JP7244547B2 - Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法 - Google Patents
Ｆ８遺伝子機能を回復させるためのアデノ随伴ウイルス組成物及びその使用の方法 Download PDFInfo
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関連出願
本出願は、2018年2月19日出願の米国仮特許出願第62/632,300号、2018年2月20日出願の米国仮特許出願第62/639,919号及び2018年5月16日出願の米国仮特許出願第62/672,385号に対する優先権を主張し、これらの全開示は、本明細書で参照により組み込まれる。
本出願は、2018年2月19日出願の米国仮特許出願第62/632,300号、2018年2月20日出願の米国仮特許出願第62/639,919号及び2018年5月16日出願の米国仮特許出願第62/672,385号に対する優先権を主張し、これらの全開示は、本明細書で参照により組み込まれる。
電子提出された配列表に対する言及
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政府の利益の陳述
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金番号P30CA033572の下で、政府の支持によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所(National Institutes of Health)によって授与された助成金番号P30CA033572の下で、政府の支持によってなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
第VIII因子(FVIII)は、抗血友病因子としても公知であり、正常な血液凝固にとって重要な循環糖タンパク質である。第VIII因子は、肝臓類洞内皮細胞及び肝臓の外側の内皮細胞によって産生される。このタンパク質は、血管を損傷する傷害が生じるまで、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)と呼ばれる別の分子に結合した不活性形態で血流中を循環する。傷害に応答して、FVIIIは活性化され、vWFから分離する。活性タンパク質FVIIIaは、第IX因子と呼ばれる別の凝固因子と相互作用して、血餅を形成する更なる化学反応のカスケードを開始させる。
血友病Aは、第VIII因子欠乏症又は古典的血友病とも呼ばれ、欠けた又は欠損した第VIII因子によって引き起こされる遺伝性(inherited)又は自然発生的な遺伝性(genetic)障害である。症例の大部分では、これは、X連鎖劣性形質として遺伝するが、症例のほぼ3分の1は、自然発生的な変異から生じる。臨床的には、血友病Aは、内出血又は外出血エピソードを特徴とする。より重症な血友病を有する個体は、より重症かつより頻繁な出血に苦しむが、軽度の血友病を有する他の個体は、典型的には、手術又は重篤な外傷の後を除き、より軽症の症状に苦しむ;中程度の血友病を有する個体は、重症な形態と軽度の形態との間のスペクトルに沿って現れる変動する症状を有する。
FVIIIの遺伝子であるF8は、X染色体の長腕上、Xq28領域内に位置する。この遺伝子は、X染色体の186kbに相当する。これは、26個のエクソン及び25個のイントロンを含む9kbのコード領域を含む。成熟FVIIIは、2332アミノ酸を含む単鎖ポリペプチドである。重症FVIII欠乏症の症例のおよそ40%は、F8遺伝子を破壊する、イントロン22が関与する大きい逆位から生じる。欠失、挿入及び点変異は、血友病Aを引き起こすF8欠損の残り50～60%を説明する。
現在、血友病Aには治癒が存在しない。中程度から重症までの血友病A又は急性出血エピソードを有する患者について、処置には、典型的には、組換えFVIII又はヒト献血に由来するFVIIIの注入が関与する。患者はまた、FVIII又はデスモプレシン(DDAVP)の定期的な注入によって予防的に処置され得、後者は、フォン・ヴィレブランド因子(vWF)の放出を直接的に促進し、FVIII半減期を間接的に促進する。
遺伝子治療は、遺伝性障害を治癒する独自の機会を提供する。レンチウイルスベクターを含むレトロウイルスベクターは、核酸を宿主細胞ゲノム中に組み込むことが可能である。しかし、これらのベクターは、ゲノム中へのそれらの非標的化挿入に起因して、安全性の懸念を生じ得る。例えば、ベクターには、腫瘍抑制遺伝子を破壊する又は癌遺伝子を活性化し、それによって悪性腫瘍を引き起こすリスクがある。実際、CD34+骨髄前駆体をガンマレトロウイルスベクターで形質導入することによってX連鎖重症複合免疫不全(X-SCID)を処置するための臨床試験において、10人の患者のうち4人が白血病を発症した(Hacein-Bey-Abinaら、J. Clin. Invest. (2008) 118(9):3132～42)。
ヌクレアーゼベースの遺伝子編集テクノロジー、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びクラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート(CRISPR)テクノロジーが、患者において遺伝子中の欠損を修正するために使用され得る。しかし、これらのテクノロジーは各々、意図した標的部位と配列が類似したヒトゲノム中の部位のオフターゲット変異の可能性に起因して、安全性の懸念を生じる。
Hacein-Bey-Abinaら、J. Clin. Invest. (2008) 118(9):3132～42
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従って、血友病A患者においてF8遺伝子機能を効率的かつ安全に回復させることができる改善された遺伝子治療の組成物及び方法が、当該分野で必要とされている。
細胞においてF8遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス(AAV)組成物、及びF8遺伝子機能の低減と関連する疾患(例えば、血友病A)を処置するためにかかる組成物を使用するための方法が、本明細書で提供される。このアデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムもまた提供される。
本明細書で開示されるAAV組成物及び方法は、外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNAガイドされるヌクレアーゼ、例えばCas9)を使用するゲノムDNAの切断を必要とせずに、F8遺伝子中の変異のin vivoでの高度に効率的な修正を可能にするという点で、特に有利である。
従って、一態様では、本開示は、AAVカプシド;並びに(i)F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント;(ii)標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して5'側の5'相同性アームヌクレオチド配列;及び(iii)標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して3'側の3'相同性アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含む複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)であって、5'相同性アーム、編集エレメント及び3'相同性アームを含む修正ゲノムの一部分が、F8遺伝子座に対して、センス又はアンチセンス配向であり得る、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)を提供する。
別の態様では、細胞においてF8遺伝子中の変異を修正するための方法であって、細胞を、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)で形質導入する工程を含み、AAVが、AAVカプシド;並びに(i)F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント;(ii)標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して5'側の5'相同性アームヌクレオチド配列;及び(iii)標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して3'側の3'相同性アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含み、5'相同性アーム、編集エレメント及び3'相同性アームを含む修正ゲノムの一部分が、F8遺伝子座に対して、センス又はアンチセンス配向であり得、細胞が、外因性ヌクレアーゼ又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入も共投与もすることなしに形質導入される、方法。
ある特定の実施形態では、細胞は、肝細胞又は内皮細胞である。ある特定の実施形態では、内皮細胞は、肝類洞内皮細胞である。ある特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物対象中にあり、AAVは、対象中の細胞を形質導入するのに有効な量で対象に投与される。
別の態様では、本開示は、F8遺伝子変異と関連する疾患又は障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、複製欠損AAVの有効量を投与する工程を含み、前記AAVが、AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシド;並びに(i)F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント;(ii)標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して5'側の5'相同性アームヌクレオチド配列;及び(iii)標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して3'側の3'相同性アームヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含み、外因性ヌクレアーゼも外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列も対象に共投与されない、方法を提供する。
ある特定の実施形態では、疾患又は障害は、血友病Aである。ある特定の実施形態では、対象は、ヒト対象である。
以下の実施形態は、上述の態様の各々に適用される。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の一部分を含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、配列番号25に示されるアミノ酸配列をコードする。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、配列番号26に示される配列を含む又はそれからなる。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、サイレントに変更される。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'へと、F8コード配列の一部分及びポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、配列番号26に示される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476とヌクレオチド126,477との間のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476に対して3'側に隣接したヌクレオチド配列である。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'へと、スプライスアクセプター部位、F8コード配列の一部分、及び任意選択でポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン中にある。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、配列番号26に示される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン22中にある。
ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、SV40ポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、SV40ポリアデニル化配列は、配列番号23、35、36又は37に示されるヌクレオチド配列を有する。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号33に示される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、5'相同性アームヌクレオチド配列は、第1のゲノム領域に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である。ある特定の実施形態では、3'相同性アームヌクレオチド配列は、第2のゲノム領域に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である。ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1の編集ウインドウ中に位置し、第2のゲノム領域は、第2の編集ウインドウ中に位置する。ある特定の実施形態では、第1の編集ウインドウは、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第2の編集ウインドウは、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第1の編集ウインドウは、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなり、第2の編集ウインドウは、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームヌクレオチド配列の各々は、約100～約4500ヌクレオチドの長さを独立して有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号38～41からなる群から選択される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'相同性アームヌクレオチド配列に対して5'側の5'逆位末端配列(5'ITR)ヌクレオチド配列及び3'相同性アームヌクレオチド配列に対して3'側の3'逆位末端配列(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号46に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率は、AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも2%である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度は、AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも1%である。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、AAVクレードFカプシドタンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。
ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸151に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸160に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はDである;配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。
ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
(a)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(b)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(c)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(d)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(e)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はTである;配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸68に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はVである;配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はLである;配列番号2のアミノ酸151に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸160に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はDである;配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。
ある特定の実施形態では、
(a)配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はTであり、配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はYである;
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はLであり、配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
(a)配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はTであり、配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;
(b)配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はYである;
(c)配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;
(d)配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はLであり、配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;
(e)配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである;
(f)配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;
(g)配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;
(h)配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;又は
(i)配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。
ある特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含む。
別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるAAVを含む医薬組成物を提供する。
別の態様では、本開示は、AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムであって、1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列;本明細書に記載される1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列;及び本明細書に記載される修正ゲノムであって、パッケージングシステムが、カプシド中に修正ゲノムを封入してAAVを形成するための細胞において動作可能である、修正ゲノムを含むパッケージングシステムを提供する。
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、Repヌクレオチド配列及びCapヌクレオチド配列を含む第1のベクター並びに修正ゲノムを含む第2のベクターを含む。ある特定の実施形態では、Repヌクレオチド配列は、AAV2 Repタンパク質をコードする。ある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、78/68又はRep 68/52である。ある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最小のパーセント配列同一性は、AAV2 Repタンパク質をコードするアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%である。
