JP2005531302A - ヒトコリン遺伝子の制御配列 - Google Patents

ヒトコリン遺伝子の制御配列 Download PDF

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Abstract

本発明は、哺乳類コリン遺伝子から単離された新規発現制御領域を提供する。この制御領域は、心臓細胞における転写を選択的に活性化する。コリン発現を調節できる剤の同定及び心疾患の処理のためにこの制御領域を使用する方法及び組成物が提供される。

Description

本発明は、哺乳類コリン遺伝子から単離された新規発現制御領域を提供する。この制御領域は、心臓細胞における転写を選択的に活性化する。コリン発現を調節できる剤の同定及び心疾患の処理のためにこの制御領域を使用する方法及び組成物が提供される。
コリン、すなわち心臓トランスメンブランセリンプロテアーゼは、プロ−心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（プロ−ANP）のANPへの転換において重要な役割を演じる（Yan, W. など. (2000) PNAS, 97: 8525-8529; Wu など. (2002) J. Biol. Chem. 277: 16900-16905）。ANPは、塩排泄を促進し、尿生成量を高め、血液体積を低め、そして受容体依存性態様で血管緊張を緩和することにより、高血圧を低める心臓ホルモンである。ANPは、主要心血管疾患、例えば高血圧及び心不全に関与して来た（Burnett, J. C. など. (1986) Science, 231: 1145-1147）。ノックアウトマウスにおいては、ANP又はその受容体のいずれかの欠失が自発的高血圧を引き起こす（John, S. W. など. (1995) Science 267: 679-681; John, S. W. など. (1996) Am. J. Physiol. 271, R109-R114 ; Lopez など. (1995) Nature 378: 65-68）。プロ−ANPのANPへの転換の活性化段階が、心臓ホルモンの調節において決定的であることは理解されている。
コリンは、２種の縮められた様なシステインに富んでいるモチーフ、８個のLDL受容体反復体、マクロファージスカベンジャー受容体−様ドメイン、及びトリプシン−様プロテアーゼドメインを細胞外領域に含むタイプIIトランスメンブランタンパク質の予測される構造を有する（Yan など. (1999) J. BioL Chem. 274: 14926- 14935）。コリンの全体的トポロジーは、ヘプシン、エンテロキナーゼ、MT−SP1/マトリプターゼ、ヒト気道トリプシン−様プロテアーゼ、TMPRSS2、TMPRSS3/TADG-12、 TMPRSS4、 MSPL及びスタブル−スタブロイド（Stubble-stubbloid）を包含する他のタイプIIトランスメンブランセリンプロテアーゼのトポロジーに類似する。類似するトポロジー及び明白なモジュール構造は、それらのタンパク質が先祖伝来エキソンの重複及び転位により誘発された遺伝子ファミリーを含んで成ることを示唆する。
ヒト遺伝子は200kb以上に及び、そして22個のエキソンを含む。イントロン/エキソン境界は、ほとんどのエキソンコードの構造ドメインを有する種間で十分に保存されている。フリンタンパク質をコードするマウス及びヒトcDNAの両者のクローニングは、これまで報告されている（Yanなど. 前記）。ノザン分析は、コリンmRNAがヒト心臓において発現されることを示した。蛍光現場ハイブリダイゼーション分析によれば、ヒトコリン遺伝子は、染色体４（4p12-13）の短アームにマッピングされており、ここでうっ血性心疾患遺伝子座、すなわち全異常性肺静脈屈曲部はこれまでに位置決定されている。
本発明は、プロモーター及び他の調節要素を包含する、哺乳類コリン遺伝子の発現制御領域の単離、クローニング及び同定、及びコリン遺伝子発現を調節する新規剤を同定し、そして心疾患を処理するためへのこの心臓−特異的発現制御領域の使用に関する。
このためには、作用可能に結合された異種ポリヌクレオチド、例えばヒトコリン遺伝子の転写を調節する哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチド
を提供することが本発明の目的である。
コリン発現制御領域は、作用可能に結合された異種ポリヌクレオチドの心臓−特異的転写を指図し、GATA-4、Tbx−5、NKx2.5、Krppel-様因子又はNF-AT転写因子から成る群から選択された、１又は複数の転写調節要素を含んで成り、そして転写プロモーター、例えばGATA−４を結合することができる。
ヒトコリン発現制御領域を含んで成るポリヌクレオチドを提供することが本発明のさらなる目的である。本発明の好ましいポリヌクレオチドは、ヌクレオチド−4037〜−15（配列番号６）、より好ましくはヌクレオチド−1297〜−15（配列番号５）、及びさらにより好ましくはヌクレオチド−405〜−15（配列番号４）に位置し、ここで前記番号づけは、図８（配列番号２）に示されるように、ヒトコロン遺伝子又はその相補的鎖の翻訳開始部位（ATG）に対してである。
本発明のこの観点によれば、それらのポリヌクレオチドのフラグメント及び変異体がまた提供される。
コロン発現制御領域又はそのフラグメント又は変異体を含んで成るベクターを供給することが本発明のもう１つの目的である。さらなる態様においては、ベクターはまた、コロン発現制御領域に作用可能に結合される異種ポリヌクレオチドも含んで成る。本発明のこの観点によれば、そのようなベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞、及びそのような異種ポリヌクレオチドによりコードされる生成物の発現方法が提供される。
異種ポリヌクレオチドに作用可能に結合されるコリン発現制御領域又はそのようなベクターによりトランスフェクトされた宿主細胞、及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物を供給することが本発明のもう１つの目的である。
細胞におけるヒトコリン遺伝子の発現を調節する剤の同定方法を提供することが本発明のもう１つの目的であり、ここで前記方法は、
（ａ）哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチドがレポーター遺伝子に作用可能に結合されている組換えベクターを生成し；
（ｂ）前記組換えベクターにより前記細胞をトランスフェクトし；
（ｃ）前記細胞を前記剤により処理し；
（ｄ）前記処理された細胞におけるレポーター配列の発現のレベルを測定し；そして
（ｅ）処理されていないトランスフェクトされた細胞における発現のレベルに、前記剤の存在下でのレポーター配列の発現のレベルを比較することを含んで成る。
好ましい態様においては、心筋細胞が使用される。
ヒト対象における遺伝子の心臓−特異的発現の調節方法を提供することが本発明のもう1つの目的であり、ここで前記方法は、
（ａ）哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドに作用可能に結合されている組換えベクターを生成し；そして
（ｂ）前記対象に前記ベクターを治療的有効量で投与することを含んで成る。
本発明のこの観点の好ましい態様は、異種ポリヌクレオチドがコリンをコードするベクターである。コリン発現制御領域が配列番号４，５又は６の配列を有するポリヌクレオチドから選択される態様がまた好ましい。
ヒト対象におけるうっ血性心不全、高血圧又は心筋梗塞の処理方法を提供することが本発明のもう１つの目的であり、ここで前記方法は、コリン、心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（ANP）、B型ナトリウム排泄増加性ペプチド、ホスホランバン、アンギオテンシン転換酵素（ACE）又はそれらの遺伝子の負の優勢形から成る群から選択された遺伝子に作用可能に結合された哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る、治療的有効量の単離されたポリヌクレオチドを、前記対象に投与することを含んで成る。他方では、コリン発現制御領域は、アンチセンスRNA分子をコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合され得る。
本発明のこの観点の好ましい態様においては、選択される遺伝子はコリンである。
心不全を有するヒト対象の処理方法を提供することが、本発明のもう1つの観点であり、ここで前記方法は、
（ａ）哺乳類コロン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチドが、ANP、B型ナトリウム排泄増加性ペプチド、ホスホランバン、ACE又はそれらの遺伝子の負の優勢形から成る群から選択されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作用可能に結合されている組換えベクターを生成し；そして
（ｂ）医薬的に許容できる担体中、前記組換えベクターを、前記対象に投与することを含んで成る。
本発明は、プロモーター及び他の調節要素を包含する、心臓−特異的コリン遺伝子の発現制御領域の単離、クローニング及び同定に関する。単離されたコリン発現制御領域及びそのフラグメント及び変異体は、コリン遺伝子発現の調節を研究し、そしてコリン遺伝子発現の新規モジュレーターを同定するためのインビトロ及びインビボ実験モデルの構成に使用される。発現制御領域はまた、心臓疾患状態、例えば心不全に標的化される遺伝子療法にも使用され得る。
定義：
本明細書、例及び特許請求の範囲において使用される場合、特にことわらない限り、次の用語は、示される意味を有する。
“核酸”又は“ポリヌクレオチド”とは、一本鎖又は二本鎖形でのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及びそのポリマーを言及する。この用語は、合成であり、天然に存在し、そして天然に存在せず、対照の核酸と類似する結合性質を有し、そして対照のヌクレオチドに類似する態様で代謝される、既知のヌクレオチド類似体又は修飾された主鎖残基又は連鎖を含む核酸を包含する。そのような類似体の例は、ホスホロチオエート、ホスホラミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−0−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（PNA）を包含するが、但し、それらだけには減退されない。
特にことわらない限り、特定の核酸配列はまた、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列、並びに明白に示される配列を絶対的に包含する。特に、縮重コドン置換は、１又は複数の選択された（又はすべての）コドンの第３の位置が混合された塩基及び/又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することによってた達成され得る（Batzerなどl. (1991) Nucl. Acids Res. 19: 5081; Ohtsuka など. (1985) J. Biol. Chem. 260: 2605-08; Rossolini など. (1994) Mol. Cell. Probes 8: 91-98）。用語、核酸は、遺伝子cDNA、mRNA, オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと交換可能的に使用される。
特定の核酸配列はまた、“スプライス変異体”を絶対的に包含する。同様に、核酸によりコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライス変異体によりコードされるいずれかの変異体を絶対的に包含する。“スプライス変異体”は、その名称が示すように、遺伝子の選択的スプライシングの生成物である。転写の後、初期核酸転写体は、異なった（代わりの）核酸スプライス生成物が異なったポリペプチドをコードするようスプライシングされ得る。スプライス変異体の生成機構は種々であるが、しかしエキソンの代わりのスプライシングを包含する。読み合わせを転写により同じ核酸から誘導される代わりのポリペプチドはまた、この定義により包含される。組換え形のスプライス生成物を包含する、スプライシング反応のいずれかの生成物がこの定義により包含される。
“コリン遺伝子”とは、Yan など. (1999) J. Biol. Chem. 274: 14926-14935に開示されるように、ヒトコロン遺伝子アミノ酸配列と少なくとも約60％（好ましくは、75％、78％、90％及びより好ましくは約95％）の同一性を共有する連続アミノ酸配列をコードする遺伝子を意味する。
“コリン発現制御領域”又は“発現制御領域”とは、天然に存在する哺乳類コリン遺伝子のコード領域の上流の（5’）ゲノム配列内に位置するポリヌクレオチドを言及する。ヒトコリン遺伝子においては、コリン発現制御領域は、図８に示されるように、ヌクレオチド−4165で開始し、そしてコリン遺伝子又はその相補的鎖の翻訳開始部位（ATG）に対してヌクレオチド−15で終結する。コリン発現制御領域は、心臓組織（筋細胞）におけるコリン遺伝子の転写を活性化することができる。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、100〜5000個の長さのヌクレオチドであり得；機能的ヒトコリン発現制御領域の特定の態様は、4023、1283又は391個の長さのヌクレオチド（それぞれ、配列番号６，５及び４）である。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは一般的に、それらの配列に対して少なくとも70％相同である。
