CN101173296B - 广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法 - Google Patents

Abstract

广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法，涉及微生物学领域。技术方案是：PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子，将Amp启动子与绿色荧光蛋白结构基因连接，得到以其启动绿色荧光蛋白表达的广谱型原核表达载体。本发明利用能在细菌中广泛发挥作用的氨苄青霉素抗性基因(Amp)的启动子构建了一种广谱型GFP表达载体，所构建的载体表达GFP不受细菌型别和种类的限制，也不受细菌生长环境的限制，只要转化进细菌细胞，即可发挥作用，表达GFP，因而大大扩展了应用领域。

Description

广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法

技术领域

本发明涉及微生物学领域。

背景技术

绿色荧光蛋白(GFP)是一种理想的示踪标记，已经在生物技术、细胞生物学、转基因动物、环境工程、微生物学等领域得到广泛的应用。但是，目前要在特定宿主细胞表达外源蛋白(也包括GFP)，必须使用与宿主细胞相适应表达载体。对于原核表达系统来说，大肠杆菌是广为使用的表达外源基因的宿主菌，其原核表达载体中使用的启动子类型主要有基于lac操纵子的启动子、T7噬菌体启动子、λ噬菌体PL启动子、碱性磷酸酶phoA启动子等。含这些启动子的载体表达外源蛋白时都需要满足特定的诱导条件，而且还需要特定基因型大肠杆菌作为外源基因表达的宿主菌。诱导lac启动子需要cAMP激活蛋白，即CAP，而在含葡萄糖的培养环境中CAP含量很低，外源基因不能表达。也就是说含lac启动子载体必须在无葡萄糖培养时才能表达外源蛋白，而且还需要补加IPTG诱导。但是IPTG价格昂贵，不能用于大量诱导。用T7噬菌体启动子时，宿主菌细胞内必须能提供T7噬菌体基因1的产物，即T7噬菌体RNA聚合酶，要么由感染性λ噬菌体提供，要么由插入大肠杆菌染色体的基因产生，一般采用的溶源性细菌BL21(DE3)，其中T7噬菌体基因1是受控于IPTG诱导的lac UV5启动子。用λ噬菌体PL启动子时，其受控于温度敏感阻抑物cIts857，宿主菌必须携带cIts857基因，阻抑物cIts857在低温下启动表达，高温时不能。phoA启动子是碱性磷酸酶启动子，在过量磷酸盐存在时被抑制，磷酸盐饥饿时被逐渐诱导，外源基因与编码phoA信号肽序列融合，当蛋白分泌到细菌内外膜之间时被信号肽酶切割，因而适宜表达分泌型蛋白。

因此，目前没有任何一种表达载体可在所有类型(包括野生型)的大肠杆菌中都能进行外源基因的表达，更不用说能在多种宿主细菌中表达的广谱型表达载体了。

发明内容

本发明目的是发明一种于普通生长条件下均可表达绿色荧光蛋白(GFP)的广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体。

本发明技术方案是：PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子，将Amp启动子与绿色荧光蛋白结构基因连接，得到以其启动绿色荧光蛋白表达的广谱型原核表达载体。

本发明利用能在细菌中广泛发挥作用的氨苄青霉素抗性基因(Amp)的启动子构建了一种广谱型GFP表达载体，所构建的载体表达GFP不受细菌型别和种类的限制，也不受细菌生长环境的限制，只要转化进细菌细胞，即可发挥作用，表达GFP，因而大大扩展了应用领域。

本发明包括以下步骤：

1)以pcDNA3为模板通过PCR方法扩增Amp启动子，亚克隆进pGEMT载体，然后用Pvu II和BamH I消化，凝胶电泳回收Amp启动子；设计Amp启动子的序列上、下游引物时，在上游引物中引入Pvu II酶切位点，下游引物中引入BamHI酶切位点；

2)用Pvu II和BamHI消化pEGFP质粒，回收载体框架；

3)将步骤2)回收的载体框架与Amp启动子连接，得到广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体pAEGFP。

pAEGFP转化入各种细菌菌株中，在可见光和紫外线激发条件下分别检测相应菌株转化后GFP的表达。表达菌株提取质粒，用酶切和PCR方法检测Amp启动子和GFP基因确实存在于菌株细胞中。用本质粒构建的工程菌进行示踪研究。

另，本发明中，PCR扩增氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子的步骤包括：

1)从含Amp启动子的质粒中用引物扩增出Amp启动子；

2)将扩增的产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化；

3)把纯化的Amp启动子与pGEMT载体在16℃环境条件下连接2h，取出，置于-20℃环境中；

4)用一步法试剂制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将上述连接产物转化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后小量制备质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出携带目的DNA片段的重组质粒，即Amp启动子。

