CN1940076A - 条件复制型病毒载体及其用法 - Google Patents

Abstract

本发明提供条件复制型病毒载体，提供制备、修饰、繁殖和选择性包装以及使用这样一种载体的方法，提供与这类载体相关的特定核苷酸序列和氨基酸序列的分离分子、包含这样一种载体的药物组合物和宿主细胞、这样一种宿主细胞筛选药物的用法。这些方法包括病毒感染、特别是HIV感染的预防和治疗处理，因此也涉及病毒疫苗和癌的治疗，特别是病毒病因学的癌的治疗。其它方法包括这类条件复制型病毒载体在基因治疗和其它应用中的用法。

Description

条件复制型病毒载体及其用法

本申请系1996年11月27日提交的，申请号为200410064246.1的，发明名称与本申请相同的申请的分案申请。

该申请享有1995年11月28日申请的美国专利申请序号08/563,459的优先权，后者从此已经转变为临时专利申请，将其通过引用整个结合到本文中。

                   本发明的技术领域

本发明涉及条件复制型病毒载体，涉及这样一种载体的制备、修饰、繁殖和选择性包装的方法，涉及与这类载体相关的特定核苷酸序列和氨基酸序列的分离分子，涉及包含这样一种载体的药物组合物和宿主细胞以及使用这样一种载体和宿主细胞的方法。

                     发明背景

发现人免疫缺陷病毒(HIV)为获得性免疫缺陷综合症(AIDS)的原因已经促进众多的研究进入病毒感染周期和病毒致病的根本机制。对这些机制的研究已经为研究人员提供越来越多的靶，以研制不仅有效对HIV有效、而且也对其它病毒有效的抗病毒剂。根据这些抗病毒剂，特别是针对HIV的抗病毒剂的作用模式，可以将其分为几类。这些类别包括逆转录酶抑制剂、病毒进入细胞的竞争剂、疫苗和蛋白酶抑制剂以及本文称为“遗传抗病毒剂”的最新一类。

一般来说，每种类型的抗病毒剂有其相关的益处和限制，必须根特定治疗状况的迫切需要进行评价。诸如叠氮胸苷(3’-叠氮基-3’-脱氧胸苷，也被称为AZT)、蛋白酶抑制剂等抗病毒剂可以相对容易地传递到病人身体的细胞中，对这些抗病毒剂已经进行了广泛地研究。这些抗病毒剂以病毒感染周期中的某种特异性因子为目标，已证明对HIV相对无效。这主要是因为HIV毒株变化迅速，变为对具有单个作用位点的药剂产生抗性(Richman， AIDS Res.and Hum.Retrovir.，8，1065-1071(1992))。因此，在HIV基因组中的遗传变异和快速突变的问题迫使考虑治疗HIV感染的新抗病毒策略。根据这些方法，由于遗传抗病毒剂在细胞内作用于多个不同水平，因此有吸引力。

遗传抗病毒剂不同于其它治疗剂，因为它们作为分子元件转移到靶细胞内，其中它们保护细胞免受病毒感染(Baltimore， Nature，325，395-396(1988)；和Dropulic等， Hum.Gene Ther.，5，927-939(1994))。遗传抗病毒剂可以是任何遗传序列，包括(但不限于)反义分子、RNA引捕器、反式显性突变、干扰素、毒素、免疫原和核酶。特别是，核酶是以序列特异性方式切割靶RNA(包括HIV RNA)的遗传抗病毒剂。核酶介导的靶RNA切割的特异性启示可能使用核酶作为病毒复制(包括HIV复制)的治疗抑制剂。不同类型的核酶(诸如锤头型核酶和发夹型核酶)已经用于抗HIV策略中(参见例如美国专利第5,144,019、5,180,818和5,272,262号和PCT专利申请WO 94/01549和WO93/23569)。可以工程改造锤头型核酶和发夹型核酶，以切割含有GUC序列的任何靶RNA(Haseloff等， Nature， 334，585-591(1988)；Uhlenbeck，Nature， 334，585(1987)；Hampel等， Nuc.Acids Res.， 18，299-304(1990)；和Symons， Ann.Rev.Biochem.， 61，641-671(1992))。一般来说，锤头型核酶有两种类型的功能域，即一个侧翼为两个杂交域的保守催化域。杂交域与GUC序列周围的序列结合，而催化域切割GUC序列的3’RNA靶(Uhlenbeck(1987)，见上述；Haseloff等，(1988)，见上述；和Symons(1992)，见上述)。

大量研究证实，核酶至少可以部分有效地抑制组织培养细胞中HIV的繁殖(参见例如Saver等， Science， 247，1222-1225(1990)；Saver等， NIH Res.， 5，63-67(1993a)；Dropuluc’等， J.Virol.， 66，1432-1441(1992)；Dropulic等， Methods：Comp.Meth.Enzymol.， 5，43-49(1993)；Ojwang等， PNAS， 89，10802-10806(1992)；Yu等， PNAS， 90，6340-6344(1993)；和Weerasinghe等， J.Virol.， 65，5531-5534(1991))。具体地说，Saver等((1990)，见上述)已经证明，设计在HIV gag基因转录区内切割的锤头型核酶(即抗gag核酶)在体外可以特异性地切割HIV gagRNA。此外，当用HIV-1攻击表达抗gag核酶的细胞系时，观察到50-100倍的抑制HIV复制。同样，Weerasinghe等((1991)，见上述)已经表明，编码设计在HIV-1 RNA的U5序列内切割的逆转录病毒载体当随后用HIV攻击转导细胞时，赋予转导细胞HIV抗性。尽管如通过用来驱动核酶表达的启动子系统测定的，不同的转导细胞克隆对攻击表现出不同水平抗性，但大多数表达核酶的细胞系在培养有限时间后，屈服于HIV表达。

用杂交域对HIV U5区为特异性的核酶导入其nef基因(该基因对于组织培养中病毒的复制是不必要的)的前病毒转导到组织培养细胞中已经表明，与用野生型前病毒转导的细胞相比，100倍地抑制病毒在转导细胞中的复制(参见例如Dropulic等(1992)和(1993)，见上述)。同样，已发现发夹型核酶抑制HIV在用含U5发夹型核酶的载体转导、并用HIV攻击的T细胞中复制(Ojwang等，(1992)，见上述)。其它研究已经表明，含有由tRNA启动子表达的核酶的载体，也抑制多种HIV毒株(Yu等(1993)，见上述)。

将核酶或其它遗传抗病毒剂传递到HIV感染的细胞靶(例如CD4+T细胞和单核巨噬细胞)，已经成为有效遗传治疗处理AIDS的主要障碍。目前以造血系统细胞(即HIV感染的主要靶)为目标的途径，要求将治疗基因导入分化时产生成熟T细胞的前体多能造血干细胞或成熟CD4+T淋巴细胞中。然而，由于干细胞难以体外培养和转导，因此以干细胞为目标存在问题。以循环T淋巴细胞为目标也有问题，因为这些细胞传播得如此之广，以致于使用目前的载体传递系统难以到达所有靶细胞。此外，由于巨噬细胞是病毒传播到其它器官的主要贮主，因此应将它们考虑为细胞靶。然而，由于巨噬细胞是成体终末分化的，因此不进行细胞分裂，所以它们不易用常用载体转导。

因此，目前治疗HIV的主要方法利用复制缺陷型病毒载体和包装(即“辅助”)细胞系(参见例如Buchschacher， JAMA， 269(22)，2880-2886(1993)；Anderson， Science， 256，808-813(1992)；Miller， Nature， 357，455-460(1992)；Mulligan， Science， 260，926-931(1993)；Friedmann， Science，244，1275-1281(1989)；和Cournoyer等， Ann.Rev.Immunol.， 11，297-329(1993))，将特异性干扰病毒复制或使受感染细胞致死的外源基因导入易受病毒感染(诸如HIV感染)的细胞中(Buchschacher(1993)进行了综述，见上述)。这类复制缺陷型病毒载体除含有目的外源基因外，还含有病毒复制必需的顺式作用序列，但不含编码必需病毒蛋白质的序列。结果，这样一种载体不能够完成病毒复制周期，而使用含有并组成型表达其基因组中病毒基因的辅助细胞系来繁殖它。将复制缺陷型病毒载体导入辅助细胞系后，反式提供该载体形成病毒颗粒所需的蛋白质，产生能够感染靶细胞并在其中表达该基因的载体病毒颗粒，它干扰病毒复制，或使得病毒感染的细胞死亡。

这类复制缺陷型逆转录病毒载体包括腺病毒和腺病毒相关病毒以及用于HIV基因治疗临床实验的那些逆转录病毒载体，特别是已知为莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)的小鼠嗜两栖类逆转录病毒载体。这些缺陷型病毒载体已经用来用遗传抗病毒剂(诸如抗HIV核酶)转导CD4+细胞，其成功的程度不同(Sarver等(1990)，见上述；Weerasinghe等(1991)，见上述；Dropulic等(1993)，见上述；Ojwang等(1992)，见上述；和Yu等(1993)，见上述)。然而，这些载体本身限制HIV基因治疗的应用。例如，高转导频率在HIV治疗中是尤其重要的，在此该载体必须转导稀少的CD34+远祖造血干细胞或广泛传播的靶CD4+T细胞，其中大多数在疾病临床“潜伏”期中已经感染HIV。然而，MuLV载体难以获得高效价，因此，导致转导差。此外，在CD34+远祖干细胞中，特别是在分化为成熟T淋巴细胞后，尚未获得转导DNA的长期表达。另外，缺陷型病毒载体的使用需要体外基因转移策略(参见例如美国专利第5,399,346号)，这可能是昂贵的，并且超出大众的费用。

与使用目前可利用的用于AIDS遗传治疗处理的载体有关的这些缺点，已经使研究人员找出新的病毒载体。一种这种载体是HIV本身。HIV载体已经用于传染性研究(Page等， J.Virol.， 64，5270-5276(1990))和用来将基因(诸如自杀基因)导入CD4+细胞中，特别是导入感染HIV的CD4+细胞中(参见例如Buchschacher等， Hum.Gener.Ther.， 3，391-397(1992)；Richardson等， J.Virol.， 67，3997-4005(1993)；Carroll等， J. Virol.， 68，6047-6051(1994)；和Parolin等， J.Virol.， 68，3888-3895(1994))。这些研究的策略是使用HIV载体，将基因导入CD4+T细胞和单核细胞中。

然而迄今为止，这些载体是极其复杂的。此外，这些载体的使用伴随着通过细胞内重组产生野生型HIV的风险。已经观察到缺陷型载体序列和辅助病毒共转染/共感染导致病毒基因组同源区之间的重组(Inoue等， PNAS， 88，2278-282(1991))。体外观察到的互补表明，相似的复制缺陷型HIV载体可以在体内重组，因此加剧已经存在的HIV感染。逆转录病毒将两个RNA基因组包装到一个病毒粒子中的事实已经使研究人员指出，逆转录病毒携带两个病毒RNA，以防止由互补和/或重组引起的任何遗传缺陷(Inoue等(1991)，见上述)。

除细胞内重组，由此产生野生型HIV的风险外，HIV载体还具有体内突变的相关风险，这提高该病毒载体的致病性。这已经使Sarver等( AIDS Res.and Hum.Retrovir.， 9，483-487(1993b))推测第二代重组HIV载体的研制，这些载体具有复制能力，而无致病性。与主要使用的非复制型载体(即复制缺陷型载体)相比，这类载体在病人体内继续复制，由此提供与野生型HIV的恒定竞争。然而，迄今尚不能获得这类载体。

理想的是，治疗受感染个体的最佳机会发生在接种时，在该病毒感染该宿主之前。然而，由于许多个体直至疾病的潜伏期才认识到他们已经感染了HIV，因此难以实现这一点。在此基础上，最强烈需要抗病毒介入的阶段是临床潜伏期间。在该阶段的治疗要求面对已经感染的大量CD4+淋巴细胞引起的攻击，这种淋巴细胞含有病毒基因组。这不是平常的攻击，事实证明，迄今仍不能治疗HIV，目前可利用的治疗方法只能很差地治疗。没有有效的疫苗，尽管逆转录酶抑制剂和蛋白酶已经表明防止HIV在组织培养物中复制，但体内病毒抗性的发展已经导致治疗失败。因此，HIV基因治疗对于预测在2000年时超过四千万感染HIV的个体中的大多数而言几乎没有益处。

根据以上所述，对于某些病原体，尤其是病毒，特别是在例如AIDS和癌的情况下，发展对这些病原体的长期和持久性免疫应答也变得越来越重要。已经考虑采用具有复制能力无致病性的病毒的减毒活(LA)疫苗(Daniel等， Science， 258，1938-1941(1992)；和Desrosiers， AIDS Res. & Human Retrovir.， 10，331-332(1994))。然而，由于在一个或多个基因内的缺失而不同于相应野生型病毒的这类非致病病毒，或者(i)因为该抗原不持久(因为LA病毒不能有效地复制)而不能引起保护性免疫应答；或者(ii)LA病毒复制，但具有其它致病潜力，如LA病毒在年轻动物模型中的致病能力证实的(Baba等， Science， 267，1823-1825(1995))。

由于上述原因，仍需要病毒感染特别是在AIDS和癌的情况下的选择预防和治疗处理用药程式。本发明通过提供条件复制型载体，提供这类选择方法。本发明也提供可以使用这样一种载体的其它方法。本发明的这些和其它目的和优点以及其它发明特征将由本文提出的本

发明描述中明显看出。

                      发明概述

本发明提供一种条件复制型病毒载体，其特征在于仅在允许该载体复制的宿主细胞中复制的能力。

在一个实施方案中，该条件复制型病毒载体包含至少一个核酸序列，该序列的存在、转录或翻译赋予允许复制的宿主细胞中的该载体的选择性优势高于对应于衍生该载体的病毒的野生型毒株。

在该条件复制型病毒载体的另一实施方案中，该载体、最好是逆转录病毒包含至少一个核酸序列，该序列的存在、转录或翻译赋予感染该载体的宿主细胞的选择性优势高于感染病毒野生型毒株的细胞，其中该病毒野生型毒株相当于衍生该载体的病毒。

本发明也提供包含条件复制型病毒载体和药学上可接受载体的药物组合物。还提供包含条件复制型病毒载体的宿主细胞。所述载体如果是DNA，则包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列，所述载体如果是RNA，则包含由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列，该载体也作为本文提出的分离并纯化的核酸分子提供。同样提供产生具有核酶的载体的方法、修饰载体的方法和不用包装细胞系而繁殖并选择性地包装条件复制型载体的方法。

在本发明的再一实施方案中，提供治疗性和预防性处理感染病毒的宿主细胞的方法。这类方法可以还适当地包括使用辅助表达载体、细胞毒性药物、蛋白质/因子或蛋白酶/逆转录酶抑制剂。该方法可以用来例如抑制病毒复制、治疗癌、体内基因转移，或在宿主细胞内表达目的基因。

在又一实施方案中，提供使用包含条件复制型载体的宿主细胞检测药物/因子和蛋白质之间相互作用的方法。这样一种方法使得能够进行蛋白质特征记述和筛选对给定蛋白质有活性的药物/因子。

                     附图简述

图1A-1E图示野生型HIV(图1A)、crHIV-1.1(图1B)、crHIV-1.11(图1C)、crHIV-1.12(图1D)和crHIV-1.111(图1E)中存在的病毒基因组结构。命名：cr，条件复制型；U5，U5编码序列；Rz，核酶；Ψ，包装信号；gag、pol和env，分别形成病毒核心蛋白、逆转录酶和囊膜蛋白的编码序列；tat、rev、rre和nef，其它病毒基因；空心方框，病毒长末端重复序列。野生型U5编码区中的叉表示按照本发明核酶在野生型U5 RNA、而不是修饰的crHIV U5 RNA(即“mU5”)中切割的大致区域。

图2描述野生型HIV U5 RNA的DNA序列[SEQ ID NO：1](A)和修饰的crHIV U5 RNA的DNA序列[SEQ ID NO：2](B)。数字是指转录起始下游的碱基数。

图3为描述与不切割的crHIV U5 RNA(第8-14泳道)相比，野生型U5RNA(第1-7泳道)体外核酶切割敏感性的放射自显影照片：野生型HIV U5 RNA转录物(第1泳道)；含有以+115位点为靶(即相当于转录起始下游的碱基数)的单核酶的核酶RNA(第2和9泳道)；与以+115位点为靶的单核酶保温的野生型HIV U5 RNA，导致切割产物P1和P2(第3泳道)；含有以+115位点为靶的双核酶的核酶RNA(第4和11泳道)；与以+115位点为靶的双核酶保温的野生型HIV RNA(第5泳道)；含有以+115和+133位点为靶的双核酶的核酶RNA(第6和13泳道)；与以+115和+133位点为靶的双核酶保温的野生型HIV RNA(第7泳道)；crHIV U5 RNA转录物(第8泳道)；以及与以+115位点为靶的单核酶或双核酶保温的crHIV U5 RNA(第10、12和14泳道)，它表现出没有切割。如果存在核酶切割产物，星号表示该产物出现的位置。

图4为描述在共转染野生型HIV和crHIV-1.1(空心方框)、野生型HIV和crHIV-1.11(空心打叉方框)、野生型HIV和crHIV-1.12(打点方框)以及野生型HIV和对照质粒pGEM-3Z(实心方框)的Jurkat细胞中，逆转录酶活性(cpm/μl)对crHIV介导的野生型HIV复制抑制时间(共转染后的天数)的图。