いくつかの態様においては、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、それらの配列に対して少なくとも75％、80％、85％、90％、92％、95％又は100％相同である。用語“制御領域”は、Yanなど、前記にすでに記載されている、開始又は終結コドン及び他の配列を含まない。コリン発現制御領域は、天然又は人工的手段におけるもものと実質的に同じである手段で結合され得る種々の転写調節タンパク質、例えばGATA-4のための結合体部位を含むコリン発現制御領域は、コリン遺伝子、又は特に心臓−特異的態様で、作用可能に結合される他の異種ポリヌクレオチドの転写を活性化する。
“心臓−特異的発現”とは、ポリヌクレオチドが非心臓細胞においてよりも心臓由来の細胞において、より高い割合で転写されることを意味する。従ってコリン発現制御領域は一般的に非心臓細胞においてよりも心臓筋細胞において少なくとも２倍、より効果的に、結合されたポリヌクレオチドの転写を活性化し、ここで個々の場合における発現は、SV40プロモーター/エンハンサー、又は他の構成プロモーターに結合されるもう１つのポリヌクレオチドの転写に対して標準化される。
ポリヌクレオチドの“変異体”とは、本明細書において使用される場合、対照ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド配列とは異なるポリヌクレオチドである。一般的に、差異は制限され、その結果、対照及び変異体のポリヌクレオチド配列は、全体的に密接に類似し、そして多くの領域において同一である。前記差異は、ポリヌクレオチドの機能が変更されず、そしてポリヌクレオチドが通常、ポリペプチドをコードする場合、その得られるポリペプチドはアミノ酸配列において未変化のままであるか、又はアミノ酸配列において差異を保持しながら、機能的に同一であるようなものである。
“フラグメント”とは、本明細書において使用される場合、前述のコリン発現制御領域及びその変異体のポリヌクレオチド配列のすべてではないが、一部と同じであるポリヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを言及する。そのようなフラグメントは、作用可能に結合される異種ポリヌクレオチドの心臓−特異的転写を方向づけるコリン発現制御領域の能力を維持する。
“転写開始要素”とは、RNAポリメラーゼIIの開始部位を特定する、プロモーターにおける配列を言及する。転写開始要素は、25〜35塩基下流の転写の開始を方向づけるTATAボックス、又は転写開始部位自体近くに位置する配列である開始体要素を含むことができる。真核プロモーターは一般的に、転写開始要素及びプロモーター近位の要素、遠位の要素、遠位のエンハンサー要素、又は両者のいずれかを含んで成る。
“組換え体”は、細胞、核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、前記細胞、核酸、タンパク質又はベクターが、異種核酸又はタンパク質の導入、又は生来の核酸又はタンパク質の変更により修飾されているか、又は前記細胞がそのような修飾された細胞に由来することを示唆する。従って、例えば組換え細胞は、細胞の生来の（非組換えの）形内に見出されない遺伝子を発現するか、又は他方では、異常に発現されるか、過少に発現されるか又はまったく発現されない生来の遺伝子を発現する。
“エンハンサー”とは、転写を増強するDNA調節領域を言及する。エンハンサーは通常、但し常ではないが、近位プロモーター領域の外部に位置し、そして転写開始部位から数キロ塩基又はそれ以上離れて、さらに3’コード配列側に、又は遺伝子のイントロン内に位置することができる。プロモーター及びエンハンサーは単独で又は組合して、組織特異的発現を付与することができる。
“サイレンサー”とは、コリン遺伝子の天然の情況下で存在する場合、控えめなDNAセグメントとしてのそれ自体の作用から、又は前記要素に結合し、そして遺伝子の発現に対して負の制御をもたらすトランス−作用性因子の作用を通して、そのプロモーターからの転写の制御を引き起こすDNAの制御領域を言及する。この要素は、コリン遺伝子のために見出される制限された細胞型発現パターンにおいて役割を演じることができ、例えば発現は、サイレンサーが不活性である心筋細胞において許容され得るが、しかしサイレンサーが活性的である他の細胞型においては制限され得る。この要素は、単離、又は異種プロモーター構造体において作用することができても、又は作用しなくても良い。
“単離された”とは、例えばポリヌクレオチドに関して言及する場合、その材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合、天然環境）から除去され、そして天然に関連する少なくとも１つの他の成分から単離されるか又は分離されることを意味する。例えば、天然の生存宿主に存在する天然に存在するポリヌクレオチドは単離されないが、しかし天然システムにおける同時存在材料のすべてから分離される同じポリヌクレオチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドは組成物の一部であり得、そしてさらに、そのような組成物がその天然の環境の一部でない場合、単離され得る。
“％同一性”又は％同一とは、配列に関して言及する場合、配列が、記載されるか又は請求される配列に比較される配列の一列整列の後、請求される要素又は記載される配列に比較されることを意味する。２種の配列間の配列の比較、及び％同一性及び類似性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成され得る。そのような数学的アルゴリズムの好ましい非制限的例は、Karlin など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877に記載されている。そのようなアルゴリズムは、Altschul などl. (1997) Nucleic Acid Res. 25: 3389-3402に記載されるように、NBLAST及びXBLASTプログラム（バージョン2.0）中に組込まれる。
“高い緊縮性”とは、本明細書において使用される場合、例えば、５×SSC, 0.5％ SDS, 100μg/mlの変性されたサケ精子DNA及び50％ホルムアミドを含むハイブリダイゼーション溶液における長いポリヌクレオチドプローブと共に42℃で一晩（例えば、少なくとも12時間）のブロットのインキュベーションを意味する。ブロットは、５％以下のbpミスマッチを可能にする高い緊縮条件下で洗浄され得（例えば、0.1×SSC、及び0.1％SDSによる65℃での30分間の２度の洗浄）、それにより、例えば95％又はそれ以上の配列同一性を有する配列が選択される。
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのDNAコピーがRNAに転写される場合に“発現される”。
ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチド、及び単一分子におけるコリン発現制御領域の結合が、ポリヌクレオチドの転写、最も好ましくは心臓−特異的転写（筋細胞における）をもたらす場合、コリン発現制御領域に“作用可能に結合される”。
“異種ポリヌクレオチド”とは、コリン発現制御領域に作用可能に結合され、そして心臓−特異的細胞において選択的に発現される、コリン発現制御領域以外のポリヌクレオチドを言及する。結合されたポリヌクレオチドは、治療的に有用な分子、例えばポリペプチド、アンチセンスRNAをコードする。用語“単離された”、“精製された”又は“生物学的に純粋な”とは、その生来の状態で見出される場合、通常付随する成分を実質的に有さない材料を意味する。
純度及び均質性は典型的には、分析化学技法、例えばポリアクリルアミノゲル電気泳動又は高性能液体クロマトグラフィーを用いて決定される。調製物に存在する有力な種であるタンパク質は実質的に精製される。特に、単離された核酸は、遺伝子を両端に有し、そして他のタンパク質をコードする読み取り枠から分離される。用語“精製された”とは、核酸又はタンパク質が電気泳動ゲルにおいて実質的に１つのバンドを生ぜしめることを示す。特に、核酸又はタンパク質は少なくとも85％純粋、より好ましくは少なくとも95％純粋、及び最も好ましくは少なくとも99％純粋であることを意味する。
用語“ポリペプチド”、“ペプチド”及び“タンパク質”は、アミノ酸残基のポリマーを言及するために、本明細書に置いて交換可能的に使用される。この用語は、１又は複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工化学的擬似体であるアミノ酸ポリマー、並びに天然に存在するアミノ酸ポリマー及び天然に存在するアミノ酸ポリマーに適用される。
用語“アミノ酸”とは、天然に存在する及び合成のアミノ酸、並びに天然に存在するアミノ酸に類似する態様で機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸擬似体を意味する。天然に存在するアミノ酸は、遺伝子コードによりコードされるそれら、及び後に修飾されるそれらのアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート及びO−ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基及びR基に結合される炭素を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシドを意味する。そのような類似体は、修飾されたR基（例えば、ノルロイシン）又は修飾されたペプチド主鎖を有するが、但し天然に存在するアミノ酸と同じ基本的化学構造を保持する。アミノ酸擬似体は、アミノ酸の一般的化学構造とは異なる構造を有するが、しかし天然に存在するアミノ酸に類似する態様で機能する化合物を意味する。
アミノ酸は、それらの通常知られている３文字記号により、又はIUPAC−IUB Biochemical Nomenclature Commissionにより推薦される１文字記号により、本明細書において言及され得る。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容される１文字コードにより言及され得る。
“保持的に修飾された変異体”は、アミノ酸及び核酸配列に適用される。特定の核酸配列に関しては、保存的に修飾された変異体は、実質的に同一の配列に対して、同一か又は実質的に同一のアミノ酸配列をコードするか、又はアミノ酸配列をコードしないそれらの核酸を言及する。遺伝子コード縮重のために、多数の機能的に同一の核酸は、いずれか所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA, GCC, GCG及びGCUはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。従って、アラニンがコドンにより特定されるあらゆる位置で、コドンは、コードされるポリペプチドを変更しないで、記載されるその対応するコドンのいずれかに変更され得る。
そのような核酸変動は、保存的に修飾された変動の１つの種である“サイレント変動”である。ポリペプチドをコードする本明細書におけるあらゆる核酸配列はまた、核酸のあらゆる可能性あるサイレント変動も記載する。当業者は、核酸における個々のコドン（通常、メチオニンについての唯一のコドンであるAUG、及び通常、トリプトファンについての唯一のコドンであるTGGを除く）が、機能的に同一の分子を生成するために修飾され得ることを理解するであろう。従って、ポリペプチドをコードする核酸の個々のサイレント変動は、個々の記載される配列において明白である。
アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列における単一のアミノ酸又は数％のアミノ酸を変更し、付加し、又は欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への個々の置換、欠失又は付加が、変更が化学的に類似するアミノ酸による１つのアミノ酸の置換をもたらす“保存的に修飾された変異体”であることを認識するであろう。機能的に類似するアミノ酸を提供する保存性置換表は、当業界において良く知られている。そのような保存的に修飾された変異体は、本発明の多形変異体、種間相同体及び対立遺伝子を排除しない。
次の８種のグループはそれぞれ、お互い保存性置換であるアミノ酸を含む：
１）アラニン（A）、グリシン（G）；
２）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；
３）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
４）アルギニン（R）、リシン（K）；
５）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
６）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
７）セリン（S）、トレオニン（T）；及び
８）システイン（C）、メチオニン（M）。
例えば、Creighton, Proteins (1984) を参照のこと。
“発現ベクターは、宿主細胞における特定核酸の転写を可能にする一連の特定された核酸要素により、組換え的に又は合成的に生成された核酸構造体を言及する。発現ベクターは、プラスミド、ウィルス又は核酸フラグメントの一部であり得る。典型的には、発現ベクターは、発現制御領域、例えばコリン発現制御領域に作用可能に結合される、転写されるべき核酸を包含する。
“医薬的に許容できる賦形剤”とは、許容できる担体、及び非毒性であり、そして懸濁されるか又は包含される医薬組成物の生物学的活性に悪影響を及ぼさない、生理学的条件と適合できる、必要とされるようないずれかの医薬的に許容できる助剤を言及する。適切な賦形剤は、化合物、例えばマンニトール、スクシネート、グリシン又は血清アルブミンである。
“治療的有効量”とは、その必要な対象に投与される場合、心臓疾患を有するか、又はたぶん、前記疾患を進行する患者のための下記に定義されるような処理をもたらすのに十分である、本発明の化合物の量を言及する。“治療的有効量”を構成する化合物の量は、化合物に依存して変化するが、しかし当業者により通常、決定され得る。
“処理する”又は“処理”とは、本明細書において使用される場合、心臓疾患の処理に及び、そして
（ａ）特に、ヒトが心臓疾患の素因を有する場合、そのようなヒトにおける心臓疾患の発生を妨げ；
