CN1671729A - 人Corin基因的控制序列 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种从哺乳动物Corin基因分离得到的新的表达控制区。该控制区优选地在心脏细胞内激活转录。本发明也提供了采用该控制区来鉴定能够调控Corin表达的物质以及治疗心脏病的方法及组合物。

Description

人Corin基因的控制序列

本申请要求2002年5月31日提交的申请号为60/384,108的美国临时申请的优先权，该申请在此以其全部内容并入作为参考。

技术领域

本发明提供了一种从哺乳动物Corin基因中分离得到的新的表达控制区。该控制区优选地激活心脏细胞内的转录。本发明还提供了用该控制区鉴定能调控Corin表达的物质以及治疗心脏病的方法及组合物。

背景技术

Corin，一种心脏的跨膜丝氨酸蛋白酶，在前心房肽(pro-ANP)到ANP的转化上发挥着重要作用(Yan，W.et al.(2000)PNAS，97：8525-8529；Wu et al.(2002)J.Biol.Chem.277：16900-16905)。ANP是一种心脏激素，它通过以受体依赖性方式促进盐的排泄、增加尿量、减少血容量以及缓和血管张力来降低高血压。例如高血压和心衰的主要心血管病都与ANP有关(Burnett，J.C.et al.(1986)Science，231：1145-1147)。在基因敲除小鼠中，不论ANP或其受体的缺失都引起自发性高血压(John，S.W.et al.(1995)Science 267：679-681；John，S.W.et al.(1996)Am.J.Physiol.271，R109-R114；Lopez et al.(1995)Nature 378：65-68)。认识到从前ANP转化为ANP的活化步骤在心脏激素的调节上是至关重要的。

Corin具有推定的II型跨膜蛋白结构，它含有两个卷曲样的富含半胱氨酸基序、八个LDL受体重复序列、一个巨噬细胞清道夫受体样结构域、以及细胞外区域的胰蛋白酶样蛋白酶结构域(Yan et al.(1999)J.BioLChem.274：14926-14935)。Corin的总的拓扑学与其它II型跨膜丝氨酸蛋白酶相似，这些蛋白酶包括hepsin、肠激酶、MT-SP1/matriptase、人气道胰蛋白酶样蛋白酶、TMPRSS2、TMPRSS3/TADG-12、TMPRSS4、MSPL以及Stubble-stubbloid。相似的拓扑学以及不一样的组成结构说明这些蛋白构成了一个由祖先外显子的重复及重排所进化形成的基因家族。

该人基因跨越＞200kb并含有22个外显子。内含子/外显子之间的界限在物种之间具有较高的保守性，且绝大多数外显子编码结构结构域。先前已经描述了编码Corin蛋白的小鼠和人cDNA的克隆(Yan等，ibid)。Northern分析显示Corin mRNA大量表达于人心脏中。通过原位荧光杂交分析将人Corin基因绘制于染色体4的短臂上(4p12-13)，其中已经定位了一种先天性心脏病的基因座，即完全异常肺静脉回流的基因座。

发明内容

本发明涉及分离、克隆以及鉴定哺乳动物Corin基因的表达控制区，包括启动子和其它调节元件，并涉及该心脏特异性的表达控制区在鉴定调控心房肽基因表达的新物质以及治疗心脏病中的用途。

朝着这些目标，本发明的一个目的是提供一种含有Corin控制区的分离的多核苷酸，其中所述控制区调控任何与其可操纵地连接的异源性多核苷酸的转录，所述异源性多核苷酸包括但不限定于人Corin基因。

Corin表达控制区指导与其可操纵地连接的异源性多核苷酸的心脏特异性的转录，它包括选自由GATA、Tbx-5、NKx2.5、Krüppel样转录因子、和NF-AT结合位点构成的组的一个或多个转录调节元件，并能结合转录蛋白，例如GATA-4。

本发明的进一步的目的是提供含有人Corin表达控制区的多核苷酸。本发明优选的多核苷酸是定位于核苷酸-4037到-15(SEQ ID NO：6)，更优选的是核苷酸-1297到-15(SEQ ID NO：5)，以及进一步更优选的是核苷酸-405到-15(SEQ ID NO：4)，其中的核苷酸编号是相对于人Corin基因或如图8所示的它的互补链(SEQ ID NO：2)的翻译起始位点(ATG)的编号。

根据发明的这个方面，也提供了这些多核苷酸的片段及变体。

本发明的另一个目的是提供含有Corin表达控制区、或其片段或变体的载体。在进一步的实施方案中，载体也包括可操纵地连接于Corin表达控制区的异源性多核苷酸，例如Corin。根据发明的这个方面，也提供了被这些载体所转染的宿主细胞，以及表达由这些异源性多核苷酸编码的产物的方法。

本发明的另一个目的是提供药用组合物，其包括存在于可药用载体内的含有与异源性多核苷酸可操纵地连接的Corin表达调节区的载体或这样的载体所转染的宿主细胞。

本发明的另一个目的是提供鉴定能调控细胞内人Corin基因表达的物质的方法，其中方法包括：

(a)产生一种重组载体，其中一种包含哺乳动物Corin表达控制区的分离的多核苷酸可操作地连接于一种报告基因；

(b)用所述重组载体转染细胞；

(c)用所述物质处理细胞；

(d)测定被处理细胞内的报告序列的转录水平；以及

(e)比较在有所述物质存在时的报告序列的表达水平与未经所述物质处理的转染的对照细胞内的表达水平。

在优选的实施方案中，使用心肌细胞。

本发明的另一个目的是提供一种调控人类对象内的基因的心脏特异性表达的方法，方法包括：

(a)产生一种重组载体，其中一种包含哺乳动物Corin表达控制区的分离的多核苷酸可操纵地连接于异源性多核苷酸；以及

(b)将治疗有效量的所述载体施用于所述对象。

本发明的这个方面的优选的实施方案是这样一种载体，其中所述的异源性多核苷酸编码Corin。同样优选的实施方案是Corin表达控制区选自具有SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6的序列的多核苷酸。

本发明的另一个目的是提供一种治疗人类对象的充血性心衰、高血压或心肌梗死的方法，所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含与一种基因可操纵地连接的Corin表达控制区，所述基因选自由Corin、心房肽(ANP)、B型利钠肽、受磷蛋白(phosphonolamban)、血管紧张素转化酶(ACE)或这些基因的负显性形式所构成的组。或者，Corin表达控制区可以可操纵地连接于编码反义RNA分子的多核苷酸。

在发明的这个方面的优选的实施方案中，所选的基因是Corin基因。

本发明的另一个方面是提供一种治疗人类对象的心衰的方法，所述方法包含：

(a)产生一种重组载体，其中一种包含哺乳动物Corin表达控制区的分离的多核苷酸可操纵地连接于一种编码一种多肽的多核苷酸，所述多肽选自ANP、B型利钠肽、受磷蛋白、血管紧张素转化酶(ACE)、或这些基因的负显性形式所构成的组；以及

(b)给所述对象施用存在于可药用载体中的所述重组载体。

附图说明

图1：哺乳动物Corin基因的结构。显示了(A)人与(B)小鼠的Corin基因的结构。用鸟枪法将两个BAC克隆测序并显示了它们的组装的插入序列的大小。垂直框表示外显子。用限制性酶位点(H，Hind III；E，EcoRl)表示用于亚克隆人基因的BAC 26540的质粒克隆。利用自动测序用引物延伸法测序亚克隆的插入序列。在底部描述的是BAC克隆、重叠群(Contigs)以及横跨Corin基因的质粒克隆的位置。

图2：相对于Corin的蛋白结构域的内含子-外显子的分界位点。将Corin基因的外显子1到22(上行)与它们的对应的蛋白结构域一起排列。TM，跨膜结构域；卷曲(Frizzled)：卷曲样富含半胱氨酸结构域；LDLR，LDL受体重复序列；SRCR，清道夫受体富含半胱氨酸结构域；H、D以及S，蛋白酶结构域的催化三联体的His、Asp以及Ser残基。

图3：人(SEQ ID NO：1)及小鼠(SEQ ID NO：3)的Corin基因的5’侧翼区的比对。对人与小鼠基因的5’侧翼区，外显子1以及内含子1的一部分进行比对。编号是相对于翻译起始密码子ATG(粗体及斜体)。在人与小鼠之间所显示的编号是不同的，这是因为两者的第一外显子存在偏差。箭头表示人Corin基因的第一外显子与内含子之间的连接，下划线的是人内含子1的供体剪接序列。推定的调节序列用粗体表示(与Tbx5结合的Tbx5位点，Tbx5是一种含有T盒的转录因子；NF-AT，活化T细胞的核因子的结合位点；GATA，GATA蛋白的结合元件；与Krüppel样因子结合的GT盒；与基本转录因子TFIID结合的TATA盒；以及NKE，与Nxk2.5结合的基序)。下划线标出的是与近端GATA序列重叠的NKE序列。

图4：培养的心肌细胞内的Corin基因启动子活性的功能分析。图示了含有与萤光素酶基因连接的人及小鼠Corin基因的5’侧翼区的连续截断片段的报告基因构建体(A)。显示了推定的调节元件的定位。用pRL-SV40将这些构建体共转染到小鼠HL-5细胞中，pRL-SV40是一种由SV40病毒启动子驱动的Rellina萤光素酶表达质粒。将每个构建体所表达的萤光素酶活性标准化为每个转染的pRL-SV40表达的Rellina萤光素酶活性。每个构建体的每个转染试验都重复进行三次。数据表示为三次独立试验的平均值±S.D.(B)。

图5：人与小鼠Corin基因的5’侧翼序列的心脏特异性表达。用所示的构建体与对照构建体pRL-SV40一起转染心肌细胞HL5细胞以及上皮样的HeLa细胞。用每20μl转染细胞的细胞提取液的光量单位表示萤光素酶及Rellina活性。每个转染试验都重复进行三次。数据表示为三次独立试验的平均值±S.D.。

图6：核蛋白与包含近端GATA元件的调节序列的结合。

A：上链寡核苷酸序列用作探针及竞争序列。每个序列的GATA基序(SEQ ID NO：11和13，相应地为人和小鼠)都为粗体，而突变核苷酸(SEQ ID NO：12和14，相应地为人和小鼠)都为斜体。人与小鼠的近端GATA元件都来自所示的Corin 5’侧翼序列区域。含有两个GATA基序的共有序列GATA探针(SEQ ID NO：15)来源于人T细胞受体特异性增强子区。