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、ヘルパーウイルスベクターである第3のベクターを更に含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、独立した第3のベクターである。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第1のベクターと一体である。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスベクターは、第2のベクターと一体である。ある特定の実施形態では、第3のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びサイトメガロウイルス(CMV)からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルスである。ある特定の実施形態では、アデノウイルスのゲノムは、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む。ある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、単純ヘルペスウイルス(HSV)である。ある特定の実施形態では、HSVのゲノムは、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうち1つ又は複数を含む。
ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、第1のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、第2のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルス中にクローニングされる。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターのヌクレオチドは、組換えヘルパーウイルス中にクローニングされる。
別の態様では、本開示は、AAVの組換え調製のための方法であって、カプシド中に修正ゲノムを封入してAAVを形成するのに動作可能な条件下で、本明細書に記載されるパッケージングシステムを細胞中に導入する工程を含む、方法を提供する。
本開示は、細胞においてF8遺伝子機能を回復させることができるアデノ随伴ウイルス(AAV)組成物を提供した。このアデノ随伴ウイルス組成物を作製するためのパッケージングシステムもまた提供される。
I.定義
本明細書で使用する場合、用語「複製欠損アデノ随伴ウイルス」は、Rep遺伝子及びCap遺伝子を欠くゲノムを含むAAVを指す。
本明細書で使用する場合、用語「複製欠損アデノ随伴ウイルス」は、Rep遺伝子及びCap遺伝子を欠くゲノムを含むAAVを指す。
本明細書で使用する場合、用語「F8遺伝子」は、F8遺伝子のコード領域、エクソン、イントロン、5'UTR、3'UTR及び転写調節領域が含まれるがこれらに限定されない、FVIIIタンパク質をコードする野生型又は変異体遺伝子を指す。ヒトF8遺伝子は、Entrez遺伝子ID 2157によって同定される。野生型ヒトF8遺伝子は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5,001～191,936によって同定される。全長ヒトF8 cDNAの例示的なヌクレオチド配列は、NCBI参照番号:NM_000132.3によって同定される。その19アミノ酸のシグナルペプチドを含む全長ヒトFVIIIポリペプチドの例示的なアミノ酸配列は、NCBI参照番号:NP_000123.1によって同定される。ヒトF8のイントロン22は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド131,648～164,496(32,849nt)に対応する。
本明細書で使用する場合、用語「F8遺伝子中の変異を修正すること」は、野生型FVIIIポリペプチド又はその機能的等価物を発現することが可能なF8遺伝子を創出するための、変異体F8遺伝子中の標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を指す。ある特定の実施形態では、「F8遺伝子中の変異を修正すること」は、野生型FVIIIポリペプチド又はその機能的等価物が(例えば、内因性F8遺伝子プロモーターの制御下で)変異体F8遺伝子座から発現されるように、野生型FVIIIポリペプチド又はその機能的等価物の少なくとも一部分をコードするヌクレオチド配列を、変異体F8遺伝子中に挿入することを含む。当業者は、5'相同性アーム、編集エレメント及び3' 相同性アームを含む修正ゲノムの一部分が、標的遺伝子座(例えば、ヒトF8遺伝子)に対して、センス又はアンチセンス配向であり得ることを理解する。
本明細書で使用する場合、用語「修正ゲノム」は、F8遺伝子中の遺伝的欠損を修正するために、相同組換えを介して標的遺伝子座中に編集エレメント(例えば、1つ若しくは複数のヌクレオチド又はヌクレオチド間結合)を組み込むことが可能な、組換えAAVゲノムを指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトF8遺伝子中にある。当業者は、5'相同性アーム、編集エレメント及び3' 相同性アームを含む修正ゲノムの一部分が、標的遺伝子座(例えば、ヒトF8遺伝子)に対して、センス又はアンチセンス配向であり得ることを理解する。
本明細書で使用する場合、用語「編集エレメント」は、標的遺伝子座において組み込まれた場合に標的遺伝子座を改変する、修正ゲノムの一部分を指す。編集エレメントは、標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を媒介することができる。
本明細書で使用する場合、用語「標的遺伝子座」は、編集エレメントによって改変される染色体の領域又はヌクレオチド間結合(例えば、ヒトF8遺伝子の領域又はヌクレオチド間結合)を指す。
本明細書で使用する場合、用語「相同性アーム」は、標的遺伝子座に隣接するゲノムに対して実質的に同一な、編集エレメントに対して5'側又は3'側に位置付けられる、修正ゲノムの一部分を指す。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、ヒトF8遺伝子中にあり、相同性アームは、標的遺伝子座に隣接するゲノムに対して実質的に同一な配列を含む。
本明細書で使用する場合、用語「クレードFカプシドタンパク質」は、本明細書の配列番号1のアミノ酸1～736、138～736及び203～736にそれぞれ示されるVP1、VP2又はVP3アミノ酸配列に対して少なくとも90%の同一性を有するAAV VP1、VP2又はVP3カプシドタンパク質を指す。本明細書で使用する場合、2つのヌクレオチド配列間又は2つのアミノ酸配列間の同一性は、長い方のヌクレオチド又はアミノ酸配列の全長によって除算した、アラインメント中の同一なヌクレオチド又はアミノ酸の数によって決定される。
本明細書で使用する場合、用語「F8遺伝子変異と関連する疾患又は障害」は、F8遺伝子の変異によって引き起こされる、それによって増悪される、又はそれと遺伝的に関連する、任意の疾患又は障害を指す。ある特定の実施形態では、F8遺伝子変異と関連する疾患又は障害は、血友病Aである。
本明細書で使用する場合、用語「コード配列」は、開始コドンで始まり停止コドンで終わる、ポリペプチドをコードする相補的DNA(cDNA)の一部分を指す。遺伝子は、選択的スプライシング及び/又は選択的翻訳開始に起因して1つ又は複数のコード配列を有し得る。コード配列は、野生型であり得る又はサイレントに変更され得る。例示的な全長野生型F8コード配列は、NCBI参照番号:NM_000132.3のヌクレオチド172～7,227によって同定される。エクソン22～26に対応する、野生型F8コード配列の例示的な一部分は、配列番号26に示される。
本明細書で使用する場合、用語「サイレントに変更される」又は「サイレントな変更」は、その遺伝子によってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることのない、(例えば、ヌクレオチド置換による)遺伝子のコード配列の変更を指す。ある特定の実施形態では、サイレントな変更は、コード配列の発現レベルを増加させる。ある特定の実施形態では、サイレントな変更は、所望でないゲノム遺伝子座へのオフターゲティングを低減させる。
本明細書で使用する場合、用語「ポリアデニル化配列」は、RNAに転写された場合にポリアデニル化シグナル配列を構成するDNA配列を指す。ポリアデニル化配列は、ネイティブ(例えば、F8遺伝子由来)又は外因性であり得る。外因性ポリアデニル化配列は、哺乳動物又はウイルスのポリアデニル化配列(例えば、SV40ポリアデニル化配列)であり得る。
本開示では、F8遺伝子中のヌクレオチド位置は、開始コドンの最初のヌクレオチドに対して特定される。開始コドンの最初のヌクレオチドは、1位である;開始コドンの最初のヌクレオチドに対して5'側のヌクレオチドは、負の番号を有する;開始コドンの最初のヌクレオチドに対して3'側のヌクレオチドは、正の番号を有する。当業者は、遺伝子が、選択的スプライシング及び/又は選択的翻訳開始に起因して複数の開始コドンを有し得ることを理解する。本明細書で使用する場合、ヒトF8遺伝子のヌクレオチド1は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5172である。開始コドンに対して5'側に隣接したヌクレオチドは、ヌクレオチド-1である。従って、ヒトF8遺伝子のヌクレオチド-1は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5173である。本明細書で使用する場合、マウスF8遺伝子のヌクレオチド1は、マイナス鎖上のNCBI参照配列:NC_000086.7のヌクレオチド75,383,525である。
本開示では、F8遺伝子中のエクソン及びイントロンは、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5,172である開始コドンの最初のヌクレオチドを包含するエクソンに対して特定される。開始コドンの最初のヌクレオチドを包含するエクソンは、エクソン1である。エクソン1に対して3'側のエクソンは、5'から3'へと、エクソン2、エクソン3等である。エクソン1に対して3'側のイントロンは、5'から3'へと、イントロン1、イントロン2等である。従って、F8遺伝子は、5'から3'へと、エクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3等を含む。当業者は、遺伝子が、複数の異なるmRNAへと転写され得ることを理解する。このように、遺伝子(例えば、F8)は、複数の異なるセットのエクソン及びイントロンを有し得る。本明細書で使用する場合、ヒトF8遺伝子のエクソン1は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5,001～5,314である。ヒトF8遺伝子の例示的なイントロン1は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド5,315～28,123である。ヒトF8遺伝子の例示的なエクソン22は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド131,492～131,647(156nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なイントロン22は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド131,648～164,496(32,849nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なエクソン23は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド164,497～164,641(145nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なイントロン23は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド164,642～165,857(1216nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なエクソン24は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド165,858～166,006(149nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なイントロン24は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド166,007～167,115(1109nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なエクソン25は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド167,116～167,292(177nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なイントロン25は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド167,293～189,971(22,679nt)である。ヒトF8遺伝子の例示的なエクソン26は、NCBI参照配列:NG_011403.1のヌクレオチド189,972～191,936(1965nt)である。
本明細書で使用する場合、用語「組込み」は、修正ゲノムと標的遺伝子との間の相同組換えによる、標的遺伝子の標的遺伝子座中への編集エレメントの導入を指す。編集エレメントの組込みは、標的遺伝子中の1つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び/又は欠失を生じ得る。例えば、ある特定の実施形態では、用語「組込み」は、修正ゲノムとF8遺伝子との間の相同組換えによる、F8遺伝子の標的遺伝子座中への編集エレメントの導入を指す。編集エレメントの組込みは、F8遺伝子中の1つ又は複数のヌクレオチドの置換、挿入及び/又は欠失を生じ得る。
本明細書で使用する場合、用語「標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率」は、形質導入された集団中の、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みが生じた細胞のパーセンテージを指す。
本明細書で使用する場合、用語「標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度」は、形質導入された細胞の集団中の、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みが生じた対立遺伝子のパーセンテージを指す。
本明細書で使用する場合、用語「標準的なAAV形質導入条件」は、1.5×105の感染多重度(MOI)のAAVによるBリンパ芽球様細胞の形質導入を指し、ここで、細胞は、5%二酸化炭素(CO2)のインキュベーター環境中37℃で、15%胎仔ウシ血清(FCS)及び2mmol/LのL-グルタミンを補充したRPMI-1640培地中で培養され、対数期増殖中の細胞は、1ml当たりおよそ200,000細胞で播種され、同じ日に感染され、AAVは、リン酸緩衝食塩水(PBS)中に製剤化され、AAVは、培養培地の体積の5%以下の体積で、Bリンパ芽球様細胞を含む細胞培養培地に添加される。
本明細書で使用する場合、「外因性ポリアデニル化配列」は、遺伝子(例えば、ヒト遺伝子)の内因性ポリアデニル化配列と同一でも実質的に同一でもないポリアデニル化配列を指す。例えば、ある特定の実施形態では、「外因性ポリアデニル化配列」は、F8遺伝子(例えば、ヒトF8遺伝子)の内因性ポリアデニル化配列と同一でも実質的に同一でもないポリアデニル化配列を指す。ある特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、同じ種(例えば、ヒト)中の非F8遺伝子のポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、異なる種(例えば、ウイルス)のポリアデニル化配列である。
本明細書で使用する場合、対象へのAAVの投与に関して、用語「有効量」は、所望の予防効果又は治療効果を達成するAAVの量を指す。
II.アデノ随伴ウイルス組成物
一態様では、低減された又は他の方法で欠損したF8遺伝子機能を有する細胞においてF8発現を回復させるために有用な新規複製欠損AAV組成物が、本明細書で提供される。かかるAAV組成物は、F8遺伝子中の変異を修正する又はF8発現を回復させるのに高度に効率的であり、かかる修正を促進するために、外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNAガイドされるヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座におけるゲノムの切断を必要としない。従って、ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAV組成物は、外因性ヌクレアーゼも外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列も含まない。
一態様では、低減された又は他の方法で欠損したF8遺伝子機能を有する細胞においてF8発現を回復させるために有用な新規複製欠損AAV組成物が、本明細書で提供される。かかるAAV組成物は、F8遺伝子中の変異を修正する又はF8発現を回復させるのに高度に効率的であり、かかる修正を促進するために、外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNAガイドされるヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座におけるゲノムの切断を必要としない。従って、ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAV組成物は、外因性ヌクレアーゼも外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列も含まない。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAVは、AAVカプシドタンパク質を含むAAVカプシド;及びF8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための修正ゲノムを含む。
本明細書で開示されるAAV組成物において使用され得るAAVカプシドタンパク質には、クレードA AAV、クレードB AAV、クレードC AAV、クレードD AAV、クレードE AAV及びクレードF AAVのAAVカプシドタンパク質及びその誘導体が含まれるがこれらに限定されない。ある特定の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9又はAAVrh10のAAVカプシドタンパク質又はその誘導体である。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドタンパク質は、クレードF AAVカプシドタンパク質である。任意のAAVクレードFカプシドタンパク質又はその誘導体が、本明細書で開示されるAAV組成物において使用され得る。例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、6、7、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含む。
例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸151に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸160に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はDである;配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含む。