（ｂ）心臓疾患を阻害し、すなわちその進行を阻止するか；又は
（ｃ）心臓疾患を軽減し、すなわち病状の回復を引き起こすことを包含する。
発明の特定の記載：
本発明は、哺乳類（例えば、マウス、ヒト）コリン遺伝子の発現制御領域、例えばプロモーター及び他の調節要素のクローニング及び同定、及びコリン遺伝子発現を調節する剤の同定、及び心臓疾患の処理へのこの発現制御領域の使用に関する。特に、本発明は、新規ヒトコリン発現制御領域を含んで成り、そして作用可能に結合される異種ポリヌクレオチドの心臓−特異的発現を方向づけるこの制御領域の能力を有するポリヌクレオチドに関する。
コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの単離及び特徴化：
本発明は、組み換え遺伝学の分野における通常の技法に依存する。本発明に使用するための一般的方法を開示する基本的テキストは、Sambrook など., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (1990); 及び Ausubel など, Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, New York, NY, 1994)を包含する。
哺乳類コリン遺伝子の構成：
図１は、ヒト及びネズミコリン遺伝子の構成、及びコリン遺伝子及びそれらの5’−フランキング領域を含む、BAC（細菌人工染色体）クローン、コンチグ及びプラスミドクローンの位置を示す。ヒト及びネズミコリン遺伝子は、少なくとも200kbにおよび、そして22個のエキソン及び21個のイントロンから成る。
コリンcDNA配列は、多くの別々のドメインから構成されるタンパク質を予測する。タンパク質ドメイン間の境界は、図２に図示されるように、ゲノム構造体のエキソン/イントロン境界に正確に対応する。N−末端での細胞質端は、エキソン１、及びエキソン２の半分によりコードされ、続いて、エキソン２の他の半分によりコードされるトランスメンブランドメインによりコードされる。トランスメンブランと第１Frizzledドメインとの間の領域は、エキソン３によりコードされる。Frizzledドメインの個々は、２つのエキソンによりコードされ、８個のLDLRの個々は単一のエキソンによりコードされ、そしてスキャベンジャー受容体システインに富んでいるドメインは３個のエキソンによりコードされる。C−末端でのプロテアーゼドメインは、エキソン19〜22によりコードされ、そしてエキソン19はタンパク質分解活性化部位及び触媒性ヒスチジン残基を含む配列をコードする。エキソン20及び22は、それぞれ、他の２つの触媒性残基アスパラギン酸及びセリンを含む配列をコードする。
コリン発現制御領域のクローニング：
ヒト及びネズミコリン遺伝子及びそれらの5’−フランギング領域をクローン化するために、公開されているそれらの遺伝子のコリンcDNAに対応する特定のオリゴヌクレオチド（Yanなど. (1999) J. Biol. Chem. 274: 14926-14935）が合成された。それらのオリゴヌクレオチドプライマーは、ヒト又はネズミゲノムDNAを用いて、PCRに基づく反応において特定の生成物の増幅について試験された。
次に、特定のPCR生成物を都合良く増幅したプライマー対が、ヒト又はネズミコリン遺伝子及び/又はそれらの対応する5’−フランギング領域を含むBACクローンを同定するために、PCRに基づくスクリーンに使用された。同定された正のBACクローンが、ショットガン方法により直接的に配列決定されるか、又は配列決定のためにpUC118 (PanVera/Takara, Madison, WI) 中にサブクローン化された。ショットガン配列のアセンブリーが、Stadenパッケージ（Bonfield など. (1995) Nucleic Acids Res. 23: 4992-4999）を用いて行われた。
４種のBACクローン（２つはそれぞれヒト及びネズミコリン遺伝子を含む）が、PCRに基づくスクリーニングにより得られた。３種のBACクローンが、ショットガン方法により配列決定され、そしてそれらの配列は、入手できる追跡ファイル情報（http ://www. ncbi. nlm. nih. aov : 80/Traces/trace. cqi, http ://trace. ensembl. org）と組合して、ヒトコリン遺伝子を含む340kbの連続配列をアセンブリーするために、及びネズミコリン遺伝子のための５種のコンチグについての配列を決定するために使用された。ネズミコリン遺伝子に関しては、５種のコンチグの順序は、それぞれ隣接するコンチグにおいていくつかの対合される読み取り対の存在により確められた。
それらの距離は、公開されたショットガンライブラリーの挿入体サイズが十分に定義されているので、ギャップサイズが500bp以下であることの決定を可能にした。次に、ヒト及びネズミコリン遺伝子の構造が分析された。しかしながら、340kbのヒトゲノム配列は、5’−フランギング領域を含まなかった。追加の4165bpのHindIII −EcoRIフラグメントが、5’−フランキング領域の最初の3919bp、すべてのエキソン１及びイントロン１の一部を含むBAC26540（受託番号AF521006号としてGenBankTM/EBIデータバンクに提出されている）から単離された。
本明細書に記載されるコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、BAC26540から単離された4165bpのHindIII −EcoRIフラグメント（図８、配列番号２を参照のこと）から誘導された。それらの発現制御領域は、PCRに基づく方法、又は制限酸素消化、又は両者の組合せにより得られた。4023bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号６）は、4165bpのHindIII −EcoRIフラグメント又はヒトゲノムDNAから、プライマーF1（5'-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3'）（配列番号７）及びR１（5'-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3'）（配列番号８）を用いて増幅された。同様に、1283bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号５）は、プライマーF2（5'-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3'）（配列番号９）及びR1を用いて増幅され、そして391bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号４）は、プライマーF3（5'-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3'）（配列番号10）及びR1を用いて増幅された。
DNAが容易に抽出され得るいずれかの哺乳類組織、例えば白血球細胞は、哺乳類コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの単離のためのゲノムDNAの適切な源である。
機能的コリン発現制御領域ポリヌクレオチド：
上記コリン発現制御領域ポリヌクレオチドが、レポーター遺伝子に所定の発現制御領域ポリヌクレオチドを操作可能に結合し、心筋細胞中に前記構造体をトランスフェクトし、そしてレポーター遺伝子の心臓−特異的転写を方向づける特定の発現制御領域ポリヌクレオチド配列の能力についてアッセイすることにより、心臓−特異的転写活性についてアッセイされる。レポーター遺伝子は典型的には、天然において宿主細胞に不在である、容易にアッセイされる酵素活性を有するタンパク質をコードする。真核プロモーターのための典型的なレポータータンパク質は、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、ホタル又はレニラ（Renilla）ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、アルカリホスファターゼ及び緑色蛍光タンパク質（GFP）を包含する。好ましいレポーター遺伝子はホタルルシフェラーゼである。
コリン発現制御領域活性をアッセイするための１つのシステムは、培養された細胞系中への一時的な又は安定したトランスフェクションである。レポーター遺伝子に作用可能に結合されるコリン発現制御領域ポリヌクレオチドを担持するアッセイベクターが、プロモーター活性のアッセイのために、いずれかの哺乳類細胞系中にトランスフェクトされ；細胞培養、トランスフェクション及びレポーター遺伝子アッセイについては、Ausubel など. (2000), 前記; Transfection Guide, Promega Corporation, Madison, WI (1998)を参照のこと。
コリン発現制御領域ポリヌクレオチドが、心臓由来の細胞系及び非心臓由来の細胞系中にアッセイベクターを同時にトランスフェクトすることにより、心臓−特異的転写活性についてアッセイされ得る。典型的には、既知のプロモーターにより駆動される第２レポーター遺伝子、例えばSV40初期プロモーター/エンハンサー（pRL-SV40, Promega, Madison, WI）により駆動されるレニラルシフェラーゼを含んで成る制御ベクターが、種々の細胞系間でのトランスフェクション効率又はレポーター遺伝子翻訳の変動を制御するために、アッセイベクターと共に同時トランスフェクトされる。
あるいは、コリン発現制御領域ポリヌクレオチド駆動の転写がまた、レポーター遺伝子から転写されるRNAの量を直接的に測定することにより検出され得る。それらの態様においては、レポーター遺伝子は、宿主細胞により発現されない既知の配列のいずれかの転写できる核酸であり得る。コリン発現制御領域ポリヌクレオチド構造体から発現されるRNAが、当業界において知られている技法、例えばmRNAの逆転写及び増幅、全RNA又はポリA+ RNAの単離、ノザンブロット、ドットブロット、現場ハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護、プライマー延長、高密度ポリヌクレオチドアレイ技法及び同様の技法により分析され得る。
転写を活性化するコリン発現制御領域ポリヌクレオチド配列の能力が典型的には、制御構造体に対して評価される。１つの態様においては、転写を活性化するコリン発現制御領域ポリヌクレオチドの能力が、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドに結合されるレポーター遺伝子の発現と、そのような配列に結合されない同一のレポーター遺伝子の発現とを比較することによりアッセイされる。
従って、好ましい態様においては、ルシフェラーゼの発現が、pRL-SV40とpRL-SV40（コリン発現制御領域ポリヌクレオチド配列がルシフェラーゼ遺伝子の5’端に挿入されている；例２、図４を参照のこと）との間で比較される。他の態様においては、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの活性が、既知プロモーターの活性と比較され得る。従って、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドにより駆動されるレポーター遺伝子の活性が、特徴づけられたプロモーター（例えば、pGL3-ControlにおけるSV40プロモーター/エンハンサー、Promega, Madison, WI）により駆動されるレポーター遺伝子の活性に比較される。
コリン発現制御領域により方向づけされる転写の心臓−特異性が、心臓由来の及び非心臓由来の細胞におけるレポーター遺伝子の転写を比較することにより評価される。心臓−特異的転写を評価するための適切な心臓−由来の細胞系は、AT−１（Claycomb など. (1998) Proc. Nafl. Acad. Sci. 95: 2979-2984）、HL−１（Lansonetal. (1992) Circulation 85 : 1835- 1841）及びHL−５（Wu など. (2002) J. Biol. Chem. 277: 16900-16905）である。好ましい細胞系は、HL-5細胞系である。いずれかの容易にトランスフェクトできる哺乳類細胞系が、非心臓細胞（例えば、Hela細胞、ATCC No. CCL2）における発現制御領域をアッセイするために使用され得る。
例３（図５）においては、ヒト（hCp405LUC）及びマウス（mCp642LUC）コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの心臓−特異的活性が、HL-5及びHeLa細胞系におけるそれらの発現制御領域フラグメントを有するベクター及びそれらを有さないベクターからのホタルルシフェラーゼ発現を比較することにより示される。個々のアッセイに関しては、コリン発現制御領域活性が、細胞系間の変動性を制御するために、同時トランスフェクトされたSV40プロモーター活性（すなわち、pGL3-Control）に対して標準化される。
心臓−特異的転写性がコリン発現制御領域にポリヌクレオチドにおいて示されると、欠失、突然変異、転移及び他の配列修飾が構成され、そして本発明のアッセイにおける心臓−特異的転写についてアッセイされ得る。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドのそのような誘導体は、より小型のプロモーターを生成するために、非心臓細胞におけるバックグラウンド発現を低めるために、制御配列を排除するために、又は新規の心臓−特異的転写調節タンパク質を同定するために有用である。ヒト及び齧歯動物コリン発現制御領域配列が、保存された転写調節要素、例えば心臓−特異的発現を付与するそれらの要素を同定するために比較され得る。
