KR20210103469A - 재조합 바이러스 벡터 및 이를 생산하기 위한 핵산 - Google Patents

Abstract

재조합 아데노-관련 바이러스 (rAAV) 벡터의 생산에 사용되는 핵산, AAV 전달 카세트 및 플라스미드가 본원에 기술된다. 개시된 핵산, 카세트 및 플라스미드는 하나 이상의 질환 또는 장애의 개선, 치료 및/또는 예방에서 치료 효능을 갖는 하나 이상의 이식유전자를 발현하는 서열을 포함한다.

Description

재조합 바이러스 벡터 및 이를 생산하기 위한 핵산

관련 출원에 대한 상호 참조

본 출원은 2018년 11월 21일 출원된 미국 가출원 일련번호 62/770,202에 대한 우선권을 주장하고, 이는 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

기술분야

본 개시는 분자생물학 및 유전자 치료법 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 개시는 재조합 바이러스 벡터를 생산하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

전자적으로 제출된 텍스트 파일에 대한 설명

여기 전자적으로 제출된 텍스트 파일의 내용은 그 전문이 참고로 포함된다: 서열 목록의 컴퓨터 판독 가능 형식 사본 (파일명: STRD-011-01WO_Sequence_Listing.txt, 2019년 11월 21일 데이터 기록됨, 파일 크기 ~145 킬로바이트).

아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV)를 포함하는, 재조합 바이러스 벡터는 유전자 전달제로서 유용하고, 인간 유전자 치료법을 위한 강력한 도구이다. AAV를 사용하여, 생체 내 및 시험관 내, 다양한 세포에서 고-빈도 안정한 DNA 통합 및 발현이 달성될 수 있다. 일부 다른 바이러스 벡터 시스템과 달리, AAV는 표적 세포에서 안정한 통합을 위해 활성 세포 분열을 필요로 하지 않는다.

재조합 AAV 벡터는 바이러스 생산 세포주를 사용하는 배양에서 생산될 수 있다. 재조합 AAV의 생산은 일반적으로 세포에서 세 가지 요소의 존재를 필요로 한다: 1) AAV 역위 말단 반복 (ITR) 서열이 측면에 있는 이식유전자를 포함하는 핵산, 2) AAV rep 및 cap 유전자, 및 3) 헬퍼 바이러스 단백질 서열. 이러한 세 가지 요소는 하나 이상의 플라스미드에 제공될 수 있고, 세포를 형질감염시키거나 세포로 형질도입될 수 있다.

재조합 AAV 벡터의 생산 및 사용은 이식유전자 DNA를 바이러스 캡시드로 효율적으로 패키징하고 표적 세포에서 이식유전자를 효과적으로 발현할 능력이 없음에 제한되어 왔다. 따라서, 재조합 AAV 벡터를 생산하기 위한 개선된 조성물 및 방법에 대한 필요가 당업계에 존재한다.

요약

AAV 전달 카세트를 포함하는 핵산이 본원에 개시된다. 상기 개시된 핵산은 재조합 아데노-관련 바이러스 (AAV) 벡터의 생산에 사용될 수 있다. 상기 개시된 핵산 및 전달 카세트는 하나 이상의 질환 또는 장애의 개선, 치료 및/또는 예방에서 치료 효능을 갖는 하나 이상의 이식유전자의 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 본 개시는 5'에서 3'로, 5' 역위 말단 반복 (ITR), 프로모터, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함하는 핵산을 제공한다. 일부 구현예에서, 상기 이식유전자 서열은 프라탁신 (FXN) 단백질을 인코딩한다. 상기 FXN 단백질은 예를 들어, 인간 FXN 단백질일 수 있다. 일부 구현예에서, FXN 단백질은 서열 번호 65의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 상기 핵산은 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 5' ITR은 상기 3' ITR과 동일한 길이이다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110 내지 약 160 뉴클레오티드 길이이다. 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 예를 들어, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 5' ITR은 서열 번호 1의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 3' ITR은 서열 번호 2의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 상기 3' ITR은 서열 번호 3의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

상기 프로모터는 이식유전자의 발현을 구동할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 야생형 프로모터의 변형된 형태이다. 예를 들어, AAV에 대한 패키징 제한 때문에, 프로모터의 길이가 줄어들 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 야생형 프로모터의 절단된 형태이다.

상기 프로모터는 예를 들어, CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, EF-1 알파 코어 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 또는 포스포글리세롤 키나아제 (PGK) 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 프로모터는 서열 번호 6-12 중 어느 하나로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 이식유전자 서열은 CpG 최적화된다. 일부 구현예에서, 상기 이식유전자 서열은 서열 번호 19 또는 20, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 핵산은 이식유전자 서열에 바로 5'로 코작 서열을 포함한다. 상기 코작 서열은 예를 들어, 서열 번호 17 또는 18의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 상기 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40 (SV40), 인간 α-글로빈, 토끼 α-글로빈, 인간 β-글로빈, 토끼 β-글로빈, 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH)의 폴리아데닐화 신호로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 상기 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 21-24 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 핵산은 인핸서를 추가로 포함한다. 상기 인핸서는 예를 들어, CMV 인핸서일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인핸서는 서열 번호 4 또는 5의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 핵산은 인트론 서열을 추가로 포함한다. 상기 인트론 서열은 예를 들어, 키메라 서열 또는 하이브리드 서열일 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 인트론 서열은 하기 유전자 중 하나 이상으로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함한다: β-글로빈, 닭 베타-액틴, 미세 마우스 바이러스, 및 인간 IgG. 일부 구현예에서, 상기 인트론 서열은 서열 번호 13-16 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 상기 핵산은 적어도 하나의 스터퍼 서열을 추가로 포함한다 (예를 들어, 1, 2, 3, 4, 또는 5개의 스터퍼 서열). 일부 구현예에서, 상기 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열 번호 25-27 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함한다.

본 개시의 핵산을 포함하는 벡터 (예를 들어, AAV 벡터 또는 플라스미드)가 또한 본원에서 제공된다.

본 개시의 핵산을 포함하는 세포가 또한 제공된다.

재조합 AAV 벡터를 제조하는 방법, AAV 생산자 세포를 본 개시의 핵산 또는 플라스미드/박미드와 접촉하는 단계를 포함하는 방법이 또한 제공된다. 이러한 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터가 또한 제공된다. 상기 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 (ssAAV)이다. 일부 구현예에서, 상기 재조합 AAV 벡터는 자가 상보성 (scAAV)이다.

본 개시의 핵산, 플라스미드, 박미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 또한 제공된다.

치료학적 유효량의 본 개시의 핵산, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 상기 대상체는 프리드라이히 운동실조 (FRDA)를 갖는다.

이들 및 다른 구현예는 후술되는 상세한 설명에서 보다 상세하게 다루어진다.

도 1은 삼중 플라스미드 형질감염 방법을 사용한 AAV 생산 수율 (벡터 게놈)을 나타낸다. AAV 벡터는 액적 디지털 PCR (ddPCR^®) 분석을 사용하여 정량화한다.
도 2는 식염수 주입 마우스 (그룹 1)에 비해 5x10¹³ vg/kg의 용량으로 인간 FXN 이식유전자를 패키징하는 AAV 벡터로 처리된 FXN-결핍 (FXN ^flox/flox MCKCre ⁺ ) 마우스 (그룹 2)의 생존 백분율을 나타낸다.
도 3a-3c는 식염수 또는 인간 FXN 이식유전자 (저용량 = 1x10¹³ vg/kg, 고용량 = 5x10¹³ vg/kg)를 패키징하는 AAV 벡터로 처리된 3주령 FXN-결핍 (FXN ^flox/flox MCKCre ⁺ ) 마우스에서의 실험 결과를 나타낸다. 마우스는 처리 3주 후에 희생되었다. 도 3a는 심장 조직에서 숙주 DNA의 마이크로그램 당 인간 FXN 벡터 DNA의 카피 수를 나타낸다. 도 3b는 HPRT (히포크산틴-구아닌 포스포-리보실트랜스퍼라제) mRNA로 정규화된, FXN mRNA의 카피 수를 나타낸다. ND = 검출되지 않음. 도 3c는 FXN 단백질 수준을 나타낸다.
도 4는 다양한 용량의 AAV9-FXN로 형질도입된 배양된 Lec2 세포에서 인간 FXN의 발현 (ng/mg)을 나타낸다. 인간 FXN 수준은 표준 ELISA를 사용하여 측정하였다.
도 5는 본 개시의 AAV 전달 카세트를 사용하여 AAV를 생산하는 예시적인 방식의 개략도를 나타낸다. 5'ITR, 프로모터, 이식유전자, 및 3'ITR을 포함하는 AAV 전달 카세트는 표준 클로닝 기술을 사용하여 플라스미드로 패키징된다. AAV rep 및 cap 서열을 포함하는 제2 플라스미드, 및 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 포함하는 제3 플라스미드가 제조된다. 3개의 플라스미드는 AAV 생산자 세포주 (예를 들어, HEK293)로 형질감염된다. 그런 다음 상기 세포는 AAV를 생산하고, 이는 나중에 사용하기 위해 정제 및 냉동할 수 있다.

예를 들어, 프리드라이히 운동실조 (FRDA)를 포함하는, 유전적 질환 및 장애의 치료 및 예방에 대해 유전자 치료법은 전망이 밝다. FRDA는 프라탁신 (FXN) 유전자의 돌연변이에 의해 일반적으로 유발되는 상염색체 열성 장애이다. 미국에서 약 50,000명 중 1명이 FRDA를 갖고 있다. 일반적인 발병 연령은 약 5세에서 약 18세이다. 증상은 대상체에 따라 다르지만, (i) 팔과 다리의 조정의 손실 (운동실조), (ii) 피로/에너지 부족 및 근육 손실, (iii) 시력 손상, 청력 손실, 및 불분명 발음, (iv) 공격적인 척추측만증 (척추 만곡), (v) 당뇨병 (일반적으로 인슐린 의존성), 및 (vi) 심각한 심장 상태 (예를 들어, 비대성 심근병증 및 부정맥)를 포함할 수 있다. FRDA를 가진 개인의 정신적 능력은 그대로 유지된다. 현재 FRDA에 대한 치료법은 없고; 대상자는 증상 관리를 위해 모니터링된다. 따라서, FRDA를 치료하고/거나 예방하기 위한 조성물 및 방법이 당 업계에 필요하다.

AAV 벡터를 생산하기 위한 AAV 전달 카세트를 포함하는 핵산이 본원에서 제공된다. AAV 벡터는 예를 들어 치료적 이식유전자를 세포로 또는 이를 필요로 하는 대상체로 전달하기 위한 유전자 치료법 적용에 사용될 수 있다. 본 개시의 AAV 전달 카세트 및 벡터는 다양한 유전 질환 또는 장애, 예를 들어 FRDA를 치료하거나 예방하기 위해 사용될 수 있다.

본 명세서에서 언급된 모든 논문, 공보 및 특허는 각각의 개별 논문, 공보 또는 특허가 구체적 및 개별적으로 참고로 포함되도록 표시되고 출판물 인용과 관련하여 방법 및/또는 재료를 개시하고 설명하기 위해 본원에 참고로 포함된 바와 같이 본원에 참고로 인용된다.

문맥상 달리 표시되지 않는 한, 본원에 기술된 다양한 특성은 임의의 조합으로 사용될 수 있는 것으로 특별히 의도된다. 섹션 머리말은 조직 목적으로 본원에서 사용되고, 제한하고자 의도하지 않는다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 개시가 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서의 상세한 설명에서 사용된 용어는 단지 특정 구현예를 설명하기 위한 것이고 제한하고자 의도하지 않는다.

정의

하기 용어는 본 명세서의 상세한 설명 및 첨부된 청구 범위에서 사용된다:

단수 형태 "a," "an" 및 "the"는 문맥상 명백하게 달리 표시되지 않는 한, 복수형을 또한 포함하는 것으로 의도된다.

또한, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 양 또는 길이, 용량, 시간, 온도 등과 같은 측정 가능한 값을 지칭할 때 본원에 사용된 용어 "약"은 특정된 양의 ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0.5%, 또는 심지어 ± 0.1%의 변이를 포괄하는 것을 의미한다.

또한 본원에 사용된 바와 같이, "및/또는"은 관련된 열거 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 가능한 조합, 뿐만 아니라 대안적으로 해석될 때 ("또는") 조합의 결여를 지칭하고 포괄한다.

"핵산" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 염기, 예를 들어 RNA, DNA의 서열 또는 DNA-RNA 하이브리드 서열 (자연 발생 및 비자연 발생 뉴클레오티드를 모두 포함)이다. 일부 구현예에서, 본 개시의 핵산은 단일 또는 이중 가닥 DNA 서열이다. 핵산은 1-1,000, 1,000-10,000, 10,000-100,000, 100,000-1백만 또는 1백만 초과 뉴클레오티드 길이이다. 핵산은 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 함유할 것이지만, 일부 경우에 예를 들어, 포스포라미드, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, O-메틸포스포로아미다이트, 또는 P-에톡시 결합, 또는 펩티드 핵산 백본 및 결합을 포함하는 대체 백본을 가질 수 있는 핵산 유사체가 포함된다. 다른 유사체 핵산은 양성 백본, 비이온성 백본, 및 비-리보스 백본을 갖는 핵산을 포함한다. 하나 이상의 탄소고리 당을 함유하는 핵산이 또한 핵산의 정의 내에 포함된다. 리보스-포스페이트 백본의 이러한 변형은 표지의 추가를 촉진하거나, 생리학적 환경에서 이러한 분자의 안정성 및 반감기를 증가시킬 수 있다. 본 개시의 핵산은 선형일 수 있거나, 원형일 수 있다 (예를 들어, 플라스미드).

