CN112533645A - 通过因子viii的表达改善临床参数 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于肝特异性表达转基因的构建体。

Description

通过因子VIII的表达改善临床参数

相关专利申请的交叉引用

本申请要求于2018年8月3日提交的美国临时专利申请第62/714,553号的优先权；2019年3月29日提交的美国临时专利申请第62/826,887号；申请日为2019年7月1日的美国临时专利申请第62/869,445号，通过引用将其全部内容合并入本文。

序列表

本申请包含序列表，该序列表已经以ASCII格式电子提交，并且通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2019年8月1日，名称为1147465_SL.txt，大小为28207字节。

发明背景

基因疗法可以用于遗传改造细胞以具有一个或多个失活的基因和/或使该细胞表达该细胞先前未产生的产物(例如，通过转基因插入和/或通过内源序列校正)。转基因插入的用途的实例包括插入编码一种或多种新型治疗性蛋白质的一种或多种基因，插入编码细胞或个体中缺乏的蛋白质的编码序列，将野生型基因插入含有突变的基因序列的细胞中，和/或插入编码结构核酸(例如microRNA或siRNA)的序列。内源基因序列的“校正”的有用应用的实例包括疾病相关基因突变的改变，编码剪接位点的序列的改变，调控序列的改变和/或编码蛋白质的结构特征的序列的定向改变。

肝基因转移提供了将转基因递送至受试者以治疗和/或预防各种病症(包括血友病(hemophilias)和溶酶体贮积病症(lysosomal storage disorders))的有效手段。参见，例如，美国专利号9,150,847和美国公开号20130177983和20140017212。还已经描述了针对肝定向基因治疗的特异性载体。参见，例如，WO 2014064277；WO 2009130208；EP2451474B1，Chuah et al.,(2014)Molecular Therapy,22,1605-1613；和’Nair et al.(2014)Blood 123:3195-3199。这些载体可以包括野生型小鼠微小病毒(MVM)内含子序列。参见，例如Haut and Pintel(1998)J.Virol.72:1834-1843；Haut and Pintel(1998)Virol.258:84-94。

诸如A型血友病和B型血友病的血友病是血液凝固系统的遗传性病症，其特征在于出血到关节和软组织，以及过度出血到遭受创伤或经受手术的任何部位。A型血友病在临床上与B型血友病没有区别，但A型血友病中缺乏或不存在VIII因子(FVIII或F8)，而B型血友病患者中缺乏或不存在IX因子(FIX或F.IX)。F8基因编码血浆糖蛋白，其以非活性形式与冯·威利布兰德(von Wilebrand)因子缔合而循环。表面损伤后，固有的凝血级联反应启动，并且FVIII从复合物中释放出来并被激活。激活的形式与因子IX一起激活因子X成为激活的Xa，最终导致纤维蛋白原(fibrinogen)转变为纤维蛋白(fibrin)并诱发血凝块。参见，Levinson et al.(1990)Genomics 7(1):1-11。40-50％的A型血友病患者具有涉及F8内含子22(也称为IVS22)的染色体倒置。该倒置是由F8基因的内含子22内的9.6kb序列与位于F8基因远端约300kb的两个紧密相关的反向定向序列之一之间的染色体内重组事件引起的，从而导致外显子1至22关于外显子23至26倒置，参见Textbook of Hemophilia.Lee et al.(eds)2005,Blackwell Publishing。其他A型血友病患者具有F8缺陷，包括活性位点突变，以及无义和错义突变。

在临床上，A型血友病患者是根据患者具有出血事件(bleeding episode)的频率以及那些事件的持续时间进行评估和分层(stratify)。这两个特征都直接取决于患者血液中FVIII蛋白的量。重度血友病患者通常具有低于正常血液水平的1％的FVIII，受伤后经历出血，并经常自发出血到关节。中度患者具有正常FVIII水平的1-5％而轻度患者具有正常FVIII的6％或更多，并且只有在严重受伤、外伤或手术后才会具有出血事件(Kulkami etal.(2009)Haemophilia 15:1281-90)。用源自人血浆或重组产生的替代FVIII蛋白(通常称为“因子”)治疗A型血友病患者，其中治疗的频率取决于出血模式和血友病的严重程度。患有重度A型血友病的患者定期接受预防性治疗，以防止发生出血，而较轻度的患者只能在受伤后根据需要接受治疗。

已经描述了针对A型或B型血友病患者的基因疗法，包括引入质粒和编码功能性FVIII或F.IX蛋白的其他载体(例如AAV)。(参见，例如，美国专利号6,936,243；7,238,346和6,200,560；Shi et al.(2007)J Thromb Haemost.(2):352-61；Lee et al.(2004)Pharm.Res.7:1229-1232；Graham et al.(2008)Genet Vaccines Ther.3:6-9；Manno etal.(2003)Blood 101(8):2963-72；Manno et al.(2006)Nature Medicine 12(3):342-7；Nathwani et al.(2011)Mol Ther 19(5):876-85；Nathwani et al.(201 1)；N Engl JMed.365(25):2357-65和Mcintosh et al.(2013)Blood 121(17):3335-44)。

发明概述

公开了表达因子VIII的AAV载体和血友病的治疗方法以及其他方面。在一些实施方案中，提供了向人提供因子VIII(FVIII)蛋白的方法。在一些实施方案中，该方法包括对人施用一个或多个剂量的6x10¹¹至1x10¹³或3x10¹³、1x10¹³至1x10¹⁴或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg的如本文所述的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，其中AAV载体的施用导致人中因子VIII蛋白的产生。在一些实施方案中，剂量是9×10¹¹vg/kg，2×10¹²vg/kg，1×10¹³vg/kg，2×10¹³vg/kg，3×10¹³vg/kg或4×10¹³vg/kg。在一些实施方案中，AAV载体具有AAV6血清型，其包含核苷酸序列，所述核苷酸序列包含AAV2反向末端重复序列，所述AAV2反向末端重复序列在表达盒侧翼，所述表达盒包含与肝特异性增强子和与编码SEQ ID NO：1的多核苷酸可操作连接的启动子。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在施用之前和之后测量人血液中的FVIII蛋白。

在一些实施方案中，例如以1x10¹³vg/kg至3x10¹³或1x10¹³至1x10¹⁴，或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg的剂量施用AAV载体导致相对于患者在施用前评估的患者循环FVIII活性，临床上相关的FVIII活性的增加为5％至150％或更高的范围。在一些实施方案中，例如以3×10¹³vg/kg的剂量施用AAV载体导致临床上相关的FVIII活性增加20％至150％或更大的范围。在一些实施方案中，施用导致在3-12个月(或例如3-6个月，3个月–1、2、5或10年或更长时间)之间人受试者中自发性出血事件一次或零次发生。

在一些实施方案中，本文提供了在人受试者中增加因子VIII(FVIII)蛋白的方法，包括向人受试者施用一剂或者多剂的2x10¹²vg/kg至3x10¹³或1x10¹³至1x10¹⁴，或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，它编码FVIII蛋白(任选地包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)，其中AAV载体的施用导致临床相关的循环FVIII活性水平的增加，例如增加5％至150％；或增加50％至150％。在一些实施方案中，向患者施用的一剂或者多剂的因子VIII是在1×10¹³vg/kg至3×10¹³vg/kg的范围内。在一些实施方案中，AAV载体具有AAV6血清型。在一些实施方案中，AAV载体包含表达盒，该表达盒包含可操作连接至肝特异性增强子和启动子的编码FVIII蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，肝特异性增强子是Serpin 1增强子和/或启动子是运甲状腺素蛋白(transthyretin)最小启动子。在一些实施方案中，肝特异性增强子包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和/或启动子包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在一些实施方案中，AAV载体包含在表达盒侧翼的AAV2 5'反向末端重复(ITR)序列和AAV2 3'ITR序列。在一些实施方案中，AAV25’ITR包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列和/或AAV2 3’ITR包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。在一些实施方案中，表达盒的序列包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一些实施方案中，人受试者患有血友病。

在一些实施方案中，本文提供了在人受试者中增加因子VIII(FVIII)蛋白的方法，包括对人受试者施用一剂或者多剂的2x10¹²vg/kg至3x10¹³或1x10¹³至1x10¹⁴，或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，它编码FVIII蛋白(任选地包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列)，其中AAV载体的施用导致人受试者接受FVIII治疗的次数减少。在一些实施方案中，人受试者在施用后3-12个月(或例如3-6个月，3个月-1、2、5或10年或更长时间)没有接受任何FVIII治疗。在一些实施方案中，向患者施用的一剂或者多剂的因子VIII是在1×10¹³vg/kg至3×10¹³vg/kg的范围内。在一些实施方案中，AAV载体具有AAV6血清型。在一些实施方案中，AAV载体包含表达盒，该表达盒包含可操作连接至肝特异性增强子和启动子的编码FVIII蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，肝特异性增强子是Serpin 1增强子和/或启动子是运甲状腺素蛋白最小启动子。在一些实施方案中，肝特异性增强子包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和/或启动子包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。在一些实施方案中，AAV载体包含在所述表达盒侧翼的AAV2 5'反向末端重复(ITR)序列和AAV23'ITR序列。在一些实施方案中，AAV2 5’ITR包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列和/或AAV2 3’ITR包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。在一些实施方案中，表达盒的序列包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。在一些实施方案中，人受试者患有血友病。

在一些实施方案中，例如以2x10¹²vg/kg至3x10¹³或1x10¹³至1x10¹⁴，或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg的范围的剂量施用AAV载体导致FVIII治疗的使用减少，例如，患者每周或每月接受FVIII注射的次数减少。在一些实施方案中，FVIII的使用减少了至少20％。在其他实施方案中，FVIII的使用减少了至少50％。在一些实施方案中，FVIII的使用减少了90％或更多。

在一些实施方案中，在施用前，人具有低于正常人循环FVIII活性的1％，且在施用人后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周，人具有正常人循环FVIII活性的至少1％。

在一些实施方案中，在施用前，人具有低于正常人循环FVIII活性的5％，且在施用人后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周，人具有正常人循环FVIII活性的至少5％。

在一些实施方案中，人在施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周显示出丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，胆红素，碱性磷酸酶或白蛋白中的至少一种的正常值(ULN)的上限的1.5倍以下。

在一些实施方案中，人在施用后4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周没有可检测水平的FVIII抑制剂。

在一些实施方案中，待施用AAV载体的受试者经历预防性类固醇治疗。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在施用前以及施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周，测量冯·威利布兰德因子(vWF)，可溶性表皮生长因子受体(sEGFR)，半乳凝素3结合蛋白(GAL3BP)，C反应蛋白(CRP)，IL-6，循环甲胎蛋白的至少一种的水平。

在一些实施方案中，血管性血友病因子(vWF)，可溶性表皮生长因子受体(sEGFR)，半乳凝素-3结合蛋白(GAL3BP)，C反应蛋白(CRP)，IL-6，循环甲胎蛋白在施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周内的水平不超过施用前两周内水平的1.5倍。

在一些实施方案中，人在施用后显现较少的出血事件。在一些实施方案中，人在施用后具有10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的较少的出血事件。

在一些实施方案中，人显现出减少的用替代因子VIII蛋白治疗的需求。在一些实施方案中，人在施用后需要10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％的用替代因子VIII蛋白的治疗减少。

在一些实施方案中，人具有血友病。

在一些实施方案中，核苷酸序列包含SEQ ID NO：5。在一些实施方案中，AAV2反向末端重复序列是SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。

附图简述

图1示出了使用如实施例1中所述的生色测定法来自实施例6的FVIII活性数据。

图2示出了使用实施例1中所述的生色测定法，来自实施例6的FVIII活性数据。

图3示出了使用如实施例1中所述的一阶段凝血测定法，来自实施例6的FVIII活性数据。

图4显示基于实施例1中所述的一阶段凝血测定法，在用载体治疗后的十位患者中随时间变化的FVIII活性。

图5示出了在十名患者中用载体治疗后随时间变化，基于实施例1中描述的生色测定法的FVIII活性。

图6示出了在所示剂量的载体施用后至少3周患者自发性出血事件的数据。

图7示出了载体注射后三周或更长时间的患者使用FVIII的情况。

图8提供了严重不良事件(SAE)概述。

图9提供了与治疗有关的不良事件(AE)概述。

图10提供了结果概述。

发明详述

引言

发明人发现某些表达因子VIII(FVIII)的AAV载体可有效地在人类(包括患有血友病的人类)中产生增加的FVIII活性。例如，已经发现，在一些实施方案中，如本文所述的AAV载体的施用导致循环FVIII活性从小于1％的正常FVIII活性升高至至少1％，并且在一些实施方案中升高至至少2、3、4或5％的正常FVIII活性。此外，在一些实施方案中，如本文所述，在人中循环FVIII活性增加而对肝功能或其他生物标志物几乎没有或没有副作用。对于大多数患者，当载体的施用浓度为1x10¹³vg/kg或以上时，施用后3周(或3周以上)的出血事件率降至零，这表明浓度为1x10¹³vg/kg或以上(例如，1x10¹³vg/kg到1x10¹⁴vg/kg，例如2-4x10¹³vg/kg)导致高效治疗。因此，在一些实施方案中，以这些浓度接受载体的患者不需要进一步的FVIII输注，或至少在载体施用后3、6、9或12个月内不需要它们。

提供了编码FVIII的腺伴随病毒(AAV)载体。示例性的AAV载体是AAV6血清型的，并且包括位于表达盒侧翼的反向重复(ITR)序列，所述表达盒包含与内含子和编码FVIII的多核苷酸可操作连接的肝特异性增强子和启动子。示例性的FVIII是SEQ ID NO：1。在一些实施方案中，ITR序列是AAV2ITR，因此该载体可以被称为“AAV2/6”载体。关于AAV血清型的基因组序列和对基因组相似性的讨论，参见，例如，GenBank登录号AF028704.1；GenBank登录号J01901.1；Chiorini et al.，J.Vir.71:6823-33(1997)；Srivastava et al.，J.Vir.45:555-64(1983)；Chiorini et al.，J.Vir.73:1309-1319(1999)；Rutledge et al.,J.Vir.72:309-319(1998)；和Wu et al.，J.Vir.74:8635-47(2000)。示例性AAV2 ITR序列为：

AAV2 5’ITR:

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCAAAGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:12).