コリン発現制御領域サブフラグメント及び誘導体は、当業界において知られている従来の組換えDNA方法により構成され得る。１つのそのような方法は、コリン発現領域配列内の一連の欠失誘導体を生成することをである（例２）。一連の欠失の転写活性を比較することにより、心臓−特異的転写に寄与するか又は転写を低める要素が位置決定され得る。そのような分析に基づいて、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの改良された誘導体が企画され得る。例えば、コリン発現制御領域要素が、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドの心臓特異性又は活性を高めるために異種プロモーターからの心臓−特異的又は遍在的調節要素と組み合わされ得る。
ベクター及び宿主細胞：
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドを含むベクター、本発明のベクターにより遺伝子的に構築される宿主細胞、及び組換え技法による本発明のポリペプチドの生成にも関する。そのような技法は、Sambrook など., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989 及び Ausubel, F. M. など., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y. , 1989に記載されている。
宿主細胞は、結合されたポリヌクレオチド、例えばコリンによりコードされる生成物の発現を可能にするために、本発明のコリン発現制御領域を含むポリヌクレオチド、及びコリン又は他のポリペプチドをコードする遺伝子に作用可能に結合されるコリン発現制御領域を含むポリヌクレオチドを組込むよう遺伝子的に構築され得る。ポリヌクレオチドは、感染、トランスダクション、トランスフェクション、トランスベクション及び形質転換の良く知られた技法を用いて、宿主細胞中に導入され得る。前記ポリヌクレオチドは、単独で、又は他のポリヌクレオチドと共に導入され得る。そのような他のポリヌクレオチドは、独立的に導入されるか、同時導入されるか、又は本発明のポリヌクレオチドに結合されて導入され得る。
従って、例えば本発明のポリヌクレオチドは、例えば哺乳類細胞における同時トランスフェクション及び選択についての標準の技法を用いて、選択マーカーをコードする、もう１つの別のポリヌクレオチドと共に宿主細胞中にトランスフェクトされ得る。この場合、ポリヌクレオチドは一般的に、宿主細胞ゲノムに安定して組込まれるであろう。
あるいは、ポリヌクレオチドは、宿主における増殖のための選択マーカーを含むベクターに結合され得る。ベクター構造体は、前述の技法により宿主細胞中に導入され得る。一般的に、プラスミドベクターは、沈殿物、例えばリン酸カルシウム沈殿物において、又は荷電された脂質との複合体においてDNAとして導入される。エレクトロポレーションはまた、宿主中にポリヌクレオチドを導入するためにも使用され得る。ベクターがウィルスである場合、それはインビトロでパッケージングされ、又はパッケージング細胞中に導入され得、そしてパッケージングされたウィルスは細胞中に形質導入され得る。本発明のこの観点に従って、ポリヌクレオチドを製造し、そして細胞中にポリヌクレオチドを導入するために適切な広範囲の種類の技法は、当業者に良く知られており、そして通常のことである。
そのような技法は、それらの技法を詳細に説明する多くの実験用マニュアルを示す、上記で引用されたSambrookなど．において再考される。本発明のこの観点によれば、ベクターは例えば、プラスミドベクター、一本鎖又は二本鎖ファージベクター、１本鎖又は二本鎖RNA又はDNAウィルスベクターであり得る。そのようなベクターは、細胞中にDNA及びRNAを導入するための良く知られた技法により、ポリヌクレオチド、好ましくはDNAとして細胞中に導入され得る。ファージ及びウィルスベクターの場合、ベクターはまた、感染及び形質導入のための良く知られている技法により、パッケージングされた又は封入されたウィルスとして細胞中に導入される。ウィルスベクターは複製有能性であるか又は複製欠陥性であり得る。後者の場合、ウィルス増殖は一般的に、宿主細胞を補足することにおいてのみ生じるであろう。
ある観点においては、本発明のポリヌクレオチド及びポリペプチドの発現のためのそれらのベクターが、ベクター間で好ましい。一般的に、そのようなベクターは、発現されるべきポリヌクレオチドに作用可能に結合される、宿主における発現のために効果的なシス−作用制御領域を含んで成る。適切なトランス−作用因子は、宿主により供給され、補足ベクターにより供給されるか、又は宿主中への導入に基づいてベクター自体により供給される。
本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、種々の良く知られている及び通常の技法のいずれかにより、ベクター中に導入され得る。一般的に、発現のためのDNAリガーゼを用いて制限フラグメントを一緒に結合することにより、発現ベクターに結合される。このために使用され得る制限及び連結のための方法は、当業者に良く知られており、そして通常のことである。これに関して、及び当業者に良く知られており、且つ通常のことである、他の技法を用いての発現ベクターを構成するための適切な方法は、本明細書に引用されるSambrookなど. に詳細に示されている。
コリン発現制御領域の使用：
本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、心臓由来の細胞において治療分子を特異的に発現するために有用である。治療分子の心臓−特異的発現は例えば、うっ血性心不全、高血圧及び心臓肥大を処理するために使用され得る。従って、本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドに作用可能に結合される治療ポリヌクレオチドを含んで成るベクターは、心疾患を処理し、そして新規及び改良された治療法を開発するために、構成され、そして患者に投与され得る。
いずれかの治療ポリヌクレオチドが、コリン発現制御領域ポリヌクレオチド、例えばコリンをコードするポリヌクレオチド（但し、それだけには限定されない）に作用可能に結合され得る。典型的には、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、発現カセットに含まれ、そして発現されるべき治療ポリヌクレオチドの5’端に挿入される。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、治療ポリヌクレオチドにすぐ隣接して位置するが、但しコリン発現制御領域ポリヌクレオチドエンハンサー要素は、治療ポリヌクレオチドの数キロ塩基以内、例えば治療ポリヌクレオチドの3’末端及びイントロン内に位置することができる。所定の位置から心臓−特異的転写を付与するコリン発現制御領域ポリヌクレオチドの能力が、レポーター遺伝子に対して、適切な配置でのコリン発現制御領域ポリヌクレオチドを位置決定し、そして本明細書に記載されるように、心臓−特異的レポーター遺伝子活性についてアッセイすることにより確められ得る。
コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、追加の配列を伴わないで、治療分子をコードするポリヌクレオチドに直接的に結合され得る。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドがコリン転写開始要素を含まない態様においては、追加の要素、例えばTATAボックス及び転写開始部位が供給されるべきである。それらは、治療遺伝子に生得の転写開始要素であるか、又は異種真核又はウィルスプロモーターから誘導され得る。さらに、治療遺伝子発現のレベルは、発現の心臓−特異性（本発明のアッセイにより測定されるような）が維持される限り、治療遺伝子又は異種遺伝子からのエンハンサー及びポリアデニル化配列を含むこちにより高められ得る。
心臓由来の細胞インビトロ及びインビボでトランスフェクトするためのベクター、心臓由来の細胞においてインビボで維持される発現を確める方法、心臓−特異的プロモーターに治療ポリヌクレオチドを作用可能に結合する方法、及び心臓細胞にベクターをインビトロ又はインビボで標的化するための方法、投与経路、及び治療ベクターによる心臓疾患の処理のための用量は、Tang など. (2002) Methods 28: 259-266; Philips など. (2002) Hypertension 39: 651-655; Prentice など. (1997) Cardiovas. Res. 35: 567-574; Beggah AT など. (2002) PNAS 99: 7160-7165; Monte など. (2003) J. Physiol. 546: 49-61に見出され得る。
従って、本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、種々の治療ポリヌクレオチドの心臓−特異的発現のために使用され得る。コリン発現制御領域ポリヌクレオチドにより発現される治療ポリペプチドは、それ自体活性的であり（例えば、アンチセンス及び触媒性ポリヌクレオチド）、又は治療有益性を有するタンパク質をコードする。
アンチセンス及び触媒リボヌクレオチドの発現：
コリン発現制御領域ポリヌクレオチドにより発現され得る１つのタイプの治療ポリヌクレオチドは、アンチセンスRNA又はiRNAである（Fire, A. (1999) Trends. Genet 15: 358-363; Sharp, P. (2001) Genes Dev. 15: 485-490）。そのような態様においては、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、細胞RNAポリメラーゼにより転写される場合、標的mRNAを結合できるポリヌクレオチドに作用可能に結合される。標的タンパク質をコードするcDNA配列に基づいてのアンチセンス配列の起源は、例えばStein & Cohen (1988) Cancer Res. 48: 2659-68 及び van der Krol など. (1988) BioTechniques 6: 958-76記載されている。
標的タンパク質は一般的に、その存在が心臓疾患に寄与するか、又はその疾病の可能性を低めると思われるタンパク質、例えばアンギオテンシン転換酵素、アンギオテンシンII受容体又はNF−ATCである（Stein など. (1998) Amer. Heart J. 135: 914-923; Levin など. (1998) New Eng. J. Med. 339: 321-328; Keating and Goa (2003) Drugs 63: 47-70）。従って、アンチセンス分子の心臓−特異的発現は、危険性のある個人におけるそれらのタンパク質の発現を選択的に低めることができる。心臓−特異的アンチセンス発現の好結果をもたらす使用は、Beggah ATなど., (2002) PNAS 99: 7160−7165に記載されている。そのようなアプローチは、心臓−特異的発現を用いての心臓線維症及び心臓疾患の処理において好結果をもたらすことがわかっている（Leeなど., (1966) Anticancer Res. 16: 1805-11）。
アンチセンスポリヌクレオチドの他に、リボザイムは、標的分子の発現を阻害するよう企画され得る。リボザイムは、他のRNA分子を触媒的に分解するRNA分子である。従って、本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、コリン発現制御領域ポリヌクレオチドに、リボザイムをコードするポリヌクレオチドを結合することにより、心臓由来の細胞においてリボザイムを特異的に発現するために使用され得る。異なった種類のリボザイム、例えばグループIリボザイム、ハンマーヘッドリボザイム、ヘアーピンリボザイム、RNアーゼ及びアクスヘッド（axhead）リボザイムは記載されている（例えば、異なったリボザイムの性質の一般的な再考については、Castanotto など. (1994) Adv. in Pharmacology 25 : 289-317を参照のこと）。
ヘアーピンリボザイムの一般的特徴は、たとえばHampel など. (1990) Nucl. Acids Res. 18: 299-304; Hampel など.,ヨーロッパ特許公開 第 0 360 257号 (1990); アメリカ特許第 5,254, 678号に記載されている。リボザイムの調製方法は、当業者に良く知られている（例えば、Wong-Staal など., WO 94/26877; Ojwang など. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6340-44; Yamadaなど. (1994) Hum. Gene Ther. 1: 39-45; Leavitt など. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 699-703; Leavitt など. (1994) Hum. Gene Ther. 5 : 1115-20 ; 及び Yamadaなど. (1994) Virology 205: 121-26を参照のこと）。
治療タンパク質の発現：
広範囲の種類の治療タンパク質が、心臓疾患を処理するために使用され得る。従って、本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、心臓細胞において治療タンパク質をコードするポリヌクレオチドを特異的に発現するために使用され得る。治療タンパク質は、原核生物、真核生物、ウィルス又は合成起源のものであり得る。治療タンパク質が哺乳類起源のものでない場合、そのタンパク質のコード配列は、当業界において知られている方法（例えば、哺乳類コドン使用法及びコンセンサス翻訳開始部位）に従って、最大の哺乳類発現のために修飾され得る。