용어 "단백질," "펩티드," 및 "폴리펩티드"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 펩티드 결합에 의해 공유 결합된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 지칭한다. 단백질 또는 펩티드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하여야 하지만, 단백질 또는 펩티드의 서열을 구성할 수 있는 최대 아미노산의 수에는 제한이 없다.

본원에 사용된 바와 같이, 용어 "바이러스 벡터," "바이러스 벡터," 또는 "유전자 전달 벡터"는 핵산 전달 비히클로서 기능하는 바이러스 입자를 지칭하고, 이는 비리온 내에 패키징된 벡터 게놈을 포함한다. 본 개시의 예시적인 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터 (AAV), 렌티바이러스 벡터, 및 레트로바이러스 벡터를 포함한다.

아데노-관련 바이러스 또는 AAV는 파르보바이러스과 패밀리의 데펜도바이러스 속에 속한다. 4.7 kb 야생형 AAV 게놈은 2개의 주요 오픈 리딩 프레임을 인코딩한다. rep 유전자는 바이러스 복제 단백질을 발현하고 cap 유전자는 바이러스 캡시드 단백질을 발현한다. AAV 게놈의 말단은 T자형 구조를 형성하는 역위 말단 반복 (ITR)이다. 성숙한 AAV 비리온은 포유류 세포에서 감염성이 있지만, 복제 AAV 수명 주기는 예를 들어, 아데노바이러스 또는 헤르페스 바이러스로부터 헬퍼 기능을 필요로 한다. 재조합 AAV 벡터는 이식유전자 발현 카세트를 갖는 야생형 AAV 오픈 리딩 프레임을 대체하여 생성될 수 있다.

본원에 기술된 바와 같이, AAV는 AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B를 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAV 유형 rh32.33, AAV 유형 rh8, AAV 유형 rh10, AAV 유형 rh74, AAV 유형 hu.68, 조류 AAV, 소 AAV, 개 AAV, 말 AAV, 양 AAV, 뱀 AAV, 턱수염 도마뱀 AAV, AAV2i8, AAV2g9, AAV-LK03, AAV7m8, AAV Anc80, AAV PHP.B, 및 현재 알려지거나 나중에 발견된 임의의 다른 AAV일 수 있다. 예를 들어, BERNARD N. FIELDS 등, VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers) 참조. 다수의 AAV 혈청형 및 클레이드가 확인되었다 (예를 들어, Gao 등, (2004) J. Virology 78:6381-6388; Moris 등, (2004) Virology 33-:375-383; 및 표 1 참조).

표 1: AAV 혈청형 및 클레이드

용어 "자가 상보성 AAV" 또는 "scAAV"는 기존 단일 가닥 (ss) AAV 게놈에 비해 더 빠르고 강력한 이식유전자 발현을 야기하는, 자발적으로 어닐링하는 이량체 역위 반복 DNA 분자를 형성하는 재조합 AAV 벡터를 지칭한다. 특히, scAAV는 기존 AAV 벡터의 절반 크기인, 약 2.4kb인 게놈만을 보유할 수 있다. 일부 구현예에서, 이중-벡터 전략은 AAV의 작은 패키징 용량을 극복하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 시스-활성화, 트랜스-스플라이싱, 오버랩핑, 및 하이브리드 시스템이 사용될 수 있다.

용어 "AAV 전달 카세트"는 제1 및 제2 ITR 서열이 측면에 있는 이식유전자를 포함하는 핵산을 지칭한다. AAV 전달 카세트는 AAV 벡터 생산 동안 AAV 벡터로 패키징된다.

용어 "바이러스 생산 세포", "바이러스 생산 세포주", 또는 "바이러스 생산자 세포"는 바이러스 벡터를 생산하기 위해 사용되는 세포를 지칭한다. HEK293 및 239T 세포가 일반적인 바이러스 생산 세포주이다. 하기 표 2는 다양한 바이러스 벡터에 대한 예시적인 바이러스 생산 세포주를 열거한다.

표 2: 예시적인 바이러스 생산 세포주

"HEK293"은 원래 조직 배양에서 성장한 인간 배아 신장 세포로부터 유래된 세포주를 지칭한다. HEK293 세포주는 배양액에서 용이하게 성장하고, 바이러스 생산을 위해 일반적으로 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, "HEK293"은 또한 하나 이상의 변이체 HEK293 세포주, 즉, 하나 이상의 유전자 변형을 추가적으로 포함하는 원래 HEK293 세포주로부터 유래된 세포주를 지칭할 수 있다. 많은 변이체 HEK293 주가 개발되었고 하나 이상의 특정 적용을 위해 최적화되었다. 예를 들어, 293T 세포주는 SV40 복제 기점을 함유하는 형질감염된 플라스미드의 에피솜 복제를 허용하여, 원하는 유전자 생성물의 증가된 발현을 유도하는 SV40 대형 T-항원을 함유한다.

"Sf9"는 부모 스포도프테라 프루지퍼드 세포주 IPLB-Sf-21-AE로부터 유래된 클론 단리물인 곤충 세포주를 지칭한다. Sf9 세포는 혈청이 없는 상태에서 성장할 수 있고 부착되거나 현탁액으로 배양될 수 있다.

"형질감염제"는 세포로의 핵산의 전달을 향상시키는 조성물을 의미한다. 당 업계에서 일반적으로 사용되는 일부 형질감염제는 핵산 및 세포 표면에 결합하는 하나 이상의 지질 (예를 들어, Lipofectamine^TM)을 포함한다.

역위 말단 반복

역위 말단 반복 또는 ITR 서열은 AAV 프로바이러스 통합 및 비리온으로 AAV DNA의 패키징을 위해 필요한 최소 서열이다. ITR은 AAV 수명 주기에서 다양한 활동에 관여한다. 예를 들어, ITR 서열은 형질감염 후 플라스미드로부터의 절제, 벡터 게놈의 복제 및 숙주 세포 게놈으로부터의 통합 및 구조에서 역할을 한다.

본 개시의 핵산은 5' ITR 및/또는 3' ITR을 포함할 수 있다. ITR 서열은 약 110 내지 약 160 뉴클레오티드 길이, 예를 들어 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159 또는 160 뉴클레오티드일 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 3' ITR 과 동일한 길이이다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 3' ITR보다 길고, 다른 구현예에서, 3' ITR은 5' ITR보다 길다.

ITR은 임의의 AAV, 예를 들어 표 1에 열거된 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래될 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 5' ITR 및 3'ITR 중 적어도 하나는 AAV 이외에 또 다른 파르보바이러스 종의 구성원으로부터 단리 유래된 야생형 또는 돌연변이된 ITR일 수 있다. 예를 들어, 일부 구현예에서, ITR은 보카바이러스 또는 파르보바이러스 B19로부터 단리되거나 유래된 야생형 또는 돌연변이된 ITR일 수 있다.

일부 구현예에서, ITR은 자가 상보성 AAV (scAAV)의 생산을 촉진하는 변형을 포함한다. 일부 구현예에서, scAAV의 생산을 촉진하는 변형은 ITR로부터의 말단 분해 서열 (TRS)의 결실이다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 야생형 ITR이고, 3' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 구현예에서, 3' ITR은 야생형 ITR이고, 5' ITR은 말단 분해 서열이 결여된 돌연변이된 ITR이다. 일부 구현예에서, 말단 분해 서열이 5' ITR 및 3'ITR 둘 다에 존재하지 않는다. 다른 구현예에서, scAAV의 생산을 촉진하는 변형은 상이한 헤어핀 형성 서열, 예를 들어 shRNA-형성 서열을 갖는 ITR로 대체하는 것이다.

일부 구현예에서, 5’ ITR 또는 3’ ITR은 서열 번호 1의 서열, 또는 이와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ ITR 또는 3’ ITR은 서열 번호 2의 서열, 또는 이와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5’ ITR 또는 3’ ITR은 서열 번호 3의 서열, 또는 이와 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열 번호 1의 서열을 포함하고, 3' ITR은 서열 번호 2의 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 5' ITR은 서열 번호 1의 서열을 포함하고, 3' ITR은 서열 번호 3의 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산은 하나 이상의 "대리" ITR, 즉, ITR과 동일한 기능을 수행하는 비-ITR 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, Xie, J. 등, Mol. Ther., 25(6): 1363-1374 (2017) 참조. 일부 구현예에서, ITR은 대리 ITR에 의해 대체된다. 일부 구현예에서, 대리 ITR은 헤어핀 형성 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 대리 ITR은 짧은 헤어핀 (sh)RNA-형성 서열이다.

프로모터, 인핸서, 억제자 및 다른 조절 서열

유전자 발현은 프로모터, 인핸서, 및/또는 유전자와 작동 가능하게 연결된 억제자와 같은 뉴클레오티드 서열에 의해 제어될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된"은 핵산 발현 제어 서열 (예를 들어 프로모터, 전사 인자 결합 부위의 어레이)과 제2 핵산 서열 사이 기능적 연결을 지칭하고, 여기서 발현 제어 서열은 제2 서열에 대응하는 핵산의 전사를 지시한다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 프로모터를 포함한다. 이들 프로모터는 예를 들어, 구성적 프로모터 또는 유도성 프로모터일 수 있다. 일부 구현예에서, 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "프로모터"는 작동 가능하게 연결된 핵산의 전사를 지시하는 하나 이상의 핵산 제어 서열을 지칭한다. 프로모터는 전사 개시 부위 근처의 핵산 서열, 예를 들어 TATA 요소를 포함할 수 있다. 프로모터는 전사 인자에 의해 결합된 시스-작용 폴리뉴클레오티드 서열을 또한 포함할 수 있다. "구성적" 프로모터는 대부분의 환경 및 발달 조건에서 활동성인 프로모터이다. "유도성" 프로모터는 환경 또는 발달 조절 하에서 활동성인 프로모터이다.

본원에 기술된 핵산 및 카세트에서 사용될 수 있는 예시적인 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 프로모터 (예를 들어, SV40 초기 또는 후기 프로모터), 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유방 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 프로모터, GUSB240 프로모터 (예를 들어, 인간 GUSB240 (hGUSB240) 프로모터), GUSB379 프로모터 (예를 들어, 인간 GUSB379 (hGUSB379) 프로모터), 및 포스포글리세롤 키나아제 (PGK) 프로모터 (예를 들어, 인간 PGK (hPGK) 프로모터)를 포함한다. 일부 구현예에서, EF-1 알파는 EF-1 알파 야생형 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, 및 EF-1 알파 코어 프로모터로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, EF-1 알파 야생형 프로모터, EF-1 알파 코어 프로모터, hPGK 프로모터, hGUSB240 프로모터, 및 hGUSB379 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 구현예에서, 프로모터는 서열 번호 6-12 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

본원에 기술된 핵산 및 카세트에 사용될 수 있는 예시적인 조직 특이적 프로모터 및 인핸서의 비제한적 목록은 하기를 포함한다: HMG-COA 환원효소 프로모터; 스테롤 조절 요소 1 (SRE-1); 포스포엔올 피루베이트 카르복시 키나아제 (PEPCK) 프로모터; 인간 C-반응성 단백질 (CRP) 프로모터; 인간 글루코키나아제 프로모터; 콜레스테롤 7-알파 수산화효소 (CYP-7) 프로모터; 베타-갈락토시다제 알파-2,6 시알릴트랜스퍼라제 프로모터; 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 (IGFBP-1) 프로모터; 알돌라제 B 프로모터; 인간 트랜스페린 프로모터; 콜라겐 유형 I 프로모터; 전립선산 포스파타제 (PAP) 프로모터; 94 (PSP 94) 프로모터의 전립선 분비 단백질; 전립선 특이적 항원 복합체 프로모터; 인간 선상 칼리크레인 유전자 프로모터 (hgt-1); 근세포-특이적 인핸서 결합 인자 MEF-2; 머클 크레아틴 키나아제 프로모터; 췌장염 관련 단백질 프로모터 (PAP); 엘라스타제 1 전사 인핸서; 췌장 특이적 아밀라제 및 엘라스타제 인핸서 프로모터; 췌장 콜레스테롤 에스테라제 유전자 프로모터; 우테로글로빈 프로모터; 콜레스테롤 측쇄 절단 (SCC) 프로모터; 감마-감마 에놀라제 (뉴런 특이적 에놀라제, NSE) 프로모터; 신경사상체 중쇄 (NF-H) 프로모터; 인간 CGL-1/그랜자임 B 프로모터; 말단 데옥시 트랜스퍼라제 (TdT), 람다 5, VpreB, 및 lck (림프구 특이적 티로신 단백질 키나아제 p561ck) 프로모터; 인간 CD2 프로모터 및 이의 3' 전사 인핸서; 인간 NK 및 T 세포 특이적 활성화 (NKG5) 프로모터; pp60c-src 티로신 키나아제 프로모터; 기관-특이적 신생항원 (OSN), mw 40 kDa (p40) 프로모터; 결장 특이적 항원-P 프로모터; 인간 알파-락탈부민 프로모터; 포스포에놀피루베이트 카르복시키나아제 (PEPCK) 프로모터, HER2/neu 프로모터, 카제인 프로모터, IgG 프로모터, 융모성 배아 항원 프로모터, 엘라스타제 프로모터, 포스포빌리노겐 탈아미노효소 프로모터, 인슐린 프로모터, 성장 호르몬 인자 프로모터, 티로신 수산화효소 프로모터, 알부민 프로모터, 알파페토단백질 프로모터, 아세틸-콜린 수용체 프로모터, 알코올 탈수소효소 프로모터, 알파 또는 베타 글로빈 프로모터, T-세포 수용체 프로모터, 오스테오칼신 프로모터 IL-2 프로모터, IL-2 수용체 프로모터, 유청 (wap) 프로모터, 및 MHC 클래스 II 프로모터.