AAV2 3’ITR:

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG(SEQ ID NO:13).

示例性的肝特异性增强子包括例如野生型或突变的Serpin1增强子，并且示例性的启动子是运甲状腺素蛋白最小(TTRm)启动子。因此，在一些实施方案中，AAV载体是AAV2/6载体，其包含在野生型或突变的Serpin1增强子侧翼的AAV2 ITR序列，所述野生型或突变的Serpin1增强子与可操作连接至编码FVIII的多核苷酸的TTRm启动子相连(例如，SEQ IDNO：1)。示例性载体序列描述于例如WO 2017/074526。

SEQ ID NO：1显示具有信号肽的人FVIII氨基酸序列：

MQIELSTCFFLCLLRFCFSATRRYYLGAVELSWDYMQSDLGELPVDARFPPRVPKSFPFNTSVVYKKTLFVEFTDHLFNIAKPRPPWMGLLGPTIQAEVYDTVVITLKNMASHPVSLHAVGVSYWKASEGAEYDDQTSQREKEDDKVFPGGSHTYVWQVLKENGPMASDPLCLTYSYLSHVDLVKDLNSGLIGALLVCREGSLAKEKTQTLHKFILLFAVFDEGKSWHSETKNSLMQDRDAASARAWPKMHTVNGYVNRSLPGLIGCHRKSVYWHVIGMGTTPEVHSIFLEGHTFLVRNHRQASLEISPITFLTAQTLLMDLGQFLLFCHISSHQHDGMEAYVKVDSCPEEPQLRMKNNEEAEDYDDDLTDSEMDVVRFDDDNSPSFIQIRSVAKKHPKTWVHYIAAEEEDWDYAPLVLAPDDRSYKSQYLNNGPQRIGRKYKKVRFMAYTDETFKTREAIQHESGILGPLLYGEVGDTLLIIFKNQASRPYNIYPHGITDVRPLYSRRLPKGVKHLKDFPILPGEIFKYKWTVTVEDGPTKSDPRCLTRYYSSFVNMERDLASGLIGPLLICYKESVDQRGNQIMSDKRNVILFSVFDENRSWYLTENIQRFLPNPAGVQLEDPEFQASNIMHSINGYVFDSLQLSVCLHEVAYWYILSIGAQTDFLSVFFSGYTFKHKMVYEDTLTLFPFSGETVFMSMENPGLWILGCHNSDFRNRGMTALLKVSSCDKNTGDYYEDSYEDISAYLLSKNNAIEPRSFSQNPPVLKRHQREITRTTLQSDQEEIDYDDTISVEMKKEDFDIYDEDENQSPRSFQKKTRHYFIAAVERLWDYGMSSSPHVLRNRAQSGSVPQFKKVVFQEFTDGSFTQPLYRGELNEHLGLLGPYIRAEVEDNIMVTFRNQASRPYSFYSSLISYEEDQRQGAEPRKNFVKPNETKTYFWKVQHHMAPTKDEFDCKAWAYFSDVDLEKDVHSGLIGPLLVCHTNTLNPAHGRQVTVQEFALFFTIFDETKSWYFTENMERNCRAPCNIQMEDPTFKENYRFHAINGYIMDTLPGLVMAQDQRIRWYLLSMGSNENIHSIHFSGHVFTVRKKEEYKMALYNLYPGVFETVEMLPSKAGIWRVECLIGEHLHAGMSTLFLVYSNKCQTPLGMASGHIRDFQITASGQYGQWAPKLARLHYSGSINAWSTKEPFSWIKVDLLAPMIIHGIKTQGARQKFSSLYISQFIIMYSLDGKKWQTYRGNSTGTLMVFFGNVDSSGIKHNIFNPPIIARYIRLHPTHYSIRSTLRMELMGCDLNSCSMPLGMESKAISDAQITASSYFTNMFATWSPSKARLHLQGRSNAWRPQVNNPKEWLQVDFQKTMKVTGVTTQGVKSLLTSMYVKEFLISSSQDGHQWTLFFQNGKVKVFQGNQDSFTPVVNSLDPPLLTRYLRIHPQSWVHQIALRMEVLGCEAQDLY。

SEQ ID NO:1的信号肽部分是MQIELSTCFFLCLLRFCFS(SEQ ID NO:14)，其在蛋白质分泌时被切割掉。

例如，示例性的SERPIN1增强子是

GGGGGAGGCTGCTGGTGAATATTAACCAAGATCACCCCAGTTACCGGAGGAGCAAACAGGGACTAAGTTCACACGCGTGGTACC(SEQ ID NO:2)。

示例性的TTRm启动子是

GTCTGTCTGCACATTTCGTAGAGCGAGTGTTCCGATACTCTAATCTCCCTAGGCAAGGTTCATATTTGTGTAGGTTACTTATTCTCCTTTTGTTGACTAAGTCAATAATCAGAATCAGCAGGTTTGGAGTCAGCTTGGCAGGGATCAGCAGCCTGGGTTGGAAGGAGGGGGTATAAAAGCCCCTTCACCAGGAGAAGCCGTCACACAGATCCACAAGCTCCTG(SEQ ID NO:3)。

FVIII的示例性的编码序列是：

ATGCAGATCGAGCTCTCCACCTGCTTCTTTCTGTGCCTGTTGAGATTCTGCTTCAGCGCCACCAGGAGATACTACCTGGGGGCTGTGGAGCTGAGCTGGGACTACATGCAGTCTGACCTGGGGGAGCTGCCTGTGGATGCCAGGTTCCCCCCCAGAGTGCCCAAGAGCTTCCCCTTCAACACCTCTGTGGTGTACAAGAAGACCCTGTTTGTGGAGTTCACTGACCACCTGTTCAACATTGCCAAGCCCAGGCCCCCCTGGATGGGCCTGCTGGGCCCCACCATCCAGGCTGAGGTGTATGACACTGTGGTGATCACCCTGAAGAACATGGCCAGCCACCCTGTGAGCCTGCATGCTGTGGGGGTGAGCTACTGGAAGGCCTCTGAGGGGGCTGAGTATGATGACCAGACCAGCCAGAGGGAGAAGGAGGATGACAAGGTGTTCCCTGGGGGCAGCCACACCTATGTGTGGCAGGTGCTGAAGGAGAATGGCCCCATGGCCTCTGACCCCCTGTGCCTGACCTACAGCTACCTGAGCCATGTGGACCTGGTGAAGGACCTGAACTCTGGCCTGATTGGGGCCCTGCTGGTGTGCAGGGAGGGCAGCCTGGCCAAGGAGAAGACCCAGACCCTGCACAAGTTCATCCTGCTGTTTGCTGTGTTTGATGAGGGCAAGAGCTGGCACTCTGAAACCAAGAACAGCCTGATGCAGGACAGGGATGCTGCCTCTGCCAGGGCCTGGCCCAAGATGCACACTGTGAATGGCTATGTGAACAGGAGCCTGCCTGGCCTGATTGGCTGCCACAGGAAGTCTGTGTACTGGCATGTGATTGGCATGGGCACCACCCCTGAGGTGCACAGCATCTTCCTGGAGGGCCACACCTTCCTGGTCAGGAACCACAGGCAGGCCAGCCTGGAGATCAGCCCCATCACCTTCCTGACTGCCCAGACCCTGCTGATGGACCTGGGCCAGTTCCTGCTGTTCTGCCACATCAGCAGCCACCAGCATGATGGCATGGAGGCCTATGTGAAGGTGGACAGCTGCCCTGAGGAGCCCCAGCTGAGGATGAAGAACAATGAGGAGGCTGAGGACTATGATGATGACCTGACTGACTCTGAGATGGATGTGGTGAGGTTTGATGATGACAACAGCCCCAGCTTCATCCAGATCAGGTCTGTGGCCAAGAAGCACCCCAAGACCTGGGTGCACTACATTGCTGCTGAGGAGGAGGACTGGGACTATGCCCCCCTGGTGCTGGCCCCTGATGACAGGAGCTACAAGAGCCAGTACCTGAACAATGGCCCCCAGAGGATTGGCAGGAAGTACAAGAAGGTCAGGTTCATGGCCTACACTGATGAAACCTTCAAGACCAGGGAGGCCATCCAGCATGAGTCTGGCATCCTGGGCCCCCTGCTGTATGGGGAGGTGGGGGACACCCTGCTGATCATCTTCAAGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAACATCTACCCCCATGGCATCACTGATGTGAGGCCCCTGTACAGCAGGAGGCTGCCCAAGGGGGTGAAGCACCTGAAGGACTTCCCCATCCTGCCTGGGGAGATCTTCAAGTACAAGTGGACTGTGACTGTGGAGGATGGCCCCACCAAGTCTGACCCCAGGTGCCTGACCAGATACTACAGCAGCTTTGTGAACATGGAGAGGGACCTGGCCTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGATCTGCTACAAGGAGTCTGTGGACCAGAGGGGCAACCAGATCATGTCTGACAAGAGGAATGTGATCCTGTTCTCTGTGTTTGATGAGAACAGGAGCTGGTACCTGACTGAGAACATCCAGAGGTTCCTGCCCAACCCTGCTGGGGTGCAGCTGGAGGACCCTGAGTTCCAGGCCAGCAACATCATGCACAGCATCAATGGCTATGTGTTTGACAGCCTGCAGCTGTCTGTGTGCCTGCATGAGGTGGCCTACTGGTACATCCTGAGCATTGGGGCCCAGACTGACTTCCTGTCTGTGTTCTTCTCTGGCTACACCTTCAAGCACAAGATGGTGTATGAGGACACCCTGACCCTGTTCCCCTTCTCTGGGGAGACTGTGTTCATGAGCATGGAGAACCCTGGCCTGTGGATTCTGGGCTGCCACAACTCTGACTTCAGGAACAGGGGCATGACTGCCCTGCTGAAAGTCTCCAGCTGTGACAAGAACACTGGGGACTACTATGAGGACAGCTATGAGGACATCTCTGCCTACCTGCTGAGCAAGAACAATGCCATTGAGCCCAGGAGCTTCAGCCAGAATCCACCCGTCCTTAAGCGCCATCAGCGCGAGATCACCAGGACCACCCTGCAGTCTGACCAGGAGGAGATTGACTATGATGACACCATCTCTGTGGAGATGAAGAAGGAGGACTTTGACATCTACGACGAGGACGAGAACCAGAGCCCCAGGAGCTTCCAGAAGAAGACCAGGCACTACTTCATTGCTGCTGTGGAGAGGCTGTGGGACTATGGCATGAGCAGCAGCCCCCATGTGCTGAGGAACAGGGCCCAGTCTGGCTCTGTGCCCCAGTTCAAGAAGGTGGTGTTCCAGGAGTTCACTGATGGCAGCTTCACCCAGCCCCTGTACAGAGGGGAGCTGAATGAGCACCTGGGCCTGCTGGGCCCCTACATCAGGGCTGAGGTGGAGGACAACATCATGGTGACCTTCAGGAACCAGGCCAGCAGGCCCTACAGCTTCTACAGCAGCCTGATCAGCTATGAGGAGGACCAGAGGCAGGGGGCTGAGCCCAGGAAGAACTTTGTGAAGCCCAATGAAACCAAGACCTACTTCTGGAAGGTGCAGCACCACATGGCCCCCACCAAGGATGAGTTTGACTGCAAGGCCTGGGCCTACTTCTCTGATGTGGACCTGGAGAAGGATGTGCACTCTGGCCTGATTGGCCCCCTGCTGGTGTGCCACACCAACACCCTGAACCCTGCCCATGGCAGGCAGGTGACTGTGCAGGAGTTTGCCCTGTTCTTCACCATCTTTGATGAAACCAAGAGCTGGTACTTCACTGAGAACATGGAGAGGAACTGCAGGGCCCCCTGCAACATCCAGATGGAGGACCCCACCTTCAAGGAGAACTACAGGTTCCATGCCATCAATGGCTACATCATGGACACCCTGCCTGGCCTGGTGATGGCCCAGGACCAGAGGATCAGGTGGTACCTGCTGAGCATGGGCAGCAATGAGAACATCCACAGCATCCACTTCTCTGGCCATGTGTTCACTGTGAGGAAGAAGGAGGAGTACAAGATGGCCCTGTACAACCTGTACCCTGGGGTGTTTGAGACTGTGGAGATGCTGCCCAGCAAGGCTGGCATCTGGAGGGTGGAGTGCCTGATTGGGGAGCACCTGCATGCTGGCATGAGCACCCTGTTCCTGGTGTACAGCAACAAGTGCCAGACCCCCCTGGGCATGGCCTCTGGCCACATCAGGGACTTCCAGATCACTGCCTCTGGCCAGTATGGCCAGTGGGCCCCCAAGCTGGCCAGGCTGCACTACTCTGGCAGCATCAATGCCTGGAGCACCAAGGAGCCCTTCAGCTGGATCAAGGTGGACCTGCTGGCCCCCATGATCATCCATGGCATCAAGACCCAGGGGGCCAGGCAGAAGTTCAGCAGCCTGTACATCAGCCAGTTCATCATCATGTACAGCCTGGATGGCAAGAAGTGGCAGACCTACAGGGGCAACAGCACTGGCACCCTGATGGTGTTCTTTGGCAATGTGGACAGCTCTGGCATCAAGCACAACATCTTCAACCCCCCCATCATTGCCAGATACATCAGGCTGCACCCCACCCACTACAGCATCAGGAGCACCCTGAGGATGGAGCTGATGGGCTGTGACCTGAACAGCTGCAGCATGCCCCTGGGCATGGAGAGCAAGGCCATCTCTGATGCCCAGATCACTGCCAGCAGCTACTTCACCAACATGTTTGCCACCTGGAGCCCCAGCAAGGCCAGGCTGCATCTGCAGGGCAGGAGCAATGCCTGGAGGCCCCAGGTCAACAACCCCAAGGAGTGGCTGCAGGTGGACTTCCAGAAGACCATGAAGGTGACTGGGGTGACCACCCAGGGGGTGAAGAGCCTGCTGACCAGCATGTATGTGAAGGAGTTCCTGATCAGCAGCAGCCAGGATGGCCACCAGTGGACCCTGTTCTTCCAGAATGGCAAGGTGAAGGTGTTCCAGGGCAACCAGGACAGCTTCACCCCTGTGGTGAACAGCCTGGACCCCCCCCTGCTGACCAGATACCTGAGGATTCACCCCCAGAGCTGGGTGCACCAGATTGCCCTGAGGATGGAGGTGCTGGGCTGTGAGGCCCAGGACCTGTACTGA(SEQ ID NO:4)。