治療タンパク質は、心臓−特異的発現を可能にするためにコリン発現制御領域ポリヌクレオチドに作用可能に結合され、そしていずれかの病因の心臓疾患、例えば虚血性心臓疾患、高血圧性心臓疾患、弁心臓疾患、心筋炎、Chagas心筋症及び特発性心筋炎を処理するために都合よく使用され得る。そのような治療タンパク質は、タンパク質、例えばプロ−心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（プロ−ANP）をANPに転換するコリン、ナトリウム分泌及び血管拡張を促進することにより血液体積及び血圧を低めるANP、及びB−型ナトリウム排泄増加性ペプチド（Stein など. (1998) Amer. Heart J. 135: 914-923; Levin など. (1998) Mew Eng. J. Med. 339: 321-328; Keating and Goa (2003) Drugs 63: 47-70）、並びにそのような遺伝子の負の優性形、すなわちコリン（Wu など. (2002) J. Biol. Chem. 277: 16900-16905）を包含するが、但しそれらだけには限定されない。
コリン発現のモジュレーターの同定：
本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドは、哺乳類、特にヒトにおける心臓関連疾患、例えば心血管性高血圧、うっ血性心不全又は心筋症の制御に使用される新規モジュレーターを同定するために使用され得る。そのようなモジュレーターは、異常レベルのコリン遺伝子発現を有する宿主を処理することにおいて有用である。コリン遺伝子モジュレーターはまた、コリン遺伝子発現により影響される疾病状態、例えば機械的延伸、血液体積、塩排泄、尿生成量及び血管運動調子を処理するためにも使用され得る。モジュレーターはまた、選択されたポリペプチドの発現レベルに関連する動物におけるヒト疾病又は状態を模倣することにおいても有用である。
特に、そのような発現に結合し、そしてそれを調節する剤は、前述のように、レポーター遺伝子、例えばコリン発現制御領域ポリヌクレオチドに作用可能に結合されているルシフェラーゼの転写レベルの変化を引き起こすそれらの能力により同定され得る（例２を参照のこと）。
上記方法においてはアッセイされ得る剤は、ランダムに選択されるか、又は合理的に選択されるか又は企画され得る。本明細書において使用される場合、剤は、その剤がいずれの特定の配列も考慮しないでランダムに選択される場合、ランダムに選択されると言われる。ランダムに選択された剤の例は、科学的ライブラリー、又は生物又は植物抽出物の増殖ブイヨンの使用である（Bunin, など. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 10997-10998 及び そこに組み込まれる引例）。
本明細書において使用される場合、剤は、その剤がその剤の使用に関連して、標的部位及び/又はそのコンホメーションの配列を考慮する非ランダム的基礎に基づいて選択される場合、合理的に選択されるか又は企画されると言われる。
遺伝子療法：
本発明は、インビトロ及びインビボでの治療目的のために細胞中にトランスフェクトされ得るコリン発現制御領域ポリヌクレオチドを提供する。それらの核酸は、下記に記載されるように標的細胞及び生物のトランスフェクションのための多くの良く知られているベクターのいずれか中に挿入され得る。核酸は、ベクター及び標的細胞の相互作用を通して、エクスビボ又はインビボで細胞中にトランスフェクトされる。典型的には、コリン発現制御領域ポリヌクレオチド及び第２の治療的に有用なポリヌクレオチドの操作可能的結合は、第２ポリヌクレオチドの心臓−特異的発現を誘発する。組成物は、患者において治療応答を誘発するのに十分な量で、患者に投与される。これを達成するのに適切な量は、“治療的有効用量又は量”として定義される。
そのような遺伝子治療方法は、多くの情況において生得の及び固有の遺伝子欠陥、癌及びウィルス感染を修正するために使用されて来た。ヒトにおける治療的に有用な人工遺伝子を発現する能力は、多くの重要なヒト疾病、例えば他の治療による処理に対して敏感に反応しない多くの疾病の予防及び/又は治療を促進する（遺伝子治療方法の再考に関しては、Anderson (1992) Science 256: 808-13 ; Nabel & Felgner, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 211-17 ; Mitani & Caskey, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 162-66; Mulligan, Science (1993), Vol. 260, pp. 926-32; Dillon, TIBTECH (1993), Vol. 11, pp. 167-75; Miller, Nature (1992), Vol. 357, pp. 455-60; Van Brunt, Biotechnology (1998), Vol. 6, pp. 1149-54; Vigne, Restorative Neurol. Neurosci. (1995), Vol. 8, pp. 35-36; Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin (1995), Vol. 51, pp. 31-44; Haddada など., in Current Topics in Microbiology and Immunology (Doerfler & Bohm eds. , 1995); 及び Yu など., Gene Therapy (1994), Vol. 1, pp. 13-26を参照のこと）。
細胞中への遺伝子又は遺伝子材料の供給は、遺伝子療法に基づく疾病処理における最初の段階である。多数の供給方法は、当業者に良く知られている。好ましくは、核酸は、インビボ又はエクスビボ遺伝子療法使用のために投与される。非ウィルスベクター供給システムは、DNAプラスミド、裸の核酸及び供給ビークル、例えばリポソームにより複合体化された核酸を包含する。ウィルスベクター供給システムは、細胞への供給後、エピソーム又は組込まれたゲノムのいずれかを有する、DNA及びRNAウィルスを包含する。
核酸の非ウィルス供給方法は、リポフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスチックス（biolistics）、ビロソーム（virosome）、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオン又は脂質：核酸接合体、裸のDNA、人工ビリオン及びDNAの剤−増強された摂取を包含する。リポフェクションは、例えばアメリカ特許第5,049,386号、第4,946,787号及び第4,897,355号に記載されており、そしてリポフェクション試薬は市販されている（例えば、TransfectamTM及びLipofectionTM）。ポリヌクレオチドの効果的受容体−認識リポフェクションのために適切であるカチオン性及び中性脂質は、WO91/17424号及びWO91/16024号（Felgner）のそれらを包含する。供給は、細胞（エクスビボ投与）又は標的組織（インビボ投与）に対してである。
脂質：核酸複合体、例えば標的化されたリポソーム、例えばイムノ脂質複合体の調製は、当業者に良く知られている（例えば、Crystal, Science (1995), Vol. 270, pp. 404-10; Blaese など., Cancer Gene Ther. (1995), Vol. 2, pp. 291-97; Behr など., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 382-89; Remy など., Bioconjugate Chem. (1994), Vol. 5, pp. 647-54; Gao など., Gene Therapy (1995), Vol. 2, pp. 710-22; Ahmad など., CancerRes. (1992), Vol. 52, pp. 4817-20; アメリカ特許第4,186, 183号,4, 217,344号, 第4,235, 871号,第4,261,975号, 第4,485,054号,第4, 501,728号, 第4,774, 085号,第 4,837, 028号,及び第4,946, 787号を参照のこと）。
核酸の供給のためへのRNA又はDNAウィルスに基づくシステムの使用は、身体における特定細胞へのウィルスの標的化及び核へのウィルス弾頭のトラフィッキングのための高く開発された方法を利用する。ウィルスベクターは患者に直接的に投与され得るか（インビボ）、又はそれらはインビトロで細胞を処理するために使用され得、そして修飾された細胞が患者に投与される（エクスビボ）。核酸の供給のための従来のウィルスに基づくシステムは、遺伝子トランスファーのためのレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、アデノ−関連及びヘルペス単純ウィルスベクターを包含する。ウィルスベクターは現在、標的細胞及び組織における遺伝子トランスファーの最も効果的且つ用途の広い方法である。
宿主ゲノムへの組込みは、しばしば挿入されたトランスジーンの長期発現をもたらす、レトロウィルス、レンチウィルス及びアデノ−関連ウィルス遺伝子トランスファー方法により可能である。さらに、高いトランスダクション効率が、多くの異なった細胞型及び標的組織において観察されている。特に、少なくとも６種のウィルスベクターアプローチが現在、臨床試験において遺伝子トランスファーのために利用でき、そしてレトロウィルスベクターが最も頻繁に使用されるシステムである。それらのウィルスベクターのすべては、形質導入剤を生成するためにヘルパー細胞系中に挿入される遺伝子による欠陥ベクターの補足を包含するアプローチを使用する。
レトロウィルスの親和性は、外来性エンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の可能性である標的集団を拡張することにより変更され得る。レンチウィルスベクターは、非分裂細胞を形質導入するか又は感染し、そして典型的には、高いウィルス力価を生成できるレトロウィルスベクターである。従って、レトロウィルス遺伝子トランスファーシステムの選択は、標的組織に依存する。レトロウィルスベクターは、６〜10kbpの外来性配列のパッケージング能力を有するシス−作用性の長い末端の反復体から構成される。最小のシス−作用性LTRが、ベクターの複製及びパッケージングのために十分であり、それらは次に、永久的トランスジーン発現を提供するために標的細胞中に治療遺伝子を組込むために使用される。
広く使用されるレトロウィルスベクターは、ネズミ白血病ウィルス（MuLV）、テナガザル白血病ウィルス（GalV）、サル免疫欠損ウィルス（SIV）、ヒト免疫欠損ウィルス（HIV）及びそれらの組合せに基づかれるそれらを包含する（例えば、Buchscher など., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 2731-39; Johann など., J. Virol. (1992), Vol. 66, pp. 1635-40; Sommerfelt など., Virology (1990), Vol. 176, pp. 58-59; Wilson など., J. Virol. (1989), Vol. 63, pp. 2374-78; Miller など., J. Virol. (1991), Vol. 65, pp. 2220-24; PCT/US94/05700号を参照のこと）。
pLASN及びMFG-Sは、臨床試験に使用されて来たレトロウィルスベクターの例である（Dunbar など., Blood (1995), Vol. 85, pp. 3048-57; Kohn など., Nat. Med. (1995), Vol. 1, pp. 1017-23; Malech など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1997), Vol. 94, pp. 12133-38）。PA317/pLASNは、遺伝子療法試験に使用される最初の治療ベクターであった（Blaese など., Science (1995), Vol. 270, pp. 475-80）。50％又はそれ以上のトランスダクション効率が、MFG−Sパッケージングされたベクターに関して観察されている（Ellem など., Immunol. Immunother. (1997), Vol. 44, pp. 10-20; Dranoff など., Hum. Gene Ther. (1997), Vol. 1, pp. 111-23）。
核酸の一時的発現が好ましい適用においては、アデノウィルスに基づくシステムが典型的には使用される。アデノウィルスに基づくベクターは、多くの細胞型において非常に高いトランスダクションの効率のものであり得、そして細胞分裂を必要としない。そのようなベクターにより、高い力価及びレベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純なシステムにおいて多量に生成され得る。アデノ−関連のウィルス（“AAV”）ベクターはまた、例えば核酸及びペプチドのインビトロ生成において、及びインビボ及びエクスビボ遺伝子療法生成のために、標的核酸により細胞を形質導入するためにも使用される（例えば、West など., Virology (1987), Vol. 160, pp. 38-47; アメリカ特許第4,797, 368号; WO 93/24641号; Kotin, Hum. Gene Ther. (1994), Vol. 5, pp. 793-801; Muzyczka, J. Clin. Invest. (1994), Vol. 94, pp. 1351を参照のこと）。
組換えAAVベクターの構成は、多くの出版物、例えば（アメリカ特許第5,173, 414号; Tratschin など., Mol. Cell. Biol. (1985), Vol. 5, pp. 3251-60; Tratschin など., Mol. Cell. Biol. (1984), Vol. 4, pp. 2072-81; Hermonat & Muzyczka, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1984), Vol. 81, pp. 6466-70; 及び Samulski など, J. Virol. (1989), Vol. 63, pp. 3822-28）に記載されている。