例えば、ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はTである;配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸68に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はVである;配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はLである;配列番号2のアミノ酸151に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸160に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はDである;配列番号2のアミノ酸206に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHである;配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである;配列番号2のアミノ酸346に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はAである;配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNである;配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである;配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIである;配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸590に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はG若しくはYである;配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである;配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである;配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである;配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである;又は配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸2に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はTであり、配列番号2のアミノ酸312に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はQである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸65に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はYである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸77に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸690に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はKである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸119に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はLであり、配列番号2のアミノ酸468に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はSである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸626に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGであり、配列番号2のアミノ酸718に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はGである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸296に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はHであり、配列番号2のアミノ酸464に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はNであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸681に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はMである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸687に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸346に対応するカ
プシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含む。
プシドタンパク質中のアミノ酸はAであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRである。ある特定の実施形態では、配列番号2のアミノ酸501に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はIであり、配列番号2のアミノ酸505に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はRであり、配列番号2のアミノ酸706に対応するカプシドタンパク質中のアミノ酸はCである。ある特定の実施形態では、AAVクレードFカプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、a)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;b)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及びc)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、a)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸203～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;b)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸138～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;及びc)配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16又は17のアミノ酸1～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号8のアミノ酸138～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号8のアミノ酸1～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号8のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号8のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号8のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号8のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号8のアミノ酸203～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号8のアミノ酸138～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号8のアミノ酸1～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号11のアミノ酸138～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号11のアミノ酸1～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号11のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号11のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号11のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号11のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号11のアミノ酸203～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号11のアミノ酸138～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号11のアミノ酸1～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号13のアミノ酸138～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号13のアミノ酸1～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号13のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号13のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号13のアミノ酸138～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号13のアミノ酸1～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号16のアミノ酸138～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号16のアミノ酸1～736の配列に対して少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号16のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち1つ又は複数を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号16のアミノ酸1～736のアミノ酸配列を含むクレードFカプシドタンパク質、のうち2つ以上を含む。ある特定の実施形態では、AAVカプシドは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;(b)配列番号16のアミノ酸138～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質;及び(c)配列番号16のアミノ酸1～736からなるアミノ酸配列を有するクレードFカプシドタンパク質を含む。
本明細書で開示されるAAV組成物において有用な修正ゲノムは、一般に、(i)F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント、(ii)標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して5'側の5'相同性アームヌクレオチド配列、及び(iii)標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域に対する相同性を有する、編集エレメントに対して3'側の3'相同性アームヌクレオチド配列を含み、5'相同性アーム、編集エレメント及び3' 相同性アームを含む修正ゲノムの一部分は、F8遺伝子座に対して、センス又はアンチセンス配向であり得る。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、5'相同性アームヌクレオチド配列に対して5'側の5'逆位末端配列(5'ITR)ヌクレオチド配列及び3'相同性アームヌクレオチド配列に対して3'側の3'逆位末端配列(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む。
本明細書で開示される修正ゲノムにおいて使用される編集エレメントは、標的遺伝子座における1つ又は複数のヌクレオチドの挿入、欠失又は置換を媒介できる。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座において相同組換えによって正確に組み込まれた場合、編集エレメントは、F8遺伝子中の変異を修正して、野生型F8配列又はその機能的等価物に戻す。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の一部分(例えば、野生型FVIIIコード配列の一部分又はサイレントに変更されたF8コード配列の一部分)を含む。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8遺伝子(例えば、ヒトF8遺伝子)のエクソン23～26の野生型又はサイレントに変更された配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の少なくとも一部分を含む。例えば、ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の一部分を含み、コード配列に対して3'側の外因性ポリアデニル化配列を任意選択で更に含み得る。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、F8遺伝子のエクソン23～26の配列を含み、ゲノム(例えば、ヒトゲノム)中と同じ順序で、エクソン15～22のうち1つ又は複数の配列を任意選択で更に含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、F8遺伝子のエクソン15～26、16～26、17～26、18～26、19～26、20～26、21～26又は22～26の配列を含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、エクソン22～26の配列(配列番号26)を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号33に示される配列を含む。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、エクソン15～22のうちいずれか1つの最後のヌクレオチドに対して3'側に隣接したヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、ゲノム(例えば、ヒトゲノム)における編集エレメントの組込みは、F8遺伝子(例えば、ヒトF8遺伝子)のエクソン1からX及びイントロン1からX-1(Xマイナス1)を含む配列、並びにエクソンX+1(Xプラス1)から26又はそのサイレントに変更されたバリアントの配列を含むF8コード配列(例えば、ヒトF8コード配列)の一部分の生成を生じ、Xは、14、15、16、17、18、19、20、21及び22から選択される任意の数であり、編集エレメント中のエクソン及びイントロンは、ゲノム中と同じ順序で位置付けられる。ある特定の実施形態では、Xは22である。
ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、配列番号25に示される配列を含む又はそれからなるアミノ酸配列をコードする。ある特定の実施形態では、配列番号25をコードする核酸配列は、野生型である(例えば、配列番号26に示される配列を有する)。ある特定の実施形態では、配列番号25をコードする核酸配列は、サイレントに変更される。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、F8遺伝子のエクソン22の最後のヌクレオチドに対して3'側に隣接したヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列(例えば、ヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,476と126,477との間のヌクレオチド間結合、又はヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,477で始まる配列)であり、編集エレメントの組込みは、F8遺伝子座において、5'から3'へと、F8遺伝子のエクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3、イントロン3、エクソン4、イントロン4、エクソン5、イントロン5、エクソン6、イントロン6、エクソン7、イントロン7、エクソン8、イントロン8、エクソン9、イントロン9、エクソン10、イントロン10、エクソン11、イントロン11、エクソン12、イントロン12、エクソン13、イントロン13、エクソン14、イントロン14、エクソン15、イントロン15、エクソン16、イントロン16、エクソン17、イントロン17、エクソン18、イントロン18、エクソン19、イントロン19、エクソン20、イントロン20、エクソン21、イントロン21、エクソン22、エクソン23、エクソン24、エクソン25及びエクソン26を含む配列の生成を生じ、エクソン23、エクソン24、エクソン25及びエクソン26の各々の配列は、独立して、野生型であり得る又はサイレントに変更され得る。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の一部分(例えば、野生型F8コード配列の一部分又はサイレントに変更されたF8コード配列の一部分)を含む。かかる編集エレメントは、スプライスアクセプター部位及び/又は外因性ポリアデニル化配列を更に含み得る。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、5'から3'へと、スプライスアクセプター部位;F8コード配列の一部分(例えば、野生型F8コード配列の一部分又はサイレントに変更されたF8コード配列の一部分);及び外因性ポリアデニル化配列を含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、F8遺伝子のエクソン23～26の配列を含み、ゲノム(例えば、ヒトゲノム)中と同じ順序で、エクソン15～22のうち1つ又は複数の配列を任意選択で更に含む。ある特定の実施形態では、F8コード配列の一部分は、F8遺伝子のエクソン15～26、16～26、17～26、18～26、19～26、20～26、21～26又は22～26の配列を含む。
ある特定の実施形態では、上述の編集エレメントは、5'から3'へと、イントロンの内因性スプライスドナー部位を含むが内因性スプライスアクセプター部位は含まない、標的遺伝子座に対して5'側のF8遺伝子の一部分;スプライスアクセプター部位;F8コード配列の一部分(例えば、野生型F8コード配列の一部分又はサイレントに変更されたF8コード配列の一部分);及び外因性ポリアデニル化配列を含む組換え配列を産生するために、相同組換えによって、F8遺伝子のイントロン中に組み込まれ得る(例えば、標的遺伝子座に対して5'側のヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン中にある、又は標的遺伝子座の最も5'側のヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン中にある)。この組換え配列の発現は、F8コード配列の一部分によってコードされるFVIIIポリペプチドの部分的アミノ酸配列を含むポリペプチドに融合された、標的遺伝子座に対して5'側のF8遺伝子の一部分によってコードされるアミノ酸配列を含むポリペプチドを産生する。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン中にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、イントロン15～22のうちいずれか1つ中のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、イントロン15～22のうちいずれか1つ中のヌクレオチドに対して3'側に隣接したヌクレオチド配列である。ある特定の実施形態では、ゲノム(例えば、ヒトゲノム)における編集エレメントの組込みは、エクソン1からX、イントロン1からX-1(Xマイナス1)及びイントロンXの一部分を含む配列、スプライスアクセプター、並びにエクソンX+1(Xプラス1)から26又はそのサイレントに変更されたバリアントの配列を含むF8コード配列(例えば、ヒトF8コード配列)の一部分の生成を生じ、Xは、14、15、16、17、18、19、20、21及び22から選択される任意の数であり、編集エレメント中のエクソン及びイントロンは、ゲノム中と同じ順序で位置付けられ、スプライスアクセプターは、イントロンXの一部分とF8コード配列の一部分との間にある。ある特定の実施形態では、Xは22である。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン22中にある。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、F8遺伝子のイントロン22中のヌクレオチド間結合である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、F8遺伝子中の配列であり、この配列に対して5'側に隣接したヌクレオチドは、F8遺伝子のイントロン22中にあり、この配列の3'末端は、F8遺伝子中の任意の下流のヌクレオチドであり得る。