图5为描述在共转染野生型HIV和crHIV-1.1(空心方框)、野生型HIV和crHIV-1.11(空心打叉方框)、野生型HIV和crHIV-1.111(打点方框)以及野生型HIV和质粒pGEM-3Z(实心方框)的Jurkat细胞中，逆转录酶活性(cpm/μl)对crHIV介导的野生型HIV复制抑制时间(共转染后的天数)的图。

图6A-6C图示用来检测野生型HIV(图6A)、crHIV-1.1(图6B)和crHIV-1.111(图6C)的U5RNA转录物的引物和探针。命名U5，U5编码序列；Ψ，包装信号；gag、pol和env，分别形成病毒核心、逆转录酶和囊膜蛋白的编码序列；空心方框，病毒长末端重复序列；实心方框，tat和rev编码序列；而PE、V1、V2、V3、R1和R2，用于野生型和/或条件复制型病毒的引物。野生型U5编码区中的叉表示按照本发明的核酶在野生型U5 RNA、而不是修饰的crHIV U5RNA(即“mU5”)中切割的大致区域。

图7为描述采用病毒粒子核酶RNA的R1和R2引物进行RT-PCR扩增的放射自显影照片，这些病毒粒子由共转染野生型HIV和crHIV-1.111(第4泳道)、或只转染野生型HIV(第2泳道)的Jurkat细胞+20天培养物产生。第1泳道和第3泳道包含RT-PCR阴性对照，其中RNA是在缺乏逆转录酶的情况下伪逆转录的。

图8为描述病毒粒子(第1-4泳道)和采用病毒RNA的V1、V2和V3引物进行细胞内(第5-8泳道)RT-PCR扩增的放射自显影照片，这些病毒粒子由共转染野生型HIV和crHIV-1.111(第4和8泳道)、或单独转染野生型HIV(第2和6泳道)的Jurkat细胞+20天培养物产生。第1、3、5和7泳道包含RT-PCR阴性对照。

图9为描述细胞内HIV RNA Northern印迹分析的放射自显影照片，其中HIV RNA由共转染野生型HIV和crHIV-1.111(第4泳道)、或单独转染野生型HIV(第3泳道)的Jurkat细胞+20天培养物产生。显示野生型HIV RNA(第3泳道)和crHIV-1.111 RNA(第4泳道)的RNA制剂的质量和上样量。

图10A-10C是描述在野生型HIV助手存在下crHIV复制的放射自显影。图10A：含有crHIV-1.111 RNA的病毒粒子在转染crHIV-1.111(第4泳道)或转染pGEM 3Z(第2泳道)的受刺激ACH2细胞中的产生。第1泳道和第3泳道包含PT-PCR阴性对照。图10B：在用预先转染(第2泳道)或不转染(第1泳道)crHIV-1.11的受刺激ACH2细胞上清液感染Jurkat细胞后，crHIV-1.11核酶DNA的产生。图10C：在首先转染crHIV-1.11、然后超感染pNL4-3病毒(第2泳道)的Jurakt细胞中，含有crHIV-1.11 RNA的病毒粒子的产生。也显示了在首先转染pGEM 3Z对照质粒、然后超感染pNL4-3病毒(第2泳道)的细胞中病毒粒子的产生。第1和第3泳道包含RT-PCR阴性对照。

图11为描述采用病毒生长早期(第1-4泳道)和晚期(第5-8泳道)期间病毒粒子相关RNA的病毒特异性引物(V1、V2和V3)进行RT-PCR放射自显影照片，这些病毒粒子来自共转染野生型HIV RNA和crHIV-1.11(分别为第4和8泳道)或单独转染野生型HIV(分别为第2和6泳道)的培养物。第1、3、5和7泳道包含RT-PCR阴性对照。

图12为描述采用病毒粒子相关RNA的PE引物的引物延伸放射自显影照片，这些病毒粒子相关RNA来自在单独转染野生型HIV(第1泳道)或共转染野生型HIV和crHIV-1.11(第2泳道)的细胞中病毒生长晚期阶段的crHIV-1.11培养物。

                        推荐实施方案的描述

本发明提供抑制病毒野生型毒株的方法。该方法包括使能够感染这样一种病毒野生型毒株的宿主，最好是实际感染这样一种病毒野生型毒株的宿主，与只在允许该载体复制的宿主中繁殖的载体(即非致病条件复制型(cr)载体)接触。

正如本文进一步描述的，该方法的具体目的是在该宿主中建立用这一非致病条件复制型载体的竞争感染。一般来说，按照本发明的条件复制型载体包含至少一个赋予该条件复制型载体复制和传播选择性优势(与野生型病毒相比)的核酸序列和/或至少一个赋予含有条件复制型载体的宿主细胞选择性繁殖病毒颗粒优势(与含有野生型病毒的宿主细胞相比)的核酸序列。

在本发明的一个推荐实施方案中，该载体包含一个HIV序列，该载体用来治疗HIV感染。因此，该载体或含有该载体的宿主细胞包含至少一个核酸序列，该核酸序列(1)提供与野生型HIV基因组相比，具有选择性包装到子代病毒粒子中的优点的crHIV基因组(即在它们两者都驻留的细胞中)，和/或(2)与产生野生型病毒的宿主细胞相比，提供具有选择性产生crHIV病毒粒子的优点的产生条件复制型载体的宿主细胞。一种方法(本发明不限于该方法)通过提供crHIV基因组一个或多个能够切割野生型HIV基因组的核酶，以赋予其选择性包装的优点。

野生型病毒

按照本发明，“病毒”是一种传染因子，它由蛋白质和核酸组成，并且使用宿主细胞的遗传机构生产被病毒核酸特化的病毒产物。“核酸”是指为单链或双链、线性或环状DNA或RNA的聚合物，可选地含有能够整合到DNA或RNA聚合物中的合成、非天然或修饰核苷酸。DNA多聚核苷酸最好由基因组序列或cDNA序列组成。

“病毒野生型毒株”为不包含本文所述的任何人造突变的毒株，即为可以由自然界分离的任何病毒。或者，野生型毒株为已经在实验室培养、但在缺乏任何其它病毒的情况下仍能够产生子代基因组或病毒粒子的病毒，这些子代基因组或病毒粒子同从自然界中分离的那些基因组或病毒粒子一样。例如，下面实施例中所述的pNL4-3 HIV分子克隆是一种野生型毒株，它通过国家健康研究所得自AIDS研究和参比试剂程序目录(也参见Adachi等， J.Virol.， 59，284-291(1986))。

一般来说，本发明的方法最好用来治疗由病毒感染引起的病毒病。病毒(以及该载体，如下所述)最好是一种RNA病毒，但也可以是一种DNA病毒。RNA病毒为感染原核细胞(例如噬菌体)以及许多真核细胞(包括哺乳动物，特别是人类)的多样化的一类。大多数RNA病毒具有作为其遗传物质的单链RNA，尽管至少一个科具有作为遗传物质的双链RNA。RNA病毒分为主要的三类：正链病毒(即该病毒转移的基因组翻译为蛋白质，并且其去蛋白化核酸足以引发感染的那些病毒)、负链病毒(即该病毒转移的基因组与信使有义链互补，并且在翻译前必须用病毒粒子相关酶进行转录的那些病毒)和双链RNA病毒。本发明方法最好用来处理正链病毒、负链病毒和双链RNA病毒。

本文所用的RNA病毒包括辛德毕斯样病毒(例如披膜病毒科、雀麦花叶病毒属、黄瓜花叶病毒组、烟草花叶病毒组、等轴不稳环班病毒、烟草脆裂病毒组和马铃薯X病毒组(Potexvirus))、小核糖核酸病毒样病毒(例如小核糖核酸病毒科、杯状病毒科、缸豆花叶病毒组、线虫传多角体病毒组和potyvirus)、负链病毒(例如副粘病毒科、弹状病毒科、正粘病毒科、本雅病毒科和砂粒样病毒科)、双链病毒(例如呼肠孤病毒科和双节段RNA病毒科)、黄病毒样病毒(例如黄病毒科和瘟病毒属)、逆转录病毒样病毒(例如逆转录病毒)、冠状病毒科和其它病毒组，包括(但不限于)罗达病毒科。

推荐的按照本发明的RNA病毒是黄病毒科病毒，最好是黄病毒属病毒，尤其是马尔堡或埃波拉病毒。黄病毒科病毒最好是黄病毒属病毒，诸如黄热病病毒、登革热病毒、西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒、日本脑炎病毒、摩莱河谷脑炎病毒、罗西欧病毒、蜱传脑炎病毒等。

也最好是小核糖核酸病毒科病毒，最好是甲型肝炎病毒(HAV)、乙型肝炎病毒(HBV)或非甲非乙型肝炎病毒。

另一类推荐的RNA病毒是逆转录病毒科病毒(即逆转录病毒)，特别是肿瘤病毒亚科、泡沫病毒亚科、泡沫病毒属、慢病毒亚科和慢病毒属的属或亚科病毒。肿瘤病毒亚科的亚科RNA病毒希望是1型或2型人亲T淋巴病毒(即HTLV-1或HTLV-2)或牛白血病病毒(BLV)、禽白血病-肉瘤病毒(例如劳斯肉瘤病毒(RSV)、禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)、禽成红血细胞性病病毒(AEV)和劳斯相关病毒(RAV；RAV-0至RAV-50)、哺乳动物C型病毒(例如莫洛尼鼠白血病病毒(MuLV)、哈维鼠肉瘤病毒(HaMSV)、艾贝尔逊鼠白血病病毒(A-MuLV)、AKR-MuLV、猫白血病病毒(FeLV)、猿猴肉瘤病毒、网状内皮组织增生病毒(REV)、脾坏死病毒(SNV))、B型病毒(例如小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV))和D型病毒(例如马森-法衣扎猴病毒(MPMV)和“SAIDS”病毒)。慢病毒亚科的RNA病毒希望是1型或2型人免疫缺陷病毒(即HIV-1或HIV-2，其中HIV-1以前称为淋巴结病相关病毒3(HTLV-III)和获得性免疫缺陷综合症(AIDS)相关病毒(ARV))、或与HIV-1或HIV-2有关的、已经鉴定与AIDS或AIDS样疾病有关的另一病毒。本文所用的缩写字“HIV”或术语“AIDS病毒”或“人免疫缺陷病毒”在属类上是指这些HIV病毒和HIV相关病毒。此外，慢病毒亚科的RNA病毒最好是维斯那/梅迪病毒(例如感染羊的)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、牛慢病毒、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、马传染性贫血病病毒(EIAV)和山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)。

按照本发明的病毒也希望是DNA病毒。该DNA病毒最好是EB病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、乳头瘤病毒、痘苗病毒等等。

这些病毒中的许多病毒被分类为“第4生物安全等级”(即世界卫生组织(WHO)的“第4风险类”)的病原体，为此所有实验室研究工作都需要极端控制设备。然而，普通技术人员熟悉并能够遵守这些病毒所必需的安全注意事项。

“宿主细胞”可以是任何细胞，最好是真核细胞。该宿主细胞希望是淋巴细胞(诸如T淋巴细胞)或巨噬细胞(诸如单核巨噬细胞)，或是这些细胞中任一个的前体，诸如造血干细胞。这些细胞在细胞表面上最好包含CD4+糖蛋白，即CD4+。然而，希望已经感染AIDS病毒的CD4+T淋巴细胞尚未激活(即最好尚未发生nef的表达，甚至更优选尚未减量调节CD4基因的表达，正如下面进一步讨论的)。此外，宿主细胞最好是缺乏CD4标记的、并能够被按照本发明的病毒感染的细胞。这样的细胞包括(但不限于)星形细胞、皮肤成纤维细胞、肠上皮细胞等等。该宿主细胞最好是真核多细胞物种细胞(例如与单细胞酵母细胞相对)，甚至更优选是哺乳动物(例如人)细胞。细胞可以作为单个实体存在，或可以是较大细胞集合的部分。这样一种“较大细胞集合”可以包括例如细胞培养物(或者为混合的，或者为纯的)、组织(例如上皮组织或其它组织)、器官(例如心脏、肺、肝脏、胆囊、膀胱、眼和其它器官)、器官系统(例如循环系统、呼吸系统、消化系统、泌尿系统、神经系统、体被系统或其它器官系统)或生物(例如鸟类、哺乳动物等)。这些作为靶的器官/组织/细胞最好属于循环系统(例如包括(但不限于)心脏、血管和血液)、呼吸系统(例如鼻、咽、喉、气管、支气管、细支气管、肺等)、消化系统(例如包括口、咽、食管、胃、肠、唾液腺、胰腺、肝脏、胆囊和其它器官)、泌尿系统(例如肾、输尿管、膀胱、尿道等)、神经系统(例如包括(但不限于)脑和脊髓，以及特殊感官，诸如眼)和体被系统(例如皮肤)。作为靶的细胞更优选选自心脏、血管、肺、肝脏、胆囊、膀胱和眼细胞。

载体

“载体”是一种用来将过客核酸序列(即DNA或RNA)转移到宿主细胞中的核酸分子(通常为DNA或RNA)。三种常见类型的载体包括质粒、噬菌体和病毒。该载体最好是病毒。

希望该载体不是病毒的野生型毒株，因为它包括人造突变。因此该载体通常通过遗传操作(即通过缺失)由病毒野生型毒株衍生，以包括条件复制型病毒，正如本文进一步描述的。最理想的是，该病毒载体包括一个与引起待治疗感染的野生型病毒类型相同的病毒毒株，引起感染的病毒最好是其中一种上述野生型病毒。因此，该载体最好得自RNA病毒，该载体甚至更优选得自逆转录病毒，最理想的是，该载体得自人免疫缺陷病毒。得自人免疫缺陷病毒的这样一种载体本文从种属上说称为“crHIV”载体。

载体最好也是一种“嵌合载体”，例如病毒载体与其它序列的组合，诸如HIV序列与另一病毒(它最好得自病毒野生型毒株，以包括条件复制型载体)的组合。具体地说，希望HIV序列可以与腺病毒或腺病毒相关病毒的修饰毒株(即非野生型)、辛德毕斯病毒载体或嗜两栖类鼠逆转录病毒载体的序列连接。

如本文所包括的，载体可以包括或者DNA或者RNA。例如或者DNA载体或者RNA载体可以用来衍生该病毒。同样，cDNA拷贝可以由病毒RNA基因组枸成。另一方法是，可以体外转录cDNA(或病毒基因组DNA)部分，以生产RNA。这些技术对本领域技术人员是众所周知的，也在以下实施例中进行了描述。

“条件复制型病毒”是一种复制缺陷型病毒，它只在某些条件下是缺陷型。具体地说，该病毒在允许宿主细胞中可以完成其复制周期，而在限制性宿主细胞中不能完成其复制周期。“允许宿主细胞”是一种感染病毒野生型毒株的宿主细胞。这种感染可以发生在感染按照本发明的条件复制型病毒之前或之后。或者，“允许宿主细胞”是编码病毒复制所必需的野生型病毒基因产物的宿主细胞。因此，按照本发明的条件复制型载体是这样一种病毒(它最好与待治疗感染的病毒类型相同)，它只在与病毒野生型毒株互补时，或野生型病毒感染含有条件复制型载体基因组的细胞时进行复制。

在推荐实施方案中，载体包含以DNA形式导入的RNA病毒(例如条件复制型HIV病毒)。该推荐实施方案提供一种复制HIV-1(crHIV)载体的策略，它提供非致病crHIV-1载体基因组的选择性优势高于致病野生型HIV基因组。具体地说，在同时含有野生型HIV和crHIV基因组的细胞中，crHIV RNA具有包装到病毒粒子中的选择性优点，因为它们含有例如切割野生型RNA、但不切割crHIV RNA的核酶。这类非致病crHIV在野生型辅助病毒存在下，能够传播到对易受HIV感染的未受感染细胞(例如CD4+细胞)。crHIV的选择性包装和传播以这种方式干扰野生型HIV的复制。

具体地说，将crHIV基因组导入受感染细胞或未受感染细胞中。受感染细胞提供crHIV基因组子代病毒粒子包衣和生产所需的蛋白质。最好可以或者直接通过转导(例如可以通过脂质体介导的crHIVDNA转导，或通过采用嵌合病毒载体进行转导做到这一点)，或者通过感染由转染感染野生型HIV的细胞产生的crHIV颗粒，将crHIV基因组导入未受感染细胞中。未受感染细胞本身不产生crHIV颗粒。然而，它们可以用野生型病毒超感染，后者供应进一步生产crHIV颗粒所需的蛋白质。在这种意义上，按照本发明的条件复制型载体也用作提供可以获得多轮crHIV感染(即在同时感染野生型HIV的情况下)的方法的一种类型的“病毒传递载体”。提供一轮以上病毒复制病毒源的这样一种载体与目前所用的其它载体形成对比，目前所用的其它载体诸如与包装细胞系一起使用的那些载体，它们只提供一轮复制。

需要时(例如以促进该载体体外使用)，可以将野生型病毒基因产物共同供给感染该条件复制型载体的细胞。不仅可以通过共感染野生型病毒毒株(或cDNA或RNA病毒的前病毒)，而且可以通过将它们以它们的基因在表达载体(例如辅助表达载体(“助手”))中亚克隆形式供给细胞，供应野生型病毒基因产物，其中辅助表达载体能够使宿主细胞转录或翻译该序列(调节序列或结构序列)，或者，可以从外部供应基因产物，即通过将蛋白产物加入该细胞中。关于该“助手”，其表达可以是细胞特异性的或不是细胞特异性的，可以将其与本文限定的条件复制型载体一起导入宿主细胞中，由此能够连续复制条件复制型病毒载体。

