠肽序列在表3中以粗体突出显示。这些数据证明在结合E11E7Chimera时在IL-12p40和IL-23pl9上的残基受保护以免氘交换。
具有最高氘含量(p40：135-153；p19：112-144)的肽在IL-23的晶体结构上定位(图2)。具有直径约50埃(如横跨晶体结构3HMX测量)的抗体的FAb臂在介于在p40和p19的突出显示区域内的原子之间的25埃跨度上很好地结合。
E11E7Chimera抑制IL-23与IL-23R的结合
将hIL23R-HIS在碳酸盐涂布缓冲液中稀释到1μg/ml且将其加到96孔板的各个孔中并在4℃下孵育过夜。随后将板洗涤三次。随后所述孔通过向各个孔中加入200μl阻断缓冲剂且在25℃下孵育所述板1小时来阻断。将E11E7Chimera或抗p40抗体在抗体稀释剂中稀释到足以产生在10μg/ml下开始的滴定曲线。将生物素化hIL-23(E-bioscience)在抗体稀释剂中稀释到100ng/ml的最后浓度。将hIL-23在深孔容器中用抗体预孵育2小时。将所述板如先前所述洗涤且随后在25℃下将孔用抗体/hIL-23溶液孵育2小时。随后将所述板如先前所述洗涤且使用100μl在抗体中以1：5000的Streptavidin HRP(BDPhamingen)来检测结合的生物素化细胞因子。在25℃下孵育1小时之后，将所述板再次如先前所述洗涤。将100μl TMB底物溶液(Sigma-Aldrich)加到各孔中且允许显色历时15分钟。加入100μl1MHC1以终止显色反应且在450nm下测定吸收率(参考620nm)。
当与在所试验的最高浓度下不能抑制IL-23与IL-23R的结合的抗p40抗体相比较时，E11E7能够抑制IL-23与IL-23R的结合(图2)。
E11E7为有效的抑制剂和体外IL-23生物活性
在SPR测定中，E11E7Chimera的亲和力超过Biacore3000的灵敏度且具有小于100pM的KD。使用鼠脾细胞测定对于E11E7及其嵌合体E11E7Chimera的IL-23中和能力筛选E11E7及其嵌合体E11E7Chimera。两种抗体对人IL-23诱导的鼠科IL-17分泌展示强烈的中和(图4)。这些结果证明结合杂二聚复合物、但不结合IL-23的单个亚基的抗体是IL-23生物活性的有效中和剂。
E11E7Chimera在IL-23-推进的鼠科牛皮癣模型中有效。
用IL-23皮内至后背处理C57Bl/6J小鼠6天诱导以红斑和硬化、表皮增生、角化不全和局部化炎性渗透的组织证据为特征的局部化炎性响应，试验抗体在开始细胞因子治疗的前一天以单一剂量减少炎性响应的能力。在开始细胞因子注射的前一天，以10mg/kg的剂量单一腹膜内注射给予E11E7Chimera、人p19特异性抗体(来自US7807160的抗体7G10)或同种型对照抗体。每日对于在试验区域中的红斑和硬化对小鼠评分。所有处理和观察都以盲法进行。在研究的结束时，自各个小鼠收集皮肤样品且将其固定以便通过标准方案组织加工及苏木精和曙红(H&E)染色。
表皮厚度的值通过晒印来自各个小鼠的皮肤的切片的低功耗图像的纸印本来测定。在各个图像上的皮肤切片通过使用三条垂直线被分成四个四分体。随后在用于描绘四分体的这三条线的交叉点处测量表皮厚度，即三次厚度测量/照片。实际距离(mm)随后使用在各个图像上的标尺转化成微米。在其中测量点交叉如毛发滤泡或汗腺的不被视为代表表皮厚度的区域的那些情况下，调节测量点的位置到邻近的皮肤切片。测量由两个独立的观察员以盲法进行。
相对于同种型对照物来讲，自第5天起接受E11E7Chimera和抗p19抗体的两组具有减小的临床评分，这证明抗体在所述研究中的功效(图5A)。还观察到自第6天起E11E7Chimera证明了超过抗p19抗体的改善的功效。
相对于同种型对照物来讲，E11E7Chimera和抗p19抗体证明了表皮厚度的统计学上显著减小(图5B)。用E11E7Chimera处理比用抗p19抗体处理导致表皮厚度评分显著降低。这完全与临床评分相关，证明E11E7Chimera为有效的IL-23抑制剂，当在所述鼠科牛皮癣模型中试验时，其比抗p19抗体更有效。
大鼠抗体E11E7的人源化
使用SuperhumanisationTM(US2003/0039649)和3D模型(LoMethods Mol Biol248：135-159，2004)的平行策略来选择能够支撑大鼠E11E7抗体的CDR的合适的人框架。
使用3D模型选择人框架受体
大鼠VH和VL的独立的3D模型使用晶体结构数据库(WorldwideProtein Data Bank pdb)，http：//www.wwpdb.org)和软件包DiscoveryStudio V3.0(USA)来构建。简短地讲，蛋白质数据库集数据库通过碱基局部对准检索工具(BLAST)检索使用大鼠重链可变区或轻链可变区来查询以识别具有伴随的晶体结构信息的类似(＞70％同源性)多肽序列的抗体。随后使用这些结构来基于由大鼠可变区和所识别的晶体结构共用的氨基酸序列同源性构造同源性模型。
