KR20210030965A - 다논병을 치료하기 위한 유전자 요법 벡터 - Google Patents

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안나히타 케라바라
사이먼 무어
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로켓 파마슈티컬스, 리미티드
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Abstract

본 발명은 일반적으로 라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2, CD107b)로도 알려짐)의 돌연변이와 관련된 질병에 대한 유전자 요법에 관한 것이다. 일 양상에서, 본 개시내용은 LAMP-2의 동형 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 제공하고, 여기서 전이유전자는 인간 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다. 다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 임의의 유전자 요법 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 개선, 감소, 억제, 제거 및/또는 역전시키는 방법을 제공한다.

Description

다논병을 치료하기 위한 유전자 요법 벡터
관련 출원
본 출원은 2018년 7월 12일자로 출원된 미국 가특허 출원 제62/697,302호에 대한 우선권을 주장하며, 그 전체가 본 명세서에 참조에 의해 원용된다.
서열 목록
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출되어 있고, .txt 형식으로 전자 제출된 서열 목록을 포함한다. 이 .txt 파일에는 2019년 7월 11일자로 생성되고 약 62 킬로바이트의 크기를 갖는 "ROPA_011_01WO_SeqList_ST25.txt"라는 명칭의 서열 목록이 담겨 있다. 상기 .txt 파일에 담긴 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 전체가 본 명세서에 참조에 의해 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 일반적으로 라이소좀 관련 막 단백질 2(lysosome-associated membrane protein 2: LAMP-2, CD107b로도 알려짐)의 돌연변이와 관련된 질병에 대한 유전자 요법에 관한 것이다.
라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2, CD107b로도 알려짐)는 라이소좀 관련 막 당단백질을 암호화하는 유전자이다. 유전자의 대안적 스플라이싱(alternative splicing)은 LAMP-2A, LAMP-2B 및 LAMP-2C인 세 가지 동형(isoform)을 생산한다. LAMP-2의 기능 상실(loss-of-function) 돌연변이는 손상된 자가포식과 관련된 가족 성 심근병증인 다논병(Danon disease)을 포함하는 인간 질병과 관련이 있다.
국제 특허 출원 공개 번호 WO2017127565A1은 문헌[Hashem, et al., Stem Cells. 2015 Jul;33(7):2343-50]에 기재된 바와 같은 LAMP-2 돌연변이를 갖는 환자로부터 유래된 인간 유도된 다능성 줄기 세포(human induced pluripotent stem cell, hiPSC)에서 LAMP-2의 과발현이 산화 스트레스 수준 및 아폽토시스성 세포사멸을 감소시켜 질병 병태생리학에서 LAMP-2B의 중요성을 입증한다는 것을 개시한다.
본 기술분야에는 LAMP-2에 대한 유전자 요법 벡터에 대한 필요성이 남아 있다. 본 개시내용은 이러한 유전자 요법 벡터, 이의 사용 방법, 약제학적 조성물 등을 제공한다.
본 개시내용은 LAMP-2 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자 요법 벡터, 이의 사용 방법, 약제학적 조성물 등을 제공한다.
일 양상에서, 본 개시내용은 라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2)의 동형 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 전이유전자(transgene)를 포함하는 발현 카세트(cassette)를 포함하는 유전자 요법 벡터를 제공하고, 여기서 전이유전자는 인간 숙주 세포에서 발현을 위해 코돈 최적화된다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 CpG 부위를 함유한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 잠재적 스플라이스 부위(cryptic splice site)를 함유한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 대안적 오픈 리딩 프레임(alternative open reading frame)을 암호화한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3과 적어도 99% 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3과 동일한 서열을 포함한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 콘센서스 최적 코작(consensus optimal Kozak) 서열을 포함하되, 선택적으로 콘센서스 최적 코작 서열은 서열번호 6을 포함한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하되, 선택적으로 전체 길이의 폴리A(polyA) 서열은 서열번호 7을 포함한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 대안적 mRNA(alternative mRNA)를 생성할 수 있는 전이유전자의 5'에 개시 부위(start site)를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된 제1 역위 말단 반복체, 인핸서/프로모터 영역, 콘센서스 최적 코작 서열, 전이유전자, 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하는 3' 비해독 영역, 및 제2 역위 말단 반복체를 포함한다.
일 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 5'에서 3' 방향으로 CMV IE 인핸서 및 닭 베타-액틴 프로모터를 포함한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 공유한다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 완전한 동일성을 공유한다.
제2 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 임의의 유전자 요법 벡터를 투여하는 것을 포함하는, 필요로 하는 대상체의 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 개선, 감소, 억제, 제거 및/또는 역전시키는 방법을 제공한다.
일 실시형태에서, 벡터는 정맥내, 동맥내, 심장내, 관상동맥내, 심근내, 신장내, 요도내, 경막외 및 근육내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다.
일 실시형태에서, 자가포식 장애는 말기 심부전, 심근 경색, 약물 독성, 당뇨병, 말기 신부전 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일 실시형태에서, 대상체는 인간이다.
일 실시형태에서, 대상체는 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 증상을 나타내고 있다.
일 실시형태에서, 대상체는 LAMP-2 발현이 감소되었거나 또는 불검출성인 것으로 식별되었다.
일 실시형태에서, 대상체는 돌연변이된 LAMP-2 유전자를 갖는 것으로 식별되었다.
제3 양상에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 임의의 유전자 요법 벡터를 포함하는, 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 개선, 감소, 억제, 제거 및/또는 역전시키는데 사용하기 위한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 특징 및 이점은 이하의 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백할 것이며 이하 상세한 설명과 청구범위에 의해 포괄될 것이다.
도 1a는 본 개시내용의 바이러스 벡터의 예시적인 실시형태의 다이어그램을 제공한다.
도 1b는 아데노 관련 바이러스(adeno-associated virus, AAV) 유전자 요법 벡터의 발현 카세트의 예시적인 실시형태의 다이어그램을 제공한다.
도 2는 야생형 대(verses) 코돈 최적화 LAMP-2B 작제물을 시험 및 비교하기 위해 사용된 플라스미드 기반 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP) 리포터(reporter) 시스템의 발현 카세트를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 기반 GFP 리포터 시스템의 형질감염을 사용하여 시험되고 웰(well)당 GFP+ 세포로서 측정된 LAMP-2B 작제물의 형질감염 발현 효율을 나타내는 그래프이다. 야생형 LAMP-2B 작제물(WT)이 3개의 코돈 최적화("CO") 작제물, CO 1, CO 2 및 CO 3, 및 무벡터 대조군("ViaFect 단독"으로 표지됨)과 비교된다.
도 4는 GFP+ 세포의 평균 GFP 강도로서 흡광도 단위(A.U.)로 측정되는, LAMP-2B 작제물을 시험하는데 사용되는 플라스미드 기반 GFP 리포팅 시스템에 의해 형질감염된 세포에서의 유전자 발현 수준을 나타내는 그래프이다. 야생형 LAMP-2B 작제물(WT)에 의해 형질감염된 세포에 의한 GFP 발현이 3개의 코돈 최적화("CO") 작제물, CO 1, CO 2 및 CO 3 또는 무벡터 대조군("ViaFect 단독"으로 표지됨)에 의한 GFP 발현과 비교된다.
도 5는 플라스미드 기반 GFP 리포터 시스템에 의한 형질감염 2일 후 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래의 심근세포의 면역형광 이미지를 나타낸다. 세포를 무 DNA, 또는 야생형 LAMP-2B, CO 1 변이체, CO 2 변이체, 또는 CO 3 변이체를 발현하는 LAMP-2B 작제물을 이용하여 형질감염시켰다.
도 6은 플라스미드 기반 GFP 리포터 시스템에 의한 형질감염 7일 후 iPSC 유래 심근세포의 면역형광 이미지를 나타낸다. 세포를 무 DNA, 또는 야생형 LAMP-2B, CO 1 변이체, CO 2 변이체, 또는 CO 3 변이체를 발현하는 LAMP-2B 작제물을 이용하여 형질감염시켰다.
도 7a는 야생형 LAMP-2B v1.0 전이유전자(AAV9 1.0), 최적화된 변이체 LAMP-2B v1.2 전이유전자(AAV9 1.2), 또는 GFP 전이유전자(AAV9 GFP)를 포함하는 AAV9 바이러스 벡터에 의해 형질도입된 CHO-Lec2 세포 중의 인간 LAMP-2B 단백질의 면역블롯(immunoblot)을 나타낸다. 분자량 마커(MW) 및 대조군 LAMP-2B 재조합 단백질 샘플[LAMP2B(양성 대조군)]도 포함하였다.
도 7b는 AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0), AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 또는 AAV9-GFP(GFP) 벡터에 의해 형질도입된 CHO-Lec2 세포에서 ELISA에 의한 LAMP-2B 단백질의 정량을 나타낸다.
도 8a는 표시된 양의 AAV9-Luc(Luc), AAV9-야생형 LAMP-2B(LAMP2B v1.0) 또는 AAV9-최적화된 LAMP-2B(LAMP2B v1.2) 벡터에 의해 형질도입된 다논 환자 iPSC 유래 심근세포의 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 8b는 AAV9-Luc, AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0) 또는 AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 벡터에 의해 형질도입된 다논 환자 iPSC-유래 심근세포 중의 인간 LAMP-2B 단백질의 면역형광의 정량을 나타낸다.
도 8c는 AAV9-Luc, AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0) 또는 AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 벡터에 의해 형질도입된 다논 환자 iPSC 유래 심근세포 중의 인간 LAMP-2B 단백질의 면역블롯을 나타낸다.
도 9a는 AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0), AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 또는 AAV9 비히클 대조군으로 처리된 LAMP-2-결핍 마우스로부터 단리된 심장 조직에서 바이러스 벡터 DNA의 PCR 정량을 나타낸다. 벡터 카피 수는 심장 조직에서 VCN/이배체 핵으로서 정량하였다. 벡터를 주사하지 않은 대조용 야생형 마우스를 대조군(WT)으로 포함시켰다.
도 9b는 AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0), AAV9 최적화 LAMP-2B(v1.2) 또는 AAV9 비히클 대조군(Vehicle)으로 처리된 LAMP-2-결핍 마우스로부터 분리된 심장 조직에서 WPRE 요소에 특이적인 프로브를 사용하여 RT-PCR에 의해 측정된 전이유전자 mRNA의 정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다. mRNA의 발현은 카피 수를 벡터 게놈으로 변환하는 표준 곡선을 사용하여 총 세포 RNA ㎍당 벡터 게놈(vg)으로서 정량하였다.
도 9c는 미처리된 야생형 마우스(미처리군)와 비교된, AA9-야생형 LAMP-2B(v1.0), AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 또는 AAV9 비히클 대조군(Vehicle)으로 처리된 LAMP-2-결핍 마우스로부터 분리된 심장 조직 중의 LAMP-2B 단백질의 면역블롯을 나타낸다.
도 9d는 AAV9-야생형 LAMP-2B(v1.0), AAV9-최적화된 LAMP-2B(v1.2) 또는 AAV9 비히클 대조군으로 처리된 LAMP-2-결핍 마우스로부터 분리된 심장 조직 중의 인간 LAMP-2B 단백질의 면역형광 이미지를 나타낸다.
도 10a는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B(처리군) 벡터로 처리되거나, 또는 무벡터 비히클 대조군(미처리군)으로 처리된 영장류로부터 단리된 심장, 근육, 간 및 뇌 조직 중의 바이러스 벡터 DNA의 PCR 정량을 나타낸다. 개체는 흑색 또는 백색 사각형으로 표시된다.
도 10b는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터(처리군) 또는 무 벡터 비히클 대조군(미처리군)으로 처리된 영장류에서 단리된 심실 중의 바이러스 벡터 DNA의 PCR 정량을 나타낸다. 개체는 B059(수컷, M), A991(암컷, F) 및 A602(수컷, M)로 표시된다.
도 10c는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터(치료군) 또는 무벡터 비히클 대조군(미처리군)으로 처리된 영장류로부터 단리된 심장, 근육, 간 및 뇌 조직에서 WPRE 요소에 특이적인 프로브를 사용하여 RT-PCR에 의해 측정된 전이유전자 mRNA의 정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 10d는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터(처리군) 또는 무벡터 비히클 대조군(미처리군)이 주사된 영장류로부터 단리된 심실 중의 전이유전자 mRNA의 정량적 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 10e는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터(처리군) 또는 무벡터 비히클 대조군(미처리군)이 주사된 영장류로부터 단리된 심장, 근육 및 간 조직에서 전이유전자 mRNA를 동일계에서 발현하는 세포의 백분율을 나타낸다. 개체는 B059(수컷, M), A991(암컷, F), 및 A602(수컷, M)로 표시된다.
도 10f는 AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터 또는 무벡터 비히클 대조군(미처리군)이 주사된 영장류로부터 단리된 심장 조직 중 동일계에서의 전이유전자 mRNA 염색을 나타낸다. 개체는 B059(수컷, M), A991(암컷, F) 및 A602(수컷, M)으로서 나타낸다.
도 10g는 무벡터(미처리군)에 상대적인, AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터에 의해 처리된 영장류로부터 단리된 심장, 근육 및 간 조직에서 웨스턴 블롯에 의해 평가된 LAMP-2B 단백질의 변화 배수를 나타낸다.
도 10h는 무벡터(미처리군)에 상대적인, AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터에 의해 처리된 영장류로부터 단리된 심실에서 웨스턴 블롯에 의해 평가된 LAMP-2B 단백질의 변화 배수를 나타낸다.
도 10i는 무벡터(미처리군)에 상대적인, AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터에 의해 처리된 영장류로부터 단리된 심장, 근육 및 간 조직에서 ELISA에 의한 LAMP-2B 단백질의 정량을 나타낸다.
도 10j는 무벡터(미처리군)에 상대적인, AAV9-최적화된 인간 LAMP-2B 벡터에 의해 처리된 영장류로부터 단리된 심실에서 ELISA에 의한 LAMP-2B 단백질의 정량을 나타낸다.
본 개시내용은 LAMP-2의 동형(예를 들어, LAMP-2B)을 암호화하는 개선된 폴리뉴클레오타이드 서열, 발현 카세트 및 벡터, 뿐만 아니라 관련된 약제학적 조성물, 및 LAMP-2 결핍 또는 돌연변이와 관련된 질병 및 장애를 치료하는 그의 용도를 제공한다. 본 발명자들은 LAMP-2B의 유전자 서열에 대한 변형이 전이유전자 발현을 증가시킨다는 것을 발견하였다. 또한, LAMP-2B를 암호화하는 유전자 요법 벡터의 발현 카세트에 특정 서열 요소의 존재는 전이유전자 발현의 개선을 초래한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 LAMP-2 폴리뉴클레오타이드 서열, 발현 카세트 및 벡터는 치료적으로 관련이 있는 조직에서 더 높은 수준의 LAMP-2 발현을 달성하는 능력을 포함하여, 이전의 유전자 요법 벡터와 비교했을 때 유전자 요법에 대한 이점을 제공한다.
인간 LAMP-2B의 야생형 폴리펩타이드 서열(서열번호 1) 및 인간 LAMP-2B를 암호화하는 야생형 폴리뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)은 각각 다음과 같다:
Figure pct00001
(서열번호 1); 및
Figure pct00002
(서열번호 2).
본 명세서에는 라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2)의 동형 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 변형된 폴리뉴클레오타이드 서열은 개시된다. 특정 실시형태에서, 변형된 폴리뉴클레오타이드 서열은 LAMP-2의 동형을 암호화하는 야생형 폴리뉴클레오타이드와 비교했을 때 하나 이상의 하기 변형을 포함한다: 코돈-최적화, CpG 결핍, 잠재적 스플라이스 부위의 제거, 또는 감소된 수의 대안적 오픈 리딩 프레임(ORF). 일부 실시형태에서, 변형된 폴리뉴클레오타이드는 LAMP-2A, LAMP-2B, LAMP-2C 또는 이러한 동형 중 임의의 것의 기능적 변이체를 암호화한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 서열번호 2와 비교했을 때 하나 이상의 뉴클레오타이드 치환을 포함하는 LAMP-2B 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 전이유전자를 제공한다. 실시형태들에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 본 개시내용은 LAMP-2B를 암호화하는 적어도 3개의 예시적인 변이체 전이유전자 서열(서열번호 3 내지 5)을 제공한다:
Figure pct00003
Figure pct00004
(서열번호 3)
Figure pct00005
(서열번호 4); 및
Figure pct00006
(서열번호 5)
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 99% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 완전한 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 4와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 5와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 부분서열(subsequence)과 유사하거나 동일하다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 부분서열을 포함한다. 다양한 실시형태에서, 상기 부분서열은 적어도 약 50nt, 적어도 약 100nt, 적어도 약 150nt, 적어도 약 250nt, 적어도 약 200nt, 적어도 약 350nt, 적어도 약 450nt, 적어도 약 400nt, 적어도 약 450nt, 적어도 약 550nt, 적어도 약 600nt, 적어도 약 650nt, 적어도 약 600nt, 적어도 약 650nt, 적어도 약 700nt, 적어도 약 750nt, 적어도 약 800nt, 적어도 약 850nt, 적어도 약 900nt, 적어도 약 950nt, 또는 적어도 약 1000nt의 길이를 갖는 전체 서열 중 연속 뉴클레오타이드(nt)의 임의의 세트를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000, 또는 750 내지 1240을 포함하는 부분서열과 적어도 95% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000, 또는 750 내지 1240을 포함하는 부분서열과 적어도 99% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000, 또는 750 내지 1240을 포함하는 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000 또는 750 내지 1240을 포함하는 부분서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 실시형태들에서, 전이유전자는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000, 또는 750 내지 1240을 포함하는 부분서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 1 내지 500, 250 내지 750, 500 내지 1000, 또는 750 내지 1240을 포함하는 부분서열과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다.