B：在存在或不存在100倍过量的所示的标记寡核苷酸时，将所标记的共有序列GATA探针(SEQ ID NO：15)或其突变探针(SEQ ID NO：16)与HL-5细胞的核提取物一起孵育。箭头表示GATA序列依赖性的DNA-蛋白复合物。

C：在存在抗GATA蛋白抗体时，将所标记的共有序列GATA探针与HL-5细胞的核提取物一起孵育。箭头表示DNA-蛋白复合物，其形成被抗GATA-4抗体而不是被抗GATA-1、-3及-6抗体所阻断。

D：在存在或不存在抗GATA-4抗体时，将标记的人Corin GATA元件与HL-5的核提取物一起孵育。箭头表示在存在抗GATA-4抗体时，DNA-蛋白复合物的形成被完全阻断。

图7：近端保守的GATA元件的突变分析。将在EMSA中终止了与GATA-4蛋白结合的相同突变(GATA到CTTA)引入到小鼠的从-642到-77的5’侧翼区或人的-405到-15的5’侧翼区所驱动的萤光素酶报告基因构建体中。将突变型与野生型转染到HL-5细胞中，每种都与对照构建体pRL-SV40一起转染。将每个构建体所表达的萤光素酶活性标准化为每个转染的pRL-SV40所表达的Rellina萤光素酶活性。每个突变构建体的启动子活性都表示为相应的野生型构建体的百分比。每个转染试验都重复进行三次。数据表示为三次独立试验的平均值±S.D.。

图8：人Corin基因的5’侧翼区的核苷酸序列(SEQ ID NO：2)。4165个碱基对序列包括5’侧翼区、第一外显子以及第一内含子的起始部(下面的部分)。所有的编号都相对于翻译起始位点(ATG，粗体并有下划线)。用粗体表示推定的调节元件。在图3的图例说明中描述了推定的调节元件的缩写。

对本发明的详细描述

本发明涉及分离、克隆及鉴定心脏特异性的Corin基因的表达控制区，包括启动子和调节元件。用分离的Corin表达控制区、和它们的片段及变体体外和体内构建用于研究Corin基因表达的调控及用于鉴定新的Corin基因表达的调控物的试验模型。表达控制区也用于靶向于心脏病变例如心衰的基因治疗。

定义

如在说明书、实施例以及所附的权利要求书中所使用的，除非有特殊的相反的解释，下面的名词都为所说明的含义。

“核酸”或“多核苷酸”指的是单链或双链形式的脱氧核糖核酸或核糖核酸或它们的聚合物。名词包括含有已知的核苷酸类似物或经修饰的骨架残基或连接的核酸，它们可以是合成的、天然形成的以及非天然形成的，它们具有与所参照的核酸相似的结合特性，以及它们是以与参照核苷酸相似的方式被代谢。这些类似物的实例包括但不限定于硫代磷酸酯、亚磷酰胺、甲基磷酸酯、手性-甲基磷酸酯、2-O-甲基核糖核苷酸、核酸肽(PNA)。

除非有其它说明，特殊的核酸序列也默认包括它们的保守修饰的变体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指示的序列。特别地，通过生成其中一个或多个所选定的(或所有)密码子的第三个位点被混和碱基和/或脱氧次黄嘌呤残基所取代的序列可以完成简并密码子取代(Batzer et al.(1991)Nucl.Acids Res.19：5081；Ohtsuka et al.(1985)J.Biol.Chem.260：2605-08；Rossolini et al.(1994)Mol.Cell.Probes 8：91-98)。名词核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸以及聚核苷酸交替使用。

特殊的核酸序列也默认包括“剪接变体”。同样，核酸编码的特殊蛋白也默认包括任何该核酸的剪接变体所编码的蛋白。“剪接变体”如同名词本身所提示的，它是基因的选择性剪接的产物。在转录后，初始的核酸转录体可以被剪接，使得不同的(选择性)的核酸剪接产物可以编码不同的多肽。这种剪接变体的产生机制多种多样，但包括对外显子的选择性剪接。本定义也包括通过通读转录来源于同一核酸的候补多肽。本定义包括剪接反应的任何产物包括剪接产物的重组形式。

“Corin基因”指的是编码与Yan等(1999)J.Biol.Chem.274：14926-14935中所描述的人Corin基因氨基酸序列有着约至少60％(优选地75％、78％、90％以及更优选的约95％)相同性的连续氨基酸序列的基因。

“Corin表达控制区”或“表达控制区”指的是定位于天然形成的哺乳动物Corin基因的编码区的上游(5’)基因组序列内的多核苷酸。在人Corin基因中，相对于Corin基因或如图8所示的它的互补链的转录起始位点(ATG)，Corin表达控制区开始于-4165核苷酸并终止于-15核苷酸。Corin表达控制区能激活心脏组织(肌细胞)内的Corin基因的转录。Corin表达控制区多核苷酸的长度可以从100到5000个核苷酸；功能性的人Corin表达控制区的特殊实施方案是长度为4023、1283或391个核苷酸(相应地为SEQ ID NO：6、5和4)。Corin表达控制区多核苷酸通常与这些序列至少有70％同源性。在一些实施方案中，Corin表达控制区多核苷酸与这些序列至少有75％、80％、85％、90％、92％、95％或100％同源性。名词“控制区”不包括起始或终止密码子以及Yan等已经描述的其它序列。Corin表达控制区含有各种转录调节蛋白的结合位点，例如GATA-4，它可以按与自然或人工方式基本一样的方式被连接。Corin表达控制区激活Corin基因或其它与其可操纵地连接的异源性多核苷酸，特别是以心脏特异性的方式。

“心脏特异性表达”意思是多核苷酸在心脏源性细胞中的转录率比在非心脏细胞中更大。因此，Corin表达控制区通常在心肌细胞中激活所连接的多核苷酸的效力比在非心脏细胞中高出至少2倍，其中在每种情况下的表达被标准化为另一种与SV40启动子/增强子或其它组成型启动子连接的多核苷酸的转录。

在此所用的多核苷酸的“变体”指的是与参照多核苷酸的多核苷酸序列不同的多核苷酸。通常差别是有限的，使得参照体与变体的多核苷酸序列总体上是非常相似的并且在许多地方是完全一样的。差别是那些不改变多核苷酸功能的差别，如果多核苷酸正常地编码多肽，那么形成的多肽或者是氨基酸序列没有改变，或者是当具有不同的氨基酸序列时功能仍是完全一样的。

在此所用的“片段”指的是具有与上述的Corin表达控制区及它的变体的部分但不是全部多核苷酸序列完全一样的多核苷酸的多核苷酸。这些片段保留了Corin表达控制区指导与其可操纵地连接的异源性多核苷酸的心脏特异性转录的能力。

“转录起始元件”指的是启动子中特异于RNA聚合酶II的起始位点的序列。转录起始元件可以包括直接起始下游25-35碱基转录的TATA盒，或者起始子元件，它们是定位邻近于转录起始位点本身的序列。真核启动子通常包括转录启动元件以及或启动子近端元件、远端增强子元件或两者。

当参照于例如细胞、核酸、蛋白或载体一起使用的“重组体”代表已经被引入异源性核酸或蛋白或天然核酸或蛋白的变化所修饰的细胞、核酸、蛋白或载体、或来源于被修饰细胞的细胞。因此，例如重组细胞表达在天然形式细胞(非重组细胞)中没有发现的基因或表达不正常表达的、低表达的或根本不表达的天然基因。

“增强子”指的是一种增强转录的DNA调节区。增强子通常是但不总是定位于近端启动子区外，并且可以是定位于离转录起始位点几千碱基对或更远的地方，甚至是在编码序列的3’端或在基因的内含子内。启动子或增强子可以是独立地或组合地参与组织的特异性表达。

“沉默子”指的是一种DNA调节区，当其出现在Corin基因的天然序列中时，它或通过它本身作为慎重(discreet)DNA片段的作用或通过与所述元件结合并实现对基因表达的阴性控制的反式作用因子的作用而造成对启动子引起的转录的抑制。该元件可能在Corin基因的限制性细胞类型表达模式上发挥着重要作用，例如在心肌细胞中表达可能是允许的，其中该沉默子可能是无活性的，但在其它的细胞类型中表达是受限的，其中该沉默子是活化。该元件可以或不可以单独或在异源性启动子构建体中发挥作用。

“分离的”，当指的是例如多核苷酸时，意思是物质被远离于它的原始环境(例如，如果它是天然存在的就指天然环境)，以及与它天然连接的至少一种其它成分分离或分开。例如，存在于它的天然活宿主内的天然存在的多核苷酸不是分离的，但与天然系统中的所有共存物质分开的同一种多核苷酸是分离的。这样的多核苷酸可以是组合物的一部分，并且仍是分离的，这是因为该组合物不是其天然环境的一部分。

“相同性百分比”或相同的百分比，当指的是序列时，意思是在将所述的或所要求保护的序列与要比较的序列进行比对后，将该序列与要求保护的元件或所述的序列进行比较。用数学算法可以完成序列的比较并测定两个序列之间的相同性和相似性百分比。这样的数学算法的优选的非受限的实例被描述于Karlin等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-587中。Altschul等(1997)Nucleic Acid Res.25：3389-3402描述的NBLAST及XBLAST程序(2.0版本)中整合有这样的算法。

在此所用的“高严格性”意思是，例如在含有例如5X SSC、0.5％SDS、100：g/ml变性的鲑精DNA以及50％甲酰胺的杂交溶液中将一印迹与长多核苷酸探针在42℃孵育过夜。然后在高严格性的条件下洗涤印迹，使得发生例如小于5％的碱基错配(例如在0.1x SSC和0.1％SDS 65℃洗涤30分钟两次)，由此选择具有例如95％或更大序列相同性的序列。

当多核苷酸的DNA拷贝被转录为RNA时，该多核苷酸被“表达”。

当多核苷酸与Corin表达控制区在单一分子中的结合造成了多核苷酸的转录，最优选的是心脏特异性的转录(在心肌细胞中)，该多核苷酸是“被可操纵地连接于”Corin表达控制区。