本文所用的“互补”是指来自细胞中不同来源的病毒基因产物的非遗传相互作用。具体地说，对于混合感染，互补包括一个或两个亲本基因组病毒产量的提高，而亲本基因组的基因型保持不变。互补可以是非等位的(即基因间的，其中不同功能缺陷型的突变体通过供给另一病毒缺陷的功能，在病毒复制中相互协助)，或是等位的(即基因内的，其中两个亲本在多体蛋白的不同域中有缺陷)。

最好是，可以转染(转导)crHIV DNA(即通过脂质体或通过使用腺病毒载体或嗜两栖类逆转录病毒载体)的细胞类型可以为或者感染HIV或未感染HIV的细胞。感染的细胞可以已被激活或未被激活。如果它们被激活，那么它们将立刻转录野生型HIV RNA和crHIV RNA，导致选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中。如果感染HIV的细胞未被激活，那么crHIV DNA将驻留在该细胞中，直至它们被激活(例如通过促细胞分裂剂、抗原等刺激)，导致选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中。转染crHIV DNA的激活和未激活未受感染细胞直至它们超感染野生型HIV并通过刺激激活，再导致选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中，才产生病毒粒子。

因为crHIV基因组不编码阻断超感染的病毒蛋白(诸如env和nef)，因此发生含有crHIV基因组细胞的超感染(例如由于转染或感染产生的)。产生的crHIV病毒粒子可以感染未受感染细胞，因为这些病毒颗粒含有逆转录酶分子，后者是所有HIV颗粒携带的，使得它们可以由其基因组RNA产生DNA前病毒。该过程称为逆转录。一旦crHIV病毒粒子感染未受感染细胞，它们则可以经历逆转录，并由其基因组RNA产生前病毒。因此，这些细胞是直接转导crHIV DNA的未受感染细胞的等价物。直至这些细胞超感染野生型HIV并被激活时，才产生crHIV颗粒，然后再选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中。可能crHIV颗粒也可以感染某些已经感染HIV的细胞(参见例如Yunoki等， Arch.Virol.， 116，143-158(1991)；Winslow等， Virol.， 196，849-854(1993)；Chen等， Nuc.Acids Res.， 20，4581-4589(1992)；和Kim等， AIDS Res.& Hum.Retrovir.， 9，875-882(1993))。然而，为了发生这种情况，这些感染HIV的细胞必须不表达减量调节CD4表达的蛋白质，因为这将防止crHIV病毒粒子感染这些细胞。感染HIV的细胞激活时，一般减量调节CD4的表达。因此，未激活的感染HIV的细胞对crHIV超感染潜在地敏感，并且因此可能是crHIV颗粒生产的另一来源。

关于按照本发明的推荐crHIV载体，该载体包含RNA转录、tRNA引物结合、二聚体形成和包装所需的序列，它们或者缺乏编码阻断超感染野生型HIV的蛋白质的序列(例如nef或env蛋白)，或包含这类序列，但这些序列或者不转录，或者不翻译为功能蛋白，使得认为它们的表达是“沉默”的。甚至更优选该载体缺乏野生型HIV从gag编码序列内至nef基因并包括nef基因区域的编码区或编码序列。然而，最好是该载体确实包含rev应答因子(RRE)，后者克隆到该载体的缺失区或某些其它方便的区中。如上所述，由于该载体可以以其RNA表现形式或以DNA形式给药，我们说这种推荐的HIV载体“缺乏该区编码区或编码序列”。

载体的构建对本领域技术人员是众所周知的。例如，如实施例1所述，用限制酶切割RNA病毒(诸如HIV)的DNA表现形式，以在nef基因后面切下从gag编码区内至U3区内的HIV编码序列。在将含有多个限制位点的多接头组成的克隆盒在连接前插入该缺失区，以提供用于克隆入该载体的便利的限制位点。将含有RRE的DNA片段亚克隆到其中一个这些位点中。产生的质粒产生缩短的gag转录物，而不产生野生型Gag蛋白或任何其它野生型HIV蛋白。此外，由于该gag转录起始序列可以突变，以防止其转录，因此甚至该载体表达缩短的gag蛋白也是不必要的。

采用相同方法，可以将crHIV序列与诸如病毒和其它载体序列的其它序列连接，以衍生嵌合载体。例如，可以将crHIV序列与辛德毕斯病毒、AAV、腺病毒或嗜两栖类逆转录病毒的序列连接，这仅仅列举少数可以用来提供crHIV序列传递的这类病毒。或者利用细胞进入的连体病毒机制(例如腺病毒受体介导的胞吞作用)或其它方法(例如脂质体)，可以用这样一种嵌合载体将该载体导入该细胞中。

按照本发明，载体(即最好是crHIV载体的条件复制型病毒)最好包含至少一种核酸序列，占有该序列(即存在、转录或翻译)则赋予选择性优势。有两个类型这类核酸序列待包入该载体中：(1)一种核酸序列，拥有该序列最佳地赋予包含这种序列的载体优于病毒野生型毒株(即最好是衍生该载体的野生型毒株，并且它不包含该序列)的病毒复制和传播的选择优势，以及(2)一种核酸序列，与感染病毒野生型毒株(即最好是衍生该载体的野生型毒株(此外例如在未受感染宿主细胞中促进载体复制和/或起作用的辅助表达载体)，并且它不包含该序列)的细胞相比，拥有该序列最佳地通过例如促进细胞存活、促进载体颗粒生产和/或繁殖、促进由crHIV载体产生细胞生产crHIV载体病毒粒子(包括细胞凋亡)、促进蛋白生产或促进免疫功能或导向，赋予感染包含该序列的载体的细胞选择优势，以便达到所需预防、治疗或生物学结果。促进该载体的繁殖和/或促进特定宿主细胞功能，以便能够达到合适的预防、治疗和/或生物学结果的这些序列中的每个或多种每种这些序列(即单独的序列或与一个或多个另一因子组合的序列)，可以在缺乏或存在另一序列的情况下将其包含于该载体中，即该载体可以包含“至少一个核酸序列”和“至少一个另一核酸序列”。

“核酸”如前所述。“核酸序列”具体包括具有潜在任何大小(即当然受该载体施加的任何包装限制所限制)的任何基因或编码序列(即DNA或RNA)，其拥有提供选择性优势，如本文进一步描述的。“基因”是编码蛋白质或新生mRNA分子的任何核酸序列(无论该序列是否转录和/或翻译)。尽管基因包括编码序列以及非编码序列(例如调节序列)，但“编码序列”不包括任何非编码DNA。

1.核酸序列，该序列的拥有赋予包含这种一种序列的载体在宿主细胞中的选择性优势高于病毒野生型毒株。

赋予载体在宿主细胞中优于病毒野生型毒株的的选择优势的核酸序列，最好是这样的任一序列，它与从野生型病毒繁殖的病毒颗粒相比，使得从该载体繁殖的病毒颗粒选择性产生或包装。这类序列包括(但不限于)导致与野生型基因组相比细胞内产生的载体基因组数增加的序列和抗病毒核酸序列。

第一类核酸序列是与病毒野生型毒株相比，赋予宿主细胞中含有该序列的载体选择性优势的诸如启动子之类的序列。“启动子”是指导RNA聚合酶结合并由此启动RNA合成以及可以包括一个或多个增强子的序列。“增强子”是刺激或抑制相邻基因转录的顺式作用因子。抑制转录的增强子也称为“沉默子”。增强子不同于仅在启动子中发现的序列特异性DNA结合蛋白的DNA结合位点(也称为“启动子元件”)，因为增强子可以从两个方向的任一方向起作用，甚至在距转录区下游位点至多几千碱基对(kb)的距离起作用。

因此，最好修饰条件复制型HIV载体的启动子(例如长末端重复序列(LRT))，使得该载体比野生型HIV毒株更加响应某些细胞因子。例如，可利用证明在白介素-2存在下提高转录活性的修饰HIV启动子。将该启动子加入载体并将该载体导入感染野生型HIV的细胞中，与野生型HIV基因组相比，最好导致来自该载体基因组的子代病毒粒子的生产和包装增加。其它细胞因子和/或化学因子(chemokines)(例如包括(但不限于)肿瘤坏死因子α、RANTES等)同样可以用来促进该载体编码的病毒粒子的选择性包装。

与病毒野生型毒株相比，赋予含有该序列的载体选择性优势的第二类核酸序列，作为推荐序列包括抗病毒核酸序列。“抗病毒剂”根据其作用模式分类，例如逆转录酶抑制剂、病毒进入细胞的竞争剂、疫苗、蛋白酶抑制剂和遗传抗病毒剂。“遗传抗病毒剂”是转移到细胞中、并且或者直接(即当细胞内导入时)或者在其转化为或者RNA或者蛋白质后影响其细胞内的靶的DNA或RNA分子(Dropuli□等综述，(1994)，见上述)。遗传抗病毒序列也是一种推荐核酸序列。遗传抗病毒剂包括(但不限于)反义分子、RNA引捕器、反式显性突变、毒素、免疫原和核酶。遗传抗病毒剂希望是反义分子、免疫原和核酶。因此，赋予载体的选择性优势高于病毒野生型毒株的推荐核酸序列是遗传抗病毒剂核酸序列，选自反义分子、免疫原和核酶。

“反义分子”是与待阻断其表达的基因短区段互补的分子。导向HIV的反义分子与野生型HIV RNA杂交，允许细胞核酸酶优先降解它。反义分子最好是DNA寡核苷酸，其长度希望大约为20-200个碱基对，其长度最好是大约20-50个碱基对，最佳小于25个碱基对。反义分子可以由crHIV RNA表达，它优先与野生型基因组RNA结合，由此提供crHIV RNA包装到子代病毒粒子中的选择优势。

“免疫原”是一种导向病毒结构蛋白的单链抗体(scAb)。免疫原作为核酸转移，并在细胞内表达。同样，免疫原也可以是任何抗原、表面蛋白(包括类别限制的那些表面蛋白)或抗体，它促进载体和/或宿主细胞的选择。在推荐载体中，该核酸序列包括与野生型HIV Rev蛋白结合的scAb。这最好通过使Rev蛋白保持在内质网中防止Rev蛋白成熟。具体地说，Rev蛋白通过与RRE结合，将未剪接的HIV RNA输出到胞质，然后低聚以包围HIV RNA。与Rev复合的HIV RNA输出到细胞质中，绕过细胞剪接机制。因此，如果野生型Rev不与野生型RRE结合，那么野生型HIV RNA就不输出到细胞质中，也就不能包衣壳成为子代病毒粒子。

含有scAb核酸序列的载体最好还包含一个修饰RRE序列，并编码识别修饰(而非野生型)RRE的突变Rev蛋白。因此，在含有野生型HIV和包含scAB核酸序列的载体的细胞中，该载体优先包装为病毒粒子。最好使用相似的策略，其中野生型HIV基质蛋白或核衣壳蛋白(即，或参与影响病毒RNA包衣壳的蛋白/RNA相互作用的任何蛋白)为该scAb的靶。

“核酶”是具有催化活性的反义分子，即核酶结合RNA并影响被结合RNA分子的位点特异性切割，而不是结合RNA并抑制翻译。一般来说，有四组核酶：第I四膜虫组间插序列、RNA酶P以及锤头型和发夹型核酶。然而，在其它RNA分子中也存在另一些催化基元，例如δ肝炎病毒和真菌线粒体中的核糖体RNA。

推荐的核酶是催化域切割3’核苷酸NUH序列的核酶，其中N可以是任何核苷酸(即G、A、U或C)，而H可以为A、C或U。然而，由于这类核酶最有效切割的序列是GUC位点，因此NUH序列最好包含一个GUC位点。

这样一种核酶最好在病毒野生型毒株区内或其转录物区内切割，但不在载体或其转录物区内切割。如前所述，在这样一种病毒或载体可以或者为RNA或者为DNA的意义上，该核酶切割该病毒或其转录物。“在一区域内”切割是指在靶区域内切割，即最好是在病毒繁殖必需的病毒区域内切割。最好已经修饰该载体，使得作为靶的该特定区域(即如果真的存在于该载体中)不被该核酶切割。只要切割不发生在病毒(例如crHIV颗粒)繁殖所需的区域中，那么该核酶可以可选地切割该载体。

最好是该核酶由选自以下的一种序列编码：SEQ ID NO：3(即CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA)和SEQ ID NO：4(即ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC)。SEQ ID NO：3包含一个以野生型HIV U5区域+115位点(即根据转录起始下游的碱基数)为靶的核酶，而SEQ ID NO：5包含一个以野生型HIV U5区域+133位点为靶的核酶。

这样一种核酶能够在野生型HIV基因组(或其转录物)内切割，而不切割该载体基因组(或其转录物)内切割，因为该载体的U5序列通过诸如本领域已知并在实施例1中描述的定点诱变进行修饰。具体地说，最好修饰这些载体序列，使得该载体包含选自以下一个序列：SEQID NO：2(即GTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGAAC)、SEQ ID NO：5(即GTGTGCCCGCCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC)、SEQ ID NO：6(即GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGCAACTAGAGATC)、SEQ ID NO：14(其中至少一个N突变)、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16。RNA形式的该载体最好包含由选自以下的一个序列编码的序列：SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：14(其中至少一个N突变)、SEQ IDNO：15和SEQ ID NO：16。相反，野生型HIV包含由SEQ ID NO：1(即GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC)编码的U5序列。图2提出了全部修饰和与野生型U5序列(DNA形式)的比较。

此外，可以或者单独使用或者组合使用以病毒其它区、特别是HIV基因组为靶的其它核酶。例如，该核酶可以在病毒复制所需的其它RNA序列内切割，例如在逆转录酶、蛋白酶或反式激活蛋白、Rev内或诸如已经描述的其它必需序列内切割。载体最好包含例如以多个位点为靶的多个核酶。在这类情况下，通过定点诱变或诸如本领域已知的某些其它方法修饰该载体中的类似序列，以获得抗这种核酶切割的载体。

当该载体为人免疫缺陷病毒时，该载体最好缺乏tat基因及其5’剪接位点，取而代之包含一个抗Tat三联核酶盒，其中该三联核酶盒的每个核酶的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子上的一个不同位点，特别是tat内的不同位点。每个核酶的催化域最好切割野生型人免疫缺陷病毒核酸分子一个区域内的核苷酸序列，在野生型病毒中本身没有该载体中核酶敏感性的相应物。

2.核酸序列，与感染病毒野生型毒株的细胞相比，拥有该序

列赋予感染包含该序列的载体的细胞选择性优势。

与含有病毒野生型毒株(即缺乏该序列)的细胞相比，赋予含有包含该序列的载体的细胞选择性优势的核酸序列，最好是与含有野生型病毒的细胞相比允许含有该载体的细胞存活并繁殖病毒颗粒(即crHIV病毒颗粒)的任一序列。这类序列包括(但不限于)允许该细胞或含于该细胞的载体免于破坏的任何序列、促进细胞存活的序列、诱导细胞凋亡的序列、促进蛋白生产的序列或促进免疫功能或导向的序列。

例如，该载体上含有的这样一个核酸序列最好编码多种药物抗性的基因(参见例如Ueda等， Biochem.Biophys.Res.Commun.， 141，956-962(1986)；Ueda等， J.Biol.Chem.， 262，505-508(1987)；和Ueda等，PNAS， 84，3004-3008(1987))。在加入的细胞毒性药物(例如用于癌症化疗的药物)存在下，这允许含有该载体的细胞存活，而含有野生型病毒(诸如HIV)的细胞不能存活。这类细胞毒性药物包括(但不限于)放线菌素D、硫酸长春花碱、硫酸长春新碱、道诺霉素、阿霉素、VP-16和AMSA。

或者，这样一个核酸序列最好包含一个选自突变蛋白酶序列(或它编码的序列)和突变逆转录酶的序列(或它编码的序列)的序列。最好将突变逆转录酶工程改造，以对核苷酸和非核苷酸逆转录酶抑制剂有抗性，并且将突变的蛋白酶工程化，以对常用的蛋白酶抑制剂有抗性。

将这些蛋白抑制剂或逆转录酶抑制剂与该载体一起给予宿主，用来筛选与产生野生型病毒的细胞相反的产生该载体的细胞。同样，修改该方法，以用于抑制病毒复制的任何药物，使得该病毒可以突变以逃避抑制。因此，关于HIV的治疗，加入到该载体的选择性核酸序列最好包括突变的HIV序列。然而，这些序列最好不防止超感染野生型HIV。

该载体最好是上述那些载体之一，具体地说，为图1B-1E描述的推荐crHIV载体，即分别为crHIV-1.1、crHIV-1.11、crHIV-1.12和crHIV-1.111(Dropulic等， PNAS， 93，11103-11108(1996))。也最好是实施例11中描述的载体，即cr2HIV。

该cr2HIV载体最好缺乏来自野生型人免疫缺陷病毒基因组的tat基因及其剪接位点。该cr2HIV载体包含抗Tat三联核酶盒以取代tat基因及其剪接位点，其中三联核酶盒的每个核酶的催化域切割野生型HIV核酸分子上的一个不同位点。该三联核酶盒的每个核酶的催化域最好切割野生型HIV核酸分子上tat内的一个不同位点。每个核酶的催化域更优选切割野生型HIV核酸分子区域内的核苷酸序列，在野生型HIV病毒中本身没有该载体中抗核酶的相应物。