특정 실시형태에서, 전이유전자는 LAMP-2A, LAMP-2B 또는 LAMP-2C 중 임의의 것을 포함하는 LAMP-2의 다양한 동형 중 임의의 것, 또는 이들 동형 중 임의의 것의 기능적 단편 또는 변이체를 암호화한다. 따라서, 특정 실시형태에서, 발현 카세트는 LAMP-2A, LAMP-2B 또는 LAMP-2C 중 임의의 것을 암호화하는 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열로서, 상응하는 야생형 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교했을 때 하나 이상의 변형, 예컨대 하기 중에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함한다: LAMP-2A, LAMP-2B, 또는 LAMP-2C를 암호화하는 전이유전자 서열의 코돈 최적화; 발현 카세트 또는 전이유전자 서열이 이의 상응하는 야생형 서열보다 적은 수의 CpG 부위를 함유함; 발현 카세트 또는 전이유전자 서열이 이의 상응하는 야생형 서열보다 적은 수의 CpG 부위를 함유함; 발현 카세트 또는 전이유전자 서열이 이의 상응하는 야생형 서열보다 적은 수의 잠재적 스플라이스 부위를 함유함; 및/또는 발현 카세트 또는 전이유전자 서열이 이의 상응하는 야생형 서열보다 적은 수의 오픈 리딩 프레임을 함유함. 특정 실시형태에서, 최적화된 서열은 인간 세포에서의 증가된 발현에 대해 최적화된다. LAMP-2A 및 LAMP-2C 동형을 암호화하는 야생형 인간 폴리뉴클레오타이드 서열은 각각 서열번호 29 및 30에 제시되어 있다. 인간 LAMP-2A 및 LAMP-2C 단백질의 야생형 서열은 각각 서열번호 34 및 35에 제시되어 있다. 야생형 LAMP-2 동형의 서열 및 암호 서열은 또한 공개적으로 이용 가능하다. 본 명세서는 LMAP-2B와 관련하여 특정 실시형태를 설명하지만, 각 실시형태에 LAMP2A 또는 LAMP-2C가 대안적으로 사용될 수 있는 것으로 이해한다.
야생형 LAMP2A(서열번호 29) 및 야생형 LAMP-2C(서열번호 30)의 암호 서열은 적어도 뉴클레오타이드 1 내지 1080을 따라서 야생형 LAMP-2B(서열번호 2)의 암호 서열과 100% 동일하다. 따라서, 본 명세서에 개시된 전이유전자, 발현 카세트 및 벡터는 LMAP-2B의 뉴클레오타이드 1081-1233(서열번호 3 내지 5 중 임의의 것의 최적화된 LAMP-2B) 대신에 야생형 LAMP-2A(서열번호 29) 또는 야생형 LAMP-2C(서열번호 30) 중 어느 하나의 3' 말단(뉴클레오타이드 1081-말단)을 치환시킴으로써 LAMP-2의 동형들의 발현을 위해 개조될 수 있음을 본 기술분야의 기술자라면 쉽게 인식할 것이다. 예를 들어, 본 발명의 실시형태는 최적화된 LAMP-2B 유전자 서열, 서열번호 3 내지 5의 뉴클레오타이드 1 내지 1080, 즉 각각 서열번호 31 내지 33을 이용한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 31-33으로부터 선택된 서열과 적어도 95%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 31-33으로부터 선택된 서열과 적어도 99%의 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 31-33으로부터 선택된 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 31과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 32와 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 33과 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 동일성을 공유한다. 일부 경우에, 전이유전자는 참조 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 "천연" 또는 "야생형" LAMP-2B 서열과 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 참조 서열과 최대 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 참조 서열은 서열번호 2이다. 예를 들어, 서열번호 3은 서열번호 2와 78.5% 동일성을 공유한다.
일부 경우에, 전이유전자는 참조 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 "천연" 또는 "야생형" LAMP-2A 서열과 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 참조 서열과 최대 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 참조 서열은 서열번호 29에 제시된 야생형 인간 LAMP-2A 서열이다.
일부 경우에, 전이유전자는 참조 서열의 폴리뉴클레오타이드 서열, 예를 들어 "천연" 또는 "야생형" LAMP-2C 서열과 상이한 폴리뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 참조 서열과 최대 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 95% 동일성을 공유한다. 일부 실시형태에서, 참조 서열은 서열번호 30에 제시된 야생형 인간 LAMP-2A 서열이다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된다. 일 실시형태에서, 전이유전자 암호 서열은 드물게 나타나는 코돈을 보다 빈번하게 나타나는 코돈으로 대체함으로써 발현을 향상시키도록 변형되거나 "코돈 최적화"된다. 암호 서열은 해독을 위해 아미노산을 암호화하는 mRNA 서열의 부분이다. 해독 동안, 61개 트리뉴클레오타이드 코돈 각각이 20개의 아미노산 중 하나로 해독되어, 유전자 암호에 축퇴(degeneracy) 또는 중복(redundancy)을 초래한다. 하지만, 상이한 세포 유형, 및 상이한 동물 종은 동일한 아미노산에 대해 암호하는 tRNA(각각 안티코돈을 보유함)를 상이한 빈도로 이용한다. 유전자 서열이 상응하는 tRNA에 의해 드물게 나타나는 코돈을 함유하는 경우, 리보솜 해독 기구는 느려져 효과적인 해독을 방해할 수 있다. 발현은 특정 종에 대한 "코돈 최적화"를 통해 개선될 수 있으며, 이때 암호 서열은 동일한 단백질 서열을 암호화하도록 변형되지만, 고도로 나타나고, 및/또는 고도로 발현되는 인간 단백질에 의해 이용되는 코돈을 이용한다(Cid-Arregui et al., 2003; J.Virol. 77:4928).
일부 실시형태에서, 전이유전자의 암호 서열은 포유류 또는 영장류에서 드물게 발현되는 코돈을 영장류에서 빈번하게 발현되는 코돈으로 대체하도록 변형된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 전이유전자는 참조 폴리펩타이드(예컨대, 야생형 LAMP-2B; 서열번호 3)와 적어도 85% 서열 동일성, 예를 들어, 참조 폴리펩타이드와 적어도 90% 서열 동일성, 적어도 95% 서열 동일성, 적어도 98% 동일성, 또는 적어도 99% 동일성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다 - 여기서 암호 서열의 적어도 하나의 코돈은 상기 또는 본 명세서에 개시된 서열에서 상응하는 코돈보다 인간에서 tRNA 빈도가 더 높은 것이다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 2보다 더 적은 수의 대안적 오픈 리딩 프레임을 포함한다. 일 실시형태에서, 전이유전자는 원하는 전이유전자를 암호화하지 않는 오픈 리딩 프레임(ORF)의 종결 또는 제거에 의해 발현을 향상시키도록 변형된다. 오픈 리딩 프레임(ORF)은 개시 코돈을 뒤따르고 종결 코돈을 함유하지 않는 핵산 서열이다. ORF는 정방향 또는 역방향일 수 있으며 관심 유전자와 비교하여 "프레임내(in frame)" 또는 "프레임외(out of frame)"일 수 있다. 이러한 오픈 리딩 프레임은 발현 카세트에서 관심 유전자와 함께 발현될 가능성이 있으며 원하지 않는 부작용을 야기할 수 있다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 코돈 사용법의 추가 변경에 의해 오픈 리딩 프레임을 제거하도록 변형되었다. 이것은 하나 이상의 개시 코돈(ATG)를 제거하고 및/또는 원하는 ORF에 대해 역방향으로 또는 프레임외로 하나 이상의 종결 코돈(TAG, TAA, 또는 TGA)을 도입시키는 한편, 암호화된 아미노산 서열을 보존하고, 선택적으로 관심 유전자에 고도로 이용되는 코돈을 유지하여(즉, 빈도가 20% 미만인 코돈은 피함) 수행할 수 있다.
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자의 개시 코돈에 대해 5'에 최대 1개, 최대 2개, 최대 3개, 최대 4개 또는 최대 5개의 개시 코돈을 포함한다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자의 개시 코돈에 대해 5'에 개시 코돈을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 전이유전자의 개시 코돈에 대해 5'에 5' UTR 중의 하나 이상의 ATG 코돈, 프로모터, 인핸서, 프로모터/인핸서 요소, 또는 다른 서열은 하나 이상의 잠재적 개시 부위가 제거된 후 남아 있는다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자의 상류에 오류성 mRNA를 생성하는 잠재적 개시 부위를 포함하지 않는다.
본 개시내용의 변형에서, 전이유전자 암호 서열은 코돈 최적화 또는 비-전이유전자 ORF의 제거 또는 두 기술 모두를 사용하여 최적화될 수 있다. 일부 경우에는 코돈 최적화 동안 도입된 ORF를 제거하기 위해 코돈 최적화 후에 비-전이유전자 ORF를 제거하거나 최소화한다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 2보다 적은 수의 CpG 부위를 함유한다. 이론에 구속됨이 없이, 폴리뉴클레오타이드 서열에 CpG 부위의 존재는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 바이러스 벡터에 대한 숙주의 바람직하지 않은 면역학적 반응과 관련이 있는 것으로 사료된다. 일부 실시형태에서, 전이유전자는 CpG 부위의 수를 감소시키도록 설계된다. 예시적인 방법은 미국 특허 출원 공개 번호 US20020065236A1에 제공된다.
일 실시형태에서, 전이유전자는 서열번호 2보다 적은 수의 잠재적 스플라이스 부위를 함유한다. 최적화를 위해, GeneArt® 소프트웨어가 사용되어, 예를 들어, GC 함량을 증가시키고, 및/또는 잠재적 스플라이스 부위를 제거하여 전사 침묵을 피하여 전이유전자 발현을 증가시킬 수 있다. 대안적으로, 본 기술분야에 공지된 임의의 최적화 방법이 사용될 수 있다. 잠재적 스플라이스 부위의 제거는 예컨대 국제 특허 출원 공개 번호 WO2004015106A1에 기재되어 있다.
또한, 본 명세서에는 LAMP-2B를 암호화하는 발현 카세트 및 유전자 요법 벡터가 개시된다. 특정 실시형태에서, 발현 카세트 및 유전자 요법 벡터는 본원에 개시된 코돈 최적화된 또는 변이 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 전이유전자 서열을 포함한다.
특정 실시형태에서, LAMP-2B를 암호화하는 발현 카세트 또는 유전자 요법 벡터는 콘센서스 최적 코작 서열, 전체 길이의 폴리아데닐화(폴리A) 서열(또는 전체 길이의 폴리A의 절두된 폴리A로의 치환)을 포함하고, 및 상류(예컨대, 5') 또는 잠재적 개시 코돈(예컨대, ATG 부위)을 최소로 포함하거나 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 전이유전자에 대해 5'에 개시 부위를 포함하지 않는다. 특정 실시형태에서, 발현 카세트 또는 유전자 요법 벡터는 LMAP-2B를 암호화하는 서열, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 코돈 최적화된 또는 변이 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 전이유전자 서열을 포함한다.
일부 경우에, 발현 카세트는 2개 이상의 제1 역위 말단 반복체, 인핸서/프로모터 영역, 콘센서스 최적 코작 서열, 전이유전자(예를 들어, 본 명세서에 개시된 LAMP-2B를 암호화하는 전이유전자), 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하는 3' 비해독 영역, 및 제2 역위 말단 반복체를 함유한다. 일부 실시형태에서, 역위 말단 반복체(ITR) 중 하나 또는 둘 모두는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, 또는 AAV9 ITR이거나, 또는 본 기술분야에 공지된 어느 하나의 ITR이다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 정확하게 2개의 ITR을 포함한다. 일부 실시형태에서, 두 ITR은 AAV2, AAV5, 또는 AAV9 ITR이다. 일부 실시형태에서, 두 ITR은 AAV2 ITR이다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 코작 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 코작 서열은 서열번호 6을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진 콘센서스 최적 코작 서열이다:
GCCGCCACCATGG (서열번호 6)
다양한 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 대안적 코작 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 코작 서열은 서열번호 14 내지 18 중 어느 하나를 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진 대안적 코작 서열이다:
(gcc)gccRccAUGG (서열번호 14);
AGNNAUGN (서열번호 15);
ANNAUGG (서열번호 16);
ACCAUGG (서열번호 17);
GACACCAUGG (서열번호 18).
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 코작 서열을 포함하지 않는다.
서열번호 14에서 소문자는 염기가 변동적일 수 있는 위치라도, 가장 일반적인 염기를 표시하고; 대문자는 고도로 보존적인 염기를 나타내며; 아데닌 또는 구아닌을 나타낸다. 서열번호 14에서, 괄호 안의 서열(gcc)은 선택적이다. 서열번호 15 내지 17에서, 'N'은 임의의 염기를 나타낸다.
상기 해독 개시 부위로서 상기 콘센서스 최적 코작 서열 대신에 다양한 서열이 사용될 수 있고, 다른 서열을 식별하고 시험하는 것은 본 기술분야의 기술자의 기술 범위 내에 있다. 예컨대, 문헌[Kozak M. An analysis of vertebrate mRNA sequences: intimations of translational control. J.Cell Biol. 115(4): 887-903(1991)]을 참조한다.
일 실시형태에서, 상기 발현 카세트는 상기 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 전체 길이의 폴리A 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 상기 전체 길이의 폴리A 서열은 서열번호 7을 포함한다:
Figure pct00007
(서열번호 7).
다양한 대안적 폴리A 서열이 본 개시내용의 발현 카세트에 사용될 수 있고, 그 예로는 비제한적으로 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호(bGHpA)(서열번호 19), SV40 초기/후기 폴리아데닐화 신호(서열번호 20), 및 인간 성장 호르몬(HGH) 폴리아데닐화 신호(서열번호 21)를 포함한다:
Figure pct00008
(서열번호 19);
Figure pct00009
(서열번호 20);
Figure pct00010
(서열번호 21).
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 폴리A 서열의 활성 단편을 포함한다. 특별한 실시형태에서, 폴리A 서열의 활성 단편은 본 명세서에 개시된 폴리A 서열 중 임의의 서열의 20개 염기쌍(bp) 미만, 50bp 미만, 100bp 미만, 또는 150bp 미만을 포함하거나, 또는 이것으로 이루어진다.
일부 경우에, 전이유전자의 발현은 발현 카세트가 경쟁 ORF를 함유하지 않도록 함으로써 증가된다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 전이유전자의 개시 코돈의 5'에 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 또는 500개 염기쌍 이내에 개시 코돈을 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 전이유전자의 개시 코돈의 5'에 개시 부위를 포함하지 않는다. 일부 실시형태에서, 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 전이유전자에 대해 5'에 개시 부위를 포함하지 않는다.
일 실시형태에서, 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된 제1 역위 말단 반복체, 인핸서/프로모터 영역, 인트론, 콘센서스 최적 코작 서열, 전이유전자, 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하는 3' 비해독 영역, 및 제2 역위 말단 반복체를 포함하되, 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 전이유전자에 대해 5'에 개시 부위를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 5'에서 3' 방향으로, CMV IE 인핸서 및 닭 베타 액틴 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 CAG 프로모터(서열번호 22)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "CAG 프로모터"는 CMV 초기 인핸서 요소, 닭 베타 액틴 프로모터, 상기 닭 베타 액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론, 및 토끼 베타 글로빈 유전자로부터의 스플라이스 어셉터(acceptor)를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 지칭한다.
Figure pct00011
(서열번호 22)
일부 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 전신발현 프로모터(ubiquitous promoter)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 CMV 프로모터(서열번호 23), SV40 프로모터(서열번호 24), PGK 프로모터(서열번호 25), 및/또는 인간 베타 액틴 프로모터(서열번호 26)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 인핸서/프로모터 영역은 서열번호 23 내지 26 중 어느 하나와 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다:
Figure pct00012
(서열번호 23);
Figure pct00013
(서열번호 24);
Figure pct00014
(서열번호 25);
Figure pct00015
Figure pct00016
(서열번호 26).
또 다른 예시적인 프로모터는 인간 연장 인자(elongation factor) 1 알파 프로모터(EFS), SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 장말단 반복체(LTR) 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터(Ad MLP); 단순 헤르페스 바이러스(HSV) 프로모터, 관심 유전자에 이종성인 내인성 세포 프로모터, 거대세포바이러스(CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 즉시 초기 프로모터 영역(CMVIE), 라우스 육종 바이러스(RSV) 프로모터, 합성 프로모터, 혼성 프로모터 등을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 3' UTR은 서열번호 27과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오타이드(WPRE 요소)를 포함한다:
Figure pct00017
(서열번호 27).
일부 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 공유한다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 완전한 동일성을 공유하거나, 또는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 공유한다:
Figure pct00018
Figure pct00019
Figure pct00020
(서열번호 8);
Figure pct00021
Figure pct00022
(서열번호 9); 및
Figure pct00023
Figure pct00024
(서열번호 10).
특정 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 비교했을 때 하나 이상의 변형을 포함하며, 그 예로는 본 명세서에 개시된 임의의 변형을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 특별한 실시형태에서, 하나 이상의 변형은 다음 중 하나 이상을 포함한다: 하나 이상(예컨대, 모든)의 상류 ATG 서열의 제거, 최적화된 콘센서스 코작 서열 또는 본 명세서에 개시되는 것 중 임의의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 코작 서열에 의한 코작 서열의 대체, 및/또는 전체 길이의 폴리아데닐화 서열 또는 본 명세서에 개시되는 것 중 임의의 것을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 폴리아데닐화 서열에 의한 폴리아데닐화 서열의 대체. 예시적인 발현 카세트 내에 존재하는 유전자 요소들의 예시적인 배열은 도 1b에 도시된다.
일 실시형태에서, 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터이다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 서열번호 11 및 12로부터 선택된 역위 말단 반복체(ITR) 서열을 포함한다:
Figure pct00025
(서열번호 11);
Figure pct00026
(서열번호 12).