“异源性多核苷酸”指的是除Corin表达控制区以外的多核苷酸，它被可操纵地连接于Corin表达控制区并优选地表达于心脏特异性细胞内。所连接的多核苷酸表达治疗有用的分子，例如多肽、反义RNA。名词“分离的”、“纯化的”、或“生物学纯度”指的是物质基本上或完全游离于在它的天然状态中所见的正常地伴随于它的成分。用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱的分析化学技术通常可以确定纯度及均一性。在制剂中作为主要种类的蛋白基本上已经被纯化。具体地，分离的核酸被位于该基因侧翼的并编码其它蛋白的可读框隔离。名词“纯化的”表示核酸或蛋白在凝胶电泳上只给出一条主要条带。具体地，它指的是核酸或蛋白的纯度是至少85％、更优选的至少95％以及最优选的至少99％。

名词“多肽”、“肽”和“蛋白质”在此可以交替地用于表示氨基酸残基的聚合物。这些名词适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学的模拟物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸的聚合物和非天然存在的氨基酸的聚合物。

名词“氨基酸”指的是天然存在的或合成的氨基酸，以及氨基酸类似物和氨基酸模拟物，它们具有与天然存在的氨基酸相似的功能。天然存在的氨基酸是那些遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物指的是具有与天然存在的氨基酸相同的基础化学结构的化合物，也就是与氢、羧基基团、氨基基团以及R基团结合的碳原子，例如高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这些类似物具有被修饰的R基团(例如正亮氨酸)或被修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相似的基础化学结构。氨基酸模拟物指的是具有与氨基酸的常见化学结构不一样的结构但具有与天然存在的氨基酸相似功能的化合物。

在此氨基酸也可以用它们的熟知的三个字母符号或IUPAC-IUB生物化学标准命名委员会推荐的单个字母符号来表示。同样，核苷酸可以用它们的常用的单个字母符号来表示。

“保守修饰的变体”适用于氨基酸及核酸序列。对于特殊的核酸序列，保守修饰的变体指的是那些编码相同的或基本相同的氨基酸序列的核酸，或者对于不编码氨基酸序列的核酸，指的是基本相同的序列。因为遗传密码子的简并性，对于任何特定的蛋白可有大量功能相同的编码核酸。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在每一个某密码子所具体确定的丙氨酸位点，该密码子可以被变更为任何一种所述的相应的密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变体是“沉默变体”，它是保守修饰的变体的一种。每一种在此的编码多肽的核酸也表示核酸的每一种可能的沉默变体。本领域人员认识到核酸的每一个密码子(除了AUG，它通常是甲硫氨酸的唯一密码子，以及TGG，它通常是色氨酸的唯一密码子)都可被修饰并生成功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每一个沉默变体都包含于每一个所述的序列中。

对于氨基酸序列，本领域人员将认识到，导致在编码的序列中改变、添加或删除单个氨基酸或小部分氨基酸的那些发生于核酸、肽、多肽或蛋白序列中的单个取代、缺失或添加是“保守修饰的变体”，其中的变更造成一种氨基酸被化学性质相似的另一种氨基酸所取代。本领域熟知提供功能相似的氨基酸的保守取代的表。这些保守修饰的变体应加入到本发明的多形变体、物种间同源物以及等位基因中，而不能被排除在本发明以外。

下面8组的每一组都含有能彼此保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；以及

8)半胱氨酸(C)、甲硫氨酸(M)，

见，例如Creighton，Proteins(1984)。

“表达载体”指的是重组或合成产生的核酸构建体，以及一系列容许在宿主细胞中转录特殊核酸的特异性核酸元件。表达载体可以是质粒、病毒或核酸片段的一部分。通常的，表达载体包括被可操纵地连接到表达控制区的所转录核酸，例如Corin表达控制区。

“可药用赋形剂”指的是可药用载体以及任何所需的与生理条件相容的可药用的辅助物质，它们是无毒的且不会对悬浮或包含于其中的药用组合物的生物学活性产生不良影响。适宜的赋形剂可以是例如甘露醇、琥珀酸盐、甘油或血清白蛋白等化合物。

“治疗有效量”指的是当将本发明的化合物施用于所需的对象时，足以在患有心脏病的患者或很可能出现心脏病的患者中实现治疗作用(如下定义)的本发明的化合物的量。构成“治疗有效量”的一种化合物的量将依赖于所述的化合物，但本领域的任何人员根据他自己的知识以及本文的公开可以轻松地确定出这个量。

在此所用的“治疗的”或“治疗”覆盖了心脏的治疗并包括：

(a)预防人发生心脏病，特别是当此人处于这些疾病的易患状态时；

(b)抑制心脏病，即阻止其发展；或

(c)缓解心脏病，即造成病变的消退。

具体实施方案

本发明涉及克隆及鉴定哺乳动物Corin基因(例如，小鼠、人)的表达控制区，包括启动子及其它调节元件，以及涉及该表达控制区在鉴定用于调控Corin基因表达的物质和治疗心脏病的用途。具体地，本发明涉及包括新的Corin表达控制区的多核苷酸以及该控制区指导与其可操纵地连接的异源性多核苷酸的心脏特异性表达的能力。

Corin表达控制区多核苷酸的分离及描述

本发明依赖于重组遗传学领域的常规方法。阐述有本发明所用的常用方法的基础教材包括Sambrook et al.，Molecular Cloning，A LaboratoryManual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：ALaboratory Manual(1990)；以及Ausubel et al，Current Protocols inMolecular Biology(John Wiley and Sons，New York，NY，1994)。

哺乳动物Corin基因的结构

图1描述了人和小鼠Corin基因的结构以及(细菌人工染色体)BAC克隆、重叠群以及含有Corin基因和它们的5’侧翼区的质粒克隆的定位。人与小鼠Corin基因横跨至少200Kb并由22个外显子和21个内含子组成。

Corin cDNA序列预示了一种由大量不同的结构域所构成的蛋白。如图2中图表所示的，蛋白结构域之间的界限几乎完全对应于基因组结构的外显子/内含子界限。外显子1和外显子2的一半编码N末端的胞浆尾部，紧接着的是外显子2的另一半所编码的跨膜结构域。外显子3编码跨膜及第一个卷曲结构域之间的区域。每个卷曲结构域是由两个外显子编码，八个LDLR的每个都由单个外显子编码，以及由三个外显子编码清道夫受体富含半胱氨酸结构域。C末端的蛋白酶结构域是由外显子19到22编码，其中外显子19编码含有蛋白裂解活性位点及催化性组氨酸残基的序列。外显子20和22编码相应地含有其它两个催化残基天冬氨酸及丝氨酸的序列。

Corin表达控制区的克隆

为了克隆人与小鼠的Corin基因和它们的5’侧翼区，合成对应于这些基因的已发表的Corin cDNA序列(Yan et al.(1999)J.Biol.Chem.274：14926-14935)的特异寡核苷酸。在用人或小鼠基因组DNA的基于PCR的反应中，用这些寡核苷酸引物测试扩增特异产物。然后将成功地扩增特异PCR产物的引物对用于基于PCR的筛选方法中，该筛选方法用于鉴定含有人或小鼠Corin基因和/或它们的相应的5’侧翼区的BAC克隆。被鉴定为阳性的BAC克隆或通过鸟枪法直接测序或被亚克隆进pUC118(PanVera/Takara，Madison，WI)中进行测序。用Stagen程序包进行鸟枪序列的装配(Bonfield et al.(1995)Nucleic Acids Res.23：4992-4999)。

用基于PCR的筛选方法获得四个BAC克隆，每两个都含有人与小鼠Corin基因。用鸟枪法测序三个BAC克隆，联合这些序列以及可获得的Trace文档信息( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov：80/Traces/trace.cgi， http：//trace.ensembl.org)用于组装含有人Corin基因的340kb的连续序列，并确定小鼠Corin基因的5个重叠群的序列。对于小鼠Corin基因，通过各个邻近的重叠群内的所存在的一些配对阅读对确认5个重叠群的顺序。这些距离容许我们确定出空隙大小为小于500bp，因为公用的鸟枪文库的插入大小已经被很好的定义。然后分析人及小鼠的Corin基因的结构。然而，340kb的人基因组序列不含有5’侧翼区。从BAC 26540中分离得到的另一个4165bp的Hind III-EcoR I片段包括3919bp的5’侧翼区、所有的外显子1以及内含子1的一部分(已呈交给GenBank^TM/EBI data Bank，编号为AF 521006)。

在此所描述的Corin表达控制区多核苷酸都来源于分离于BAC26540的4165bp的Hind III-EcoR I片段(见图8，SEQ ID NO：2)。用基于PCR的方法、或限制酶消化法或联合这两种方法得到这些表达控制区多核苷酸。用引物F1(5′-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3′)(SEQ ID NO：7)和R1(5′-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3′)(SEQ ID NO：8)从Hind III-EcoR I片段或人基因组DNA中扩增得到4023bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：6)。相似地，用引物F2(5′-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3′)(SEQ ID NO：9)和R1扩增得到1283bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：5)，以及用引物F3(5′-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3′)(SEQ ID NO：10)和R1扩增得到391bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：4)。

可以容易地从中提取出DNA的任何哺乳动物组织例如白细胞都是用于分离哺乳动物Corin表达控制区多核苷酸的基因组DNA的适宜的来源。

功能性的Corin表达控制区多核苷酸

通过将特定的表达控制区多核苷酸可操纵地连接到报告基因上，将构建体转染进心肌细胞中，以及测定特殊的表达控制区多核苷酸序列指导报告基因的心脏特异性转录的能力来测定上述的Corin表达控制区多核苷酸的心脏特异性转录活性。报告基因通常编码具有容易测定的酶活性而且宿主细胞天然不存在的蛋白。常见的真核启动子的报告基因蛋白包括氯霉素乙酰转移酶(CAT)、萤火虫或Renilla萤光素酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸糖苷酶、碱性磷酸酶和绿色荧光蛋白(GFP)。优选的报告基因是萤火虫萤光素酶。

将一个检测Corin表达控制区活性的体系瞬时或稳定转染入培养细胞株。带有与报告基因可操纵地连接的表达控制区多核苷酸的检测载体可以被转染进任何哺乳动物细胞株中用于检测启动子活性；细胞培养、转染及报告基因的方法见于Ausubel et al.(2000)，supra；TransfectionGuide，Promega Corporation，Madison，WI(1998)。通过将检测载体平行地转染心脏源性的细胞株以及非心脏源性的细胞株可以检测Corin控制区多核苷酸的心脏特异性转录活性。通常，与检测载体一起共转染含有已知的启动子所驱动的第二个报告基因的对照载体，例如Sv40早期启动子/增强子驱动的Renilla萤光素酶(pRL-SV40，Promega，Madison，WI)，用于控制不同细胞株之间的转染效率或报告基因转录的差异。