使用大鼠VH和VL模型来预测其框架区氨基酸很可能与在CDR中的氨基酸相互作用且因此需要在所选择的人受体中保存人源化抗体的最优活性。还使用这些模型来基于与啮齿动物抗体的框架结构同源性从蛋白质数据库中识别合适的人VH和VL受体框架。为了确保重链和轻链的恰当成对，经由人源化方法加工所述抗体晶体结构的VH和VL人受体框架。具有较好啮齿动物-人重链框架区结构同源性的人受体抗体优选优于具有较好啮齿动物-人轻链框架同源性的那些人受体。对于大鼠抗体E11E7，所选择的人受体框架为pdb登录编码3B2U、3L5Y、1U6A和1QLR。在所选择的框架中，由于含有对于人基因系序列的多个氨基酸残基变化，所以不发展3L5Y和1U6A。
大鼠E11E7的SuperhumanisationTM
简要地讲，经由检查其相应的氨基酸序列，将典范结构分配给大鼠E11E7重链和轻链。E11E7被分配了典范结构3-1-1/1-1(VL/VH)。将共用典范结构的人基因系序列用作用于供体CDR的接枝的受体框架。
人源化数据汇总
作为人源化方法的结果，制备22种人源化抗体且试验其结合人IL-23的能力(表4)。简要地讲，经由SPR对于抗体表达水平和结合活性筛选2mL转染的这22种人源化抗体。使用胺偶合将蛋白质A固定到CM5研究级感应器芯片的FC1和FC2(或替换地FC3和FC4)上，给出大约3000RU。贯穿所述实验，将FC1用作空白试验。所述实验在HBS-P缓冲剂(SPR)中操作。将含有抗体的细胞培养上清液在10×HBS-P缓冲液中以9∶1的比率稀释。将稀释的抗体以20μl/min的流速注射到FC2上。IL-23(HEK293E产生的)以5ug/ml的浓度经过FC1和FC2的表面，随着动力学注射在5分钟的离解时间下穿过两个FC。表面的再生使用10mM甘氨酸，pH1.5进行。来自FC2的传感图数据从FC1和仅缓冲剂的对照物中减去。将在大于50RU的水平下捕捉且具有大于0.1的IL-23捕捉/抗体捕捉比的抗体按规模方法且纯化以用于进一步试验。
对于各种抗体的可变重链和轻链的序列IDs在图4中连同所选择的试验抗体的kd(脱除率)一起给出。
表4：基于人源化E11E7的抗体
所有试验的人源化抗体都证明经由表面等离子体共振与IL-23结合(表4)。用ELISA试验抗体1-4、6-22、8-22、20-4、9-22和21-4与IL-23的结合(图6)。所试验的所有抗体都证明类似于E11E7Chimera与IL-23结合。这些数据证实在人源化E11E7抗体中成功地保留着结合活性。
人源化抗体和E11E7VH和VL的序列示于图7中。所述图还显示保守/同一性的区域和共有序列。
经由Biacore进一步试验多种抗体的结合IL-23的能力(表5)。出自所试验的五种人源化抗体中的四种以皮摩尔浓度范围的亲和力力(KD)结合IL-23。当与E11E7Chimera相比较时，所述抗体具有更快的脱除率。
表5：如通过SPR测量的E11E7Chimera和人源化抗体与IL-23的结合
**这些值低于Biacore3000的灵敏度的极限，所述极限对于kd＝1.00E-051/s且对于KD＝1.00E-10M)。
人源化抗体对于IL-23的特异性
基于在表5中呈现的结果选择四种抗体，以便针对其选择性结合IL-23的能力进一步筛选。如由ELISA所证明(图8)，抗体21-4、8-22、6-22和20-4全部证明特异地结合IL-23，且不显著地结合IL-12p40或IL-23p19。
实施例2：特异地结合IL-23的人单克隆抗体的生产
噬菌体展示
尝试筛选包含多种单个人FAb片段的天然细菌噬菌体(噬菌体)文库(XOMA corporation，Berkeley)以分离结合IL23单步显著地结合IL23、p19和p40的单个亚基的抗体。
抗原与Dvnal M450磁性环氧化物珠粒交联
将1mL Dynal M450环氧化物珠粒用1mL100mM磷酸钠pH8.0洗涤一次。将洗涤的珠粒再悬浮在另外0.5mL的100mM磷酸钠pH8.0中且加入1.4μmole欲偶合的配体；用100mM磷酸钠pH8.0使最终偶合体积达到1mL。允许偶合反应在室温下在缓慢转动下进行过夜(约16小时)。珠粒随后通过加入20μ1的1M tris pH7.4且在室温下缓慢转动30分钟来阻断。将珠粒在PBS中洗涤3次且再悬浮在1mLPBS中。
噬菌体文库生物淘选
在使用不同试剂和/或淘选条件的几次不成功的噬菌体展示试验之后，从噬菌体展示文库中分离出具有上述特异性的抗IL-23抗体。通用方案遵循Marks等(Marks和Bradbury Methods Mol Biol248：161-176，2004)概述的方法。简要地讲，各次噬菌体展示试验包括三轮生物淘选，其中独立筛选两个含κ链的文库和含λ链的文库。对于各轮生物淘选，取自各个文库的噬菌体粒子通过与阻断缓冲剂(在磷酸盐缓冲盐水中的5％脱脂乳pH7.4)1∶1混合来阻断且在室温下孵育1小时。随后将阻断的噬菌体文库预贫化，其中可使用如对于所述文库所描述阻断的抗原在室温下应用1小时。
文库淘选通过在1.5mL微离心管中混合阻断且预贫化的文库与选择复合物(预阻断的)且在室温下转动1小时来进行。非特异地结合的噬菌体使用一系列洗涤除去。各洗涤包括使用磁性架将珠粒复合物从溶液拉到管壁上，吸出上清液且随后使珠粒再悬浮在新鲜的洗涤缓冲液中。这用PBS洗涤缓冲液(具有0.5％脱脂乳的PBS)或PBS-T洗涤缓冲液(具有0.05％TWEEN-20(Sigma-Aldrich)和0.5％脱脂乳的PBS)重复数次。洗脱在洗涤过程之后保持结合的噬菌体。