관련 실시형태에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 발현 카세트를 포함하는 유전자 요법 벡터를 제공한다. 일반적으로, 본 명세서에 기재된 유전자 요법 벡터는 라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2)의 하나 이상의 동형을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하며, 필요로 하는 대상체[예컨대, 다논병 또는 적어도 부분적으로 결핍성 LAMP-2 발현으로 인한 결핍성 자가포식 흐름(flux)을 특징으로 하는 다른 장애를 갖는 대상체]에서 결핍성 LAMP-2 단백질 발현 수준 및/또는 자가포식 흐름을 부분적으로 또는 완전히 교정하도록 LAMP-2를 발현시킨다. 특별한 실시형태에서, 발현 카세트는 본 명세서에 개시된 LAMP-2를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 예컨대 서열번호 3 내지 5, 또는 이의 기능적 변이체를 포함한다. 일부 실시형태에서, 변이체 서열은 서열번호 3 내지 5 중 임의의 것과 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 동일성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 변이체는 서열번호 3 내지 5 중 임의의 것의 단편, 예컨대 서열번호 3 내지 5 중 임의의 서열의 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 95%를 갖는 단편이다. 유전자 요법 벡터는 바이러스성 또는 비-바이러스성 벡터일 수 있다. 예시적인 비-바이러스성 벡터는, 예컨대, 노출된 DNA, 양이온성 리포좀 복합체, 양이온성 중합체 복합체, 양이온성 리포좀-중합체 복합체, 및 엑소좀을 포함한다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스바이러스 및 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
특정 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. AAV는 4.7 kb의 단일 가닥의 DNA 바이러스이다. AAV를 기반으로 하는 재조합 벡터는, 야생형 AAV가 비병원성이고 임의의 공지된 질병과 병인학적 관련성이 없으므로, 우수한 임상적 안전성과 관련이 있다. 또한, AAV는 고도로 효율적인 유전자 전달 능력 및 다수의 조직에서 지속적인 전이유전자 발현을 제공한다. "AAV 벡터"란 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.10, AAVrh.74 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는 아데노 관련 바이러스 혈청형으로부터 유래되는 벡터를 의미한다. AAV 벡터는 rep 및/또는 cap 유전자와 같이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자를 가질 수 있지만, 기능적인 인접 역위 말단 반복체(ITR) 서열은 보유할 수 있다. 기능적 IRT 서열은 AAV 비리온의 구제, 복제 및 패키징(packaging)에 필수적인 것이다. 즉, AAV 벡터는 본 명세서에서 바이러스의 복제 및 패키징을 위해 시스(cis)로 요구되는 서열(예컨대, 기능적 ITR)을 최소한 포함하는 것으로 정의된다. 상기 ITR은 야생형 뉴클레오타이드 서열일 필요는 없고, 상기 서열이 기능적 구제, 복제 및 패키징을 제공하는 한, 뉴클레오타이드의 삽입, 결실 및 치환 등에 의해 변경될 수 있다. AAV 벡터는 하나 이상의 변형된 캡시드 단백질(예컨대, VP1, VP2 및/또는 VP3)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 다른 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡시드 단백질은 향성(tropism) 변경 및/또는 면역원성 감소를 위해 변형될 수 있다.
AAV를 기반으로 하는 재조합 벡터는, 야생형 AAV가 비병원성이고 임의의 공지된 질병과 병인학적 관련성이 없으므로, 우수한 임상적 안전성과 관련이 있다. 또한, AAV는 고도로 효율적인 유전자 전달 능력 및 다수의 조직에서 지속적인 전이유전자 발현을 제공한다. AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAVrh.10, AAVrh.74 등을 포함하는 다양한 AAV의 혈청형이 알려져 있다. AAV 벡터는 rep 및/또는 cap 유전자와 같이 전체적으로 또는 부분적으로 결실된 하나 이상의 AAV 야생형 유전자를 가질 수 있지만, 기능적인 인접 역위 말단 반복체(ITR) 서열은 보유할 수 있다. 재조합 AAV 벡터의 혈청형은 이의 캡시드에 의해 결정된다. 국제 특허 공개 번호 WO2003042397A2는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV8, AAV9, 및 rh10의 것을 포함하는 다양한 캡시드 서열을 개시한다. 국제 특허 공개 번호 WO2013078316A1은 AAVrh74로부터의 VP1의 폴리펩타이드 서열을 개시한다. 수많은 다양한 자연 발생 또는 유전자 변형된 AAV 캡시드 서열은 본 기술분야에 공지되어 있다.
예시적인 비제한적 캡시드는 서열번호 28의 서열을 갖는 AAV9 캡시드(또는 이의 VP1, VP2, 또는 VP3 단편)이다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 AAV 벡터는 서열번호 28의 전체 서열 중에서, 또는 서열번호 28의 아미노산 138 내지 736 상에서, 또는 서열번호 28의 아미노산 203 내지 736 상에서, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는 캡시드 단백질을 포함한다.
Figure pct00027
(서열번호 28)
AAV 발현 벡터는 전사 방향으로 작동 가능하게 연결된 구성성분으로서 전사 개시 영역을 포함하는 제어 요소, 관심 DNA(즉, LAMP-2 유전자) 및 전사 종결 영역을 최소한 제공하도록 공지된 기술을 사용하여 작제한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV9 벡터이다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터의 발현 카세트에는 AAV2 역위 말단 반복체(ITR)가 인접해 있다. 개시된 벡터의 대안적 실시형태에 사용된 ITR은 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, 및 AAV9를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 AAV2/9 벡터이다. 기호 AAV2/9는 AAV2의 ITR과 AAV9의 캡시드를 갖는 AAV 벡터를 지칭한다. 본 개시내용의 다른 실시형태는 제한없이 AAV2/9, AAV5/9, AAVrh74, AAV2/rh74, AAV5/9, 및 AAV5/rh74 벡터를 포함한다. 본 기술분야에 공지된 다른 ITR이 사용될 수 있다. 본 개시내용의 벡터에 유용한 예시적인 ITR(및 다른 AAV 구성성분)은 제한없이 US6936466B2, US9169494B2, US20050220766A1, US20190022249A1, 및 US7282199B2에 기재된 것들을 포함하며, 이 문헌들은 각각 전체가 본원에 참고로 포함된다.
일부 실시형태에서, 상기 벡터는 레트로바이러스 벡터, 또는 보다 구체적으로 렌티바이러스 벡터이다. 본 명세서에 사용된 용어 "레트로바이러스(retrovirus)" 또는 "레트로바이러스의"는 게놈 RNA를 선형 이중 가닥 DNA 카피로 역전사한 후, 이의 게놈 DNA를 숙주 게놈으로 공유적으로 통합시킨 RNA 바이러스를 의미한다. 레트로바이러스 벡터는 유전자 전달에 일반적인 도구이다(Miller, 2000, Nature. 357: 455-460). 바이러스가 숙주 게놈으로 일단 통합되면 "프로바이러스"라고 지칭된다. 프로바이러스는 RNA 중합효소 II의 주형 역할을 하며 바이러스에 의해 암호화된 RNA 분자의 발현을 유도한다.
예시적인 레트로바이러스(레트로바이러스과)는 (1) 감마레트로바이러스 속, 예를 들어 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(M-MuLV), 몰로니 뮤린 육종 바이러스(MoMSV), 뮤린 유선 종양 바이러스(MuMTV), 긴팔 원숭이 백혈병 바이러스(GaLV) 및 고양이 백혈병 바이러스(FLV), (2) 스푸마바이러스 속, 예컨대 유인원 포말 바이러스, (3) 렌티바이러스 속, 예컨대, 인간 면역결핍 바이러스-1 및 유인원 면역결핍바이러스를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "렌티바이러스의" 또는 "렌티바이러스(lentivirus)"는 복합 레트로바이러스 군(또는 속)을 지칭한다. 예시적인 렌티바이러스에는 HIV(인간 면역결핍 바이러스; 예컨대, HIV 1형 및 HIV 2형 포함); 비스나-메디(visna-maedi) 바이러스(VMV) 바이러스; 염소 관절염-뇌염 바이러스(CAEV); 말 감염성 빈혈 바이러스(EIAV); 고양이 면역결핍 바이러스(FIV); 소 면역결핍 바이러스(BIV); 및 유인원 면역결핍 바이러스(SIV)가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, HIV 기반 벡터 백본(backbone)(즉, HIV 시스-작용상 서열 요소)이 바람직하다.
레트로바이러스 벡터, 더욱 특히 렌티바이러스 벡터는 본 발명을 수행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 본 명세서에 사용된 용어 "레트로바이러스 벡터"는 "렌티바이러스 벡터"를 포함하려는 것이고; 본 명세서에 사용된 용어 "레트로바이러스"는 "렌티바이러스"를 포함하려는 것이다.
용어 바이러스 벡터는 핵산을 세포로 전달할 수 있는 벡터 또는 바이러스 입자 또는 전달된 핵산 자체를 지칭할 수도 있다. 바이러스 벡터는 주로 바이러스에서 유래된 구조적 및/또는 기능적 유전자 요소를 함유한다. 용어 "레트로바이러스 벡터"는 주로 레트로바이러스로부터 유래되는, 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 용어 "렌티바이러스 벡터"는 주로 렌티바이러스에서 유래되는 LTR을 포함하는, 구조적 및 기능적 유전자 요소 또는 이의 일부를 함유하는 바이러스 벡터를 지칭한다. 용어 "혼성체(hybrid)"는 레트로바이러스, 예를 들어 렌티바이러스의 서열과 비-렌티바이러스의 바이러스 서열을 둘 다 함유하는 벡터, LTR 또는 다른 핵산을 지칭한다. 일 실시형태에서, 혼성 벡터는 역전사, 복제, 통합 및/또는 패키징을 위한 레트로바이러스, 예컨대 렌티바이러스의 서열을 포함하는 벡터 또는 전이 플라스미드를 지칭한다.
특별한 실시형태에서, 용어 "렌티바이러스 벡터" 및 "렌티바이러스 발현 벡터"는 렌티바이러스의 전이 플라스미드 및/또는 감염성 렌티바이러스 입자를 지칭하는데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 클로닝 부위, 프로모터, 조절 요소, 이종 핵산 등과 같은 요소가 언급되는 경우, 이들 요소의 서열은 본 발명의 렌티바이러스 입자에서 RNA 형태로 존재하고, 본 발명의 DNA 플라스미드에서 DNA 형태로 존재하는 것으로 이해되어야 한다.
특정의 구체적인 실시형태에 따르면, 대부분 또는 모든 바이러스 벡터 백본 서열이 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1에서 유래된다. 하지만, 많은 상이한 출처의 렌티바이러스 서열이 사용될 수 있고, 본 명세서에 기재된 기능을 수행하는 전이 벡터의 능력을 손상시킴이 없이 특정 렌티바이러스 서열에 수많은 치환 및 변경이 수용될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 더욱이, 다양한 렌티바이러스 벡터는 본 기술분야에 공지되어 있으며, 문헌[Naldini et al., (1996a, 1996b 및 1998); Zufferey et al., (1997); Dull et al., 1998, 미국 특허 번호 6,013,516; 및 5,994,136]을 참조하고, 이들 중 다수는 본 발명의 바이러스 벡터 또는 전이 플라스미드를 생성하기 위해 개조될 수 있다.
본 명세서에 개시된 LAMP-2B 전이유전자 서열은, 다양한 실시형태에서, 본 기술분야에 공지되거나, 전향적으로 발견되는 임의의 벡터 시스템에 사용된다. 본 발명은, 과도한 실험없이 그리고 합리적인 성공의 예측을 갖고 다른 벡터 시스템에 전이유전자 서열을 사용하는 것이 본 기술분야의 기술자의 기술 내에 속한 것이므로, 본 명세서에 기재된 임의의 특별한 바이러스 벡터에 제한되지 않는다.
본 발명의 수행에 유용한 유전자 전달 바이러스 벡터는 분자 생물학 분야에 잘 알려진 방법론을 이용하여 작제할 수 있다. 전형적으로, 전이유전자를 운반하는 바이러스 벡터는 전이유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 적합한 조절 요소 및 세포 형질도입을 매개하는 바이러스 단백질의 생산에 필요한 요소로부터 조립된다. 이러한 재조합 바이러스는 본 기술분야에 공지된 기술, 예를 들어 패키징 세포를 형질감염시키거나 또는 헬퍼 플라스미드 또는 바이러스를 사용한 일시적 형질감염에 의해 생성될 수 있다. 바이러스 패키징 세포의 전형적인 예는 HeLa 세포, SF9 세포(선택적으로 바큘로바이러스 헬퍼 벡터와 함께), 293 세포 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않다. 헤르페스바이러스 기반 시스템은 US20170218395A1에 기재된 바와 같이, AAV 벡터를 생성하는데 사용될 수 있다. 이러한 복제-결함성 재조합 바이러스를 생산하기 위한 세부적인 프로토콜은 예를 들어 각각의 전체 내용이 본 명세서에 참고로 포함되는 W095/14785, W096/22378, 미국 특허 번호 5,882,877, 미국 특허 번호 6,013,516, 미국 특허 번호 4,861,719, 미국 특허 번호 5,278,056 및 W094/19478에서 찾을 수 있다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 발현 카세트 또는 벡터(예를 들어, 유전자 요법 벡터) 및 하나 이상의 약제학적 허용성 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 특별한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 발현 카세트를 포함하는 AAV 벡터를 포함하며, 예를 들어 여기서 발현 카세트는 LAMP-2B를 암호화하는 코돈 최적화된 전이유전자, 예를 들어 서열번호 3 내지 5 중 임의의 것, 및 이의 변이체를 포함한다. 약제학적 조성물이 제공되며, 이는 예컨대 LAMP-2의 하나 이상의 동형을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 핵산 서열을 포함하는 본 명세서에 개시된 발현 카세트 또는 벡터의 치료적 유효량을 포함하는 결핍성 자가포식 흐름을 특징으로 하는 장애(예컨대, 다논병)을 예방하거나 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 수행에 유용한 AAV 벡터는 아데노바이러스 기반 및 무헬퍼(helper-free) 시스템을 포함하는 다양한 시스템을 사용하여 AAV 비리온(바이러스 입자)에 패키지될 수 있다. AAV 생물학에서 표준 방법은 문헌[Kwon and Schaffer. Pharm Res. (2008) 25(3): 489-99; Wu et al. Mol.Ther. (2006) 14(3):316-27. Burger et al. Mol.Ther. (2004) 10(2):302-17; Grimm et al. Curr Gene Ther. (2003) 3(4):281-304; Deyle DR, Russell DW. Curr Opin Mol Ther. (2009) 11(4):442-447; McCarty et al. Gene Ther. (2001) 8(16):1248-54; 및 Duan et al. Mol Ther. (2001) 4(4):383-91]에 기재된 것을 포함한다. 무헬퍼 시스템은 US 6,004,797; US 7,588,772; 및 US 7,094,604에 기재된 것을 포함한다.
발현 카세트 또는 벡터를 함유하는 약제학적 조성물은 선택된 투여 방식, 예를 들어, 심실내, 심근내, 관상동맥내, 정맥내, 동맥내, 신장내, 요도내, 경막외 또는 근육내 투여에 적합한 임의의 형태일 수 있다. 하나 이상의 LAMP-2 동형을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 유전자 요법 벡터는 단독 활성제로서, 또는 다른 활성제와 조합으로, 단위 투여 형태로, 통상적인 약제학적 지지체와의 혼합물로서, 동물 및 인간에게 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 개시내용의 임의의 유전자 요법 벡터에 의해 생체외에서 형질도입된 세포를 포함한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터(예를 들어, AAV 벡터) 또는 그 벡터를 포함하는 약제학적 조성물은 전신 투여될 때 효과적이다. 예를 들어, 본 개시내용의 바이러스 벡터는, 일부 경우에, 대상체(예를 들어, 영장류, 예컨대 인간이 아닌 영장류 또는 인간)에게 정맥내 투여될 때 효능을 입증한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 전신 투여될 때 다양한 조직에서(예를 들어, 심장, 근육 및/또는 폐에서) LAMP-2B의 발현을 유도할 수 있다. 특정 실시형태에서, 대상체에게 정맥내로 서열번호 3과 실질적으로 동일하거나, 또는 동일한 전이유전자를 포함하는 AAV9 벡터의 투여는 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, LAMP-2B의 발현은 대상체의 심장의 좌심실, 우심실, 좌심방, 및 우심방 중 하나 이상, 또는 전부에서 검출가능하다. 일부 실시형태에서, LMAP-2B의 발현은 대상체의 심장 중 좌심실의 소부위 1 및/또는 소부위 2에서 검출가능하다.
"검출가능한 발현"은 전형적으로 바이러스 벡터에 의해 처리되지 않은 대조용 대상체 또는 조직에 비해 적어도 5%, 10%, 15%, 20% 또는 그 이상의 전이유전자 발현을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 검출가능한 발현은 무 벡터 대조군보다 적어도 1.5배, 적어도 2배, 적어도 2.5배, 적어도 3배, 적어도 5배, 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 50배 또는 적어도 100배 큰 발현을 의미한다. 전이유전자 발현은 세포 중의 야생형 또는 내인성 유전자의 발현에 대한 증가(전이유전자의 발현이 내인성 유전자의 발현에 영향을 미칠 수 있을 것이라는 가능성을 감안하여)로서 결정할 수 있다. 전이유전자 발현은 또한 전이유전자 mRNA 전사체에는 존재하지만 내인성 유전자의 mRNA 전사체에는 존재하지 않는 서열의 RT-PCR 검출에 의해 결정될 수도 있다. 예를 들어, 전사체의 3' UTR을 사용하여 내인성 유전자(상이한 3' UTR을 가질 수 있음)의 발현에 독립적인 전이유전자의 발현을 결정할 수 있다. 전이유전자에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 발현은 이하 실시예에 기재된 바와 같은 웨스턴 블롯 또는 효소 면역흡착법(ELISA)이나, 또는 본 기술분야에 공지된 다른 방법에 의해 평가될 수 있다. 단백질의 야생형 및 외인성 카피에 대해 교차반응성인 항체가 사용될 수 있다. 일부 경우에, 외인성 단백질에 특이적인 항체는 식별되어 전이유전자 발현을 결정하는데 사용될 수 있다. 본 기술분야의 기술자는 표적 세포 또는 조직을 고려하여 적당한 검출 방법론을 설계할 수 있다. 일부 경우에, 발현은 표준 곡선을 사용하여 정량적으로 측정한다. 표준 곡선은 실시예에 기재되거나, 본 기술분야에 공지된 방법에 의해 정제된 LAMP-2 단백질을 사용하여 생성할 수 있다. 대안적으로, 전이유전자의 발현은 상응하는 mRNA의 정량에 의해 평가될 수 있다.