組換えアデノ−関連ウィルスベクター（rAAV）は、欠陥及び非病原性パルボウィルスアデノ−関連タイプ２ウィルスに基づく有望なもう１つの遺伝子供給システムである。すべてのベクターは、トランスジーンカセットを両端に有するAAV 145bpの逆方向末端反復体のみを保持するプラスミドから誘導される。形質導入された細胞のゲノム中への組込みによる効果的遺伝子トランスファー及び安定したトランスジーン供給は、このベクターシステムの大きめのキー特徴である（Wagner など, Lancet (1998), Vol. 351, pp. 1702-03; Kearns など., Gene Ther. (1996), Vol. 9, pp. 748-55）。
複製−欠失組換えアデノウィルスベクター（Ad）は、それらが高い力価で生成され得、そして多くの異なった細胞型を容易に感染するので、一時的な発現遺伝子療法に優先的に使用される。ほとんどのアデノウィルスベクターは、トランスジーンがAd, E1a, E1b及びE3遺伝子を置換するよう構成され；続いて、複製欠失ベクターが、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト293細胞において増殖される。Adベクターは、インビボで複数型の組織、例えば非分裂性の分化された細胞、例えば肝臓、人造及び筋肉系組織に見出されるそれらの細胞を形質導入することができる。従来のAdベクターは、大きな担持能力を有する。
臨床試験へのAdベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療を包含した（Sterman など., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-92）。臨床試験における遺伝子トランスファーのためへのアデノウィルスベクターの使用の追加の例は、Rosenecker など., Infection (1996), Vol. 241, pp. 5-10; Welsh など., Hum. Gene Ther. (1995), Vol. 2, pp. 205-18; Alvarezなど., Hum. Gene Ther. (1997), Vol. 5, pp. 597-613; Topf など., Gene Ther. (1998), Vol. 5, pp. 507-13; Sterman など., Hum. Gene Ther. (1998), Vol. 9, pp. 1083-89を包含する。
多くの遺伝子療法用途においては、遺伝子療法ベクターが特定の組織型に高い特異性で供給されることが所望される。ウィルスベクターは典型的には、ウィルスの外表面上にウィルスコードタンパク質を有する融合タンパク質としてリガンドを発現することにより、所定の細胞型に対する特異性を有するよう修飾される。リガンドは、興味ある細胞型上に存在することが知られている受容体に対する親和性を有するよう選択される。例えば、Han など., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1995), Vol. 92, pp. 9747- 51は、Maloneyネズミ白血病ウィルスがgp70に融合されるヒトヘレグリンを発現するために修飾され、そして組換えウィルスがヒト上皮成長因子受容体を発現する一定のヒト乳癌細胞を感染することを報告している。
この原理は、リガンド融合タンパク質を発現する他の対のウィルス、及び受容体を発現する標的細胞に拡張され得る。例えば、線上ファージは、実質的にいずれかの選択された細胞受容体についての特異的結合親和性を有する抗体フラグメント（例えば、Fab又はFv）を示すよう構築され得る。上記の記載は主にウィルスベクターに適用されるが、同じ原理が非ウィルスベクターに適用され得る。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取り込みを好むと思われる特定の取り込み配列を含むよう構築され得る。
医薬組成物及び投与：
本発明はまた、コリン発現制御領域、又は医薬的に許容できる担体と共に前記発現制御領域を含んで成るベクターを含んで成る医薬組成物に関する。本発明の１つの態様においては、医薬的に許容できる担体は医薬的に不活性である。
遺伝子療法ベクターは、下記に記載されるように、典型的には全身性投与（例えば、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）、又は局部適用による個々の患者への投与によりインビボで供給され得る。他方では、ベクターは、エクスビボで、細胞、例えば個々の患者から拡張された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引物、組織生検）、又は普遍的なドナー造血幹細胞に供給され、続いて、通常ベクターを組込んだ細胞についての選択の後、患者への細胞の再移植を伴う。
診断、調査又は遺伝子療法のためのエクスビボ細胞トランスフェクション（例えば、宿主生物中へのトランスフェクトされた細胞の再注入を通しての）は、当業者に良く知られている。好ましい態様においては、細胞は、対象生物から単離され、核酸（遺伝子又はcDNA）によりトランスフェクトされ、そして対象生物（例えば、患者）中に再注入される。エクスビボトランスフェクションのために適切な種々の細胞型は、当業者に良く知られている（たとえば、Freshney など., Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique (3rd ed. , 1994)及び患者から細胞をいかに単離し、そして培養するかの議論について、そして引用される引例を参照のこと）。
治療核酸を含むベクター（例えば、レトロウィルス、アデノウィルス、リポソーム、等）はまた、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接的に投与され得る。他方では、裸のDNAが投与され得る。投与は、血液又は組織細胞との究極的な接触中に分子を通常、導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸の適切な投与方法は、入手でき、そして当業者に知られており、そして１つよりも多くの経路が特定の組成物を投与するために使用され得るが、特定の経路はしばしば、もう１つの経路よりもより即効的な反応を提供することができる。
医薬的に許容できる担体は、投与される特定の組成（例えば、核酸、タンパク質、調節化合物又は形質導入された細胞）により、及び組成物を投与するために使用される特定の方法により一部決定される。従って、本発明の医薬組成物の広範囲の種類の適切な配合物が存在する（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1 7th ed., 1989を参照のこと）。投与はいずれかの便利な手段で、例えば注射、経口投与、吸入、又は経皮適用により行われ得る。
経口投与のために適切な配合物は、次のものから成ることができる：（ａ）液体溶液、例えば希釈剤、例えば水、塩溶液又はPEG400に懸濁された、有効量のパッケージングされた核酸；（ｂ）液体、固体、顆粒又はゼラチンとして、予定された量の活性成分をそれぞれ含むカプセル、香粉又は錠剤；（ｃ）適切な液体における懸濁液；及び（ｄ）適切なエマルジョン。
錠剤形は、１又は複数のラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモ澱粉、微晶性セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化珪素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、保湿剤、保存剤、風味剤、顔料、粉砕剤、及び医薬的に適当できる担体を含む。ロゼンジ形は、風味剤、例えばスクロース中、活性成分を含んで成り、そして香剤は不活性塩基、例えばゼラチン及びグリセリン又はスクロース中、活性成分を含んで成り、そしてアカシアエマルジョン、ゲル及び同様のものは、活性成分の他に、当業界において知られている担体を含む。
選択の化合物は、単独で又は他の適切な成分と組合わして、吸入を通して投与されるエアロゾル配合物に製造され得る（すなわち、それらは“ネブライズ化”され得る）。エアロゾル配合物は、圧縮された許容できる噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素及び同様のものの中に配置され得る。
非経口投与、例えば、関節内（関節）、静脈内、筋肉内、経皮用、腹腔内及び皮下経口による投与のために適切な配合物は、酸化防止剤、緩衝液、静菌剤、及び意図された受容体の血液と配合物とを等張性にする溶質を含むことができる。水性及び排水性等張無菌注射溶液、及び沈殿防止剤、溶解剤、増粘剤、安定剤及び保存剤を含むことができる、水性及び非水性無菌懸濁液を包含する。本発明の実質においては、組成物は、例えば静脈内注入、経口、局部的、腹腔内、膀胱内又は鞘内投与され得る。非経口投与及び静脈内投与が、好ましい投与方法である。生成物の配合物は、単位−用量又は多−用量の密封された容器、例えばアンプル及びバイアルに提供され得る。
注射用溶液及び懸濁液は、前に記載された種類の無菌の粉末、顆粒及び錠剤から調製され得る。エクスビボ療法に関しての核酸により形質導入された細胞はまた、上記のように、静脈内又は非経口投与され得る。
本発明に関して、患者に投与される用量は、時間にわたって患者における効果的な治療応答をもたらすのに十分であるべきである。その用量は、使用される特定のベクターの効能、及び患者の状態、及び処理される患者の体重又は表面積により決定されるであろう。用量のサイズはまた、存在物、自然、及び特定患者における特定ベクター又は形質導入された細胞型の投与に付随するいずれかの副作用の程度により決定されるであろう。
投与されるベクターの有効量の決定においては、医者は、ベクターの循環血漿レベル、ベクター毒性、疾病の進行及び抗ベクター抗体の生成を評価する。一般的に、ベクターからの裸の核酸の用量は、典型的な70kgの患者当たり約１μg〜100μgであり、そしてレトロウィルス粒子を含むベクターの用量は、等量の治療核酸を生成するために計算される。
投与に関しては、本発明の化合物及び形質導入された細胞は、患者の質量及び全体的健康に適用される場合、インヒビター、ベクター又は形質導入された細胞型のLD−50、及び種々の濃度でのインヒビター、ベクター又は細胞型の副作用により決定される速度で投与され得る。投与は、単一又は分割された用量を通して達成され得る。
キット：
本発明はさらに、本発明の前述の組成物中の１又は複数の成分により充填される１又は複数の容器を含んで成る医薬パック及びキットに関する。医薬又は生物学的生成物の製造、使用又は市販を規定する政府機関により処方され、ヒト投与のための生成物の製造、使用又は市販の政府機関による許可を表す形でのそのような容器が注目される。
トランスジェニック：
本発明のコリン発現制御領域ポリヌクレオチドはまた、トランスジェニック哺乳類、好ましくはマウスを生成するためにも使用され得る。そのようなトランスジェニック生成物は、例えばそのようなポリヌクレオチドの発現及び/又は活性を調節する剤を同定し、そして/又は特徴づけるために有用である。トランスジェニック動物はまた、心臓疾患状態についてのモデルとしても有用である。本明細書に開示される発明はまた、本発明のポリヌクレオチドの１又は複数のコピーを、そのゲノム内に含んで成る非ヒトトランスジェニック動物にも関する。本発明のトランスジェニック動物は、前記ポリヌクレオチドの１又は複数のコピーを、それらのゲノム内に含むことができる。
好ましい態様においては、トランスジェニック動物は、ヒトコリン遺伝子の発現制御領域をそのゲノム内に含んで成る。種々の非トランスジェニック生物、例えばショウジョウバエ、C. エレガンス（C. elegans）、ゼブラフィッシュ及び酵母が、本発明により包含される。本発明のトランスジェニック動物は、好ましくは哺乳類、例えばウシ、ヤギ、羊、ウサギ、非ヒト霊長類又はラット、最も好ましくはマウスである。
トランスジェニック動物の生成方法は、当業者の範囲内であり、そして例えば相同組換え、突然変異誘発（例えば、ENU, Rathkolb など. (2000) Exp. Physio., 85: 635-644）、及びテトラサイクリン−調節された遺伝子発現システム（例えば、アメリカ特許第6,242,667号）を包含し、そして本明細においては詳細に記載されないであろう（例えば、Wu など, Methods in Gene Biotechnology, CRC 1997, pp. 339-366; Jacenko, O., Strategies in Generating Transgenic Animals, in Recombinant Gene Expression Protocols, Vol. 62 of Methods in Molecular Biology, Humana Press, 1997, pp 399-424を参照のこと）。
本発明はまた、そのゲノムが、レポーターに作用可能に結合されるヒトコリン遺伝子の発現制御領域（前記領域は、レポーター配列の転写を開始し、終結し、又は調節するのに効果的である）を含む非ヒトノックアウト動物にも関する。
制御配列により作用可能に結合されるレポーター配列の機能的破壊は、いずれかの効果的手段、例えば得られるポリペプチドが生物学的不活性である（例えば、触媒ドメイン、リガンド結合ドメイン、等を欠いているので）ようコード配列のいずれかの部分中への停止コドンの導入、不活性化するレポーター配列への外因性のレポーター配列の転写を停止するか、又は低めるのに効果的であるプロモーター又は他の調節配列中への突然変異の導入により達成され得る。機能的に破壊された遺伝子を有するトランスジェニック動物の例は、アメリカ特許第6,239,326号、第6,225,525号、第6,207,878号に記載されるように、良く知られている。