ある特定の実施形態では、編集エレメント内のF8コード配列の1つ又は複数の一部分は、野生型F8遺伝子の対応する配列に対して非同一であるように、サイレントに変更され得る。サイレントな変更は、当該分野で公知の任意の方法によって実施することができる(例えば、その全体が本明細書で参照により組み込まれるMauro及びChappell (2014) Trends Mol Med. 20(11):604～13に記載されるとおり)。例示的な部分的なサイレントに変更されたF8コード配列は、配列番号33に示される。
従って、ある特定の実施形態では、編集エレメントは、野生型F8遺伝子の対応するエクソンに対して100%未満(例えば、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%又は50%未満)同一であるようにサイレントに変更されたF8コード配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号26に示される配列に対して100%未満(例えば、95%、90%、85%、80%、75%、70%、65%、60%、55%又は50%未満)同一であるようにサイレントに変更されたヌクレオチド配列を含む。かかる編集エレメントは、F8遺伝子コード配列に対して3'側の外因性ポリアデニル化配列を更に含み得る。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、F8コード配列の一部分に対して3' 側のポリアデニル化配列を更に含む。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列は、外因性ポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、外因性ポリアデニル化配列は、SV40ポリアデニル化配列である。ある特定の実施形態では、SV40ポリアデニル化配列は、配列番号23、35、36又は37に示されるヌクレオチド配列を有する。
本明細書で開示される編集エレメントのいずれか及び全ては、野生型F8遺伝子中には存在しない制限エンドヌクレアーゼ部位を更に含み得る。かかる制限エンドヌクレアーゼ部位は、標的遺伝子座及びその隣接領域又はそれから増幅された核酸の制限断片長多型分析に基づく又は核酸配列決定分析による、標的遺伝子座において編集エレメントの組込みを有する細胞の同定を可能にする。
本明細書で開示される編集エレメントのいずれか及び全ては、標的遺伝子座中に組み込まれた場合に、FVIIIポリペプチドにおいて1つ又は複数のアミノ酸変異を引き起こす、1つ又は複数のヌクレオチド変更を含み得る。ある特定の実施形態では、変異体FVIIIポリペプチドは、野生型FVIIIポリペプチドの機能的等価物である、即ち、野生型FVIIIポリペプチドとして機能できる。ある特定の実施形態では、機能的に等価なFVIIIポリペプチドは、野生型FVIIIポリペプチドでは見出されない少なくとも1つの特徴、例えば、タンパク質分解に抵抗する能力を更に含む。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される編集エレメントは、少なくとも0、1、2、10、100、200、500、1000、1500、2000、3000、4000又は5000ヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、1～5000、1～4500、1～4000、1～3000、1～2000、1～1000、1～500、1～200、1～100、1～50若しくは1～10ヌクレオチドを含む、又は1～5000、1～4500、1～4000、1～3000、1～2000、1～1000、1～500、1～200、1～100、1～50若しくは1～10ヌクレオチドからなる。
ある特定の実施形態では、本明細書に記載される編集エレメントは、部分的F8コード配列(例えば、ヒトF8コード配列のエクソン22～26、又は配列番号31のヌクレオチド4～783)、5'非翻訳領域(UTR)、3'UTR、プロモーター、スプライスドナー、スプライスアクセプター、非コードRNAをコードする配列、インスレーター、遺伝子、若しくはそれらの組み合わせを含む、又はそれらからなる。
ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号33に示される配列に対して少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%同一な核酸配列を含む。ある特定の実施形態では、編集エレメントは、配列番号33に示される核酸配列を含む。
本明細書で開示される修正ゲノムにおいて使用される相同性アームは、F8遺伝子の任意の領域又はゲノム上の近傍の遺伝子に指向され得る。相同性アームの正確な正体及び位置付けは、編集エレメント及び/又は標的遺伝子座の正体によって決定される。
本明細書で開示される修正ゲノムにおいて使用される相同性アームは、標的遺伝子座(例えば、F8遺伝子中の標的遺伝子座)に隣接するゲノムに対して実質的に同一である。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、標的遺伝子座に対して5'側の第1の領域に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、第1の領域に対して100%のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、標的遺伝子座に対して3'側の第2の領域に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、第2の領域に対して100%のヌクレオチド配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは各々、標的遺伝子座(例えば、F8遺伝子中の標的遺伝子座)に隣接する第1及び第2の領域に対して、それぞれ、少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一である。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは各々、標的遺伝子座(例えば、F8遺伝子中の標的遺伝子座)に隣接する第1及び第2の領域に対して、それぞれ、100%同一である。ある特定の実施形態では、5'相同性アーム及び/又は3'相同性アーム並びに標的遺伝子座に隣接するゲノムの対応する領域のヌクレオチド配列中の差異は、ヌクレオチド配列中の非コード差異を含む、それから本質的になる、又はそれからなる。
当業者は、相同組換えによるその標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みを媒介できるのに、相同性アームが標的遺伝子座に隣接するゲノム配列に対して100%同一である必要がないことを理解する。例えば、相同性アームは、ヒト集団における1つ若しくは複数の遺伝子的バリエーション、及び/又は発現レベル若しくは特異性を改善するように設計された1つ若しくは複数の改変(例えば、ヌクレオチド置換、挿入又は欠失)を含み得る。ヒトの遺伝子的バリエーションには、遺伝性バリエーション及び標的ゲノムに固有のde novoバリエーションの両方が含まれ、単純なヌクレオチド多型、挿入、欠失、再編成、逆位、重複、マイクロリピート(micro-repeat)、及びそれらの組み合わせが包含される。かかるバリエーションは、当該分野で公知であり、例えば、dnSNP(Sherryら、Nucleic Acids Res. 2001; 29(1):308～11を参照のこと)、Database of Genomic Variants(Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号):D986～92を参照のこと)、ClinVar(Nucleic Acids Res. 2014; 42(データベース特集号): D980～D985を参照のこと)、Genbank(Nucleic Acids Res. 2016; 44(データベース特集号): D67～D72を参照のこと)、ENCODE(genome.ucsc.edu/encode/terms.html)、JASPAR(Nucleic Acids Res. 2018; 46(D1): D260～D266を参照のこと)及びPROMO(Messeguerら、Bioinformatics 2002; 18(2):333～334; Farreら、Nucleic Acids Res. 2003; 31(13):3651～3653を参照のこと)のデータベース中に見出され得、これらは各々、本明細書で参照により組み込まれる。当業者は、相同性アームが標的遺伝子座に隣接するゲノム配列に対して100%同一でない状況において、標的遺伝子座に隣接するゲノム配列が、使用される相同性アームの配列に対して同一になるように、相同性アームとゲノムとの間の相同組換えがかかるゲノム配列を変更し得ることを、更に理解する。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域は、第1の編集ウインドウ中に位置し、第1の編集ウインドウは、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、第2の編集ウインドウ中に位置し、第2の編集ウインドウは、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、第1及び第2の編集ウインドウは、異なる。ある特定の実施形態では、第1の編集ウインドウは、第2の編集ウインドウに対して5'側に位置する。ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1のゲノム領域が位置する第1の編集ウインドウの配列の一部分からなる。ある特定の実施形態では、第1のゲノム領域は、第1のゲノム領域が位置する第1の編集ウインドウの配列からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、第2のゲノム領域が位置する第2の編集ウインドウの配列の一部分からなる。ある特定の実施形態では、第2のゲノム領域は、第2のゲノム領域が位置する第2の編集ウインドウの配列からなる。ある特定の実施形態では、第1の編集ウインドウは、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなり;第2の編集ウインドウは、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域は、配列番号31に示される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、配列番号32に示される配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域及び標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、それぞれ、配列番号31及び32に示される配列からなる。
ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、配列番号31のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、配列番号32のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、それぞれ、配列番号31及び32のヌクレオチド配列に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、それぞれ、配列番号31及び32に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、第1及び第2の編集ウインドウは、同じである。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座は、編集ウインドウ中のヌクレオチド間結合又はヌクレオチド配列であり、第1のゲノム領域は、標的遺伝子座に対して5'側の編集ウインドウの第1の一部分からなり、第2のゲノム領域は、標的遺伝子座に対して3'側の編集ウインドウの第2の一部分からなる。ある特定の実施形態では、編集ウインドウの第1の一部分は、編集ウインドウの5'末端から、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドまでの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウインドウの第2の一部分は、標的遺伝子座に対して3'側に隣接したヌクレオチドから、編集ウインドウの3'末端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウインドウの第1の一部分は、編集ウインドウの5'末端から、標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドまでの配列からなり、編集ウインドウの第2の一部分は、標的遺伝子座に対して3'側に隣接したヌクレオチドから、編集ウインドウの3'末端までの配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウインドウは、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、編集ウインドウの第1及び第2の一部分は、実質的に等しい長さを有する(例えば、短い方の一部分の長さの長い方の一部分の長さに対する比は、0.5、0.55、0.6、0.65、0.7、0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、0.96、0.97、0.98又は0.99よりも大きい)。
ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列の第1の一部分に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列の第1の一部分からなる。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列の第2の一部分に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列の第2の一部分からなる。ある特定の実施形態では、第1の一部分は、配列番号34中の第2の一部分に対して5'側である。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列のそれぞれ第1の一部分及び第2の一部分に対して少なくとも約90%(例えば、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%又は99.5%)同一なヌクレオチド配列からなり、第1の一部分は、配列番号34中の第2の一部分に対して5'側である。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、配列番号34のヌクレオチド配列のそれぞれ第1の一部分及び第2の一部分からなり、第1の一部分は、配列番号34中の第2の一部分に対して5'側である。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域は、第1の編集ウインドウ中に位置し、第1の編集ウインドウは、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなる第2のF8標的化遺伝子座中に位置する。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域は、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなる第1のF8標的化遺伝子座中に位置し;標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、配列番号34に示されるヌクレオチド配列からなる第2のF8標的化遺伝子座中に位置する。
ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域は、配列番号31に示される配列を含む又はそれからなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、配列番号32に示される配列を含む又はそれからなる。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座に対して5'側の第1のゲノム領域及び標的遺伝子座に対して3'側の第2のゲノム領域は、それぞれ、配列番号31及び32に示される配列を含む又はそれからなる。
ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、約50～約4500ヌクレオチド(例えば、約100～約3000、約200～約2500、約300～約2000、約400～約1500、約500～約1000ヌクレオチド)の長さを有する。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、約800ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、5'相同性アームは、約100ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、約50～約4500ヌクレオチド(例えば、約100～約3000、約200～約2500、約300～約2000、約400～約1500、約500～約1000ヌクレオチド)の長さを有する。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、約800ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、3'相同性アームは、約100ヌクレオチドの長さを有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームの各々は、約50～約4500ヌクレオチド(例えば、約100～約3000、約200～約2500、約300～約2000、約400～約1500、約500～約1000ヌクレオチド)の長さを独立して有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームの各々は、約800ヌクレオチドの長さを有する。
ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、実質的に等しいヌクレオチド長さを有する。ある特定の実施形態では、5'及び3'相同性アームは、非対称のヌクレオチド長さを有する。ある特定の実施形態では、ヌクレオチド長さにおける非対称性は、5'相同性アームと3'相同性アームとの間での、長さにおける最大で90%の差異、例えば、長さにおける最大で80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%又は10%の差異によって、定義される。
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号38～41からなる群から選択される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示される修正ゲノムは、5'相同性アームヌクレオチド配列に対して5'側の5'逆位末端配列(5'ITR)ヌクレオチド配列及び3'相同性アームヌクレオチド配列に対して3'側の3'逆位末端配列(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含む。任意のAAV血清型由来のITR配列又はそのバリアントが、本明細書で開示される修正ゲノムにおいて使用され得る。5'及び3'ITRは、同じ血清型のAAV由来又は異なる血清型のAAV由来であり得る。本明細書で開示される修正ゲノムにおける使用のための例示的なITRは、本明細書の配列番号18～21、46、61及び63に示される。
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、AAV2由来である。ある特定の実施形態では、5'ITR及び3'ITRは共に、AAV2由来である。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有する、又は3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号18に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号34に示される核酸配列を有する編集エレメント、配列番号18の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列及び配列番号19、61又は63の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号34に示される核酸配列、配列番号18の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列及び配列番号19、61又は63の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、AAV5由来である。ある特定の実施形態では、5'ITR及び3'ITRは共に、AAV5由来である。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有する、又は3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列は、配列番号20に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有し、3'ITRヌクレオチド配列は、配列番号21に対して少なくとも95%(例えば、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)の配列同一性を有する。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号34に示される核酸配列を有する編集エレメント、配列番号20の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列及び配列番号21の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号34に示される核酸配列、配列番号20の配列を有する5'ITRヌクレオチド配列及び配列番号21の配列を有する3'ITRヌクレオチド配列を含む。