载体最好与载体导入的细胞相容，例如载体能够使得该细胞表达该载体编码的核酸序列。该载体最好包含在该细胞中有功能的复制起点。当核酸序列以其DNA编码序列形式(例如与包含其本身启动子的完整基因形式相对)转移时，该载体最好也含有能够驱动该编码序列表达并操作性地与该编码序列连接的启动子。当启动子能够指导编码序列转录时，则该编码序列是“操作性地连接”该启动子(例如当该编码序列和该启动子一起组成天然或重组基因时)。

在本发明重组载体中，最好将所有合适的转录信号(例如起始信号和终止信号)、翻译信号(例如核糖体进入或结合位点等)和加工信号(例如剪接供体位点或剪接受体位点，必要时和多腺苷酸化信号)正确地布置在该载体上，使得任何基因或编码序列在导入该载体的细胞中适当地转录(和/或翻译，如果这样要求)。确保在宿主细胞中合适表达的这类信号的操作是普通技术人员众所周知的，并且在其专门技术范围内。

该载体最好也包含鉴定和筛选该载体或其含有的亚克隆序列的某些工具。采用多种本领域技术人员已知的方法完成载体的鉴定和/或筛选。例如，最好通过杂交、存在于该载体上的标记基因编码的所谓“标记”基因功能的存在或缺乏、和/或特定序列的表达，鉴定含有特定基因或编码序列的载体。在第一种方法中，采用包含与相关序列同源的序列的探针，通过杂交(例如通过DNA-DNA杂交)检测载体中特定序列的存在。在第二种方法中，在存在于该载体上编码这些功能的特定基因引起的某一标记基因功能(诸如抗生素抗性、胸苷激酶活性等)存在或缺乏的基础上，鉴定和筛选该重组载体/宿主系统。在第三种方法中，通过检测该载体编码的特定基因产物鉴定载体。这类检测基于该基因产物的物理性质、免疫学性质或功能性质。

因此，本发明也提供一种载体，它如果是DNA，那么包含选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列，它如果是RNA，那么包含由选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列。

本发明还提供产生具有核酶的载体的方法，该载体得自野生型人免疫缺陷病毒，并只能够在允许所述载体复制的宿主细胞中复制。包含在该载体内或由该载体编码的核酶切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，如果有转录物的话也切割其转录物，但不切割该载体本身及其转录物。该方法包括获得载体并将一种核酸序列加入该载体中，该载体得自野生型人免疫缺陷病毒，并只能够在允许所述载体复制的宿主细胞中复制，该序列包含或编码一种核酶，后者的催化域切割野生型人免疫缺陷病毒的核酸，如果有转录物的话也切割其转录物，但不切割该载体本身及其转录物。在这样一种方法中，包含或编码野生型人免疫缺陷病毒U5序列的核苷酸序列可以从该载体上缺失，并且如果该载体是DNA，则用选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列取代，如果该载体是RNA，则用选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列取代。该载体最好在允许所述载体复制1次以上的宿主细胞中复制。

本发明也提供修饰载体的方法。该方法包括获得载体，并且如果该载体是DNA，将选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16DNA序列的一个核苷酸序列导入该载体中；如果该载体是RNA，将选自SEQ ID NO：2、3、4、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16一个核苷酸序列编码的核苷酸序列导入该载体中。

本发明还提供不用包装细胞系繁殖和选择性包装条件复制型载体的方法。该方法包括使该条件复制型载体与能够感染另一载体的细胞接触，另一载体的类型与该条件复制型载体相同，它由于复制能力方面为野生型而不同于条件复制型载体；随后使该细胞与另一载体接触；然后在有助于繁殖该条件复制型载体的条件下培养该细胞。

也提供分离和纯化的核酸分子，后者选自DNA分子和RNA分子，这些DNA分子包含选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列，而这些RNA分子包含选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列编码的一个核苷酸序列。

使用方法

为了进行病毒感染的预防处理和治疗处理，为了易于载体保持以及其它原因，最好将上述载体导入宿主细胞中。因此，本发明提供包含按照本发明载体的宿主细胞。宿主细胞的分离和/或这类细胞或在培养中由其得到的细胞系的保持已经成为常规实验并且是普通技术人员精通的实验。

具体地说，上述载体最好用于病毒感染的预防处理和治疗处理，最好诸如该感染来自野生型病毒，最好是野生型RNA病毒，甚至更优选来自野生型逆转录病毒，最佳是来自野生型HIV。

该方法包括使能够感染野生型病毒的宿主细胞与条件复制型载体接触，该载体只能够在允许该载体复制的宿主细胞中复制，该载体的存在、转录或翻译抑制病毒野生型毒株在宿主细胞中的复制。该载体最好复制1次以上，并包含至少一个核酸序列，与病毒野生型毒株、最好是与衍生该载体毒株相比，拥有该核酸序列(即存在、转录或翻译)赋予宿主细胞中的该载体选择性优势。

按照该方法，该核酸序列最好包含一种核苷酸序列，它包含或编码一种遗传抗病毒剂，后者不利地影响非所述载体的病毒的复制和/或表达。该遗传抗病毒剂希望选自反义分子、核酶和免疫原。该遗传抗病毒剂最好是核酶，其催化域最好在3’核苷酸NUH序列处切割(即尤其是GUC序列)。该核酶可选地至少部分由选自SEQ ID NO：3和SEQID NO：4的序列编码。希望该核酶在该病毒野生型毒株或其转录物区域中切割，但不在该载体或其转录物区域内切割。这最好是因为该病毒野生型毒株包含SEQ ID NO：1编码的序列，而该载体如果是DNA，则包含一个选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的核苷酸序列，该载体如果是RNA，则包含选自SEQ ID NO：2、5、6、14(其中至少一个N突变)、15和16的一个核苷酸序列编码的核苷酸序列。

也希望进行该方法，其中该载体包含至少一个核酸序列，与感染病毒野生型毒株(它最好是衍生该载体的病毒毒株)的细胞相比，拥有该核酸序列(即存在、转录或翻译)赋予感染该载体的宿主细胞选择性优势。在该方面，与相应于衍生该载体的病毒的病毒野生型毒株相比，载体包含至少一个赋予感染该病毒的宿主细胞选择性优势的核酸序列和至少一个赋予该载体选择性优势的核酸序列。

因此，最好进行这种方法，其中该核酸序列包含一种编码多种药物抗性的核苷酸序列。或者，诸如当待预防处理或治疗处理的病毒感染为逆转录病毒时，进行这样一种方法，其中该核酸序列包含突变蛋白酶编码核苷酸序列和突变逆转录酶的编码核苷酸序列。

该方法最好还包括给予宿主细胞选自细胞毒性药物、蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂的一种药剂(即除给予该载体外)。

因此，可以按照上述方法使用载体，不仅用于治疗处理病毒感染，而且用于保护潜在的宿主细胞免受病毒感染，该方法即预防处理病毒感染的方法或接种抗目的病毒(诸如RNA病毒，特别是逆转录病毒，诸如HIV)疫苗。该方法在宿主细胞与病毒野生型毒株接触之前，基本上抑制病毒野生型毒株的复制。在该方面，该载体可以包含或编码阻断超感染野生型病毒的蛋白质。该方法包括使该宿主细胞与上述条件复制型载体和“辅助表达载体”(即促进该“载体”在未受感染宿主中复制的病毒基因组)接触。该条件复制型载体包括选择性包装和/或繁殖的优势。此外，该载体例如可以含有提高细胞存活率、促进病毒生产、诱导细胞凋亡、促进蛋白生产和/或促进免疫功能和/或导向的序列。该“辅助表达载体”构建物是对该“载体”不能复制的能力进行互补的任何表达载体。这类辅助表达载体是常用的，并且是本领域技术人员易于构建的。该辅助表达载体可以或者象该载体一样包装入病毒粒子，或者不需要包装而进行表达。由于该“载体”具有选择性包括和/或繁殖的优势，因此该系统提供一种安全的方法，以达到病毒的高度复制，而没有减毒活病毒可以潜在引起的可能的致病作用。此外，该载体可以与非特异性佐剂混合，以提高免疫原性。这类佐剂是本领域技术人员已知的，包括(但不限于)弗氏完全佐剂或不完全佐剂、由细菌和分支杆菌细胞壁组分组成的乳液等。

当按照上述方法作为预防处理病毒感染使用载体时，该载体可以编码一种不由野生型病毒编码的蛋白抗原，诸如突变病毒蛋白或非病毒蛋白。因此，该载体编码的抗原可以例如来自细菌或来自癌细胞。此外，该“载体”也可以编码MHC基因，以适当地将抗原导向宿主免疫系统。因此，这类载体可以用来促进对多样化系列的潜在病原体和/在异常细胞中选择性表达的内源蛋白(例如肿瘤特异性抗原)的持久性的免疫应答。

此外，可以通过加入或省去允许细胞特异性载体复制和传播的特定遗传元件/因子(或者在该载体中，或者在辅助病毒表达构建物中)，将该“辅助病毒”(本文也称为“助手”)表达载体工程改造，以只在特定细胞类型(例如干细胞、专门抗原提呈细胞和肿瘤细胞)中表达。因此，该载体仍通过与辅助病毒构建物互补进行传播，但该传播是细胞特异性的，取决于某一遗传元件/因子是否加入该载体或辅助病毒表达构建物或省去。这可以单独使用，或与上述其它策略结合使用。

例如，可以设计条件复制型HIV载体以在巨噬细胞而不是T细胞中特异性复制。可能组成Tat缺陷型HIV的该载体(该载体编码另一些HIV蛋白，但它们因为缺乏Tat转录反式激活蛋白而不表达)，可以编码切割野生型HIV、但不切割条件复制型HIV RNA的核酶。该载体的辅助表达载体可以编码巨噬细胞特异性启动子表达的tat基因。因此，crHIV只能够在巨噬细胞中有条件复制，而不能在T细胞或其它细胞类型中复制。

或者，tat基因可以操作性地与肿瘤特异性启动子连接；因此，该crHIV然后只在肿瘤CD4细胞中复制，而不在正常CD4细胞中复制。遗传元件/因子也可以是该载体启动子序列的修饰物，使得它与该“辅助病毒”表达构建物一致，只在特定细胞类型中表达，而不在其它细胞类型中表达。

在另一实施方案中，可以修饰该辅助表达构建物或该载体构建物的囊膜蛋白(如果工程改造这类构建物使其含有囊膜蛋白)，使得该载体-病毒粒子特异性地感染某些细胞类型(例如肿瘤细胞)，而不能感染其它细胞类型(例如正常细胞)。在再一实施方案中，缺乏一个或几个关键复制因子的腺病毒可以通过使用一种辅助构建物进行互补，该辅助构建物提供连接肿瘤特异性启动子的这类因子。因此，互补腺病毒复制的因子只能在肿瘤细胞中表达，由此允许病毒在肿瘤细胞中复制(表达细胞杀伤所需的蛋白)，但不在正常细胞中复制。

因此，本发明也提供治疗癌症、特别是治疗T细胞白血病的方法。按照本发明“治疗癌症”包括给予宿主一种进一步修饰的本文提出的载体，以用于实现治疗反应。可以通过监测肿瘤生长的减弱和/或肿瘤消退，评价这样一种反应。“肿瘤生长”包括肿瘤大小的增加和/或肿瘤数的增加。“肿瘤消退”包括肿瘤质量的减小。

按照本发明的“癌”包括特征为异常细胞增殖和缺乏接触抑制的癌，它可以通过肿瘤形成证实。该术语包括局限在肿瘤中的癌以及不局限在肿瘤中的癌，例如由一个肿瘤通过侵入局部扩张或通过转移全身性扩张的那些癌细胞。理论上，任何类型的癌都可以作为按照本发明进行治疗的靶。然而，该癌最好是由病毒引起的。

最后，上述载体可以直接用于体内基因治疗。目前的基因治疗策略是失败的，因为它们不介导基因传递到大部分细胞中；只感染一定百分比的细胞。在关键是对整个肿瘤群体进行基因转导的抗肿瘤策略中，这是尤其重要的。通过与“助手”一起加入该“载体”，即刻转导的细胞将产生可以感染相邻细胞的病毒颗粒，并使得达到高的、可能完全转导的效率。在本发明的一个实施方案中，人逆转录病毒(可能是HIV或反转座子元件)可以与“助手”构建物一起传递到组织中(或体外细胞中)。即刻含有该载体和助手的细胞将产生病毒，并将该载体有条件地包装为病毒粒子。这些病毒粒子将能够介导高效率的相邻细胞的转导(由于细胞-细胞接触是转导细胞的最有效方法)。即刻转导的细胞可能死亡或不死亡，取决于该载体/助手组合是否导致溶胞感染。在反转座子的情况下，由于正常细胞或肿瘤细胞可能含有包衣壳为病毒粒子所需蛋白/因子，因此该助手可能不必含有结构蛋白。这样，该助手可能仅仅是(但不限于)激活反转座子包衣壳所需因子转录的反式激活蛋白。在HIV的情况下，将HIV基因组包衣壳为感染/转导细胞的子代病毒粒子可能(但不必)需要其它因子。

上述载体也可以用于反生物战和反化学战策略中。例如条件复制型载体可以传递到新近感染高度致病的病毒或细菌或化学试剂(例如毒素)的个体中。如前所述，载体可能干扰该致病病毒的复制。然而，该条件复制型载体也可以与辅助表达载体(“助手”)一起用于抗菌或抗化学药品策略中。

例如，条件复制型载体在“助手”允许其表达和繁殖后，可以分泌抗菌或抗毒素抗体。该“助手”可以(但不必)驱动关闭被细菌、细胞因子(对细菌感染应答)、抗生素(如同四环素诱导型启动子系统一样(Paulus等， J.Virol.， 70，62-67(1996))或化学药品(例如毒素本身)激活时允许其表达的诱导型启动子。因此，该条件复制型载体不仅可以在该“助手”的帮助下，对遭遇的病原体或毒素(该助手激活的结果)应答，选择性进行繁殖，而且分泌抗病原体或抗毒素抗体，抑制肿瘤抗原、病原体或化学药品(例如毒素)的致病作用。因此，可以将或者转录为mRNA和/或者转录为蛋白的任何蛋白、因子或遗传元件，与“助手”一起插入条件复制型载体中，以抑制致病反应，“助手”促进其选择性繁殖和表达(选择性是因为该助手的产物是条件型表达的(例如(但不限于)(a)诱导型启动子系统--肿瘤细胞中的因子激活助手因子的产生、表达助手因子的毒素应答序列或细胞因子应答启动子诱导助手因子的产生，(b)助手RNA/蛋白/因子在某些细胞中是选择性稳定化的，而在其它细胞中不是选择性稳定化的)，以及(c)影响辅助病毒蛋白生产、护送、导向、结构或其它生物功能的第三方基因的间接诱导)。这类策略可以用于转基因植物和动物中，以保护它们免受病原体的的侵害。同样，这类策略可以用于转基因系统中，以生产有价值的异源蛋白/因子。

按照本发明方法的另一实施方案中，可以开发出细胞系以筛选药物/因子，以测定例如该蛋白/因子的哪一部分对特定功能是重要的。可以产生一个载体，以在给定细胞系中表达诱变的目的蛋白。然而，通过例如插入沉默点突变，使编码该诱变蛋白的RNA对核酶产生抗性。然而，在该细胞系中抑制野生型蛋白的表达。也可以构建表达目的蛋白的核酶的载体，以表达突变测试蛋白。当将该载体转导到细胞中时，大多数编码正常蛋白的天然RNA被切割，而表达该突变测试蛋白。该方法可以与新近开发的传递和筛选技术一起使用，作为测定给定蛋白如何起作用和给定因子/药物如何与该蛋白相互作用的快速高效技术。

本发明方法和载体在体外也有许多用途。例如，载体可以用来确定病毒复制和核酶功能的某些细微差异。同样，含核酶的载体可以用作诊断工具，例如以评价病变细胞存在的突变或检测遗传漂变。关于本发明用途的上述讨论决不是全面性的。

本发明的益处

采用crHIV策略进行遗传治疗处理AIDS和其它病毒的优点相当多。例如，解决了将该载体导向感染HIV的细胞的问题。在体内将crHIV转染入受感染CD4+细胞后，该crHIV采用内源感染性HIV的囊膜蛋白包装为子代病毒粒子。因此，该crHIV RNA沿子代病毒粒子内和可被特定HIV毒株正常感染的受感染细胞类型内标记，产生非致病病毒粒子。这包括难以导向的细胞，诸如脑的小神经胶质细胞，后者为中枢神经系统HIV感染的主要贮主。由于crHIV载体不编码病毒蛋白，因此可能几乎没有与感染未受感染CD4+细胞的crHIV有关的毒性。此外，crHIV载体与野生型HIV竞争的结果，导致产生非致病颗粒，后者导致病毒荷载降低。由于crHIV颗粒也可以全身性传播(即与传染性HIV一样)，因此降低致病HIV-1的荷载不仅可以增加受感染个体的存活时间，而且可以降低向未受感染个体传染的速率。血液中致病HIV-1荷载的降低，在感染HIV的受孕个体中可能特别重要，因为crHIV的产生也可以减少HIV-1由受感染母亲传递到子宫中的胎儿。