유전자 발현은 또한 하나 이상의 원위 "인핸서" 또는 "억제자" 요소에 의해 제어될 수 있고, 이는 전사 개시 부위로부터 수천 개 염기 쌍만큼 위치할 수 있다. 인핸서 또는 억제자 요소는 인핸서 요소가 전사 개시 부위로부터 멀리서 작용할 수 있다는 점을 제외하고, 전사 개시 부위 근처 시스-작용 요소와 유사한 방식으로 전사를 조절한다.

일부 구현예에서, 본원에 기술된 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 인핸서를 포함한다. 인핸서는 프로모터에 작동 가능하게 연결될 수 있다. 인핸서는 예를 들어, CMV 인핸서일 수 있다. 일부 구현예에서, 인핸서는 서열 번호 4 또는 5의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

이식유전자

본원에 기술된 핵산 및 AAV 전달 카세트는 표적 세포에서 발현을 위한 이식유전자 서열을 포함할 수 있다.

이식유전자는 임의의 관심 이종 핵산 서열(들)일 수 있다. 관심 핵산은 치료 (예를 들어, 의료 또는 수의학 용도) 또는 면역원성 (예를 들어, 백신 용도) 폴리펩티드 또는 RNA를 포함하는, 폴리펩티드를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 cDNA 서열이다.

일부 구현예에서, 이식유전자는 치료적 폴리펩티드를 인코딩한다. 치료적 폴리펩티드 낭포성 섬유증 막관통 조절자 단백질 (CFTR), 디스트로핀 (미니- 및 마이크로-디스트로핀을 포함, 예를 들어, Vincent 등, (1993) Nature Genetics 5: 130; 미국 특허 공개 번호 2003/017131; 국제 공보 WO/2008/088895, Wang 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 1 3714-13719 (2000); 및 Gregorevic 등, Mol. Ther. 16:657-64 (2008) 참조), 미오스타틴 프로펩티드, 폴리스타틴, 액티빈 유형 11 가용성 수용체, IGF-1, 항-염증 폴리펩티드 예를 들어 이카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스팬, 유트로핀 (Tinsley 등, (1996) Nature 384:349), 미니-유트로핀, 응고 인자 (예를 들어, 인자 VIII, 인자 IX, 인자 X, 등), 에리트로포이에틴, 안지오스타틴, 엔도스타틴, 카탈라제, 티로신 수산화효소, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, LDL 수용체, 지단백질 리파제, 오르니틴 트랜스카르바밀라제, β-글로빈, α-글로빈, 스펙트린, 알파-1-항트립신, 아데노신 탈아미노효소, 히포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제, β-글루코세레브로시다제, 스핑고미엘리나제, 리소좀 헥소사미니다제 A, 분지-쇄 케토산 탈수소효소, RP65 단백질, 사이토카인 (예를 들어, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 감마-인터페론, 인터루킨-2, 인터루킨-4, 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자, 림포톡신 등), 펩티드 성장 인자, 신경 영양 인자 및 호르몬 (예를 들어, 소마토트로핀, 인슐린, 인슐린 유사 성장 인자 1 및 2, 혈소판 유래 성장 인자, 표피 성장 인자, 섬유아세포 성장 인자, 신경 성장 인자, 신경 영양 인자-3 및 -4, 뇌 유래 신경 영양 인자, 뼈 형태 형성 단백질 [RANKL 및 VEGF 포함], 아교 유래 성장 인자, 형질 전환 성장 인자-α 및 -β 등), 리소좀 산 알파-글루코시다제, 알파-갈락토시다제 A, 수용체 (예를 들어, 종양 괴사 성장 인자 가용성 수용체), S100A1, 파르발부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, 칼슘 취급을 조절하는 분자 (예를 들어, SERCA_2A,　PP1의 억제제 1 및 이의 단편 [예를 들어, WO 2006/029319 및 WO 2007/100465]), 절단된 구성 활성 bARKct와 같은 G-단백질 결합된 수용체 키나아제 유형 2 녹다운에 영향을 미치는 분자, IRAP와 같은 항-염증 인자, 항-미오스타틴 단백질, 아스파르토아실라제, 단일클론 항체 (단쇄 단일클론 항체를 포함; 예시적인 Mab는 Herceptin^®　Mab임), 뉴로펩티드 및 이의 단편 (예를 들어, 갈라닌, 뉴로펩티드 Y (미국 7,071,172 참조)), 바소히빈 및 다른 VEGF 억제제와 같은 혈관 신생 억제제 (예를 들어, 바소히빈 2 [WO JP2006/073052 참조])를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 다른 예시적인 치료적 폴리펩티드는 자살 유전자 생성물 (예를 들어, 티미딘 키나아제, 시토신 탈아미노효소, 디프테리아 독소, 및 종양 괴사 인자), 숙주 인자의 전사를 향상 또는 억제하는 단백질 (예를 들어, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 뉴클레아제-사멸 Cas9, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 징크-핑거 단백질, 전사 인핸서 또는 억제제 요소에 연결된 전사 활성제-유사 (TAL) 이펙터), 암 치료에 사용되는 약물에 대해 내성을 부여하는 단백질, 종양 억제자 유전자 생성물 (예를 들어, p53, Rb, Wt-1), TRAIL, 프라탁신 (FXN), FAS-리간드, 및 이를 필요로 하는 대상체에서 치료적 효과를 갖는 임의의 다른 폴리펩티드를 포함한다. 이식유전자는 단일클론 항체 또는 항체 단편, 예를 들어, 미오스타틴에 대한 항체 또는 항체 단편일 수 있다 (예를 들어, Fang 등, Nature Biotechnology 23:584-590 (2005) 참조). 치료적 폴리펩티드는 또한, 리포터 폴리펩티드 (예를 들어, 효소)를 인코딩하는 것들을 포함한다. 리포터 폴리펩티드는 당 업계에 공지되어 있고 녹색 형광 단백질, β-갈락토시다제, 알칼리성 포스파타제, 루시퍼라제, 및 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 유전자를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.

선택적으로, 이식유전자는 분비된 폴리펩티드 (예를 들어, 그 자연적 상태에서 분비된 폴리펩티드 또는 예를 들어, 당 업계에 공지된 분비 신호 서열과 작동 가능한 연결에 의해 분비되도록 조작된 폴리펩티드)를 인코딩한다.

대안적으로, 일부 구현예에서, 이식유전자는 안티센스 핵산, 리보자임 (예를 들어, 미국 특허 번호 5,877,022에 기술된 바와 같음), 스플라세오좀-매개/램-스플라이싱에 영향을 미치는 RNA (Puttaraju 등, (1999) Nature Biotech. 17:246; 미국 특허 번호 6,013,487; 미국 특허 번호 6,083,702 참조), 유전자 침묵을 매개하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA를 포함하는 간섭 RNA (RNAi) (Sharp 등, (2000) Science 287:2431 참조), 및 다른 비-번역 RNA, 예를 들어 "가이드" RNA 등을 인코딩할 수 있다. 예시적인 비번역 RNA는 다중 약물 내성 (MDR) 유전자 생성물에 대한 RNAi (예를 들어, 종양을 치료하고/거나 예방 및/또는 화학요법에 의한 손상을 방지하기 위해 심장에 투여), 미오스타틴에 대한 RNAi (예를 들어, 뒤쉔 근이영양증), VEGF에 대한 RNAi (예를 들어, 종양을 치료하고/거나 예방), 포스포람반에 대한 RNAi (예를 들어, 심혈관 질환을 치료, 예를 들어, Andino 등, J. Gene Med. 10: 132-142 (2008) 및 Li 등, Acta Pharmacol Sin. 26:51-55 (2005) 참조); 포스포람반 S 16E와 같은 포스포람반 억제 또는 우성 음성 분자 (예를 들어, 심혈관 질환 치료, 예를 들어, Hoshijima 등 Nat. Med. 8:864-871 (2002) 참조), 아데노신 키나아제에 대한 RNAi (예를 들어, 간질), 및 병원성 유기체 및 바이러스에 대한 RNAi (예를 들어, B형 간염 및/또는 C형 바이러스, 인간 면역 결핍 바이러스, CMV, 단순 포진 바이러스, 인간 유두종 바이러스 등)를 포함한다.

추가로, 이식유전자 서열은 대체 스플라이싱을 지시할 수 있다. 예를 들면, 디스트로핀 엑손 51의 5' 및/또는 3' 스플라이스 부위에 상보적인 안티센스 서열 (또는 다른 억제 서열)은 이 엑손의 스키핑을 유도하기 위해 U1 또는 U7 소형 핵 (sn) RNA 프로모터와 함께 전달될 수 있다. 예를 들어, 안티센스/억제 서열(들)에 대해 5'에 위치한 U1 또는 U7 snRNA 프로모터를 포함하는 DNA 서열이 카세트에 패키징되고 본 개시의 AAV 벡터에 전달될 수 있다.

일부 구현예에서, 이식유전자는 유전자 편집을 지시할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자는 가이드 RNA 또는 뉴클레아제와 같은 유전자-편집 분자를 인코딩할 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 징크-핑거 뉴클레아제, 귀소성 엔도뉴클레아제, TALEN (전사 활성화제 유사 이펙터 뉴클레아제), NgAgo (아그로나우트 엔도뉴클레아제), SGN (구조 유도된 엔도뉴클레아제), 또는 Cas9 뉴클레아제 또는 Cpf1 뉴클레아제와 같은 RGN (RNA-유도된 뉴클레아제)을 인코딩할 수 있다.

이식유전자는 숙주 염색체상의 유전자좌와 상동성을 공유하고 재조합할 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어, 숙주 세포의 유전적 결함을 수정하기 위해 활용될 수 있다.

이식유전자는 예를 들어, 백신 접종에 대한 면역원성 폴리펩티드일 수 있다. 이식유전자는 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV), 시미안 면역 결핍 바이러스 (SIV), 인플루엔자 바이러스, HIV 또는 SIV gag 단백질, 종양 항원, 암 항원, 박테리아 항원, 바이러스 항원 등으로부터의 면역원을 포함하지만, 이에 한정되지 않는 당 업계에 공지된 임의의 관심 면역원을 인코딩할 수 있다.

본 개시에 따른 바이러스 벡터는 분할 및 비분할 세포를 포함하는, 광범위한 세포로 이식유전자를 전달하는 수단을 제공한다. 바이러스 벡터는 시험관 내, 예를 들어, 시험관 내 폴리펩티드를 생산하기 위해 또는 생체 외 유전자 치료법을 위해 세포로 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 추가적으로 예를 들어, 면역원성 또는 치료적 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 발현하기 위해 이를 필요로 하는 대상체로 이식유전자를 전달하는 방법에서 유용하다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드 또는 기능적 RNA는 대상체에서 생체 내 생산될 수 있다. 대상체가 폴리펩티드가 결핍되어 있기 때문에 대상체는 폴리펩티드를 필요로 할 수 있다. 또한, 대상체에서 폴리펩티드 또는 기능적 RNA의 생산이 일부 유익한 효과를 부여할 수 있기 때문에 방법이 실행될 수 있다.

바이러스 벡터는 또한 배양된 세포에서 또는 대상체에서 (예를 들어, 폴리펩티드를 생산하거나 예를 들어, 선별 방법과 함께 대상체 상의 기능적 RNA의 효과를 관찰하기 위해 대상체를 생체반응기로 사용하여) 관심 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 생산하기 위해 사용될 수 있다.