ある特定の実施形態では、5'ITRヌクレオチド配列及び3'ITRヌクレオチド配列は、互いに対して実質的に相補的である(例えば、5'又は3'ITR中の1、2、3、4又は5つのヌクレオチド位置におけるミスマッチを除き、互いに対して相補的である)。
ある特定の実施形態では、5'ITR又は3'ITRは、Repタンパク質による分解(resolution)を低減又は無効にするために改変される(「分解不能な(non-resolvable)ITR」)。ある特定の実施形態では、分解不能なITRは、末端分解部位(terminal resolution site)のヌクレオチド配列中に挿入、欠失又は置換を含む。かかる改変は、移入ゲノムが感染細胞中で複製された後の、AAVの自己相補的二本鎖DNAゲノムの形成を可能にする。例示的な分解不能なITR配列は、当該分野で公知である(例えば、それらの全体が本明細書で参照により組み込まれる、米国特許第7,790,154号及び米国特許第9,783,824号に提供されるものを参照のこと)。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号46に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号46に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号46に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITR及び3'ITRは、それぞれ、配列番号46及び19に示されるヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、5'ITR及び3'ITRは、それぞれ、配列番号46及び61に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号18、20、46のうちいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、5'ITRは、配列番号18、20、46のうちいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号19、21、61、63のうちいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号19、21、61、63のうちいずれか1つに示されるヌクレオチド配列に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、3'ITRには、野生型AAV2ゲノム配列に由来する更なるヌクレオチド配列が隣接する。ある特定の実施形態では、3'ITRには、野生型AAV2 ITRに隣接する、野生型AAV2配列に由来する更なる37bp配列が隣接する。例えば、Savyら、Human Gene Therapy Methods (2017) 28(5): 277～289 (その全体が本明細書で参照により組み込まれる)を参照のこと。ある特定の実施形態では、更なる37bp配列は、3'ITRに対して内部である。ある特定の実施形態では、37bp配列は、配列番号62に示される配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号63に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'ITRは、配列番号63に示されるヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、3'ITRのヌクレオチド配列は、配列番号63に対して少なくとも95%、96%、97%、98%又は99%同一なヌクレオチド配列からなる。ある特定の実施形態では、3'ITRのヌクレオチド配列は、配列番号63に示されるヌクレオチド配列からなる。
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、修正ゲノムは、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列からなる。
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR)を含む。
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含む。
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);並びに/又は(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR)を含む。
ある特定の実施形態では、複製欠損AAVは、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;並びに/又は(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含む。
本明細書で開示されるAAV組成物は、in vivo及びin vitroの両方で高い効率で細胞においてF8遺伝子を修正することが可能であるという点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率は、AAVを、Bリンパ芽球様細胞について標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも2%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度は、AAVを、Bリンパ芽球様細胞について標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも1%(例えば、少なくとも1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、肝臓における標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率は、AAVを、標準的なAAV投与条件下で、外因性ヌクレアーゼの存在も外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の存在もなしに対象に投与した場合に、少なくとも2%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、肝臓における標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度は、AAVを、標準的なAAV投与条件下で、外因性ヌクレアーゼの存在も外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の存在もなしに対象に投与した場合に、少なくとも1%(例えば、少なくとも1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。本明細書で使用する場合、用語「標準的なAAV投与条件」は、マウスのサイズ及び身体形状を有する対象について、体重1キログラム当たり1.5×105ベクターゲノムの用量でのAAVの静脈内投与を指す。当業者は、類似の予測された有効性を達成するために、用量を対象のサイズ及び身体形状に従って調整すべきであることを理解する。種間での例示的な用量変換は、その全体が本明細書で参照により組み込まれるNairら(2016) J. Basic Clin. Pharm. 7(2): 27～31によって提供される。
F8遺伝子の編集の効率を決定するための任意の方法が使用され得る。ある特定の実施形態では、個々の細胞は、形質導入された細胞の集団から分離され、F8遺伝子の標的遺伝子座中に正確に組み込まれた編集エレメントの存在を同定することができるPCRプライマーを使用する単一細胞PCRに供される。かかる方法は、未改変の標的遺伝子座を選択的に増幅するPCRプライマーを使用する、同じ細胞の単一細胞PCRを更に含み得る。この方法で、細胞の遺伝子型が決定され得る。例えば、細胞が編集された標的遺伝子座及び未改変の標的遺伝子座の両方を有することを単一細胞PCRが示した場合、この細胞は、編集されたF8遺伝子についてヘテロ接合性とみなされる。
更に又は或いは、ある特定の実施形態では、線形増幅媒介性PCR(LAM-PCR)、定量的PCR(qPCR)又はドロップレットデジタルPCR(ddPCR)が、編集されたF8対立遺伝子のみを検出するプライマー及びプローブを使用して、形質導入された細胞の集団から抽出されたDNAに対して実施され得る。かかる方法は、サンプル中の総ゲノムの数、及び未編集のF8対立遺伝子の数を決定するために、更なるqPCR又はddPCR(同じ反応又は別々の反応でのいずれか)を更に含み得る。これらの数は、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度を決定するために使用され得る。
更に又は或いは、ある特定の実施形態では、F8遺伝子座は、修正ゲノムによって包含されるゲノム領域に隣接するF8遺伝子の領域に結合するプライマーを使用するPCRによって、又は修正ゲノム内の領域(例えば、遺伝子座にとって非ネイティブな外因性配列を含む領域)に結合するプライマーを使用する線形増幅媒介性PCR(LAM-PCR)によって、形質導入された細胞の集団から抽出されたDNAから増幅され得る。得られたPCRアンプリコンは、形質導入された細胞の集団中に存在する編集されたF8対立遺伝子及び未編集のF8対立遺伝子の相対的な数を決定するために、単一分子次世代配列決定(NGS)技術を使用して個々に配列決定され得る。これらの数は、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度を決定するために使用され得る。
別の態様では、本開示は、薬学的に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤、ビヒクル若しくは担体、又はそれらの組み合わせと一緒に、本明細書で開示されるAAVを含む医薬組成物を提供する。「薬学的に許容される担体」には、組成物の活性成分と組み合わせた場合に、意図しない免疫反応等の破壊的な生理的反応を引き起こすことなく、その成分が生物学的活性を保持するのを可能にする、任意の物質が含まれる。薬学的に許容される担体には、水、リン酸緩衝食塩水、油/水エマルジョンなどのエマルジョン及び湿潤剤が含まれる。かかる担体を含む組成物は、Remington's Pharmaceutical Sciences、最新版、Mack Publishing Co.、Easton Pa. 18042、USA; A. Gennaro (2000)「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第20版、Lippincott, Williams, & Wilkins; Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems (1999) H. C. Anselら、第7版、Lippincott, Williams, & Wilkins;及びHandbook of Pharmaceutical Excipients (2000) A. H. Kibbeら、第3版、Amer. Pharmaceutical Assoc.に示されるもの等の周知の従来の方法によって製剤化される。
III.使用の方法
別の態様では、本開示は、細胞においてF8遺伝子中の変異を修正するための方法又は細胞においてFVIIIポリペプチドを発現するための方法を提供する。これらの方法は一般に、細胞を、本明細書で開示される複製欠損AAVで形質導入する工程を含む。かかる方法は、F8遺伝子中の変異を修正する又はF8発現を回復させるのに高度に効率的であり、かかる修正を促進するために、外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNAガイドされるヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座におけるゲノムの切断を必要としない。従って、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、細胞を、外因性ヌクレアーゼ又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入も共投与もすることなしに、本明細書で開示される複製欠損AAVで形質導入することを含む。
別の態様では、本開示は、細胞においてF8遺伝子中の変異を修正するための方法又は細胞においてFVIIIポリペプチドを発現するための方法を提供する。これらの方法は一般に、細胞を、本明細書で開示される複製欠損AAVで形質導入する工程を含む。かかる方法は、F8遺伝子中の変異を修正する又はF8発現を回復させるのに高度に効率的であり、かかる修正を促進するために、外因性ヌクレアーゼ(例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、転写アクチベーター様ヌクレアーゼ(TALEN)、又はRNAガイドされるヌクレアーゼ、例えばCas9)の作用による標的遺伝子座におけるゲノムの切断を必要としない。従って、ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法は、細胞を、外因性ヌクレアーゼ又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入も共投与もすることなしに、本明細書で開示される複製欠損AAVで形質導入することを含む。
本明細書で開示される方法は、F8遺伝子のエクソン23～26のいずれか若しくは全て又はイントロン22～25のいずれか若しくは全て中に変異を保有する任意の細胞に適用され得る。当業者は、F8発現において活性な細胞が特に目的とされることを理解する。従って、ある特定の実施形態では、この方法は、肝細胞、肝臓類洞内皮細胞及び/又は他の内皮細胞に適用される。ある特定の実施形態では、この方法は、肝臓に適用される。細胞又は肝臓は、対象(例えば、ヒト対象)中にあり得る。
本明細書で開示される方法は、研究目的のためにin vitroで実施され得る、又は治療目的のためにex vivo若しくはin vivoで実施され得る。
ある特定の実施形態では、形質導入される細胞は、哺乳動物対象中にあり、AAVは、対象中の細胞を形質導入するのに有効な量で対象に投与される。従って、ある特定の実施形態では、本開示は、F8遺伝子変異と関連する疾患又は障害を有する対象を処置するための方法であって、対象に、本明細書で開示される複製欠損AAVの有効量を投与する工程を一般に含む、方法を提供する。対象は、ヒト対象又はヒト肝臓細胞を含むげっ歯類対象(例えば、マウス)であり得る。適切なマウス対象には、ヒト肝臓細胞(例えば、ヒト肝細胞及びヒト肝類洞内皮細胞)が生着したマウスが含まれるがこれらに限定されない。エクソン23～26のいずれか若しくは全て又はイントロン22～25のいずれか若しくは全て中のF8遺伝子変異と関連する血友病A又は任意の他の障害が、本明細書で開示される方法を使用して処置され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、外因性ヌクレアーゼ又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入も共投与もすることなしに形質導入される。
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR)を含む複製欠損AAVを使用する。
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;(b)配列番号16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;並びに/又は(c)配列番号16のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含む複製欠損AAVを使用する。
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR);並びに/又は(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質、並びに5'から3'へと以下の遺伝エレメントを含む修正ゲノム:5'ITRエレメント(例えば、配列番号18の5'ITR)、5'相同性アーム(例えば、配列番号27又は31の5'相同性アーム)、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(例えば、配列番号26のコード配列)、任意選択のSV40ポリアデニル化配列(例えば、配列番号37のSV40ポリアデニル化配列)、3'相同性アーム(例えば、配列番号28又は32の3'相同性アーム)及び3'ITRエレメント(例えば、配列番号19、61又は63の3'ITR)を含む複製欠損AAVを使用する。
ある特定の実施形態では、上述の方法は、(a)配列番号13のアミノ酸203～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;(b)配列番号13のアミノ酸138～736のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノム;並びに/又は(c)配列番号13のアミノ酸配列を含むAAVカプシドタンパク質及び配列番号26に示されるヌクレオチド配列を含む修正ゲノムを含む複製欠損AAVを使用する。
本明細書で開示される方法は、in vivo及びin vitroの両方で高い効率で細胞においてF8遺伝子を修正することが可能であるという点で、特に有利である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率は、AAVを、Bリンパ芽球様細胞について標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも2%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度は、AAVを、Bリンパ芽球様細胞について標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも1%(例えば、少なくとも1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、肝臓における標的遺伝子座中への編集エレメントの組込み効率は、AAVを、標準的なAAV投与条件下で、外因性ヌクレアーゼの存在も外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の存在もなしに対象に投与した場合に、少なくとも2%(例えば、少なくとも2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。ある特定の実施形態では、肝臓における標的遺伝子座中への編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度は、AAVを、標準的なAAV投与条件下で、外因性ヌクレアーゼの存在も外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の存在もなしに対象に投与した場合に、少なくとも1%(例えば、少なくとも1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%、4%、4.5%、5%、7.5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%又は95%)である。本明細書で使用する場合、用語「標準的なAAV投与条件」は、マウスのサイズ及び身体形状を有する対象について、体重1キログラム当たり1.5×105ベクターゲノムの用量でのAAVの静脈内投与を指す。当業者は、類似の予測された有効性を達成するために、用量を対象のサイズ及び身体形状に従って調整すべきであることを理解する。種間での例示的な用量変換は、その全体が本明細書で参照により組み込まれるNairら(2016) J. Basic Clin. Pharm. 7(2): 27～31によって提供される。本明細書に記載されるものが含まれるがそれらに限定されない、F8遺伝子の編集の効率を決定するための任意の方法が使用され得る。
本明細書で開示される方法は、in vivo及びin vitroの両方で高い効率で細胞においてFVIIIタンパク質を発現することが可能であるという点でも、有利である。ある特定の実施形態では、FVIIIタンパク質の発現レベルは、F8遺伝子中に変異を有さない同じ型の細胞における内因性FVIIIタンパク質の発現レベルの、少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%である。ある特定の実施形態では、FVIIIタンパク質の発現レベルは、F8遺伝子中に変異を有さない同じ型の細胞における内因性FVIIIタンパク質の発現レベルよりも、少なくとも1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2、3、4、5、6、7、8、9又は10倍高い。ELISA、ウエスタンブロッティング、免疫染色及び質量分析が含まれるがこれらに限定されない、FVIIIタンパク質の発現レベルを決定する任意の方法が使用され得る。