在第一轮和第二轮淘选的末尾，将输出的噬菌体加到10mL按指数规律地生长的TG1大肠杆菌(酵母菌-胰蛋白胨(YT)生长培养基)的培养物中且允许通过在不振荡的情况下在37℃下孵育30分钟，随后在以250rpm振荡下历时30分钟来浸染细胞。随后遵循标准方案(Marks和Bradbury，2004，上文)营救作为噬菌体粒子的编码噬菌体展示输出物的噬菌粒。在第三轮淘选的末尾，将TG1细胞用输出的噬菌体感染，但将细胞在足够的稀释度下涂覆在固态YT生长培养基(补充有2％葡萄糖和100μg/mL羧苄西林)以制备离散的大肠杆菌菌落。
用于筛选的Fabs的表达
将来自第三轮生物淘选噬菌体文库的离散的大肠杆菌菌落用于在96孔深孔板中接种1mL2YT生长培养基(补充有2％葡萄糖和100μg/ml羧苄西林)的等分试样。将板在30℃下以380rpm振荡(Innova44R震荡器，1英寸轨道)生长过夜以制备底板。对于Fab诱导，将细菌在含有新鲜2YT培养基(补充有100μg/ml羧苄西林)的又一96孔深孔板中以1∶100稀释且在37℃、380rpm下生长直至OD600达到0.5。加入最后浓度的1.25mM IPTG且随后使板在25℃下如前所述振荡下生长过夜(约16小时)。
可溶性Fabs的制备：
来自诱导板的细菌球粒通过在2000g下离心分离10分钟(室温)收获。弃去用过的培养基且将球粒再悬浮在200μl/孔的由160μg/mL溶菌酶、10μg/mL RNAse、5μg/mL DNAse和蛋白酶抑制剂混合物(cOmplete，Roche)组成的溶菌酶缓冲液中。将板在21℃、400rpm下孵育30分钟，之后加入另外100μl/孔的溶菌酶缓冲液且在21℃、400rpm下进一步孵育30分钟。随后将板在3000g下离心分离15分钟(室温)，之后在测定中使用Fab提取物。
用于Fab表达的ELISA筛选和对抗原IL-23、IL-23p19-Fc和 IL-12p40-Fc的结合
将NuncMaxisorp96-孔板用未加标签的人IL-23以在碳酸盐涂布缓冲液中的1μg/ml涂布且在4℃下孵育过夜。其它板如对于IL-23所述使用抗原人p19-Fc、人p40-Fc和抗κ抗体或抗λ抗体涂布。将板洗涤，随后在室温下用在PBS中的1％BSA阻断1小时。将板再次洗涤，之后加入50μl/孔Fab提取物且在室温下再孵育1小时。将板洗涤，之后加入50μl/孔1∶2000稀释的抗v5-HRP抗体偶联物(InvitrogenTM)且在室温下再孵育1小时。将板洗涤，显影且如先前所述读数。
显示IL-23结合特异性的前导Fabs的噬菌体展示结果
遵循多种筛选方法，出自768种Fabs的一种Fab(命名为ST883/885)从试验4和5筛选，其结合IL-23，观察到几乎不结合IL-23p19-Fc或IL-12p40-Fc。使含有编码具有所述特异性的ST883/885Fabs的噬菌粒的细菌在5mL LB肉汤(补充有100μg/ml胺苄西林)中再生长过夜且用于分离质粒DNA以便定序。ST883/885的可变重链作为SEQ ID NO：49给出且可变轻链作为SEQ ID NO：50给出。
将ST883/885的VH和VL PCR扩增且亚克隆到其相应pTT5重链和轻链表达载体中。称为ST883/885IgG的全长抗体随后在如上所述的HEK293E细胞中表达为人IgG1λ同种型抗体。在通过离心分离从悬浮液中除去细胞之后，抗体通过蛋白质A色谱(如先前描述)纯化。如在图9中所述，发现抗体对IL-23具有特异性，不显著地结合IL-12p40和IL-23p19。
实施例3：通过IL-23特异性抗体进行的内源IL-23的检测
如E11E7的IL-23特异性抗体可用于检测在生物样品中的IL-23。
为了证明E11E7检测IL-23的有效性，使标准的夹层ELISA显影。将在PBS中以2μg/ml的E11E7涂布在Maxisorp板(Nunc)上且在4℃下孵育。在下一天，板使用具有0.05％Tween-20的PBS(PBS-T)洗涤且在在PBS中的10％胎牛血清阻断1小时。以3ng/mL的最大浓度加入rhIL23且在整个板上进行连续稀释。将板孵育1小时，随后用PBS-T洗涤3次。复合物使用生物素化IL-23检测Ab来检测，接着用3X PBS-T洗涤且随后进行Strepavidin HRP检测。重组IL-23使用E11E7作为捕捉抗体在剂量-滴定中检测(图10A)。
为了测定E11E7是否可用以检测天然IL-23，将THP-1细胞用1μg/mL商陆促分裂原(PWM)和在培养物中不同浓度的脂多糖(LPS)激发24小时。随后收集上清液且在上述ELISA格式中测定。E11E7能够在所试验的多种浓度的LPS下检测天然IL-23(图10B)。
实施例4：制备其它抗体和抗体片段
4.1杂交瘤细胞系的产生
对抗杂二聚IL-23的单克隆抗体通过常规蛋白质免疫或使用基本上如在实施例1中所述的遗传免疫来产生。所述方法在一些形式中改进以使小鼠而不是大鼠免疫。
杂交瘤筛选和DNA定序基本上如在实施例1中所述和/或如在图11中所描绘进行。
4.2自展示文库分离其它IL-23杂二聚体抗体