일반적으로, 본 개시의 핵산 및 바이러스 벡터는 치료적 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 전달하는 것이 유익한 임의의 질환 상태를 치료하고/거나 예방하기 위한 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 인코딩하는 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예시적인 질환 상태는 낭포성 섬유증 (낭포성 섬유증 막관통 조절자 단백질) 및 다른 폐 질환, 혈우병 A (인자 VIII), 혈우병 B (인자 IX), 탈라세미아 (β-글로빈), 빈혈 (에리스로포이에틴) 및 다른 혈액 장애를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 알츠하이머병 (GDF; 네프릴리신), 다발성 경화증 (β-인터페론), 파킨슨병 (교세포주 유래 신경 영양 인자 [GDNF]), 헌팅턴병 (반복을 제거하는 RNAi), 근위축성측삭경화증, 간질 (갈라닌, 신경 영양 인자), 및 다른 신경 장애, 암 (엔도스타틴, 안지오스타틴, TRAIL, FAS-리간드, 인터페론을 포함하는 사이토카인; VEGF에 대한 RNAi 또는 다중 약물 내성 유전자 생성물을 포함하는 RNAi, mir-26a [예를 들어, 간세포 암종]), 당뇨병 (인슐린), 뒤쉔을 포함한 근이영양증 (디스트로핀, 미니-디스트로핀, 인슐린 유사 성장 인자 I, 사르코글리칸 [예를 들어, a, β, γ], 근위축 미오스타틴 프로펩티드에 대한 RNAi, 폴리스타틴, 액티빈 유형 II 가용성 수용체, 항-염증 폴리펩티드 예를 들어 이카파 B 우성 돌연변이체, 사르코스팬, 유트로핀, 미니-유트로핀, 안티센스 또는 엑손 스키핑을 유도하는 디스트로핀 유전자에서 스플라이스 접합에 대한 RNAi [예를 들어, WO/2003/095647 참조], 엑손 스키핑을 유도하는 U7 snRNA에 대한 안티센스 [예를 들어, WO/2006/021724 참조], 및 미오스타틴 또는 미오스타틴 프로펩티드에 대한 항체 또는 항체 단편) 및 베커, 고셔병 (글루코세레브로시다제), 헐러병 (a-L-이두로니다제), 아데노신 탈아미노효소 결핍 (아데노신 탈아미노효소), 글리코겐 저장 질환 (예를 들어, 파브리병 [a-갈락토시다제] 및 폼페병 [리소좀산 알파-글루코시다제]) 및 다른 대사 장애, 선천성 폐기종 (알파-1-항트립신), 레슈-나이한 증후군 (하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제), 니만-픽병 (스핑고미엘리나아제), 테이-삭스 병 (리소좀 헥소사미니다제 A), 메이플 시럽 소변 병 (분지쇄 케토산 탈수소효소), 망막 퇴행성 질환 (및 눈 및 망막의 다른 질환; 예를 들어, 황반 변성에 대한 PDGF 및/또는 바소히빈 또는 VEGF의 다른 억제제 또는 예를 들어, 유형 I 당뇨병에서 망막 장애를 치료/예방하기 위한 다른 혈관신생 억제제), 뇌와 같은 고형 기관의 질환 (파킨슨병 [GDNF], 성상세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi], 교모세포종 [엔도스타틴, 안지오스타틴 및/또는 VEGF에 대한 RNAi]를 포함), 간, 신장, 울혈성 심부전 또는 말초 동맥 질환 (PAD)을 포함하는 심장 (예를 들어, 단백질 포스파타제 억제제 I (I-1) 및 이의 단편 (예를 들어, IlC)을 전달, serca2a, 포스포람반 유전자를 조절하는 징크 핑거 단백질, Barkct, [32-아드레날린 수용체, 2-아드레날린 수용체 키나아제 (BARK), 포스포이노시티드-3 키나아제 (PI3 키나아제), S100A1, 파르브알부민, 아데닐릴 시클라제 유형 6, 절단 구성적 활성 bARKct와 같은 G-단백질 결합된 수용체 키나아제 유형 2 녹다운에 영향을 주는 분자; 칼사르신, 포스포람반에 대한 RNAi; 포스포람반 S16E 등과 같은 포스포람반 억제 또는 우성-음성 분자), 관절염 (인슐린 유사 성장 인자), 관절 장애 (인슐린 유사 성장 인자 1 및/또는 2), 내막 증식증 (예를 들어, 에노스, 이노스를 전달함으로써), 심장 이식의 생존 개선 (슈퍼옥사이드 디스무타제), AIDS (가용성 CD4), 근육 소모 (인슐린 유사 성장 인자 I), 신장 결핍 (에리스로포이에틴), 빈혈 (에리스로포이에틴), 관절염 (I RAP 및 TNFa 가용성 수용체와 같은 항-염증 인자), 간염 (a-인터페론), LDL 수용체 결핍 (LDL 수용체), 고암모니아혈증 (오르니틴트랜스카르바밀라제), 크라베병 (갈락토세레브로시다제), 바텐병, 프리드라이히 운동실조 (FRDA), SCA1, SCA2 및 SCA3, 페닐케톤뇨증을 포함하는 척추 뇌성 운동실조 (페닐알라닌 수산화효소), 자가 면역 질환 등. 본 개시는 이식의 성공을 높이기 위해 및/또는 보조 요법의 부정적인 부작용을 감소시키기 위해 (예를 들어, 사이토카인 생산을 차단하기 위해 면역억제제 또는 억제 핵산을 투여함으로써) 장기 이식 후 추가로 사용될 수 있다. 다른 예로서, 골 형태 형성 단백질 (BNP 2, 7 등, RANKL 및/또는 VEGF를 포함)은 예를 들어, 암 환자에서 브레이크 또는 외과적 제거 후 골 동종 이식과 함께 투여될 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 바이러스 벡터는 간 질환 또는 장애를 치료하고/거나 예방하기 위한 폴리펩티드 또는 기능적 RNA를 인코딩하는 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 간 질환 또는 장애는 예를 들어, 원발성 담즙 간경변, 비알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 비알코올성 지방 간염 (NASH), 자가 면역 간염, B형 간염, C형 간염, 알코올성 간 질환, 섬유증, 황달, 원발성 경화성 담관염 (PSC), 버드-키아리 증후군, 혈색소침착증, 윌슨 병, 알코올성 섬유증, 비알코올성 섬유증, 간 지방증, 길버트 증후군, 담도 폐쇄증, 알파-1-항트립신 결핍, 알라질 증후군, 진행성 가족성 간 내 담즙 정체, 혈우병 B, 유전성 혈관 부종 (HAE), 동형 접합 가족성 고콜레스테롤혈증 (HoFH), 이종 접합 가족성 고콜레스테롤혈증 (HeFH), 폰 기르케병 (GSD I), 혈우병 A, 메틸말론 산혈증, 프로피온산 혈증, 호모시스틴뇨증, 페닐케톤뇨증 (PKU), 티로신혈증 유형 1, 아르기나제 1 결핍, 아르기니노숙시네이트 리아제 결핍, 카르바모일인산합성효소 1 결핍, 시트룰린혈증 유형 1, 시트린 결핍, 크리글러/나자르증후군 유형 1, 시스틴증, 파브리병, 글리코겐 저장 질환 1b, LPL 결핍, N-아세틸글루타메이트합성효소 결핍, 오르니틴 트랜스카르바밀라제 결핍, 오르니틴 트랜스로카제 결핍, 원발성 과옥살산뇨증 유형 1, 또는ADA SCID일 수 있다.

본 개시의 바이러스 벡터는 유도된 다능성 줄기 세포 (iPS)를 생산하기 위해 사용된 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 바이러스 벡터는 줄기 세포 관련된 핵산(들)을 비-다능성 세포, 예를 들어 성인 섬유아세포, 피부 세포, 간 세포, 신장 세포, 지방 세포, 심장 세포, 신경 세포, 상피 세포, 내피 세포 등으로 전달하는데 사용될 수 있다. 줄기 세포와 관련된 인자를 인코딩하는 이식유전자는 당 업계에 공지되어 있다. 줄기 세포 및 다능성과 관련된 이러한 인자의 비제한적 예시는 Oct-3/4, SOX 패밀리 (예를 들어, SOX 1, SOX2, SOX3 및/또는 SOX 15), Klf 패밀리 (예를 들어, Klfl, KHZ Klf4 및/또는 Klf5), Myc 패밀리 (예를 들어, C-myc, L-myc 및/또는 N-myc), NANOG 및/또는 LIN28을 포함한다.

본 개시의 바이러스 벡터는 대사 장애 예를 들어 당뇨병 (예를 들어, 인슐린), 혈우병 (예를 들어, 인자 IX 또는 인자 VIII), 리소좀 저장 질환 예를 들어 뮤코다당류증 장애 (예를 들어, 슬라이 증후군 [β-글루쿠로니다제], 헐러 증후군 [알파-L-아이두로니다제], 샤이에 증후군 [알파-L-아이두로니다제], 헐러-샤이에 증후군 [알파-L-아이두로니다제], 헌터 증후군 [아이두로네이트 술파타제], 산필리포 증후군 A [헤파란 술파미다제], B [N-아세틸글루코사미니다제], C [아세틸-CoA:알파-글루코사미니드 아세틸트랜스퍼라제], D [N-아세틸글루코사민 6-술파타제], 모르퀴오 증후군 A [갈락토스-술페이트 술파타제], B [β-갈락토시다제], 마로토-라미 증후군 [N-아세틸갈락코사민-4-술파타제] 등), 파브리병(알파-갈락토시다제), 고셔병 (글루코세레브로시다제), 또는 글리코겐 저장 장애 (예를 들어, 폼페병; 리소좀 산 알파-글루코시다제)를 치료하고/거나 예방하기 위한 이식유전자를 전달하기 위해 사용될 수 있다.

일부 구현예에서, 이식유전자는 프리드라이히 운동실조 치료에 유용하다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 프라탁신 (FXN) 단백질을 인코딩한다. 프라탁신 단백질은 예를 들어, 인간 프라탁신 단백질일 수 있다. 예시적인 인간 프라탁신 단백질 서열은 하기에 제공된다 (서열 번호 65):

MWTLGRRAVAGLLASPSPAQAQTLTRVPRPAELAPLCGRRGLRTDIDATCTPRRASSNQRGLNQIWNVKKQSVYLMNLRKSGTLGHPGSLDETTYERLAEETLDSLAEFFEDLADKPYTFEDYDVSFGSGVLTVKLGGDLGTYVINKQTPNKQIWLSSPSSGPKRYDWTGKNWVYSHDGVSLHELLAAELTKALKTKLDLSSLAYSGKDA

그 전문이 참고로 포함된 Uniprot 수탁 번호 Q16595를 또한 참조. 일부 구현예에서, 프라탁신 단백질은 인간 프라탁신 단백질의 서열과 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 프라탁신 단백질은 서열 번호 65의 서열과 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 갖는다. 일부 구현예에서, 인간 프라탁신 단백질은 프라탁신의 동형, 변이체 (예를 들어 대체 스플라이스 변이체) 또는 돌연변이 형태이다. 일부 구현예에서, 돌연변이 프라탁신은 표 3에 나타낸 치환 중 하나 이상을 갖는다.

표 3: 예시적인 프라탁신 아미노산 치환

일부 구현예에서, 이식유전자는 야생형 서열에 비하여 코돈 최적화된 프라탁신 cDNA를 포함한다. 예를 들어, cDNA는 숨겨진 스플라이스 수용자/공여자 부위를 제거하고, 희귀 코돈의 사용을 감소시키고, 리보솜 진입 부위를 제거하는 등을 위해 변형될 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 CpG 최적화된 프라탁신 cDNA를 포함한다. 예를 들어, cDNA는 CpG 디뉴클레오티드의 숫자를 줄이기 위해 변형될 수 있다.

일부 구현예에서, 이식유전자는 서열 번호 19의 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프라탁신 cDNA를 포함한다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 서열 번호 20의 서열, 또는 이와 적어도 90% 동일한, 적어도 95% 동일한, 적어도 96% 동일한, 적어도 97% 동일한, 적어도 98% 동일한, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함하는 프라탁신 cDNA를 포함한다.

폴리아데닐화 (폴리A) 신호

폴리아데닐화 신호는 거의 모든 포유동물 유전자에서 발견되고 유전자 전사체의 3' 말단에 대략 200개 아데노신 잔기 (폴리(A) 꼬리)의 스트링의 추가를 제어하는 뉴클레오티드 서열이다. 폴리(A) 꼬리는 mRNA 안정성에 기여하고, 폴리(A) 꼬리가 결여된 mRNA는 빠르게 분해된다. 또한 폴리(A) 꼬리의 존재가 번역의 개시에 영향을 줌으로써 mRNA의 번역 가능성에 긍정적으로 기여한다는 증거가 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 및 AAV 전달 카세트는 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 및 AAV 전달 카세트는 2개, 3개, 4개, 또는 이상의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40 (SV40), α-글로빈 (예를 들어, 인간 α-글로빈, 마우스 α-글로빈, 또는 토끼 α-글로빈), β-글로빈 (예를 들어, 인간 β-글로빈, 마우스 β-글로빈, 또는 토끼 β-글로빈), 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬 (hGH) 또는 소 성장 호르몬 (bGH), 또는 이의 변이체의 폴리아데닐화 신호일 수 있다.

일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 (bGH) 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 서열 번호 21의 서열을 갖는 bGH 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 인간 성장 호르몬 (hGH) 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 hGH 서열 번호 22의 서열을 갖는 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 인간 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 서열 번호 23의 서열을 갖는 인간 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 서열 번호 24의 서열을 갖는 토끼 베타 글로빈 폴리아데닐화 신호이다. 일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 21-24 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

일부 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 역방향으로 핵산 또는 카세트에서 존재할 수 있다. 역방향에서, 폴리아데닐화 신호는 안전 인자로 작용할 수 있다. 예를 들어, 역방향 폴리아데닐화 신호는 역방향에서 프로모터로부터 상당한 전사를 방지할 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 2개의 폴리아데닐화 신호, 예를 들어 서열 번호 21 및 22의 폴리아데닐화 신호를 포함한다. 핵산 또는 AAV 전달 카세트가 2개의 폴리아데닐화 신호를 포함하는 구현예에서, 신호 중 하나는 역방향으로 존재할 수 있다.