さらなる労力を伴わないで、当業者は前述の記載を用いて、本発明を十分な程度、利用すると思われる。すべての例は、特にことわらない限り、当業界において良く知られている標準の技法を用いて行われる。次の例の通常の分子生物学技法は、標準の実験マニュアル、例えばSambrook など., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. , 1989に記載されるようにして行われ得る。
従って、次の好ましい特定の態様は、単なる例示として構成され、そして本発明の範囲を制限するものではない。すべての出願、特許及び引用される出版物のすべての用事は、引用により本明細書に組込まれる。
例１．5’−フランキング領域を含むヒト及びマウスコリン遺伝子の単離及び特徴化
ヒト及びネズミコリン遺伝子及びそれらの5’−フランキング領域をクローン化するために、コリンcDNA配列の5’−及び3’−末端に対応する特定のオリゴヌクレオチドを合成した。それらのオリゴヌクレオチドプライマーを、ヒト又はネズミゲノムDNAを用いて、PCRに基づく反応における特定の生成物の増幅について試験した。PCR反応を、30サイクルの増幅（94℃での１分間の変性、50℃での１分間のアニーリング及び72℃での１分間の延長）及び72℃での最終の７分間の延長を伴って、PCR Reagent System (Life Technologies Inc.) を用いて行った。
次に、特定のPCR生成物を都合よく増幅したプライマー対を、ヒト又はネズミコリン遺伝子及び/又はそれらの発現制御の領域を含むBACクローンを同定するために、PCRに基づくスクリーンに使用した。BACクローンからのDNA単離を、製造業者の説明書（Incyte Genomics, Palo Alto, CA）に従って行った。さらに、同定された陽性細菌人工染色体（BAC）クローンを、32P−ラベルされたヒト及びネズミコリンcDNAプローブを用いて、サザン分析により確めた。BACクローンを、ショットガン方法により直接的に配列決定するか、又は配列決定のためにpUC118 (PanVera/Takara, Madison, WI) 中にサブクローン化した。ショットガン配列のアッセンブリーを、Stadenソフトウェアパッケージ（MRC Laboratory of Molecular Biology; Bonfield など. (1995) Nucleic Acid Res. 23: 4992-4999）を用いて行った。
４種のBACクローン（２種のそれぞれはヒト及びネズミコリン遺伝子を含む）を、PCRに基づくスクリーニングにより得る。３種のBACクローンを、染色ターミネーター化学を用いて、ショットガン方法により配列決定した。ショットガンデータと公的に入手できる追跡ファイル情報（http : //www. ncbi. nlm. nih. gov : 80/Traces/trace. cqi, http ://trace. ensembl. orq）との組合せを用いて、ヒトコリン遺伝子を含む340bpの連続配列及びネズミコリン遺伝子についての５種のコンチグをアセンブリーした。
６個のコンチグの順序は、それぞれの隣接するコンチグにおけるいくつかの対合された読み取り対の存在により確められた。それらの距離は、公開のショットガンライブラリーの挿入体サイズは十分に定義されているので、500bp以下のギャップサイズの決定を可能にした。ヒト及びネズミコリン遺伝子の構造を分析した。しかしながら、340kbのヒトゲノム配列は、5’−フランキング領域を含まなかった。追加の4165bpのHindIII −EcoRIフラグメントをBAC26540から単離し、これは5’−フランキング領域の最初の3919bp、すべてのエキソン１及びイントロン１の一部を含んだ（受託番号AF521006号として、GenBankTM/EBIデータバンクに提出されている）。
コリン発現領域ポリヌクレオチド（配列番号４，５及び６）をPCRに基づく方法、又は制限酵素消化、又は両者の組合せを用いて、BAC26540から単離された、4165bpのHindIII −EcoRIフラグメント（図８、配列番号２）から誘導した。例えば、本明細書に記載される4023bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号６）を、プライマーF1（5'-AAGCTTCATGAGGGCAGGAG-3'）（配列番号７）及びR1（5'-GAGCTCGCTTATTCTTCTGTCCACTT-3'）（配列番号８）を用いて、4165bpのHindIII - EcoRIフラグメント又はヒトゲノムDNAから増幅した。
本明細書に記載される1283bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号５）を、プライマーF2（5'-AAGCTTATAAAAATAATAGCTTCTTC-3'）（配列番号９）及びR1を用いて、4165bpのHindIII -EcoRIフラグメントから増幅した。本明細書に記載される391bpのコリン発現制御領域ポリヌクレオチド（配列番号４）を、プライマーF3（5'-AAGCTTAGTAACTCTTTTGCTCCCAA-3'）（配列番号10）及びR1を用いて、4165bpのHindIII -EcoRIフラグメント又はヒトゲノムDNAから増幅した。DNAが容易に抽出され得るいずれかの哺乳類組織、例えば白血球細胞は、哺乳類コリンポリヌクレオチドの単離のためのゲノムDNAの適切な源である。
例２．5’−フランキング領域のプロモーター活性
コリン遺伝子の5’−フランキング領域のプロモーター活性を、ヒト又はネズミコリン遺伝子の5’−フランキング配列の連続的に切断されたフラグメントがプロモーターを有さないルシフェラーゼ遺伝子に結合されているレポーター構造体を調製することにより試験した（図4Aを参照のこと）。
ヒトコリンプロモーターレポーター構造体、hCp1297LUC（ホタルルシフェラーゼ遺伝子に結合される1383bpのコリン発現制御領域（配列番号５）及びhCp405LUC（ホタルルシフェラーゼ遺伝子結合される391bpのコリン発現制御領域（配列番号４）を、次の２段階で生成した：第１、それぞれSacI及びHindIII の制限部位を担持するプライマーを用いての−1297又は−405〜−15（翻訳開始コドンATGに対する）からのヒトコリン遺伝子の5’−フランキング領域のPCRに基づくクローニング；及び第２、pGL3−基本ベクター（Pramega, Madison, WI）のSacI及びHindIII 部位中へのそれぞれのPCR生成物の挿入。
同様に、ネズミコリンプロモーター構造体、mCp1183LUC, mCp809LUC 及び mCp646LUCをまた、EndoFree Plasmid Maxi kit (Qiagen, Valencia, CA)を用いて調製した。HL-5細胞（Claycomb など. (1998) Proc. Nati. Acad. Sci., USA 95: 2979-2984）のトランスフェクションを、リポフェクチンに基づく方法を用いて、その製造業者の説明書（Life Technologies）に従って行った。手短には、コリンレポーター構造体の個々のDNA10μg及び0.1μgのpRL-SV40 (Promega, Madison, WI)を、1mlのCPTI−MEMI還元された血清培地にわたって20μgのリポフェクチンと共に混合した。
その混合物を室温で30分間インキュベートし、そして次に６−ウェルプレートの１つのウェルにおいて培養されたHL-5に添加し、約70％の集密性にした。６時間のインキュベーションの後、培地を、新鮮なEx−Cell320培養培地により置換し；そして30時間後、トランスフェクトされた細胞を収穫し、そしてホタル及びレニラルシフェラーゼ活性についてアッセイした。二重ルシフェラーゼ活性アッセイを、製造業者の説明書（Promega）に従って行った。手短には、細胞抽出物を、トランスフェクトされた細胞を50μlの新しく希釈された受動性溶解緩衝液（Promega）により溶解することにより調製した。
溶解物を凍結し、そして融解し、その後、13,000rpmで５分間、遠心分離し、細胞残骸をペレット化した。上清液を新しい管に移し、そして上清液の20μlのアリコートを、Dual−Luciferase Reporter Assay Systemによりアッセイした。サンプルの発光を、Microplate Luminometer LB96 V (EG & G Berthold)によりモニターし、光生成（相対光単位）を10秒間、測定した。細胞抽出物の個々を三重反復してアッセイした。個々の構造体についての個々のトランスフェクション実験を、三重反復して行った。ホタルルシフェラーゼ活性を、レニラルシフェラーゼの活性に対して標準化した。
図4Bに示されるように、ヒトコリンレポーター構造体、hCP1297LUC 及び hCP405LUCは、pGL3に基づくトランスフェクトされた細胞におけるバックグラウンドよりも有意に高いルシフェラーゼ活性を促進した。同様に、ネズミ受容体構造体mCp1183LUC, mCp809LUC,及び mCp646LUCは、ヒト構造体のそれらに比較できる有意なルシフェラーゼ活性を促進した。それらのデータは、ほとんどのプロモーター活性を担当できるシス配列がそれぞれヒト及びネズミコリン遺伝子においてヌクレオチド−405〜−15又はヌクレオチド−646〜−77間に位置することを示唆する。
例３．心臓−特異的発現の表示
構造体が心臓−特異的発現を仲介するかどうかを決定するために、コリンmRNA及びタンパク質を発現しないHela細胞（ATCC No. CCL2）を、上記に記載される構造体によりトランスフェクトした。HL-5細胞におけるそれらの高い活性に比較して、構造体hCp405LUC 及び mCp646LUCは、HeLa細胞において最初のプロモーター活性のみを有した（図５）。
対照として、同時にトランスフェクトされたpRL-SV40は、HL−5細胞におけるよりもHeLa細胞において高いレベルのレニラルシフェラーゼ活性を促進し、このことは、HeLa細胞がそれらの実験においてHL-5細胞として容易にトランスフェクトされることを示した。それらは、ヒトコリン遺伝子の−405〜−15又はネズミコリン遺伝子の−645〜−77からの5’−フランキング配列が、培養された心臓細胞における特異的発現のために十分である要素を含むことを示す。
例４．GATA−４に結合する近位GATA要素がコリンプロモーターの最適な機能のために必要とされる
ヒトにおけるヌクレオチド−405〜−15又はマウスにおけるヌクレオチド−646〜−77の5’−フランキング領域は、HeLa細胞においてではなく、培養された心筋細胞において高レベルの遺伝子発現を促進するために十分であった。これは、それらの領域が心筋細胞−特異的発現を担当する調節要素を含むことを示唆する。それらの領域の調査は、保存されたGATAコンセンサス配列（近位のGATA配列として企画される）を示した。
近位GATA配列が実際、GATAタンパク質に結合するかどうかを決定するために、本発明者は、Schreiber E. など., (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6419に記載されるように、指数的に増殖するHL-5細胞から核抽出物を調製し、そして十分に特徴づけられたコンセンサスGATAオリゴヌクレオチドプローブ（Redondo, J. M. など. (1990) Science 247 (4947), 1225-9）及び近位GATA配列（図6A）の個々を包含するプローブを用いて、競争電気泳動移動シフトアッセイ（EMSA）を行った。２種のコンセンサスGATA配列又は突然変異誘発されたGATA配列（GATA→CTTA）を含む二本鎖オリゴヌクレオチドプローブを、Santa Cruz Biotechnologyから購入した。
ヒト又はネズミコリンGATA（それぞれ配列番号11及びB）、又は突然変異誘発されたヒト及びネズミコリンGATA（GATA→CTTA）（それぞれ配列番号12及び14）を包含するプローブ（図6Aを参照のこと）を、合成し、そしてHPLC−精製した。オリゴヌクレオチドプローブを、[γ−32P]ATP（3000 Ci/mモル、Amersham Pharmacia Biotech）を用いて、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（Life Technologies）により5’−末端ラベルした。ゲル移動シフトアッセイを、前述のように行った（Pan, J. & McEver R. P. (1993) J. Biol. Chem. 268: 22600-22608）。予測されるように、ラベルされたコンセンサスGATAプローブ（配列番号15）は、HL-5細胞の核抽出と共にインキュベートされる場合、配列−特異的DNA−タンパク質複合体を形成した（図6B）。
この複合体を形成は、関連しないGAS要素ではなく、100倍過剰のラベルされていないプローブの添加により妨げられた。複合体形成は、GATA配列における突然変異誘発が複合体の形成を破壊するので、損なわれていないGATA配列に依存する。さらに、その複合体は、ヒト又はネズミ近位GATA配列を含むラベルされていない、100倍過剰のラベルされていないプローブの存在下で検出されなかった。対照的に、変異体近位GATA配列（配列番号12及び14）を包含する、100倍過剰のラベルされていないプローブは、複合体形成に対して最少の効果を有した。それらのデータは、コリン近位GATA配列及びコンセンサスGATAプローブが通常のGATAタンパク質に結合することを示す。
GATAタンパク質が複合体に含まれるかどうかを決定するために、本発明者は、GATAファミリーのメンバーに対する抗体の存在下でラベルされたコンセンサスGATAプローブによりEMSAを行った。マウスGATA-1 (SC-1234x), GATA-3 (SC-268x), GATA-4 (SC-12237x) 及び GATA-6 (SC-7244x)に対する抗体を、Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA)から入出した。図６Cに示されるように、GATA-4に対する抗体は、複合体形成を著しく阻害したが、ところがGATA-1, -3及び-6対する抗体はほとんど効果がなかった。