对于初级选择，对于FLAG-标签化的IL-23蛋白质淘选展示抗体片段的噬菌体的文库且保持阳性结合噬菌体。随后，联合使用抗FLAG M2涂布的珠粒(Sigma)和FLAG-标签化的IL-12p40消耗对于IL-12p40亚基结合为阳性的噬菌体，使用抗FLAG M2涂布的珠粒(Sigma)和FLAG-标签化的p19进行对于IL-23p19亚基结合为阳性的噬菌体的消耗。这将留下对IL-23的杂二聚界面具有特异性的噬菌体展示抗体片段(图11)(Henderikx等，Selection of antibodies againstbiotinylated antigens.Antibody Phage Display：Methods and protocols，编者：O′Brien和Atkin，Humana Press(2002))。这些抗体片段的其它亲和力成熟通过对于抗FLAG M2涂布的珠粒(Sigma)和FLAG-标签化的IL-23筛选来进行。来自选自输出物的噬菌体载体随后通过质粒preps(Qiagen)分离且抗体片段插入物通过限制消化释放。这些插入物连接到噬菌体表达载体中且用以转变大肠杆菌株HB2151以便抗体片段的可溶性表达和筛选。替换地，将抗体片段插入物定序且用截断的人恒定区表达。
实施例5：表达抗体的载体的构建和抗体的表达及纯化
表达抗体的载体基本上如上所述生产。随后基本上如上所述表达并纯化抗体。
实施例6：纯化的抗体的表征
如在实施例5中描述来表达并纯化的抗体基本上如上所述使用ELISA测定、IL-23/IL-23R抑制测定和IL-17释放测定使用小鼠脾细胞来表征。
实施例7：用于杂二聚体特异性抗体的表位的表征
使用点突变技术，在基于三维X射线晶体结构(3D85)预测侧链将与溶液接触的各个位置将丙氨酸引入IL-23的蛋白质序列中。随后使用上文对于IL-23的表达和纯化所描述的方法来表达并纯化含有单一丙氨酸点突变的各种IL-23蛋白质。使用SPR技术，将候选抗体固定在蛋白质A芯片的表面上，且使各种IL-23变异体蛋白质经过所述表面并测量结合动力学。未能结合固定的抗体或与固定的抗体弱结合的蛋白质变异体可在IL-23上的抗体表位处含有点突变。
在又一实验中，将各种IL-23变异体涂布到ELISA板上。在阻断之后，随后将候选抗体连同对IL-23具有同一性的多株抗体一起加入。随后使用相应的第二抗体来检测两种抗体。候选抗体没能结合IL-23变异体但多株抗体结合IL-23变异体的情形可指出在IL-23变异体上的丙氨酸突变的氨基酸位置充当与候选抗体相互作用的氨基酸位置。

Claims (28)

1.一种分离或重组IL-23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基都不是IL-23的组分时，不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，并且其中所述抗原结合域包含：
(i)根据Kabat编号系统的重链CDR1，其由SEQ ID NO:8中列出的序列组成；
(ii)根据Kabat编号系统的重链CDR2，其由SEQ ID NO:9或SEQID NO:22中列出的序列组成；
(iii)根据Kabat编号系统的重链CDR3，其由SEQ ID NO:10中列出的序列组成；
(iv)根据Kabat编号系统的轻链CDR1，其由SEQ ID NO:13中列出的序列组成；
(v)根据Kabat编号系统的轻链CDR2，其由SEQ ID NO:14中列出的序列组成；和
(vi)根据Kabat编号系统的轻链CDR3，其由SEQ ID NO:15中列出的序列组成。
2.如权利要求1所述的IL-23结合蛋白，其中
(i)所述抗原结合域特异地结合IL-23的杂二聚界面；
(ii)所述抗原结合域：
(a)特异地结合IL-23，但当IL-12p40亚基和IL-23p19都不是IL-23的组分时，所述抗原结合域不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基；
(b)结合IL-23，其中在所述IL-23中的氢已经与氘交换；和
(c)在与其中的氢已经与氘交换的IL-23结合后，减少了在包含SEQ ID NO:2的残基112-144的区域中氘与氢的交换；
(iii)所述IL-23结合蛋白减少IL-23与IL-23受体(IL-23R)的结合，其中IC50为1nM或更低和/或EC50为1nM或更低；
(iv)所述IL-23结合蛋白减少由脾细胞进行的IL-23诱导的IL-17分泌，其中IC50为1nM或更低和/或EC50为1nM或更低；或者
(v)当IL-23p19亚基为IL-23的组分时，所述抗原结合域在包含SEQID NO:2的氨基酸112至144的区域中特异地结合IL-23的IL-23p19亚基。
3.如权利要求1所述的IL-23结合蛋白，其包含：
(i)由SEQ ID NO:7中列出的序列组成的VH或者其人源化形式；和
(ii)由SEQ ID NO:12中列出的序列组成的VL或者其人源化形式。
4.如权利要求1所述的IL-23结合蛋白，其中所述抗原结合域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，其中所述VH和所述VL结合以形成Fv。