일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vector genome, vg)으로서, 5×1014 vg/kg 이하, 3×1014 vg/kg 이하, 2×1014 vg/kg 이하, 1×1014 vg/kg 이하, 9×1013 vg/kg 이하, 8×1013 vg/kg 이하, 7×1013 vg/kg 이하, 6×1013 vg/kg 이하, 5×1013 vg/kg 이하, 4×1013 vg/kg 이하, 3×1013 vg/kg 이하, 2×1013 vg/kg 이하, 또는 1×1013 vg/kg 이하의 용량에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vg)으로서, 1×1013 vg/kg 내지 2×1013 vg/kg, 2×1013 vg/kg 내지 3×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg 내지 4×1013 vg/kg, 4×1013 vg/kg 내지 5×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg 내지 6×1013 vg/kg, 6×1013 vg/kg 내지 7×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg 내지 8×1013 vg/kg, 8×1013 vg/kg 내지 9×1013 vg/kg, 9×1013 vg/kg 내지 1×1014 vg/kg, 1×1014 vg/kg 내지 2×1014 vg/kg, 2×1014 vg/kg 내지 3×1014 vg/kg, 또는 3×1014 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vg)으로서, 1×1013 vg/kg 내지 3×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg 내지 5×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg 내지 7×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg 내지 9×1013 vg/kg, 9×1013 vg/kg 내지 2×1014 vg/kg, 또는 2×1014 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vg)으로서, 1×1013 vg/kg 내지 5×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg 내지 9×1013 vg/kg, 또는 9×1013 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LMAP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vg)으로서, 1×1013 vg/kg 내지 9×1013 vg/kg, 또는 9×1013 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈(vg)으로서, 1×1013 vg/kg 내지 5×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg 내지 1×1014 vg/kg, 또는 1×1014 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다.
일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 1×1013 vg/kg 내지 5×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다. 일부 실시형태에서, 심장 조직에서 LAMP-2B의 검출가능한 발현은 대상체의 체중 킬로그램(kg)당 벡터 게놈으로서, 1×1013 vg/kg 내지 1×1014 vg/kg의 용량에서 일어난다.
다양한 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사될 수 있는 제형에 약제학적으로 허용성인 비히클(예컨대, 운반체, 희석제 및 부형제)을 함유한다. 예시적인 부형제는 폴록사머를 포함한다. 바이러스 벡터(AAV 포함)를 위한 제형 완충액은 일반적으로 응집을 방지하는 염 및 벡터의 점착력을 감소시키는 다른 부형제(예컨대, 폴록사머)를 함유한다. 이것은 특히 등장성, 멸균성, 식염수 용액(인산 일나트륨 또는 이나트륨, 염화 나트륨, 칼륨, 칼슘 또는 마그네슘. 및 이의 유사물 또는 상기 염의 혼합물), 또는 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 식염수의 첨가 시에 주사성 용액을 구성시키는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다. 유리하게는, 상기 제형은 동결 시(예컨대, 0℃ 미만, 약 -60℃, 또는 약 -72℃에서) 저장 및 사용하기에 안정하다.
라이소좀 장애 및/또는 다논병을 치료하는 예시적인 방법은 전체적으로 본 명세서에 포함된 WO 2018/170239 A1에 제공되어 있다. 본 개시내용의 전이유전자, 발현 카세트 및 벡터는 생체내(예를 들어, 전신, 특히 정맥내 사용) 및 또한 생체외 사용 모두에 유용하다. LAMP-2B 전이유전자 및 기능적 프로모터는 환자의 자가유래 조혈 줄기 및 전구 세포(HSPC)를 생체외 유전자 교정하는데 사용될 수 있고, 이것은 그 다음 환자에게 재이식되어 환자의 나머지 수명 동안 "건강한" 세포의 저장소인 골수를 재증식시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 교정된 생체외 유전자를 위해 사용되지만, 다른 비-바이러스 또는 바이러스 벡터가 렌티바이러스 벡터 대신에 사용될 수 있다. 본 개시내용은 공여체 HSPC를 사용하는 동종이계 이식체를 구상한다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 자가 불활성화(self-inactivating, SIN) 렌티바이러스 벡터이다. 일부 실시형태에서, HSPC는 예를 들어 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 및/또는 플레릭사포르(plerixafor)를 사용하여 동원된 말초 혈액으로부터 유래된다.
다른 양상에서, 본 개시내용은 대상체에게 본 개시내용의 유전자 요법 벡터를 투여하는 것을 포함하여, 필요로 하는 대상체의 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 개선, 감소, 억제, 제거 및/또는 역전시키는 방법을 제공한다. 용어 "다논병"은 다기관 임상 소견을 갖는 X-관련 우성 골격 및 심장 근육 장애를 지칭한다. 다논병 돌연변이는 라이소좀 관련 막 단백질 2(LAMP-2) 단백질 발현의 부재를 야기한다. 주요 임상 특징으로는 골격 및 심장 근육병증, 심장 전도 이상, 인지 곤란 및 망막 질병을 포함한다. 수컷은 일반적으로 암컷보다 더 일찍 더 심각하게 영향을 받는다.
일 실시형태에서, 벡터는 비경구, 정맥내, 동맥내, 심장내, 관상동맥내, 심근내, 신장내, 요도내, 경막외 및 근육내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여된다. 일 실시형태에서, 벡터는 복수 회 투여된다. 일 실시형태에서, 벡터는 벡터의 근육내 주사에 의해 투여된다. 일 실시형태에서, 벡터는 골격근 내로 벡터의 주사에 의해 투여된다. 일 실시형태에서, 발현 카세트는 근육 특이적 프로모터, 선택적으로 근육 크레아틴 키나제(MCK) 프로모터 또는 문헌[Takeshita et al. Muscle creatine kinase/SV40 hybrid promotor for muscle-targeted long-term transgene expression. Int J Mol Med. 2007 Feb;19(2):309-15]에 기재된 바와 같은 MCK/SV40 혼성 프로모터를 포함한다. 일 실시형태에서, 벡터는 심장내 주사에 의해 투여된다.
일 실시형태에서, 벡터, 예를 들어 AAV 벡터는 전신으로, 보다 특히 정맥내로 투여된다. 유리하게는, 벡터는 원시(original) 또는 야생형 LAMP-2B 서열이 사용될 때 동일한 반응을 관찰하는데 필요한 용량보다 적은 용량(vg/mL, vg/kg 체질량, 또는 vg/min/kg)으로 투여된다. 특별한 실시형태에서, 벡터는 본 명세서에 개시된 LAMP-2B를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 카세트를 포함하는 AAV2/9 벡터이다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은 대상체에서 LAMP-2B를 발현시키는 방법으로서, 대상체에게 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 전신 투여하는 것을 포함하되, AAV 벡터가 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 공유하거나, 또는 서열번호 3과 동일한 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 전이유전자는 인핸서/프로모터 영역에 작동적으로 연결되어 있고, 대상체에게 AAV 벡터의 전신 투여는 AAV 벡터를 투여하기 전의 LAMP-2B의 발현 또는 미처리된 대조군 대상체에서의 LAMP-2B의 발현에 비해, LAMP-2B의 증가된 발현을 초래하는 방법을 제공한다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 AAV2/9 벡터이다. 특별한 실시형태에서, 발현 카세트는 본 명세서에 개시된 임의의 요소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 전신 투여는 정맥내 투여를 포함한다. 일부 실시형태에서, 대상체는 다논병 증상을 나타내고 있다. 일부 실시형태에서, 대상체는 다논병을 앓고 있거나, 또는 다논병 위험이 있다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램(kg)당 AAV 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 렌티바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg)의 용량(vg/kg)으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 AAV 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 렌티바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 전신 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 전신 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 AAV 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, AAV 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 렌티바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 바이러스 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 정맥내 투여된다. 일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg 미만, 약 3×1012 vg/kg 미만, 약 5×1012 vg/kg 미만, 약 7×1012 vg/kg 미만, 약 1×1013 vg/kg 미만, 약 3×1013 vg/kg 미만, 약 5×1013 vg/kg 미만, 약 7×1013 vg/kg 미만, 약 1×1014 vg/kg 미만, 약 3×1014 vg/kg 미만, 약 5×1014 vg/kg 미만, 약 7×1014 vg/kg 미만, 약 1×1015 vg/kg 미만, 약 3×1015 vg/kg 미만, 약 5×1015 vg/kg 미만, 또는 약 7×1015 vg/kg 미만의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 약 1×1012 vg/kg, 약 3×1012 vg/kg, 약 5×1012 vg/kg, 약 7×1012 vg/kg, 약 1×1013 vg/kg, 약 3×1013 vg/kg, 약 5×1013 vg/kg, 약 7×1013 vg/kg, 약 1×1014 vg/kg, 약 3×1014 vg/kg, 약 5×1014 vg/kg, 약 7×1014 vg/kg, 약 1×1015 vg/kg, 약 3×1015 vg/kg, 약 5×1015 vg/kg, 또는 약 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 바이러스 벡터는 1×1012 vg/kg, 3×1012 vg/kg, 5×1012 vg/kg, 7×1012 vg/kg, 1×1013 vg/kg, 3×1013 vg/kg, 5×1013 vg/kg, 7×1013 vg/kg, 1×1014 vg/kg, 3×1014 vg/kg, 5×1014 vg/kg, 7×1014 vg/kg, 1×1015 vg/kg, 3×1015 vg/kg, 5×1015 vg/kg, 또는 7×1015 vg/kg의 용량으로 정맥내 투여된다.
일부 실시형태에서, 전신(또는 보다 특히 정맥내) 투여는 대상체의 하나 이상의 조직(예컨대, 심장, 근육 및/또는 간)에서 전이유전자로부터 발현된 mRNA의 형태의 mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드를 발현시킨다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 심장에서 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 심장에서 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 심장에서 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 3배, 또는 4배 증가한다.
일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 근육에서 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 근육에서 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 근육에서 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 3배, 또는 4배 증가한다.
일부 실시형태에서, 상기 LAMP-2B 전이유전자는 심장에서 발현되나, 대상체의 간에서는 발현되지 않는다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 간에 비해 심장에서 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배인 것으로 관찰된다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 간에 비해 심장에서 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 4배인 것으로 관찰된다. 일부 실시형태에서, mRNA로서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드의 발현은 간에 비해 심장에서 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 3배, 또는 4배인 것으로 관찰된다.
일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에 비해 심장에서 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 심장에서 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 미처리된 대상체 또는 대조용 벡터로 처리된 대상체에서의 발현에 비해 심장에서 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 3배, 또는 4배 증가한다.
일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 간에 비해 심장에서 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배 또는 적어도 약 5배 증가한다. 일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 간에 비해 심장에서 적어도 1.2배, 적어도 1.3배, 적어도 1.4배, 적어도 1.5배, 적어도 1.6배, 적어도 1.7배, 적어도 1.8배, 적어도 1.9배, 적어도 2.0배, 적어도 2.2배, 적어도 2.3배, 적어도 2.4배, 적어도 2.5배, 적어도 3배 또는 적어도 4배 증가한다. 일부 실시형태에서, 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현은 간에 비해 심장에서 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 2.0배, 2.2배, 2.3배, 2.4배, 2.5배, 3배, 또는 4배 증가한다.
일부 실시형태에서, 유전자 요법 벡터의 투여는 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 최대 약 1.1배, 최대 약 1.2배, 최대 약 1.3배, 최대 약 1.4배, 최대 약 1.5배, 최대 약 1.6배, 최대 약 1.7배, 최대 약 1.8배, 최대 약 1.9배 또는 최대 약 2배 증가된 간에서의 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 유전자 요법 벡터의 투여는 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 최대 1.1배, 최대 1.2배, 최대 1.3배, 최대 1.4배, 최대 1.5배, 최대 1.6배, 최대 1.7배, 최대 1.8배, 최대 1.9배 또는 최대 2배 증가된 간에서의 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래한다. 일부 실시형태에서, 유전자 요법 벡터의 투여는 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 1.1배, 1.2배, 1.3배, 1.4배, 1.5배, 1.6배, 1.7배, 1.8배, 1.9배, 또는 2배 증가된 간에서의 야생형 또는 기능적 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래한다.
일 실시형태에서, 본 개시내용은 세포를 본 개시내용에 따른 유전자 요법 벡터와 접촉시키고, 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하여, 필요로 하는 대상체의 질병 또는 장애, 선택적으로 다논병을 치료하는 방법을 제공한다. 일 실시형태에서, 세포는 줄기 세포이고, 선택적으로 다능성 줄기 세포이다. 일 실시형태에서, 줄기 세포는 심장 조직으로 분화할 수 있다. 일 실시형태에서, 줄기 세포는 근육 조직, 예컨대 심장 근육 조직 및/또는 골근육 조직으로 분화할 수 있다. 일 실시형태에서, 줄기 세포는 자가유래이다. 일 실시형태에서, 줄기 세포는 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC)이다.
일 실시형태에서, 질병 또는 장애는 자가포식 장애이다. 일부 실시형태에서, 자가포식 장애는 말기 심부전, 심근 경색, 약물 독성, 당뇨병, 말기 신부전 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택되나, 이에 제한되지는 않는다. 일 실시형태에서, 대상체는 포유류, 예컨대 인간이다. 일 실시형태에서, 대상체는 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 증상을 나타내고 있다. 일 실시형태에서, 대상체는 감소된 또는 검출 불가능한 LAMP-2 발현을 갖는 것으로 식별되었다. 일 실시예에서, 대상체는 돌연변이된 LAMP-2 유전자를 갖는 것으로 식별되었다.
본 명세서에 기재된 방법을 사용하여 치료할 수 있는 대상체/환자는 불충분한 자가포식 흐름[예를 들어, 다논병 뿐만 아니라, 자가포식의 다른 공지된 장애, 예컨대 수축기 및 이완기 심부전, 심근 경색, 약물 독성(예를 들어, 안트라사이클린 클로로퀸 및 이의 유도체), 당뇨병, 말기 신장 질환 및 노화를 포함하나, 이에 제한되지 않음]을 특징으로 하는 질병 또는 장애의 위험이 있으나, 증상을 나타내지는 않는 개체, 뿐만 아니라 현재 증상을 나타내는 대상체를 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 대상체는 돌연변이된 LAMP-2 유전자를 갖거나, 또는 LAMP-2 발현의 감소된 또는 검출 불가능한 수준을 갖는 것으로 식별되었을 수 있다.
일부 실시형태에서, 환자는 인간이다. 일부 실시형태에서, 환자는 소아, 청소년, 또는 성인이다. 일부 실시형태에서, 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 또는 20세, 또는 20세 초과이다. 일부 실시형태에서, 환자는 20 내지 50세이다. 일부 실시형태에서, 환자는 50 내지 65세이다. 일부 실시형태에서, 환자는 1 내지 5세, 2 내지 6세, 3 내지 7세, 4 내지 8세, 5 내지 9세, 6 내지 10세, 7 내지 11세, 8 내지 12세, 9 내지 13세, 10 내지 14세, 11 내지 15세, 12 내지 16세, 13 내지 17, 14 내지 18세, 15 내지 19세 또는 16 내지 20세이다. 일부 실시형태에서, 환자는 5 내지 6세, 6 내지 7세, 7 내지 8세, 8 내지 9세, 9 내지 10세, 10 내지 11세, 11 내지 12세, 12 내지 13세, 13 내지 14세, 14 내지 15세, 15 내지 16세, 16 내지 17세, 17 내지 18세, 18 내지 19세, 19 내지 20세 또는 20 내지 21세이다. 특별한 실시형태에서, 환자는 15 내지 16세이다.
일부 실시형태에서, 환자는 인간 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 소아, 청소년 또는 성인 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20세 수컷이거나, 또는 20세 초과 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 20 내지 50세 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 50 내지 65세 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 1 내지 5세, 2 내지 6세, 3 내지 7세, 4 내지 8세, 5 내지 9세, 6 내지 10세, 7 내지 11세, 8 내지 12세, 9 내지 13세, 10 내지 14세, 11 내지 15세, 12 내지 16세, 13 내지 17세, 14 내지 18세, 15 내지 19세, 16 내지 20세 수컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 5 내지 6세, 6 내지 7세, 7 내지 8세, 8 내지 9세, 9 내지 10세, 10 내지 11세, 11 내지 12세, 12 내지 13세, 13 내지 14세, 14 내지 15세, 15 내지 16세, 16 내지 17세, 17 내지 18세, 18 내지 19세, 19 내지 20세, 또는 20 내지 21세 수컷이다. 특별한 실시형태에서, 환자는 15 내지 16세이다.
일부 실시형태에서, 환자는 인간 암컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 소아, 청소년 또는 성인 암컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20세 암컷 또는 20세 초과의 암컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 20 내지 50세 암컷이다. 일부 실시형태에서, 환자는 50 내지 65세 암컷이다.