可以用于将crHIV载体导入宿主细胞的质粒DNA/脂类混合物应该是稳定的，并且生产便宜，避开昂贵的体外策略。当然，因为本发明方法需要时也可以用于体外基因传递，因此它本质上是灵活的。无论如何，脂质体介导方法的可用性打开了治疗一般群体(用目前基因治疗策略行不通的某些群体)的可能性。也可以工程改造crHIV载体，以含有几种核酶，后者可以制成导向HIV基因组的不同靶。这就降低了传染性HIV可能突变并逃避抗HIV核酶作用的可能性。此外，具有条件复制能力的病毒策略可以用来治疗其它病毒感染，尤其是病毒周转高的那些病毒感染。

crHIV特别有用的特征是，它们可以用来转录后表达遗传抗病毒剂，例如核酶。因此，用crHIV载体感染未受感染细胞产生的毒性低，因为在缺乏Tat蛋白时，几乎没有由HIV长末端重复(LTR)启动子发生的表达。只在通过用野生型HIV互补提供Tat蛋白时，crHIV表达及其随后的抗病毒活性的水平高。因此，设计的crHIV载体不保护细胞免受HIV感染，而是通过选择性积累非致病crHIV颗粒，减少完整野生型HIV病毒的含量。

尽管本发明的操作和功能不试图结合特定理论，但如在以下实施例中所证实的，相信因为以下两个有用的性质，核酶可以用来向crHIV基因组提供选择性优势：(1)它们的特异性程度高，以及(2)它们具有相当的效率，取决于它们与靶RNA共定位的能力(Cech， Science， 236，1532-1539(1987))。通过核酶与含有XUY位点的互补靶序列特异性的杂交，提供核酶的特异性。因为仅当核酶与靶RNA有效地共定位时，它们高效地切割靶RNA，因此核酶是相当有效的。在混合HIV/crHIV感染中，由于HIV RNA基因组在包装到子代病毒粒子中之前二聚化，因此必定发生含核酶的crHIV RNA与野生型HIV RNA的共定位。病毒蛋白生产所需的野生型HIV RNA非基因组物质的切割效率可以低于基因组野生型HIV RNA的切割效率，因为非基因组HIV RNA不二聚化。在本文所述实验中发现，赋予crHIV的选择性优势是由于crHIV选择性包装到病毒颗粒中引起的。这些结果表明，胞内最有效的切割发生在二聚化期间，导致野生型HIV被宿主核酸酶选择性地破坏。这允许crHIV RNA优先包装到病毒颗粒中。

用于HIV治疗的crHIV载体应用不仅可以涉及crHIV的基因组筛选，而且可以涉及产生crHIV颗粒的细胞的细胞筛选。否则，产生野生型HIV的细胞以高于产生crHIV颗粒的细胞的选择性优势产生野生型HIV颗粒，并且快速地占优势。通过将赋予表达crHIV的细胞(在有药物的情况下)高于表达野生型HIV细胞存活优势的一个基因插入crHIV基因组中(例如多种药物抗性基因)，可以赋予表达crHIV细胞的选择性优势。在这些条件下，表达野生型HIV的细胞逐渐死亡，但仍产生一些野生型HIV，同时选择性地产生crHIV的表达crHIV的细胞存活。含crHIV的细胞感染残余的野生型HIV，会导致进一步产生含crHIV的病毒颗粒。因此，随着感染crHIV基因组的的CD4+细胞的累积，可能产生病毒基因组漂变，由此宿主中的病毒平衡，由致病野生型HIV改变为非致病crHIV基因组。一旦HIV基因组的平衡选择性地由野生型HIV漂变为crHIV，这样一种策略可以导致野生型HIV的清除。由于crHIV只能在野生型HIV助手基因组的存在下复制，因此病毒复制实际上停止。因此，在这类突变限制条件下，可能工程改造crHIV载体，该载体不仅降低HIV病毒的荷载，而且从感染HIV的宿主中清除该病毒。

给药方法

按照本发明，按前述方法将载体导入需要基因治疗病毒感染的宿主细胞中。导入方法包括使能够感染病毒的宿主与按照本发明的载体接触。这种接触最好包括将该载体导入宿主细胞中的任何方法；该方法不取决于任何导入方法，也不是如此解释。导入方法是本领域技术人员众所周知的，在本文中也进行了例举。

因此，可以例如或者体外(例如在基因治疗的体外类型方法中)或者体内进行导入，这包括采用电穿孔、转化、转导、接合或三亲本交配、转染、感染、与阳离子脂类膜融合、用涂有DNA的微弹高速轰击、与磷酸钙-DNA沉淀物一起保温、直接微注射到单个细胞中等。也可利用其它方法，它们是本领域技术人员已知的。

然而，最好通过阳离子脂类(例如脂质体)导入该载体或核酶。这类脂质体是市售的(例如Life Technologies，Gibco BRL，Gaithersburg，MD供应的Lipofectin^、Lipofectamine^TM等)。此外，体内转移能力高和/或毒性较低的脂质体(例如在PCT专利申请WO 95/21259中所综述的)可以用于本发明。对于脂质体给药，可以遵循在PCT专利申请WO93/23569中鉴定的建议。一般来说，关于这种给药，该制剂于37℃，在8小时内被大多数淋巴细胞吸收，静脉注射后1小时，在脾中检测到50％以上的注射剂量。同样，其它传递载体包括水凝胶和控释聚合物。

该载体导入宿主细胞的形式可以改变，部分取决于该载体是体外导入还是体内导入。例如，该核酸可以是闭环的、带切口的或是线性化的，取决于该载体是否在基因组外保持(即作为自主复制载体)、作为前病毒或前噬菌体整合、瞬时转染、利用复制缺陷型或条件复制型病毒瞬时感染，或是通过双或单交叉重组事件稳定导入该宿主基因组中。

在本发明的载体在导入宿主之前，可以配制为各种组合物，以用于治疗处理和预防处理方法中。具体地说，该载体可以通过与合适的药学上可接受的载体或稀释剂混合，制成药物组合物，并且可以进行配制，以适用于或者人类或者兽医应用。

因此，用于本发明方法的组合物可以包括一种或多种上述载体，最好与药学上可接受的载体混合。药学上可接受的载体是本领域技术人员众所周知的，合适的给药方法也是众所周知的。该载体的选择将部分取决于特定的载体以及用来该组合物给药的特定方法。本领域技术人员也理解，可以利用组合物给药的各种途径，尽管可以使用一种以上的途径给药，但可以提供一种比其它途径更直接、更有效反应的特定途径。因此，有种类繁多的本发明组合物的合适制剂。

单独或与其它抗病毒化合物混合的本发明载体组成的组合物可以制成适于胃肠外给药、特别是腹膜注射的制剂。这样一种制剂可以包括含水和非水等渗无菌注射液，该注射液可以含有抗氧剂、缓冲液、抑菌剂和提供制剂与受体血液等渗的溶质和含水和非水无菌悬液，后者可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。制剂可以以单位剂量存在或多剂量封闭容器(诸如安瓿和西林瓶)存在，可以在冷冻干燥(冻干)条件下贮存，使用前只需要加入无菌液体载体(例如水)即可立刻注射。可以由本文所述的无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备临时注射液和悬液。

适用于口服的制剂可以包括液体溶液剂(诸如溶于稀释剂的有效量的该化合物，稀释剂诸如水、盐水或果汁)；胶囊剂、小药囊或片剂，每种制剂都含有预定量的作为固体或颗粒的活性组分；水性液体中的溶液或悬液；和水包油型乳液或油包水型乳液。片剂形式可以包括一种或多种乳糖、甘露醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、阿拉伯胶、明胶、胶体二氧化硅、croscarmellose sodium、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、色料、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂和药学上相容的载体。

也可以制备适用于通过吸入给药的气溶胶制剂。可以将气溶胶制剂置于加压可接受的抛射剂(诸如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。

同样，适于口服的制剂可以包括在调味剂中可以包含活性组分的糖锭形式，调味剂通常为蔗糖和阿拉伯胶和西黄蓍胶；在惰性碱(诸如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶)中包含该活性组分的锭剂；和在合适液体载体中包含该活性组分的漱口药；以及乳膏、乳液、凝胶等，它们除含有该活性组分外，还含诸如本领域已知的载体。

适用于局部用药的制剂可以为乳膏、软膏或洗剂形式。

用于直肠给药的制剂可以以具有合适碱、包含例如可可油或水杨酸盐的栓剂出现。适用于阴道给药的制剂可以以阴道栓、塞子、乳膏、凝胶、糊剂、泡沫剂或喷雾配方出现，它们除含有该活性组分外，还含有本领域已知的这类合适载体。同样，该活性组分可以与润滑剂混合，作为避孕套上的涂层。

在本发明正文中，给予动物(特别是人类)的剂量应该足以在合理的时间框内，实现受感染个体的治疗反应。由用于治疗的特定载体的效力、病情的严重性以及受感染个体的体重和年龄决定该剂量。由可能伴随所用特定载体的使用产生的任何不利副作用的存在决定该剂量的大小。通常最好是无论何时都可能将不利副作用保持在最小限度。

该剂量可以为单位剂量形式，诸如片剂或胶囊剂。本文所用的术语“单位剂量形式”是指物理上分离的适用作人和动物对象的单元剂量单位，每个单位含有预定量的单独的载体或与其它抗病毒剂混合的载体，以与药学上可接受的稀释剂、载体或溶媒一起足以产生所需作用的量计算。本发明单位剂量形式的规格取决于所用的一种或多种特定化合物和待达到的效果以及与宿主中每种化合物有关的药效学。给药剂量应该是“抗病毒有效量”或在各个病人中达到“有效水平”的必需量。

由于“有效水平”用作剂量的推荐终点，因此实际剂量和时间表可以改变，取决于药物动力学、药物分布和代谢的个体间差异。该“有效水平”可以定义为例如该病人中相当于一种或多种按照本发明载体浓度的所需血液水平或组织水平，该有效水平在预测化学化合物临床抗病毒活性的测定中抑制诸如HIV之类的病毒。当本发明组合物与叠氮胸苷或其它已知抗病毒化合物或其组合物混合使用时，本发明化合物的“有效水平”也可以改变。

本领域技术人员可以容易地确定待用组合物准确配方的合适给药剂量、给药时间表和给药方法，以便在单个病人中达到所需“有效水平”。本领域技术人员也可以通过合适的病人样品(例如血液和/或组织)的直接(例如分析化学分析)或间接(例如病毒感染的代替指标，诸如用于治疗AIDS或AIDS样疾病的p24或逆转录酶)分析，容易地确定和使用本发明化合物“有效水平”的合适指标。

另外，关于确定病人中治疗AIDS或AIDS样疾病的有效水平，特别是可利用合适的动物模型，并已经广泛地应用了用于评价各种基因治疗方案对HIV的体内效力的合适动物模式(Saver等(1993b)，见上述)。这些模型包括小鼠、猴子和猫。即使这些动物不是天然对HIV疾病敏感，但用人外周血单核细胞(PBMC)、淋巴结或胎肝/胸腺组织重建的组织嵌合小鼠模型(例如SCID、bg/nu/xid、切除骨髓的BALB/c)可以感染HIV，并将其用作HIV发病机理和基因治疗的模型。同样，可以使用猿猴免疫缺陷病毒(SIV)/猴模型，猫免疫缺陷病毒(FIV)/猫模型也可以使用。

一般来说，足以达到的给予核酶(或载体)组织浓度的载体量最好大约为50-300mg/kg体重/天，尤其是大约100-200mg/kg体重/天。在某些应用中，例如局部应用、眼部应用或阴道应用，最好是每天多个剂量。此外，剂量的数量取决于传递方法和使用的特定载体。

在某些病毒感染个体的治疗中，可能最好利用“大剂量”制度，其中给予大剂量的载体，给与允许该化合物起作用的时间，然后将合适的试剂给予该个体，以灭活活性化合物。在本发明方法中，该治疗(即该载体与待治疗病毒竞争复制)必定是受限制的。换句话说，当例如HIV的水平下降时，依赖于HIV产生病毒粒子的载体水平也将下降。

药物组合物当用于治疗处理AIDS时，可以结合按照本发明的载体含有其它药物。这些其它药物可以以其传统方式使用(即作为治疗HIV感染的药剂)，以及更具体地说，以体内选择crHIV病毒的方法使用。本文所述的这种选择将促进条件复制型HIV的传播，并允许条件复制型HIV更有效地与野生型HIV竞争，这必然限制野生型HIV的致病性。具体地说，预期使用一种抗逆转录病毒剂，诸如最好是叠氮胸苷。除前述那些药物外可以使用的这些其它药物的其它代表实例包括抗病毒化合物、免疫调节剂、免疫刺激物、抗生素和可以用来治疗AIDS的其它药剂和治疗制度(包括作为选择性医药认识的那些药剂和治疗制度)。抗病毒化合物包括(但不限于)ddI、ddC、gancyclovir、氟化二脱氧核苷酸、非核苷酸类似化合物，诸如nevirapine(Shih等，PANS， 88，9878-9882(1991))；TIBO衍生物，诸如R82913(White等，Antiviral Research， 16，257-266(1991))和BI-RJ-70(Shih等， Am.J.Med.，90(增补本4A)，8S-17S(1991))。免疫调节剂和免疫刺激物包括(但不限于)各种白介素、CD4、细胞因子、抗体制剂、输血制品和细胞转输。抗生素包括(但不限于)抗真菌剂、抗细菌剂和抗卡氏肺囊虫剂。

将抑制病毒化合物与其它抗逆转录病毒剂、特别是已知的RT抑制剂(诸如ddC、叠氮胸苷、ddI、ddA)或作用于其它HIV蛋白的其它抑制剂(诸如抗TAT剂)一起给药，一般抑制病毒生活周期的大多数或全部复制阶段。ddC和叠氮胸苷用于AIDS或ARC病人的剂量已经是公布的。ddC的病毒抑制范围一般为0.05-1.0μM。在大多数病人中，大约0.005-0.25mg/kg体重的范围是抑制病毒的。口服的剂量范围稍宽些，例如为0.001-0.25mg/kg，以2小时、4小时、6小时、8小时和12小时等间隔给予一个或多个剂量。最好每8小时给予0.01mg/kg体重的ddC。当在混合疗法中给予时，例如其它抗病毒剂可以在给予按照本发明载体的同时给药，或可以根据需要错开服药时间。该载体也可以混入组合物中。每种药物混合使用时的剂量可以低于分别单独使用时的剂量。

                        实施例

在以下实施例的正文中进一步描述本发明化合物和方法。这些实施例用来进一步说明本发明，而不是限制本发明的范围。

实施例1

该实施例描述按照本发明的有条件复制能力的载体的构建。具体地说，该实施例描述基于HIV的条件复制型载体(即crHIV载体)的构建。

HIV-1发病机理的一个最突出的方面是产生该病毒的遗传变异体。体内迅速产生HIV变异体表明，可以认为该病毒在达尔文氏遗传模式化的框架内(参见例如Coffin， Curr.Top.Microbiol.Immuniol.， 176，143-164(1992)和Coffin， Science， 267，483-489(1995))。这些变异体是由HIV-1逆转录酶分子不精确造成的，这在由病毒基因组RNA新转录的前病毒中产生突变。因此，在无显著瓶颈和许多复制周期的体内条件下，发生相当程度的遗传变异，产生许多病毒变异体。另外，由于在这类非限制条件下野生型HIV具有最高选择优势，因此野生型HIV仍占优势。然而，在抑制剂(例如叠氮胸苷)存在下，将选择被赋予高于野生型毒株选择优势的病毒变异体，它随后占优势(Coffin(1992)和(1995)，见上述)。基于这一点，本发明提供一种条件复制型病毒载体策略，它提供选择优势高于致病野生型HIV-1的非致病HIV-1基因组。

这些非致病条件复制型HIV(crHIV)载体是缺陷型HIV，它只在感染野生型HIV的细胞中进行复制和包装。crHIV基因组与致病野生型HIV病毒竞争，并降低致病野生型HIV的病毒荷载。降低受感染宿主中野生型HIV病毒荷载的作用应该导致寿命的延长。它也应该降低受感染宿主将野生型HIV传染未受感染个体的能力。为了使crHIV成功地与野生型HIV-1竞争，两个因素似乎是重要的：(1)crHIV基因组的选择优势高于野生型HIV基因组，以及(2)表达crHIV的细胞的选择优势高于表达野生型HIV的细胞(即与表达野生型HIV的细胞相比，表达crHIV细胞产生crHIV病毒粒子的选择性优势)。

由于crHIV载体含有RNA表达、二聚化和包装所需的序列，但不表达功能性(即野生型)HIV-1蛋白，因此crHIV载体有条件地复制。通过插入在野生型HIV基因组U5区内切割、但不切割crHIV U5 RNA的核酶盒，赋予crHIV载体选择性优势。

因为crHIV RNA的U5区已经通过保守碱基置换(存在于其它HIV毒株的碱基置换)而进行修饰，以防止核酶有效地结合并切割这些位点，因此存在于载体的核酶不切割该crHIV RNA。此外，因为crHIV不编码相信引起CD4+细胞死亡的蛋白，因此crHIV为非致病的。当感染HIV的细胞(已经转染该crHIV载体)被激活时，这些细胞变得能够互补crHIV基因组的缺陷，导致产生crHIV子代病毒粒子。

一般来说，由全长传染性HIV克隆pNL4-3构建crHIV基因组(Adachi等(1986)，见上述)。采用普通技术人员熟知的并已经在本领域中描述的方法，例如Maniatis等， 分子克隆：实验手册(Molecular Cloing：A Laboratory Manual)，第2版，(冷泉港实验室，NY(1982))，进行所有克隆反应和DNA、RNA和蛋白操作。用于这些反应的酶和试剂得自市场供应商(例如New England Biolabs，Inc.，Beverly，MA；Clontech，Palo Alto，CA；和Boehringer Mannheim，Inc.，Indianapolis，IN)并按照生产商的建议使用。此外，采用通常已知技术和先前已经描述的技术(例如Dropulic等(1992)，见上述；和Dropulic等(1993)，见上述)，进行载体保持和繁殖。