5.如权利要求4所述的IL-23结合蛋白，其中所述VH和所述VL处于单一多肽链中。
6.如权利要求5所述的IL-23结合蛋白，其为：
(i)单链Fv片段(scFv)；
(ii)二聚scFv(di-scFv)；或
(iii)与Fc或重链恒定域(CH)2和/或CH3连接的(i)和/或(ii)中的至少一种。
7.如权利要求4所述的IL-23结合蛋白，其中所述VL和所述VH处于单独的多肽链中。
8.如权利要求7所述的IL-23结合蛋白，其为：
(i)二抗；
(ii)三抗；
(iii)四抗；
(iv)Fab；
(v)F(ab’)2；
(vi)Fv；或
(iv)与Fc或重链恒定域(CH)2和/或CH3连接的(i)-(iii)中的至少一种。
9.如权利要求7所述的IL-23结合蛋白，其为抗体。
10.如权利要求1至9中任一项所述的IL-23结合蛋白，其为嵌合的或人源化的抗体。
11.如权利要求10所述的IL-23结合蛋白，其为包含以下中的任何一个的人源化抗体：
(i)由SEQ ID NO:30的氨基酸1-120中列出的序列组成的VH和由SEQ ID NO:45的氨基酸1-113中列出的序列组成的VL；
(ii)由SEQ ID NO:31的氨基酸1-120中列出的序列组成的VH和由SEQ ID NO:45的氨基酸1-113中列出的序列组成的VL；
(iii)由SEQ ID NO:32的氨基酸1-120中列出的序列组成的VH和由SEQ ID NO:46的氨基酸1-113中列出的序列组成的VL；或
(iv)由SEQ ID NO:33的氨基酸1-120中列出的序列组成的VH和由SEQ ID NO:46的氨基酸1-113中列出的序列组成的VL。
12.如权利要求10所述的IL-23结合蛋白，其为包含以下的嵌合抗体：与人重链恒定区连接的由SEQ ID NO:7中列出的序列组成的VH和与人轻链恒定区连接的由SEQ ID NO:12中列出的序列组成的VL。
13.如权利要求12所述的IL-23结合蛋白，其中所述嵌合抗体包含重链和轻链，所述重链由SEQ ID NO:20中列出的序列组成，所述轻链由SEQ ID NO:21中列出的序列组成。
14.如权利要求9所述的IL-23结合蛋白，其为包含以下的单克隆抗体：由SEQ ID NO:7中列出的序列组成的VH和由SEQ ID NO:12中列出的序列组成的VL或者其嵌合或人源化形式。
15.一种分离或重组IL-23结合蛋白，其包含抗体的抗原结合域，其中所述抗原结合域特异地结合IL-23，但在IL-12p40亚基和IL-23p19亚基都不是IL-23的组分时，不显著地结合IL-12p40亚基且不显著地结合IL-23p19亚基，并且其中所述抗原结合域包含：
(i)重链CDR1，其由SEQ ID NO:51中列出的序列组成；
(ii)重链CDR2，其由SEQ ID NO:52中列出的序列组成；
(iii)重链CDR3，其由SEQ ID NO:53中列出的序列组成；
(iv)轻链CDR1，其由SEQ ID NO:54中列出的序列组成；
(v)轻链CDR2，其由SEQ ID NO:55中列出的序列组成；和
(vi)轻链CDR3，其由SEQ ID NO:56中列出的序列组成。
16.如权利要求1所述的IL-23结合蛋白，其与化合物偶联。
17.如权利要求15所述的IL-23结合蛋白，其与化合物偶联。
18.一种分离或重组核酸，其编码如权利要求1至15中任一项所述的IL-23结合蛋白。
19.一种表达构建体，其包含操作性地连接至启动子的如权利要求18所述的核酸。
20.一种分离或重组细胞，其表达如权利要求1至15中任一项所述的IL-23结合蛋白。
21.一种组合物，其包含如权利要求1至17中任一项所述的IL-23结合蛋白或如权利要求18所述的核酸或如权利要求19所述的表达构建体或如权利要求20所述的细胞和合适的载体或稀释剂。
22.如权利要求21所述的组合物，其中所述载体或稀释剂为药学上可接受的。
23.如权利要求1至17中任一项所述的IL-23结合蛋白或如权利要求18所述的核酸或如权利要求19所述的表达构建体或如权利要求20所述的细胞在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防在细胞、组织、器官或受试者中的至少一种IL-23-介导的病状的症状。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述病状为炎性病状。
25.如权利要求24所述的用途，其中所述病状为牛皮癣、克罗恩氏病或多发性硬化。
26.如权利要求1至17中任一项所述的IL-23结合蛋白在制备试剂中的用途，所述试剂用于检测样品中的IL-23。
27.如权利要求1至17中任一项所述的IL-23结合蛋白在制备试剂中的用途，所述试剂用于诊断受试者中的病状。
28.如权利要求16或17所述的IL-23结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物用于定位和/或检测在受试者中的IL-23，其中所述蛋白与可检测的标记物偶联。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO3244B1 (ar) 2009-10-26 2018-03-08 Amgen Inc بروتينات ربط مستضادات il – 23 البشرية