表达盒的侧翼是反向末端重复序列的示例性序列是：

SEQ ID NO：5包含(从5'到3')绝缘子(间隔子)序列Ins1(SEQ ID NO：5的核苷酸14-32)，Serpin1增强子CRMSBS2(SEQ ID NO：5的核苷酸33-104)，运甲状腺素蛋白最小启动子TTRm(SEQ ID NO：5的nt 117-339)，SBR内含子3(SEQ ID NO：5的nt 340-432)，FVIII编码序列hF8 BDD(SEQ ID NO：5的438-4811)，SPA51合成的poly A序列(SEQ ID NO：5的nt4818-4868)和绝缘子序列Ins3(SEQ ID NO：5的nt 4869-4885)，如PCT公开号WO 2017/074526中所述。

重组AAV载体的构建已经在许多出版物中进行了描述，包括美国专利No.5,173,414；Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka，PNAS81:6466-6470(1984)；和Samulski et al.，J.Virol.63:03822-3828(1989)。由于整合到转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因传递是该载体系统的特征。参见，例如，Wagner et al.，Lancet351:9117 1702-3(1998)，Kearns et al.,Gene Ther.9:748-55(1996)。

待施用的AAV载体的有效量可以因患者而异。在一些实施方案中，有效量是由施用该组合物(AAV载体)的医师确定。对治疗性多肽的血清，血浆或其他组织水平的分析以及与施用前的初始水平的比较可以确定所施用的量是否过低、在正确范围内还是过高。初次和随后施用的合适方案也是可变的，但以初次施用为代表，任选地在必要时随后进行后续施用。随后的施用可以以可变的间隔进行，范围从每天到每年到每几年。在一些实施方案中，可以推荐适当的免疫抑制技术以避免通过递送载体的免疫抑制来抑制或阻止转导。参见，例如，Vilquin et al.,(1995)Human Gene Ther.,6:1391-1401。

可以通过任何方式施用。考虑了体内和离体方法。在一些实施方案中，静脉内注射(例如，但不限于，经由门静脉)是施用方法。在一些实施方案中，施用是通过标准静脉内施用。其他体内施用方式包括，例如，直接注射入肝叶或胆管，以及静脉注射到肝脏远端(包括通过肝动脉)，直接注射入肝实质，通过肝动脉注射，和/或通过胆管树逆行注射。离体施用方式包括切除的肝细胞或肝脏其他细胞的体外转导，然后将转导的、切除的肝细胞输注回人类患者的门脉血管系统，肝实质或胆管树，参见例如Grossman et al.,(1994)NatureGenetics,6:335-341。

在一些实施方案中，本文所述的AAV载体的示例性静脉内剂量可以在6x10¹¹至1x10¹³或3x10¹³或1x10¹³至1x10¹⁴，或1x10¹³至5x10¹³或2x10¹³至4x10¹³vg/kg之间，例如从1x10¹²或2x10¹²至3x10¹³人类接受者的病毒基因组/千克(vg/kg)。在一些实施方案中，剂量是1×10¹¹至1×10¹²vg/kg。在一些实施方案中，剂量是1×10¹²至1×10¹³vg/kg或3×10¹³。在一些实施方案中，剂量是2×10¹²至3×10¹³。在一些实施方案中，剂量是5×10¹²至5×10¹³vg/kg。如上所述，在一些实施方案中，将AAV载体作为单剂量提供给接受者。在一些实施方案中，剂量是6×10¹¹、9×10¹¹、1.2×10¹²、2×10¹²、4×10¹²、6×10¹²、1×10¹³、3×10¹³、4×10¹³或5×10¹³vg/kg。在一些实施方案中，患者接受单剂量的AAV载体。

可将药学上可接受的运载体作为所施用制剂的一部分包括在内。药学上可接受的运载体部分地取决于所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法。因此，如下所述，有各种各样的合适的药物组合物制剂(参见，例如，《Remington’s PharmaceuticalSciences》，第17版，1989)。

用于离体和体内施用的制剂可以包括在液体或乳化液体中的悬浮液(例如，遗传修饰的细胞、脂质体或纳米颗粒)。可以将活性成分与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。另外，该组合物可以包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂或增强药物组合物有效性的其他试剂。

接收所述的AAV载体的受试者可以是任何人。示例性的接受者包括例如患有血友病(例如A型血友病)的个体。在一些实施方案中，关于A型血友病的治疗或用于减少患有A型血友病的受试者的出血事件期间的出血时间的方法的治疗有效量是指能够引起以下一种或多种效果的量：(1)在一定程度上减轻，抑制或预防A型血友病的一种或多种生理症状，包括例如瘀伤，关节痛或肿胀，长时间头痛，呕吐或疲劳，(2)改善血液凝结能力，(3)减少出血事件期间的总体出血时间，(4)施用导致受试者血浆中功能性FVIII蛋白的浓度或活性可测量地增加和/或(5)在一定程度上缓解与该病症有关的一种或多种症状。

在一些实施方式中，大于在正常个体中发现的因子浓度的1％的FVIII血液浓度是由于施用本文所述的AAV载体而导致的，从而将严重的疾病表型改变为中度的。严重的表型以关节损伤和威胁生命的出血为特征。在一些实施方案中，施用如本文所述的AAV载体导致FVIII血液浓度为正常的至少5％。在一些实施方案中，为了将中度疾病表型转化为轻度表型，需要FVIII血液浓度大于正常值的5％。例如，通过活化的部分促凝血酶原激酶时间(activated partial thromboplastin time,aPTT)一阶段凝血测定，正常人的FVIII水平为约1.14±0.48nM血浆(参见，例如，Butenas，et al.，Thromb Res.(2010Aug)；126(2):119–123)。因此，通过表达FVIII可以实现治疗效果，使得受试者/人中FVIII的总量大于正常受试者/人中存在的FVIII的1％，例如1.14±0.48nM的1％。

在一些实施方案中，在施用前，人具有低于正常人循环FVIII活性的1％，2％，3％，4％或5％，并且在施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、28、32、36、40、44、48或52周内，人分别具有正常人循环FVIII活性的至少1％，2％，3％，4％或5％。在一些实施方案中，如本文所述的AAV载体施用导致人接受者血浆中功能性FVIII蛋白活性与施用前(例如，施用前14天之内)受试者血浆中存在的功能性FVIII蛋白活性的量相比，增加至少1，2，3，4，5，6，7，8、9、10、11、12、13、14、15或更高的IU/dl。在一些实施方案中，如本文所述的AAV载体的施用导致在受试者的血浆中循环FVIII活性的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高IU/dl的表达。就这一点而言，关于FVIII活性的术语“IU”或“国际单位”是通常理解的术语，其中1IU的FVIII活性等于在一毫升正常人血浆中的FVIII的量。在一些实施方案中，正常人FVIII活性是0.500-1.500IU/ml血浆。世界卫生组织描述血友病的严重性水平如下：

血浆中的FVIII活性可以通过许多众所周知且接收受的测定法来定量测定，所述测定法包括例如活化的部分促凝血酶原激酶时间(APPT)方法(参见，例如Miletich JP:Activated partial thromboplastin time.In Williams Hematology.Fifthedition.Edited by E Beutler，MA Lichtman，BA Coller，TJ Kipps.New York，McGraw-Hill，1995，pp L85-86,Greaves and Preston,Approach to the bleeding patient.见Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice.Fourthedition.Edited by RW Colman，J Hirsh，VJ Marder，et al.Philadelphia，JBLippincott Co,2001，pp 1197-1234和Olson et al，Arch.Pathol.Lab.Med.122:782-798(1998))或生色FXa测定(Harris et al.，Thromb.Res.128(6):125-129(2011))。

在其他实施方式中，受试者的出血时间可以通过众所周知且接受的技术来测量，包括例如Ivy方法(参见，例如，Ivy et al.,Surg.Gynec.Obstet.60:781(1935)and Ivy etal.，J.Lab.Clin.Med.26:1812(1941))或Duke方法(参见，例如Duke et al.,JAMA 55:1185(1910))。受试者的“出血事件”是指导致受试者外部或内部出血的损伤，并且通常包括从损伤到形成血块的时间段。在一些实施方案中，在施用本文所述的AAV载体后，在受试者中出血事件的频率降低。在一些实施方案中，施用后出血事件的频率降低10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。

在一些实施方案中，在施用之前、之后或之前和之后测量人血液中FVIII蛋白的浓度。可以使用直接或间接测定法来测量FVIII血液浓度。示例性的间接方法包括，例如描述于Over，J.(1986)Scand.J.Haematol.33(Suool.41),13-24；Kemball-Cook,G.,et al.(1993)Brit.J.Haematol.84,273-278。直接检测方法包括例如在美国专利号8715951中描述的那些方法。在一些实施方案中，在初次施用AAV载体之前两周内确定FVIII血液浓度，以最佳地确定施用后的效果。

在一些实施方案中，用本文所述的AAV载体的施用和治疗将导致受试者对用替代因子VIII蛋白进行治疗的需求减少。这可以通过在本文所述的AAV载体施用之前注意到需要治疗的频率，然后在施用之后注意需要治疗的频率来测量。在一些实施方案中，需要治疗的减少为在施用后减少10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或100％。

在一些实施方案中，用本文所述的AAV载体的施用和治疗对肝脏几乎没有或没有造成损害。肝状态可以例如通过测量个体血液中的一种或多种标志物来测量。指示肝健康的示例性标志物包括但不限于丙氨酸氨基转移酶(ALT)或天冬氨酸氨基转移酶(AST))，胆红素，碱性磷酸酶和白蛋白。在一些实施方案中，在施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周内，人显示出不超过丙氨酸氨基转移酶(ALT)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)，胆红素，碱性磷酸酶或白蛋白中至少一种的正常上限(ULN)的1.0、1.2、1.5、1.7或2.0倍。ULN通常可以从群体中确定。ALT的讨论参见，例如，Neuschwander-Tetri,B.,etal.,Arch Intern Med.2004 Mar 24；168(6):663–666。在一些实施方案中，用于ALT的ULN是44U/L。在一些实施方案中，用于AST的ULN是39U/L。在一些实施方案中，胆红素的ULN为对于总胆红素的是0.1-1.0mg/dl，对于缀合胆红素的是0.2-0.7mg/dl，对于未缀合的胆红素的是0.1-0.4mg/dl。参见例如Lisa B,VanWagner(2015).Journal of American MedicalAssociation(JAMA)313(5):516–517。在一些实施方案中，碱性磷酸酶的ULN为129或133U/L。参见，例如，Gowda,et al.,Pan Afr Med J.(2009)3:17。在一些实施方案中，白蛋白的正常范围是35-55g/升(Burtis and Ashwood(1999)Tietz Textbook of Clinical Chemistry,3^rd edition.Saunders Editor)。

在一些实施方案中，用本文所述的AAV载体的施用和治疗例如在施用后第4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、52周的任何一个或多个时间点不会导致可检测水平的FVIII抑制剂。通过Nijmegen-Bethesda测定法检测FVIII抑制剂(Duncan，et al.,MethodsMol Biol.2013；992:321-33和Miller CH，et al.Am J Hematol.90:871-876(2015))。该测定的检测限为0.6BU。低于0.6BU的任何结果均视为不可检测的。