用酶Pst I(它在gag中大约在转录起始起+1000的位置酶切)和XhoI(它在nef中大约在转录起始起+8400的位置酶切)酶切pNL4-3，并插入含有便利限制位点的多接头。将含有rev应答元件(RRE)的0.86kbBgl II至Bam HI的片段克隆到多接头中存在的Bam HI位点。这些操作导致HIV野生型基因组从gag编码区内至U3编码区内的缺失(即由此也缺失nef基因)。尽管该载体能够产生缩短的gag转录物，但该载体不产生全长的功能Gag蛋白。然而，由于按照本发明野生型Gag功能是不必要的，因此gag序列可以突变，以防止翻译Gag蛋白。

将本文所述的含有单个或多个核酶的核酶盒插入该Bam HI位点下游的Sal I位点中。为了完成这一点，合成编码核酶序列的互补脱氧寡核苷酸，将其退火，然后克隆到该Sal I位点。用来构建crHIV载体的核酶为锤头型核酶。这些核酶含有由22个碱基对组成的催化域和每个由9个碱基对组成的杂交域。这些核酶或者导向U5 RNA序列的+115位点，或者导向其+133位点(即相当于转录起始下游的碱基对数)。导向+115位点和+113位点的核酶的杂交域和催化域(加下线)如下：

CACACAACACTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACGGGCACA(“+115核酶”)[SEQ ID NO：3]

ATCTCTAGTCTGATGAGGCCGAAAGGCCGAAACCAGAGTC(“+113核酶”)[SEQ ID NO：4]

该核酶盒由或者单、双或者三核酶串联组成。含有或者单核酶(即“crHIV-1.1”载体，图1B)或三核酶(即“crHIV-1.111载体，图1E)的载体导向该U5 HIV RNA的同一位点，即+115位点。含有双核酶的载体或者导向同一位点即+115位点(即“crHIV-1.11”载体，图1C)，或者导向该U5 HIV RNA+115位点和+133位点的不同位点；crHIV-1.12(即“crHIV-1.12”载体，图1D)。本文在种属上将这些载体称为“crHIV”载体。

为了完成这些载体的构建，通过突变锤头型核酶在该crHIV基因组的U5区内的一个识别位点，赋予crHIV载体对核酶酶切的抗性(即以它们作为RNA的显示物)。为了完成这一点，含有图2所述碱基置换(SEQ ID NO：2]的双链寡核苷酸(即AAGCTTGCCTTGAGTGCTCAAAGTAGTGTGTGCCCACCTGTTGTGTGACTCTGGCAGCTAGAGATCCCACAGACCCTTTTAGTCAGTGTGGAAAATCTCTAGCAGTGGCGCC[SEQ ID NO：13]被用来将修饰位点导入该载体。具体地说，将碱基置换工程改造到该核酶在115碱基对和133碱基对处的杂交和酶切位点中。正如图所示，特别是将这些突变导入113、114、132、134和142碱基对处。可以修饰这些位点，以包含任何突变(即GTGTGCCCNNCTGTTGTGTGACTCTGGNANCTAGAGANC，其中N可以是任何核苷酸[SEQ ID NO：14]。然而，最好突变这些序列，使得在+113位点例如G置换为A(即使得该序列包含GTGTGCCCATCTGTTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGATC[SEQ ID NO：15]，在+114位点U(即根据该DNA序列为T)置换为C[SEQ ID NO：5]，在+132位点U(即根据该DNA序列为T)置换为C[SEQ ID NO：6]，在+134位点A置换为G(即使得该序列包含GTGTGCCCGTCTGTTGTGTGACTCTGGTAGCTAGAGATC[SEQ ID NO：16])以及在+142位点U(即根据该DNA序列为T)置换为A，这些突变可以或者单独制备或者组合制备。特别是，在缺乏其它U5突变的情况下，crHIV U5 RNA中的+114位点[SEQ ID NO：5]和/或+132位点[SEQ ID NO：6]的U(即根据该DNA序列为T)置换为C，防止核酶的切割(Uhlenbeck(1987)，见上述)。这些插入的碱基置换存在于HIV的其它各种毒株中(Myers等，HIVSequence Database，Los Alamos Nat.Lab.(1994))，这表明这些置换不降低该HIV基因组的复制能力。

本文提出的方法可以用来构建其它条件复制型载体，例如由不同病毒基因组(例如不同RNA病毒)组成的载体，或由不同遗传抗病毒剂组成的载体。另外，可以进一步修饰条件复制型载体，以赋予导入该载体的宿主细胞的选择性优势高于含有野生型病毒的细胞。例如，可以修饰这样一种载体以进一步编码多种药物抗性或一种突变蛋白酶或逆转录酶。

实施例2

该实施例描述条件复制型载体、特别是crHIV载体对核酶酶切的抗性。

为了证实crHIV载体对核酶酶切的抗性，进行体外转录。为了完成这一点，将核酶序列克隆入pBluescript KSII(Stratagene，La Jolla，CA)的Xho I位点。同样从该crHIV载体切下含有该突变crHIV U5区的0.21千碱基对(kb)的Bal II片段，将其插入pBluescript KSII的Bam HI位点。在体外转录之前，将所得的修饰pBluescript KSII载体用Bss HII线性化。表达野生型HIV U5 RNA的相似载体(在Myers等(1994)中进行了描述，见上述)用作对照。在体外转录之前，用Eco RI将其线性化。

如前述(Dropulic等(1992)，见上述)通过这些载体的体外转录，产生放射性标记的U5 HIV RNA和核酶RNA。放射性标记的转录物在含有40mM Tris-HCl pH 7.5、6mM MgCl₂、2mM亚精胺和10mMNaCl的1×转录缓冲液中一起保温(靶与核酶的摩尔比为1∶2)。在加入含有95％甲酰胺、20mM EDTA、0.05％溴酚蓝和0.05％二甲苯靛FF之前，将样品加热至65℃，然后冷却至37℃5分钟。然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分辨产物，并通过放射自显影进行检测。

当野生型U5-HIV RNA与含有+115位点单核酶转录物一起保温时，容易观察到切割。这种切割产生产物PI和P2。当野生型HIV RNA与含有导向或者相同位点或者不同位点双核酶的RNA一起保温时，也可以见到切割。当含导向两个不同位点核酶的转录物与野生型HIVRNA一起保温时，产生产物P1、P2和P3。P3由+133位点的切割产生。

相比之下，当含修饰U5的crHIV RNA或者与导向+115位点的单核酶，或者与导向+115位点或+133位点的双核酶一起保温，检测不到切割产物。因此，这些结果证实，crHIV U5 RNA抗核酶切割，而野生型HIV-U5 RNA被抗U5核酶切割。此外，这些结果证实，与病毒野生型毒株相比，当条件复制型载体导入宿主细胞时，本发明方法可以用来赋予条件复制型载体(包括非crHIV载体的载体)选择性复制的优势。

实施例3

该实施例描述含核酶的条件复制型载体在胞内切割野生型病毒RNA的能力。具体地说，该实施例描述crHIV载体在胞内切割野生型HIV RNA的能力。

通过将基因组共转染到Jurkat细胞中，测试crHIV载体介导的抑制野生型HIV的效力。通过在0pti-MEN培养基(Life Technologies，Gibco BRL，Gaitherburg，MD)中洗涤大约106 Jurkat细胞，然后用大约0.6μg野生型HIV RNA(即pNL4-3)和大约1.8μg crHIV DNA共转染细胞，进行转染。用摩尔比大约为1∶3的野生型HIV与crHIV前病毒以确保转染野生型HIV的所有细胞也都含有crHIV前病毒。DNA在细胞转染试剂溶液(Life Technologies)中混合30分钟，然后与Jurkat细胞一起保温大约3-6小时，此后加入含有10％胎牛血清(FBS)的完全RPMI1640培养基。如前述(Dropulic等(1992)，见上述)，每2-4天收获含病毒的上清液，通过细胞上清液中的逆转录酶活性分析病毒水平。

crHIV基因组对野生型HIV复制的作用示于图3中。当野生型HIV与crHIV-1.1共转染时，相对于共转染野生型HIV和对照病毒的细胞(图3，实心方框)，病毒生长延迟(图3，空心方框)，但不抑制病毒生长。由于抗U5核酶在共定位条件下(例如Dropulic等(1992)，见上述)可以抑制体内HIV复制，因此所见的病毒生长可能是以下原因之一：(a)优先将野生型HIV RNA包装到子代病毒粒子中，(b)抗核酶切割的野生型HIV RNA的产生，或(c)crHIV RNA中非功能性核酶的积累。

通过共转染野生型HIV与含有双核酶的crHIV载体，测试“逃逸”病毒生长的本质。如果优先包装野生型HIV是病毒生长的原因，那么含有双核酶crHIV的培养物应该具有与含有单核酶crHIV培养物相似的生长动力学。然而，如果病毒生长由变为抗核酶作用的野生型HIVRNA所产生(即由于病毒逆转录酶不精确)，那么含有crHIV-1.12(即导向两个病毒位点)的培养物的病毒生长动力学应该表现出比含有crHIV-1.11(即导向单个病毒位点)的培养物更延迟。或者，如果如果见到在含有不同含双核酶crHIV的培养物中病毒生长延迟相当，那么启示一定比例的单个表达的核酶在体内不起作用。

如图3中所见，含有crHIV-1.11(图3，空心打叉方框)或crHIV-1.12(图3，打点方框)的培养物表现出病毒生长开始比含有单个转录核酶的crHIV-1.1(图3，空心方框)延迟。然而，在crHIV-1.11和crHIV-1.12之间病毒生长开始的延迟是相似的，表明第三种可能性的正确性，即单个转录核酶切割靶RNA的动力学效率低于双核酶的效率。这启示，由于共转染实验是以过量摩尔的含核酶crHIV基因组进行的，因此一定比例的胞内转录核酶可以形成非功能性的、可能错误折叠的构象。

探测多核酶通过提供功能性核酶与野生型HIV RNA联合的更大可能性解除该动力学限制的能力。关于这些实验，将Jurkat细胞用野生型HIV和crHIV-1.111共转染，crHIV-1.111含有导向+115位点的三核酶。正如图3中所见(打点方框)，甚至培养22天后，使用三核酶没有证据表明病毒生长。鉴于正常初级T细胞通常在感染HIV后不久(例如大约1周)死亡，因此这些结果特别重要。

此外，这些结果证实，含核酶的条件复制型载体(诸如crHIV载体)，特别是含多核酶的载体可以用来在胞内与野生型病毒基因组(诸如HIV)竞争。

实施例4

该实施例描述支持含核酶的条件复制型载体，特别是crHIV载体在胞内切割野生型病毒RNA能力的机制的研究。

关于这些实验，如本文所述，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检查来自野生型HIV和crHIV-1.111共转染培养物的细胞上清液RNA。使用图5A-C中所述的引物进行RT-PCR。即使用引物R1和R2检测核酶RNA，使用引物V1和V3检测野生型HIV RNA，使用引物V2和V3检测crHIV RNA。引物R1(TGTGACGTCGACCACACAACACTGATG[SEQ ID NO：7]和R2(TGTGACGTCGACTCTAGATGTGCCCGTTTCGGC[SEQ ID NO：8]每种包含一个Sal I限制位点，通过与该核酶杂交序列结合，扩增抗U5核酶RNA。在crHIV-1.111表达细胞中，见到单核酶、双核酶和三核酶扩增产物。引物VI(GGTTAAGCTTGAATTAGCCCTTCCAGTCCCC[SEQ ID NO：9]和V2(GGTTGGATCCGGGTGGCAAGTGGTCAAAAAG[SEQ ID NO：10]每种包含Bam HI或Hin dIII限制位点，并扩增野生型HIV RNA。V3(CGGATCCACGCGTGTCGACGAGCTCCCATGGTGATCAG[SEQ ID NO：11]引物与上述V1引物一起包含Bam HI和其它限制位点。该引物组由crHIV特异性多接头序列扩增crHIV RNA。

为了进行RT-PCR，采用Trizol^TM(Life Techologies)分离病毒粒子和胞内RNA。由微量离心的细胞沉淀直接分离胞内病毒RNA。从首先通过以12,000×g微量离心5分钟清除细胞和沉淀的培养物上清液中分离病毒粒子RNA。将Trizol^TM加入无细胞上清液中，在加入氯仿进行相分离之前，将混合物保温5分钟。将水相转移至新试管中，利用糖原用异丙醇沉淀该RNA。重建RNA沉淀后，逆转录这些病毒RNA，然后使用放射性标记的引物通过PCR进行扩增。

于42℃，在含有50mM Tris-HCl pH 8.3、75mM KCl、3mMMgCl₂、5mM DTT、1mM dNTPs和20单位(U)RNA酶抑制剂的第一链缓冲液中，加入25U MuLV逆转录酶，进行1小时逆转录。完成逆转录后，将逆转录酶于65℃加热灭活10分钟。然后将整个混合物直接加入PCR缓冲液中，以组成含有终浓度为10mM Tris-HCl pH8.3、50mM KCl和1.5mM MgCl₂的混合物。使用2.5U Taq酶，将该混合物扩增30个周期。然后通过变性PAGE分辨放射性标记的PCR产物，并通过放射自显影进行检测。

crHIV-1.111核酶RNA存在于共转染野生型HIV-1和crHIV-1.111前病毒基因组后20多天的细胞上清液中。通过单核酶、双核酶和三核酶RNA PCR产物的存在，证明这一点。相比之下，在转染对照野生型HIV的培养物中，没有见到这类产物。在此期间，细胞看来是正常的，没有crHIV诱导的细胞毒性的明显迹象。这证明，即使没有观察到逆转录酶活性，crHIV也包装到病毒颗粒中。此外，这表明crHIV可以由HIV基因功能在胞内互补。

因此，这些结果表明，crHIV通过抑制野生型HIV的传播，抑制野生型HIV的复制。结果进一步表明，例如其它病毒载体的其它条件复制型载体和/或含有其它遗传抗病毒剂的载体同样可以用来抑制野生型病毒的复制和传播。

实施例5

该实施例描述支持含核酶的条件复制型载体，特别是crHIV载体在胞内切割野生型病毒RNA能力的机制的进一步研究。

一个可能的机制是，野生型HIV RNA和crHIV RNA都可以包装到子代病毒粒子中，由于核酶和靶RNA的共定位，在这小病毒体积中发生有效的切割。或者，因为在胞内而不是在HIV病毒粒子内野生型HIV RNA的切割占优势，因此可能发生选择性地将crHIV RNA包装到子代病毒粒子中。本文探究这些机制。

通过与病毒粒子与细胞有关的病毒RNA的RT-PCR，在单独转染野生型HIV或共转染野生型HIV和crHIV-1.111的细胞培养物中检测crHIV-1.111抑制野生型HIV传播的方法。crHIV-1.111仅存在于共转染后产生的子代病毒粒子。相比之下，转染对照野生型HIV的培养物产生的病毒粒子仅含有野生型HIV RNA。在共转染的培养物中，证明在胞内同时存在野生型HIV RNA和crHIV RNA。因此，尽管在胞内既合成野生型HIV RNA，也合成crHIV RNA，但选择性地将crHIVRNA包装到子代病毒粒子中。这启示，crHIV-1.111通过在包衣壳之前选择性地切割野生型HIV基因组RNA，同时允许某些亚基因组野生型RNA翻译为生产病毒的蛋白，抑制野生型HIV的传播。

为了测试野生型基因组RNA是否被crHIV RNA选择性地切割，通过Northern杂交检测存在于共转染后大约20天获得的Jurkat细胞培养物中存在的胞内RNA类型。由pNL4-3U5区的0.21kb Bgl II片段分离图5所示的用于Northern印迹分析的探针。

转染野生型HIV的培养物表达所有野生型HIV RNA种类，即基因组和亚基因组RNA种类。相比之下，共转染crHIV-1.111的培养物不表达显著量的野生型HIV基因组(9.7kb)RNA。在共转染培养物中中观察到低分子量的RNA(反映野生型HIV亚基因组RNA的存在)。这些样品中不清晰的HIV RNA启示，这些低分子量RNA中可能存在某些降解的基因组HIV RNA。相比之下，来自对照野生型HIV细胞的不清晰的野生型HIV RNA是由于在HIV感染晚期观察到的由显著CPE发生的RNA降解。

因此，这些结果证明，野生型HIV基因组RNA在含有野生型HIV和crHIV-1.111基因组的细胞中被选择性地切割和降解，允许选择性地将crHIV RNA包装到病毒粒子中。另外，这些结果表明，该方法可能同样用于其它病毒，特别是用于其它RNA病毒。

实施例6

该实施例描述含核酶的条件复制型载体，特别是crHIV载体在野生型辅助病毒存在下，经历完整的病毒复制周期能力的研究。

为了证实crHIV基因组在辅助野生型HIV基因组存在下经历完整的病毒复制周期，在几种条件下检测含crHIV基因组的病毒颗粒的产生。具体地说，首先在激活的ACH2细胞(AIDS试剂参比程序，Rockville，Maryland)中检测含crHIV基因组的病毒颗粒的产生。这些细胞包含潜伏感染HIV-1的细胞系。下一步，检测得自这些培养物的任何crHIV颗粒感染未受感染Jurkat细胞和产生crHIV DNA的能力。