或者，通过直接测定从报告基因转录的RNA量也可以测定出Corin表达控制区多核苷酸所驱动的转录。在这些实施方案中，报告基因可以是任何可转录的已知序列的且宿主细胞所没有表达的核酸。本领域的技术例如mRNA逆转录和扩增、总RNA或poly A⁺RNA的分离、northern印迹法、斑点杂交、原位杂交、RNase保护、引物扩增、高密度多核苷酸阵列检测技术等等可用于分析Corin表达控制区多核苷酸构建体所表达的RNA。

常规地测定相对于对照构建体的Corin控制区多核苷酸序列激活转录的能力。在一个实施方案中，通过比较与Corin表达控制区多核苷酸连接的报告基因的表达和没有与这样的序列连接的同样的报告基因的表达来测定Corin控制区多核苷酸激活转录的能力。因此，在优选的实施方案中，比较pRL-SV40与在萤光素酶基因的5’端插入Corin控制区多核苷酸序列的pRL-SV40之间的萤光素酶的表达(见实施例2，图4)。在其它的实施方案中，可以与已知启动子的活性比较Corin表达控制区多核苷酸的活性。因此，比较了Corin表达控制区多核苷酸驱动的报告基因的活性与特定的启动子所驱动的报告基因的活性(例如，pGL3-对照的SV40启动子/增强子，Promega，Madison，WI)。

通过比较报告基因在心脏源性与非心脏源性细胞中的转录测定Corin表达控制区所指导的转录的心脏特异性。用于测定心脏特异性转录的适宜的心脏源性细胞株是AT-1(Claycomb et al.(1998)Proc.Nafl.Acad.Sci.95：2979-2984)，HL-1(Lanson et al.(1992)Circulation 85：1835-1841)，以及HL-5(Wu et al.(2002)J.Biol.Chem.277：16900-16905)。优选的细胞株是HL-5细胞株。任何容易转染的哺乳动物细胞株都可以用于测定Corin表达控制区在非心脏源性细胞中的活性(例如，HeLa细胞，ATCCNo.CCL2)。在实施例3中(图5)，通过比较具有和不具有这些表达控制区片段的载体在HL-5及HeLa细胞株中的萤火虫萤光素酶的表达来证明人(hCp405LUC)与小鼠(mCp642LUC)Corin表达控制区多核苷酸的心脏特异性活性。对于每一种检测，将Corin表达控制区活性标准化为共转染的SV40启动子活性(即pGL3-对照)来控制不同细胞株之间的变异性。

一旦在Corin表达控制区多核苷酸中证实了心脏特异性的转录活性，可以构建缺失、突变、重排以及其它的序列修饰，并用本发明的方法测定心脏特异性的转录。这些Corin表达控制区多核苷酸的衍生物可用于生成更紧凑的启动子，以减少非心源性细胞的背景表达、消除抑制序列或鉴定新的心脏特异性转录调节蛋白。比较人与啮齿动物的Corin表达控制区序列可以鉴定保守的转录调节元件，包括那些赋予心脏特异性表达的元件。

本领域已知的常规的重组DNA方法可以构建Corin表达控制区的亚片段及衍生物。这些方法可以生成一系列Corin表达控制区序列内的缺失衍生物(实施例2)。通过比较缺失系列的转录活性，可以定位出造成或减弱心脏特异性转录的元件。根据这些分析，可以设计出Corin表达控制区多核苷酸的改良衍生物。例如，Corin表达控制区元件可以与异源性启动子的心脏特异的或通用的调节元件组合以增加Corin表达控制区多核苷酸的心脏特异性或活性。

载体和宿主细胞

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体、用本发明载体遗传学加工的宿主细胞以及重组技术生成的本发明的多肽产物。这些技术被描述于Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Press，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel，F.M.et al.，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1989。

为了可以表达所连接的多核苷酸编码的产物例如Corin，宿主细胞可以被遗传学加工成组合有含有本发明的Corin表达控制区的多核苷酸以及含有与Corin表达控制区可操纵地连接的编码Corin或其它多肽的基因的多核苷酸。利用熟知的感染、转导、转染、转位、转化技术可以将多核苷酸引入到宿主细胞内。可以单独或与其它多核苷酸一起引入多核苷酸。这些其它的多核苷酸可以被单独引入、共同引入或结合到本发明的多核苷酸后引入。

因此，例如利用例如哺乳动物细胞的共转染及选择技术可以将本发明的多核苷酸与另一种编码选择性标记物的单独的多核苷酸一起转染宿主细胞。在这种情况中，多核苷酸通常被稳定地结合于宿主细胞的基因组中。

或者，多核苷酸可以与含有选择性标记物的载体结合并用于在宿主中的繁殖。用前述的技术可以将载体构建体引入到宿主细胞内。通常，质粒载体以沉淀物中的DNA，例如磷酸钙沉淀或与带电荷脂质形成复合物的形式被引入。也可以用电穿孔将多核苷酸引入到宿主中。如果载体是病毒，那么它可以在体外被包装或引入到包装细胞内并且被包装的病毒可以被转导到细胞内。根据发明的这个部分，大量的适合于制备多核苷酸以及将多核苷酸引入到细胞内的技术对于本领域人员是熟知及常规的技术。这些技术在上述引用的Sambrook等中已经被详细地描述，它是许多详细描述这些技术的实验室手册的一个范例。根据本发明的这个方面，载体可以是例如质粒、单链或双链噬菌体载体、单链或双链RNA或DNA病毒载体。用熟知的将DNA和RNA转导进细胞的技术可以将这些载体以多核苷酸，优选的作为DNA形式引入到细胞内。对于噬菌体和病毒载体，用熟知的感染和转导技术也可以将载体以被包装或包裹的病毒的形式转染细胞。病毒载体可以是可复制的或不可复制的。在后一种情况中，病毒传播通常只发生在互补的宿主细胞中。

在某些部分，优选的载体是那些用于表达本发明的多核苷酸及多肽的载体。这些载体通常包括对于表达宿主内与宿主可操纵地连接的需表达的多核苷酸是有效的顺式作用控制区。适宜的反式作用因子或由宿主提供、由互补载体提供或由引入到宿主内的载体本身提供。

用多种已知的及常规的技术中的任何一种技术可以将本发明的Corin表达控制区多核苷酸插入到载体内。一般而言，通过用一种或多种限制性内切酶降解DNA序列和表达载体以及然后用T4 DNA连接酶将这些限制性片段连接在一起，将用于表达的DNA连接到表达载体中。用于这个目的的内切酶限制性及连接的方法对于本领域人员是熟知及常规的技术。这方面的适合的方法以及用其它技术构建表达载体的方法对于这些人员也是熟知及常规的技术，并且在在此引用的Sambrook等中有更多详细的描述。

Corin表达控制区的用途

本发明的Corin表达控制区多核苷酸适用于在心脏源性细胞内特异性表达治疗性分子。治疗性分子的心脏特异性表达可用于例如治疗充血性心衰、高血压以及心脏肥大。因此，含有与本发明的Corin表达控制区多核苷酸可操纵地连接的治疗性多核苷酸的载体可以被构建并被施用于患者以治疗心脏病及发展新的和改进的治疗方法。

任何治疗性多核苷酸都可以被可操纵地连接于Corin表达控制区多核苷酸，包括但不限定于表达Corin的多核苷酸。通常，Corin表达控制区多核苷酸包含于表达盒内并插入于所表达的治疗性多核苷酸的5’端。Corin表达控制区多核苷酸可以被定位于非常接近于治疗性多核苷酸的位置，尽管Corin表达控制区多核苷酸增强子元件可以定位于治疗性多核苷酸的数千碱基内的任何位置，包括治疗性多核苷酸的3’末端以及内含子中。通过将Corin表达控制区多核苷酸以相对于报告基因的合适的构型定位并如在此所描述的检测心脏特异性报告基因的活性可以验证给定位点的Corin表达控制区多核苷酸赋予心脏特异性表达的能力。

Corin表达控制区多核苷酸可以被直接连接于编码治疗性分子的多核苷酸，且不需要附加序列。在Corin表达控制区多核苷酸不包括Corin表达起始元件的实施方案中，应当提供例如TATA盒及转录起始位点的附加元件。这些元件可以是治疗性基因的天然转录元件，也可以是来源于异源性真核或病毒启动子的元件。例外，只要保留心脏特异性的表达(如本发明的检测所测定的)，通过包含来自治疗性基因或来自异源性基因的增强子和多腺苷酰化序列可以增加治疗基因的表达水平。

在Tang et al.(2002)Methods 28：259-266；Philips et al.(2002)Hypertension 39：651-655；Prentice et al.(1997)Cardiovas.Res.35：567-574；Beggah AT et al.(2002)PNAS 99：7160-7165；Monte et al.(2003)J.Physiol.546：49-61中可以发现体外和体内转染心脏源性细胞的载体、确保体内心脏源性细胞内的持续表达的方法、将治疗性多核苷酸可操纵地连接于心脏特异性启动子的方法、以及体外或体内将载体靶向于心脏细胞的方法、施用途径以及用治疗性载体治疗心脏病的剂量。

因此，本发明的Corin表达控制区多核苷酸可以用于心脏特异性表达各种治疗性多核苷酸。Corin表达控制区多核苷酸所表达的治疗性多核苷酸是活性多核苷酸本身(例如反义及催化性多核苷酸)或编码具有治疗作用的蛋白的多核苷酸。

反义及催化性核糖核苷酸的表达

可以被Corin表达控制区多核苷酸所表达的治疗性多核苷酸的一种类型是反义RNA或RNA(Fire，A.(1999)Trends.Genet 15：358-363；Sharp，P.(2001)Genes Dev.15：485-490)。在这些实施方案中，Corin表达控制区多核苷酸被可操纵地连接于多核苷酸，该多核苷酸被细胞内RNA聚合酶转录后能与靶mRNA结合。在例如Stein & Cohen(1988)Cancer Res.48：2659-68和van der Krol et al.(1988)Bio Techniques 6：958-76中描述了根据编码靶蛋白的cDNA序列的反义序列的衍生物。靶蛋白通常是一种它的存在被认为是造成了或增加了心脏病的机会的蛋白，例如血管紧张素转化酶、血管紧张素II受体或NF-ATC(Stein et al.(1998)Amer.Heart J.135：914-923；Levin et al.(1998)New Eng.J.Med.339：321-328；Keating andGoa(2003)Drugs 63：47-70)。因此，反义分子的心脏特异性表达可以优选地减少这些蛋白在高危个体中的表达。已经描述了心脏特异性的反义分子表达的成功应用(Beggah AT et al.(2002)PNAS 99：7160-7165)。这些利用心脏特异性表达的方法已经证实在治疗心脏纤维化及心衰上是成功的(Lee et al.(1966)Anticancer Res.16：1805-11)。