在一些实施方案中，用本文所述的AAV载体的施用和治疗不会显著影响某些生物标志物的表达，并且理想地导致生物标志物的改善的结果。示例性生物标志物包括，例如，冯·威利布兰德因子(vWF)，可溶性表皮生长因子受体(sEGFR)，半乳凝素-3结合蛋白(GAL3BP)，C反应蛋白(CRP)，IL-6，循环甲胎蛋白。在一些实施方案中，在施用之前或之后或在两者之后在个体的血液中测量一种或多种以上列出的生物标志物。在一些实施方案中，当在施用后2、4、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48或52周内测定时，一种或多种生物标志物的血液水平不超过在施用前两周内的水平的1.0、1.2、1.5、1.7或2.0倍。

概述

除非另有说明，否则本文所公开的方法的实践以及组合物的制备和使用均采用分子生物学，生物化学，染色质结构和分析，计算化学，细胞培养，重组DNA和相关领域中的常规技术，如同在本领域技术范围内。这些技术在文献中已得到充分解释。参见，例如，Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001；Ausubel et al.,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987和定期更新；系列METHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego；Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998；METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119，“ChromatinProtocols”(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999。

定义

术语“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，并且是指线性或环状构型以及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不应解释为对聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如硫代磷酸酯骨架)中修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物将与T碱基配对。

术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”可互换使用，是指氨基酸残基的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一种或多种氨基酸是相应天然氨基酸的化学类似物或修饰的衍生物。

在本文描述的任何方法中，外源核苷酸序列(“表达构建体”或“表达盒”或“载体”)可以含有与目的区域中的基因组序列同源但不相同的序列，从而刺激同源重组以在目的区域插入不同的序列。因此，在某些实施方案中，与目的区域中的序列同源的表达盒序列的部分与被置换的基因组序列表现出约80-99％(或其之间的任何整数)的序列同一性。在其他实施方案中，表达盒和基因组序列之间的同源性高于99％，例如，如果表达盒的同源性区域与超过100个连续碱基对的基因组序列之间只有1个核苷酸不同。在某些情况下，表达盒的非同源部分可以含有在目标区域中不存在的序列，从而将新的序列引入目标区域。在这些情况下，非同源序列的侧翼通常是与目的区域中的序列同源或相同的50-1,000个碱基对(或其之间的任何整数值)或任何数量的大于1,000的碱基对的序列。

术语“序列”是指任何长度的核苷酸序列，可以是DNA或RNA；可以是线性、环形或分支的，并且可以是单链或双链的。术语“转基因”是指插入基因组中的核苷酸序列。转基因可以具有任何长度，例如长度在2至100,000,000个核苷酸之间(或其之间或其上方的任何整数值)，优选长度在约100至100,000个核苷酸之间(或其之间的任何整数)，更优选地在约2000至20,000之间核苷酸的长度(或其间的任何值)，甚至更优选约5至15kb(或其间的任何值)。

“染色体”是包含细胞基因组的全部或部分的染色质复合物。细胞的基因组通常以其核型为特征，核型是包括细胞基因组的所有染色体的集合。细胞的基因组可以包含一个或多个染色体。

“附加体(episome)”是复制核酸，核蛋白复合物或其他结构，其包含不是细胞染色体核型的一部分的核酸。附加体的实例包括质粒和某些病毒基因组。本文所述的肝特异性构建体可以是附加体维持的，或者可以稳定地整合到细胞中。

“外源性”分子是通常不存在于细胞中但可以通过一种或多种遗传、生化或其他方法引入细胞的分子。关于细胞的特定发育阶段和环境条件确定“细胞中的正常存在”。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子是相对于成年肌肉细胞的外源性分子。类似地，由热激诱导的分子是相对于非热激细胞的外源性分子。外源性分子可以包括例如功能失常的内源性分子的功能版本或功能正常的内源性分子的功能失调版本。

外源性分子尤其可以是诸如通过组合化学过程产生的小分子，或者是大分子，诸如蛋白质，核酸，碳水化合物，脂质，糖蛋白，脂蛋白，多糖，上述分子的任何修饰的衍生物或包含一个或多个上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线性，分支或环形的；并且可以是任何长度。核酸包括能够形成双链体的核酸以及形成三链体的核酸。参见，例如，美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白，转录因子，染色质重塑因子，甲基化DNA结合蛋白，聚合酶，甲基化酶，脱甲基酶，乙酰化酶，脱乙酰基酶，激酶，磷酸酶，连接酶，去泛素酶，整合酶，重组酶，连接酶，拓扑异构酶，旋转酶(gyrase)和解旋酶。

外源性分子可以是与内源性分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包含感染性病毒基因组，引入细胞中的质粒或附加体或细胞中通常不存在的染色体。将外源性分子引入细胞的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)，电穿孔，直接注射，细胞融合，粒子轰击，磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源性分子也可以是与内源性分子相同类型的分子，但其来源不同于细胞来源的物种。例如，可以将人核酸序列引入最初源自小鼠或仓鼠的细胞系。将外源性分子引入植物细胞的方法是本领域技术人员已知的，包括但不限于原生质体转化，碳化硅(例如，WHISKERS^TM)，农杆菌介导的转化，脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)，电穿孔，直接注射，细胞融合，粒子轰击(例如，使用“基因枪”)，磷酸钙共沉淀，DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。

相反，“内源性”分子是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的分子。例如，内源性核酸可以包含染色体，线粒体，叶绿体或其他细胞器的基因组，或天然存在的附加型核酸。另外的内源性分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。

如本文所用，术语“外源核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物两者，例如，转录产物(诸如RNA的多核苷酸)和翻译产物(多肽)。

就本公开的目的而言，“基因”包括编码基因产物的DNA区域(见下文)，以及调控该基因产物产生的所有DNA区域，无论这种调控序列是否与编码和/或转录序列相邻。因此，基因包括但不必然限于启动子序列，终止子，翻译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点，增强子，沉默子，绝缘子，边界元件，复制起点，基质附着位点和基因座控制区。

“基因表达”是指将基因中包含的信息转换成基因产物。基因产物可以是基因(例如，mRNA，tRNA，rRNA，反义RNA，核酶，结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质的直接转录产物。基因产物还包括通过诸如加帽，聚腺苷酸化，甲基化和编辑等过程修饰的RNA，以及通过例如甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化，ADP-核糖基化，肉豆蔻化和糖基化修饰的蛋白质。

基因表达的“调节(modulation)”是指基因活性的变化。表达的调节可包括但不限于基因激活和基因阻抑。基因组编辑(例如切割，改变，失活，随机突变)可以用于调节表达。基因失活是指与不包含如本文所述的ZFP，TALE或CRISPR/Cas系统的细胞相比，基因表达的任何减少。因此，基因失活可以是部分或完全的。

“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(例如酵母)，植物细胞，动物细胞，哺乳动物细胞和人细胞(例如T细胞)，包括干细胞(多能和多潜能的)。

术语“可操作连接”和“可操作地”(或“可操作连接的”)是关于两个或更多个组件(例如顺序元件)的并置而互换使用，其中所述组件被布置成使得组件两者正常起作用，并允许至少一个组件能够介导施加在至少一个其他组件上的功能。举例来说，如果转录调控序列响应一种或多种转录调控因子的存在或不存在来控制编码序列的转录水平，则转录调控序列例如启动子可操作连接至编码序列。转录调控序列通常与编码序列顺式可操作连接，但不必直接与其相邻。例如，增强子是与编码序列可操作连接的转录调控序列，即使它们不是连续的。

蛋白质，多肽或核酸的“功能片段”是这样的蛋白质，多肽或核酸，其序列与全长蛋白质，多肽或核酸的序列不同，但仍保留与全长蛋白质，多肽或核酸相同的功能。功能片段可以具有与相应的天然分子更多，更少或相同数目的残基，和/或可以含有一个或多个氨基酸或核苷酸取代。确定核酸功能(例如，编码功能，与另一种核酸杂交的能力)的方法是本领域众所周知的。类似地，确定蛋白质功能的方法是众所周知的。例如，B结构域缺失的人因子VIII是全长因子VIII蛋白的功能片段。

多核苷酸“载体”或“构建体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”，“表达载体”，“表达构建体”，“表达盒”和“基因转移载体”是指能够指导目的基因表达并可以转移基因序列到靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且是指哺乳动物，例如人类患者和非人类灵长类动物，以及实验动物，例如兔子，狗，猫，大鼠，小鼠和其他动物。因此，本文所用的术语“受试者”或“患者”是指可以对其施用本发明表达盒的任何哺乳动物患者或受试者。本发明的受试者包括患有疾病的受试者。

如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指减轻症状的严重性和/或频率，消除症状和/或根本原因，预防症状和/或其根本原因的发生，以及改善或补救损害。癌症和移植物抗宿主疾病是可以使用本文所述的组合物和方法治疗的病况的非限制性实例。因此，“治疗”和“治疗”包括：

(i)防止疾病或病况在哺乳动物中发生，特别是当这种哺乳动物易患该病况但尚未被诊断为患有该疾病或病况时；

(ii)抑制疾病或病况，即阻止其发展；

(iii)减轻疾病或病况，即导致疾病或病况消退；和/或

(iv)缓解或消除由疾病或病况引起的症状，即缓解疼痛并且处理或不处理潜在疾病或病况。

如本文所用，术语“疾病”和“病况”可互换使用或可以不同，因为特定的疾病(malady)或病况可能不具有已知的病原体(cusative agent)(因此病因尚未得到解决)并且因此，它尚未被识别为疾病，而仅被识别为不期望的病况或综合症，其中临床医生已识别出或多或少的特定的症状集合。

“药物组合物”是指本发明的化合物和本领域通常接受的用于将生物活性化合物递送给哺乳动物例如人的介质的制剂。这样的介质包括所有药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。

“有效量”或“治疗有效量”是指本发明化合物当施用于哺乳动物，优选人时，足以在哺乳动物，优选人中进行治疗的量。构成“治疗有效量”的本发明组合物的量将根据化合物，病况及其严重程度，施用方式和待治疗的哺乳动物的年龄而变化，但是可以由本领域普通技术人员考虑到他自己的知识和本公开常规地确定。

肝特异性表达构建体

本文还描述了用于指导转基因在肝细胞中表达的表达盒(构建体)，包括在向受试者施用表达盒后(例如，肝递送)体内。表达构建体可以在游离状态下(episomally)维持并在染色体外驱动转基因的表达，或者，表达构建体可以整合到肝细胞的基因组中，例如通过核酸酶介导的靶向整合。

多核苷酸表达构建体包含增强子序列，启动子序列和一个或多个转基因。任选地包括以下一个或多个：内含子序列，聚腺苷酸化序列和/或信号肽。任何增强子序列均可用于本文所述的表达构建体。在某些实施方案中，增强子是野生型或修饰的Serpin1增强子(Chuah et al.，(2014)Molecular Therapy，22，1605-1613；Nair et al.，(2014)Blood，123,3195-3199)。

显而易见的是，任何转基因均可用于本文所述的构建体。此外，本文描述的构建体的各个组分(启动子，增强子，绝缘子，转基因等)可以以任何组合进行混合和匹配。

本文所述的构建体可以包含在任何病毒或非病毒载体内。构建体可以在游离状态下维持或可以整合到细胞的基因组中(例如，通过核酸酶介导的靶向整合)。

非病毒载体包括DNA或RNA质粒，DNA MC，裸核酸以及与诸如脂质体，纳米颗粒或泊洛沙姆的递送运载体复合的核酸。可用于携带本文所述表达盒的病毒载体包括但不限于逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺伴随病毒载体，牛痘和单纯疱疹病毒载体。向宿主基因组整合可以用逆转录病毒，慢病毒和腺伴随病毒基因转移方法，如本文所述，可以通过核酸酶介导的整合来促进。

在某些实施方案中，构建体包含在腺伴随病毒(“AAV”)载体或载体系统中，其可以在游离状态下维持或整合到肝细胞的基因组中(例如，通过核酸酶介导的靶向整合)。重组AAV载体的构建在许多出版物中，包括美国专利No.5,173,414；Tratschin et al.，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin，et al.，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka，PNAS81:6466-6470(1984)；和Samulski et al.,J.Virol.63:03822-3828(1989)。

因此，在某些实施方案中，表达构建体被携带在AAV构建体上，并且进一步包含在如本文所述的表达构建体元件(例如，增强子，启动子，任选的内含子，转基因等)侧翼的5'和3'ITR。任选地，间隔物分子也包括在表达构建体的一个或多个组件之间，例如在5′ITR与增强子之间和/或在聚腺苷酸化信号与3′ITR之间。间隔物可以用作同源臂，以促进重组为安全港基因座(例如白蛋白)。

在某些实施方案中，本文所述的AAV载体可以源自任何AAV。在某些实施方案中，AAV载体源自缺陷性和非致病性细小病毒腺相关的2型病毒。所有此类载体均源自仅保留转基因表达盒侧翼的AAV 145bp反向末端重复序列的质粒。由于整合到转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因递送是该载体系统的关键特征。(Wagner et al.,Lancet351:9117 1702-3(1998),Kearns et al.,Gene Ther.9:748-55(1996))。根据本发明，也可以使用其他AAV血清型，包括AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV7，AAV8，AAV9和AAVrh.10，以及任何新颖的AAV血清型。在一些实施方案中，使用嵌合AAV，其中病毒核酸的LTR序列的病毒起源与衣壳序列的病毒起源异源。非限制性实例包括具有源自AAV2的LTR和源自AAV5，AAV6，AAV8或AAV9的衣壳的嵌合病毒(分别为AAV2/5，AAV2/6，AAV2/8和AAV2/9)。