스터퍼 서열

AAV 벡터는 일반적으로 약 4 kb 내지 약 5.2 kb, 또는 약간 이상인 정의된 크기 범위를 갖는 DNA의 삽입물을 일반적으로 받아들인다. 따라서, 더 짧은 서열의 경우, AAV 벡터에 허용 가능한 필요한 길이를 달성하기 위해 삽입 단편에 추가 핵산을 포함하는 것이 필요할 수 있다. 스터퍼 서열은 공지된 유전자 또는 핵산 서열의 비코딩 영역 (예를 들어, 인트론 영역)으로 단리되거나 유래될 수 있다. 스터퍼 서열은 예를 들어, 1-10, 10-20, 20-30, 30-40, 40-50, 50-60, 60-75, 75-100, 100-150, 150-200, 200-250, 250-300, 300-400, 400-500, 500-750, 750-1,000, 1,000-1,500, 1,500-2,000, 2,000-2,500, 2,500- 3,000, 3,000-3,500, 3,500-4,000, 4,000-4,500, 4,500-5,000, 5,500-6,000, 6,000-7,000, 7,000- 8,000, 또는 8,000-9,000 뉴클레오티드 길이 사이 서열일 수 있다. 스터퍼 서열은 기능 또는 활성을 방지하지 않는 임의의 원하는 위치에서 핵산 또는 카세트에 위치할 수 있다.

일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 스터퍼 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 서퍼 서열은 인트론 서열, 또는 그로부터 유래된 서열을 포함한다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 키메라 서열이다. 일부 구현예에서, 스터퍼 서열은 알파1-항트립신 또는 알부민과 같은 유전자로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 서퍼 서열은 서열 번호 25-27 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열로부터 선택된다.

인트론 서열

일부 구현예에서, 본 개시의 핵산 및/또는 전달 카세트는 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열을 포함하면 효율적인 핵 배출 및 번역에 중요한 전사된 mRNA에 대한 인자를 모집할 수 있다. 따라서, 인트론 서열의 포함은 인트론 서열의 부재 하 발현과 비교하여 발현을 향상시킬 수 있다.

일부 구현예에서, 인트론 서열은 하이브리드 또는 키메라 서열이다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 β-글로빈, 닭 베타-액틴, 미세 마우스 바이러스 (MVM), 인자 IX, SV40, 및/또는 인간 IgG (중쇄 또는 경쇄) 중 하나 이상의 인트론 서열로부터 단리되거나 유래된다. 일부 구현예에서, 인트론 서열은 서열 번호 13-16 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

코작 서열

코작 서열은 mRNA의 번역의 효율적인 개시를 허용하는 진핵 세포 mRNA의 번역 개시 부위 주위를 중심으로 하는 짧은 서열이다. 리보솜 번역 기계는 코작 서열의 맥락에서 AUG 개시 코돈을 인식한다.

일부 구현예에서, 본 개시의 AAV 전달 카세트는 코작 서열을 포함할 수 있다. 코작 서열은 이식유전자의 번역 효율 및 전반적인 발현을 향상시킬 수 있다. 코작 서열은 이식유전자 서열에 대해 바로 5'에 위치하거나, 이식유전자 서열과 중첩될 수 있다.

본 개시의 핵산 또는 AAV 전달 카세트의 코작 서열은 공통 서열, 또는 이의 변형된 버전일 수 있다. 코작 서열은 서열 번호 17-18 또는 66-70 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함할 수 있다.

핵산 및 AAV 전달 카세트

일부 구현예에서, 핵산 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 전달 카세트는 인핸서, 프로모터, 인트론 서열, 코작 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 서퍼 서열 중 하나 이상을 포함한다. 일부 구현예에서, 핵산 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 전달 카세트는 인핸서, 프로모터, 인트론 서열, 코작 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및/또는 서퍼 서열의 임의의 조합을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV) 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' 역위 말단 반복 (ITR), 프로모터, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 인핸서, 프로모터, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 인핸서, 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 폴리A 신호 (역방향), 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 스터퍼 서열, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 스터퍼 서열, 폴리아데닐화 신호 (역방향), 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 스터퍼 서열, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 스터퍼 서열, 폴리아데닐화 신호 (역방향), 프로모터, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 스터퍼 서열, 및 3' ITR을 포함한다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 5' ITR, 프로모터, 인트론 서열, 이식유전자 서열, 폴리아데닐화 신호, 서퍼 서열, 및 3' ITR을 포함한다.

상기 구현예 중 하나에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 코작 서열을 추가로 포함할 수 있다. 코작 서열은 이식유전자 서열에 대해 바로 5'로 위치할 수 있다. 코작 서열은 서열 번호 17-18 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 표 4에 나타낸 요소, 또는 이의 임의의 서브셋을 포함한다. 상이한 예시적인 핵산 또는 AAV 전달 카세트를 표의 각 행에 나타낸다. "x"는 표시된 요소가 핵산 또는 AAV 전달 카세트에 포함되어 있음을 표시한다.

표 4: 예시적인 핵산 또는 AAV 전달 카세트 (5'에서 3')

상기 구현예 중 하나에서, 이식유전자 서열은 프라탁신 (FXN) 단백질을 인코딩할 수 있다. 이식유전자 서열은 예를 들어, 서열 번호 19 또는 서열 번호 20의 서열을 가질 수 있다. 일부 구현예에서, 이식유전자는 서열 번호 65의 서열을 갖는 FXN 단백질을 인코딩할 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 5' ITR은 서열 번호 1의 서열을 가질 수 있고, 3' ITR은 서열 번호 2 또는 3의 서열을 가질 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 인핸서는 서열 번호 4-5 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 프로모터는 서열 번호 6-12 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 인트론 서열은 서열 번호 13-16 중 어느 하나의 서열을 가질 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 21-24 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.

상기 구현예 중 하나에서, 스터퍼 서열은 서열 번호 25-27 중 어느 하나의 서열을 포함할 수 있다.

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 5’에서 3’로, 표 5에 나타낸 요소 및 서열, 또는 이의 임의의 서브셋을 포함한다. 상이한 예시적인 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 표의 각 행에 나타낸다. 표에 제공된 번호는 서열 번호에 해당한다.

표 5: 예시적인 핵산 또는 AAV 전달 카세트 (5'에서 3')

일부 구현예에서, 핵산 또는 AAV 전달 카세트는 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 또는 적어도 99% 동일한 서열을 포함한다.

본원에 기술된 핵산 및 AAV 전달 카세트는 표준 분자생물학 기술을 사용하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 박미드)에 포함될 수 있다. 벡터 (예를 들어, 플라스미드 또는 박미드)는 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 포함하는, AAV의 생산 동안 사용되는 하나 이상의 유전적 요소를 추가로 포함할 수 있다.

재조합 AAV 및 AAV 생산 방법

핵산 및 AAV 전달 카세트, 및 본원에 기술된 핵산 및 AAV 전달 카세트를 포함하는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)는 재조합 AAV 벡터를 생산하기 위해 사용될 수 있다. AAV 벡터는 단일 가닥 게놈 또는 이중 가닥 게놈 (즉, scAAV)을 포함할 수 있다. 고 역가 AAV 제제는 표준 삼중 형질감염 또는 바큘로바이러스 생산 방법과 같은, 당 업계에 공지된 기술을 사용하여 생산될 수 있다.

일반적으로, AAV 벡터의 생산 방법은 4개의 구성요소를 포함한다: 트랜스로 작용하는 플라스미드 및 시스로 작용하는 이식유전자. 이들 구성요소는 하기를 포함한다: 1) 캡시드 형성 및 복제를 위한 AAV Rep 및 Cap 유전자를 함유하는 플라스미드, 2) 아데노바이러스 헬퍼 유전자를 함유하는 플라스미드,　3) 2개의 역위 말단 반복 (ITR)으로 둘러싸인 이식유전자를 함유하는 카세트, 및 4) 바이러스 패키징 세포주. AAV는 매우 감염성이 높고 많은 비율의 인간 집단에 자연적으로 존재하기 때문에, 세포 배양물 및 모든 재료는 사용 전 일시적인 야생형 AAV 감염에 대해 철저히 검사될 수 있다.

일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은 AAV 생산자 세포 (예를 들어, HEK293 세포)를 본 개시의 핵산, AAV 전달 카세트 또는 벡터 (예를 들어, 플라스미드)와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 AAV 생산자 세포를 예를 들어, AAV rep 및 cap 유전자, 및 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 인코딩하는 하나 이상의 추가 벡터 (예를 들어, 플라스미드)와 접촉시키는 것을 추가로 포함한다. 일부 구현예에서, 방법은 AAV가 생산되는 조건하에 AAV 생산자 세포를 유지시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법은 AAV 생산자 세포 (예를 들어, 곤충 세포 예를 들어 Sf9 세포)를 본 개시의 핵산 또는 AAV 전달 카세트를 포함하는 적어도 하나의 곤충 세포-호환 가능 벡터와 접촉시키는 것을 포함한다. "곤충 세포-호환 가능 벡터"는 임의의 화합물 또는 제제, 생물학적 또는 화학물이고, 이 제제는 핵산을 사용하는 곤충 세포의 형질전환 또는 형질감염을 촉진한다. 일부 구현예에서, 곤충 세포-호환 가능 벡터는 바큘로바이러스 벡터이다.　일부 구현예에서, 방법은 AAV가 생산되는 조건하에 곤충 세포를 유지시키는 것을 추가로 포함한다.

일부 구현예에서, AAV 생산자 세포는 3개의 플라스미드를 사용하여 형질감염 (예를 들어, 형질감염제 사용)된다: (1) 본 개시의 핵산 또는 AAV 전달 카세트를 포함하는 제1 플라스미드, (2) AAV rep 및 cap 유전자 서열을 포함하는 제2 플라스미드, 및 (3) 헬퍼 바이러스 단백질 서열을 포함하는 제3 플라스미드. 예를 들어, 도 5 참조. AAV 생산자 세포는 표 2에 열거된 세포 중 하나일 수 있다. AAV 생산자 세포는 AAV가 생산되는 조건하에 유지될 수 있다. 그런 다음 AAV는 표준 기술, 예를 들어 염화 세슘 (CsCl) 구배 원심분리 또는 컬럼 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제될 수 있다.

생산된 재조합 AAV 벡터는 임의의 혈청형, 예를 들어 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV의 캡시드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 재조합 AAV 벡터는 천연 AAV 캡시드에 비해 하나 이상의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환 및/또는 결실)을 갖는 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 재조합 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 및 소 AAV로부터 유래된 변형된 AAV 캡시드를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 생산된 AAV 벡터는 AAV9이다. 일부 구현예에서, 생산된 AAV 벡터는 AAV1이다. 일부 구현예에서, 생산된 AAV 벡터는 AAV4이다.

재조합 AAV 벡터는 예를 들어 재조합 AAV 벡터를 표적 세포와 접촉시킴으로써, 표적 세포를 이식유전자 서열로 형질도입하기 위해 사용될 수 있다.

조성물

본 개시의 핵산, AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물이 또한 제공된다. 일부 구현예에서, 조성물은 액체 조성물이다. 일부 구현예에서, 조성물은 고체 조성물이다.

일부 구현예에서, 본 개시의 핵산, AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 본 개시에 따른 약학적 조성물, 및 본 개시에 따른 용도는 핵산, AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터 이외에, 약학적으로 허용 가능한 부형제, 담체, 완충제, 안정화제 또는 다른 물질 (예를 들어, 희석제, 보조제, 충전제, 방부제, 항산화제, 윤활제, 가용화제, 계면활성제 (예를 들어, 습윤제), 차폐제, 착색제, 향미제, 및 감미제)을 포함할 수 있다. 이러한 물질은 바람직하게는 무독성이어야 한다. 적합한 담체, 희석제, 부형제 등은 표준 약학 문서에서 찾을 수 있다. 예를 들어, Handbook of Pharmaceutical Additives, 2nd Edition (eds. M. Ash 및 I. Ash), 2001 (Synapse Information Resources, Inc., Endicott, New York, USA), Remington 's Pharmaceutical Sciences, 20th edition, pub. Lippincott, Williams & Wilkins, 2000; 및 Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd edition, 1994 참조. 담체 또는 다른 물질의 정확한 특성은 경구, 또는 주사, 예를 들어 피부, 피하, 또는 정맥 내일 수 있는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.

경구 투여용 약학적 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 형태일 수 있다. 정제는 고체 담체 또는 보조제를 포함할 수 있다. 액체 약학적 조성물은 일반적으로 물, 석유, 동물 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 오일과 같은 액체 담체를 포함한다. 생리 식염수액, 덱스트로스 또는 다른 당류 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이 포함될 수 있다. 캡슐은 젤라틴과 같은 고체 담체를 포함할 수 있다.

정맥 내, 피부 또는 피하 주사, 또는 통증 부위 주사의 경우, 약학적 조성물은 발열원이 없고 적합한 pH, 등장성 및 안정성을 갖는 비경구적으로 허용 가능한 수용액 형태일 수 있다. 적합한 용액은 예를 들어, 염화나트륨, 링거액, 및/또는 젖산링거액과 같은 등장성 비히클을 포함할 수 있다. 방부제, 안정화제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제가 필요한 경우, 포함될 수 있다.