除了反义多核苷酸，可以设计核酶以抑制靶分子的表达。核酶是一种能催化地降解其它RNA分子的RNA分子。因此，通过将编码核酶的多核苷酸连接于Corin表达控制区多核苷酸，可以用本发明的Corin表达控制区多核苷酸在心脏源性细胞内特异性地表达核酶。已经描述了不同类型的核酶，包括I组核酶、锤头状核酶、发夹状核酶、RNase P、以及斧头状核酶(axhead ribozyme)(见，例如Castanotto et al.(1994)Adv.inPharmacology 25：289-317对不同核酶特性的综述)。在例如Hampelet al.(1990)Nucl.Acids Res.18：299-304；Hampel et al.，欧洲专利文件No.0 360257(1990)；美国专利No.5,254,678中描述了发夹状核酶的常见特性。制备核酶的方法对于本领域人员是熟知的(见，例如Wong-Staal et al.，WO 94/26877；Ojwang et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6340-44；Yamada et al.(1994)Hum.Gene Ther.1：39-45；Leavitt et al.(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：699-703；Leavitt et al.(1994)Hum.Gene Ther.5：1115-20；和Yamada et al.(1994)Virology 205：121-26)。

治疗性蛋白的表达

很多种治疗性蛋白可以用于治疗心脏病。因此，可以用本发明的Corin表达控制区多核苷酸在心脏细胞内特异性地表达编码治疗性蛋白的多核苷酸。治疗性蛋白可以是原核、真核、病毒或合成来源的蛋白。当治疗性蛋白不是哺乳动物来源时，根据本领域已知的方法(例如，哺乳动物密码子选择及同一转录起始位点)可以将蛋白的编码序列修饰为最大化的哺乳动物的表达。

可以将治疗性蛋白可操纵地连接于Corin表达控制区多核苷酸，使得可以进行心脏特异性的表达并被成功地应用于治疗各种病因的心脏病，包括(但不限定于)缺血性心脏病、高血压心脏病、瓣膜性心脏病、心肌炎、Chagas心肌病和特发性心肌病。这些治疗性蛋白包括但不限定于例如Corin的蛋白，它将心房肽前体(pro-ANP)转化为ANP以及B型利钠肽，ANP通过促进钠的排泄以及血管扩张来降低血容量和血压。

Corin表达调控物的鉴定

可以用本发明的Corin表达控制区多核苷酸鉴定新的调控物，它们可用于控制哺乳动物尤其是人的心脏相关性疾病，实例包括心血管性高血压、充血性心衰或心肌病。这些调控物可用于治疗具有异常水平的Corin基因表达的宿主。也可以用Corin基因调控物治疗Corin基因表达的水平所影响的疾病和病变，例如但不限定于机械性牵拉、血容量、盐排泄、尿量以及血管舒缩张力。调控物也可用于治疗动物的与所选定的多肽的表达水平相关的模拟人的疾病或病变。

具体地，通过物质所造成报告基因的转录水平变化的能力可以鉴定出结合并调控这些表达的物质，报告基因例如萤光素酶，如前所述它被可操纵地连接于Corin表达控制区多核苷酸(见实施例2)。

上述方法中所测定的物质可以被随机地选择或有目的地选择或设计。如在此所用的，当不考虑任何特异的序列随机地选择物质时，物质被认为是被随机选择的。随机选择的物质的实例是化学文库或生物体的生长培养基或植物提取物(Bunin，et al.(1992)J.Am.Chem.Soc.114：10997-10998，在此一同并入参考)。

如在此所用的，当考虑靶位点的序列和/或其与物质作用相关的构象从非随机的基库中选择物质时，物质被认为是被有目的选择或设计的。

基因治疗

本发明提供了可以被转染到细胞内用于体外和体内治疗目的的Corin表达控制区多核苷酸。这些核酸可以被插入到大量的用于转染如下所述的靶细胞和生物体的熟知载体中的任何一个载体中。通过载体与靶细胞之间的相互作用，可以将核酸体内或体外转染到细胞内。通常，Corin表达控制区多核苷酸与第二种治疗有用的多核苷酸的可操纵地连接造成了第二种多核苷酸的心脏特异性的表达。将足量的组合物施用于患者以引发患者的治疗反应。达到这点的足够多的量被称为“治疗有效剂量或治疗有效量”。

这些基因治疗方法已经被用于纠正获得性或先天性遗传缺陷、肿瘤和病毒感染等等。在人体中表达治疗有用的人工基因的能力有助于许多重要的人类疾病的预防和/或治愈，这些疾病包括许多其它治疗方法所不能治疗的疾病(基因治疗方法的综述，见Anderson(1992)Science 256：808-13；Nabel & Felgner，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.211-17；Mitani &Caskey，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.162-66；Mulligan，Science(1993)，Vol.260，pp.926-32；Dillon，TIBTECH(1993)，Vol.11，pp.167-75；Miller，Nature(1992)，Vol.357，pp.455-60；Van Brunt，Biotechnology(1998)，Vol.6，pp.1149-54；Vigne，Restorative Neurol.Neurosci.(1995)，Vol.8，pp.35-36；Kremer & Perricaudet，British Medical Bulletin(1995)，Vol.51，pp.31-44；Haddada et al.，in Current Topics in Microbiology and Immunology(Doerfler& Bohm eds.，1995)；以及Yu et al.，Gene Therapy(1994)，Vol.1 pp.13-26)。

将基因或遗传物质转移到细胞内是基于基因治疗的疾病治疗的第一步。本领域人员熟知大量转移方法。优选的，施用核酸以用于体内或体外基因治疗的用途。非病毒载体转移体系包括DNA质粒、裸核酸以及与转移微粒例如脂质体复合的核酸。病毒载体转移体系包括DNA和RNA病毒，它在转移进细胞后可以是游离或整合于基因组中。

核酸的非病毒转移的方法包括脂染、微注射、biolistics、病毒核蛋白颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质：核酸结合体、裸DNA、人工病毒颗粒以及物质强化的DNA摄取。在例如美国专利No 5,049,386、4,946,787和4,897,355中描述了脂染，脂染试剂是可商业化获得的(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适合用于多核苷酸的有效的受体识别脂染的阳离子及中性脂质包括Felgner在WO 91/17424和WO 91/16024中所述的那些。可以转移到细胞(体外施用)或靶组织(体内施用)。

本领域人员熟知脂质：核酸复合物的制备，包括例如免疫脂质复合物的靶向脂质体(见例如，Crystal，Science(1995)，Vol.270，pp.404-10；Blaese et al.，Cancer Gene Ther.(1995)，Vol.2，pp.291-97；Behr et al.，Bioconjugate Chem.(1994)，Vol.5，pp.382-89；Remy et al.，BioconjugateChem.(1994)，Vol.5，pp.647-54；Gao et al.，Gene Therapy(1995)，Vol.2，pp.710-22；Ahmad et al.，Cancer Res(1992)，Vol.52，pp.4817-20；美国专利Nos.4,186,183、4,217,344、4,235,871、4,261,975、4,485,054、4,501,728、4,774,085、4,837,028和4,946,787)。

使用用于转移核酸的基于RNA或DNA病毒的体系的优点是将病毒靶向于体内的特异细胞并将病毒载量加入到核内的高度进化的过程。可以直接将病毒载体施用于患者(体内)或可以将病毒载体体外处理细胞并将经修饰的细胞施用于患者(体外)。用于转移核酸的常规的基于病毒的体系包括用于基因转移的逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒以及单纯疱疹病毒的载体。目前病毒载体是最有效的和用途广泛的靶细胞与组织的基因转移的方法。用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法可以整合于宿主基因组中，常造成插入的转基因的长期表达。另外，在许多不同的细胞类型和靶组织中观察到了较高的转导效率。特别地，目前至少有六种病毒载体方法正被用于基因转移的临床试验，至今逆转录病毒载体是应用最为广泛的体系。所有的这些病毒载体都利用涉及插入到辅助细胞株的基因对缺陷载体的互补作用并生成转导物质的方法。

通过结合外源性的包被蛋白可以改变逆转录病毒的向性，扩展潜在靶向的靶细胞群。慢病毒载体是能转导或感染非分裂细胞病通常能生成高病毒滴度的逆转录病毒载体。因此，对逆转录病毒转移体系的选择将依赖于靶组织。逆转录病毒载体由具有包装最大到6-10kbp外源序列的能力的顺式作用长末端重复构成。最小的顺式作用LTR作用于载体的复制和包装，然后它被用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久的转基因表达。被广泛使用的逆转录病毒载体包括那些基于小鼠白细胞病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、猿免疫缺陷病毒(SIV)、人免疫缺陷病毒(HIV)以及它们的组合载体(见例如Buchscher et al.，J.Virol.(1992)，Vol.66，pp.2731-39；Johann et al.，J.Virol.(1992)，Vol.66，pp.1635-40；Sommerfelt et al.，Virology(1990)，Vol.176，pp.58-59；Wilson et al.，J.Virol.(1989)，Vol.63，pp.2374-78；Miller et al.，J.Virol.(1991)，Vol.65，pp.2220-24；PCT/US94/05700)。

pLASN和MFG-S是已经应用于临床试验的逆转录病毒的实例(Dunbar et al.，Blood(1995)，Vol.85，pp.3048-57；Kohn et al.，Nat.Med.(1995)，Vol.1，pp.1017-23；Malech et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1997)，Vol.94，pp.12133-38)。PA317/pLASN是第一个应用于基因治疗试验的治疗性载体(Blaese et al.，Science(1995)，Vol.270，pp.475-80)。在MFG-S包装的载体中观察到了50％或更高的转导效率(Ellem et al.，Immunol.Immunother.(1997)，Vol.44，pp.10-20；Dranoff et al.，Hum.Gene Ther.(1997)，Vol.1，pp.111-23)。