ある特定の実施形態では、本明細書で開示されるAAV組成物による細胞の形質導入は、本明細書で提供されるように、又は当業者に公知の形質導入の任意の方法によって、実施され得る。ある特定の実施形態では、細胞は、50,000;100,000;150,000;200,000;250,000;300,000;350,000;400,000;450,000;若しくは500,000の感染多重度(MOI)の、又は細胞の最適な形質導入を提供する任意のMOIのAAVと接触され得る。
本明細書で開示されるAAV組成物は、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、外用又は皮内経路が含まれるがこれらに限定されない任意の適切な経路によって、対象に投与され得る。ある特定の実施形態では、組成物は、静脈内注射又は皮下注射を介した投与のために製剤化される。
IV.AAVパッケージングシステム
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される複製欠損AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。かかるパッケージングシステムは、一般に、1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列;本明細書で開示される1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列;及び本明細書で開示されるF8遺伝子の修正のための修正ゲノムであって、パッケージングシステムが、カプシド中に修正ゲノムを封入してAAVを形成するための細胞において動作可能である、修正ゲノムを含む。
別の態様では、本開示は、本明細書で開示される複製欠損AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムを提供する。かかるパッケージングシステムは、一般に、1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列;本明細書で開示される1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列;及び本明細書で開示されるF8遺伝子の修正のための修正ゲノムであって、パッケージングシステムが、カプシド中に修正ゲノムを封入してAAVを形成するための細胞において動作可能である、修正ゲノムを含む。
ある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、Repヌクレオチド配列及びCapヌクレオチド配列を含む第1のベクター並びに修正ゲノムを含む第2のベクターを含む。本明細書に記載されるパッケージングシステムに関連して使用する場合、「ベクター」は、細胞中に核酸を導入するためのビヒクルである核酸分子(例えば、プラスミド、ウイルス、コスミド、人工染色体等)を指す。
任意のAAV Repタンパク質が、本明細書で開示されるパッケージングシステムにおいて使用され得る。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、Repヌクレオチド配列は、AAV2 Repタンパク質をコードする。適切なAAV2 Repタンパク質には、Rep 78/68又はRep 68/52が含まれるがこれらに限定されない。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、最小のパーセント配列同一性は、AAV2 Repタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも70%(例えば、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、少なくとも99%又は100%)である。パッケージングシステムのある特定の実施形態では、AAV2 Repタンパク質は、配列番号22に示されるアミノ酸配列を有する。
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、パッケージングシステムは、第3のベクター、例えば、ヘルパーウイルスベクターを更に含む。第3のベクターは、独立した第3のベクターであり得る、第1のベクターと一体であり得る、又は第2のベクターと一体であり得る。ある特定の実施形態では、第3のベクターは、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む。
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、ヘルパーウイルスは、アデノウイルス、ヘルペスウイルス(単純ヘルペスウイルス(HSV)を含む)、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)、サイトメガロウイルス(CMV)及びバキュロウイルスからなる群から選択される。ヘルパーウイルスがアデノウイルスであるパッケージングシステムのある特定の実施形態では、アデノウイルスのゲノムは、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む。ヘルパーウイルスがHSVであるパッケージングシステムのある特定の実施形態では、HSVのゲノムは、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうち1つ又は複数を含む。
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、第1、第2及び/又は第3のベクターは、1つ又は複数のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、第1のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターは、第2のトランスフェクトプラスミド内に含まれる。
パッケージングシステムのある特定の実施形態では、第1、第2及び/又は第3のベクターは、1つ又は複数の組換えヘルパーウイルス内に含まれる。ある特定の実施形態では、第1のベクター及び第3のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。ある特定の実施形態では、第2のベクター及び第3のベクターは、組換えヘルパーウイルス内に含まれる。
更なる態様では、本開示は、本明細書に記載されるAAVの組換え調製のための方法であって、カプシド中に修正ゲノムを封入して本明細書に記載されるAAVを形成するのに動作可能な条件下で、記載されるパッケージングシステムで細胞をトランスフェクト又は形質導入する工程を含む、方法を提供する。AAVの組換え調製のための例示的な方法には、一過的トランスフェクション(例えば、本明細書に記載される第1及び第2の、並びに任意選択で第3のベクターを含む1つ又は複数のトランスフェクションプラスミドによる)、ウイルス感染(例えば、本明細書に記載される第1及び第2の、並びに任意選択で第3のベクターを含む、1つ又は複数の組換えヘルパーウイルス、例えば、アデノウイルス、ポックスウイルス(例えば、ワクシニアウイルス)、ヘルペスウイルス(HSVを含む)、サイトメガロウイルス又はバキュロウイルスによる)、及び安定な産生細胞株のトランスフェクション又は感染(例えば、本明細書に記載される、1つ若しくは複数のAAV Repタンパク質をコードするRepヌクレオチド配列及び/又は1つ若しくは複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCapヌクレオチド配列を含む安定な産生細胞、例えば、哺乳動物又は昆虫細胞による、並びにトランスフェクトプラスミド又は組換えヘルパーウイルスの形態で送達される本明細書に記載される修正ゲノムによる)が含まれる。
V.実施例
本明細書で開示される組換えAAVベクターは、高度に効率的な遺伝子編集又は遺伝子移入をin vitro及びin vivoで媒介する。以下の実施例は、本明細書で開示されるAAVベースのベクターを使用して、特定のヒト疾患、例えば血友病Aにおいて変異されるF8遺伝子の発現の効率的な回復を実証する。これらの実施例は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
本明細書で開示される組換えAAVベクターは、高度に効率的な遺伝子編集又は遺伝子移入をin vitro及びin vivoで媒介する。以下の実施例は、本明細書で開示されるAAVベースのベクターを使用して、特定のヒト疾患、例えば血友病Aにおいて変異されるF8遺伝子の発現の効率的な回復を実証する。これらの実施例は、例示として提供されるのであって、限定としてではない。
(実施例1)
AAVベクターを使用したヒトF8遺伝子座の編集
この実施例は、ヒトF8遺伝子のそれぞれエクソン22の後ろ又はエクソン22中へのレポーター(蛍光タンパク質(FP))コード配列の挿入のための編集エレメントを各々が含む、F8修正ベクターVG-F8-002-FP及びVG-F8-003-FPを提供する。
AAVベクターを使用したヒトF8遺伝子座の編集
この実施例は、ヒトF8遺伝子のそれぞれエクソン22の後ろ又はエクソン22中へのレポーター(蛍光タンパク質(FP))コード配列の挿入のための編集エレメントを各々が含む、F8修正ベクターVG-F8-002-FP及びVG-F8-003-FPを提供する。
VG-F8-002-FP
VG-F8-002-FPベクターは、図1Aに示されるように、5'から3'へと、5'ITR;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド125,677～126,476の配列からなる5'相同性アーム;T2Aエレメント;FPコード配列;核局在化シグナル(NLS)コード配列;SV40ポリアデニル化配列;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,477～127,276の配列からなる3'相同性アーム;及び3'ITRを包含する。
VG-F8-002-FPベクターは、図1Aに示されるように、5'から3'へと、5'ITR;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド125,677～126,476の配列からなる5'相同性アーム;T2Aエレメント;FPコード配列;核局在化シグナル(NLS)コード配列;SV40ポリアデニル化配列;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,477～127,276の配列からなる3'相同性アーム;及び3'ITRを包含する。
ヒトゲノム中へのF8特異的修正ベクターVG-F8-002-FPの組込みは、ヒトF8遺伝子のエクソン22の最後のコドンの後ろに、T2Aエレメント、FPコード配列、NLS及びSV40ポリアデニル化配列を挿入する。T2Aペプチドは、2つのポリペプチドの生成をもたらす:T2AペプチドのN末端部分と融合した、エクソン22の終端で終結する短縮型F8ペプチド、及びN末端に残留するT2Aペプチド由来のプロリンを有する全長FPポリペプチド。それによって、このベクターの組込みは、ヒトゲノム中に存在するがVG-F8-002-FPベクター中には提供されないF8プロモーターの制御下での蛍光タンパク質の発現を指示する。
VG-F8-003-FP
VG-F8-003-FPベクターは、図1Bに示されるように、5'から3'へと、5'ITR;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド125,777～126,576の配列からなる5'相同性アーム;スプライスアクセプターエレメント;T2Aエレメント;FPのコード配列;NLSコード配列;SV40ポリアデニル化配列;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,577～127,376の配列からなる3'相同性アーム、及び3'ITRを包含する。
VG-F8-003-FPベクターは、図1Bに示されるように、5'から3'へと、5'ITR;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド125,777～126,576の配列からなる5'相同性アーム;スプライスアクセプターエレメント;T2Aエレメント;FPのコード配列;NLSコード配列;SV40ポリアデニル化配列;ヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,577～127,376の配列からなる3'相同性アーム、及び3'ITRを包含する。
ヒトゲノム中へのF8特異的修正ベクターVG-F8-003-FPの組込みは、イントロン22中のヒトF8遺伝子のヌクレオチド126,576の後ろに、スプライスアクセプター、T2Aエレメント、FPコード配列、NLSコード配列及びSV40ポリアデニル化配列を挿入する。編集されたF8遺伝子座から転写されたmRNAは、ヒトF8遺伝子のエクソン1～22、T2Aエレメント、FPコード配列及びNLSコード配列を含む。2Aペプチドは、2つのポリペプチドの生成をもたらす:2AペプチドのN末端部分と融合した、エクソン22の終端で終結する短縮型FVIIIペプチド、及びN末端に残留する2Aペプチド由来のプロリンを有する全長FPポリペプチド。それによって、このベクターの組込みは、ヒトゲノム中に存在するがVG-F8-003-FPベクター中には提供されないF8プロモーターの制御下での蛍光タンパク質の発現を指示する。
VG-F8-002-FP及びVG-F8-003-FPを、標的化組込みの評価のためにin vitroで試験した。Bリンパ芽球様細胞株16756、14623及び13023を、15%胎仔ウシ血清(FCS)及び2mMのL-グルタミンを補充したRPMI中で培養した。細胞を、1mL当たりおよそ200,000細胞で播種し、細胞が1mL当たり500,000細胞～1,000,000細胞の間に達した時点で分割した。
ベクターを、AAVHSC17でパッケージングし、ウイルス粒子を、Bリンパ芽球様細胞においてヒトF8遺伝子を編集するそれらの能力について試験した。AAV2 ITR、AAVS1遺伝子座中へのゲノム組込みのための相同性アーム、及びプロモーターなし蛍光タンパク質を含むAAVベクターであるAAVHSC-AAVS1-FPは、遺伝子組込みについての対照として機能する(例えば、その全体が本明細書で参照により組み込まれるWO2016/049230 A1を参照のこと)。
細胞は、形質導入当日に、対数期増殖に入った。細胞を計数し、適切な数の細胞をプレートした。典型的には、10,000細胞を、フローサイトメトリー分析のためにプレートした。ベクターは、培養体積の10%を超えなかった。ベクターを、力価及びMOIに基づいて計算し、適切なプレートを使用したことを確実にするために、プレートする前に計算した。
ベクターを氷上で解凍し、必要に応じて形質導入前に氷上で超音波処理した。ウイルスを各ウェルに個々に添加し、培地をピペットで上下させて、ウイルスを均等に分布させた。形質導入の48時間後、AAVF F8 FPベクターで形質導入した細胞を、FACS緩衝液(1×PBS、2%FCS、0.1%アジ化ナトリウム)を使用して回収した。細胞を、1200RPMで10分間スピンダウンした。およそ200μLが残るように、FACS緩衝液を除去した。DAPI(100μM作業ストック)を、3μMの最終濃度になるように、フローサイトメトリー分析の直前に添加した。
未形質導入のサンプル中のFP陽性細胞のパーセンテージを、対応する形質導入されたサンプル中のFP陽性細胞のパーセンテージから差し引くことによって、遺伝子編集の比率を計算した。図2に示されるように、FANCD2ヘテロ接合性Bリンパ芽球様細胞(細胞ID:16756)の約3～8%が、ヒトF8遺伝子座において、AAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-F8-002-FPベクターによって編集され、FANCD1ヘテロ接合性Bリンパ芽球様細胞(細胞ID:14623)の約4～9%が、ヒトF8遺伝子座において、AAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-F8-003-FPによって編集された。対照的に、FANCD1(BRCA2とも呼ばれる、相同組換えの重要なメディエーター)欠損Bリンパ芽球様細胞(細胞ID:13023)における遺伝子編集の比率は、検出不能であった。つまり、これらのデータは、AAVベクターを使用したF8遺伝子座の編集を示し、観察された編集が相同組換えによって媒介されていることを更に示している。
(実施例2)
F8を発現することが可能なヒト組織
F8の発現は、F8を発現することが可能な1つ又は複数の細胞型において回復され得る。図3は、初代ヒト肝類洞内皮細胞(「HHSEC」)、ヒトヘパトーマHepG2細胞(「HepG2」)、正常個体由来のBリンパ芽球(「F8 lymphobl.nor」)、F8イントロン22逆位を保有する患者由来のBリンパ芽球(「F8 lymphobl. inv」)、及び初代ヒト肝細胞(「1ry Hepatocyte RNA」)中のF8 mRNAのレベルを示す。これらのレベルは、以下に記載されるプロトコールに従って、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)によって測定した。
F8を発現することが可能なヒト組織
F8の発現は、F8を発現することが可能な1つ又は複数の細胞型において回復され得る。図3は、初代ヒト肝類洞内皮細胞(「HHSEC」)、ヒトヘパトーマHepG2細胞(「HepG2」)、正常個体由来のBリンパ芽球(「F8 lymphobl.nor」)、F8イントロン22逆位を保有する患者由来のBリンパ芽球(「F8 lymphobl. inv」)、及び初代ヒト肝細胞(「1ry Hepatocyte RNA」)中のF8 mRNAのレベルを示す。これらのレベルは、以下に記載されるプロトコールに従って、ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)によって測定した。
凍結細胞ペレットをRNA単離に使用した。細胞を解凍し、PBSで洗浄してDMSOを除去した。総RNAを、RNeasy mini kit(Qiagen社)を使用して細胞ペレットから単離し、濃度をSimpliNano(GE healthcare社)で測定した。450ngのRNAをRT反応に使用した、F8イントロン22逆位を保有する患者由来のBリンパ芽球を除いて、細胞型1つ当たり900ngのRNAをRT反応に使用して、cDNAを生成した。これは、最終データ分析において補正した。
TaqMan(登録商標)逆転写試薬(Applied Bioscience社、カタログ番号N8080234)を使用して、cDNAを生成した。使用したTaqMan(登録商標)プライマー及びプローブは、以下のTable 1(表1)に示される。相補的DNAサンプルを、蒸留水中に1:3希釈し、混合物を、10μlのマスターミックス、1μlのFAMプローブ(F8)、1μlのVICプローブ(GAPDH)及び8μlの希釈cDNAで作成した。ドロップレットを、QX200ドロップレットジェネレーターマニュアル(Bio-Rad社番号10031907)に従って、DG8カートリッジを使用して生成した。ddPCRのためのサイクルパラメーターは、Table 2(表2)に記載される。PCR後、ドロップレットを、QX200ドロップレットリーダーで読み取り、Quantasoftソフトウェアを使用して分析した。
(実施例3)
AAVベクターを使用したマウスF8遺伝子座のin vivo編集
この実施例は、VG-mF8-001-Lucベクターの投与後のF8遺伝子座のin vivo編集を提供する。VG-mF8-001-Lucベクターのマップは、図4Aに示される。このベクターは、5'から3'へと、5'ITR(示さず)、マウスF8のイントロン5からイントロン6までの第1の配列に対する相同性を有する左相同性アーム(「HAL」、マウスF8のヌクレオチド48,303～49,102の配列を有する)、スプライスアクセプター(「SA」)、T2Aエレメント(「2A」)、ルシフェラーゼをコードするプロモーターなしヌクレオチド配列(「Luc ORF」)、SV40ポリアデニル化配列(「pA」)、マウスF8のイントロン6からイントロン7までの第2の配列に対する相同性を有する右相同性アーム(「HAR」、マウスF8のヌクレオチド49,103～49,902の配列を有する)、及び3'ITR(示さず)を含む。
AAVベクターを使用したマウスF8遺伝子座のin vivo編集
この実施例は、VG-mF8-001-Lucベクターの投与後のF8遺伝子座のin vivo編集を提供する。VG-mF8-001-Lucベクターのマップは、図4Aに示される。このベクターは、5'から3'へと、5'ITR(示さず)、マウスF8のイントロン5からイントロン6までの第1の配列に対する相同性を有する左相同性アーム(「HAL」、マウスF8のヌクレオチド48,303～49,102の配列を有する)、スプライスアクセプター(「SA」)、T2Aエレメント(「2A」)、ルシフェラーゼをコードするプロモーターなしヌクレオチド配列(「Luc ORF」)、SV40ポリアデニル化配列(「pA」)、マウスF8のイントロン6からイントロン7までの第2の配列に対する相同性を有する右相同性アーム(「HAR」、マウスF8のヌクレオチド49,103～49,902の配列を有する)、及び3'ITR(示さず)を含む。