치료 방법

본 개시의 핵산 또는 AAV 전달 카세트를 사용하여 제조된 AAV 벡터를 포함하는, 본 개시의 AAV 벡터는 이를 필요로 하는 대상체에서 질환, 장애, 또는 다른 병태를 치료 또는 예방하기 위해 사용될 수 있다. 대상체는 포유류 또는 조류일 수 있다. 일부 구현예에서, 포유류는 고양이, 개, 마우스, 랫트, 말, 소, 돼지, 기니피그, 또는 비-인간 영장류이다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간이다. 인간은 소아 대상체, 성인 대상체, 또는 노인 대상체일 수 있다.

본 개시의 AAV 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물은 생체 내 또는 생체 외 세포와 접촉할 수 있다. 그런 다음 세포는 세포에서 이식유전자의 발현에 충분한 조건하에 유지될 수 있다.

본 개시의 AAV 벡터, 또는 이를 포함하는 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에 투여될 수 있다. 투여는 당 업계에 알려진 임의의 수단일 수 있다. 선택적으로, 바이러스 벡터 및/또는 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체에 치료적 유효 용량으로 전달된다. 일부 구현예에서, 치료적 유효 용량의 바이러스 벡터 및/또는 조성물이 전달된다.

대상체에 투여될 바이러스 벡터 및/또는 조성물의 투여량은 투여 방식, 치료되고/거나 예방될 질환 또는 병태, 개별 대상체의 상태, 특정 바이러스 벡터 또는 조성물, 전달될 핵산 등에 따라 다르고, 일상적인 방식으로 결정될 수 있다. 치료적 효과 달성을 위한 예시적인 용량은 적어도 약 10⁵, 적어도 약 10⁶, 적어도 약 10⁷, 적어도 약 10⁸, 적어도 약 10⁹, 적어도 약 10¹⁰, 적어도 약 10¹¹, 적어도 약 10¹², 적어도 약 10¹³, 적어도 약 10¹⁴, 적어도 약 10¹⁵　변환 단위, 선택적으로 약 10⁸　내지 약 10¹³　변환 단위의 역가이다.

특정 구현예에서, 1회를 초과하는 투여 (예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 이상의 투여)가 예를 들어, 매일, 매주, 매달, 매년 등 다양한 간격의 기간 동안 원하는 수준의 유전자 발현을 달성하기 위해 사용될 수 있다.

예시적인 투여 방식은 경구, 직장, 경점막, 비강, 흡입 (예를 들어, 에어로졸을 통해), 구강 (예를 들어, 설하), 질, 경막 내, 안내, 경피, 자궁 내 (또는 난소 내), 비경구 (예를 들어, 정맥 내, 피하, 피내, 근육 내 (골격, 횡격막 및/또는 심장 근육에 대한 투여를 포함), 피내, 흉막 내, 뇌 내 및 관절 내), 국소 (예를 들어, 기도 표면을 포함하는 피부 및 점막 표면 모두에, 및 경피 투여), 림프 내 등, 뿐만 아니라 직접 조직 또는 기관 주사 (예를 들어, 간, 골격근, 심장 근육, 횡격막 근육 또는 뇌로)를 포함한다. 투여는 종양 (예를 들어, 종양 또는 림프절 내 또는 근처)에 대한 것일 수 있다. 주어진 경우에 가장 적합한 경로는 치료되고/거나 예방될 병태의 특성 및 중증도 및 사용될 특정 벡터의 특성에 따라 다를 것이다.

일부 구현예에서, AAV 벡터 또는 벡터를 포함하는 조성물은 심장 또는 중추 신경계(CNS) 조직으로 직접 주사에 의해 투여될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 벡터 또는 벡터를 포함하는 조성물은 척수강 내, 신경 내, 대뇌 내 또는 심실 내 투여를 포함하여 두개 내로 전달될 수 있다. 일부 구현예에서, AAV 벡터 또는 벡터를 포함하는 조성물은 심근으로 직접 투여로, 심외막 주사 후 소흉술에 의해, 관상동맥 내 주사, 또는 심내막 주사에 의해 심장으로 전달될 수 있다.

표적 조직에 대한 전달은 또한 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포에 의해 달성될 수 있다. 대표적인 구현예에서, 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 데포가 골격, 심장 및/또는 횡격막 근육 조직에 이식되거나 조직이 바이러스 벡터 및/또는 캡시드를 포함하는 필름 또는 다른 매트릭스와 접촉될 수 있다. 이러한 이식 가능한 매트릭스 또는 기질은 미국 특허 번호 7,201,898에 기술되어 있다.

AAV의 투여는 표적 세포 또는 조직에서 강하고 지속적인 이식유전자 발현을 유발할 수 있다. 예를 들어, 이식유전자 발현은 적어도 1주, 적어도 2주, 적어도 3주, 적어도 4주, 적어도 5주, 적어도 6주, 적어도 7주, 적어도 8주, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 적어도 5개월, 적어도 6개월, 적어도 12개월, 적어도 24개월, 적어도 36개월 또는 그 이상 동안 지속될 수 있다.

일부 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법은 대상체에 치료학적 유효량의 본 개시의 핵산, AAV 전달 카세트, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV를 투여하는 것을 포함한다. 일부 구현예에서, 대상체는 인간 대상체이다. 일부 구현예에서, 대상체는 프리드라이히 운동실조를 앓고 있다. 투여는 대상체의 CNS 조직 (예를 들어, 신경 조직) 또는 심장 조직에서 치료학적 유효량의 FXN 단백질의 발현을 유발할 것이다.

일부 구현예에서, 투여는 프리드라이히 운동실조의 하나 이상의 증상의 완화를 유발할 것이다. 예를 들어, 투여는 (1) 대상체의 팔과 다리에서 조정 (운동실조)을 개선하고, (2) 대상체에서 에너지 수준을 높이고/하거나 피로 및 근육 손실을 감소시키고, (3) 대상체에서 시력, 청력, 또는 언어 능력을 개선하고 (3) 척추 측만증 또는 이의 진행 속도를 감소시키고, (4) 인슐린 감수성과 같은 당뇨병 증상을 개선하거나, (5) 비대성 심근병증 또는 부정맥과 같은 심장 상태를 개선할 수 있다. 치료로 인한 대상체의 개선은 대상체 치료 전과 비교할 때, 또는 프리드라이히 운동실조가 있는 전형적인 대상체와 비교할 때 개선일 수 있다.

일부 구현예에서 투여는 대상체의 수명 연장을 유발할 수 있다. 예를 들어, 투여는 대상체의 수명을 프리드라이히 운동실조가 있는 전형적인 대상체와 비교하여 약 1년, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 5-10년, 또는 10년 초과하여 연장할 수 있다.

실시예

예시 목적으로만 본원에 포함된 하기 실시예는 제한하고자 하는 것이 아니다.

실시예 1: 포유류 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조

3개의 플라스미드가 제공된다. 제1 플라스미드는 2개의 ITR (서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 3)이 측면에 있는 인간 프라탁신 (서열 번호 19 또는 20)을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 전달 카세트를 포함하고, 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열을 갖는다. 제2 플라스미드는 Rep 및 Cap 유전자를 인코딩하는 서열을 포함한다. 제3 플라스미드는 AAV 생산에 필요한 다양한 "헬퍼" 서열 (E4, E2a, 및 VA)을 포함한다.

3개의 플라스미드는 적절한 형질감염제 (예를 들어, Lipofectamine^TM)를 사용하여 바이러스 생산 세포 (예를 들어, HEK293)로 형질감염된다. 미리 결정된 시간 동안 37℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지 또는 세포로부터 수집하고 용해하여 AAV 입자를 방출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제, 적정하고, 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관할 수 있다.

실시예 2: 곤충 세포에서 재조합 AAV 벡터의 제조

제1 재조합 바큘로바이러스 벡터가 제공된다. 제1 재조합 바큘로바이러스 벡터는 2개의 ITR (서열 번호 1, 서열 번호 2 또는 3)이 측면에 있는 인간 프라탁신 (서열 번호 19 또는 20)을 인코딩하는 cDNA를 포함하는 전달 카세트 서열을 포함하고, 여기서 전달 카세트는 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열을 갖는다.

곤충 세포 (예를 들어, Sf9)를 제1 재조합 바큘로바이러스 벡터 및 AAV Rep 및 Cap 단백질을 인코딩하는 서열을 포함하는 적어도 하나의 추가 재조합 바큘로바이러스 벡터와 현탁 배양액에서 공동 감염시켰다. 미리 결정된 시간 동안 28℃에서 배양한 후, AAV 입자를 배지 또는 세포로부터 수집하고 용해하여 AAV 입자를 배출한다. 그런 다음 AAV 입자를 정제, 적정하고, 나중에 사용하기 위해 -80℃에서 보관할 수 있다.

실시예 3: 재조합 AAV 패키징 FXN 이식유전자는 생체 내 심장 세포를 FXN 결핍 마우스의 수명을 연장한다

인간 FXN 이식유전자를 포함하는, AAV 전달 카세트 (서열 번호 32)를 포함하는 플라스미드를 표준 클로닝 기술 (FXN 플라스미드)를 사용하여 제조하였다. FXN 플라스미드, AAV Rep 및 Cap (AAV9) 유전자를 인코딩하는 서열을 포함하는 제2 플라스미드, 및 AAV 헬퍼 서열을 인코딩하는 서열을 포함하는 제3 플라스미드를 포함하는 조성물을 제조하였고 표준 "삼중 형질감염" 프로토콜을 사용하여 HEK293 세포를 형질감염시키기 위해 사용하였다. HEK293 세포를 재조합, 자가 상보성 AAV9 벡터의 생산을 허용하는 표준 배양 조건(37℃, 5% CO₂) 하에 유지시켰다. 이 절차를 여러 번 반복하였고, AAV9 벡터 수율을 ddPCR^®을 사용하여 정량하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 각각의 실행에서 AAV9 패키징 FXN 이식유전자 (AAV9-FXN)의 수율은 10¹³ 내지 10¹⁴ 벡터 게놈이었다.

재조합 AAV9-FXN을 배양에서 Lec2 세포를 형질도입하는데 사용하였다. 도 4는 다양한 용량의 AAV9-FXN로 형질도입된 배양된 Lec2 세포에서 인간 FXN (ng/mg)의 발현을 나타낸다. 더 높은 용량의 벡터가 사용되었을 때 hFXN의 더 높은 발현이 관찰되었다.

재조합 AAV9-FXN을 또한, 심장 및 골격근에서 FXN이 결여된 마우스 (FXN ^flox/flox MCKCre ⁺ )를 감염시키는데 사용하였다. 마우스를 3주령에 식염수 또는 AAV9-FXN (5x10¹³ vg/kg)으로 처리하고, 생존을 모니터링하였다. 도 2에 나타낸 바와 같이, AAV9-FXN 처리는 수명을 상당히 증가시켰다. 식염수 주입 마우스의 생존 중앙값은 64일인 반면, AAV9-FXN 주입된 마우스의 생존 중앙값은 138.5일이었다.

별도의 실험에서, FXN 결핍 마우스를 3주령에 식염수, 또는 저 또는 고 용량의 AAV9-FXN (각각, 1x10¹³ 또는 5x10¹³ vg/kg)으로 처리하였다. 마우스를 처리 3주 후 희생하였고, 심장 조직을 분석하였다. 도 3a에 나타낸 바와 같이, 인간 FXN (hFXN) DNA가 AAV9-FXN 처리된 마우스의 심장 조직으로부터 검출 가능하였다. hFXN DNA는 RNA로 형질도입되었고 (도 3b) 단백질로 번역되었다 (도 3c). 더 높은 용량의 AAV9-FXN이 심장 샘플에서 더 높은 수준의 FXN DNA, RNA, 및 단백질을 초래하였다.

모두 종합하면, 이들 데이터는 FXN 이식유전자를 포함하는 본 개시의 AAV 전달 카세트가 재조합 AAV 벡터를 생산하는데 사용될 수 있고, 생체 내 대상체의 세포를 형질도입하는데 사용될 수 있음을 나타낸다.

번호 부여된 구현예

첨부된 청구 범위에도 불구하고, 본 개시는 본 개시의 하기 번호 부여된 구현예를 제시한다:

1. 5’에서 3’로: 5' 역위 말단 반복 (ITR); 프로모터; 이식유전자 서열; 폴리아데닐화 신호; 및 3' ITR를 포함하고; 상기 이식유전자 서열은 프라탁신 (FXN) 단백질을 인코딩하는, 핵산.

2. 구현예 1에 있어서, 상기 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110 내지 약 160 뉴클레오티드 길이인 핵산.

3. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 5' ITR은 3' ITR과 동일한 길이인 핵산.

4. 구현예 1 또는 2에 있어서, 상기 5' ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는 핵산.

5. 구현예 1 내지 4 중 어느 하나에 있어서, 상기 5' ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래된 핵산.

6. 구현예 1에 있어서, 상기 5’ ITR은 서열 번호 1의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

7. 구현예 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' ITR은 서열 번호 2의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

8. 구현예 1 내지 7 중 어느 하나에 있어서, 상기 3' ITR은 서열 번호 3의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

9. 구현예 1 내지 8 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터가 이식유전자의 발현을 구동하는 핵산.

10. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터인 핵산.

11. 구현예 1 내지 9 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인 핵산.

12. 구현예 1 내지 11 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터인 핵산.

13. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, EF-1 알파 코어 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제 (PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 핵산.

14. 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터인 핵산.

15. 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터는 EF-1 알파 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, 또는 EF-1 알파 코어 프로모터인 핵산.