在优选为核酸的瞬时表达的申请中，常使用基于腺病毒的体系。基于腺病毒的体系在许多细胞类型中都具有非常高的转导效率并且不需要细胞分裂。用这些载体，已经获得高滴度及高水平的表达。在相对简单的体系中可以大量生产这种载体。腺相关病毒(“AAV”)也用于靶核酸的细胞转导，例如在核酸及肽的体外生产，以及体内及体外基因治疗方法中(见，例如West et al.，Virology(1987)，Vol.160，pp.38-47；美国专利No.4,797,368；WO 93/24641；Kotin，Hum.Gene Ther.(1994)，Vol.5，pp.793-801；Muzyczka，J.Clin.Invest.(1994)，Vol.94，pp.1351)。在大量文献中都描述了重组AAV载体的构建，包括美国专利No.5,173,414；Tratschinet al.，Mol.Cell.Biol.(1985)，Vol.5，pp.3251-60；Tratschinet al.，Mol.Cell.Biol.(1984)，Vol.4，pp.2072-81；Hermonat & Muzyczka，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.(1984)，Vol.81，pp.6466-70；以及Samulski et al，J.Virol.(1989)，Vol.63，pp.3822-28。

重组腺相关病毒载体(rAAV)是一种基于缺陷的及非致病性的细小病毒2型腺相关病毒的有前途的可选择的基因转移体系。所有载体都来源于一个质粒，它只保留了转基因表达盒一侧的AAV 145bp的反向末端重复。因为整合进所转导细胞的基因组内所具有的有效的基因转移及稳定的转基因转移是这种载体体系的重要特点(Wagner et al，Lancet(1998)，Vol.351，pp.1702-03；Kearnset al.，Gene Ther.(1996)，Vol.9，pp.748-55)。

复制缺陷重组腺病毒载体(Ad)主要被用于瞬时表达的基因治疗，因为它们可以被高滴度地生成并且它们容易感染多种不同的细胞类型。绝大多数腺病毒载体被加工成转基因取代了Ad E1a、E1b和E3基因；随后在人293细胞中扩增复制缺陷载体，该细胞反式提供了被删除基因的功能。Ad载体可以体内转导多种类型的组织，包括例如在肝脏、肾脏和肌肉系统组织中所发现的非分裂的、已分化的细胞。传统的Ad载体具有很大的携带能力。Ad载体在临床试验上应用的一个实例包括多核苷酸治疗用于肌肉注射的抗肿瘤接种免疫(Stermanet al.，Hum.Gene Ther.(1998)，Vol.9，pp.1083-92)。腺病毒载体在基因转移的临床试验中的应用的实例还包括Rosenecker et al.，Infection(1996)，Vol.241，pp.5-10；Welsh et al.，Hum.Gene Ther.(1995)，Vol.2，pp.205-18；Alvarez et al.，Hum.Gene Ther.(1997)，Vol.5，pp.597-613；Topf et al.，Gene Ther.(1998)，Vol.5，pp.507-13；Stermanet al.，Hum.Gene Ther.(1998)，Vol.9，pp.1083-89。

在许多基因治疗的应用中，需要的是基因治疗载体的转运应具有对特殊组织类型的高度特异性。通过在病毒的外表面表达一个作为与病毒包膜蛋白的融合蛋白的配基，通常可将病毒载体修饰为具有对特定细胞类型的特异性。所选择的配基具有对目标细胞类型中存在的已知受体的亲和力。例如，Han et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)，Vol.92，pp.9747-51报告，Moloney小鼠白血病病毒可以被改造成表达与gp70融合的Heregulin，该重组病毒感染特定的表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。这个原理可被扩展到其它对的表达配基融合蛋白的病毒与表达受体的靶细胞。例如，丝状噬菌体可以被加工成展示具有对任何所选定的细胞受体的特异性结合亲和力的抗体片段(例如，Fab或Fv)。尽管上述的方法主要应用于病毒载体，但是相同的方法也可以应用于非病毒载体。这些载体可以被加工成具有被认为能有利于特殊的靶细胞摄取的特殊摄取序列。

药用组合物及施用

本发明也涉及药用组合物，它可以包括联合有可药用载体的Corin表达控制区，或含有表达控制区的载体。在本发明的一个实施方案中，可药用载体是药学惰性的载体。

通过施用可以将基因治疗载体体内转运到个体患者中，经常通过全身施用(例如，静脉内、腹腔内、肌肉内、皮下或颅内灌注)或局部施用，如下面所描述的。同样可以将载体体外转运到细胞内，例如从个体患者中取得的细胞(例如淋巴细胞、骨髓穿刺物、组织活检物)或通用供体的造血干细胞，紧接着将细胞重新移植到患者体内，这通常是在选择出已经整合有载体的细胞之后。

本领域人员熟知用于诊断、研究或基因治疗的体外细胞转染方法(例如，通过将转染细胞重新输注到宿主体内)。在优选的实施方案中，从对象生物体中分离出细胞，用核酸(基因或cDNA)转染细胞，将细胞重新输注回对象生物体内(例如患者)。本领域人员熟知各种适用于体外转染的细胞类型(见，例如Freshney et al.，Culture of Animal Cells，A Manual ofBasic Technique(3rd ed.，1994)，以及其中所引用的关于如何从患者中分离及培养细胞的讨论的参考文献)。

也可以将用于体内转导细胞的含有治疗性核酸的载体(例如，逆转录病毒、腺病毒、脂质体等)直接施用于生物体。同样，可以施用裸DNA。通过任何正常地用于将分子引入与血液或组织细胞最后接触的途径施用。适合于施用这些核酸的方法是可获得的并且是为本领域人员所熟知的，尽管多于一种途径可用于施用特殊的组合物，但一种特殊的途径常比另一种途径提供更迅速及更有效的反应。

所施用的具体的组合物(例如，核酸、蛋白、调控化合物或转导细胞)以及用于施用组合物的具体方法部分地决定了所用的可药用载体。因此，有很多种本发明的药用组合物的适宜制剂(见，例如Remington’sPharmaceutical Sciences，17^th ed.，1989)。施用可以是任何便利的方式，例如经注射、口服施用、吸入或经皮使用。

适合于口服施用的制剂包括：(a)液体溶液，例如悬浮于稀释液的有效量的被包装的核酸，稀释液例如水、盐水或PEG 400)；(b)胶囊、粉剂或片剂，每种都含有设定量的为液体、固体、颗粒或凝胶的活性成分；(c)适宜液体中的悬浮液；以及(d)适宜的乳剂。片剂形式可以包括一种或多种乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、和其它赋形剂、显色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、湿化剂、防腐剂、调味剂、染料、分解剂和药用相容性载体。除了活性成分外，糖锭形式可以包括有味道的活性成分，例如蔗糖，以及含有惰性基底的活性成分的药片，例如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶乳剂、凝胶，以及本领域已知的载体的类似物。

所选定的组合物单独或与其它适宜的成分一起可以被通过制成吸入施用的气雾剂制剂(即，它们可以被“雾化”)。气雾剂制剂可以被放置于被压缩的可用的推进剂中，例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等等。

适合于例如经关节(关节内)、静脉内、肌肉内、皮内、腹腔内、皮下途径施用的肠外施用的制剂包括水性和非水性、等渗无菌注射溶液，它可以包括抗氧化剂、缓冲液、抑菌剂和使得制剂与预计受体的血液等渗的溶剂；以及水性和非水性无菌悬浮液，它可以包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在本发明的实践中，例如可以经静脉内输注、口服、局部、腹腔内、膀胱内、鞘内施用组合物。肠外施用以及静脉内施用是优选的施用方法。组合物的制剂放置在单剂量或多剂量的密封容器中，例如安瓿和小药瓶。

可以从前述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备出注射溶液和悬浮液。如上述也可以经静脉内或肠外施用用于体外治疗的核酸所转导的细胞。

在本发明的范围内，施用于患者的剂量应当足够给患者造成长时间的有益治疗反应的剂量。剂量由所采用的具体载体的效率和患者的条件、以及所治疗的患者的体重或体表面积所决定的。剂量的大小也由施用具体载体所伴随的任何副作用的出现、性质以及严重程度、或具体患者的转导细胞的类型所决定的。

在决定所施用的载体的有效量中，医生评估载体的血浆水平、载体毒性、疾病进展以及抗载体抗体的生成。通常的，对于常规的70公斤的患者，与之相当的载体的裸核酸的剂量是约1μg到100μg，并计算出包括逆转录病毒颗粒的载体的剂量以得到相当剂量的治疗性核酸。

对于施用，本发明的化合物和转导细胞可以以一定的速度被施用，该速度是由抑制剂、载体或转导细胞类型的LD50、和不同浓度的抑制剂、载体或细胞类型的副作用，如患者的体重和总的健康状况所决定的。可以通过单一剂量或分次剂量施用。

试剂盒

本发明进一步涉及药用包装和试剂盒，包括一个或多个装有一种或多种上述的本发明的组合物的成分的容器。与这些容器相关的是管理药品或生物制品的生产、使用或销售的政府部门所规定的通告形式，这反映了施用人的产品的生产、使用或销售的管理机构的认证。

转基因小鼠

本发明的Corin表达控制区多核苷酸也可用于生产转基因哺乳动物，优选的是转基因小鼠。这些转基因生物体可用于，例如鉴定和/或描绘调控这样的多核苷酸的表达和/或活性的物质。转基因动物也可用作心脏病变的模型。在此阐述的发明也涉及非人的转基因动物，在其基因组中包括一个或多个本发明的多核苷酸的拷贝。本发明的转基因动物可以在它们的基因组中包含有多个多核苷酸的拷贝。

在一个优选的实施方案中，转基因动物在它的基因组中包含有人Corin基因的表达控制区。本发明包括各种非人的转基因生物体，例如果蝇、C.elegans、斑马鱼和酵母。本发明的转基因动物优选的是哺乳动物，例如牛、山羊、绵羊、兔、非人的灵长类动物、或大鼠，最优选的是小鼠。

生产转基因动物的方法对本领域人员是熟知的，并包括例如同源重组、突变(例如，ENU，Rathkolb et al.(2000)Exp.Physio.，85：635-644)，和四环素调节的基因表达体系(例如，美国专利No.6,242,667)，在此没有被详细描述(见例如，Wu et al，Methods in Gene Biotechnology，CRC1997，pp.339-366；Jacenko，O.，Strategies in Generating Transgenic Animals，in Recombinant Gene Expression Protocols.Vol.62 of Methods in MolecularBiology，Humana Press，1997，pp 399-424)。