일부 실시형태에서, 대상체는 불충분한 자가포식 흐름을 특징으로 하는 질병 또는 장애(예를 들어, 다논병, 뿐만 아니라 수축기 및 이완기 심부전, 심근 경색, 약물 독성, 당뇨병, 말기 신장 질환 및 노화를 포함하지만, 이에 제한되지는 않음)의 증상을 나타내고 있다. 증상은 활발하게 나타날 수 있고, 또는 억제되거나 제어될 수 있으며(예컨대, 약물치료에 의해), 또는 회복 중일 수 있다. 대상체는 예컨대 자격이 있는 의사에 의해, 상기 장애로 진단을 받았거나 받지 않았을 수 있다.
정의
용어 "라이소좀 관련 막 단백질 2" 및 "LAMP-2"는 다음과 같은 핵산 및 폴리펩타이드 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 상동체를 호환적으로 지칭한다: (1) LAMP-2 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열[예컨대, GenBank 수탁 번호 NM_002294.2(동형 A), NM_013995.2(동형 B), NM_001122606.1(동형 C) 참조] 또는 LAMP-2 폴리펩타이드의 아미노산 서열[예컨대, GenBank 수탁 번호 NP_002285.1(동형 A), NP_054701.1(동형 B), NP_001116078.1(동형 C) 참조]과, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400, 또는 그 이상의 아미노산 상에서, 또는 전체 길이 상에서, 약 90% 초과의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것; (2) LAMP-2 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 LAMP-2 폴리펩타이드)의 아미노산 서열 또는 LAMP-2 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 LAMP-2 폴리뉴클레오타이드)에 의해 암호화된 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형된 변이체를 포함하는 면역원에 대해 유발된 항체, 예를 들어 다클론 항체에 결합하는 것; (3) LAMP-2 단백질 및 이의 보존적 변형된 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 상응하는 안티센스 가닥에 엄중한 혼성화 조건 하에서 특이적으로 혼성화하는 것; (4) LAMP-2 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 LAMP-2 폴리뉴클레오타이드, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 LAMP-2 폴리펩타이드를 암호화하는 LAMP-2 폴리뉴클레오타이드)에 대해, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000개 이상의 뉴클레오타이드의 영역 상에서 또는 전체 길이 상에서, 약 90% 초과, 바람직하게는 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것.
용어 "라이소좀 관련 막 단백질 2B" 및 "LAMP-2B"는 다음과 같은 핵산 및 폴리펩타이드 다형성 변이체, 대립유전자, 돌연변이체 및 종간 상동체를 호환적으로 지칭한다: (1) LAMP-2B 핵산에 의해 암호화된 아미노산 서열(예컨대, NM_013995.2 참조) 또는 LAMP-2B 폴리펩타이드의 아미노산 서열(예컨대, NP_054701.1 참조)과, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 300, 400개, 또는 그 이상의 아미노산 영역 상에서, 또는 전체 길이 상에서, 약 90% 초과의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 또는 그 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것; (2) LAMP-2B 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 기재된 LAMP-2B 폴리펩타이드)의 아미노산 서열; 또는 LAMP-2B 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드)에 의해 암호화된 아미노산 서열, 및 이의 보존적 변형된 변이체를 포함하는 면역원에 대해 유발된 항체, 예를 들어 다클론 항체에 결합하는 것; (3) LAMP-2B 단백질 및 이의 보존적 변형된 변이체를 암호화하는 핵산 서열에 상응하는 안티센스 가닥에 엄중한 혼성화 조건 하에서 특이적으로 혼성화하는 것; (4) LAMP-2B 핵산(예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드, 및 본 명세서에 기재된 바와 같은 LAMP-2B 폴리펩타이드를 암호화하는 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드)에 대해, 바람직하게는 적어도 약 25, 50, 100, 200, 500, 1000, 2000개 이상의 뉴클레오타이드의 영역 상에서 또는 전체 길이 상에서, 약 90% 초과, 바람직하게는 약 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 초과, 또는 그 이상의 뉴클레오타이드 서열 동일성을 갖는 핵산 서열을 갖는 것.
단백질(예컨대, LAMP-2B)과 관련하여 용어 "기능적 변이체"는 단백질의 하나 이상의 기능적 속성을 유지하는, 폴리펩타이드 서열, 또는 적어도 약 30, 적어도 약 40, 적어도 약 50, 적어도 60, 적어도 약 70, 또는 적어도 약 80개의 아미노산 잔기를 갖는 폴리펩타이드 서열의 단편을 지칭한다. 예를 들어, LAMP-2B의 기능적 변이체는 (1) 인간 심근세포 기능 조절[Chi et al. (2019) PNAS USA 116(2)556-565]; (2) 다논병에서 대사 및 생리 기능의 개선[Adler et al. (2019) J. Am. College Cardiology S0735-1097(19)31295-1]; 및/또는 (3) 자가포식[Rowland et al. (2016) J. Cell Sci. (2016) 129, 2135-2143]과 같은 하나 이상의 기능을 유지하는 LAMP-2B(본 명세서에 정의된 것과 같음)이다.
LAMP-2B는 내강 도메인(잔기 29 내지 375), 막관통 도메인(잔기 376 29 내지 399) 및 세포질 도메인(잔기 400 29 내지 410)을 갖는다. UniProt 수탁 번호 P13473 참조. LAMP-2B 기능은 다양한 스트레스에 대한 반응으로서, 및 긴 생물학적 반감기를 갖는 단백질의 정상적인 전환(turnover)의 일부로서 단백질의 라이소좀성 분해를 매개하는 과정인 샤페론 매개 자가포식을 포함한다[Cuervo et al. Science 273:501-503(1996), Cuervo et al. J. Cell Sci. 113:4441-4450(2000), Bandyopadhyay et al. Mol. Cell. Biol. 28:5747-5763(2008), Li et al. Exp. Cell Res. 327:48-56(2014), Hubert et al. Biol. Open 5:1516-1529(2016)]. LAMP-2B는 라이소좀 분해를 위해 GAPDH 및 MLLT11을 표적으로 삼을 수 있다. LAMP-2B는 자가포식 동안 라이소좀과 자가포식소체(autophagosomes)의 융합에 필요할 수 있다. LAMP2가 부족한 세포는 VAMP8의 정상 수준을 발현하지만, 자가포식소체에 STX17을 축적하지 못하며, 이는자가포식소체와 라이소좀 간의 융합 부족에 대한 가장 가능성 있는 설명인 것으로 제안되었다. LAMP-2B는 자가포식소체의 함유물에 대한 정상적인 분해에 필요할 수 있다. LAMP-2B는 라이소좀성 단백질 분해에서의 기능을 통해 효율적인 MHCII 매개의 외인성 항원 제시에 필요할 수 있고; 엔도좀/라이소좀 구획에서 프로테아제에 의해 생성된 항원성 펩타이드는 초기 MHCII 서브유닛에 의해 포획된다[Crotzer et al. Immunology 131: 318-330(2010)].
따라서, LAMP-2B의 기능적 변이체는 전술한 기능 중 임의의 것을 매개할 수 있는 LAMP-2B의 단편을 포함한다. 일부 실시형태에서, LAMP-2B의 기능 단편은 내강, 막관통 및 세포질 도메인 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, LAMP-2B의 기능적 변이체는 천연 LAMP-2B와 관련하여 하나 이상의 C-말단 또는 N-말단 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, LAMP-2B의 기능적 변이체는 천연 LAMP-2B와 관련하여 하나 이상의 내부 결실을 포함한다.
2개 이상의 핵산 또는 폴리펩타이드 서열의 상황에서 용어 "동일한" 또는 "동일성" 퍼센트는 이하의 서열 비교 알고리즘 중 하나를 사용하거나 수동 정렬 및 육안 조사에 의해 측정했을 때, 비교창 상에서, 또는 지정된 영역 상에서 최대 대응도로 비교 및 정렬한 경우, 참조 서열, 예컨대 본 명세서에 기재된 LAMP-2 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 특정 영역 상에서 동일하거나, 또는 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 특정 백분율을 보유하는(즉, 적어도 약 80% 동일성, 예컨대 적어도 약 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 동일성을 공유함) 2 이상의 서열 또는 부분서열을 지칭한다. 이러한 서열은 이후 "실질적으로 동일한"이라고 한다. 이 정의는 시험 서열의 보체를 지칭하기도 한다. 바람직하게는, 동일성은 참조 서열의 적어도 약 25개 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역 상에, 예컨대 50, 100, 200, 300, 400개 아미노산 또는 뉴클레오타이드 길이인 영역 상에, 또는 전체 길이 상에 존재한다.
서열 비교를 위해, 전형적으로 하나의 서열은 참조 서열로서 작용하고, 이에 대해 시험 서열이 비교된다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 서열 및 참조 서열이 컴퓨터에 입력되고, 필요한 경우 부분서열 좌표가 지정되고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터가 지정된다. 디폴트 프로그램 파라미터가 사용될 수 있거나, 또는 대안적 파라미터가 지정될 수 있다. 서열 비교 알고리즘은 이후 프로그램 파라미터를 기반으로 하여, 참조 서열에 상대적인 시험 서열의 서열 동일성 퍼센트를 계산한다. LAMP-2 핵산 및 단백질에 대한 핵산 및 단백질의 서열 비교에는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘 및 디폴트 파라미터가 사용된다.
본 명세서에 사용된 "비교창"은 두 서열이 최적으로 정렬된 후 동일한 수의 근접 위치들의 참조 서열과 서열을 비교할 수 있다는 점에서 20 내지 600개, 일반적으로 약 50 내지 약 200개, 보다 일반적으로 약 100 내지 약 150개로 이루어진 군으로부터 선택된 근접 위치의 수 중 어느 하나의 분절에 대한 참고를 포함한다. 비교하기 위한 서열의 정렬 방법은 본 기술분야에 공지되어 있다. 비교하기 위한 서열의 최적 정렬은, 예를 들어, Smith & Waterman[Adv.Appl.Math. 2:482(1981)]의 국소 상동성 알고리즘, Needleman & Wunsch[J.Mol.Biol. 48:443(1970)]의 상동성 정렬 알고리즘, Pearson & Lipman[Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444(1988)]의 유사성 방법에 대한 조사, 이러한 알고리즘들의 컴퓨터 구현(GAP, BESTFIT, FASTA, and TEASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI), 또는 수동 정렬 및 육안 조사[예컨대, Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology(1995 supplement)]에 의해 수행될 수 있다. 서열 동일성 및 서열 유사성 퍼센트를 결정하기에 적합한 알고리즘의 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌[Altschul et al., J.Mol.Biol. 215:403-410(1990)] 및 [Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402(1977)]에 기재되어 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생명공학정보 센터(월드와이드 웹 ncbi.nlm.nih.gov/)를 통해 공개적으로 이용할 수 있다.
2개의 핵산 서열 또는 폴리펩타이드가 실질적으로 동일하다는 표시는 이하에 기재된 바와 같이, 제1 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드가 제2 핵산에 의해 암호화된 폴리펩타이드에 대해 유발된 항체와 면역학적으로 교차반응성인 것이다. 따라서, 예컨대 두 펩타이드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 폴리펩타이드는 전형적으로 제2 폴리펩타이드와 실질적으로 동일하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 다른 표시는 두 분자 또는 이들의 보체가 엄격한 조건 하에서 서로 혼성화한다는 것이다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 표시는 서열을 증폭시키기 위해 동일한 프라이머를 사용할 수 있다는 것이다.
본 명세서에 사용된, "투여하는"은 국소 및 전신 투여, 예컨대 장, 비경구, 폐, 및 국부/경피 투여를 포함하는 것을 의미한다. 본 명세서에 기재된 방법에 사용되는 화합물(예컨대, 하나 이상의 LAMP-2 동형을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드)의 투여 경로는, 예컨대, 경구[경구투약(P.O.)] 투여, 비강 또는 흡입 투여, 좌약으로서 투여, 국부 접촉, 경피 전달(예컨대, 경피 패치를 통해), 척수강내(IT) 투여, 정맥내("iv") 투여, 복강내("ip") 투여, 근육내("im") 투여, 병변내 투여 또는 피하("sc") 투여, 또는 서방형 장치, 예를 들어, 미니 삼투 펌프, 데포 제형 등을 대상체에 이식하는 것을 포함한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 경구, 비강, 질, 직장 또는 경피)을 포함한 임의의 경로에 의해 이루어질 수 있다. 비경구 투여는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 동맥내, 신장내, 요도내, 심장내, 관상동맥내, 심근내, 피내, 경막외, 피하, 복강내, 심실내, 이온영동 및 두개내를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포솜 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
용어 "전신 투여" 및 "전신 투여된"은 화합물 또는 조성물이 순환계를 통해 약제학적 작용의 표적 부위를 포함하는 신체의 부위로 전달되도록 화합물 또는 조성물을 포유류에 투여하는 방법을 지칭한다. 전신 투여는 경구, 비강내, 직장 및 비경구(예를 들어, 근육내, 정맥내, 동맥내, 경피 및 피하와 같이, 소화관을 통과하는 것 외에 다른 것) 투여를 포함하지만, 이에 제한되지 않다.
용어 "공동투여" 또는 "병행 투여"는, 예를 들어, 화합물(예를 들어, LAMP-2 폴리뉴클레오타이드) 및/또는 이의 유사체 및 다른 활성제와 관련하여 사용될 때, 화합물 및/또는 유사체 및 활성제 둘 모두가 동시에 생리적 효과를 달성할 수 있도록 하는 화합물 및/또는 유사체와 활성제의 투여를 의미한다. 하지만, 두 제제가 반드시 함께 투여될 필요는 없다. 특정 실시형태에서, 하나의 제제의 투여가 다른 제제의 투여보다 선행될 수 있다. 동시적인 생리학적 효과는 동시에 순환계 중에 두 제제의 존재를 반드시 필요로 하지는 않는다. 하지만, 특정 실시형태에서, 공동투여는 전형적으로 두 제제가 임의의 주어진 용량에서 각각의 최대 혈청 농도 중 유의적인 분율(예컨대, 20% 이상, 예컨대 30% 또는 40% 또는 그 이상, 예컨대 50%, 또는 60% 또는 그 이상, 예컨대 70%, 또는 80%, 또는 90%, 또는 그 이상)로 체내에(예컨대, 혈장내에) 동시에 존재하게 한다.
용어 "유효량" 또는 "약제학적 유효량"은 원하는 결과, 예컨대 손상된 또는 결핍성 자가포식을 특징으로 하는 질병(예컨대, 다논병)의 최대 가혹함을 감소시키기에 충분한 양으로 하나 이상의 LAMP-2 동형의 증가된 발현을 초래하는데 필수적인 하나 이상의 화합물(예컨대, 유전자 요법 벡터)의 양 및/또는 투여량, 및/또는 투여 요법을 지칭한다.
어구 "투여되도록 하는"은 대상체에게 문제의 제제(들)/화합물(들)의 투여를 조절하고 및/또는 허용하는, 의료 전문가(예컨대, 의사) 또는 대상체의 의료적 치유를 제어하는 자가 취하는 행위를 지칭한다. 투여되도록 하는 것은, 대상체에 대한 적당한 치료 또는 예방 요법, 및/또는 처방한 특별한 제제(들)/화합물들의 진단 및/또는 결정을 수반할 수 있다. 이러한 처방은 예를 들어 처방전을 작성하고, 의료 기록에 주해를 다는 것 등을 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 용어 "치료하는" 및 "치료"는 이 용어가 적용되는 질병 또는 상태, 또는 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을, 개시를 지연시키거나, 진행을 저지 또는 역전시키거나, 중증도를 감소시키거나, 또는 경감 또는 예방하는 것을 지칭한다. 용어 "치료하는" 및 "치료"는 또한 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 예방, 완화, 개선, 감소, 억제, 제거 및/또는 역전시키는 것도 포함한다.
용어 "완화"는 상기 병리 또는 질병의 하나 이상의 증상의 감소 또는 제거, 및/또는 상기 병리 또는 질병의 하나 이상의 증상의 개시 또는 중증도의 속도 감소 또는 지연, 및/또는 상기 병리 또는 질병의 예방을 지칭한다. 특정 실시형태에서, 병리 또는 질병의 하나 이상의 증상의 감소 또는 제거는 예컨대 LAMP-2의 하나 이상의 동형의 발현 수준의 측정 가능하고 지속적인 증가를 포함할 수 있다.
본 명세서에 사용된, 어구 "본질적으로 이루어지는"은 방법 또는 조성물에서 언급된 활성 약제학적 제제의 속 또는 종을 지칭하며, 언급된 적응증 또는 목적에 대해 실질적인 활성을 자체적으로 갖지 않는 다른 제제를 더 포함할 수 있다.
용어 "대상체", "개체", 및 "환자"는 포유류, 바람직하게는 인간 또는 비인간 영장류를 지칭하지만, 가정에서 길들인 포유류(예컨대, 개 또는 고양이), 실험용 포유류(예컨대, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니 피그), 및 농업용 포유류(예컨대, 말, 소, 돼지, 양)도 호환적으로 지칭한다. 다양한 실시형태에서, 대상체는 인간일 수 있다(예컨대, 성인 수컷, 성인 암컷, 청소년기 수컷, 청소년기 암컷, 남아, 여아).
용어 "유전자 전이" 또는 "유전자 전달"은 이종 DNA를 숙주 세포 내로 신뢰할 수 있게 삽입하기 위한 방법 또는 시스템을 지칭한다. 이러한 방법은 비통합 전이된 DNA의 일시적 발현, 염색체외 복제 및 전이된 레플리콘(예컨대, 에피좀)의 발현, 또는 숙주 세포의 게놈 DNA 내로 전이된 유전자 물질의 통합을 초래할 수 있다.