16. 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터는 GUSB240 프로모터인 핵산.

17. 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터는 GUSB379 프로모터인 핵산.

18. 구현예 13에 있어서, 상기 프로모터는 PGK 프로모터인 핵산.

19. 구현예 1 내지 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 6-12 중 어느 하나로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

20. 구현예 1 내지 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 FXN 단백질은 인간 FXN 단백질인 핵산.

21. 구현예 1 내지 20 중 어느 하나에 있어서, 상기 FXN 단백질은 서열 번호 65의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 갖는 핵산.

22. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 CpG 최적화된 핵산.

23. 구현예 1 내지 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 서열 번호 19 또는 20, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

24. 구현예 1 내지 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 이식유전자 서열에 바로 5’인 코작 서열을 포함하는 핵산.

25. 구현예 24에 있어서, 상기 코작 서열은 서열 번호 17 또는 18의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

26. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40 (SV40), 인간 α-글로빈, 토끼 α-글로빈, 인간 β-글로빈, 토끼 β-글로빈, 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH)의 폴리아데닐화 신호로부터 선택된 핵산.

27. 구현예 26에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 핵산.

28. 구현예 26에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인 핵산.

29. 구현예 26에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호인 핵산.

30. 구현예 26에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호인 핵산.

31. 구현예 1 내지 25 중 어느 하나에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 21-24 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

32. 구현예 1 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 인핸서를 추가로 포함하는 핵산.

33. 구현예 32에 있어서, 상기 인핸서는 CMV 인핸서인 핵산.

34. 구현예 32에 있어서, 상기 인핸서는 서열 번호 4 또는 5의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

35. 구현예 1 내지 34 중 어느 하나에 있어서, 상기 카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는 핵산.

36. 구현예 35에 있어서, 상기 인트론 서열은 키메라 서열인 핵산.

37. 구현예 35에 있어서, 상기 인트론 서열은 하이브리드 서열인 핵산.

38. 구현예 35에 있어서, 상기 인트론 서열은 β-글로빈, 닭 베타-액틴, 미세 마우스 바이러스, 및 인간 IgG 중 하나 이상의 인트론 서열로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함하는 핵산.

39. 구현예 35에 있어서, 상기 인트론 서열은 서열 번호 13-16 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

40. 구현예 1 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산은 적어도 하나의 스터퍼 서열을 추가로 포함하는 핵산.

41. 구현예 40에 있어서, 상기 핵산은 2개의 스터퍼 서열을 포함하는 핵산.

42. 구현예 40에 있어서, 상기 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열 번호 25-27 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

43. 구현예 1에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는 핵산.

44. 구현예 1-43 중 어느 하나의 핵산을 포함하는 플라스미드.

45. 구현예 1-43 중 어느 하나의 핵산 또는 구현예 44의 플라스미드를 포함하는 세포.

46. 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 AAV 생산자 세포를 구현예 1-43 중 어느 하나의 핵산 또는 구현예 44의 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.

47. 구현예 46의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.

48. 구현예 47에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV (ssAAV)인 재조합 AAV 벡터.

49. 구현예 47에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터는 자가 상보성 AAV (scAAV)인 재조합 AAV 벡터.

50. 구현예 47-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터.

51. 구현예 47-49 중 어느 하나에 있어서, 상기 AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함하는 재조합 AAV 벡터.

52. 구현예 1-43 중 어느 하나의 핵산, 구현예 44의 플라스미드, 구현예 45의 세포, 또는 구현예 47-51 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.

53. 치료학적 유효량의 구현예 1-43 중 어느 하나의 핵산, 구현예 44의 플라스미드, 구현예 45의 세포, 또는 구현예 47-41 중 어느 하나의 재조합 AAV 벡터를 대상체에 대해 투여하는 것을 포함하는 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.

54. 구현예 53에 있어서, 상기 대상체는 프리드라이히 운동실조를 갖는 방법.

55. 구현예 53 또는 54에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인 방법.

56. 구현예 53-55 중 어느 하나에 있어서, 상기 핵산, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터는 중추 신경계로 직접 주사에 의해 투여되는 방법.

전술한 것은 본 발명의 예시이고, 이를 제한하는 것으로서 해석되어서는 안 된다. 본 발명은 청구 범위의 등가물이 그 안에 포함되는, 하기 청구 범위로 정의된다.

<110> StrideBio, Inc. <120> RECOMBINANT VIRAL VECTORS AND NUCLEIC ACIDS FOR PRODUCING THE SAME <130> STRD-011/01WO 331843-2071 <150> US 62/770,202 <151> 2018-11-21 <160> 70 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Dependoparvovirus Adeno-associated virus serotype 2 <400> 1 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc t 141 <210> 2 <211> 113 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' ITR <400> 2 ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag gtcgcccgac 60 gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag gga 113 <210> 3 <211> 141 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' ITR <400> 3 aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60 ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120 gagcgcgcag ctgcctgcag g 141 <210> 4 <211> 380 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cytomegalovirus sp. <400> 4 gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 60 catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 120 acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 180 ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 240 aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 300 ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 360 tagtcatcgc tattaccatg 380 <210> 5 <211> 286 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Cytomegalovirus sp. <400> 5 cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 60 gacgtcaata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 120 gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 180 cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttgtgcccag tacatgacct tatgggactt 240 tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatg 286 <210> 6 <211> 276 <212> DNA <213> Gallus gallus <400> 6 tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 60 ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 120 cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 180 gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 240 cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcg 276 <210> 7 <211> 227 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc 60 ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg 120 tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc 180 gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac gcgtaag 227 <210> 8 <211> 1182 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 gctccggtgc ccgtcagtgg gcagagcgca catcgcccac agtccccgag aagttggggg 60 gaggggtcgg caattgaacc ggtgcctaga gaaggtggcg cggggtaaac tgggaaagtg 120 atgtcgtgta ctggctccgc ctttttcccg agggtggggg agaaccgtat ataagtgcag 180 tagtcgccgt gaacgttctt tttcgcaacg ggtttgccgc cagaacacag gtaagtgccg 240 tgtgtggttc ccgcgggcct ggcctcttta cgggttatgg cccttgcgtg ccttgaatta 300 cttccacgcc cctggctgca gtacgtgatt cttgatcccg agcttcgggt tggaagtggg 360 tgggagagtt cgaggccttg cgcttaagga gccccttcgc ctcgtgcttg agttgaggcc 420 tggcctgggc gctggggccg ccgcgtgcga atctggtggc accttcgcgc ctgtctcgct 480 gctttcgata agtctctagc catttaaaat ttttgatgac ctgctgcgac gctttttttc 540 tggcaagata gtcttgtaaa tgcgggccaa gatctgcaca ctggtatttc ggtttttggg 600 gccgcgggcg gcgacggggc ccgtgcgtcc cagcgcacat gttcggcgag gcggggcctg 660 cgagcgcggc caccgagaat cggacggggg tagtctcaag ctggccggcc tgctctggtg 720 cctggcctcg cgccgccgtg tatcgccccg ccctgggcgg caaggctggc ccggtcggca 780 ccagttgcgt gagcggaaag atggccgctt cccggccctg ctgcagggag ctcaaaatgg 840 aggacgcggc gctcgggaga gcgggcgggt gagtcaccca cacaaaggaa aagggccttt 900 ccgtcctcag ccgtcgcttc atgtgactcc acggagtacc gggcgccgtc caggcacctc 960 gattagttct cgagcttttg gagtacgtcg tctttaggtt ggggggaggg gttttatgcg 1020 atggagtttc cccacactga gtgggtggag actgaagtta ggccagcttg gcacttgatg 1080 taattctcct tggaatttgc cctttttgag tttggatctt ggttcattct caagcctcag 1140 acagtggttc aaagtttttt tcttccattt caggtgtcgt ga 1182 <210> 9 <211> 212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EF1a core promoter <400> 9 gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa 60 ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc 120 gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc 180 tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac gc 212 <210> 10 <211> 511 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60 tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120 cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180 tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240 ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300 gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360 cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420 gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480 cgttgaccga atcaccgacc 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cagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcc 120 tttctctcca cag 133 <210> 26 <211> 500 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> A1AT stuffer <400> 26 agagacacag tttttgctct ggtgaattac atcttcttta aaggcaaatg ggagagaccc 60 tttgaagtca aggacacaga ggaagaggac ttcctagtgg accaggtgac caccttgaag 120 gtgcctatgt aaaagcattt aggcatgttt aacatccagc actgtaagaa gctgtccagc 180 tgggtgctgc tgtaaaaata cctgggcaat gccaccacca tcttcttcct gcctgatgag 240 gggaaactac agcacctgga aaatgaactc acccactata ttatcaccaa gttcctggaa 300 aatgaagaca gaaggtctgc cagcttacat ttacccaaac tgtcaattac tggaacctat 360 gatctgaaga gcttcctggg tcaactgggc atcactaagg tcttcagcaa tggggctgac 420 ctctcctggg tcacagagga ggcacccctg aagctctcca aggccttgca taaggctgtg 480 ctgaccatca ataagaaagg 500 <210> 27 <211> 502 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 taagtttttg tatgaatatg caagaaggca tcctgattac tctgtcttgc tgctgctgag 60 acttgccaag acctatgaaa ccactctaga gaagtgctgt gcctctgcag atcctcatga 120 atgctatgcc aaagtgttca gtgaatttaa 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gaaaaaccag aaagttcatg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 600 gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 660 tactgacatc cactttgcct ttctctccac agtactggta cccggagcag catgtggact 720 ctcgggcgcc gcgcagtagc cggcctcctg gcgtcaccca gcccagccca ggcccagacc 780 ctcacccggg tcccgcggcc ggcagagttg gccccactct gcggccgccg tggcctgcgc 840 accgacatcg atgcgacctg cacgccccgc cgcgcaagtt cgaaccaacg tggcctcaac 900 cagatttgga atgtcaaaaa gcagagtgtc tatttgatga atttgaggaa atctggaact 960 ttgggccacc caggctctct agatgagacc acctatgaaa gactagcaga ggaaacgctg 1020 gactctttag cagagttttt tgaagacctt gcagacaagc catacacgtt tgaggactat 1080 gatgtctcct ttgggagtgg tgtcttaact gtcaaactgg gtggagatct aggaacctat 1140 gtgatcaaca agcagacgcc aaacaagcaa atctggctat cttctccatc cagtggacct 1200 aagcgttatg actggactgg gaaaaactgg gtgtactccc acgacggcgt gtccctccat 1260 gagctgctgg ccgcagagct cactaaagcc ttaaaaacca aactggactt gtcttccttg 1320 gcctattccg gaaaagatgc ttgagatccg actgcaggta ggtttaaaca agcttggtac 1380 cgtgattaat cttcgaatga ctgacgggtg gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct 1440 cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 1500 catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 1560 gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 1620 ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 1680 tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 1740 atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 1800 ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 1860 cactgctccc ttccctgtcc ttagatctgt gtgttggttt tttgtgtgag aacagaacta 1920 ccaggtttag aaccatgggc aagacataga tgactagtcc actccctctc tgcgcgctcg 1980 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 2040 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg a 2071 <210> 62 <211> 2071 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Cassette <400> 62 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtgttgac agacctccta ggaggactgc ttgtatgcat 180 gcttttgcta agtactcaag aggttctggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc 240 acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg 300 cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg 360 ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc 420 gccagaacac gcgtaagggc taattccagc acactggctg ctgttactag agccatgcat 480 agtgaacctt cagatagaca tccagcctct ggactctagt gatcaggtac tagaggaact 540 gaaaaaccag aaagttcatg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 600 gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 660 tactgacatc cactttgcct ttctctccac agtactggta cccggagcag catgtggact 720 ctggggagga gagcagtagc tggcctcctg gcatcaccca gcccagccca ggcccagacc 780 ctcaccaggg tccctagacc agcagagttg gccccactct gtggcaggag aggcctgagg 840 acagacattg atgccacctg cacccccagg agagcaagtt ccaaccaaag aggcctcaac 900 cagatttgga atgtcaaaaa gcagagtgtc tatttgatga atttgaggaa atctggaact 960 ttgggccacc caggctctct agatgagacc acctatgaaa gactagcaga ggaaacactg 1020 gactctttag cagagttttt tgaagacctt gcagacaagc catacacctt tgaggactat 1080 gatgtctcct ttgggagtgg tgtcttaact gtcaaactgg gtggagatct aggaacctat 1140 gtgatcaaca agcagactcc aaacaagcaa atctggctat cttctccatc cagtggacct 1200 aagaggtatg actggactgg gaaaaactgg gtgtactccc atgatggagt gtccctccat 1260 gagctgctgg ctgcagagct cactaaagcc ttaaaaacca aactggactt gtcttccttg 1320 gcctattctg gaaaagatgc ttgagatccg actgcaggta ggtttaaaca agcttggtac 1380 cgtgattaat cttcgaatga ctgacgggtg gcatccctgt gacccctccc cagtgcctct 1440 cctggccctg gaagttgcca ctccagtgcc caccagcctt gtcctaataa aattaagttg 1500 catcattttg tctgactagg tgtccttcta taatattatg gggtggaggg gggtggtatg 1560 gagcaagggg caagttggga agacaacctg tagggcctgc ggggtctatt gggaaccaag 1620 ctggagtgca gtggcacaat cttggctcac tgcaatctcc gcctcctggg ttcaagcgat 1680 tctcctgcct cagcctcccg agttgttggg attccaggca tgcatgacca ggctcagcta 1740 atttttgttt ttttggtaga gacggggttt caccatattg gccaggctgg tctccaactc 1800 ctaatctcag gtgatctacc caccttggcc tcccaaattg ctgggattac aggcgtgaac 1860 cactgctccc ttccctgtcc ttagatctgt gtgttggttt tttgtgtgag aacagaacta 1920 ccaggtttag aaccatgggc aagacataga tgactagtcc actccctctc tgcgcgctcg 1980 ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc 2040 ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg a 2071 <210> 63 <211> 2072 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Cassette <400> 63 cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60 gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120 actccatcac taggggttcc ttgtgttgac agacctccta ggaggactgc ttgtatgcat 180 gcttttgcta agtactcaag aggttctggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc 240 acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg 300 cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg 360 ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc 420 gccagaacac gcgtaagggc taattccagc acactggctg ctgttactag agccatgcat 480 agtgaacctt cagatagaca tccagcctct ggactctagt gatcaggtac tagaggaact 540 gaaaaaccag aaagttcatg taagtatcaa ggttacaaga caggtttaag gagaccaata 600 gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct 660 tactgacatc cactttgcct ttctctccac agtactggta cccacagcca ccatgtggac 720 tctcgggcgc cgcgcagtag ccggcctcct ggcgtcaccc agcccagccc aggcccagac 780 cctcacccgg gtcccgcggc cggcagagtt ggccccactc tgcggccgcc gtggcctgcg 840 caccgacatc gatgcgacct gcacgccccg ccgcgcaagt tcgaaccaac gtggcctcaa 900 ccagatttgg aatgtcaaaa agcagagtgt ctatttgatg aatttgagga aatctggaac 960 tttgggccac ccaggctctc tagatgagac cacctatgaa agactagcag aggaaacgct 1020 ggactcttta gcagagtttt ttgaagacct tgcagacaag ccatacacgt ttgaggacta 1080 tgatgtctcc tttgggagtg gtgtcttaac tgtcaaactg ggtggagatc taggaaccta 1140 tgtgatcaac aagcagacgc caaacaagca aatctggcta tcttctccat ccagtggacc 1200 taagcgttat gactggactg ggaaaaactg ggtgtactcc cacgacggcg tgtccctcca 1260 tgagctgctg gccgcagagc tcactaaagc cttaaaaacc aaactggact tgtcttcctt 1320 ggcctattcc ggaaaagatg cttgagatcc gactgcaggt aggtttaaac aagcttggta 1380 ccgtgattaa tcttcgaatg actgacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 1440 tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 1500 gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 1560 ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa 1620 gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga 1680 ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct 1740 aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact 1800 cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa 1860 ccactgctcc cttccctgtc cttagatctg tgtgttggtt ttttgtgtga gaacagaact 1920 accaggttta gaaccatggg caagacatag atgactagtc cactccctct ctgcgcgctc 1980 gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2040 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg ga 2072 <210> 64 <211> 2072 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AAV Transfer Cassette 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gatgccacct gcacccccag gagagcaagt tccaaccaaa gaggcctcaa 900 ccagatttgg aatgtcaaaa agcagagtgt ctatttgatg aatttgagga aatctggaac 960 tttgggccac ccaggctctc tagatgagac cacctatgaa agactagcag aggaaacact 1020 ggactcttta gcagagtttt ttgaagacct tgcagacaag ccatacacct ttgaggacta 1080 tgatgtctcc tttgggagtg gtgtcttaac tgtcaaactg ggtggagatc taggaaccta 1140 tgtgatcaac aagcagactc caaacaagca aatctggcta tcttctccat ccagtggacc 1200 taagaggtat gactggactg ggaaaaactg ggtgtactcc catgatggag tgtccctcca 1260 tgagctgctg gctgcagagc tcactaaagc cttaaaaacc aaactggact tgtcttcctt 1320 ggcctattct ggaaaagatg cttgagatcc gactgcaggt aggtttaaac aagcttggta 1380 ccgtgattaa tcttcgaatg actgacgggt ggcatccctg tgacccctcc ccagtgcctc 1440 tcctggccct ggaagttgcc actccagtgc ccaccagcct tgtcctaata aaattaagtt 1500 gcatcatttt gtctgactag gtgtccttct ataatattat ggggtggagg ggggtggtat 1560 ggagcaaggg gcaagttggg aagacaacct gtagggcctg cggggtctat tgggaaccaa 1620 gctggagtgc agtggcacaa tcttggctca ctgcaatctc cgcctcctgg gttcaagcga 1680 ttctcctgcc tcagcctccc gagttgttgg gattccaggc atgcatgacc aggctcagct 1740 aatttttgtt tttttggtag agacggggtt tcaccatatt ggccaggctg gtctccaact 1800 cctaatctca ggtgatctac ccaccttggc ctcccaaatt gctgggatta caggcgtgaa 1860 ccactgctcc cttccctgtc cttagatctg tgtgttggtt ttttgtgtga gaacagaact 1920 accaggttta gaaccatggg caagacatag atgactagtc cactccctct ctgcgcgctc 1980 gctcgctcac tgaggccggg cgaccaaagg tcgcccgacg cccgggcttt gcccgggcgg 2040 cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg ga 2072 <210> 65 <211> 210 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Met Trp Thr Leu Gly Arg Arg Ala Val Ala Gly Leu Leu Ala Ser Pro 1 5 10 15 Ser Pro Ala Gln Ala Gln Thr Leu Thr Arg Val Pro Arg Pro Ala Glu 20 25 30 Leu Ala Pro Leu Cys Gly Arg Arg Gly Leu Arg Thr Asp Ile Asp Ala 35 40 45 Thr Cys Thr Pro Arg Arg Ala Ser Ser Asn Gln Arg Gly Leu Asn Gln 50 55 60 Ile Trp Asn Val Lys Lys Gln Ser Val Tyr Leu Met Asn Leu Arg Lys 65 70 75 80 Ser Gly Thr Leu Gly His Pro Gly Ser Leu Asp Glu Thr Thr Tyr Glu 85 90 95 Arg Leu Ala Glu Glu Thr Leu Asp Ser Leu Ala Glu Phe Phe Glu Asp 100 105 110 Leu Ala Asp Lys Pro Tyr Thr Phe Glu Asp Tyr Asp Val Ser Phe Gly 115 120 125 Ser Gly Val Leu Thr Val Lys Leu Gly Gly Asp Leu Gly Thr Tyr Val 130 135 140 Ile Asn Lys Gln Thr Pro Asn Lys Gln Ile Trp Leu Ser Ser Pro Ser 145 150 155 160 Ser Gly Pro Lys Arg Tyr Asp Trp Thr Gly Lys Asn Trp Val Tyr Ser 165 170 175 His Asp Gly Val Ser Leu His Glu Leu Leu Ala Ala Glu Leu Thr Lys 180 185 190 Ala Leu Lys Thr Lys Leu Asp Leu Ser Ser Leu Ala Tyr Ser Gly Lys 195 200 205 Asp Ala 210 <210> 66 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 66 accatgg 7 <210> 67 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 67 gccgccacca tgg 13 <210> 68 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 68 gccgccgcca tgg 13 <210> 69 <211> 9 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 69 ccaccatgg 9 <210> 70 <211> 8 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kozak sequence <400> 70 ccaccatg 8