关于这些实验，用大约2.5μg载体DNA转染大约10⁶ACH2细胞。在转染后大约24小时，用50nM 12-O-肉豆蔻酰佛波醇13-乙酸酯(TPA)刺激细胞。转染后大约72小时，从细胞上清液中分离RNA。采用实施例4所述R1和R2引物进行RT-PCR。在转染crHIV-1.11后，但不是在转染pGEM 3Z对照质粒(Promega，Madison，WI)后激活的ACH2细胞产生的病毒粒子中检测到crHIV核酶RNA。因此，crHIV载体转染到受感染CD4+细胞中导致含有crHIV RNA的病毒颗粒的产生。

下一步，检测得自这些培养物的crHIV病毒粒子感染未受感染的Jurkat细胞并产生crHIV前病毒的能力。通过用Trizol^TM分离细胞DNA、用Eco RI酶切该DNA，然后使用实施例4所述R1和R2引物通过PCR扩增核酶RNA，检测这类前病毒。在感染得自转染crHIV的ACH2细胞的细胞上清液后的Jurkat细胞中产生crHIV DNA。即在这种情况下，见到crHIV-1.11核酶DNA的特异性扩增。相比之下，单独感染受刺激ACH2细胞上清液的细胞(即在缺乏感染crHIV-1.111的ACH2细胞的情况下)没有显示出核酶DNA产物。

由于crHIV载体只在野生型辅助HIV基因组的存在下传播，因此检测含有crHIV基因组的未受感染细胞在感染野生型HIV后被解救的能力。通过首先用crHIV-1.11(即作为crHIV载体的代表)转染细胞，然后用野生型HIV(即pNL4-3)超感染，进行这些实验。因此，用大约2.5μg crHIV DNA转染大约10⁶Jurkat细胞。让这些细胞在感染野生型HIV病毒贮液之前生长大约72小时。转染crHIV-1.11的Jurkat细胞与pNL4-3贮液(2×10⁵TCID₅₀单位/10⁶细胞)一起于37℃保温大约2小时，在Opti-MEM^I还原血清培养基中洗涤3次，然后重悬浮于完全培养基(具有10％FBS的RPMI 1640)中。感染后大约5天，按实施例4所述方法从细胞上清液中分离RNA。

关于TCID₅₀测定，用5倍限制稀释液将含有HIV的上清液在96孔板上铺平板。然后将大约10⁴MT4细胞(AIDS试剂参比程序，Rockville，Maryland；和Harada等， Science， 229，563-566(1985))加入稀释的病毒上清液中，将所得的上清液培养7天，直至发生完全的病毒生长。MT4细胞是修饰的T细胞，它含有来自HTLV-1的Tax基因，后者为类似于HIV-1中Tat的反式激活因子基因。然后分析上清液的逆转录酶活性并按前述计分(Dropulic’等(1992)，见上述)。用Reed和Muench的方法( Tech.in HIV Res.，Johnson等，eds.，Stocton Press，71-76(1990))测定该组织培养物的感染剂量(TCID₅₀)。

转染crHIV的Jurkat细胞超感染野生型HIV，导致crHIV基因组解救到病毒颗粒中。在超感染野生型HIV后，crHIV基因组被包装到病毒颗粒中。在此期间，这些细胞看来是正常的，没有显著的细胞毒性迹象。

这些结果证实，crHIV基因组在与野生型HIV辅助病毒互补后，能够经历整个复制周期。这些结果也证实，其它病毒基因组在与相应的野生型病毒互补后，可能能够经历整个复制周期。

实施例7

该实施例描述先前实施例中报道的逃逸病毒生长。

通过采用前述RT-PCR分析病毒粒子RNA，检测来自转染野生型HIV或共转染野生型HIV和crHIV-1.11的培养物的逃逸病毒生长的本质。病毒生长早期培养物(即转染野生型HIV第+11天的培养物，共转染crHIV-1.11第+19天的培养物)产生的病毒主要含有crHIV RNA。相比之下，病毒生长晚期的培养物(即转染野生型HIV第+17天的培养物，共转染crHIV-1.11第+23天的培养物)主要含有野生型HIV RNA。因此，共转染野生型HIV和crHIV-1.11前病毒的细胞的病毒生长看来似乎是由从胞内核酶限制作用逃逸的野生型HIV的生长导致的。很明显，甚至在病毒生长晚期培养物中，crHIV基因组仍占总HIV基因组相当大的比例。这提示，尽管野生型HIV基因组占优势，然而crHIV通过该培养物传播，尽管其效率低于野生型HIV基因组的效率。

这证明，crHIV载体以及其它条件复制型载体可以有效地与野生型病毒基因组竞争病毒复制。

实施例8

该实施例进一步描述先前实施例中报道的逃逸病毒生长的本质。

通过测定传染性野生型HIV的效价，研究逃逸病毒生长期间将crHIV RNA包装到病毒粒子中的作用。在病毒生长对数期培养物(即第+14天的野生型HIV培养物，第+16天的crHIV-1.1培养物，第+20天的crHIV-1.11或crHIV-1.12培养物)的病毒上清液上进行限制稀释TCID₅₀的测定(如实施例6中所述)。在采用逆转录酶测定之前，将样品归一化。野生型HIV、crHIV-1.1、crHIV-1.11和crHIV-1.12的培养物上清液的感染剂量分别为1.3×10⁴TCID₅₀/ml、5.4×10³TCID₅₀/ml、3.8×10³TCID₅₀/ml和3.8×10³TCID₅₀/ml。因此，在逃逸病毒生长期间crHIV RNA包装到病毒粒子中导致产生的传染性野生型HIV颗粒数的降低。

下一步检测传染性野生型HIV效价的降低是否为切割逃逸病毒粒子内野生型HIV RNA的结果。通过引物延伸评价存在于共转染细胞上清液中病毒粒子的RNA切割产物。使用图6中鉴定的、含有Hin dIII限制位点的PE引物(GGTTAAGCTTGTCGCCGCCCCTCGCCTCTTG[SEQ ID NO：12]。在包含50mM Tris-HCl pH 8.3、75mM KCl、3mMMgCl₂、5mM DTT、1mM dNTPs和20U RNA酶抑制剂的第一链缓冲液中，在其中加入25U MuLV逆转录酶，于42℃进行2小时跨过该切割位点的引物延伸。从得自共转染crHIV培养物的浓缩病毒粒子制剂中分离病毒RNA。通过于4℃以2,000×g离心15分钟，除去细胞和沉淀。然后通过于4℃以30,000×g超离心4小时浓缩病毒。然后采用Trizol^TM，如前所述从病毒沉淀中分离病毒RNA。

在病毒生长晚期从转染野生型HIV和共转染crHIV-1.11的培养物(即转染野生型HIV第+17天的培养物，共转染crHIV-1.11第+23天的培养物)上清液中分离病毒RNA。这些培养物中的病毒粒子既含有野生型HIV基因组RNA，也含有crHIV基因组RNA。在转染野生型HIV和共转染crHIV-1.11的培养物中都观察到引物延伸的全长cDNA。尽管进行了广泛的引物延伸分析，但没有检测可能由U5 RNA切割产生的的较小的cDNA。因此，传染性野生型HIV RNA效价的降低不是由于野生型HIV RNA的病毒内切割引起的，而是由于在子代病毒粒子内被crHIV RNA进行数量置换引起的。

因此，这些结果表明，本文所述方法可以用来用按照本发明的条件复制型载体，从子代病毒粒子中取代野生型基因组，诸如HIV基因组和其它基因组。

实施例9

该实施例证明，用质粒或重组crHIV-1.111病毒攻击后，crHIV载体可以抑制野生型HIV的复制。

Jurkat细胞用HIV贮液(克隆pNL4-3)感染，然后用或者(1)含crHIV-1.111构建物的质粒DNA或者(2)在293细胞中包装的重组crHIV-1.111病毒(即突变crHIV-1.M)(Nadlini等， Science， 272，263-267(1996))进行攻击。对这些细胞进行DLS脂类介导的转染(Thierry等，PNAS，92，9742-9746(1995))或crHIV介导的传递。通过在原始感染HIV后12天使用逆转录酶分析测定病毒的复制。野生型阳性对照培养物表现出正常水平的野生型HIV生长。当通过DLS介导的转染用突变crHIV-1.M攻击感染野生型HIV的细胞时，不影响野生型HIV病毒的生长。相比之下，当通过DLS介导的转染，用编码抗HIV核酶的crHIV-1.111攻击感染野生型HIV的细胞时，显著抑制野生型HIV病毒的生长(即复制)。此外，当用野生型HIV攻击突变crHIV-1.M时，不影响野生型HIV的复制。相反，当用crHIV-1.111攻击野生型HIV时，显著抑制野生型HIV的复制。该数据表明，crHIV载体可以用来在胞内显著抑制野生型HIV的复制。

实施例10

该实施例描述条件复制型载体在癌的治疗处理中的用途。

可以构建治疗癌的条件复制型病毒载体，使其在正常细胞中的复制能力有缺陷，因为它缺乏其复制所需的病毒蛋白。然而，当该载体感染癌细胞时，该癌细胞的独特性质提供一种因子(例如最好是促进癌细胞异常生长的同一突变细胞蛋白)，它促进该缺陷型治疗癌的载体复制。因此，该方法不同于用于治疗病毒感染的方法，因为不发生病毒载体选择性地包装，而是因为在该细胞中包装载体衍生的子代病毒粒子而优先裂解癌细胞。然而，该方法类似于用于病毒感染的方法，因为它可以使用辅助病毒表达载体选择性地在癌细胞中繁殖该条件复制型载体。该载体和/或辅助病毒表达载体可以制成对肿瘤特异性因子应答，由此促进载体选择性地在肿瘤细胞中传播。

可以在该治疗方法中利用的肿瘤特异性因子包括(但不限于)在以下水平上作用的那些因子：(1)病毒进入细胞的水平(例如允许病毒载体选择性地进入癌细胞中，而不进入正常细胞中的肿瘤特异性受体的存在)；(2)病毒转录水平(例如与正常细胞相反，一种突变癌细胞蛋白将允许治疗癌的载体选择性地在癌细胞中转录其RNA；以及(3)病毒成熟和释放(例如突变癌细胞蛋白可以例如通过使这些突变细胞蛋白与病毒蛋白或基因组联合和导致促进病毒成熟和释放，允许该治疗癌的条件复制型载体选择性地成熟)。因此，存在于癌细胞中的突变蛋白可以与病毒复制周期许多阶段的病毒蛋白(或基因组RNA或DNA)相互作用。可以操作这些相互作用，产生治疗癌的条件复制型载体，后者在正常细胞中为缺陷型，而在癌细胞中可以复制。

具体地说，该方法可以用来治疗T细胞白血病。T细胞白血病为预后差的严重癌形式。许多白血病T细胞为CD4+。因此，可以使用野生型HIV作为该载体骨架，构建治疗抗T细胞白血病的条件复制型载体。由于HIV显然通过CD4糖蛋白进入细胞，因此该载体能够在病毒进入细胞水平上起作用。

可以通过例如将缺失导入野生型HIV中，将该载体制成治疗癌的载体。可以按前述方法，通过产生DNA形式的HIV基因组并进行定点诱变，使该HIV基因组突变。通过用其它肿瘤抑制突变或阴性癌基因互补病毒缺陷，或通过利用与病毒蛋白相互作用的其它肿瘤特异性因子，同样可以利用该方法。例如可以缺失tat基因，后者编码的蛋白对HIV复制是重要的。在缺乏Tat的情况下，HIV不再能够增量调节其表达，后者对HIV复制是绝对必要的。Tat蛋白通过结合与HIV启动子联合的TAR RNA茎-环结构起作用，并能够将HIV表达增量调节100倍以上。因此，没有Tat，基于HIV的载体不表达HIV蛋白，将不繁殖并且不杀伤正常(即非癌性)T细胞。

然而，白血病T细胞通常包含功能改变的分子，它或者突变、过量表达，或者沉默。该改变状态的分子功能与正常细胞无关。在其非突变状态中(但不是其突变状态)，该分子在细胞增殖和/或细胞凋亡的调节中起作用。与该突变状态有关的变化可以用来特异性地促进条件复制型病毒载体的繁殖。这可以在存在或缺乏辅助病毒表达载体的情况下进行。例如Tat的缺陷可以由驱动肿瘤特异性启动子的辅助表达载体互补，这里该启动子来自过量表达的白血病细胞的一个基因。这样一种载体仅可以在白血病T细胞中复制，而不能在正常细胞中复制。在白血病T细胞中的病毒表达和繁殖可以导致细胞裂解和死亡，同时产生新生病毒。该载体也可以携带另一元件，以促进细胞杀伤(例如编码毒素、细胞因子或促进免疫导向的抗原的序列)。

其它方法和策略同样可以用于其它治疗癌的条件复制型载体的构建中。

实施例11

该实施例描述第二代crHIV构建物(cr2HIV)的开发，它的繁殖性能优于crHIV-1.111载体。

第二代载体能够增加crHIV产生细胞的crHIV颗粒生产。更多crHIV颗粒的产生促进它们传播，并防止培养物中野生型HIV的过生长。由于缺乏阻断超感染野生型HIV的蛋白的编码序列，这些载体含有所有天然野生型HIV的序列，但不编码Tat基因。在Tat基因上三个不同位点上制成的抗Tat三联核酶盒([SEQ ID NO：18])取代该Tat基因。另外，缺失该Tat剪接位点，使得Tat核酶选择性地切割野生型HIV基因组RNA，而不是已剪接的野生型HIV RNA，后者互补Tat中的缺陷，并促进crHIV复制。与先前不编码非(或许是)蛋白性遗传抗病毒剂(诸如免疫原)蛋白的载体相反，第二代载体编码这些蛋白，但只在Tat的存在下表达这些蛋白。在含有野生型HIV和crHIV基因组的细胞中，由于不仅野生型HIV产生结构蛋白，而且crHIV基因组也产生结构蛋白，因此不仅选择性地包装crHIV基因组，而且生产的病毒粒子多于crHIV-1.111细胞。因此，由于不仅由野生型HIV模板产生病毒粒子，而且由crHIV模板产生病毒粒子，因此赋予该载体选择性包装的优势。

第二代载体的特征也是包含或编码核酶，其催化域导向该载体本身以外的区域。与包含或编码导向HIV前导序列U5区的核酶的crHIV-1.111(它需要将修饰的U5序列加入该crHIV载体的前导序列中)相反，第二代载体的核酶导向的区域不在该载体中，由此消除了修饰该载体序列的需要。这减小可以通过野生型HIV与修饰crHIV U5序列重组形成抗性HIV的可能性。因此，野生型HIV与crHIV序列的重组可能没有对野生型HIV提供益处；将核酶序列加入野生型HIV中只可能对野生型HIV有害。

第二代载体的另一特征为加入大量的不同核酶，每种核酶都导向不同位点，以减小野生型HIV形成抗核酶突变体的可能性。

在安全目的的该载体系统的另一改进中，可以通过加入以安全方式特异性促进crHIV复制和传播的遗传元件/因子，进一步修饰条件复制型疫苗、“辅助载体”构建物。一个实施方案是将核酶导入该辅助载体中，以防止它与该载体进行遗传重组产生野生型病毒。因此，上述cr2HIV载体可以与Tat辅助表达载体互补，以促进其传播。通过将抗HIV的核酶插入该辅助表达载体中，最大限度地减小重组机会，因为该载体遇到辅助载体RNA可能导致它们相互剪切和破坏。因此，可以以多种方式修饰该辅助表达载体，以有助于特定的预防或治疗策略。因此，由于cr2HIV载体(1)复制并因此持久性地刺激宿主免疫应答，以及(2)由于它们得自HIV并在抗原上变化，允许该宿主识别多样化表位，因此r2HIV载体具有作为抗HIV疫苗的实用性。

本文引用的所有参考文献包括专利、专利申请和出版物通过引用整个结合到本文中。

尽管已经描述了本发明，重点在推荐实施方案上，但本领域技术人员会明显看出，在推荐实施方案中可以产生变化，并使用这些变化，并且除本文具体描述的实施方案外，可以实施本发明。本发明将包括这类变化和其它实施。因此，本发明包括以下权利要求书限定的本发明精神和范围内包括的所有修改。

                              序列表

(1)一般资料：

  (i)申请人：Dropulic，Boro

          Pitha，Paula M.

  (ii)发明题目：条件复制型病毒载体及其用途

  (iii)序列数：17

  (iv)通讯地址：

    (A)地址：Leydig，Voit & Mayer，Ltd.