PT2635601T (pt) 2010-11-04 2016-09-27 Boehringer Ingelheim Int Anticorpos anti-il-23
EP4039275A1 (en) 2012-05-03 2022-08-10 Boehringer Ingelheim International GmbH Anti-il-23p19 antibodies
JP6362587B2 (ja) * 2012-05-22 2018-07-25 ブリストル−マイヤーズ スクイブ カンパニーＢｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ Ｉｌ−１７ａ／ｆｉｌ−２３二重特異性抗体およびその使用
WO2014004436A2 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Merck Sharp & Dohme Corp. Crystalline anti-human il-23 antibodies
GB201214974D0 (en) * 2012-08-22 2012-10-03 Univ Edinburgh Avian proteins, nucleic acids and uses thereof
US9669091B2 (en) * 2013-03-15 2017-06-06 Inovio Pharmaceuticals, Inc. Vaccines having an antigen and interleukin-23 as an adjuvant
WO2014149425A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Amgen Inc. Methods for treating psoriasis using an anti-il-23 antibody
KR20150128859A (ko) 2013-03-15 2015-11-18 암젠 인크 항-il23 항체를 사용하여 크론병을 치료하는 방법
EP3172339A1 (en) 2014-07-24 2017-05-31 Boehringer Ingelheim International GmbH Biomarkers useful in the treatment of il-23a related diseases
BR112017004169A2 (pt) 2014-09-03 2017-12-05 Boehringer Ingelheim Int composto direcionado à il-23a e ao tnf-alfa e usos do mesmo
AR102417A1 (es) 2014-11-05 2017-03-01 Lilly Co Eli Anticuerpos biespecíficos anti-tnf- / anti-il-23
KR20180063127A (ko) 2015-09-17 2018-06-11 암젠 인크 Il23 경로 바이오마커를 사용한, il23-길항제에 대한 임상 반응의 예측
WO2017072299A1 (en) * 2015-10-30 2017-05-04 Ablynx Nv Polypeptides against il-23
KR20180096633A (ko) 2015-12-22 2018-08-29 암젠 인크 Il23-길항제에 대한 임상적 반응의 예측인자로서의 ccl20
PE20191497A1 (es) * 2016-12-21 2019-10-21 Cephalon Inc Anticuerpos que se unen especificamente a il-15 humana y usos de estos
SG11202100185VA (en) 2018-07-13 2021-02-25 Astrazeneca Collaboration Ventures Llc Treating ulcerative colitis with brazikumab
CN109970855A (zh) * 2019-04-12 2019-07-05 深圳普瑞金生物药业有限公司 Il23单域抗体的vhh链、il23单域抗体、核苷酸序列及试剂盒
CN111956606B (zh) * 2020-08-31 2021-05-14 江苏荃信生物医药有限公司 包含高浓度抗人白介素23单克隆抗体的低粘度液体制剂

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101252951A (zh) * 2005-06-30 2008-08-27 森托科尔公司 抗il-23抗体、组合物、方法和用途