용어 "벡터"는 다른 핵산 분자를 전이 또는 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭하기 위해 본 명세서에 사용된다. 전이된 핵산은 상기 벡터 핵산 분자에 일반적으로 연결되고, 예컨대 삽입된다. 벡터는 세포에서 자율적인 복제 또는 역전사를 유도하는 서열을 포함할 수 있고, 또는 숙주 세포 DNA에 통합되기에 충분한 서열을 포함할 수 있다. "벡터"는 유전자 요법 벡터를 포함한다. 본 명세서에 사용된, 용어 "유전자 요법 벡터"는 유전자 요법을 수행하는데 사용할 수 있는 벡터, 예컨대 치료 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 대상체에게 전달하는데 사용할 수 있는 것을 지칭한다. 유전자 요법 벡터는 치료적 활성 폴리펩타이드, 예컨대 LAMP-2B를 암호화하는 핵산 분자("전이유전자") 또는 대상체에게 도입되었을 때 대체 유전자 요법에 유용한 다른 유전자를 포함할 수 있다. 유용한 벡터는 바이러스 벡터를 포함하지만, 이들로 제한되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어 "발현 카세트"는 적절한 환경에서 발현 카세트에 통합된 치료적 활성 폴리펩타이드(예컨대, LAMP-2B)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드("전이유전자")의 발현을 유도할 수 있는 DNA 분절을 지칭한다. 숙주 세포에 도입된 경우, 발현 카세트는 특히 세포의 기구가 전이유전자를 RNA로 전사하도록 유도할 수 있고, 그 다음 일반적으로 추가 프로세싱되고 마지막으로 치료 활성 폴리펩타이드로 해독된다. 발현 카세트는 유전자 요법 벡터에 포함될 수 있다. 일반적으로, 용어 발현 카세트는 5'ITR에 대해 5' 및 3'ITR에 대해 3'에 있는 폴리뉴클레오타이드 서열은 포함하지 않는다.
본 명세서에서 참조되고 식별된 모든 특허, 특허 공보, 및 다른 간행물은 모든 목적을 위해 그 전체 내용이 본 명세서에 개별적이고 명백하게 참고로 포함된다.
실시예
실시예 1: Lamp-2B 전이유전자 변이체를 이용한 향상된 유전자 발현
도 2에 도시된 유전자 발현 카세트는 LAMP-2B 전이유전자 발현을 위해 플라스미드 기반 녹색 형광 단백질(GFP) 리포터 시스템에 작제하였다. 플라스미드는 LAMP-2B 전이유전자, 2A 펩타이드, 및 향상된 녹색 형광 단백질(eGFP)을 암호화하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하였다. 2A 펩타이드의 해독후 자가-절단은 LAMP-2B 및 eGFP를 등몰량으로 공동발현시켰다. 야생형 LAMP-2B 암호 서열(서열번호 2) 및 LAMP-2B 암호 서열의 3개의 코돈 변이체(코돈 변이체 1, 2 및 3; 각각 서열번호 3 내지 5)를 전이유전자로서 시험하였다. 3개의 코돈 변이체는 야생형 LAMP-2B 암호 서열에 비해, 감소된 수의 CpG, 잠재적 부위의 제거, 및 감소된 수의 오픈 리딩 프레임을 함유하였다.
CellBIND 96웰 평판(NUNC #3300)의 40개 웰을 0.1% 젤라틴 수용액(Millipore ES-006-B)으로 실온에서 1 시간 동안 코팅하였다. 약 88,000개의 유도된 다능성 줄기 세포(iPSC) 유래된 심근세포(VWR MSPP-CMC10001)를 평판 배지(VWR #1001)에서 각 웰로 플레이팅하여 37℃ 및 5% 이산탄소(CO2)에서 배양하였다. 4시간 후, 상기 배지를 37℃ 및 5% CO2에서 예비평형화된 유지 배지(VWR #M1003)로 교환하였다. 형질감염 혼합물은 형질감염 시약(ViaFect Promega #E4982) 6㎕를 OptiMEM 중의 0.015 ㎍/㎕ 플라스미드(야생형 또는 코돈 변이체 1, 2, 또는 3) 128㎕에 첨가하여 제조하거나, 또는 OptiMEM + ViaFect 단독(음성 대조군)으로 제조하고 10 내지 30분 동안 항온배양하였다. 형질감염 혼합물 100㎕를 37℃ 및 5% CO2로 예비평형화된 유지 배지 1 mL에 첨가하였다.
초기 플레이팅 후 약 28시간째, 유지 배지 중의 상기 형질감염 혼합물 100㎕를 각 웰에 첨가하였다. 형질감염 혼합물과 배지를 첨가하고 약 48시간 후, 세포는 자동 공초점 현미경(Perkin Elmer Operetta CLS, Harmony version 4.5 소프트웨어)에서 영상촬영하고 GFP 양성 세포(도 3) 및 이의 평균 형광 강도(도 4)에 대해 분석하였다. 형질감염 후 2일 또는 7일째, 상기 세포의 면역형광 영상은 각각 도 5 및 도 6에 제시하였다.
도 3은 코돈 변이체 1("CO 1") 또는 2("CO 2")의 사용이 야생형 전이유전자에 비해 유의적으로 높은(약 9배 높은) 수의 세포에서 GFP의 발현을 초래하였음을 보여준다. 이와 유사하게, 도 4에서는 코돈 변이체 1("CO 1") 및 2("CO 2")에 의해 형질감염된 세포에서 평균 GFP 강도가 야생형보다 1.5배 더 높은 것으로 나타났다.
실시예 2: 최적화된 LAMP-2B 유전자 요법 벡터
최적화된 AAV 유전자 요법 벡터는 실시예 1에 기재된 LAMP-2B 최적화된 변이체 CO1 서열을 재조합 AAV 벡터의 발현 카세트에 삽입하여 생성한다. AAV 조절 카세트는 상류 잠재적 ATG 서열을 제거하고, 최적화된 콘센서스 코작 서열 및/또는 전체 길이의 폴리아데닐화 서열을 사용하여 변형시킨다. 벡터는 전이유전자의 상류에 하나 이상의 추가 ATG 부위, 비-최적의 코작 서열, 및/또는 비-전체 길이의 폴리아데닐화 서열을 함유하는 대조용 재조합 AAV 벡터와 비교하여 시험한다. 벡터는 다논병 환자 iPSC 유래의 심근세포 및 다논병의 LAMP-2-/- 녹아웃 마우스 모델에서 시험관내 시험한다. 최적화된 AAV 유전자 요법 카세트 및 벡터는 대조용 재조합 AAV 벡터에 비해 더 높은 수준의 발현 및/또는 더 높은 백분율의 세포에서의 발현을 초래할 것으로 예측된다.
실시예 3: AAV9-LAMP-2B.v1.2의 시험관내 평가
AAV 유전자 요법 카세트 및 벡터는 전이유전자의 상류에 잠재적 개시 부위 없이, 최적화된 콘센서스 코작 서열 및 토끼 글로빈의 전체 길이의 폴리아데닐화(폴리A) 서열을 갖는 재조합 AAV 플라스미드 벡터에 LAMP-2B 변이 서열 CO1(서열번호 3)을 삽입하여 생성하였다("LAMP-2B.v.1.2"; 발현 카세트: 서열번호 8). LAMP-2B.v1.2는 최적의 코작 서열 및 미니-폴리A 없이 야생형 LAMP-2B 전이유전자(전이유전자 서열: 서열번호 2)를 갖는 조절 카세트인 LAMP-2B v1.0과 비교하였다.
3가지 플라스미드를 이용하여 바이러스 입자를 생성하기 위해 HEK293 세포를 사용하였고, 헬퍼 바이러스-무함유 시스템을 사용하여 혈청형 9 캡시드 단백질 및 LAMP-2B 발현 카세트에 인접한 AAV2 ITR을 갖는 바이러스 게놈을 함유하는 재조합 AAV 입자를 생성하였다. 발현 카세트는 CMV IE 인핸서(CMV IE), 닭 β-액틴(CBA) 프로모터, 및 CBA 인트론 스플라이스 공여체를 함유하는 상류 키메라성 "CAG" 프로모터에 의해 유도되는 인간 코돈 최적화된 LAMP-2B 암호 서열(v1.2 또는 v1.0)을 함유한다(도 1a). 발현 카세트는 또한 하류 WPRE 요소를 포함하고 토끼 베타-글로빈 폴리아데닐화 신호(RGpA)에 의해 종결된다. HEK293 세포는 LAMP-2B.v1.2 플라스미드 벡터 또는 LAMP-2B.v1.0 플라스미드 벡터, pAAV2/9 패키징 플라스미드, 및 pAd-헬퍼 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드에 의해 일시적으로 형질감염시켰다.
CHO-Lec2 세포를 10% FBS 및 1% Normocin을 함유한 MEM-α에서 1.2×105 세포/mL로 24웰 평판에 파종하였다. 다음 날, CHO-Lec2 세포를 무혈청 MEMα 배지에서, AAV9-LAMP-2B.v1.0, AAV9-LAMP-2B.v1.2, 또는 LAMP-2B 전이유전자 대신에 GFP를 갖는 동일 벡터를 이용하여 형질도입시켰다(3×105의 MOI에서). 형질도입 7일 후, Mammalian Cell Lysis 키트(Sigma)를 사용하여 용해물을 수확하였고, MicroBCA 키트를 제조업체의 지시에 따라 사용하여 총 단백질을 정량하였다. 단백질은 SDS-PAGE로 분리하였고, 니트로셀룰로스 막 위로 전이시키고 LAMP-2B(1:500) 및 GAPDH(1:10,000)에 대해 면역블로팅하였다. AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2에 의해 형질도입된 CHO-Lec2 세포는 원시의 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0에 의해 형질도입된 CHO-Lec2 세포에 비해 증가된 발현을 나타내었다(도 7a). LAMP-2B는 AAV9-GFP 벡터만에 의해 형질도입된 세포에서는 검출되지 않았다(도 7a).
LAMP-2B 발현은 또한 세포 용해물에서 ELISA에 의해 정량하였다. 간단히 설명하면, 96웰 평판에 항-LAMP-2B 항체(클론: H4B4)를 코팅하였고, 용해물을 웰에 첨가하였고, 항-LAMP-2B 다클론 항체(1:500, Thermo Fisher PA; 5-24575)를 사용한 뒤, HRP-접합된 항-토끼 항체(1:3000, Sigma)와 항온처리하여 검출을 수행하였다. AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2 벡터에 의한 형질도입은 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0에 의해 형질도입된 세포에 비해 LAMP-2B 발현을 약 7배 증가시켰다(도 7b).
심근세포는 다논병을 가진 개체에서 생성된 iPSC로부터 유래되었다. 율동적 수축 및 순도 선택 후, 다논병 심근세포를 다양한 바이러스 게놈 카피(vg)의 AAV9-Luc(음성 대조군), AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0 또는 AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2로 형질도입시켰다. 형질도입 10일 후, 형질도입된 심근세포를 4% 파라포름알데하이드로 고정시키고, 투과화한 후, 5% IgG-무함유 BSA에서 30분 동안 차단시키고 마우스 항-인간 LAMP-2B 항체(1:25, 클론: H4B4) 또는 토끼 항-α-액티닌 항체(1:200, #A7811, Sigma)와 1시간 동안 항온처리하였다. 세포는 1X PBS로 세척하여 미결합된 잔류 1차 항체를 제거하였고, 그 다음 적절한 항-마우스 AlexaFluor 태그화된 2차 항체 및 200 ng/mL DAPI로 실온에서 60분 동안 처리하였다. 그 다음, 영상촬영 전에 웰을 PBS로 세척하였다. 인간 LAMP-2B 발현은 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0의 최고 역가(8.45×1010 vg/웰)에 의해 형질도입된 심근세포에 비해 낮은 역가(1.56×108 vg/웰)의 AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2 벡터에 의해 형질도입된 심근세포에서 더 높은 수준으로 발현되었다(도 8a 및 도 8b).
형질도입된 다논병 심근세포에 대해 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. AAV9-야생형 LAM2B.v1.0(1.347×109 vg/웰) 또는 AAV9-Luc(1.167×109 vg/웰) 벡터에 의해 형질도입된 세포에서 LAMP-2B 단백질이 검출되지 않는 것에 비해, AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2는 0.983×109 vg/웰에서 LAMP-2B 단백질의 유의적인 발현을 나타내었다(도 8c). 종합적으로, 상기 결과들은 최적화된 AAV9-LAMP-2B.v1.2 벡터가 원시 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0 벡터보다 유의적으로 높은 수준으로 다논병 심근세포에서 인간 LAMP-2B 발현을 매개한다는 것을 입증한다.
실시예 4: 다논병 마우스 모델에서 AAV9-LAMP-2B.v1.2의 생체내 평가
LAMP-2 결핍성 마우스에게 원시 인간 LAMP-2B를 함유하는 AAV9 바이러스 벡터(AAV9-LAMP-2B.v1.0), 최적화된 인간 LAMP-2B를 함유하는 AAV9 바이러스 벡터(AAV9-LAMP-2B.v1.2, 코돈 변이체 1 - 서열번호 3), 또는 비히클 단독을 1×1013 vg/kg으로 정맥내로 주사하였다. 처리 6주 후, 마우스를 희생시키고, LAMP-2B 발현을 분석하기 위해 심장 조직을 수집하였다.
방법
벡터 카피 수의 정량적 분석을 위해, 총 DNA를 동결된 조직으로부터 DNeasy Blood and Tissue 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단리하였다. DNA 농도 및 온전성은 분광광도법적으로 평가하였다. 정방향(5'-ATCATGCTATTGCTTCCCGTA-3'; 서열번호 36) 및 역방향(5'-GGGCCACAACTCCTCATAAA-3'; 서열번호 37) 프라이머 및 WPRE 유전자용 프로브(5'-CCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCT-3'; 서열번호 38)를 가지고 TaqPath ProAmp Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하여 qPCR을 수행하여 DNA ㎍당 바이러스 게놈 카피를 계산하였다. RNase P는 내인성 대조군으로서 사용하였다(Thermofisher, #4403328). 바이러스 생성에 사용된 벡터 게놈(WPRE)을 함유한 선형화된 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 샘플당 DNA의 정량은 TaqMan 카피 수 참조 검정을 사용하여 계산하였고 이배체 핵당 벡터 카피 수(VCN/이배체 핵)로서 나타내었다.
RNA는 RNeasy Fibrous Tissue Mini 키트를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 심장에서 추출 및 정제하였다. RNA 농도 및 온전성은 분광광도법적으로 평가하였다. RNA는 iScript cDNA Synthesis 키트를 사용하여 역전사하였고 cDNA는 정량적 실시간(qRT)-PCR의 주형으로서 사용하였다. qRT-PCR은 정방향(5'-ATCATGCTATTGCTTCCCGTA-3'; 서열번호 36) 및 역방향(5'-GGGCCACAACTCCTCATAAA-3'; 서열번호 37) 프라이머 및 WPRE 유전자용 프로브(5'-CCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCT-3'; 서열번호 38)를 가지고 TaqPath ProAmp Master Mix를 사용하여 cDNA에서 수행하였다.
단백질 추출을 위해, 조직을 급속 냉동 및 분쇄하고, 이어서 조직 분말을 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 단백질 용해 완충액(100mM Tris, 300mM NaCl, 20mM EDTA, 2% NP-40, 0.2% SDS)에서 분해시켰다. 부분 단백질 용해물을 유리 조직 그라인더를 통해 통과시키고, 30 진폭 미크론 전력으로 10초 간격을 두고 얼음 위에서 5초 동안 3번 초음파 처리하였다. 샘플을 12000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 다음 상청액을 수집하였다. 샘플의 단백질 농도는 Lowry 검정에 의해 결정하였다. 단백질(20 ㎍/샘플)은 10 내지 20% SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 신속한 건식 전달 기술을 통해 PVDF 막으로 전이시켰다. 막을 그 다음 5% 밀크(0.1% Tween-20을 함유한 PBS에 가용화된 무지방 분유)로 1시간 동안 차단시켰고, 항-인간 LAMP-2B(1:100, H4B4), 항-마우스 LAMP-2B(1:100) 또는 항-GAPDH(1:1000, #32233, Santa Cruz) 항체와 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 막을 세척한 다음 적절한 HRP-접합된 2차 항체(1:10,000)와 함께 실온에서 1시간 동안 항온처리하였다. 블롯은 WesternBright™ Sirius 기질을 사용하여 발색시킨 다음, BioRad 겔 영상화기(imager)에서 영상촬영하였다.
면역형광 분석을 위해, 조직을 4℃에서 30% 수크로스/PBS에서 동결보호하고 최적의 절단 온도(OCT) 탑재 배지에 매립시킨 다음, 조직을 표준 냉동조직절편기에서 8 내지 10 μm 두께로 절단하였다. 냉동절편을 그 다음 4% PFA로 5분 동안 고정시키고, 0.2% Triton-X로 5분 동안 투과화하고 1% BSA, 3% 혈청, PBS 중의 1% 냉수 피시 젤라틴으로 30분 동안 차단시켰다. 절편을 Alexa Fluor 647에 직접 접합된 마우스 항-인간 LAMP-2B 항체(1:50, H4B4) 및 토끼 항-디스트로핀 항체와 함께 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 슬라이드를 그 다음 항-토끼 Alexa Fluor 488 2차 항체 및 DAPI(1:2000, #D9542, Sigma)와 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 그 다음, Olympus FluoView FV1000 공초점 현미경을 사용하여 슬라이드를 영상촬영하였다. 스캔 속도, 오프세트, 전압 및 게인(gain)은 주어진 날짜에 모든 영상 수집 동안 일정하게 유지시켰다.
결과
AAV9 처리된 LAMP-2-결핍 마우스의 심장 조직에서 정량적 PCR을 수행하였다. 야생형 및 최적화된 LAMP-2B 함유 벡터에 의해 처리된 마우스의 심장 조직에서 유사한 바이러스 카피 수가 관찰되었지만(도 9a), AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2의 전사는 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0에 비해 거의 7배 증가하였다(도 9b). 심장 조직에 v1.0 및 v1.2 바이러스 벡터의 유사한 형질도입에도 불구하고, 인간 LAMP-2B mRNA 발현의 유도는 v1.2에 의해 현저하게 향상되었다.
AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2 벡터를 정맥 주사한 LAMP-2 결핍 마우스는 또한 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0 또는 비히클 대조군으로 처리된 LAMP2 결핍 마우스에 비해 심장 조직에서 인간 LAMP-2B 단백질의 유의적으로 높은 수준을 나타내었다(도 9c). 유사한 결과가 면역형광 염색에 의해 달성되었다: 인간 LAMP-2B는 AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2로 처리된 LAMP-2-결핍 마우스의 심장 조직에서 고도로 유도되었다(도 9d). 종합적으로, 이들 데이터는 AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2 벡터를 사용한 바이러스 형질도입이 동일 용량에서 AAV9-야생형 LAMP-2B.v1.0에 비해 생체내 심장 조직에서 인간 LAMP-2B 단백질의 발현을 증가시킨다는 것을 보여준다.
실시예 4: 비인간 영장류에서 AAV9-LAMP-2B.v1.2의 생체내 평가
비-인간 영장류에게 실시예 2에 기재된 코돈 변이체 LAMP-2B(v1.2, 코돈 변이체 1-서열번호 3)를 함유하는 AAV9 바이러스 벡터, 또는 비히클 대조군 중 하나를 1×1013 vg/kg으로 정맥내 주사하였다. 치료 8주 후, 비-인간 영장류를 인간적으로 희생시키고, LAMP-2B 발현 분석을 위해 심장, 근육, 간 및 뇌 조직을 수집하였다.
방법
벡터 카피 수의 정량적 분석을 위해, 총 DNA를 동결된 조직으로부터 Qiagen DNeasy 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 단리하였다. DNA 농도 및 온전성은 분광광도법적으로 평가하였다. 단리된 DNA에 대해 정방향(5'-ATCATGCTATTGCTTCCCGTA-3'; 서열번호 36) 및 역방향(5'-GGGCCACAACTCCTCATAAA-3'; 서열번호 37) 프라이머 및 WPRE 유전자용 프로브(5'-CCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCT-3'; 서열번호 38)를 가지고 TaqMan Universal Master Mix II(Applied Biosystems)를 사용하여 정량적 PCR을 수행하였다. RNaseP는 내인성 대조군으로서 사용하였다(#4403328, Thermofisher). 바이러스 생산에 사용된 벡터 게놈(WPRE)을 함유한 선형화된 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다. 샘플당 DNA의 정량은 TaqMan 카피 수 참조 검정을 사용하여 계산하였고 이배체 핵당 벡터 카피 수(VCN/Diploid Nucleus)로서 나타내었다.
심장 및 골격근으로부터는 RNeasy Fibrous Tissue Mini 키트를 사용하고 간 및 뇌로부터는 RNeasy Lipid Tissue 키트(Qiagen)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 RNA를 추출 및 정제하였다. RNA 농도 및 온전성은 NanoProp 분광광도계를 사용하여 평가하였다. RNA는 SuperScript IV VILO 마스터 믹스(ThermoFischer)를 사용하여 역전사하였고, cDNA를 정량적 실시간(qRT)-PCR의 주형으로서 사용하였다. qRT-PCR은 정방향(5'-ATCATGCTATTGCTTCCCGTA-3'; 서열번호 36) 및 역방향(5'-GGGCCACAACTCCTCATAAA-3'; 서열번호 37) 프라이머 및 WPRE 유전자용 프로브(5'-CCTCCTTGTATAAATCCTGGTTGCTGTCT-3'; 서열번호 38)를 가지고 TaqMan Universal Master Mix II를 사용하여 cDNA에서 수행하였다. 인간 HPRT-1은 내인성 대조군으로서 사용하였다. 바이러스 생산에 사용된 벡터 게놈을 함유한 선형화된 플라스미드를 사용하여 표준 곡선을 생성하였다.
RNAScope 기술을 사용한 mRNA의 반정량적 분석을 위해, 심장 조직을 10% 중성 완충화된 포르말린에서 고정시키고, 파라핀에 매립시키고 절단시켰다. 전이유전자 mRNA는 RNAscope 2.5 LS RED를 가지고 WPRE-O3 프로브(#518628, ACD)를 사용하여 검출하였다. 1 도트(dot)보다 큰 세포는 양성으로 간주하였고, 양성 세포의 백분율은 5개의 부류: 0%, 1 내지 25%, 26 내지 50%, 51 내지 75% 또는 100%로 범주화(binned)하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 125mg의 심장 조직을 500㎕의 용해 완충액에서 Next Advance Bullet System을 사용하여 균질화하였다. 단백질 농도는 BCA 키트(ThermoFischer)를 사용하여 결정하였고, 단백질(50 ㎍/샘플)은 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 그 다음 니트로셀룰로스 막으로 전이시켰다. 막은 그 다음 마우스 항-인간 LAMP2(1:100)로 프로브화하였고, 세척한 뒤, HRP-접합된 항-마우스 항체와 항온처리하였다. 블롯은 ECL 기질 및 BioRad ChemiDoc MP 시스템을 사용하여 발색시켰다.
LAMP-2B ELISA를 위해, 단백질 추출은 전술한 바와 같이 수행하였다. 평판은 마우스 항-LAMP2 항체(클론: H4B4, #NBP2-22217, Novus Biologicals)로 코팅하였고, 각 웰에 100 ㎍의 조직 용해물을 첨가하였고, 검출은 항-LAMP2 다클론 항체(#AF6228, R&D Systems)를 사용한 뒤, HRP-접합된 당나귀 항-염소 항체(#AP180P, Millipore)를 사용하여 수행하였다.
결과
AAV9 처리된 영장류의 다양한 조직에서 정량적 PCR을 수행하였다. 바이러스, 카피 수는 비히클 대조군에 비해, AAV9-LAMP-2B.v1.2 벡터가 1×1013 vg/kg으로 주사된 영장류의 심장, 근육 및 간 조직에서 증가하였다(도 10a). 벡터 게놈은 좌심실 및 우심실과 좌심방 및 우심방을 포함하는 조사된 모든 심실에서 검출되었다(도 10b). 벡터 mRNA는 미처리된 비히클 대조군에 비해 처리된 영장류의 심장, 골격근 및 간 조직에서 유의적인 수준으로 검출되었다(도 10c 및 도 10d). 동일계내 DNA 분석은 벡터 mRNA를 발현하는 약 25-75%의 심장 및 간 조직을 나타내었다(도 10e 및 도 10f). 이 데이터는 영장류에 1×1013 vg/kg의 AAV9-최적화된 LAMP-2B.v1.2의 전신 투여가 생체내 심장 조직에서 효율적인 형질도입 및 발현을 초래한다는 것을 입증한다.
웨스턴 블롯 분석은 1×1013 vg/kg의 LAMP-2B.v1.2에 의해 전신 처리된 영장류가 미처리된 대조군에 비해 심장의 좌심실 및 우심실과 좌심방에서 증가된 인간 LAMP-2B 단백질을 나타내었음을 보여주었다(도 10g 및 도 10h). ELISA도 역시 인간 LAMP-2B 단백질이 미처리된 대조군에 비해 AAV9-LAMP-2B.v1.2 벡터에 의해 처리된 영장류의 골격근 조직뿐만 아니라 심장의 좌심실 및 좌심방에서 증가하였음을 보여주었다(도 10i 및 도 10j). AAV9.LAMP-2B.v1.2에 의한 벡터 형질도입은 생체내 영장류의 심장 조직에서 인간 LAMP-2B 단백질의 발현을 야기한다.
SEQUENCE LISTING <110> ROCKET PHARMACEUTICALS, LTD. <120> GENE THERAPY VECTORS FOR TREATMENT OF DANON DISEASE <130> WO2020/014523 <140> PCT/US2019/041465 <141> 2019-07-11 <150> US 62/697,302 <151> 2018-07-12 <160> 38 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 409 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn 20 25 30 Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met 35 40 45 Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val 50 55 60 Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly 65 70 75 80 Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe 85 90 95 Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp 100 105 110 Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp 115 120 125 Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg 130 135 140 Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg 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atacacacca ctgtgccatc tcctactaca acacctactc caaaggaaaa accagaagct 660 ggaacctatt cagttaataa tggcaatgat acttgtctgc tggctaccat ggggctgcag 720 ctgaacatca ctcaggataa ggttgcttca gttattaaca tcaaccccaa tacaactcac 780 tccacaggca gctgccgttc tcacactgct ctacttagac tcaatagcag caccattaag 840 tatctagact ttgtctttgc tgtgaaaaat gaaaaccgat tttatctgaa ggaagtgaac 900 atcagcatgt atttggttaa tggctccgtt ttcagcattg caaataacaa tctcagctac 960 tgggatgccc ccctgggaag ttcttatatg tgcaacaaag agcagactgt ttcagtgtct 1020 ggagcatttc agataaatac ctttgatcta agggttcagc ctttcaatgt gacacaagga 1080 aagtattcta cagcccaaga gtgttcgctg gatgatgaca ccattctaat cccaattata 1140 gttggtgctg gtctttcagg cttgattatc gttatagtga ttgcttacgt aattggcaga 1200 agaaaaagtt atgctggata tcagactctg taa 1233 <210> 3 <211> 1233 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> variant of LAMP-2 <400> 3 atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60 ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120 tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180 tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240 gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300 aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360 ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420 ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480 aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540 acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600 atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660 ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720 ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780 agcactggga gctgcagatc acatacagct ctgctgaggc tcaactcctc caccatcaag 840 tacctggact ttgtgtttgc tgtgaagaat gagaacaggt tctacctcaa ggaagtgaac 900 atttccatgt acctggtcaa tggttcagtg ttctctattg ccaacaacaa tctgagctac 960 tgggatgcac ccctgggatc ctcctacatg 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acctggtgaa tgggagtgtg ttctccattg ctaacaacaa cctgagctac 960 tgggatgccc ctctgggctc ctcatacatg tgcaacaagg aacagactgt gagtgtgtca 1020 ggggccttcc agatcaacac ttttgacctg agagtgcagc cctttaatgt gacacaggga 1080 aagtacagca ctgctcagga gtgcagcctg gatgatgaca ctatcctgat ccctatcatt 1140 gtgggggcag gcctgtctgg actcattatt gtgattgtga ttgcctatgt gatagggaga 1200 aggaagtctt atgctggata ccagaccctg taa 1233 <210> 6 <211> 13 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Kozak sequence <400> 6 gccgccacca tgg 13 <210> 7 <211> 387 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> full-length polyA sequence <400> 7 tggctaataa aggaaattta ttttcattgc aatagtgtgt tggaattttt tgtgtctctc 60 actcggaagg acatatggga gggcaaatca tttaaaacat cagaatgagt atttggttta 120 gagtttggca acatatgccc atatgctggc tgccatgaac aaaggttggc tataaagagg 180 tcatcagtat atgaaacagc cccctgctgt ccattcctta ttccatagaa aagccttgac 240 ttgaggttag atttttttta tattttgttt tgtgttattt ttttctttaa catccctaaa 300 attttcctta catgttttac tagccagatt tttcctcctc tcctgactac tcccagtcat 360 agctgtccct 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4549 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> expression cassette <400> 10 ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60 ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120 aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctaccag ggtaatgggg 180 atcctctaga actatagcta gtcgacattg attattgact agttattaat agtaatcaat 240 tacggggtca ttagttcata gcccatatat ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa 300 tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt 360 tcccatagta acgccaatag ggactttcca ttgacgtcaa tgggtggagt atttacggta 420 aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt 480 caatgacggt aaatggcccg cctggcatta tgcccagtac atgaccttat gggactttcc 540 tacttggcag tacatctacg tattagtcat cgctattacc atggtcgagg tgagccccac 600 gttctgcttc actctcccca tctccccccc ctccccaccc ccaattttgt atttatttat 660 tttttaatta ttttgtgcag cgatgggggc gggggggggg ggggggcgcg cgccaggcgg 720 ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga ggtgcggcgg cagccaatca 780 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<210> 13 <400> 13 000 <210> 14 <211> 13 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> alternative Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3) <223> May be absent <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1) <223> g is the most common base, but may vary <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> c is the most common base, but may vary <220> <221> misc_feature <222> (4)..(4) <223> g is the most common base, but may vary <220> <221> misc_feature <222> (5)..(6) <223> c is the most common base, but may vary <220> <221> misc_feature <222> (8)..(9) <223> c is the most common base, but may vary <400> 14 nnnnnnrnna ugg 13 <210> 15 <211> 8 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> alternative Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (3)..(4) <223> n is a, c, g, or u <220> <221> misc_feature <222> (8)..(8) <223> n is a, c, g, or u <400> 15 agnnaugn 8 <210> 16 <211> 7 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> alternative Kozak sequence <220> <221> misc_feature <222> (2)..(3) <223> n is a, c, g, or u <400> 16 annaugg 7 <210> 17 <211> 7 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> alternative Kozak sequence <400> 17 accaugg 7 <210> 18 <211> 10 <212> RNA <213> Unknown <220> <223> alternative Kozak sequence <400> 18 gacaccaugg 10 <210> 19 <211> 235 <212> DNA <213> Bos taurus <400> 19 tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt gccttccttg 60 accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat tgcatcgcat 120 tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag caagggggag 180 gattgggagg acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc ttctg 235 <210> 20 <211> 222 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 20 cagacatgat aagatacatt gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa 60 aatgctttat ttgtgaaatt tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca 120 ataaacaagt taacaacaac aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggagatgt 180 gggaggtttt ttaaagcaag taaaacctct acaaatgtgg ta 222 <210> 21 <211> 202 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ctgcccgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc tcctggccct ggaagttgcc 60 actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt gcatcatttt gtctgactag 120 gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat ggagcaaggg gcccaagttg 180 ggaagaaacc tgtagggcct gc 202 <210> 22 <211> 1730 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> CAG promoter <400> 22 ctagtcgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60 atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120 cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180 tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240 tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300 ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360 acgtattagt catcgctatt accatggtcg aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc 420 ccatctcccc cccctcccca cccccaattt tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg 480 cagcgatggg ggcggggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg 540 ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa 600 agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga 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Artificial Sequence <220> <223> variant of LAMP-2 <400> 31 atggtctgct tcagactgtt ccctgtccct ggatctggtc tggtgcttgt gtgcttggtg 60 ctgggtgctg tgagatccta tgcccttgag ctgaacctga ctgactcaga aaatgccact 120 tgcctgtatg ccaagtggca gatgaacttc actgtgagat atgagactac caacaagacc 180 tacaagactg tgaccatctc agaccatggc actgtcacct acaatggatc aatctgtggt 240 gatgatcaga atggcccaaa gatagcagtg cagtttgggc ccggtttttc ctggattgct 300 aacttcacca aggcagcctc cacctacagc attgactcag tcagcttcag ctacaacact 360 ggggataaca ccaccttccc tgacgcagag gacaagggaa tccttactgt ggacgaactc 420 ctggcaatca gaatccccct taacgacctg ttcagatgca actccctttc aacccttgaa 480 aagaatgatg tggtgcaaca ctattgggac gtcctggtgc aagcctttgt gcagaatggg 540 acagtgagta ccaacgagtt cctctgtgac aaggacaaga ccagcactgt ggcccccact 600 atccacacca ctgtgcccag ccctaccact acccccaccc ctaaagagaa gccagaagct 660 ggaacctact cagtcaacaa tggaaatgac acatgcctcc ttgccaccat gggactgcag 720 ctgaacatca ctcaggacaa ggtggcctca gtgattaaca tcaaccctaa caccactcat 780 agcactggga gctgcagatc acatacagct 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Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met 35 40 45 Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val 50 55 60 Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly 65 70 75 80 Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe 85 90 95 Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp 100 105 110 Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp 115 120 125 Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg 130 135 140 Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu 145 150 155 160 Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe 165 170 175 Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp 180 185 190 Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro 195 200 205 Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser 210 215 220 Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln 225 230 235 240 Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro 245 250 255 Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu 260 265 270 Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val 275 280 285 Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr 290 295 300 Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr 305 310 315 320 Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr 325 330 335 Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val 340 345 350 Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Gln Asp Cys 355 360 365 Ser Ala Asp Asp Asp Asn Phe Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala 370 375 380 Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly Leu 385 390 395 400 Lys His His His Ala Gly Tyr Glu Gln Phe 405 410 <210> 35 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Met Val Cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly Ser Gly Leu Val Leu 1 5 10 15 Val Cys Leu Val Leu Gly Ala Val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn 20 25 30 Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gln Met 35 40 45 Asn Phe Thr Val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr Val 50 55 60 Thr Ile Ser Asp His Gly Thr Val Thr Tyr Asn Gly Ser Ile Cys Gly 65 70 75 80 Asp Asp Gln Asn Gly Pro Lys Ile Ala Val Gln Phe Gly Pro Gly Phe 85 90 95 Ser Trp Ile Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser Ile Asp 100 105 110 Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp 115 120 125 Ala Glu Asp Lys Gly Ile Leu Thr Val Asp Glu Leu Leu Ala Ile Arg 130 135 140 Ile Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn Ser Leu Ser Thr Leu Glu 145 150 155 160 Lys Asn Asp Val Val Gln His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gln Ala Phe 165 170 175 Val Gln Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp 180 185 190 Lys Thr Ser Thr Val Ala Pro Thr Ile His Thr Thr Val Pro Ser Pro 195 200 205 Thr Thr Thr Pro Thr Pro Lys Glu Lys Pro Glu Ala Gly Thr Tyr Ser 210 215 220 Val Asn Asn Gly Asn Asp Thr Cys Leu Leu Ala Thr Met Gly Leu Gln 225 230 235 240 Leu Asn Ile Thr Gln Asp Lys Val Ala Ser Val Ile Asn Ile Asn Pro 245 250 255 Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu 260 265 270 Arg Leu Asn Ser Ser Thr Ile Lys Tyr Leu Asp Phe Val Phe Ala Val 275 280 285 Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu Val Asn Ile Ser Met Tyr 290 295 300 Leu Val Asn Gly Ser Val Phe Ser Ile Ala Asn Asn Asn Leu Ser Tyr 305 310 315 320 Trp Asp Ala Pro Leu Gly Ser Ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gln Thr 325 330 335 Val Ser Val Ser Gly Ala Phe Gln Ile Asn Thr Phe Asp Leu Arg Val 340 345 350 Gln Pro Phe Asn Val Thr Gln Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys 355 360 365 Ser Ala Asp Ser Asp Leu Asn Phe Leu Ile Pro Val Ala Val Gly Val 370 375 380 Ala Leu Gly Phe Leu Ile Ile Val Val Phe Ile Ser Tyr Met Ile Gly 385 390 395 400 Arg Arg Lys Ser Arg Thr Gly Tyr Gln Ser Val 405 410 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 36 atcatgctat tgcttcccgt a 21 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 37 gggccacaac tcctcataaa 20 <210> 38 <211> 29 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis virus <400> 38 cctccttgta taaatcctgg ttgctgtct 29

Claims (74)

  1. 유전자 요법 벡터로서, 라이소좀 관련 막 단백질 2(lysosome-associated membrane protein 2: LAMP-2)의 동형(isoform) 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 전이유전자(transgene)를 포함하는 발현 카세트를 포함하되, 상기 전이유전자는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위해 최적화된, 유전자 요법 벡터.