本发明也涉及非人的基因敲除动物，其基因组包含有与报告基因序列可操纵地连接的人Corin的表达控制区，其中所述的控制区能有效地启动、终止或调节报告基因序列的转录。

用任何有效的方法可以完成与控制序列可操纵地连接的报告基因序列的功能裂解，包括将终止密码子引入到编码序列的任何部分，使得所形成的多肽是生物学无活性的(例如，因为它缺少催化结构域、配体连接结构域等)；将突变引入到启动子或其它调节序列中，使得能有效地终止转录，或减少外源序列的报告基因序列转录成使之失活的报告基因序列。具有功能性裂解基因的转基因动物的实例是熟知的，例如在美国专利No.6,239,326、6,225,525、6,207,878中所描述的。

不需要进一步的推敲，相信本领域人员可以利用前面的描述最大限度地应用本发明。所有的实施例都利用标准技术进行，这些技术在本领域是熟知的，除其它详细说明的技术外。

如在标准的实验室手册例如Sambrook et al.，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，2^ndEd.；Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，1989中描述的实施下面实施例的常规的分子生物学技术。

因此，下面优选的特殊的实施方案只作为举例说明，无论如何都不是对发明的剩余内容的任何形式的限制。在此一同并入上面所引用的所有申请书、专利和文献的全部内容作为参考。

实施例1：包括5’侧翼区的人与小鼠的Corin基因的分离和描述

为了克隆人和小鼠的Corin基因以及它们的5’侧翼区，合成了与Corin cDNA序列的5’和3’末端相对应的特异的寡核苷酸。在利用人或小鼠基因组DNA的基于PCR的反应中，用这些寡核苷酸引物尝试扩增特异产物。用PCR试剂体系(Life Technologies Inc)进行PCR反应，为30个扩增周期(94℃变性1分钟，50℃退火1分钟，以及72℃延伸1分钟)和最后的72℃延伸7分钟。然后在基于PCR的筛选中用成功扩增特异PCR产物的引物对鉴定含有人或小鼠Corin基因和/或它们的表达控制区的BAC克隆。根据厂家说明书(Incyte Genomics，Palo Alto，CA)进行BAC克隆的DNA分离。用利用32P标记的人和小鼠Corin DNA探针的southern印迹分析进一步确认经鉴定为阳性的细菌人工染色体(BAC)克隆。将BAC克隆直接用鸟枪法测序或将其亚克隆到pUC118(PanVera/Takara，Madison，WI)内进行测序。用Staden软件包进行鸟枪序列的组装(MRC Laboratory of Molecular Biology；Bonfield et al.(1995)Nucleic Acid Res.23：4992-4999)。

用基于PCR的筛选得到四个BAC克隆，每两个都含有人和小鼠Corin基因。采用染料末端化学法，以鸟枪法测序三个BAC克隆。联合鸟枪法数据与公开获得的Trace文档信息( http：//www.ncbi.nlm.nih.gov：80/Traces/trace.cgi， http：//trace.ensembl.org)，装配含有人Corin基因的340kb的连续序列和小鼠Corin基因的5个重叠群。通过相应的邻近重叠群中存在的一些配对的阅读对确认5个重叠群的顺序。这些重叠群的距离使得我们可以确定间隔大小小于500bp，因为公用鸟枪文库的插入大小已经被很好的定义。然后分析人和小鼠Corin基因的结构。然而340kb的人基因组序列没有包含5’侧翼区。从BAC26540中分离得到另外的4165bp的Hind III-EcoR I片段，它包括5’侧翼区的最初的3919bp碱基、外显子1以及内含子1的部分碱基对(提交于GenBank^TM/EBI数据库，编号为AF 521006)。

利用基于PCR的方法、或限制性酶切方法、或联合于两者，Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6)都来源于从BAC 26540中分离到的4165bp的Hind III-EcoR I片段(图8，SEQ ID NO：2)。例如，用引物F1(5′-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3′)(SEQ ID NO：7)和R1(5′-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3′)(SEQ ID NO：8)从4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因组DNA中扩增得到在此所述的4023bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：6)。用引物F2(5′-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3′)(SEQ ID NO：9)和R1从4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因组DNA中扩增得到在此所述的1283bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：5)。用引物F3(5′-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3′)(SEQ ID NO：10)和R1从4165bp Hind III-EcoR I片段或人基因组DNA中扩增得到在此所述的391bp的Corin表达控制区多核苷酸(SEQ ID NO：4)。任何从中容易提取出DNA的哺乳动物组织都是用于分离哺乳动物Corin多核苷酸的基因组DNA的适宜来源。

实施例2：5’侧翼区的启动子活性

通过制备人或小鼠的Corin基因的5’侧翼序列的连续的截断片段与无启动子的萤光素酶基因相连接(见图4A)的报告基因构建体测定Corin基因的5’侧翼区的启动子活性。分两步产生人Corin启动子报告基因构建体，hCp1297LUC(与萤火虫萤光素酶基因相连的1283bp的Corin表达控制区(SEQ ID NO：))以及hCp405LUC(与萤火虫萤光素酶基因相连的391bp的Corin表达控制区(SEQ ID NO：))：首先，用具有Sac I和Hind III的限制性位点的引物相应地PCR克隆-1297或-405到-15的人Corin基因的5’侧翼区；以及第二步，将相应的PCR产物插入到pGL3基本载体(Promega，Madison，WI)的Sac I和Hind III位点中。

相似地，用上述的PCR克隆方法制备小鼠Corin启动子构建体，mCp1183LUC、mCp809LUC和mCp646LUC。用EndoFree Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)制备这些构建体的质粒。根据厂家的说明书用基于Lipofectin的方法进行对HL-5细胞的转染(Claycomb et al.(1998)Proc.Nati.Acad.Sci.，USA 95：2979-2984)。简要的，将10μg每种Corin报告基因构建体的DNA加上0.1μg pSL-SV40与1ml含有20μgLipofectin的OPTI-MEM I低血清培养基(reduced-serum medium)混和。在室温下孵育混合物30分钟，然后将混合物加入到培养于6孔板的一个孔内的70％融合的HL-5细胞中。孵育6个小时后，用新鲜的Ex-Cell 320培养基替换培养基，30小时后，收集转染细胞并测定萤火虫及Renilla萤光素酶活性。根据厂家的说明书(Promega)进行二次萤光素酶活性测定。简要的，通过用250μl新稀释的被动裂解缓冲液(Promega)裂解转染细胞制成细胞提取物。在13,000rpm离心5分钟去除细胞碎片之前将裂解物冻融1次。将上清液转移到新的试管中，用二次萤光素酶报告基因检测体系测定20μl上清液。用微量板发光计数器LB96 V(EG&Berthold)监测标本的荧光强度，它测定了10秒间期内的光产物(相对发光值)。每种细胞提取物重复测定三次。每种构建体的每个转染试验重复三次。将萤火虫萤光素酶活性标准化为Renilla萤光素酶活性。

如图4B所示，人Corin报告基因构建体hCP1297LUC和hCP405LUC所启动的萤光素酶活性要显著地高于pGL-3基础转染细胞的背景活性。同样，小鼠报告基因构建体mCp1183LUC、mCp809LUC和mCp646LUC产生了比得上人构建体所启动的显著的荧光素活性。这些数据说明负责大多数启动子活性的顺式作用序列相应地定位于人和小鼠Corin基因的-405到-15核苷酸或-646到-77核苷酸之间。

实施例3：心脏特异性表达的验证

为了验证这些构建体是否介导心脏特异性表达，用所述的构建体转染不表达Corin mRNA和蛋白的HeLa细胞(ATCC，No.CCL2)。与hCp405LUC和mCp646LUC构建体在HL-5细胞中的高活性相反，它们在HeLa细胞中只有很小的启动子活性(图5)。作为对照，同步转染的pRL-SV40在HeLa中比在HL-5细胞中启动了更高水平的Renilla萤光素酶活性，说明在这些试验中HeLa细胞和HL-5细胞一样容易被转染。这些结构说明从-405到-15的人Corin基因的5’侧翼序列或从-646到-77的小鼠Corin基因的5’侧翼序列含有足以在培养的心肌细胞中进行特异性表达的元件。

实施例4：与GATA-4结合的近端GATA元件对于Corin启动子的最佳功能是必需的

从人-405到-15核苷酸或从小鼠-646到-77核苷酸的5’侧翼区能启动培养的心肌细胞而不是HeLa细胞内的高水平的基因表达。这说明这些区域含有负责进行心肌特异性表达的调节元件。对这些区域的观察发现了保守的GATA共有序列(称为近端GATA序列)。

为了确定近端GATA序列是否真的结合于GATA蛋白，我们如前所述的从指数生长的HL-5细胞中制备出核提取物(Schreiber E.et al.，(1989)Nucleic Acids Res.17：6419)，并用已经被描述过的共有GATA寡核苷酸探针(Redondo，J.M.et al.(1990)Science 247(4947)，1225-9)以及含有每种近端GATA序列(图6A)的探针进行电泳迁移率改变分析(EMSA)。含有两个共有GATA序列或突变的GATA序列(从GATA到CTTA)的双链寡核苷酸探针购自Santa Cruz Biotechnology。合成并HPLC纯化含有人或小鼠Corin GATA(相应地为SEQ ID NO：11和13)、或突变的人和小鼠Corin GATA(从GATA到CTTA)(相应地为SEQ ID NO：12和14)的探针序列。利用[γ-³²P]ATP(3000Ci/mmol，Amersham Pharmacia Biotech)，以T4多核苷酸激酶(Life Techologies)进行寡核苷酸的5’末端标记。如前所述的进行胶迁移率改变分析(Pan，J.& McEver R.P.(1993)J.Biol.Chem.268：22600-22608)。与设想的一样，当标记的共有GATA探针(SEQ ID NO：15)与HL-5细胞的核提取物一起孵育时，它形成了序列特异性的DNA-蛋白复合物(图6B)。加入100倍过量的未标记探针阻止了该复合物的形成，而无关的GAS元件没有阻断这种形成。复合物的形成依赖于完整的GATA序列，因为GATA序列的突变中断了复合物的形成。而且，在存在100倍过量的含有人或小鼠近端GATA序列的标记探针时，没有检测到复合物。相反的，100倍过量的含有突变的近端GATA序列(SEQ ID NO：12和14)的标记探针对复合物形成只有很小的影响。这些数据说明Corin近端GATA序列以及共有的GATA探针与常见的GATA蛋白结合。