マウスゲノム中へのVG-mF8-001-Lucベクターの組込みは、マウスF8遺伝子のイントロン6において、スプライスアクセプター、T2Aエレメント、ルシフェラーゼコード配列及びSV40ポリアデニル化配列を挿入する。編集されたF8遺伝子座から転写されたmRNAは、マウスF8遺伝子のエクソン1～6、T2Aエレメント及びルシフェラーゼコード配列を含む。T2Aペプチドは、2つのポリペプチドの生成をもたらす:T2AペプチドのN末端部分と融合した、エクソン6の終端で終結する短縮型FVIIIペプチド、及びN末端に残留する2Aペプチド由来のプロリンを有する全長ルシフェラーゼポリペプチド。それによって、このベクターの組込みは、マウスゲノム中に存在するがVG-mF8-001-Lucベクター中には提供されないF8プロモーターの制御下でのルシフェラーゼタンパク質の発現を指示する。
これらの相同性アーム配列は、エピソームルシフェラーゼ発現を駆動するように作用し得る転写調節エレメントの予測された特徴は含まなかった(Saboら(2006) Nat Methods 3: 511～18; Griffithら(2008) Nucleic Acids Res 36: D107～13;及びRandoら(2009) Annu Rev Biochem 78: 245～71において予測された転写調節エレメントを参照のこと)。ルシフェラーゼタンパク質がゲノム組込みなしには編集ベクターから発現されなかったことを確実にするために、VG-mF8-001-Lucベクターを、ヒトHEK293細胞及びマウスNIH3T3細胞中にトランスフェクトした。図4Bに示されるように、トランスフェクションの24時間後、トランスフェクトされた細胞からの生物発光は検出されなかった。対照的に、CMVプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼコード配列を含む陽性対照ベクターでトランスフェクトした細胞からは、生物発光が検出された。理論に束縛されることは望まないが、相同組換えの比率は、トランスフェクションによって、即ち、AAVHSC送達装置の非存在下で低かったので、このベクターは、NIH3T3細胞のゲノム中に実質的に組み込まれなかったと仮説が立てられる。
図4Cは、VG-mF8-001-LucベクターでトランスフェクトしたHEK293細胞及びNIH3T3細胞からのルシフェラーゼ発現を相対ルミノメーター単位(RLU)で示すグラフである。図4Cに示されるように、ルシフェラーゼ発現は、VG-mF8-001-LucベクターをトランスフェクトしたHEK293細胞及びNIH3T3細胞と、未形質導入のHEK293細胞及びNIH3T3細胞との間で同じであると測定された。対照的に、ニワトリβ-アクチン(CBA)プロモーターによって駆動されるルシフェラーゼコード配列を含む陽性対照ベクターをトランスフェクトした細胞からは、ルシフェラーゼ発現が検出された。
VG-mF8-001-Lucベクターを、AAVHSC15又はAAVHSC17中にパッケージングした(その全体が本明細書で参照により組み込まれるWO2016/049230 A1を参照のこと)。スプライスアクセプターが存在しないという点でVG-mF8-001-Lucとは異なる、VG-ΔSA-mF8-001-Lucと命名した対照ベクターもまた、AAVHSC15中にパッケージングした。一貫したAAVウイルス品質を確実にするために、各ベクターを、特徴のパネルを横断して分析した;DNA及びカプシド力価、銀染色によるベクタータンパク質純度、カプシドタンパク質のウエスタンブロット、並びに内毒素負荷。各ベクター調製物間で、ベクター純度にも品質にも力価にも、有意な差異は存在しなかった。Charles River Laboratories社から取得した雌性C57BL/6マウス6～8週齢は、各マウスに最大10ml/kgで尾静脈を介して静脈内注射した、1×1010の低用量のベクターゲノム(体重1キログラム当たりおよそ5×1011のベクターゲノム)又は3×1012の高用量のベクターゲノム(体重1キログラム当たりおよそ1.5×1014のベクターゲノム)のいずれかを受けた。連続生物発光画像化を、0.15mg/gのルシフェリン(Caliper Life Sciences社)を腹腔内注射した麻酔したマウスに対して実施した。画像を、ルシフェリン注射の10分後に、SPECTRAL LagoX画像化システム(Spectral Instruments Imaging社、LLC)を使用して得た。マウスを、ラージビニングで腹側性に5分間にわたって画像化した。次いで、臓器を回収し画像化した。画像を、AMIViewソフトウェアバージョン1.7.06を使用して分析した。
F8遺伝子の編集を検出するために、肝臓サンプルを、AAVベクターの投与後にマウスから収集し、総DNAを、QIAamp DNA mini kit(Qiagen社)を使用してサンプルから単離し、DNA濃度をNanoDrop(ThermoFisher社)で測定した。DNAサンプルを、以下の方法によって分析した:
エンドポイントPCR
肝臓ゲノムDNAを、標的部位中へのルシフェラーゼカセットの組込みに対して特異的なプライマーを使用するエンドポイントPCRによって分析した。これらのプライマー配列は、以下のTable 3(表3)に提供され、それらの標的化領域は、図5Aに示される。PCR条件は、Table 4(表4)に提供される。ゲノムPCR対照として、各相同性アームにわたる同等のサイズのPCRを実施した。各アンプリコンの特異性を、サンガー配列決定によって確認した。
肝臓ゲノムDNAを、標的部位中へのルシフェラーゼカセットの組込みに対して特異的なプライマーを使用するエンドポイントPCRによって分析した。これらのプライマー配列は、以下のTable 3(表3)に提供され、それらの標的化領域は、図5Aに示される。PCR条件は、Table 4(表4)に提供される。ゲノムPCR対照として、各相同性アームにわたる同等のサイズのPCRを実施した。各アンプリコンの特異性を、サンガー配列決定によって確認した。
ドロップレットデジタルPCR(ddPCR)
ドロップレットデジタルPCRは、DNAサンプルを油エマルジョン中に分配し、ここでエンドポイントPCR反応を実行し、分子密度のバイナリ測定値として定量化した。この方法は、各ゲノム断片の個々の分析並びに編集されたDNA鎖及び未編集のDNA鎖の定量化を可能にした。使用したTaqMan(登録商標)プライマー及びプローブは、以下のTable 5(表5)に示され、それらの標的化領域は、図5Bに示される。簡潔に述べると、DNAサンプルを、10ng/μlになるようにヌクレアーゼを含まない水中に希釈し、混合物を、12μlのSuperMix dUTPなし(BioRad社)、0.6μlのFAMプローブ(F8)、0.6μlのVICプローブ(SA2A)、4.8μlのヌクレアーゼを含まない水及び6μlの希釈DNA(合計で60ng)で作成した。サンプル混合物を含むドロップレットを、QX200(商標)AutoDG(商標)自動ドロップレットジェネレーター(BioRad社)を使用して生成し、次いで、PCRのためにサーマルサイクラーに移した。ddPCRのためのサイクルパラメーターは、Table 6(表6)に記載される。PCR後、ドロップレットを、QX200ドロップレットリーダー(BioRad社)で読み取り、Quantasoftソフトウェア(BioRad社)を使用して分析した。編集されたDNAを、ペイロードを保有する単一のDNA分子(SA2Aアッセイによって検出される)及び相同性アームの外側のゲノムDNA配列(F8アッセイによって検出される)として認識した。こうして、編集頻度を、別々の核酸分子からのペイロード及びゲノムDNAの共分配の予期された確率を超えた、単一のドロップレット中のペイロード及びゲノムDNAの検出された共分配に基づいて計算した。
ドロップレットデジタルPCRは、DNAサンプルを油エマルジョン中に分配し、ここでエンドポイントPCR反応を実行し、分子密度のバイナリ測定値として定量化した。この方法は、各ゲノム断片の個々の分析並びに編集されたDNA鎖及び未編集のDNA鎖の定量化を可能にした。使用したTaqMan(登録商標)プライマー及びプローブは、以下のTable 5(表5)に示され、それらの標的化領域は、図5Bに示される。簡潔に述べると、DNAサンプルを、10ng/μlになるようにヌクレアーゼを含まない水中に希釈し、混合物を、12μlのSuperMix dUTPなし(BioRad社)、0.6μlのFAMプローブ(F8)、0.6μlのVICプローブ(SA2A)、4.8μlのヌクレアーゼを含まない水及び6μlの希釈DNA(合計で60ng)で作成した。サンプル混合物を含むドロップレットを、QX200(商標)AutoDG(商標)自動ドロップレットジェネレーター(BioRad社)を使用して生成し、次いで、PCRのためにサーマルサイクラーに移した。ddPCRのためのサイクルパラメーターは、Table 6(表6)に記載される。PCR後、ドロップレットを、QX200ドロップレットリーダー(BioRad社)で読み取り、Quantasoftソフトウェア(BioRad社)を使用して分析した。編集されたDNAを、ペイロードを保有する単一のDNA分子(SA2Aアッセイによって検出される)及び相同性アームの外側のゲノムDNA配列(F8アッセイによって検出される)として認識した。こうして、編集頻度を、別々の核酸分子からのペイロード及びゲノムDNAの共分配の予期された確率を超えた、単一のドロップレット中のペイロード及びゲノムDNAの検出された共分配に基づいて計算した。
組込みが予期された位置において生じたかどうかを決定するために、組み込まれた配列とその配列が組み込まれた染色体との間の遺伝連鎖を測定した。ddPCRを、図5Bに示される領域を標的化するプローブを用いて実施した。図5Dに示されるように、測定された連鎖は、予期された連鎖と良好に相関し、これは、組込みが予期された位置において生じたことを示している。
次世代配列決定(NGS)
編集頻度を、次世代配列決定アッセイによっても測定した。例示的な方法は、Frockら(2015) Nat Biotechnol 33: 179～186に記載された。図5Cに示されるように、相同性アームの外側のゲノム領域を標的化するビオチン化ベイトプライマーを使用する線形増幅を、編集挿入部位に向かって伸長させた。一本鎖DNA産物を、ストレプトアビジン単離によって精製した。NGSアダプターのライゲーション及びペアードエンド配列決定の後、編集効率を、ルシフェラーゼ導入遺伝子中に延びる読み取りと未編集の挿入部位との比として決定した。正確な定量化を確実にするために、これらの遺伝子型決定アッセイを、人工的に構築した編集対照サンプルの標準対照に対して試験した。
編集頻度を、次世代配列決定アッセイによっても測定した。例示的な方法は、Frockら(2015) Nat Biotechnol 33: 179～186に記載された。図5Cに示されるように、相同性アームの外側のゲノム領域を標的化するビオチン化ベイトプライマーを使用する線形増幅を、編集挿入部位に向かって伸長させた。一本鎖DNA産物を、ストレプトアビジン単離によって精製した。NGSアダプターのライゲーション及びペアードエンド配列決定の後、編集効率を、ルシフェラーゼ導入遺伝子中に延びる読み取りと未編集の挿入部位との比として決定した。正確な定量化を確実にするために、これらの遺伝子型決定アッセイを、人工的に構築した編集対照サンプルの標準対照に対して試験した。
結果
図6A、図6B及び図6Cに示されるように、AAVHSC15中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターの投与の7日後、組み込まれたVG-mF8-001-Lucベクターからの生物発光が、用量依存的様式で、肝臓において主に検出されたが、低いレベルが、心臓、肺、脾臓及び腎臓においても観察された。この結果は、このベクターの静脈内投与によるF8遺伝子の編集が、肝臓において優勢に生じたが、他の主要臓器においてもより低いレベルで検出することができたことを示した。図6Dは、AAVHSC15中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを種々の用量で投与したマウスの肝臓における生物発光の全光束を示し、用量依存的応答を示す。図6Dは、種々の用量のベクターの投与後にddPCRによって測定した、肝臓における編集効率を示す。図6Fは、肝臓における生物発光の全光束に対してプロットした、マウス肝臓におけるVG-mF8-001-Lucベクターの編集効率を示すグラフであり、これら2つのパラメーター間の強い正の相関を示す。これらのデータは、in vivo編集効率が、投与したAAVHSC15-VG-mF8-001-Lucの用量に依存することを実証している。
図6A、図6B及び図6Cに示されるように、AAVHSC15中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターの投与の7日後、組み込まれたVG-mF8-001-Lucベクターからの生物発光が、用量依存的様式で、肝臓において主に検出されたが、低いレベルが、心臓、肺、脾臓及び腎臓においても観察された。この結果は、このベクターの静脈内投与によるF8遺伝子の編集が、肝臓において優勢に生じたが、他の主要臓器においてもより低いレベルで検出することができたことを示した。図6Dは、AAVHSC15中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを種々の用量で投与したマウスの肝臓における生物発光の全光束を示し、用量依存的応答を示す。図6Dは、種々の用量のベクターの投与後にddPCRによって測定した、肝臓における編集効率を示す。図6Fは、肝臓における生物発光の全光束に対してプロットした、マウス肝臓におけるVG-mF8-001-Lucベクターの編集効率を示すグラフであり、これら2つのパラメーター間の強い正の相関を示す。これらのデータは、in vivo編集効率が、投与したAAVHSC15-VG-mF8-001-Lucの用量に依存することを実証している。
AAVベクターがF8をin vivoで編集する能力もまた、長期研究において評価した。簡潔に述べると、VG-mF8-001-Lucベクターゲノムを、AAVHSC15又はAAVHSC17中にパッケージングした(WO2016/049230 A1を参照のこと)。体重1キログラム当たり5.8×1012のベクターゲノムの用量を、各NOD.CB17-Prkdcscid/NCrCrl(NOD/SCID)6～8週齢雄性マウスに、尾静脈を介して静脈内注射した。マウスを、ベクター注射の63日後に屠殺し、肝臓サンプルを収集した。経時的なマウス全体の連続生物発光画像化及び肝臓サンプルにおける編集効率測定を、上記と同じ方法を使用して実施した。
組み込まれたVG-mF8-001-Lucベクターからの発光は、AAVHSC15又はAAVHSC17のいずれか中にパッケージングされたベクターの投与後24時間以内に最初に検出可能であり、投与のおよそ40日後にプラトーに達した(図7B)。生物発光レベルは、投与の63日後に高いままであった(図7A)。図7Cは、AAVHSC15又はAAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを投与したマウスから取得した細胞において測定した編集効率を示す。「HindIII」で示されるベクターは、HindIII制限酵素で処理されたベクターを指す;これらのベクターは、挿入されたペイロードを標的ゲノムDNAから人工的に分離することによって、陰性対照として機能する。生物発光は、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたベクターの注射の7日後に、マウスの肝臓サンプルにおいて観察された(図7D)。図7Eに示されるように、生物発光は、他の主要臓器の組織と比較して、肝臓において有意により高いレベルで検出された。図7Fは、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを投与した正常マウスにおける生物発光が、少なくとも470日間にわたって検出されることを示している。併せて考えると、これらのデータは、AAVHSC15又はAAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターの静脈内送達が、マウスにおいてF8遺伝子座の永続的な編集を生じることを示している。
対照的に、VG-mF8-001-Lucベクターからのスプライスアクセプターの除去は、マウスにおけるルシフェラーゼ発現を大きく低減させた。mF8delta2A-lucベクターのマップについては、図10Eを参照のこと。AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたmF8delta2A-lucベクターを投与したマウスは、インタクトなベクターと比較して、大きく低減された生物発光を示した(図10A)。定量化すると、mF8delta2A-lucベクターを投与したマウスは、インタクトなベクターと比較して、観察可能な生物発光の96%の喪失を示したことが決定された(図10B)。図10Cに示されるように、生物発光は、インタクトなベクターと比較して、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたmF8delta2A-lucベクターを投与したマウスの肝臓において、大きく低減された。生物発光における低減は、脳及び腎臓組織においても観察された(図10D)。
F8遺伝子の編集を検出するために、VG-mF8-001-Lucベクターの投与の9週間後のマウス肝臓からのDNAサンプルを、上記のように、エンドポイントPCR、ドロップレットデジタルPCR及び次世代配列決定によって分析した。図8Aに示されるように、編集特異的PCR産物が、AAVHSC15及びAAVHSC17中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを注射したマウスの肝臓サンプルにおいて検出された。ddPCRによって測定した、肝臓における編集効率は、AAVHSC15及びAAVHSC17中にパッケージングされたベクターの注射を受けたマウスにおいて、それぞれ、およそ7%及び11%であった(図8B)。次世代配列決定は、AAVHSC15中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを注射したマウスの肝臓サンプルにおいて、14.4%の類似の編集効率を検出した(図8C)。
上の結果は、F8修正ベクターの静脈内投与が、肝臓細胞からのF8の発現を、高い効率で変更し得る(例えば、回復させ得る)ことを示唆している。
図7Cは、AAVHSC15又はAAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを投与したマウスから取得した細胞における編集効率を示すグラフである。*は、ビヒクル対照と比較したp<0.004の有意水準を示す。「HindIII」で示されるベクターは、HindIII制限酵素で処理されたベクターを指す;これらのベクターは、挿入されたペイロードを標的ゲノムDNAから人工的に分離することによって、陰性対照として機能する。**は、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクター(AAVHSC15-mF8-Luc)と比較したp<0.03の有意水準を示す;***は、AAVHSC17カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクター(AAVHSC17-mF8-Luc)と比較したp<0.004の有意水準を示す。図7Dは、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクター(AAVHSC15-mF8-Luc)の投与後の種々の時点におけるマウスの肝臓、腎臓、筋肉及び脳組織(各写真において左から右に)の生物発光画像を示す写真のセットである。種々の時点は、写真の上の列において左から右に増加し、下の列において左から右に連続する。図7Eは、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを投与したマウスの肝臓、腎臓、筋肉及び脳組織の生物発光の全光束を示すグラフである。*は、ビヒクル対照と比較したp=0.007の有意水準を示す;**は、他の組織と比較したp<0.0001の有意水準を示す。図7Fは、投与の470日後までの、AAVHSC15カプシド中にパッケージングされたVG-mF8-001-Lucベクターを投与したマウスにおける生物発光の全光束を示すグラフである。*は、ビヒクル対照と比較したp<0.0001の有意水準を示す。
(実施例4)
F8遺伝子中へのF8コード配列の挿入のためのF8修正ベクター
この実施例は、ヒトF8遺伝子のエクソン22の最後のヌクレオチドの後ろへの挿入のためのF8コード配列を各々が含む、F8修正ベクターpHMI-F8-001-F8、pHMI-F8-002-F8、pHMI-F8-003-F8及びpHMI-F8-004-F8を提供する。これらのベクターは、イントロン22逆位を有する変異体F8遺伝子座からのF8の発現を回復させることが可能である。
F8遺伝子中へのF8コード配列の挿入のためのF8修正ベクター
この実施例は、ヒトF8遺伝子のエクソン22の最後のヌクレオチドの後ろへの挿入のためのF8コード配列を各々が含む、F8修正ベクターpHMI-F8-001-F8、pHMI-F8-002-F8、pHMI-F8-003-F8及びpHMI-F8-004-F8を提供する。これらのベクターは、イントロン22逆位を有する変異体F8遺伝子座からのF8の発現を回復させることが可能である。