包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞包括可以用于包装AAV和腺病毒的HEK293和Sf9细胞，以及可包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。基因疗法中使用的病毒载体通常由生产者细胞系产生，该生产者细胞系将核酸载体包装到病毒颗粒中。载体通常含有包装和随后整合入宿主(如果适用)所需的最小病毒序列，其他病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒取代。缺失的病毒功能由包装细胞系反式提供。例如，用于基因疗法的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，这是包装和整合到宿主基因组中所需要的。病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其他AAV基因(即rep和cap)但缺少ITR序列的辅助质粒。该细胞系也被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，因此没有大量包装辅助质粒。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒比AAV对热处理更敏感。在一些实施方案中，使用杆状病毒表达系统产生AAV。

在许多基因疗法应用中，期望以高度特异性将基因疗法载体递送至特定组织类型。因此，通过将配体表达为与病毒外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白，可以修饰病毒载体以对给定的细胞类型具有特异性。选择该配体以使其对已知存在于目的细胞类型上的受体具有亲和力。例如，Han et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道，可以对莫洛尼氏(Moloney)鼠白血病病毒进行修饰以表达与gp70融合的人调蛋白，并且该重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。该原理可以扩展到其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，并且病毒表达包含细胞表面受体配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可以被工程化以展示对几乎任何选择的细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管以上描述主要适用于病毒载体，但是相同的原理可以适用于非病毒载体。可以将此类载体工程化以含有有利于特定靶细胞摄取的特定摄取序列。

本文所述的多核苷酸可包括一种或多种非天然碱基和/或主链。特别地，本文所述的表达盒可包括甲基化的胞嘧啶，以在目的区域中实现转录静止状态。

此外，本文所述的表达构建体还可包含其他转录或翻译调控序列或其他序列，例如，Kozak序列，其他启动子，增强子，绝缘子，内部核糖体进入位点，编码2A肽，弗林蛋白酶(furin)切割位点和/或聚腺苷酸化信号的序列。此外，可以将目的基因的控制元件与报道基因可操作连接以产生嵌合基因(例如，报道基因表达盒)。

递送

本文所述的构建体可以通过任何合适的方式体内或离体递送至任何细胞类型，优选递送至肝脏(肝递送)。类似地，当与核酸酶组合用于靶向整合时，核酸酶可以多核苷酸和/或蛋白质形式递送，例如使用非病毒载体，病毒载体和/或RNA形式，例如，作为mRNA。

常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可以用于在细胞(例如哺乳动物细胞)和靶组织中引入编码工程改造的基因调节剂的核酸。此类方法还可以用于将编码此类阻遏物(或其组分)的核酸体外施用细胞。在某些实施方案中，施用编码阻遏物的核酸用于体内或离体基因治疗用途。非病毒载体递送系统包括DNA质粒，裸核酸以及与诸如脂质体或泊洛沙姆的递送载体复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，它们在递送至细胞后具有游离型基因组或整合的基因组。有关基因治疗程序的综述，参见Anderson,Science256:808-813(1992)；Nabel&Felgner，TIBTECH 11:211-217(1993)；Mitani&Caskey，TIBTECH 11:162-166(1993)；Dillon,TIBTECH 11:167-175(1993)；Miller，Nature 357:455-460(1992)；Van Brunt，Biotechnology6(10):1149-1154(1988)；Vigne，RestorativeNeurology and Neuroscience 8:35-36(1995)；Kremer&Perricaudet，British MedicalBulletin 51(1):31-44(1995)；Haddada et al.,in Current Topics in Microbiologyand Immunology Doerfler and

(eds.)(1995)；and Yu et al.，Gene Therapy 1:13-26(1994)。

可以使用任何载体系统，包括但不限于质粒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺伴随病毒载体等。另参见美国专利号8,586,526；6,534,261；6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824，通过引用整体并入本文。

核酸的非病毒递送的方法包括电穿孔，脂转染，显微注射，生物射弹，病毒体，脂质体，免疫脂质体，其他纳米颗粒，聚阳离子或脂质：核酸缀合物，裸露的DNA，人工病毒体和试剂增强的DNA摄取。使用例如Sonitron 2000系统(Rich-Mar)的超声操作也可以用于核酸的递送。另外的示例性核酸递送系统包括由AmaxaBiosystems(Cologne,Germany)，Maxcyte公司(Rockville，Maryland)，BTX分子递送系统(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics公司提供的那些(参见例如US6008336)。

在一些实施方案中，表达构建体是AAV载体。任选的核酸酶可以以mRNA形式或使用一种或多种病毒载体(AAV，Ad等)施用。施用可以通过将多核苷酸递送至所需靶细胞的任何方式进行。考虑了体内和离体方法。向门静脉的静脉内注射是一种可能的施用方法。其他体内施用方式包括，例如，直接注射入肝叶或胆管，以及静脉注射到肝脏远端(包括通过肝动脉)，直接注射入肝实质，通过肝动脉注射，和/或通过胆管树逆行注射。体外施用方式包括切除的肝细胞或肝脏其他细胞的体外转导，然后将转导的、切除的肝细胞输注回人类患者的门脉血管系统，肝实质或胆管树，参见例如Grossman et al.,(1994)Nature Genetics,6:335-341。

在涉及递送多于一个的多核苷酸(例如，本文所述的构建体和多核苷酸形式的核酸酶)的系统中，使用一种或多种相同和/或不同的载体递送两种或更多种多核苷酸。例如，多核苷酸形式的核酸酶可以mRNA形式递送，并且本文所述的肝特异性构建体可以通过其他方式递送，例如病毒载体(例如，AAV)，小环DNA，质粒DNA，线性DNA，脂质体，纳米粒子等。

另外的示例性核酸递送系统包括由Amaxa Biosystems(Cologne,Germany),Maxcyte,Inc.(Rockville,Maryland)，BTX Molecular Delivery Systems(Holliston,MA)和Copernicus Therapeutics Inc.提供的那些(参见例如US6008336)。脂质转染描述于例如美国专利号5,049,386；4,946,787；和4,897,355中)和脂转染试剂在商业上出售(例如

和

和

RNAiMAX)。适用于多核苷酸的有效受体识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括Felgner，WO 91/17424，WO 91/16024的那些。可以递送至细胞(离体施用)或靶组织(体内施用)。

脂质：核酸复合物，包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合物的制备，是本领域技术人员众所周知的(参见，例如，Crystal,Science 270:404-410(1995)；Blaese et al.,Cancer Gene Ther.2:291-297(1995)；Behr et al.,Bioconjugate Chem.5:382-389(1994)；Remy et al.,Bioconjugate Chem.5:647-654(1994)；Gao et al.,Gene Therapy2:710-722(1995)；Ahmad et al.,Cancer Res.52:4817-4820(1992)；U.S.Pat.Nos.4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975,4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028和4,946,787)。

另外的递送方法包括使用待递送的核酸包装到EnGeneIC递送载体(EDV)中。使用双特异性抗体将这些EDV特异性地递送至靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，而另一臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过内吞作用将EDV带入细胞。一旦进入细胞，内容物就被释放(参见MacDiarmid et al(2009)Nature Biotechnology27(7):643)。

在需要瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的系统。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中都具有很高的转导效率，并且不需要细胞分裂。使用这样的载体，已经获得了高滴度和高水平的表达。该载体可以在相对简单的系统中大量产生。腺伴随病毒(“AAV”)载体也用于例如靶核酸和肽的体外生产中，以及在体内和离体基因治疗程序中，用靶核酸转导细胞(参见，例如，West et al.,Virology 160:38-47(1987)；美国专利No.4,797,368；WO93/24641；Kotin，Human Gene Therapy 5:793-801(1994)；Muzyczka,J.Clin.Invest.94:1351(1994)。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81:6466-6470(1984)；和Samulski et al.，J.Virol.63:03822-3828(1989)。

重组腺伴随病毒载体(rAAV)是一种基于有缺陷且非致病性细小病毒腺相关2型病毒的有前途的替代基因递送系统。所有载体均源自仅保留转基因表达盒侧翼的AAV 145bp反向末端重复序列的质粒。由于整合到转导细胞的基因组中，有效的基因转移和稳定的转基因递送是该载体系统的关键特征。(Wagner et al.，Lancet 351:9117 1702-3(1998)，Kearns et al.，Gene Ther.9:748-55(1996))。根据本发明也可以使用其他AAV血清型，包括AAV1，AAV2，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV8AAV 8.2，AAV9和AAV rh10，以及伪型(pseudotype)AAV，例如AAV2/8，AAV2/9，AAV2/5和AAV2/6。根据本发明也可以使用能够穿过血脑屏障的新型AAV血清型(参见例如US20150079038)。在一些实施方案中，使用AAV6。

包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这样的细胞包括包装腺病毒的293细胞和包装逆转录病毒的ψ2细胞或PA317细胞。基因治疗中使用的病毒载体通常由生产者细胞系产生，该生产者细胞系将核酸载体包装到病毒颗粒中。载体通常含有用于包装和随后整合入宿主(如果适用)所需的最小病毒序列，其他病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒取代。缺失的病毒功能由包装细胞系反式提供。例如，用于基因疗法的AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，这是包装和整合到宿主基因组中所需要的。病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其他AAV基因(即rep和cap)但缺少ITR序列的辅助质粒。该细胞系也被作为辅助者的腺病毒感染。辅助病毒可促进AAV载体的复制和辅助质粒中AAV基因的表达。由于缺少ITR序列，因此没有大量包装辅助质粒。腺病毒的污染可以通过例如热处理来减少，腺病毒比AAV对热处理更敏感。

从293或杆状病毒系统中纯化AAV颗粒通常涉及产生病毒的细胞的生长，然后从细胞上清液中收集病毒颗粒或裂解细胞并从粗裂解物中收集病毒。然后通过本领域已知的方法纯化AAV，包括离子交换色谱法(例如，参见美国专利7,419,817和6,989,264)，离子交换色谱法和CsCl密度离心(例如，PCT公开WO2011094198A10)，免疫亲和色谱法(例如，WO2016128408)或使用AVB Sepharose(例如GE Healthcare Life Sciences)纯化。

在许多基因治疗应用中，期望以高度特异性将基因疗法载体递送至特定组织类型。因此，通过将配体表达为与病毒外表面上的病毒外壳蛋白的融合蛋白，可以修饰病毒载体以对给定的细胞类型具有特异性。选择该配体以使其对已知存在于目的细胞类型上的受体具有亲和力。例如，Han et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)报道可以对莫洛尼氏小鼠白血病病毒进行修饰以表达与gp70融合的人调蛋白，并且该重组病毒感染某些表达人表皮生长因子受体的人乳腺癌细胞。该原理可以扩展到其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，并且病毒表达包含细胞表面受体配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可以被工程化以展示对几乎任何选择的细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管以上描述主要适用于病毒载体，但是相同的原理可以适用于非病毒载体。可将此类载体工程化以含有有利于特定靶细胞摄取的特定摄取序列。

基因疗法载体可以通过施用给个体患者，通常通过全身性施用(例如，静脉内，腹膜内，肌内，皮下或颅内输注，包括直接注射入脑内)或局部施用而在体内递送，如下面所述。

药学上可接受的载体部分地取决于所施用的特定组合物以及用于施用该组合物的特定方法。因此，如下所述有各种各样的药物组合物合适的制剂(参见，例如，Remington’s Pharmaceutical Sciences,17th ed.,1989)。

待施用的表达盒(和任选的核酸酶和/或修饰的细胞)的有效量将因患者而异。因此，有效量最好由施用组合物(例如细胞)的医师来确定，并且合适的剂量可以由本领域普通技术人员之一容易地确定。对治疗性多肽的血清，血浆或其他组织水平的分析以及与施用前的初始水平的比较可以确定所施用的量是否过低、在正确范围内还是过高。初次和随后施用的合适方案也是可变的，但是以初次施用为代表，如果需要，随后进行后续施用。随后的施用可以以可变的间隔进行，范围从每天到每年到每几年。本领域技术人员将理解，可以推荐适当的免疫抑制技术以通过递送载体的免疫抑制来避免转导的抑制或阻断，参见例如Vilquin et al.,(1995)Human Gene Ther.,6:1391-1401。

用于离体和体内施用的制剂包括在液体或乳化液体中的悬浮液(例如，遗传修饰的细胞，脂质体或纳米颗粒)。通常将活性成分与药学上可接受的并且与活性成分相容的赋形剂混合。合适的赋形剂包括例如水，盐水，右旋糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。另外，该组合物可以包含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂或增强药物组合物有效性的其他试剂。

