CN104711294A

CN104711294A - 一种基于禽网状内皮组织增生症病毒ltr的真核表达线性化载体的构建方法及应用

Info

Publication number: CN104711294A
Application number: CN201510154789.0A
Authority: CN
Inventors: 叶建强; 田晓彦; 范中雷; 秦爱建; 邵红霞
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2015-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2015-06-17

Abstract

本发明涉及一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达载体的构建及应用。该方法是利用序列如SEQ ID NO.1和2的引物，以SNV毒株为模板，进行PCR扩增得REV病毒LTR线性化载体。此发明不仅可用于研究REV或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实现对外源基因的快速克隆、高效表达。

Description

一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达线性化载体的构建方法及应用

技术领域

本发明涉及一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达载体的构建及应用。此发明不仅可用于研究REV或其它反转录病毒的复制、转译、致病等机制；而且能实现对外源基因的快速克隆、高效表达。

背景技术

禽网状内皮组织增生症病毒(REV)主要引起以网状内皮细胞增生为主要特征的一组综合征，包括急性网状细胞增生症、矮小综合征和淋巴组织及其它组织的慢性肿瘤增生性疾病。REV感染鸡群往往生长迟缓，淘汰率和死亡率升高；并引起感染鸡的免疫抑制，干扰其它禽病疫苗的免疫效应，导致免疫失败。REV前病毒基因组结构具有完整的反转录病毒基因组结构，包括5’LTR-gag-pol-env-LTR3’基本结构。其中，LTR为非编码长末端重复序列，与病毒复制、转译密切相关；且被证明具有真核启动子和增强子活性。5’LTR不但具有RNA聚合酶Ⅱ启动子功能，还具有增强子及转录调控原件。3’LTR除了具有PolyA终止转录功能外，也具有启动子特性。因此，有效利用LTR中序列成分，不但可以研究REV病毒复制、转译、致病等机制，而且可构建表达载体，用于外源基因表达及运输。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。因此，开发不依赖于限制性内切酶的基于REV LTR的线性化真核表达载体可简化克隆过程，实现基因快速克隆表达。

发明内容

1、要解决的技术问题

本发明的目的是在于提供一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的线性真核表达载体的构建及应用方法，用于外源基因的快速克隆与表达。本发明的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出含REV病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段，利用商品化的重组酶ExnaseTM II不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆，随后转化到大肠杆菌进行质粒扩增与鉴定；并将阳性克隆转染真核细胞实现基因高效表达。

所述引物如下：

a,PCR扩增REV病毒LTR线性化载体引物：

上游引物：5‘ccaacagagatggataccctaggtcaatg3’；

下游引物：5‘agacggaagacactggaggcaaaaggctc3’；

b,PCR扩增外源基因引物：

上游引物：5‘cagtgtcttccgtctATGNNNNNNNNNNNNNNN3’；

下游引物：5‘atccatctctgttggCTANNNNNNNNNNNNNNN3’；

本发明公开了PCR扩增REV病毒LTR线性化载体引物以及PCR扩增外源基因用于体外快速重组克隆引物的保守序列。本发明还公开了一种基于REV病毒LTR的外源基因快速克隆表达的方法，其特征在于用重组酶ExnaseTM II，将线性化的REV病毒LTR载体与外源基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆转化到大肠杆菌。

2、技术方案

1)设计扩增含REV病毒LTR的线性化载体以及外源基因片段引物：扩增含REV病毒LTR的线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组7783-7811位；扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组974-1002位；扩增外源基因的上游引物中除了ATG起始密码子，外源基因特异的15个碱基N外，均带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物互补的碱基；扩增外源基因的下游引物中除了终止子，外源基因特异的15个碱基N外，均带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由Life Technologies上海赛默飞世尔科技公司合成。

2)基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及外源基因为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含REV病毒LTR的真核表达线性化载体REV-LTR以及外源基因片段(附图1，步骤1)；并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆即可进行真核细胞转染、表达鉴定(附图1，步骤3)。

3、有益效果

该发明设计的引物以及构建的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体，不仅对研究反转录病毒复制、转译、致病等分子机制具有重要意义；而且可实现对外源基因的快速克隆高效表达，具有潜在的应用价值。本发明中整合了基于重组酶ExnaseTM II的快速克隆策略。该克隆方法不依赖于限制性内切酶以及连接酶，大大简化了外源基因的克隆过程，提高了效率。通过单轮PCR及重组即可成功获得在REV病毒LTR调控下的外源基因高效真核表达载体。