Family Cites Families (57)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4593089A (en) 1980-07-30 1986-06-03 Abbott Laboratories Fluorescent polarization immunoassay utilizing substituted triazinylaminofluorescein aminoglycosides
US4554101A (en) 1981-01-09 1985-11-19 New York Blood Center, Inc. Identification and preparation of epitopes on antigens and allergens on the basis of hydrophilicity
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
US4751190A (en) 1985-07-22 1988-06-14 Abbott Laboratories Fluorescence polarization immunoassay and reagents for use therein
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
US5260203A (en) 1986-09-02 1993-11-09 Enzon, Inc. Single polypeptide chain binding molecules
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
US6291158B1 (en) 1989-05-16 2001-09-18 Scripps Research Institute Method for tapping the immunological repertoire
US5859205A (en) 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
WO1994004679A1 (en) 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
DE4211351A1 (de) 1992-04-04 1993-10-07 Behringwerke Ag Verfahren zur Analyse partikelverstärkter Agglutinationsreaktionen auf Zentrifugalanalysatoren durch Bestimmung der Trübungsaufhellung
AU3691093A (en) 1992-04-14 1993-10-21 Hybritech Incorporated Methods of inhibiting the growth of multidrug resistant tumors
US20080152586A1 (en) 1992-09-25 2008-06-26 Avipep Pty Limited High avidity polyvalent and polyspecific reagents
EP0672068A4 (en) 1992-09-25 1997-02-26 Commw Scient Ind Res Org TARGET MOLECULES BINDING POLYPEPTIDES.
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
US6291189B1 (en) 1994-05-10 2001-09-18 Carta Proteomics, Inc. Methods for the high-resolution identification of solvent-accessible amide hydrogens in polypeptides or proteins and for characterization of the fine structure of protein binding sites
US5516637A (en) 1994-06-10 1996-05-14 Dade International Inc. Method involving display of protein binding pairs on the surface of bacterial pili and bacteriophage
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6113898A (en) 1995-06-07 2000-09-05 Idec Pharmaceuticals Corporation Human B7.1-specific primatized antibodies and transfectomas expressing said antibodies
ES2176484T3 (es) 1995-08-18 2002-12-01 Morphosys Ag Bancos de proteinas/(poli)peptidos.