近位GATA配列へのGATA-4の結合を直接的に示すために、本発明者は、GATA-4に対する同じ抗体の不在又は存在下でラベルされたヒト近位GATAプローブを使用した。図６Dに示されるように、GATA-4に対する抗体は、コンセンサスGATAプローブにより形成される複合体の移動度に類似する移動度を有するDNA−タンパク質複合体の形成を完全に阻害した。それらのデータは、GATA-4が近位GATA配列に結合することを示し、このことは、近位GATA配列へのGATA-4の結合が心筋細胞におけるコリンの遺伝子発現に寄与することを示唆する。
近位GATA要素がプロモーター活性のために実際的に必要とされるかどうかを確証するために、本発明者は、最高のプロモーター活性を促進したヒト又はネズミ構造体において、野生型AGATAAをACTTAAに突然変異誘発した（図７）。変異体構造体hCp405mutGATA 及び mCp646mutGATAを、オーバーラップPCRプロトコール（Ho S. N.など., (1989) Gene (Amst) 77: 51-59）により構成した。手短には、２種の別々のPCR生成物（１つは、ハイブリッド生成物の個々の半分である）を、アンチセンス又はセンス突然変異誘発されたGATAオリゴヌクレオチド及び１つの外部プライマーにより生成した。２つの生成物を精製し、そして混合した。
次に、第２のPCRを、２種の外部プライマーを用いて行った。PCR生成物を、SacI及びHindIII により消化し、そしてSacI−及びHindIII −消化されたpGL3−基本ベクターに連結した。すべての構造体を、制限マッピング及びDNA配列決定により確めた。GATA要素における突然変異は、EMSAに使用される変異体GATAプローブにより行われたそれらの突然変異と同じであった。HL-5中のトランスフェクトされる場合、ヒト及びネズミ変異体構造体は、それらのそれぞれの野生型配列に比較して、プローブ活性の10％又は42％を有した。それらの結果は、近位GATA要素が培養された心筋細胞におけるヒト又はネズミコリン遺伝子の構成的発現のために必要とされることを示す。
前述の例は、遺伝子的に又は特異的に記載される本発明の反応及び/又は操作条件と前述の例に使用されるそれらとを置換することにより、類似するこの結果を伴って反復され得る。
本発明はある融合タンパク質構造体の生成に関して例示されてきたが、本発明の変更及び修飾が本発明の範囲内で行われ得ることは明らかであろう。
図１は、哺乳類コリン遺伝子の構成を示す。（A）ヒト及び（B）マウスコリン遺伝子の構成が示される。２種のBACクローンをショットガン方法により配列決定し、そしてそれらのアセンブリーされた挿入体配列のサイズを示す。垂直の棒はエキソンを示す。ヒト遺伝子におけるBAC26540からのサブクローニングのために使用されるプラスミドクローンは、制限酵素部位（H. HindIII ；E. EcoRI）により示される。サブクローンの挿入体を、自動配列決定を用いて、プライマー延長方法により配列決定した。底部で、BA（クローン、コンチグ、及びコリン遺伝子まで及びプラスミドクローンの位置が示される。
図２は、コリンのタンパク質ドメインに対するイントロン−エキソン境界位置を示す。コリン遺伝子のエキソン１〜22（上部パネル）が、それらの対応するタンパク質ドメインと共に整列される。TM：トランスメンブランドメイン；Frizzled：frizzled−様システインに富んでいるドメイン；LDLR：LDL受容体反復体；SRCR：スキャベンジャー受容体システイン−富化ドメイン；H, DA及びS：プロテアーゼドメインの触媒三元体のHis, Asp及びSer残基。
図３は、ヒト（配列番号１）及びマウス（配列番号３）コリン遺伝子の5’−フランキング領域の一列整列を示す。5’−フランキング領域、エキソン１、及びイントロン１の一部が、ヒト及びネズミ遺伝子間で整列されている。番号づけは、翻訳開始体ATGに対してである（太字型及びイタリック型）。示される番号は、最初のエキソンにおける相違のために、ヒト及びマウスの間で異なる。矢頭は、ヒトコリン遺伝子の最初のエキソンオ及びイントロン間の結合を示し、そしてヒトイントロン１のドナースプライス配列は下線が引かれている。推定上の調節配列が示され、そして太字分類されている（Tbx5に結合するためのTbx5部位、転写因子を含むT−ボックス、NF−AT：活性化されたT細胞の核因子のための結合部位；GATA：GATAタンパク質のための結合要素；Kruppel−様因子に結合するためのGTボックス；基本的転写因子TFIIDに結合するためのTATAボックス；及びNKE：Nxk2.5のための結合モチーフ）。近位GATA配列とオーバーラップするNKE配列は下線が引かれている。
図４は、培養された心筋細胞におけるコリン遺伝子プロモーター活性の機能的分析を示す。ルシフェラーゼ遺伝子に結合されるヒト及びネズミコリン遺伝子の5’−フランキング領域の一連の切断されたセグメントを含むレポーター構造体が図解される（パネルA）。推定上の調節要素の位置が示されている。それらの構造体は、pRL-SV40、すなわちSV40ウィルスプロモーターにより駆動されるレリナルシフェラーゼ発現プラスミドによりマウスHL-5細胞中に同時トランスフェクトされた。個々の構造体により発現されたルシフェラーゼ活性が、個々のトランスフェクションのためにpRL-SV40により発現されたレリナルシフェラーゼの活性に対して標準化された。個々のトランスフェクション実験は、個々の構造体について三重反復して行われた。そのデータは、３種の孤立した実験の平均±S.D.を表す（パネルB）。
図５は、ヒト及びネズミコリン遺伝子からの5’−フラッキング配列の心臓−特異的発現を示す。心筋細胞HL5細胞及び上皮HeLa細胞が、対照の構造体pRL-SV40と共に、示される構造体によりトランスフェクトされた。ルシフェラーゼ及びレリナ活性が、トランスフェクトされた細胞からの細胞抽出物の20μlアリコート当たりの光単位として表される。個々のトランスフェクション実験は、三重反復して行われた。データは、３種の独立した実験の平均±S.D.を表す。
図６は、近位GATA要素を包含する調節配列への核タンパク質の結合を示す。 A：プローブ及び競争体として使用される上方鎖のオリゴヌクレオチドの配列。個々の配列におけるGATAモチーフ（それぞれ、ヒト及びマウスに関して、配列番号11及び13）は、太字で示され、そして突然変異誘発されたヌクレオチド（それぞれ、ヒト及びマウスに関して、配列番号12及び14）は、イタリック型で示される。ヒト及びネズミ近位GATA要素は、コリン5’−フランキング配列の示される領域からである。２種のGATAモチーフを含むコンセンサスGATAプローブ（配列番号15）は、ヒトT−細胞受容体特異的エンハンサー領域から誘導される。
B：ラベルされたコンセンサスGATAプローブ（配列番号15）又はその変異体プローブ（配列番号16）が、100倍過剰の示されるラベルされていないオリゴヌクレオチドの存在又は不在下で、HL-5細胞からの核抽出物と共にインキュベートされた。矢印は、GATA−配列依存性DNA−タンパク質複合体を示す。
C：ラベルされたコンセンサスGATAプローブが、GATAタンパク質に対する抗体の存在下で、HL-5細胞からの核抽出物と共にインキュベートされた。矢印は、DNA−タンパク質複合体を示し、この形成はGATA-4に対する抗体により阻止されるが、しかしGATA-1, -3及び-6に対する抗体によっては阻止されなかった。
D：ラベルされたヒトコリンGATA要素が、GATA-4に対する抗体の存在又は不在下で、HL-5からの核抽出物と共にインキュベートされた。矢印は、DNA−タンパク質の複合体を示し、この形成は、抗−GATA-4抗体の不在下で完全に阻止された。
図７は、近位の保存されたGATA要素の突然変異分析を示す。EMSAにおけるGATA-4タンパク質の結合を破壊する同じ突然変異誘発（GATA→CTTA）が、マウスにおける−642〜−77又はヒトにおける−405〜−15の5’−フランキング領域により駆動されるルシフェラーゼレポーター構造体中に導入された。変異及び野生型構造体が、対照構造体pRL-SV40と共に、HL-5細胞中にトランスフェクトされた。個々の構造体により発現されるルシフェラーゼ活性が、個々のトランスフェクションに関して、pRL-SV40により発現されるレニラルシフェラーゼ活性に対して標準化された。個々の変異体構造体のプロモーター活性が、その対応する野生型構造体の百分率として表された。個々のトランスフェクション実験は三重反復して行われた。データは、３種の独立した実験の平均±S.D.を表す。
図８は、ヒトコリン遺伝子の5’−フランキング領域のヌクレオチド配列（配列番号２）を示す。その4165−塩基対配列は、5’−フランキング領域、最初のエキソン、及びイントロン１の開始を含む（下部における）。すべての番号づけは、翻訳開始部位（ATG、太字及び下線）に対してである。推定上の調節要素は、太字で示される。推定上の調節要素についての略語は、図３に記載される。

Claims (28)

  1. 作用可能に結合された異種ポリヌクレオチドの転写を調節する哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチド。
  2. 前記制御領域が、哺乳類コリン遺伝子の転写を調節する請求項１記載のポリヌクレオチド。
  3. 前記転写が心臓組織において生じる請求項１記載のポリヌクレオチド。
  4. 前記制御領域が、GATA、Tbx-5、NKx2.5又はNF−AT結合部位から成る群から選択された転写調節要素を含んで成る請求項１記載のポリヌクレオチド。
  5. 前記制御領域が、GATA-4、Tbx−5、NKx2.5、Krppel-様因子又はNF-AT転写因子から成る群から選択された転写調節タンパク質に結合する請求項１記載のポリヌクレオチド。
  6. 前記哺乳類がヒトである請求項１記載のポリヌクレオチド。
  7. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号４で示される配列を有する請求項６記載のポリヌクレオチド。
  8. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号５で示される配列を有する請求項６記載のポリヌクレオチド。
  9. 前記ポリヌクレオチドが、配列番号６で示される配列を有する請求項６記載のポリヌクレオチド。
  10. 作用可能に結合された異種ポリヌクレオチドを転写できる、請求項１記載のポリヌクレオチドのフラグメント又は変異体。
  11. 前記フラグメント又は変異体が、配列番号４に対して少なくとも70％同一である請求項10記載のフラグメント又は変異体。
  12. 前記フラグメント又は変異体が、配列番号５に対して少なくとも70％同一である請求項10記載のフラグメント又は変異体。
  13. 前記フラグメント又は変異体が、配列番号６に対して少なくとも70％同一である請求項10記載のフラグメント又は変異体。
  14. 請求項１記載のコリン発現制御領域を含んで成るベクター。
  15. 請求項14記載のベクターを含んで成る宿主細胞。
  16. 請求項15記載の宿主細胞から、コリン発現制御領域に作用可能に結合された異種ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを発現することを含んで成る、ポリペプチドの生成方法。
  17. 請求項15記載の宿主細胞から、コリン発現制御領域に作用可能に結合された異種ポリヌクレオチドによりコードされるアンチセンス分子を発現することを含んで成る、ポリヌクレオチドの生成方法。
  18. 請求項14記載のベクター及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
  19. 請求項15記載の細胞及び医薬的に許容できる担体を含んで成る医薬組成物。
  20. 細胞におけるヒトコリン遺伝子の発現を調節する剤の同定方法であって、
    （ａ）哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチドがレポーター遺伝子に作用可能に結合されている組換えベクターを生成し；
    （ｂ）前記組換えベクターにより前記細胞をトランスフェクトし；
    （ｃ）前記細胞を前記剤により処理し；
    （ｄ）前記処理された細胞におけるレポーター配列の発現のレベルを測定し；そして
    （ｅ）処理されていないトランスフェクトされた細胞における発現のレベルに、前記剤の存在下でのレポーター配列の発現のレベルを比較する；
    ことを含んで成る方法。
  21. 前記細胞が心筋細胞である請求項20記載の方法。
  22. ヒト対象における遺伝子の発現の調節方法であって、
    （ａ）哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る単離されたポリヌクレオチドが異種ポリヌクレオチドに作用可能に結合されている組換えベクターを生成し；そして
    （ｂ）前記対象に前記ベクターを治療的有効量で投与することを含んで成る方法。
  23. 前記異種ポリヌクレオチドが、治療用タンパク質、例えばコリン、ANP、B型ナトリウム排泄増加性ペプチド、ホスホランバン、ACE又はそれらの遺伝子の負の優勢形をコードする請求項22記載の方法。
  24. 前記異種ポリヌクレオチドがコリンをコードする請求項23記載の方法。
  25. 前記異種ポリヌクレオチドが、治療用ポリヌクレオチド、例えばアンチセンスRNA分子又は触媒性RNA分子をコードする請求項22記載の方法。
  26. 前記制御領域が、配列番号４，５又は６から成る群から選択される請求項22記載の方法。
  27. ヒト対象におけるうっ血性心不全、高血圧又は心筋梗塞の処理方法であって、コリン、心房ナトリウム排泄増加性ペプチド（ANP）、B型ナトリウム排泄増加性ペプチド、ホスホランバン、アンギオテンシン転換酵素（ACE）又はそれらの遺伝子の負の優勢形から成る群から選択された遺伝子に作用可能に結合された哺乳類コリン発現制御領域を含んで成る、治療的有効量の単離されたポリヌクレオチドを、前記対象に投与することを含んで成る方法。
  28. 前記遺伝子がコリンである請求項27記載の方法。
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