应用

本文公开的方法和组合物用于通过提供表达该疾病的中没有或缺乏的产物的转基因或以其他方式治疗或预防该疾病来提供针对任何疾病的疗法。

实施例

实施例1：临床方法

定量PCR

qRT-PCR(用于人类因子VIII mRNA水平)：按照制造商的说明(Qiagen，CarlsbadCA)，使用AllPrep DNA/RNA试剂盒从血浆中分离RNA/DNA。然后使用Quantitect cDNA合成试剂盒(Qiagen，Carlsbad CA)将提取的RNA用于制备cDNA。然后使用来自IDT(CoralvilleIA)的标记引物/探针测定法在Biorad CFX 96上使用SsoAdvanced Universal ProbesSupermix(Biorad，Hercules CA)进行定量PCR。为了特异性检测人因子VIII mRNA，引物/探针测定是定制的(custom)；正向引物(GGAGATGAAGAAGGAGGACTTTG)(SEQ ID NO：6)，探针(ACATCTACGACGAGGACGAGAACCA)(SEQ ID NO：7)和反向引物(TCCACAGCAGCAATGAAGTAG)(SEQID NO：8)。使用定量qRT-PCR(不是绝对的)，对每个样品进行针对GAPDH的归一化，并且最终数据分析报告为相对于设置为1.0的一个样品。所有样品均没有模板对照，也没有逆转录酶对照一起运行，并且不会产生可检测的信号。

qPCR(用于载体基因组，VG，分析)：根据制造商的说明(Qiagen，Carlsbad CA)，使用AllPrep DNA/RNA试剂盒从血浆中分离RNA/DNA。提取的DNA用于以TaqMan快速通用PCR预混液(No AmpErase UNG)(Applied Biosystems，Foster City，CA)在AB 7300实时PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA)上进行定量PCR。为了特异性检测人因子VIII，引物/探针测定是定制的；正向引物(CCTGGGCCAGTTCCTGCT)(SEQ ID NO：9)，探针(TTCTGCCACATCAGCAGCCACCA)(SEQ ID NO：10)和反向引物(GGCCTCCATGCCATCATG)(SEQ IDNO：11)。所有样品均无模板对照一起运行，并且不会产生可检测信号。qPCR DNA标准曲线由已知量的纯化的、线性化人因子VIII质粒的七个连续4倍稀释液生成。

人FVIII总抗原免疫测定。使用Sangamo Therapeutics，Inc.开发的hFVIIIBDD免疫测定法测量柠檬酸化人血浆中人因子VIII B-结构域缺失的(hFVIII-BDD)总抗原。

(人重组BDD-FVIII)参照物质将被用作校准物。

也将用作QC，代表hFVIII-BDD抗原。测定法是夹心ELISA，其使用单克隆抗体(mAb)作为捕获抗体，并使用生物素化的mAb作为检测抗体，两者均具有FVIII的A2结构域作为表位。用捕获mAb(GMA-8023；Green Mountain Antibodies)包被后，封闭并清洗，血浆样品，最低要求稀释度(MRD)为5的校准样品和质量对照样品在测定板中孵育，然后清洗。在加入链霉亲和素-辣根过氧化酶(SA-HRP)偶联试剂之前，将生物素化的mAb(GMA-8024；Green Mountain Antibodies)应用于培养板并孵育，随后洗涤。在SA-HRP孵育和洗涤后，添加3,3',5,5'-四甲基联苯胺(TMB)底物溶液10分钟，然后添加酸性终止溶液淬灭反应，然后在450nm运行下检测。相对于线性标准曲线对捕获的hFVIII-BDD抗原进行定量，该线性标准曲线使用对数-对数线性拟合在0.020IU/mL至0.500IU/mL的范围内回归。将使用在合并的先天性FVIII缺陷血浆(GeorgeKing Bio-Medical或等效物)中制备的10.0IU/mL

工作溶液制备校准物。

使用稀释至测定稀释物(Assay Diluent)中适用水平的测定校准物制备9点校准曲线(定量范围为0.500IU/mL至0.020IU/mL，锚定点为0.010IU/mL和0.000IU/mL)。使用对数-对数线性拟合以单曲线进行校准，一式两份，以IU/mL为单位测量的总hFVIII-BDD抗原含量在x轴上，并且光密度(OD，在450nm处测量)在y轴上。最后两个标准水平将是锚定点，以0.010IU/mL和0.000IU/mL制备，没有接受标准。一式两份测定样品和QC，然后根据校准曲线反算以确定总hFVIII-BDD抗原(浓度报告为IU/mL)。

生色人因子VIII活性测定。血浆中分泌的人因子VIII的活性是根据制造商的方案，使用Diapharma生色性凝血因子VIII测定法(Diapharma Chromogenic CoamaticFactor VIII assay(West Chester，OH))测定的，但人因子VIII标准品除外。ELISA测定中使用的人因子VIII标准品是来自US Biologicals(Salem，MA)的重组纯化的人因子VIII(#F0016-06)。

凝血活性测定根据制造商的方案，使用Diagnostica Stago(Boston MA)的活化部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)测定法测定血浆中分泌的人因子VIII的活性，但人因子VIII标准品和人因子VIII缺乏血浆除外。人因子VIII标准品与ELISA分析中使用的标准品相同(重组纯化的人因子VIII，#F0016-06，来自US Biologicals，Salem，MA)。凝血测定中使用的缺陷FVIII试剂是Haematologic Technologies，Inc.(Essex Junction，VT)的FVIII-CD<1％FVIII活性(冷冻缺陷FVIII)。

实施例2：SB-525的制备

使用USP级试剂制备最终产品制剂基础缓冲液SBR-0099，其由磷酸盐缓冲盐水(PBS)组成，其中含有CaCl₂，MgCl₂，35mM NaCl(即0.90mM CaCl₂，0.49mM MgCl₂，2.68mMKCl，1.47mM KH₂PO₄，172mM NaCl，8.10mM Na₂HPO₄)。在最终制剂缓冲液中将SB-525Bulk的目标浓度调整为1.0x10¹³vg/mL，该最终制剂缓冲液包含PBS，其中包含CaCl₂，MgCl₂，35mMNaCl，1％蔗糖，0.05％Kolliphor(Poloxamer)P 188。

SB-525载体是AAV载体，包含AAV6衣壳并且包含SEQ ID NO：5，其分别在5’和3’的侧翼是AAV2 ITR SEQ ID NO：12和13。

通过将剂量水平(vg/kg)乘以受试者的体重(kg)，然后除以病毒基因组浓度(vg/mL)来计算产物组分体积，从而制备SB-525产物。计算得出生理盐水(NS)的体积与SB-525产物的比例为1：1。通过将NS的体积与SB-525产物的体积相加来计算总体积。下表I示出了SB-525产物在受试者中的示例性剂量：

表I：示例性SB-525剂量

剂量水平	总SB-525AAV剂量(vg/kg)
		1	6.00x10<sup>11</sup>
2	9.00x10<sup>11</sup>
		3	1.20x10<sup>12</sup>
4	2.00x10<sup>12</sup>
		5	4.00x10<sup>12</sup>
6	6.00x10<sup>12</sup>
		7	1.00x10<sup>13</sup>

实施例3：输液方案

取决于受试者的剂量水平分配和体重，总体积预计在4mL至200mL之间。如果总体积小于50mL，则通过注射器来施用输液产品，而当体积大于50mL时，通过输液袋来施用输液产品。使用恒定速度输液泵，两种输液速度均为100mL/小时。

实施例4：研究目的和临床终点

纳入和排除标准：对于该研究，纳入标准包括已经被治疗或暴露于FVIII浓缩物或冷沉淀至少150个暴露日的男性且≥18岁的受试者。此外，受试者在过去的12个月中需要发生≥12次出血事件。排除标准包括这样的受试者，其具有抗AAV6衣壳的中和抗体，FVIII抑制剂或既往病史，对FVIII过敏，除A型血友病外还存在任何出血性病症的证据，肝炎标志物以及使用全身性(IV或口服)免疫调节剂。

研究目的：该研究的主要目的是评估安全性。首要目的是检查SB-525的安全性和耐受性，并评估SB-525施用后FVIII活性的时程分布。次要终点包括观察FVIII替代疗法(“因子”)的基线使用变化以及出血事件的频率和严重性，评估给药后对A型血友病的临床影响，并且还评估对FVIII的免疫反应和AAV2/6载体的载体脱落。探索性目标包括通过ELISA和FVIII活性测定评估FVIII水平之间的一致性，并评估对SB-525的任何免疫反应。

大约20名受试者可以参加这项研究。在每个剂量水平上研究的剂量的选择和受试者的数量将基于安全性和在先前给药的受试者中观察到的累积药效学反应(循环FVIII水平的动力学)。

可能需要研究大约7种剂量水平以鉴定安全且可耐受的治疗范围。潜在剂量水平为6x10¹¹、9x10¹¹、1.2x10¹²、2x10¹²、4x10¹²、6x10¹²和1x10¹³vg/kg。在NHP研究中，起始剂量水平(9x10¹¹vg/kg)与正常的12％的FVIII活性相关。

实施例5：初步结果

初步治疗五名患者。发现SB-525通常耐受性良好，没有与治疗相关的严重不良事件，也没有使用类固醇逐渐减少剂量。在第三组(cohort)(剂量水平3)中治疗的一名患者在治疗相关水平上达到了因子VIII的表达，该水平可预测自发性出血和因子使用的显著减少或消除。在第二组(剂量水平2)中，治疗后观察到减少的因子使用。

实施例6：用SB-525基因疗法治疗的八名患者显示出FVIII活性呈剂量依赖性增加，其中用3x10¹³vg/kg剂量治疗的两名患者达到正常FVIII水平

1/2期Alta研究是开放标签的(open-label)剂量变化的(dose-ranging)临床试验，被设计用来评估SB-525在多达20名患有严重A型血友病的成年患者中的安全性和耐受性。数据表明SB-525通常在四个剂量组中耐受性良好，并证明了因子VIII(FVIII)水平呈剂量依赖性增加。

来自用SB-525基因疗法治疗的前八名A型血友病患者的数据令人鼓舞，并证明了剂量依赖性关系，持续因子水平的证据以及每个患者内和每个组内的低差异性。

1/2期数据包括在四个递增剂量组(9x10¹¹vg/kg，2x10¹²vg/kg，1x10¹³vg/kg和3x10¹³vg/kg，每组两名患者)中治疗的八名患者。患者证明了FVIII水平的剂量依赖性的增加，实现了在较高剂量组中FVIII活性的临床相关的增加，和在3x10¹³vg/kg剂量组中正常FVIII水平(正常范围：50-150％)。还观察到使用因子VIII替代疗法的剂量依赖性降低，在较高剂量组中观察到显著降低。SB-525通常耐受性良好，其中一名患者(用3x10¹³vg/kg剂量治疗)报告了与治疗有关的严重不良事件:低血压和发烧，该事件在载体输注后发生，并通过在完成载体输注后24小时内处理得到解决。

研究中的患者未用预防性类固醇治疗。在前三个组中未观察到与治疗相关的严重不良事件，也未观察到需要超过7天皮质类固醇治疗的ALT升高。第四组的一名患者在第四周经历了ALT升高(>1.5x ULN)，需要逐渐减少的口服类固醇疗程。类固醇疗法开始后7周，患者没有任何相关的VIII因子活性丧失或ALT升高。同一名患者经历了治疗相关的输液反应，但按照方案规定的时间表在第二天出院。

表II提供了说明9×10¹¹、2×10¹²、1×10¹³和3×10¹³vg/Kg的AAV载体的剂量施用结果的数据。图1-3提供了施用后获得的FVIII活性数据。

表II.AAV剂量施用的结果。“随访”是指施用后测量FVIII活性水平(第2列)和FVIII治疗频率(第5列)的时间段。

实施例7：·用SB-525基因疗法治疗的十名患者显示出剂量依赖性的FVIII活性增加，其中四名用3x10¹³vg/kg剂量治疗的患者达到正常的FVIII水平

对实施例6中所述的八名患者进行了更多次的随访，并且以3×10¹³vg/kg的剂量将另外两名患者(患者9和10)加入了试验。图4和5绘示了用载体治疗后所有十名患者随时间的FVIII活性。

随着剂量的增加，自发性出血事件消失，并且任何高剂量患者均未报告出血事件。见图6。在载体注射覆盖后约3周后，对于第3组一名患者(1x10¹³vg/kg)和高剂量组(3x10¹³vg/kg)所有患者，FVIII的使用降低至零。患者9在3周又2天进行最后一次输液，但此后没有输液。见图7(星号表示输液发生在3周又2天)。

图8-10总结了临床试验中的不良事件发现。

本文提及的所有专利、专利申请和出版物均通过引用全文并入本文。

尽管出于清楚理解的目的以说明和示例的方式详细地提供了公开，但是对于本领域技术人员显而易见的是，在不脱离本公开的精神或范围的情况下可以进行各种改变和修改。因此，前述说明和示例不应解释为限制性的。

序列表

<110> 桑格摩生物治疗股份有限公司（SANGAMO THERAPEUTICS, INC.）

<120> 通过因子VIII的表达改善临床参数

<130> 1147465

<140>

<141>

<150> 62/869,445

<151> 2019-07-01

<150> 62/826,887

<151> 2019-03-29

<150> 62/714,553

<151> 2018-08-03

<160> 14

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1457

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala Val Glu Leu Ser

20 25 30

Trp Asp Tyr Met Gln Ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro Val Asp Ala Arg

35 40 45

Phe Pro Pro Arg Val Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser Val Val

50 55 60

Tyr Lys Lys Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile

65 70 75 80

Ala Lys Pro Arg Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln

85 90 95

Ala Glu Val Tyr Asp Thr Val Val Ile Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser

100 105 110

His Pro Val Ser Leu His Ala Val Gly Val Ser Tyr Trp Lys Ala Ser

115 120 125

Glu Gly Ala Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp

130 135 140

Asp Lys Val Phe Pro Gly Gly Ser His Thr Tyr Val Trp Gln Val Leu

145 150 155 160

Lys Glu Asn Gly Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr Ser

165 170 175

Tyr Leu Ser His Val Asp Leu Val Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile

180 185 190

Gly Ala Leu Leu Val Cys Arg Glu Gly Ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr

195 200 205

Gln Thr Leu His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala Val Phe Asp Glu Gly