附图说明

图1基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用策略

步骤1：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及外源基因为模版，利用表1中引物，PCR分别扩增出含REV病毒LTR的真核表达线性化载体REV-LTR以及外源基因片段；步骤2：利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；步骤3：阳性克隆转染真核细胞、表达鉴定。

图2电泳分析PCR产物

泳道1，扩增出的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体；泳道2，扩增出的eGFP片段。

图3eGFP在基于REV病毒LTR的真核表达载体中的表达

A.转染REV-LTR-eGFP的DF1细胞，B.未转染正常DF1细胞。

具体实施方式

为更好的理解本发明的内容，以下实施方式结合附图给出了基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体的构建及应用的示例。

实施例

1)设计扩增含REV病毒LTR的线性化载体以及EGFP片段引物：扩增含REV病毒LTR的线性化载体上游引物位于SNV毒株前病毒基因组7783-7811位；扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物位于SNV毒株前病毒基因组974-1002位；扩增EGFP片段的上游引物中除了eGFP片段特异的18个碱基外，还带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体下游引物互补的碱基；扩增eGFP片段的下游引物中除了EGFP片段特异的18个碱基N外，还带有15个保守的与扩增含REV病毒LTR的线性化载体上游引物互补的碱基。具体引物序列见附表1，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成。

2)基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体以及EGFP片段PCR扩增：以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV以及pcDNA3.1-EGFP为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl 10倍缓冲液，1μl 10mM dNTP，1μl 10μmol上游引物，1μl 10μmol下游引物,1μl 10ng/μl的SNV以及pcDNA3.1-EGFP，1μl商品化的PhantaSuper-Fidelity DNA聚合酶。PCR扩增反应循环参数为：95℃变性3分钟,随后进行30个循环(95℃变性10秒,57℃退火30秒，72℃延伸3分钟),最后72℃延伸10分钟。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳。如图2所示，其中泳道M表示对照品DNA Marker的电泳分析图，其中泳道1、2分别代表基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体REV-LTR(SEQ ID NO.7)以及eGFP片段PCR扩增产物的电泳分析图。

3)eGFP片段快速克隆进基于REV病毒LTR的真核表达载体：将以上纯化的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体REV-LTR以及eGFP片段PCR产物在商品化重组酶ExnaseTM II的作用下进行重组克隆。如图1中的步骤2。具体重组反应体系如下：纯化的eGFP产物50-100ng，纯化的基于REV病毒LTR的真核表达线性化载体50ng，2μl商品化的ExnaseTM II酶，4μl 5倍的缓冲液，其它补加水至20μl。反应物于37℃作用30分钟后，置冰上5分钟。随后将20μl反应物转化到常规感受态细菌，涂LB板。次日挑取细菌克隆进行质粒制备，阳性克隆鉴定。

4)eGFP在基于REV病毒LTR的真核表达载体中的表达：将获得的含eGFP的阳性克隆(命名为REV-LTR-eGFP)转染DF1细胞，转染12hr后,在荧光显微镜下观察eGFP的表达。如图1中的步骤3。具体转染步骤如下：取2ug的REV-LTR-eGFP质粒加入到50ul的OPTI-MEM培养基，随后与4ul的Mirus转染试剂混匀；室温放置45min后，加入450ul的OPTI-MEM培养基混匀后，直接加到新鲜培养的贴壁的DF1。转染12hr后,在荧光显微镜下观察EGFP的表达。在转染后12小时，就能在荧光显微镜下观察到大量eGFP的表达。图3A是REV-LTR-eGFP在DF1细胞中的表达；图3B正常DF1细胞。

表1线性化载体和外源基因引物设计。

Claims

1.一种基于禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达线性化载体的制备方法，其特征在于，利用下述引物，以SNV毒株为模板，进行PCR扩增得REV病毒LTR线性化载体；

上游引物：5‘ccaacagagatggataccctaggtcaatg3’；

下游引物：5‘agacggaagacactggaggcaaaaggctc3’。

2.一种利用禽网状内皮组织增生症病毒LTR的真核表达线性化载体表达外源基因的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以含REV病毒前病毒全基因组质粒SNV为模板，以SEQ IDNO.1和2为引物，PCR扩增出含REV病毒LTR的真核表达线性化载体；

2)以外源基因为模板，以SEQ IDNO.3和4为引物，PCR扩增出外源基因片段；

3)并利用重组酶ExnaseTM II对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆即可进行真核细胞转染、表达鉴定。