    (B)街区：Two Prudential Plaza，Suite 4900

    (C)城市：芝加哥

    (D)州：IL

    (E)国家：美国

    (F)邮政编码：60601

  (v)计算机可读形式：

    (A)媒体类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容机

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release #1.0，版本#1.25

  (vi)当前申请数据：

    (A)申请号：WO 96US18997

    (B)填写日期：1996年11月27日

    (C)分类：

  (vi)先前申请数据：

    (A)申请号：US 08-563459

    (B)填写日期：1995年11月28日

    (C)分类：

  (viii)代理律师/代理人资料：

    (A)姓名：Kilyk Jr.John

    (B)登记号：30,763

    (C)参考/档案号：74993

  (ix)电讯资料：

    (A)电话：(312)616-5600

    (B)传真：(312)616-5700

    (C)电传：25-3533

(2)有关SEQ ID NO：1的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC                            39

(2)有关SEQ ID NO：2的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GTGTGCCCAC CTGTTGTGTG ACTCTGGCAG CTAGAGAAC                            39

(2)有关SEQ ID NO：3的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：40个碱基对

    (B)类型：核酸

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  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

CACACAACAC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACGGGCACA                           40

(2)有关SEQ ID NO：4的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：40个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

ATCTCTAGTC TGATGAGGCC GAAAGGCCGA AACCAGAGTC                           40

(2)有关SEQ ID NO：5的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GTGTGCCCGC CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC                            39

(2)有关SEQ ID NO：6的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

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  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGCAA CTAGAGATC                            39

(2)有关SEQ ID NO：7的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：27个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TGTGACGTCG ACCACACAAC ACTGATG                                         27

(2)有关SEQ ID NO：8的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：33个碱基对

    (B)类型：核酸

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    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TGTGACGTCG ACTCTAGATG TGCCCGTTTC GGC                                  33

(2)有关SEQ ID NO：9的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：31个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

GGTTAAGCTT GAATTAGCCC TTCCAGTCCC C                                     31

(2)有关SEQ ID NO：10的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：31个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

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  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GGTTGGATCC GGGTGGCAAG TGGTCAAAAA G                                    31

(2)有关SEQ ID NO：11的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：38个碱基对

    (B)类型：核酸

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    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

CGGATCCACG CGTGTCGACG AGCTCCCATG GTGATCAG                             38

(2)有关SEQ ID NO：12的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：31个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

GGTTAAGCTT GTCGCCGCCC CTCGCCTCTT G                                    31

(2)有关SEQ ID NO：13的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：112个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它核酸)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：13：

AAGCTTGCCT TGAGTGCTCA AAGTAGTGTG TGCCCACCTG TTGTGTGACT CTGGCAGCTA     60

GAGATCCCAC AGACCCTTTT AGTCAGTGTG GAAAATCTCT AGCAGTGGCG CC            112

(2)有关SEQ ID NO：14的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

GTGTGCCCNN CTGTTGTGTG ACTCTGGNAN CTAGAGANC                            39

(2)有关SEQ ID NO：15的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

GTGTGCCCAT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAA CTAGAGATC                           39

(2)有关SEQ ID NO：16的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：39个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(基因组)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

GTGTGCCCGT CTGTTGTGTG ACTCTGGTAG CTAGAGATC                            39

(2)有关SEQ ID NO：17的资料：

  (i)序列特征：

    (A)长度：152个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：双链

    (D)拓扑结构：线状

  (ii)分子类型：DNA(其它)

  (xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

GATCGAATTC CTGCTATGTT CTGATGAGTC CGAAAGGACG AAACACCCAT TTCCCGGGTT     60

TAGGATCCTG ATGAGCGGAA AGCCGCGAAA CTGGCTCCGG CCGTTTTAGG CTCTGATGAG    120

CTGGAAACAG CGAAACTTCC TGGTCGACGA TC                                  152

Claims (49)

1.逆转录病毒载体，其包含：

(a)来源于慢病毒的5’和3’长末端重复(LTR)，其中载体3’LTR，或通过该载体的逆转录产生的5’LTR，包含启动子，并且载体3’LTR或通过该载体的逆转录产生的5’LTR经修饰包含非来源于所述慢病毒的序列，藉此由所述经修饰3’LTR或逆转录的5’LTR引起的序列表达控制不同于由未经修饰的LTR引起的表达控制；和

(b)异源核酸序列，其与修饰的LTR操作性连接，并且在逆转录产物中，异源核酸序列位于修饰的5’LTR的3’端，从而允许修饰的5’LTR控制异源核酸序列的表达；且

其中在载体中所述修饰的3’LTR位于异源序列的下游，在通过载体的逆转录产生的病毒基因组中，表达的异源核酸序列位于修饰的5’LTR的下游。

2.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体条件性复制。

3.权利要求1的逆转录病毒载体，其中修饰的载体3’LTR和通过载体的逆转录产生的5’LTR包含修饰的启动子，或进一步包含非来源于所述慢病毒的启动子，或包含非来源于所述慢病毒的增强子。

4.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述异源核酸序列包含已转录成RNA的、选自以下的序列：反义分子、RNA引捕器和核酶；或者所述异源核酸序列编码选自以下的蛋白质：反式显性突变体、毒素和针对病毒结构蛋白的单链抗体(scAb)。

5.一种宿主细胞，其包含权利要求1的载体。

6.一种用于逆转录病毒载体的细胞特异性复制和/或繁殖的方法，所述方法包括培养权利要求5的宿主细胞。

7.一种在细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括在异源核酸序列表达的条件下，培养权利要求5的细胞。

8.一种表达重组多肽的方法，其包括在异源核酸表达的条件下，表达权利要求1的载体。

9.一种在细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括在细胞中表达逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包含：

(a)来源于慢病毒的5’和3’长末端重复(LTR)，其中3’LTR包含异源或修饰的启动子，所述启动子通过逆转录拷贝到5’LTR，其中启动子在细胞中有活性，或者提供一种化合物激活启动子；和

(b)与异源或修饰的启动子操作性连接的异源核酸序列，使得启动子控制异源核酸序列的表达。

10.一种从逆转录病毒载体表达异源核酸序列的方法，其包括：

(a)提供逆转录病毒载体，所述逆转录病毒载体包含(i)来源于慢病毒的5’长末端重复(LTR)和3’LTR，其中载体3’LTR包含异源或修饰的启动子，所述启动子通过逆转录拷贝到5’LTR；和(ii)与异源或修饰的启动子操作性连接的异源核酸序列，使得启动子控制异源核酸序列的表达；以及

(b)提供激活启动子表达的化合物，使异源核酸序列表达。

11.一种在特定细胞中表达异源核酸序列的方法，其包括：

(a)提供宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求1的逆转录病毒载体，其中载体和宿主细胞缺少编码功能性Tat蛋白的核酸序列，其中载体3’LTR或逆转录产物5’LTR应答Tat蛋白；

(b)使宿主细胞与辅助载体接触，所述辅助载体包含编码Tat蛋白的核苷酸序列，其中核苷酸序列与在宿主细胞内有活性的启动子操作性连接，用于在宿主细胞内表达。

12.权利要求11的方法，其中逆转录病毒载体条件性复制。

13.权利要求7的方法，其中所述异源核酸序列包含已转录成RNA的、选自以下的序列：反义分子、RNA引捕器、核酶、siRNA；或者所述异源核酸序列编码选自以下的蛋白质：反式显性突变体、毒素、针对病毒结构蛋白的抗体和针对病毒结构蛋白的单链抗体(scAb)。

14.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述载体选自图1B、1C、1D、1E、6B和6C所示载体。

15.权利要求14的逆转录病毒载体，其中所述载体包含(a)一种或几种核酶，或(b)一段核酸序列，所述核酸序列能(i)治疗或预防疾病或病症，(ii)编码能够治疗或预防疾病或病症的蛋白，(iii)用作抗菌剂、抗毒素剂或抗化学品剂，或(iv)编码能用作抗菌剂、抗毒素剂或抗化学品剂的蛋白。

16.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体包含病毒复制抑制序列或病毒包装抑制序列，所述序列包含至少一种抑制或防止有复制能力的慢病毒基因组与逆转录病毒载体共包装。

17.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体包含一段核酸序列，所述核酸序列包含或编码反义分子、RNA引捕器、反式显性突变体、毒素、免疫原、干扰素、抗体、反生物学或反化学药剂或核酶。

18.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述逆转录病毒载体包含一段核酸序列，所述核酸序列能(i)治疗或预防疾病或病症，(ii)编码能够转录或预防疾病或病症的蛋白，(iii)用作抗菌剂、抗毒素剂或抗化学品剂，或(iv)编码能用作抗菌剂、抗毒素剂或抗化学品剂的蛋白。

19.权利要求1的逆转录病毒载体，其中被治疗或预防的疾病或病症是癌症。

20.权利要求19的逆转录病毒载体，其中癌症是T细胞白血病。

21.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述载体进一步包含提高靶细胞存活率、促进病毒生产、诱导细胞凋亡、促进蛋白生产和/或促进免疫功能和/或导向的序列。

22.权利要求1的逆转录病毒载体，其中所述载体被基因工程改造以仅在特定的细胞类型中表达，所述基因工程改造的方法是添加或缺失特定的遗传元件或因子，所述遗传元件或因子允许条件复制型慢病毒载体细胞特异性复制和/或包装。

23.权利要求1的逆转录病毒载体，其中载体包于衣壳蛋白中，所述衣壳蛋白使载体特异性地感染某种细胞类型，而不能感染其他细胞类型。

24.权利要求1的逆转录病毒载体，其中载体被配制成疫苗。

25.一种逆转录病毒载体，其包含：

(a)包含修饰的或异源启动子的3’LTR，使得逆转录的载体生成包含修饰的或异源启动子的5’LTR；和

(b)异源核酸序列，其与所述修饰的或异源启动子操作性连接，使得可以通过启动子控制异源核酸序列的表达。

26.权利要求25的逆转录病毒载体，其中修饰的或异源的启动子包含逆转录病毒启动子。

27.权利要求26的逆转录病毒载体，其中载体包含与修饰的或异源的启动子操作性连接的核酸。

28.权利要求27的逆转录病毒载体，其中与启动子操作性连接的核酸包含待表达基因、抗病毒序列或编码蛋白的序列。

29.一种逆转录病毒载体，其包含

(a)5’LTR和3’LTR，和

(b)与启动子操作性连接的异源核酸序列，使得可以通过启动子控制异源核酸序列的表达。

30.条件复制型病毒载体，其包含

(a)编码条件复制型逆转录病毒基因组的核酸，所述基因组包含逆转录病毒5’长末端重复(LTR)和逆转录病毒3’LTR；和

(b)第一和第二异源核酸序列，其中第一异源核酸序列包含控制第二异源序列表达的启动子。

31.来源于逆转录病毒的病毒载体，其包含：

(a)编码逆转录病毒基因组的核酸，所述基因组包含逆转录病毒5’长末端重复(LTR)和3’LTR；和

(b)第一异源核酸序列和第二异源核酸序列，其中第一异源核酸序列包含控制第二异源序列表达的启动子。

32.权利要求29、30或31的载体，其中第二异源序列包含待表达基因、抗病毒序列或编码蛋白的序列。

33.一种载体对，其包含：

(a)包含第一核苷酸序列的条件复制型慢病毒载体；和

(b)一种辅助载体或辅助病毒，其能够对所述条件复制型慢病毒载体的复制或包装进行互补，

其中所述第一序列包含至少一段抑制或防止有复制能力的慢病毒基因组在宿主细胞中复制或包装的序列，使得条件复制型慢病毒载体比有复制能力的慢病毒基因组更有利于选择性复制或包装；并且

其中所述条件复制型慢病毒载体仅通过与有复制能力的慢病毒基因组或辅助病毒或辅助载体进行互补而在宿主细胞中复制。

34.权利要求33的载体对，其中所述辅助载体包含至少一段核苷酸序列，所述核苷酸序列：

(a)能够破坏、剪接或切割核酸，所述核酸由辅助载体或辅助病毒或野生型病毒与条件复制型慢病毒载体或其转录产物之间重组产生；或

(b)能够破坏、剪接或切割辅助载体或辅助病毒或野生型病毒，或它们的转录产物，由此降低在辅助载体或辅助病毒或野生型病毒与条件复制型慢病毒载体之间重组的机会；

其中任选地至少一段核苷酸序列包含至少一段核酶核苷酸序列。

35.权利要求33的载体对，其中所述第一核苷酸序列包含遗传抗病毒剂或编码抗病毒剂的序列。

36.权利要求35的载体对，其中所述遗传抗病毒剂或抗病毒剂包含核酸，其包含反义分子的转录物或蛋白产物，核酶、锤头型或发夹型核酶，包含切割3’核苷酸NUH序列的催化结构域的核酶，包含在编码逆转录酶的序列中进行切割的催化结构域的核酶，蛋白酶，反式激活蛋白或Rev，核酸引捕器，反式显性突变蛋白，单链抗体，免疫原，抗原，细胞表面蛋白，与野生型HIV Rev蛋白结合的蛋白或抗体，识别修饰的但非野生型RRE的突变的Rev蛋白，与野生型HIV基质蛋白或核衣壳蛋白结合的蛋白或抗体，单链抗体(scAB)，疫苗，蛋白酶抑制剂，逆转录酶抑制剂，病毒进入细胞的竞争剂，细胞因子，抗原，受体或自杀基因。

37.一种载体对，其包含：

(a)第一载体，所述第一载体包含：

(i)一种核酸构建体，其抑制野生型慢病毒基因组复制，或使条件复制型慢病毒基因组的复制或包装比野生型慢病毒基因组的复制有选择性优势，其中核酸构建体包含：(1)条件复制型慢病毒基因组；和(2)包含病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列的核酸；

其中条件复制型慢病毒基因组包含慢病毒5’长末端重复(LTR)和3’LTR，并且病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列的转录活性在LTR的控制下；

病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列或其产物不抑制或仅部分抑制条件复制型慢病毒基因组的复制或包装；

病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列或其产物抑制野生型慢病毒基因组的复制或包装，或使条件复制型慢病毒基因组的复制或包装比野生型慢病毒基因组的复制有选择性优势；以及

(b)辅助载体或辅助病毒，其能够与第一载体的复制或包装进行互补。

38.一种载体对，其包含：

(a)第一载体，所述第一载体包含：

(i)包含3’LTR的逆转录病毒载体，所述3’LTR包含修饰的或异源启动子，使得逆转录的载体生成包含修饰的或异源启动子的5’LTR，并且异源核酸序列操作性地与修饰的或异源启动子连接，使得可以通过启动子控制异源核酸序列的表达；和

(b)辅助载体或辅助病毒，其能够与第一载体的复制或包装进行互补。

39.一种载体对，其包含：

(a)第一载体，所述第一载体包含：

(i)一种逆转录病毒载体，其包含5’LTR和3’LTR，以及与启动子操作性连接的异源核酸序列，使得可以通过启动子控制异源核酸序列的表达；和

(b)辅助载体或辅助病毒，其能够与第一载体的复制或包装进行互补。

40.一种载体对，其包含：

(a)第一载体，所述第一载体包含：

(i)条件复制型病毒载体，其包含编码包含逆转录病毒5’长末端重复(LTR)和逆转录病毒3’LTR的条件复制型逆转录病毒基因组的核酸，以及第一和第二异源核酸序列，其中第一异源核酸序列包含控制第二异源序列表达的启动子；和

(b)辅助载体或辅助病毒，其能够与第一载体的复制或包装进行互补。

41.一种载体对，其包含：

(a)第一载体，所述第一载体包含：

(i)来源于逆转录病毒的病毒载体，其包含编码包含逆转录病毒5’长末端重复(LTR)和3’LTR的逆转录病毒基因组的核酸，以及第一和第二异源核酸序列，其中第一异源核酸序列包含控制第二异源序列表达的启动子；和

(b)辅助载体或辅助病毒，其能够与第一载体的复制或包装进行互补。

42.条件复制型载体，其包含：

一种核酸构建体，其抑制野生型慢病毒基因组复制或使条件复制型慢病毒基因组的复制或包装比野生型慢病毒基因组的复制有选择性优势，其中核酸构建体包含：(1)条件复制型慢病毒基因组；和(2)包含病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列的核酸；

其中条件复制型慢病毒基因组包含慢病毒5’长末端重复(LTR)和3’LTR，并且病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列的转录活性在LTR的控制下；

病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列或其产物不抑制或仅部分抑制条件复制型慢病毒基因组的复制或包装；

病毒复制抑制性或病毒包装抑制性序列或其产物抑制野生型慢病毒基因组的复制或包装，或使条件复制型慢病毒基因组的复制或包装比野生型慢病毒基因组的复制有选择性优势。

43.一种条件复制型载体，其包含：

包含第一核苷酸序列的条件复制型慢病毒基因组，其中所述第一序列包含至少一段抑制或防止有复制能力的慢病毒基因组在宿主细胞中复制或包装的序列，使得条件复制型慢病毒载体比有复制能力的慢病毒基因组更有利于选择性复制或包装，并且条件复制型慢病毒载体仅通过与有复制能力的慢病毒基因组或辅助病毒或辅助载体进行互补而在宿主细胞中复制。

44.一种条件复制型载体，其包含：

条件复制型病毒载体，所述条件复制型病毒载体包含编码包含逆转录病毒5’长末端重复(LTR)和逆转录病毒3’LTR的条件复制型逆转录病毒基因组的核酸，以及第一和第二异源核酸序列，其中第一异源核酸序列包含控制第二异源序列表达的启动子。

45.权利要求33的载体对，其中载体进一步包含第二核酸序列，其中第二核酸序列或其编码的蛋白可以(a)治疗或预防疾病或病症，(b)用作抗菌剂、抗毒素剂或抗化学品剂，和/或(c)包括反义分子、RNA引捕器、反式显性突变体、毒素、免疫原、干扰素、抗体、反生物学或反化学药剂或核酶，

其中任选地被治疗或预防的疾病或病症是癌症，并且任选地癌症是T细胞白血病。

46.一种细胞或细胞系，其包含权利要求33的载体对，其中细胞任选地是人细胞。

47.权利要求33的载体对，其中至少一种载体选自图1B、1C、1D、1E、6B和6C所示载体。

48.一种制备经包装的条件复制型慢病毒的方法，其包括用权利要求33的载体对转导、转染、感染或注射细胞。

49.一种预防或治疗细胞中病毒感染的方法，其包括向细胞中导入权利要求33的载体对。

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