US6541213B1 (en) 1996-03-29 2003-04-01 University Of Washington Microscale diffusion immunoassay
US6699658B1 (en) 1996-05-31 2004-03-02 Board Of Trustees Of The University Of Illinois Yeast cell surface display of proteins and uses thereof
CA2244326C (en) 1997-08-11 2006-03-28 Shinichi Eda Microparticle enhanced light scattering agglutination assay and microparticle reagents therefor
US6562622B1 (en) 1998-05-08 2003-05-13 Diatech Pty, Ltd Continuous in vitro evolution
WO2000034317A2 (en) 1998-12-08 2000-06-15 Biovation Limited Method for reducing immunogenicity of proteins
US6566051B1 (en) 1999-01-15 2003-05-20 Medtox Scientific, Inc. Lateral flow test strip
US7270969B2 (en) 1999-05-05 2007-09-18 Phylogica Limited Methods of constructing and screening diverse expression libraries
US7229619B1 (en) 2000-11-28 2007-06-12 Medimmune, Inc. Methods of administering/dosing anti-RSV antibodies for prophylaxis and treatment
PT1355919E (pt) 2000-12-12 2011-03-02 Medimmune Llc Moléculas com semivida longa, composições que as contêm e suas utilizações
WO2004006955A1 (en) 2001-07-12 2004-01-22 Jefferson Foote Super humanized antibodies
US7205159B2 (en) 2001-08-20 2007-04-17 Proteome Systems Intellectual Property Pty Ltd. Diagnostic testing process and apparatus
US7217798B2 (en) 2003-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of Fc-fusion protein serum half-lives by mutagenesis
US7217797B2 (en) 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
CA2507415A1 (en) 2002-11-21 2004-06-03 The University Of Leicester Bodily fluid markers of tissue hypoxia
US7355008B2 (en) 2003-01-09 2008-04-08 Macrogenics, Inc. Identification and engineering of antibodies with variant Fc regions and methods of using same
JP2007515939A (ja) * 2003-05-09 2007-06-21 セントカー・インコーポレーテツド ＩＬ−２３ｐ４０特異的免疫グロブリン由来タンパク質、組成物、方法および用途
CA2527726A1 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Alexion Pharmaceuticals, Inc. De-immunized anti-cd3 antibody
AR051444A1 (es) 2004-09-24 2007-01-17 Centocor Inc Proteinas derivadas de inmunoglobulina especifica de il-23p40, composiciones, epitopos, metodos y usos
US20070135620A1 (en) 2004-11-12 2007-06-14 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US8802820B2 (en) 2004-11-12 2014-08-12 Xencor, Inc. Fc variants with altered binding to FcRn
US7700099B2 (en) 2005-02-14 2010-04-20 Merck & Co., Inc. Non-immunostimulatory antibody and compositions containing the same
EP1872125A4 (en) 2005-03-31 2009-04-01 Telethon Inst For Child Health ISOLATION OF INHIBITOR OF IRES-MEDIATED TRANSLATION
EP1907418A2 (en) 2005-07-15 2008-04-09 ZymoGenetics, Inc. Heterodimeric four helix bundle cytokines
JP2009504685A (ja) 2005-08-15 2009-02-05 アラーナ・テラピューティクス・リミテッド 新世界霊長類フレームワーク領域を用いる設計された抗体
SG165322A1 (en) * 2005-08-31 2010-10-28 Schering Corp Engineered anti-il-23 antibodies
WO2009082624A2 (en) 2007-12-10 2009-07-02 Zymogenetics, Inc. Antagonists of il-17a, il-17f, and il-23 and methods of using the same
AR073060A1 (es) * 2008-08-14 2010-10-13 Arana Therapeutic Ltd Anticuerpos anti-il-12/il-23
MX2011002159A (es) 2008-08-27 2011-03-29 Schering Corp Formulaciones liofilizadas de anticuerpos anti-interleucina-23p19 construidos por ingenieria.
AR074369A1 (es) 2008-11-20 2011-01-12 Genentech Inc Anticuerpos anti-unc 5b (receptor de netrina) y metodos de uso
RU2593720C2 (ru) 2008-12-19 2016-08-10 Макродженикс, Инк. Ковалентные диантитела и их применение

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101252951A (zh) * 2005-06-30 2008-08-27 森托科尔公司 抗il-23抗体、组合物、方法和用途

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Publication number Publication date
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GRABULOVSKI et al. Patent 2888583 Summary

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