210 215 220

Lys Ser Trp His Ser Glu Thr Lys Asn Ser Leu Met Gln Asp Arg Asp

225 230 235 240

Ala Ala Ser Ala Arg Ala Trp Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr

245 250 255

Val Asn Arg Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val

260 265 270

Tyr Trp His Val Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile

275 280 285

Phe Leu Glu Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser

290 295 300

Leu Glu Ile Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met

305 310 315 320

Asp Leu Gly Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile Ser Ser His Gln His

325 330 335

Asp Gly Met Glu Ala Tyr Val Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro

340 345 350

Gln Leu Arg Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp

355 360 365

Leu Thr Asp Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn Ser

370 375 380

Pro Ser Phe Ile Gln Ile Arg Ser Val Ala Lys Lys His Pro Lys Thr

385 390 395 400

Trp Val His Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro

405 410 415

Leu Val Leu Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn

420 425 430

Asn Gly Pro Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met

435 440 445

Ala Tyr Thr Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu

450 455 460

Ser Gly Ile Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu

465 470 475 480

Leu Ile Ile Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro

485 490 495

His Gly Ile Thr Asp Val Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys

500 505 510

Gly Val Lys His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe

515 520 525

Lys Tyr Lys Trp Thr Val Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp

530 535 540

Pro Arg Cys Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe Val Asn Met Glu Arg

545 550 555 560

Asp Leu Ala Ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu

565 570 575

Ser Val Asp Gln Arg Gly Asn Gln Ile Met Ser Asp Lys Arg Asn Val

580 585 590

Ile Leu Phe Ser Val Phe Asp Glu Asn Arg Ser Trp Tyr Leu Thr Glu

595 600 605

Asn Ile Gln Arg Phe Leu Pro Asn Pro Ala Gly Val Gln Leu Glu Asp

610 615 620

Pro Glu Phe Gln Ala Ser Asn Ile Met His Ser Ile Asn Gly Tyr Val

625 630 635 640

Phe Asp Ser Leu Gln Leu Ser Val Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp

645 650 655

Tyr Ile Leu Ser Ile Gly Ala Gln Thr Asp Phe Leu Ser Val Phe Phe

660 665 670

Ser Gly Tyr Thr Phe Lys His Lys Met Val Tyr Glu Asp Thr Leu Thr

675 680 685

Leu Phe Pro Phe Ser Gly Glu Thr Val Phe Met Ser Met Glu Asn Pro

690 695 700

Gly Leu Trp Ile Leu Gly Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly

705 710 715 720

Met Thr Ala Leu Leu Lys Val Ser Ser Cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp

725 730 735

Tyr Tyr Glu Asp Ser Tyr Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys

740 745 750

Asn Asn Ala Ile Glu Pro Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu

755 760 765

Lys Arg His Gln Arg Glu Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln

770 775 780

Glu Glu Ile Asp Tyr Asp Asp Thr Ile Ser Val Glu Met Lys Lys Glu

785 790 795 800

Asp Phe Asp Ile Tyr Asp Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg Ser Phe

805 810 815

Gln Lys Lys Thr Arg His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp

820 825 830

Asp Tyr Gly Met Ser Ser Ser Pro His Val Leu Arg Asn Arg Ala Gln

835 840 845

Ser Gly Ser Val Pro Gln Phe Lys Lys Val Val Phe Gln Glu Phe Thr

850 855 860

Asp Gly Ser Phe Thr Gln Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His

865 870 875 880

Leu Gly Leu Leu Gly Pro Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile

885 890 895

Met Val Thr Phe Arg Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser

900 905 910

Ser Leu Ile Ser Tyr Glu Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg

915 920 925

Lys Asn Phe Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val

930 935 940

Gln His His Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp

945 950 955 960

Ala Tyr Phe Ser Asp Val Asp Leu Glu Lys Asp Val His Ser Gly Leu

965 970 975

Ile Gly Pro Leu Leu Val Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His

980 985 990

Gly Arg Gln Val Thr Val Gln Glu Phe Ala Leu Phe Phe Thr Ile Phe

995 1000 1005

Asp Glu Thr Lys Ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn

1010 1015 1020

Cys Arg Ala Pro Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys

1025 1030 1035

Glu Asn Tyr Arg Phe His Ala Ile Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr

1040 1045 1050

Leu Pro Gly Leu Val Met Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr

1055 1060 1065

Leu Leu Ser Met Gly Ser Asn Glu Asn Ile His Ser Ile His Phe

1070 1075 1080

Ser Gly His Val Phe Thr Val Arg Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met

1085 1090 1095

Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val Phe Glu Thr Val Glu Met

1100 1105 1110

Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Arg Val Glu Cys Leu Ile Gly

1115 1120 1125

Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe Leu Val Tyr Ser

1130 1135 1140

Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly His Ile Arg

1145 1150 1155

Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp Ala Pro

1160 1165 1170

Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly Ser Ile Asn Ala Trp Ser

1175 1180 1185

Thr Lys Glu Pro Phe Ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro

1190 1195 1200

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe

1205 1210 1215

Ser Ser Leu Tyr Ile Ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr Ser Leu Asp

1220 1225 1230

Gly Lys Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn Ser Thr Gly Thr Leu

1235 1240 1245

Met Val Phe Phe Gly Asn Val Asp Ser Ser Gly Ile Lys His Asn

1250 1255 1260

Ile Phe Asn Pro Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro

1265 1270 1275

Thr His Tyr Ser Ile Arg Ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly

1280 1285 1290

Cys Asp Leu Asn Ser Cys Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys

1295 1300 1305

Ala Ile Ser Asp Ala Gln Ile Thr Ala Ser Ser Tyr Phe Thr Asn

1310 1315 1320

Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser Lys Ala Arg Leu His Leu Gln

1325 1330 1335

Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln Val Asn Asn Pro Lys Glu

1340 1345 1350

Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met Lys Val Thr Gly Val

1355 1360 1365

Thr Thr Gln Gly Val Lys Ser Leu Leu Thr Ser Met Tyr Val Lys

1370 1375 1380

Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln Trp Thr Leu

1385 1390 1395

Phe Phe Gln Asn Gly Lys Val Lys Val Phe Gln Gly Asn Gln Asp

1400 1405 1410

Ser Phe Thr Pro Val Val Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu Thr

1415 1420 1425

Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp Val His Gln Ile Ala

1430 1435 1440

Leu Arg Met Glu Val Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr

1445 1450 1455

<210> 2

<211> 84

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述:

SERPIN1 增强子序列

<400> 2

gggggaggct gctggtgaat attaaccaag atcaccccag ttaccggagg agcaaacagg 60

gactaagttc acacgcgtgg tacc 84

<210> 3

<211> 223

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述:

TTRm启动子序列

<400> 3

gtctgtctgc acatttcgta gagcgagtgt tccgatactc taatctccct aggcaaggtt 60

catatttgtg taggttactt attctccttt tgttgactaa gtcaataatc agaatcagca 120

ggtttggagt cagcttggca gggatcagca gcctgggttg gaaggagggg gtataaaagc 180

cccttcacca ggagaagccg tcacacagat ccacaagctc ctg 223

<210> 4

<211> 4374

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述:

FVIII的编码序列

<400> 4

atgcagatcg agctctccac ctgcttcttt ctgtgcctgt tgagattctg cttcagcgcc 60

accaggagat actacctggg ggctgtggag ctgagctggg actacatgca gtctgacctg 120

ggggagctgc ctgtggatgc caggttcccc cccagagtgc ccaagagctt ccccttcaac 180

acctctgtgg tgtacaagaa gaccctgttt gtggagttca ctgaccacct gttcaacatt 240

gccaagccca ggcccccctg gatgggcctg ctgggcccca ccatccaggc tgaggtgtat 300

gacactgtgg tgatcaccct gaagaacatg gccagccacc ctgtgagcct gcatgctgtg 360

ggggtgagct actggaaggc ctctgagggg gctgagtatg atgaccagac cagccagagg 420

gagaaggagg atgacaaggt gttccctggg ggcagccaca cctatgtgtg gcaggtgctg 480

aaggagaatg gccccatggc ctctgacccc ctgtgcctga cctacagcta cctgagccat 540

gtggacctgg tgaaggacct gaactctggc ctgattgggg ccctgctggt gtgcagggag 600

ggcagcctgg ccaaggagaa gacccagacc ctgcacaagt tcatcctgct gtttgctgtg 660

tttgatgagg gcaagagctg gcactctgaa accaagaaca gcctgatgca ggacagggat 720

gctgcctctg ccagggcctg gcccaagatg cacactgtga atggctatgt gaacaggagc 780

ctgcctggcc tgattggctg ccacaggaag tctgtgtact ggcatgtgat tggcatgggc 840

accacccctg aggtgcacag catcttcctg gagggccaca ccttcctggt caggaaccac 900

aggcaggcca gcctggagat cagccccatc accttcctga ctgcccagac cctgctgatg 960

gacctgggcc agttcctgct gttctgccac atcagcagcc accagcatga tggcatggag 1020

gcctatgtga aggtggacag ctgccctgag gagccccagc tgaggatgaa gaacaatgag 1080

gaggctgagg actatgatga tgacctgact gactctgaga tggatgtggt gaggtttgat 1140

gatgacaaca gccccagctt catccagatc aggtctgtgg ccaagaagca ccccaagacc 1200

tgggtgcact acattgctgc tgaggaggag gactgggact atgcccccct ggtgctggcc 1260

cctgatgaca ggagctacaa gagccagtac ctgaacaatg gcccccagag gattggcagg 1320

aagtacaaga aggtcaggtt catggcctac actgatgaaa ccttcaagac cagggaggcc 1380

atccagcatg agtctggcat cctgggcccc ctgctgtatg gggaggtggg ggacaccctg 1440

ctgatcatct tcaagaacca ggccagcagg ccctacaaca tctaccccca tggcatcact 1500

gatgtgaggc ccctgtacag caggaggctg cccaaggggg tgaagcacct gaaggacttc 1560

cccatcctgc ctggggagat cttcaagtac aagtggactg tgactgtgga ggatggcccc 1620

accaagtctg accccaggtg cctgaccaga tactacagca gctttgtgaa catggagagg 1680

gacctggcct ctggcctgat tggccccctg ctgatctgct acaaggagtc tgtggaccag 1740

aggggcaacc agatcatgtc tgacaagagg aatgtgatcc tgttctctgt gtttgatgag 1800

aacaggagct ggtacctgac tgagaacatc cagaggttcc tgcccaaccc tgctggggtg 1860

cagctggagg accctgagtt ccaggccagc aacatcatgc acagcatcaa tggctatgtg 1920

tttgacagcc tgcagctgtc tgtgtgcctg catgaggtgg cctactggta catcctgagc 1980

attggggccc agactgactt cctgtctgtg ttcttctctg gctacacctt caagcacaag 2040

atggtgtatg aggacaccct gaccctgttc cccttctctg gggagactgt gttcatgagc 2100

atggagaacc ctggcctgtg gattctgggc tgccacaact ctgacttcag gaacaggggc 2160

atgactgccc tgctgaaagt ctccagctgt gacaagaaca ctggggacta ctatgaggac 2220

agctatgagg acatctctgc ctacctgctg agcaagaaca atgccattga gcccaggagc 2280

ttcagccaga atccacccgt ccttaagcgc catcagcgcg agatcaccag gaccaccctg 2340

cagtctgacc aggaggagat tgactatgat gacaccatct ctgtggagat gaagaaggag 2400

gactttgaca tctacgacga ggacgagaac cagagcccca ggagcttcca gaagaagacc 2460

aggcactact tcattgctgc tgtggagagg ctgtgggact atggcatgag cagcagcccc 2520

catgtgctga ggaacagggc ccagtctggc tctgtgcccc agttcaagaa ggtggtgttc 2580

caggagttca ctgatggcag cttcacccag cccctgtaca gaggggagct gaatgagcac 2640

ctgggcctgc tgggccccta catcagggct gaggtggagg acaacatcat ggtgaccttc 2700

aggaaccagg ccagcaggcc ctacagcttc tacagcagcc tgatcagcta tgaggaggac 2760

cagaggcagg gggctgagcc caggaagaac tttgtgaagc ccaatgaaac caagacctac 2820

ttctggaagg tgcagcacca catggccccc accaaggatg agtttgactg caaggcctgg 2880

gcctacttct ctgatgtgga cctggagaag gatgtgcact ctggcctgat tggccccctg 2940

ctggtgtgcc acaccaacac cctgaaccct gcccatggca ggcaggtgac tgtgcaggag 3000

tttgccctgt tcttcaccat ctttgatgaa accaagagct ggtacttcac tgagaacatg 3060

gagaggaact gcagggcccc ctgcaacatc cagatggagg accccacctt caaggagaac 3120

tacaggttcc atgccatcaa tggctacatc atggacaccc tgcctggcct ggtgatggcc 3180

caggaccaga ggatcaggtg gtacctgctg agcatgggca gcaatgagaa catccacagc 3240

atccacttct ctggccatgt gttcactgtg aggaagaagg aggagtacaa gatggccctg 3300

tacaacctgt accctggggt gtttgagact gtggagatgc tgcccagcaa ggctggcatc 3360

tggagggtgg agtgcctgat tggggagcac ctgcatgctg gcatgagcac cctgttcctg 3420

gtgtacagca acaagtgcca gacccccctg ggcatggcct ctggccacat cagggacttc 3480

cagatcactg cctctggcca gtatggccag tgggccccca agctggccag gctgcactac 3540

tctggcagca tcaatgcctg gagcaccaag gagcccttca gctggatcaa ggtggacctg 3600

ctggccccca tgatcatcca tggcatcaag acccaggggg ccaggcagaa gttcagcagc 3660

ctgtacatca gccagttcat catcatgtac agcctggatg gcaagaagtg gcagacctac 3720

aggggcaaca gcactggcac cctgatggtg ttctttggca atgtggacag ctctggcatc 3780

aagcacaaca tcttcaaccc ccccatcatt gccagataca tcaggctgca ccccacccac 3840

tacagcatca ggagcaccct gaggatggag ctgatgggct gtgacctgaa cagctgcagc 3900

atgcccctgg gcatggagag caaggccatc tctgatgccc agatcactgc cagcagctac 3960

ttcaccaaca tgtttgccac ctggagcccc agcaaggcca ggctgcatct gcagggcagg 4020

agcaatgcct ggaggcccca ggtcaacaac cccaaggagt ggctgcaggt ggacttccag 4080

aagaccatga aggtgactgg ggtgaccacc cagggggtga agagcctgct gaccagcatg 4140

tatgtgaagg agttcctgat cagcagcagc caggatggcc accagtggac cctgttcttc 4200

cagaatggca aggtgaaggt gttccagggc aaccaggaca gcttcacccc tgtggtgaac 4260

agcctggacc cccccctgct gaccagatac ctgaggattc acccccagag ctgggtgcac 4320

cagattgccc tgaggatgga ggtgctgggc tgtgaggccc aggacctgta ctga 4374

<210> 5

<211> 4894

<212> DNA

<213> 未知

<220>

<223> 未知的描述:

表达盒序列

<400> 5

gcggcctaag cttggaacca ttgccacctt cagggggagg ctgctggtga atattaacca 60

agatcacccc agttaccgga ggagcaaaca gggactaagt tcacacgcgt ggtaccgtct 120

gtctgcacat ttcgtagagc gagtgttccg atactctaat ctccctaggc aaggttcata 180

tttgtgtagg ttacttattc tccttttgtt gactaagtca ataatcagaa tcagcaggtt 240

tggagtcagc ttggcaggga tcagcagcct gggttggaag gagggggtat aaaagcccct 300

tcaccaggag aagccgtcac acagatccac aagctcctga agaggtaagg gtttaagtta 360

tcgttagttc gtgcaccatt aatgtttaat tacctggagc acctgcctga aatcattttt 420

ttttcaggtt ggctagtatg cagatcgagc tctccacctg cttctttctg tgcctgttga 480

gattctgctt cagcgccacc aggagatact acctgggggc tgtggagctg agctgggact 540

acatgcagtc tgacctgggg gagctgcctg tggatgccag gttccccccc agagtgccca 600

agagcttccc cttcaacacc tctgtggtgt acaagaagac cctgtttgtg gagttcactg 660

accacctgtt caacattgcc aagcccaggc ccccctggat gggcctgctg ggccccacca 720

tccaggctga ggtgtatgac actgtggtga tcaccctgaa gaacatggcc agccaccctg 780

tgagcctgca tgctgtgggg gtgagctact ggaaggcctc tgagggggct gagtatgatg 840

accagaccag ccagagggag aaggaggatg acaaggtgtt ccctgggggc agccacacct 900

atgtgtggca ggtgctgaag gagaatggcc ccatggcctc tgaccccctg tgcctgacct 960

acagctacct gagccatgtg gacctggtga aggacctgaa ctctggcctg attggggccc 1020

tgctggtgtg cagggagggc agcctggcca aggagaagac ccagaccctg cacaagttca 1080

tcctgctgtt tgctgtgttt gatgagggca agagctggca ctctgaaacc aagaacagcc 1140

tgatgcagga cagggatgct gcctctgcca gggcctggcc caagatgcac actgtgaatg 1200

gctatgtgaa caggagcctg cctggcctga ttggctgcca caggaagtct gtgtactggc 1260

atgtgattgg catgggcacc acccctgagg tgcacagcat cttcctggag ggccacacct 1320

tcctggtcag gaaccacagg caggccagcc tggagatcag ccccatcacc ttcctgactg 1380

cccagaccct gctgatggac ctgggccagt tcctgctgtt ctgccacatc agcagccacc 1440

agcatgatgg catggaggcc tatgtgaagg tggacagctg ccctgaggag ccccagctga 1500

ggatgaagaa caatgaggag gctgaggact atgatgatga cctgactgac tctgagatgg 1560

atgtggtgag gtttgatgat gacaacagcc ccagcttcat ccagatcagg tctgtggcca 1620

agaagcaccc caagacctgg gtgcactaca ttgctgctga ggaggaggac tgggactatg 1680

cccccctggt gctggcccct gatgacagga gctacaagag ccagtacctg aacaatggcc 1740

cccagaggat tggcaggaag tacaagaagg tcaggttcat ggcctacact gatgaaacct 1800

tcaagaccag ggaggccatc cagcatgagt ctggcatcct gggccccctg ctgtatgggg 1860

aggtggggga caccctgctg atcatcttca agaaccaggc cagcaggccc tacaacatct 1920

acccccatgg catcactgat gtgaggcccc tgtacagcag gaggctgccc aagggggtga 1980

agcacctgaa ggacttcccc atcctgcctg gggagatctt caagtacaag tggactgtga 2040

ctgtggagga tggccccacc aagtctgacc ccaggtgcct gaccagatac tacagcagct 2100

ttgtgaacat ggagagggac ctggcctctg gcctgattgg ccccctgctg atctgctaca 2160

aggagtctgt ggaccagagg ggcaaccaga tcatgtctga caagaggaat gtgatcctgt 2220

tctctgtgtt tgatgagaac aggagctggt acctgactga gaacatccag aggttcctgc 2280

ccaaccctgc tggggtgcag ctggaggacc ctgagttcca ggccagcaac atcatgcaca 2340

gcatcaatgg ctatgtgttt gacagcctgc agctgtctgt gtgcctgcat gaggtggcct 2400

actggtacat cctgagcatt ggggcccaga ctgacttcct gtctgtgttc ttctctggct 2460

acaccttcaa gcacaagatg gtgtatgagg acaccctgac cctgttcccc ttctctgggg 2520

agactgtgtt catgagcatg gagaaccctg gcctgtggat tctgggctgc cacaactctg 2580

acttcaggaa caggggcatg actgccctgc tgaaagtctc cagctgtgac aagaacactg 2640

gggactacta tgaggacagc tatgaggaca tctctgccta cctgctgagc aagaacaatg 2700

ccattgagcc caggagcttc agccagaatc cacccgtcct taagcgccat cagcgcgaga 2760

tcaccaggac caccctgcag tctgaccagg aggagattga ctatgatgac accatctctg 2820

tggagatgaa gaaggaggac tttgacatct acgacgagga cgagaaccag agccccagga 2880

gcttccagaa gaagaccagg cactacttca ttgctgctgt ggagaggctg tgggactatg 2940

gcatgagcag cagcccccat gtgctgagga acagggccca gtctggctct gtgccccagt 3000

tcaagaaggt ggtgttccag gagttcactg atggcagctt cacccagccc ctgtacagag 3060

gggagctgaa tgagcacctg ggcctgctgg gcccctacat cagggctgag gtggaggaca 3120

acatcatggt gaccttcagg aaccaggcca gcaggcccta cagcttctac agcagcctga 3180

tcagctatga ggaggaccag aggcaggggg ctgagcccag gaagaacttt gtgaagccca 3240

atgaaaccaa gacctacttc tggaaggtgc agcaccacat ggcccccacc aaggatgagt 3300

ttgactgcaa ggcctgggcc tacttctctg atgtggacct ggagaaggat gtgcactctg 3360

gcctgattgg ccccctgctg gtgtgccaca ccaacaccct gaaccctgcc catggcaggc 3420

aggtgactgt gcaggagttt gccctgttct tcaccatctt tgatgaaacc aagagctggt 3480

acttcactga gaacatggag aggaactgca gggccccctg caacatccag atggaggacc 3540

ccaccttcaa ggagaactac aggttccatg ccatcaatgg ctacatcatg gacaccctgc 3600

ctggcctggt gatggcccag gaccagagga tcaggtggta cctgctgagc atgggcagca 3660

atgagaacat ccacagcatc cacttctctg gccatgtgtt cactgtgagg aagaaggagg 3720

agtacaagat ggccctgtac aacctgtacc ctggggtgtt tgagactgtg gagatgctgc 3780

ccagcaaggc tggcatctgg agggtggagt gcctgattgg ggagcacctg catgctggca 3840

tgagcaccct gttcctggtg tacagcaaca agtgccagac ccccctgggc atggcctctg 3900

gccacatcag ggacttccag atcactgcct ctggccagta tggccagtgg gcccccaagc 3960

tggccaggct gcactactct ggcagcatca atgcctggag caccaaggag cccttcagct 4020

ggatcaaggt ggacctgctg gcccccatga tcatccatgg catcaagacc cagggggcca 4080

ggcagaagtt cagcagcctg tacatcagcc agttcatcat catgtacagc ctggatggca 4140

agaagtggca gacctacagg ggcaacagca ctggcaccct gatggtgttc tttggcaatg 4200

tggacagctc tggcatcaag cacaacatct tcaacccccc catcattgcc agatacatca 4260

ggctgcaccc cacccactac agcatcagga gcaccctgag gatggagctg atgggctgtg 4320

acctgaacag ctgcagcatg cccctgggca tggagagcaa ggccatctct gatgcccaga 4380

tcactgccag cagctacttc accaacatgt ttgccacctg gagccccagc aaggccaggc 4440

tgcatctgca gggcaggagc aatgcctgga ggccccaggt caacaacccc aaggagtggc 4500

tgcaggtgga cttccagaag accatgaagg tgactggggt gaccacccag ggggtgaaga 4560

gcctgctgac cagcatgtat gtgaaggagt tcctgatcag cagcagccag gatggccacc 4620

agtggaccct gttcttccag aatggcaagg tgaaggtgtt ccagggcaac caggacagct 4680

tcacccctgt ggtgaacagc ctggaccccc ccctgctgac cagatacctg aggattcacc 4740

cccagagctg ggtgcaccag attgccctga ggatggaggt gctgggctgt gaggcccagg 4800

acctgtactg aggatccaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt 4860

tgtgtgtttt cctgtaacga tcgggctcga gcgc 4894

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成引物

<400> 6

ggagatgaag aaggaggact ttg 23

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成探针

<400> 7

acatctacga cgaggacgag aacca 25

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成引物

<400> 8

tccacagcag caatgaagta g 21

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成引物

<400> 9

cctgggccag ttcctgct 18

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成探针

<400> 10

ttctgccaca tcagcagcca cca 23

<210> 11

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 人工序列描述: 合成引物

<400> 11

ggcctccatg ccatcatg 18

<210> 12

<211> 130

<212> DNA

<213> 腺伴随病毒

<400> 12

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60

ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120

aggggttcct 130

<210> 13

<211> 108

<212> DNA

<213> 腺伴随病毒

<400> 13

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgcccgggc tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcag 108

<210> 14

<211> 19

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Met Gln Ile Glu Leu Ser Thr Cys Phe Phe Leu Cys Leu Leu Arg Phe

1 5 10 15

Cys Phe Ser

Claims (15)

1.一种在人受试者中增加因子VIII(FVIII)蛋白的方法，包括向人受试者施用一剂或者多剂的5×10¹²至5×10¹³vg/kg的编码FVIII蛋白的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体的施用导致循环FVIII活性水平的临床上相关的增加。

2.一种在人受试者中增加因子VIII(FVIII)蛋白的方法，包括向人受试者施用一剂或者多剂的5×10¹²至5×10¹³vg/kg的编码FVIII蛋白的腺病毒伴随病毒(AAV)载体，其中所述AAV载体的施用导致所述人受试者经历FVIII治疗的次数减少。

3.权利要求1或2的方法，其中所述施用导致在施用后3-12个月之间在所述人受试者中自发性出血事件的一次或零次发生。

4.权利要求1或2的方法，包括施用一剂或者多剂的1×10¹³vg/kg至3×10¹³vg/kg。

5.权利要求1或2的方法，包括施用一剂或者多剂的2×10¹³vg/kg至4×10¹³vg/kg。

6.权利要求1或2的方法，包括施用一剂或者多剂的3×10¹³vg/kg。

7.权利要求1或2的方法，其中所述FVIII包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列。

8.权利要求1-7中任一项的方法，其中所述AAV载体具有AAV6血清型。

9.权利要求8的方法，其中所述AAV载体包含表达盒，所述表达盒包含与肝特异性增强子和启动子可操作连接的编码FVIII蛋白的多核苷酸。

10.权利要求9的方法，其中所述肝特异性增强子包含SEQ ID NO：2的核苷酸序列和/或启动子包含SEQ ID NO：3的核苷酸序列。

11.权利要求8至10中任一项的方法，其中所述AAV载体包含所述表达盒侧翼的AAV2 5'反向末端重复(ITR)序列和AAV2 3'ITR序列。

12.权利要求8至10中任一项的方法，其中所述AAV2 5′ITR包含SEQ ID NO：12的核苷酸序列和/或AAV2 3′ITR包含SEQ ID NO：13的核苷酸序列。

13.权利要求8至12中任一项的方法，其中所述表达盒的序列包含SEQ ID NO：5的核苷酸序列。

14.权利要求1至13中任一项的方法，其中所述人受试者具有血友病。

15.权利要求2的方法，其中所述人受试者在施用后3-12个月没有接受任何FVIII治疗。

Images