pHMI-F8-001-F8、pHMI-F8-002-F8、pHMI-F8-003-F8及びpHMI-F8-004-F8のベクターマップは、それぞれ、図9A、図9B、図9C及び図9Dに示される。これらのベクターの各々は、5'から3'へと、以下のエレメントを含む:5'ITR(「5' ITR Cam/NC004101/pTZAAV (FLIP)」);5'相同性アーム(「F8 HA-L e22, 800 bp」又は「F8 HA-L e22」);ヒトF8のエクソン23～26のコード配列(「エクソン23」、「エクソン24」、「エクソン25」及び「エクソン26」);任意選択のSV40ポリアデニル化配列(pHMI-F8-002-F8及びpHMI-F8-004-F8のみにおいて「SV40 pA」);3'相同性アーム(「F8 HA-R i22, 800 bp」又は「F8 HA-R i22」);及び3'ITR(「3' ITR Cam/NC004101/pTZAAV (FLOP)」)。これらのエレメントの配列は、Table 7(表7)に示される。独自の制限エンドヌクレアーゼのための制限部位及び切断部位を含む標的化組込み制限カセット(「TI REカセット」)が、ポリアデニル化配列の下流に挿入されて、所望の相同組換えの検出を促進することができる。
5'相同性アームは、挿入部位の上流の野生型ゲノム配列を含み、この挿入部位は、F8遺伝子のエクソン22とイントロン22との間のヌクレオチド間結合である。3'相同性アームは、挿入部位の下流の野生型ゲノム配列下流を含む。ヒトゲノム中へのpHMI-F8-001-F8、pHMI-F8-002-F8、pHMI-F8-003-F8又はpHMI-F8-004-F8ベクターの組込みは、5'から3'へと以下のエレメントを含むpre-mRNAへの、F8遺伝子座の転写を可能にする:内因性5'末端から挿入部位までのF8 pre-mRNAの一部分、及び部分的F8コード配列(エクソン22～26、ポリアデニル化配列を除く)。このpre-mRNAのスプライシングは、5'から3'へと以下のエレメント含むmRNAを生成する:エクソン1、イントロン1、エクソン2、イントロン2、エクソン3、イントロン3、エクソン4、イントロン4、エクソン5、イントロン5、エクソン6、イントロン6、エクソン7、イントロン7、エクソン8、イントロン8、エクソン9、イントロン9、エクソン10、イントロン10、エクソン11、イントロン11、エクソン12、イントロン12、エクソン13、イントロン13、エクソン14、イントロン14、エクソン15、イントロン15、エクソン16、イントロン16、エクソン17、イントロン17、エクソン18、イントロン18、エクソン19、イントロン19、エクソン20、イントロン20、エクソン21、イントロン21、エクソン22、エクソン23、エクソン24、エクソン25及びエクソン26。内因性ポリアデニル化配列は、イントロン22逆位を有する変異体F8遺伝子の下流に存在する。従って、編集されたF8遺伝子の転写は、ポリアデニル化配列を含まないpHMI-F8-001-F8及びpHMI-F8-003-F8ベクターであっても、適切に終結される。SV40ポリアデニル化配列は、効率的な転写終結を確実にするために、pHMI-F8-002-F8及びpHMI-F8-004-F8ベクターにおいて付加される。ヒトゲノム中へのこれらのベクターのうちいずれか1つの組込みは、ヒトF8のエクソン23～26のコード配列を挿入し、それによって、F8遺伝子のエクソン22の下流の変異(例えば、イントロン22逆位)によって損なわれた野生型F8タンパク質の発現を回復させる。
ベクターを、クレードF AAVカプシド(例えば、AAVHSC7、AAVHSC15及びAAVHSC17)でパッケージングする。パッケージングされたウイルスを、標的化組込みの評価のためにin vitroで試験する。Bリンパ芽球様細胞を、15%胎仔ウシ血清(FCS)及び2mMのL-グルタミンを補充したRPMI-1640培地中で培養する。細胞を、1mL当たりおよそ200,000細胞で播種し、細胞が1mL当たりおよそ500,000細胞～1,000,000細胞に達した時点で分割する。細胞は、形質導入当日に、対数期増殖に入る。細胞を計数し、適切な数の細胞をプレートする。典型的には、10,000細胞を、フローサイトメトリー分析のためにプレートする。ベクターを氷上で解凍し、必要に応じて形質導入前に氷上で超音波処理する。ウイルスを各ウェルに個々に添加し、培地をピペットで上下させて、ウイルスを均等に分布させる。ベクターは、培養体積の10%を超えない。ベクターを、力価及びMOIに基づいて計算し、適切なプレートを使用していることを確実にするために、プレートする前に計算する。
形質導入の48時間後、ベクターで形質導入した細胞を、FACS緩衝液(1×PBS、2%FCS、0.1%アジ化ナトリウム)を使用して回収する。細胞を、1200RPMで10分間スピンダウンする。およそ200μLが残るように、FACS緩衝液を除去する。DAPI(100μM作業ストック)を、3μMの最終濃度になるように、フローサイトメトリー分析の直前に添加する。
本発明は、本明細書に記載される具体的な実施形態によって範囲を限定されない。実際、記載されたものに加えた本発明の種々の改変が、上述の説明及び添付の図面から、当業者に明らかとなる。かかる改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内に入る意図である。
本明細書で引用される全ての参考文献(例えば、刊行物又は特許若しくは特許出願)は、各個々の参考文献(例えば、刊行物又は特許若しくは特許出願)が、その全体が全ての目的のために本明細書で参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されるのと同じ程度まで、それらの全体が全ての目的のために本明細書で参照により組み込まれる。他の実施形態は、以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (38)
- 細胞において、ex vivoでF8遺伝子中の変異を修正するための方法であって、前記細胞に、ex vivoで、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)で形質導入する工程を含み、前記AAVが、
a) AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシド;並びに
b) 5’から3’に以下の配列を含む、修正ゲノム:
(i) 5'AAV逆位末端配列(5'AAV ITR)ヌクレオチド配列;
(ii) 配列番号27に対して少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、1000ヌクレオチド以下の長さの5'相同性アームヌクレオチド配列であって、F8遺伝子の標的遺伝子座に隣接する5'側の第1の領域と少なくとも90％の同一性を有する、5'相同性アームヌクレオチド配列;
(iii)ポリアデニル化配列に連結していてもよい配列番号26にコードされるアミノ酸配列から成るアミノ酸配列をコードする、F8ヌクレオチド配列を含む、F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント;
(iv) 配列番号28に対して少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、1000ヌクレオチド以下の長さの3'相同性アームヌクレオチド配列であって、F8遺伝子の標的遺伝子座に隣接する3'側の第2の領域と少なくとも90％の同一性を有する、3'相同性アームヌクレオチド配列;及び
(v) 3' AAV ITRヌクレオチド配列
を含み、
前記細胞が、外因性ヌクレアーゼ又は外因性ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を共形質導入も共投与もすることなしに形質導入され、
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、方法。 - 前記細胞が肝細胞又は内皮細胞であり、前記内皮細胞は肝類洞内皮細胞であり、前記細胞は、哺乳動物の細胞である、請求項1に記載の方法。
- 前記F8ヌクレオチド配列がサイレントに変更される、請求項1に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476とヌクレオチド126,477との間のヌクレオチド間結合であり、前記F8遺伝子は、野生型ヒトF8遺伝子のヌクレオチド5,001～191,936に相当する、請求項1に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476に対して3'側に隣接したヌクレオチド配列であり、前記F8遺伝子は、野生型ヒトF8遺伝子のヌクレオチド5,001～191,936に相当する、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリアデニル化配列が、SV40ポリアデニル化配列である、請求項1に記載の方法。
- 前記ポリアデニル化配列が、配列番号23に示されるヌクレオチド配列を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記5' AAV ITRヌクレオチド配列が、配列番号18又は46に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、及び/又は、前記3' AAV ITRヌクレオチド配列が、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記5' AAV ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3' AAV ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、請求項1に記載の方法。
- 前記修正ゲノムが、配列番号39、41、43及び45からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記修正ゲノムが、配列番号39、41、43及び45からなる群から選択されるヌクレオチド配列のみから成る、請求項1に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座中への前記編集エレメントの組込み効率が、前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも2%である、請求項1に記載の方法。
- 前記標的遺伝子座中への前記編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度が、前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも1%である、請求項1に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸1～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項1に記載の方法。
- a) AAVクレードFカプシドタンパク質を含むAAVカプシド;並びに
b) 5’から3’に以下の配列を含む、修正ゲノム:
(i) 5'AAV逆位末端配列(5'AAV ITR)ヌクレオチド配列;
(ii) 配列番号27に対して少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、1000ヌクレオチド以下の長さの5'相同性アームヌクレオチド配列であって、F8遺伝子の標的遺伝子座に隣接する5'側の第1の領域と少なくとも90％の同一性を有する、5'相同性アームヌクレオチド配列;
(iii)ポリアデニル化配列に連結していてもよい配列番号26にコードされるアミノ酸配列から成るアミノ酸配列をコードする、F8ヌクレオチド配列を含む、F8遺伝子中の標的遺伝子座を編集するための編集エレメント;
(iv) 配列番号28に対して少なくとも99％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、1000ヌクレオチド以下の長さの3'相同性アームヌクレオチド配列であって、F8遺伝子の標的遺伝子座に隣接する3'側の第2の領域と少なくとも90％の同一性を有する、3'相同性アームヌクレオチド配列;及び
(v) 3' AAV ITRヌクレオチド配列
を含み、
前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、複製欠損アデノ随伴ウイルス(AAV)
を含む、細胞においてF8遺伝子中の変異を修正するための医薬組成物。 - 前記編集エレメントがF8コード配列の一部分を含み、前記F8コード配列がサイレントに変更される、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476とヌクレオチド126,477との間のヌクレオチド間結合である；
前記標的遺伝子座は、F8遺伝子のヌクレオチド126,476に対して3'側に隣接したヌクレオチド配列であり、前記F8遺伝子は、野生型ヒトF8遺伝子のヌクレオチド5,001～191,936に相当する；又は、
前記編集エレメントは、5'から3'へと、スプライスアクセプター部位、F8コード配列の一部分、及びポリアデニル化配列を含み、
前記標的遺伝子座に対して5'側に隣接したヌクレオチドが、前記F8遺伝子のイントロン中にある；及び／又は、
前記F8コード配列の前記一部分が、配列番号26に示される配列からなり、
前記標的遺伝子座に対して5'側に隣接した前記ヌクレオチドが、前記F8遺伝子のイントロン22中にある；及び／又は、
前記ポリアデニル化配列が、外因性ポリアデニル化配列であり、
前記外因性ポリアデニル化配列が、SV40ポリアデニル化配列である；及び/又は、
前記外因性ポリアデニル化配列が、SV40ポリアデニル化配列であり、前記SV40ポリアデニル化配列が、配列番号23に示されるヌクレオチド配列を有する；及び/又は、
前記編集エレメントが、配列番号33に示される核酸配列を含む、
請求項18に記載の医薬組成物。 - 前記5'相同性アームヌクレオチド配列が、第1のゲノム領域に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である；
前記3'相同性アームヌクレオチド配列が、第2のゲノム領域に対して少なくとも90%、95%、96%、97%、98%又は99%同一である；
第1のゲノム領域が、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなる；
第2のゲノム領域が、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる；
前記5'及び3'相同性アームヌクレオチド配列の各々が、100～1000ヌクレオチドの長さを独立して有する;
前記修正ゲノムが、配列番号38～41からなる群から選択される核酸配列を含む；及び／又は、
第1のゲノム領域が、第1の編集ウインドウ中に位置し、第2のゲノム領域が、第2の編集ウインドウ中に位置し、
前記第1の編集ウインドウが、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなり、
前記第2の編集ウインドウが、配列番号31、32又は34に示されるヌクレオチド配列からなる；及び／又は、
前記第1の編集ウインドウが、配列番号31に示されるヌクレオチド配列からなり、前記第2の編集ウインドウが、配列番号32に示されるヌクレオチド配列からなる、
請求項18に記載の医薬組成物。 - 前記修正ゲノムが、前記5'相同性アームヌクレオチド配列に対して5'側の5'逆位末端配列(5'ITR)ヌクレオチド配列及び前記3'相同性アームヌクレオチド配列に対して3'側の3'逆位末端配列(3'ITR)ヌクレオチド配列を更に含み；
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号18又は46に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号19、61又は63に対して少なくとも95%の配列同一性を有する；及び／又は、
前記5'ITRヌクレオチド配列が、配列番号20に対して少なくとも95%の配列同一性を有し、前記3'ITRヌクレオチド配列が、配列番号21に対して少なくとも95%の配列同一性を有する、
請求項18に記載の医薬組成物。 - 前記修正ゲノムが、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列を含む；及び／又は、 前記修正ゲノムが、配列番号42～45からなる群から選択される核酸配列のみからなる、
請求項18に記載の医薬組成物。 - 前記標的遺伝子座中への前記編集エレメントの組込み効率が、前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも2%である；及び／又は、
前記標的遺伝子座中への前記編集エレメントの組込みの対立遺伝子頻度が、前記AAVを、標準的なAAV形質導入条件下で、外因性ヌクレアーゼの非存在下でin vitroでBリンパ芽球様細胞の集団と接触させた場合に、少なくとも1%である、請求項18に記載の医薬組成物。 - 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸203～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸138～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記AAVクレードFカプシドタンパク質が、配列番号13又は16のアミノ酸1～736のアミノ酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項18に記載の医薬組成物。
- F8遺伝子変異と関連する疾患又は障害を有する対象を処置するための、請求項１８～２７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
- AAVの組換え調製のためのパッケージングシステムであって、
a)1つ又は複数のAAV Repタンパク質をコードするRep核酸;
b)請求項１８に規定の1つ又は複数のAAVクレードFカプシドタンパク質をコードするCap核酸;及び
c)請求項18に規定の修正ゲノムであって、前記パッケージングシステムが、前記カプシド中に前記修正ゲノムを封入して前記AAVを形成するための細胞において動作可能である、修正ゲノム
を含む、パッケージングシステム。 - 前記Rep核酸及び前記Cap核酸を含む第1のベクター並びに前記修正ゲノムを含む第2のベクターを含む、請求項２９に記載のパッケージングシステム。
- 前記Rep核酸が、AAV2 Repタンパク質をコードし、
前記AAV2 Repタンパク質が、78/68又はRep 68/52である、及び/又は、
前記AAV2 Repタンパク質が、配列番号22のAAV2 Repアミノ酸配列に対して最小のパーセント配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、前記最小のパーセント配列同一性が、前記AAV2 Repタンパク質をコードするアミノ酸配列の長さにわたって少なくとも90%である、請求項２９に記載のパッケージングシステム。 - 前記パッケージングシステムが、ヘルパーウイルスベクターである第3のベクターを更に含み；
前記ヘルパーウイルスベクターが、独立した第3のベクターである、
前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第1のベクターと一体である、
前記ヘルパーウイルスベクターが、前記第2のベクターと一体である、又は
前記第3のベクターが、ヘルパーウイルスタンパク質をコードする遺伝子を含む、
請求項２９に記載のパッケージングシステム。 - 前記ヘルパーウイルスが、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス及びサイトメガロウイルス(CMV)からなる群から選択され；
前記アデノウイルスのゲノムが、E1、E2、E4及びVAからなる群から選択される1つ又は複数のアデノウイルスRNA遺伝子を含む、及び／又は
前記ヘルパーウイルスが単純ヘルペスウイルス(HSV)であり、前記HSVのゲノムが、UL5/8/52、ICPO、ICP4、ICP22及びUL30/UL42からなる群から選択されるHSV遺伝子のうち1つ又は複数を含む、
請求項３２に記載のパッケージングシステム。 - 前記第1のベクター及び前記第3のベクターが、第1のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項３２に記載のパッケージングシステム。
- 前記第2のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、第2のトランスフェクトプラスミド内に含まれる、請求項３２に記載のパッケージングシステム。
- 前記第1のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルス中にクローニングされる、請求項３２に記載のパッケージングシステム。
- 前記第2のベクター及び前記第3のベクターのヌクレオチドが、組換えヘルパーウイルス中にクローニングされる、請求項３２に記載のパッケージングシステム。
- AAVの組換え調製のための方法であって、カプシド中に修正ゲノムを封入して前記AAVを形成するのに動作可能な条件下で、請求項２９に記載のパッケージングシステムを細胞中に導入する工程を含む、方法。
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