Claims (56)

1. 핵산으로서, 5’에서 3’로
   5' 역위 말단 반복 (ITR);
   프로모터;
   이식유전자 서열;
   폴리아데닐화 신호; 및
   3' ITR를 포함하고;
   상기 이식유전자 서열은 프라탁신 (FXN) 단백질을 인코딩하는, 핵산.
2. 제1항에 있어서, 상기 5’ ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 약 110 내지 약 160 뉴클레오티드 길이인, 핵산.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 5’ ITR은 3' ITR 과 동일한 길이인, 핵산.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 5’ ITR 및 3' ITR은 상이한 길이를 갖는, 핵산.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 5’ ITR 및 3' ITR 중 적어도 하나는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 게놈으로부터 단리되거나 유래된, 핵산.
6. 제1항에 있어서, 상기 5’ ITR은 서열 번호 1의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 서열 번호 2의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 3' ITR은 서열 번호 3의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 이식유전자의 발현을 구동하는, 핵산.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 구성적 프로모터인, 핵산.
11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 유도성 프로모터인, 핵산.
12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 조직 특이적 프로모터인, 핵산.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 CMV 프로모터, SV40 초기 프로모터, SV40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 바이러스 (MMTV) 프로모터, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터, EF-1 알파 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, EF-1 알파 코어 프로모터, 디히드로폴레이트 환원효소 (DHFR) 프로모터, GUSB240 프로모터, GUSB379 프로모터, 및 포스포글리세롤 키나아제 (PGK) 프로모터로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 핵산.
14. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는 닭 β-액틴 (CBA) 프로모터인, 핵산.
15. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는 EF-1 알파 프로모터, EF-1 알파 짧은 프로모터, 또는 EF-1 알파 코어 프로모터인, 핵산.
16. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는 GUSB240 프로모터인, 핵산.
17. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는 GUSB379 프로모터인, 핵산.
18. 제13항에 있어서, 상기 프로모터는 PGK 프로모터인, 핵산.
19. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터는 서열 번호 6-12 중 어느 하나로부터 선택된 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질은 인간 FXN 단백질인, 핵산.
21. 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 FXN 단백질은 서열 번호 65의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 갖는, 핵산.
22. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 CpG 최적화된, 핵산.
23. 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이식유전자 서열은 서열 번호 19 또는 20, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
24. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 이식유전자 서열에 바로 5’인 코작 서열을 포함하는, 핵산.
25. 제24항에 있어서, 상기 코작 서열은 서열 번호 17 또는 18의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 시미안 바이러스 40 (SV40), 인간 α-글로빈, 토끼 α-글로빈, 인간 β-글로빈, 토끼 β-글로빈, 인간 콜라겐, 폴리오마 바이러스, 인간 성장 호르몬 (hGH) 및 소 성장 호르몬 (bGH)의 폴리아데닐화 신호로부터 선택된, 핵산.
27. 제26항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 핵산.
28. 제26항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 신호인, 핵산.
29. 제26항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호인, 핵산
30. 제26항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 토끼 β-글로빈 폴리아데닐화 신호인, 핵산.
31. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 폴리아데닐화 신호는 서열 번호 21-24 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
32. 제1항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 인핸서를 추가로 포함하는, 핵산.
33. 제32항에 있어서, 상기 인핸서는 CMV 인핸서인, 핵산.
34. 제32항에 있어서, 상기 인핸서는 서열 번호 4 또는 5의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
35. 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 카세트는 인트론 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
36. 제35항에 있어서, 상기 인트론 서열은 키메라 서열인, 핵산.
37. 제35항에 있어서, 상기 인트론 서열은 하이브리드 서열인, 핵산.
38. 제35항에 있어서, 상기 인트론 서열은 β-글로빈, 닭 베타-액틴, 미세 마우스 바이러스, 및 인간 IgG 중 하나 이상의 인트론 서열로부터 단리되거나 유래된 서열을 포함하는, 핵산.
39. 제35항에 있어서, 상기 인트론 서열은 서열 번호 13-16 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
40. 제1항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산은 적어도 하나의 스터퍼 서열을 추가로 포함하는, 핵산.
41. 제40항에 있어서, 상기 핵산은 2개의 스터퍼 서열을 포함하는, 핵산.
42. 제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 스터퍼 서열은 서열 번호 25-27 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
43. 제1항에 있어서, 상기 핵산은 서열 번호 28-64 중 어느 하나의 서열, 또는 이와 적어도 95% 동일한 서열을 포함하는, 핵산.
44. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산을 포함하는 플라스미드.
45. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산 또는 제44항의 플라스미드를 포함하는 세포.
46. 재조합 AAV 벡터를 생산하는 방법으로서, AAV 생산자 세포를 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산과 또는 제44항의 플라스미드와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
47. 제46항의 방법에 의해 생산된 재조합 AAV 벡터.
48. 제47항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터는 단일 가닥 AAV (ssAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
49. 제47항에 있어서, 상기 재조합 AAV 벡터는 자가 상보성 AAV (scAAV)인, 재조합 AAV 벡터.
50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11, AAV12, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh32.33, AAVrh74, 조류 AAV 또는 소 AAV의 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
51. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 AAV 벡터는 야생형 AAV 캡시드 단백질에 비해 하나 이상의 치환 또는 돌연변이를 갖는 캡시드 단백질을 포함하는, 재조합 AAV 벡터.
52. 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산, 제44항의 플라스미드, 제45항의 세포, 또는 제47항 내지 제51항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 포함하는 조성물.
53. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제43항 중 어느 한 항의 핵산, 제44항의 플라스미드, 제45항의 세포, 또는 제47항 내지 제41항 중 어느 한 항의 재조합 AAV 벡터를 대상체에 대해 투여하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 대상체는 프리드라이히 운동실조를 갖는, 방법.
55. 제53항 또는 제54항에 있어서, 상기 대상체는 인간 대상체인, 방법.
56. 제53항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 핵산, 플라스미드, 세포, 또는 재조합 AAV 벡터는 중추 신경계로 직접 주사에 의해 투여되는, 방법.

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