为了确定复合物涉及哪种GATA蛋白，我们在存在抗GATA家族成员的抗体时，用标记的共有GATA探针进行EMSA。抗小鼠GATA-1(SC-1234x)、GATA-3(SC-268x)、GATA-4(SC-12237x)和GATA-6(SC-7244x)抗体都来自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。如图6C所示，抗GATA-4抗体显著地抑制了复合物的形成，而抗GATA-1、-3和-6抗体几乎没有这种作用。为了直接确认GATA-4与近端GATA序列的结合，我们在不存在或存在相同的抗GATA-4抗体时使用标记的人近端GATA探针。如图6D所示，抗GATA-4抗体完全抑制了与用共有GATA探针形成的复合物相同迁移率的DNA-蛋白复合物的形成。这些数据说明GATA-4与近端GATA序列结合，提示GATA-4与近端GATA序列的结合可能造成Corin在心肌细胞中的基因表达。

为了验证近端GATA元件是否是启动子活性所必需的，我们将启动最高启动子活性的人或小鼠构建体中的野生型序列AGATAA突变成ACTTAA(图7)。用重叠PCR方法(Ho S.N.et al.，(1989)Gene(Amst)77：51-59)构建突变构建钵hCp405mutGATA和mCp646mutGATA。简要的，用一个反义或有义突变的GATA寡核苷酸和一个外引物(outside primer)生成两个单独的PCR产物，每一个产物是杂交产物的一半。纯化两种产物并混和。然后用两种外引物进行第二次PCR。用Sac I和Hind III消化PCR产物并连接到用Sac I和Hind III消化的pGL3-基础载体上。用限制性酶切图和DNA测序确认所有的构建体。GATA元件的突变与在EMSA中所用的突变GATA探针中的突变一样。当突变构建体转染进HL-5细胞时，与它们的相应的野生型序列比较，人和小鼠突变构建体具有10％或42％启动子活性。这些结果说明近端GATA元件对于培养的心肌细胞内的人或小鼠Corin基因的组成型表达是必需的。

通过替换在前述的实施例中所使用的一般或具体描述的本发明的试剂和/或操作条件可以重复出同样成功的上述实施例。

虽然本发明被描述为关于人或小鼠Corin基因的新的表达控制区，显而易见的是，只要不脱离发明的精神或范围就可以对发明进行变化和修改。

                                序列表

<110>舍林股份公司

<120>人Corin基因的控制序列

<130>52351AWOM1

<150>US 60/384,108

<151>2002-05-31

<160>16

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1888

<212>DNA

<213>Homo sapiens

<220>

<221>misc_feature

<222>(922)..(922)

<223>n is a，c，g，or t

<400>1

aaagaagatg aaatagaaac ttgtacttgg cctcagaatg cctgtagaaa ccttagcaat      60

tgaatccagc ccttatgtta taggctgagt taactgtggc ccagaaagac tatgtgattt     120

gctcacagtt cttgattccc agactggcac tgcggtgatg gtgtgtgatg aggtagtatc     180

ttagtaagaa cacaatccag aagtcactgc ctcgggggaa tcccagctca gcttcttgct     240

agcttgcgta ggctggttac ttcacttcag ctccctgaat ctgctttctt atctctaaaa     300

taaaaataat agcttcttcc tcagagtagt tggtggaact gaaagaatac atgtaaagtg     360

cttagtatga cacctgccac ataatatgaa ctgaattatt gtgaattatg ataaatttgt     420

cagatactgg tttacaaatc ggatgttaga ataacatgga atcagtgttt cagtcatttt     480

actatacata tgcaatattt tctacatttg atctcacttc agaaacaaaa tactgccccc     540

cccattttac aaatgcatat ttttttctca gcaataatgt tcaagaacaa gtgcttggcc     600

catattttgt tgtctttaca tggctttctt taaataatgg ggatggattt attaaataac     660

ctcatgagta attttcaaaa tttccattaa gatcttgatt gaaattggat gaaaaatcat     720

ttctaagaaa aacccaatga agtgtttttc tttgccacat ttgacaattg ccttggactt     780

ggtaaagtaa tcattactgt gttgagtacc tccagtgccc tccttgacgc tgccttagaa     840

aaggtagctg cttttgaatg acaggcagga atttgttcgc cttttaggtt cagcctgtag     900

gtgccctctg caggaaatca gnaactaggg ttttggaagc agtcagggtg gggttctccc     960

ttgtccctgc agcctcagca aagactcagg cagtctggca aaagcagttt cttcagcata    1020

cctaacagaa cgcaagtttc catatgcctg atgcaaataa tggcctccaa acgttaaacc    1080

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<210>2

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tctttaattg ccagcgcctg cagttaattt tgattggcta cactctggtt aaaagaaaat    3600

gctttcgatg tgatatggca aatttggaga aaagtaactc ttttgctccc aaccagtctt    3660

ccacaactta aacttaatcg tcctgtcctt tttctgctgc cctcgtggag tgtaagtttt    3720

tgagggagac cagcagaaac tgactttcca tatgcccctg aagaataact tctttgaatg    3780

caaagaggtg gggacacgga ggatctgtca ttacgggtta ttatgggtgg gacccagaga    3840

cgggagtgaa gggagggtgt ggcccgcggg tgggatctgt agagcagaca aaatatgggg    3900

cccctggcgc ttaaagttca gtttgtctct cttgagcttg gagaaaatca tccgtagtgc    3960

ctccccgggg gacacgtaga ggagagaaaa gcgaccaaga taaaagtgga cagaagaata    4020

agc                                                                  4023

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>primer

<400>7

aagcttcatg agggcaggag                                                20

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>primer

<400>8

gagctcgctt attcttctgt ccactt                                         26

<210>9

<211>26

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>primer

<400>9

aagcttataa aaataatagc ttcttc                                         26

<210>10

<211>26

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>primer

<400>10

acgcttagta actcttttgc tcccaa                                         26

<210>11

<211>42

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>11

cgtagaggag agaaaagcga ccaagataaa agtggacaga ag                       42

<210>12

<211>42

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>12

cgtagaggag agaaaagcga ccaacttaaa agtggacaga ag                       42

<210>13

<211>42

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>13

catagagcag agaaaagcga ccgagataag agtggacaga gg                       42

<210>14

<211>42

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>14

catagagcag agaaaagcga ccgacttaag agtggacaga gg                       42

<210>15

<211>27

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>15

cacttgataa cagaaagtga taactct                                        27

<210>16

<211>27

<212>DNA

<213>artificial sequence

<220>

<223>probe

<400>16

cacttcttaa cagaaagtct taactct                                        27

Claims (28)

1.一种包含哺乳动物的Corin表达控制区的分离的多核苷酸，其中所述控制区调控与其可操纵地连接的异源性多核苷酸的转录。

2.权利要求1的多核苷酸，其中所述控制区调控哺乳动物Corin基因的转录。

3.权利要求1的多核苷酸，其中转录发生于心脏组织。

4.权利要求1的多核苷酸，其中所述控制区包含选自GATA结合位点、Tbx-5结合位点、NKx2.5结合位点和NF-AT结合位点的一种转录调节元件。

5.权利要求1的多核苷酸，其中所述控制区与转录调节蛋白结合，其中所述蛋白选自GATA-4、Tbx-5、NKx2.5、Krüppel样因子和NF-AT转录因子。

6.权利要求1的多核苷酸，其中哺乳动物是人。

7.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：4所示的序列。

8.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：5所示的序列。

9.权利要求6的多核苷酸，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：6所示的序列。

10.一种权利要求1的多核苷酸的片段或变体，其中所述片段或变体能转录与其可操纵地连接的异源性多核苷酸。

11.权利要求10的片段或变体，其中所述片段或变体具有的序列与SEQ ID NO：4具有至少70％的相同性。

12.权利要求10的片段或变体，其中所述片段或变体具有的序列与SEQ ID NO：5具有至少70％的相同性。

13.权利要求10的片段或变体，其中所述片段或变体具有的序列与SEQ ID NO：6具有至少70％的相同性。

14.一种包含权利要求1的Corin表达控制区的载体。

15.一种包含权利要求14的载体的宿主细胞。

16.一种生产多肽的方法，其包含自权利要求15的宿主细胞中表达由可操纵地连接于Corin表达控制区的异源性多核苷酸所编码的多肽。

17.一种生产多核苷酸的方法，其包含自权利要求15的宿主细胞中表达由可操纵地连接于Corin表达控制区的异源性多核苷酸所编码的反义分子。

18.一种药物组合物，其包含存在于可药用载体中的权利要求14的载体。

19.一种药物组合物，其包含存在于可药用载体中的权利要求15的细胞。

20.一种鉴定调控细胞内人Corin基因的表达的物质的方法，其中所述方法包括：

(a)产生一种重组载体，其中一种包含哺乳动物Corin表达控制区的分离的多核苷酸可操纵地连接于一种报告基因；

(b)用所述重组载体转染细胞；

(c)用物质处理所述细胞；

(d)测定所处理的细胞中的报告基因序列的表达水平；以及

(e)比较在存在所述物质情况下所述报告基因序列的表达水平与未被处理的转染的对照细胞中的表达水平。

21.权利要求20的方法，其中所述细胞是心脏的肌细胞。

22.一种用于调控人类对象的基因表达的方法，所述方法包括：

(a)产生一种重组载体，其中一种包含哺乳动物Corin表达控制区的分离的多核苷酸可操纵地连接于一种异源性多核苷酸；

(b)将治疗有效量的所述载体施用于所述对象。

23.权利要求22的方法，其中所述异源性多核苷酸编码一种治疗性蛋白质，例如Corin、ANP、B型利钠肽、受磷蛋白、ACE、或这些基因的负显性形式。

24.权利要求23的方法，其中所述异源性多核苷酸编码Corin。

25.权利要求22的方法，其中所述异源性多核苷酸编码一种治疗性多核苷酸，例如反义RNA分子或催化性RNA分子。

26.权利要求22的方法，其中所述控制区选自SEQ ID NO：4、SEQID NO：5、和SEQ ID NO：6。

27.一种用于治疗人类对象的充血性心衰、高血压或心肌梗死的方法，所述方法包括给所述对象施用治疗有效量的一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包含与选自Corin、ANP、B型利钠肽、受磷蛋白、ACE、和这些基因的负显性形式的一种基因可操纵地连接的哺乳动物Corin表达控制区。

28.权利要求27的方法，其中所述基因是Corin。

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