以质粒pcDNA3作为模板扩增Amp启动子的上、下游引物序列为：

CGCAGCTGGACGTCAGGTGGCACTTT，

CGGGATCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT。

附图说明

图1为本发明构建的广谱细菌宿主GFP表达载体的结构示意图。

图2为携带pAEGFP的大肠杆菌DH5α菌落在紫外光激发下的图像。

图3为携带pAEGFP的大肠杆菌BL21菌落在紫外光激发下的图像。

图4为携带pAEGFP的伤寒杆菌无鞭毛株菌落在紫外光激发下的图像。

图5为携带pAEGFP的伤寒杆菌有鞭毛株菌落在紫外光激发下的图像。

图6为携带pAEGFP的大肠杆菌分离株菌落在紫外光激发下的图像。

具体实施方式

1、Amp启动子的扩增

根据Amp启动子序列设计引物，并分别于上下游引物中引入Pvu II和BamH I酶切位点，上下游引物序列为：

CGCAGCTGGACGTCAGGTGGCACTTT，CGGGATCCACTC

TTCCTTTTTCAATATTAT。

小量提取质粒pcDNA3作为模板扩增Amp启动子，50μl PCR扩增体系包括5μl 10×缓冲液，2mmol/L Mg²⁺，200μmol/L dNTPs，200nmol/L正、反向引物，1ng pcDNA3，2.5U LA Tag DNA聚合酶。30次循环的PCR程序为94℃/30s(第一次循环为5min)，55℃/30s，72℃/20s(最后一次循环为5min)。扩增产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化。

参照TaKaRa公司的DNA Ligation Kit说明书把扩增的Amp启动子进行T克隆，即与pGEMT载体连接，反应体系含pGEMT 50ng、Amp启动子10ng、Ligation buffer I 5μl，其中Amp启动子与pGEMT摩尔比大于3∶1。16℃连接2h，取出置于-20℃备用。用上海生工的一步法试剂制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将上述连接产物转化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后小量制备质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳分析，筛选可能携带目的DNA片段的重组质粒，用Pvu II和BamHI进行酶切鉴定。

2、广谱型GFP表达载体的构建

含Amp启动子的pGEM载体用Pvu II和BamHI进行酶切。50μl酶切反应体系含pGEM-Amp 10μg、10×H Buffer 5μl、Pvu II和BamHI各20U，用水补足到50μl，37℃酶切4h后进行1％琼脂糖凝胶电泳，长波长紫外灯下用刀片将含Amp启动子的凝胶条带切下，用TaKaRa公司的Agarose Gel DNAPurification kit进行回收纯化。

回收产物与经Pvu II和BamHI消化后凝胶回收的pEGFP载体骨架区(大片段)进行连接。即，用Amp启动子替换pEGFP载体中lac启动子。

连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。长出的菌落扩培后提取质粒，凝胶电泳分析是否含有重组载体pAGFP，并用Amp启动子的引物作PCR进行进一步验证。

3、广谱型GFP表达载体的应用

把pAGFP分别转化入大肠杆菌DH5α、大肠杆菌BL21、伤寒杆菌无鞭毛株、伤寒杆菌有鞭毛株、分离株大肠杆菌后，分别获得携带pAEGFP的大肠杆菌DH5α菌落、大肠杆菌BL21菌落、伤寒杆菌无鞭毛株、伤寒杆菌有鞭毛株、分离株大肠杆菌菌落。

含pAGFP的各菌株在可见光下观察即可见到淡淡的蓝绿色荧光，在紫外光激发下则发出很明亮的绿色荧光。如图2～6所示。

同样的上述5株菌株，用pEGFP载体转化后，在不诱导的条件下，均未能观察到绿色荧光蛋白的表达。

总结：本发明所构建的广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体，在普通生长条件下均可表达绿色荧光蛋白(GFP)。

<110>扬州大学

<120>广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法

<160>2

<210>1

<211>26

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据质粒pcDNA3基因序列设计

<400>1

cgcagctgga cgtcaggtgg cacttt

<210>2

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>根据质粒pcDNA3基因序列设计

<400>2

cgggatccac tctccttttt caatattat

Claims (1)

1.广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：

1)设计氨苄青霉素抗性基因的Amp启动子序列的上、下游引物时，在上游引物中引入Pvu II酶切位点，下游引物中引入BamH I酶切位点；所述上、下引物序列为：

CGCAGCTGGACGTCAGGTGGCACTTT，

CGGGATCCACTC TTCCTTTTTCAATATTAT；

以pcDNA3为模板通过PCR方法扩增Amp启动子，将扩增的产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳分析并回收纯化；把纯化的Amp启动子与pGEMT载体在16℃环境条件下连接2h，取出，置于-20℃环境中；制备大肠杆菌DH5α感受态细胞，并将上述连接产物转化进感受态细胞，挑取长出的白色菌落扩培后小量制备质粒DNA，1％琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出携带目的DNA片段的重组质粒，然后用Pvu II和BamHI消化，凝胶电泳回收Amp启动子；

2)用Pvu II和BamHI消化pEGFP质粒，回收载体框架；

3)将步骤2)回收的载体框架与Amp启动子连接，得到广谱细菌宿主绿色荧光蛋白表达载体pAEGFP。

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