  2. 제1항에 있어서, 상기 전이유전자는 인간 숙주 세포에서의 발현을 위해 코돈 최적화된, 유전자 요법 벡터.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 CpG 부위를 함유하는, 유전자 요법 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 잠재적 스플라이스 부위(cryptic splice site)를 함유하는, 유전자 요법 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 2보다 적은 수의 대안적 오픈 리딩 프레임(alternative open reading frame)을 암호화하는, 유전자 요법 벡터.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성 또는 적어도 99% 동일성을 공유하는, 유전자 요법 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 3 내지 5로부터 선택된 서열을 포함하는, 유전자 요법 벡터.
  8. 제7항에 있어서, 상기 전이유전자는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 공유하거나, 또는 서열번호 3과 동일한 유전자 요법 벡터.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 콘센서스 최적 코작(Kozak) 서열을 포함하되, 선택적으로 상기 콘센서스 최적 코작 서열이 서열번호 6을 포함하는, 유전자 요법 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하되, 선택적으로 상기 전체 길이의 폴리A 서열은 서열번호 7을 포함하는, 유전자 요법 벡터.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 상기 전이유전자에 대해 5'에 개시 부위를 포함하지 않는, 유전자 요법 벡터.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 제1 역위 말단 반복체, 인핸서/프로모터 영역, 인트론, 콘센서스 최적 코작 서열, 상기 전이유전자, 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하는 3' 비해독 영역, 및 제2 역위 말단 반복체를 포함하는, 유전자 요법 벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인핸서/프로모터 영역은 5'에서 3' 방향으로 CMV IE 인핸서 및 닭 베타-액틴 프로모터를 포함하고, 선택적으로 상기 인핸서/프로모터 영역은 닭 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론과 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 어셉터(splice acceptor)를 더 포함하는, 유전자 요법 벡터.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 적어도 95% 동일성을 공유하는, 유전자 요법 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 8 내지 10으로부터 선택된 서열과 완전한 동일성을 공유하는, 유전자 요법 벡터.
  16. 제14항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 공유하거나, 또는 서열번호 8과 동일한 유전자 요법 벡터.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 벡터는 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터인, 유전자 요법 벡터.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 요법 벡터를 포함하는, 약제학적 조성물.
  19. 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체의 다논병 또는 다른 자가포식 장애를 치료하거나 예방하는 방법으로서, 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항의 유전자 요법 벡터 또는 제18항의 약제학적 조성물을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서, 상기 벡터 또는 약제학적 조성물은 정맥내, 동맥내, 심장내, 관상동맥내, 심근내, 신장내, 요도내, 경막외 및 근육내로 이루어진 군으로부터 선택된 경로를 통해 투여되는, 방법.
  21. 제19항 또는 제20항에 있어서, 상기 자가포식 장애는 말기 심부전, 심근 경색, 약물 독성, 당뇨병, 말기 신부전 및 노화로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인, 방법.
  23. 제19항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 다논병 또는 다른 자가포식 장애의 증상을 나타내고 있는, 방법.
  24. 제19항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 감소된 또는 검출 불가능한 LAMP-2 발현을 갖는 것으로 식별된, 방법.
  25. 제19항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 돌연변이된 LAMP-2 유전자를 갖는 것으로 식별된, 방법.
  26. 제19항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체에 비해 심장에서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  27. 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체에 비해 심장에서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  28. 제19항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 최대 약 1.1배, 최대 약 1.2배, 최대 약 1.3배, 최대 약 1.4배 또는 최대 약 1.5배 증가된 간에서의 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래하는, 방법.
  29. 대상체에서 LAMP-2B를 발현시키는 방법으로서, 아데노 관련 바이러스(AAV) 벡터를 상기 대상체에게 전신 투여하는 단계를 포함하되, 상기 AAV 벡터는 서열번호 3과 적어도 95% 동일성을 공유하거나 또는 서열번호 3과 동일한 전이유전자를 포함하는 발현 카세트를 포함하고, 상기 전이유전자는 인핸서/프로모터 영역에 작동적으로 연결되어 있으며, 상기 대상체에 대한 상기 AAV 벡터의 전신 투여는 상기 AAV 벡터의 투여 전의 LAMP-2B의 발현 또는 미처리된 대조군 대상체에서의 LAMP-2B의 발현에 비해 LAMP-2B의 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  30. 제29항에 있어서, 상기 전신 투여는 정맥내 투여를 포함하는, 방법.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 상기 대상체의 총 체질량 킬로그램(vg) 당 AAV 벡터 약 1×1012 내지 5×1014 벡터 게놈(vg) 사이의 용량(vg/kg)으로 투여되는, 방법.
  32. 제31항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 약 1×1013 내지 5×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여되는, 방법.
  33. 제31항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 약 5×1013 내지 3×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여되는, 방법.
  34. 제31항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 약 5×1013 내지 1×1014 vg/kg 사이의 용량으로 투여되는, 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 인핸서/프로모터 영역은 5'에서 3' 방향으로 CMV IE 인핸서 및 닭 베타-액틴 프로모터를 포함하고, 선택적으로 상기 인핸서/프로모터 영역은 닭 베타-액틴 유전자의 제1 엑손 및 제1 인트론과 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 어셉터를 더 포함하는, 방법.
  36. 제29항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 콘센서스 최적 코작 서열을 포함하되, 선택적으로 상기 콘센서스 최적 코작 서열은 서열번호 6을 포함하는, 방법.
  37. 제29항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 전이유전자에 작동 가능하게 연결된 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하되, 선택적으로 상기 전체 길이의 폴리A 서열은 서열번호 7을 포함하는, 방법.
  38. 제29항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 대안적 mRNA를 생성할 수 있는 상기 전이유전자에 대해 5'에 개시 부위를 포함하지 않는, 방법.
  39. 제29항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 5'에서 3' 방향으로 작동 가능하게 연결된 제1 역위 말단 반복체, 인핸서/프로모터 영역, 인트론, 콘센서스 최적 코작 서열, 상기 전이유전자, 전체 길이의 폴리A 서열을 포함하는 3' 비해독 영역, 및 제2 역위 말단 반복체를 포함하고, 상기 발현 카세트는 상기 전이유전자의 개시 코돈에 대해 5'에 개시 코돈을 포함하지 않는, 방법.
  40. 제29항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 영장류인, 방법.
  41. 제29항 내지 제40항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 감소되거나 검출 불가능한 LAMP-2 발현을 갖는 것으로 식별되었거나, 또는 갖는 것으로 의심되는, 방법.
  42. 제29항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 돌연변이된 LAMP-2 유전자를 갖는, 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 다논병의 증상을 나타내는, 방법.
  44. 제29항 내지 제43항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체는 다논병을 앓고 있거나, 또는 다논병의 위험이 있는, 방법.
  45. 제29항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여는 미처리된 대상체에 비해 심장에서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  46. 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여는 미처리된 대상체에 비해 심장에서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  47. 제29항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 최대 약 1.1배, 최대 약 1.2배, 최대 약 1.3배, 최대 약 1.4배 또는 최대 약 1.5배 증가된 간에서의 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래하는, 방법.
  48. 서열번호 3 내지 5 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능적 변이체를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  49. 제48항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하거나, 또는 이의 기능적 변이체인 폴리뉴클레오타이드.
  50. 제49항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오타이드.
  51. 제50항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 3으로 이루어지는, 폴리뉴클레오타이드.
  52. 제48항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 LAMP-2B를 암호화하는 전이유전자 또는 이의 기능적 변이체인, 폴리뉴클레오타이드.
  53. 제48항 내지 제52항 중 어느 한 항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, 발현 카세트.
  54. 제53항에 있어서, 상기 발현 카세트는 CAG 프로모터(서열번호 22)와 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 인핸서/프로모터 영역을 포함하는, 발현 카세트.
  55. 제53항에 있어서, 상기 발현 카세트는 CMV 프로모터(서열번호 23), SV40 프로모터(서열번호 24), PGK 프로모터(서열번호 25), 및/또는 인간 베타-액틴 프로모터(서열번호 26)로부터 선택된 서열과 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 인핸서/프로모터 영역을 포함하는, 발현 카세트.
  56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 서열번호 27과 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 3' UTR을 포함하는, 발현 카세트.
  57. 제53항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 발현 카세트는 CAG 프로모터(서열번호 7)와 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리아데닐화 서열을 포함하는, 발현 카세트.
  58. 발현 카세트로서,
    (a) CAG 프로모터(서열번호 22)와 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 인핸서/프로모터 영역;
    (b) 서열번호 3과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는 LAMP-2B 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열;
    (c) 서열번호 27과 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 3' UTR; 및
    (d) CAG 프로모터(서열번호 7)와 적어도 80% 동일성, 적어도 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 폴리아데닐화 서열
    을 5'에서 3' 순서로 포함하는, 발현 카세트.
  59. 제58항에 있어서, 상기 기능적 LAMP-2B는 서열번호 1과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는, 발현 카세트.
  60. 제58항 또는 제59항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 2와 최대 90%, 최대 91%, 최대 92%, 최대 93%, 최대 94%, 최대 95%, 최대 96%, 최대 97%, 최대 98%, 최대 99% 또는 최대 100% 동일성을 공유하는 LAMP-2B 단백질을 암호화하는, 발현 카세트.
  61. 제53항 내지 제69항 중 어느 한 항의 발현 카세트와 이에 인접한 (i) 서열번호 11과 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 5' ITR 및 (ii) 서열번호 12와 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 5' ITR을 포함하는, AAV 벡터.
  62. 제61항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV9 캡시드를 포함하는, AAV 벡터.
  63. 제62항에 있어서, 상기 AAV9 캡시드는 서열번호 27의 아미노산 1 내지 736, 서열번호 27의 아미노산 138 내지 736, 및/또는 서열번호 27의 아미노산 203 내지 736과 적어도 95% 동일성을 공유하는, AAV 벡터.
  64. 서열번호 8 내지 10 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  65. 제64항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 적어도 100% 동일성을 공유하는, 폴리뉴클레오타이드.
  66. 제65항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 8로 이루어지는, 폴리뉴클레오타이드.
  67. 제65항 또는 제66항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 LAMP-2B 또는 이의 기능적 변이체를 암호화하는 발현 카세트를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  68. 제65항 내지 제67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 (i) 서열번호 11과 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 5' ITR 및 (ii) 서열번호 12와 적어도 80% 동일성, 90% 동일성, 95% 동일성 또는 100% 동일성을 공유하는 5' ITR 중 어느 하나 또는 둘 모두를 포함하는, 폴리뉴클레오타이드.
  69. 제65항 내지 제68항 중 어느 하나의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는, AAV 벡터.
  70. 제69항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV9 캡시드를 포함하는, AAV 벡터.
  71. 제71항에 있어서, 상기 AAV9 캡시드는 서열번호 27의 아미노산 1 내지 736, 서열번호 27의 아미노산 138 내지 736, 및/또는 서열번호 27의 아미노산 203 내지 736과 적어도 95% 동일성을 공유하는, AAV 벡터.
  72. 다논병의 치료를 필요로 하는 대상체의 다논병을 치료하는 방법으로서, 제61항 내지 63항 또는 제69항 내지 제71항 중 어느 하나의 AAV 벡터를 대상체에게 정맥내 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  73. 제72항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체에 비해 심장에서 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 적어도 약 1.2배, 적어도 약 1.3배, 적어도 약 1.4배, 적어도 약 1.5배, 적어도 약 1.6배, 적어도 약 1.7배, 적어도 약 1.8배, 적어도 약 1.9배, 적어도 약 2.0배, 적어도 약 2.2배, 적어도 약 2.3배, 적어도 약 2.4배, 적어도 약 2.5배, 적어도 약 3배 또는 적어도 약 4배 증가된 발현을 초래하는, 방법.
  74. 제72항 또는 제73항에 있어서, 상기 유전자 요법 벡터의 투여가 미처리된 대상체의 간에서의 발현에 비해 최대 약 1.1배, 최대 약 1.2배, 최대 약 1.3배, 최대 약 1.4배 또는 최대 약 1.5배 증가된 간에서의 LAMP-2B 폴리뉴클레오타이드 및/또는 LAMP-2B 단백질의 발현을 초래하는, 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038479A1 (ko) * 2021-09-08 2023-03-16 주식회사 꿈랩 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼
KR20230039787A (ko) * 2021-09-08 2023-03-21 주식회사 꿈랩 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113508130A (zh) * 2019-02-12 2021-10-15 太空飞船七有限责任公司 用于治疗达农病的基因治疗载体
EP4188404A1 (en) 2020-07-29 2023-06-07 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Transgene cassettes, aav vectors, and aav viral vectors for expression of human codon-optimized cstb
AU2021320902A1 (en) 2020-08-07 2023-04-06 Spacecraft Seven, Llc Plakophilin-2 (PKP2) gene therapy using AAV vector
EP4217010A1 (en) * 2020-09-28 2023-08-02 Tacit Therapeutics, Inc. Trans-splicing system for tissue-specific replacement of rna sequences
EP4228610A1 (en) * 2020-10-13 2023-08-23 Kriya Therapeutics, Inc. Viral vector constructs for delivery of nucleic acids encoding cytokines and uses thereof for treating cancer
MX2023006694A (es) * 2020-12-07 2023-08-25 Spacecraft Seven Llc Tratamiento de la enfermedad de danon.
US20230133924A1 (en) * 2021-07-08 2023-05-04 Tenaya Therapeutics, Inc. Optimized expression cassettes for gene therapy

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5139941A (en) 1985-10-31 1992-08-18 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV transduction vectors
WO1992001070A1 (en) 1990-07-09 1992-01-23 The United States Of America, As Represented By The Secretary, U.S. Department Of Commerce High efficiency packaging of mutant adeno-associated virus using amber suppressions
US5173414A (en) 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
JP3534749B2 (ja) 1991-08-20 2004-06-07 アメリカ合衆国 アデノウイルスが介在する胃腸管への遺伝子の輸送
US20020065236A1 (en) * 1998-09-09 2002-05-30 Yew Nelson S. CpG reduced plasmids and viral vectors
WO2004048537A2 (en) * 2002-11-25 2004-06-10 Exelixis, Inc. Lamps as modifiers of the p53 pathway and methods of use
WO2007091250A2 (en) 2006-02-06 2007-08-16 The Medical Research And Infrastructure Fund Of The Tel-Aviv Sourasky Medical Center Enzyme replacement therapy for treating lysosomal storage diseases
US8324367B2 (en) 2006-11-03 2012-12-04 Medtronic, Inc. Compositions and methods for making therapies delivered by viral vectors reversible for safety and allele-specificity
WO2008154198A1 (en) 2007-06-06 2008-12-18 Genzyme Corporation Gene therapy for lysosomal storage diseases
WO2011146879A2 (en) * 2010-05-20 2011-11-24 University Of Rochester Methods and compositions related to modulating autophagy
DK3444342T3 (da) 2012-07-11 2020-08-24 Sangamo Therapeutics Inc Fremgangsmåder og sammensætninger til behandlingen af lysosomale aflejringssygdomme
US10648001B2 (en) * 2012-07-11 2020-05-12 Sangamo Therapeutics, Inc. Method of treating mucopolysaccharidosis type I or II
EP2908842A1 (en) 2012-10-17 2015-08-26 Fondazione Telethon Gene therapy for glycogen storage diseases
EP3307310A2 (en) * 2015-05-13 2018-04-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Aav-mediated expression of anti-influenza antibodies and methods of use thereof
CA3011731A1 (en) 2016-01-19 2017-07-27 Eric D. Adler Methods for the treatment of danon disease and other disorders of autophagy
CA3035605A1 (en) * 2016-09-08 2018-03-15 Fundacion Instituto De Investigacion Sanitaria Fundacion Jimenez Diaz Gene therapy for patients with fanconi anemia
ES2859661T3 (es) * 2016-09-30 2021-10-04 Esteve Pharmaceuticals Sa Vectores de virus adenoasociados para el tratamiento de mucopolisacaridosis
CN113508130A (zh) * 2019-02-12 2021-10-15 太空飞船七有限责任公司 用于治疗达农病的基因治疗载体

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023038479A1 (ko) * 2021-09-08 2023-03-16 주식회사 꿈랩 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼
KR20230039787A (ko) * 2021-09-08 2023-03-21 주식회사 꿈랩 생체분자의 안정적 발현 및 전달을 위한 플라스미드 플랫폼

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