ES2280694T3 - Metodo para la extraccion directa y la amplificacion de virus integrados del adn celular de tejidos. - Google Patents
Metodo para la extraccion directa y la amplificacion de virus integrados del adn celular de tejidos. Download PDFInfo
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Abstract
Reivindicaciones 1. Un método de rescate directo de virus adeno-asociados (AAV) del ADN celular de tejidos, que comprende las etapas de (a) digestión del ADN en una muestra de ADN genómico a partir de una fuente celular de mamífero con una enzima de restricción de corte rara la cual no divide el genoma nativo de AAV; (b) transfección del ADN digerido a las células; (c) cultivo de las células transfectadas bajo condiciones en las cuales se expresen en las células, al menos las, funciones adenovirales mínimas necesarias para el empaque y la replicación del AAV; (d) realizar un pasaje del lisado obtenido de la etapa de cultivo (c) a células que expresan funciones auxiliares; (e) opcionalmente, someter el lisado de la etapa de pasaje a un pasaje adicional; y (f) detección, identificación y/o aislamiento del AAV a partir del lisado.
Description
Método para la extracción directa y la
amplificación de virus integrados del ADN celular de tejidos.
El virus adeno-asociado (AAV),
un miembro de la familia del Parvovirus, es un virus icosaédrico,
no-encapsulado pequeño, con genomas de ADN lineal
monocatenario de 4.7 a 6 kb (Mr. 1.5-2.0 x
10^{6}). El AAV se asigna al género, Dependovirus, puesto
que el virus se descubrió como un contaminante en stocks de
adenovirus purificado. El ciclo vital del AAV incluye una fase
latente en la cual los genomas de AAV, después de la infección, se
integran específicamente al sitio en los cromosomas huésped y una
fase lítica o de producción en la cual, continúa la
super-infección del adenovirus o del virus del
herpes simple, los genomas integrados posteriormente se rescatan,
replican, y empacan en virus infecciosos. Las propiedades de una
estructura genómica simple, no-patogenicidad,
amplio rango huésped de infectividad, incluyendo células que no se
dividen, y potencial integración cromosómica
sitio-específica hace del AAV una atractiva
herramienta para la transferencia génica. Los estudios recientes
sugieren que los vectores de AAV pueden ser el vehículo preferido
para lograr una expresión génica estable.
Hasta el momento, seis diferentes serotipos de
AAV (AAV1-6) se han aislado de humano o primates no
humanos (NHP), bien caracterizados y vectorados para las
aplicaciones de transferencia génica. Todos ellos se han aislado
como virus infecciosos a partir de preparaciones de adenovirus
contaminados o muestra de tejidos de origen primate y primate no
humano. Entre ellos, AAV 1 y AAV4 se aislaron de primates no
humanos; AAV2, 3 y 5 se derivaron de humanos, y AAV6 fue un
contaminante de una preparación de adenovirus humano.
Recientemente, tomando la ventaja de la
habilidad del AAV para penetrar el núcleo, para integrar en el
huésped y establecer una infección latente en ausencia de una
co-infección auxiliar del virus, inventamos una
estrategia basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para el aislamiento de las secuencias de AAVs novedosos a partir de
ADNs celulares preparados de diferentes tejidos de origen primate no
humano. Utilizando esta estrategia, hemos aislado al menos 16 tipos
moleculares y 8 subtipos moleculares de AAVs novedosos, generado un
virus recombinante para dos de ellos para evaluar su funcionamiento
en aplicaciones de transferencia génica.
Permanece una necesidad en el oficio de métodos
confiables de identificación y aislamiento de viriones de AAV a
partir de fuentes celulares.
La presente invención proporciona un
acercamiento único para aislar un novedoso virus de AAV a partir de
ADN celular de tejidos mediante la transfección del ADN celular en
células, rescatando el virus y amplificando el virus a través de
pasajes seriales en la presencia de las funciones auxiliares de
adenovirus. Esta estrategia es una herramienta muy útil y práctica
para el aislamiento de AAVs novedosos, y otros virus integrados
auxiliar-dependientes a partir de tejidos,
particularmente de tejidos de primate no humano (NHP) y de
humano.
Estos y otros aspectos de la invención serán
fácilmente evidentes a partir de la siguiente descripción detallada
de la invención. Según lo utilizado durante toda esta especificación
y las reivindicaciones, el término "comprende" y sus variantes
incluyendo, "comprende", "que comprende", entre otras
variantes, es inclusive de otros componentes, elementos, números
enteros, etapas y similares. El término "consiste de" o "que
consiste de" es exclusivo de otros componentes, elementos,
números enteros, etapas y similares.
En un aspecto, la invención proporciona un
método de rescate directo de secuencias virales o
no-virales integradas a partir de ADN celular de
tejidos humanos o no humanos.
El método es particularmente conveniente para
emplear en el rescate de virus integrados,
auxiliar-dependientes, tal como el virus
adeno-asociado (AAV). Por ejemplo, utilizando un
novedoso serotipo de AAV recientemente aislado, se probó que el
método de la invención trabaja muy bien. Las secuencias AAV8 y la
expresión de la proteína rep/cap se amplificaron dramáticamente en
las células 293 después de la transfección y los pasajes seriales.
Sin embargo, aunque los ejemplos en esta demuestran el rescate y la
amplificación de un novedoso serotipo AAV, el método de la
invención es fácilmente aplicable a serotipos AAVs conocidos y
desconocidos, y otras secuencias virales y
no-virales que integren el genoma de la célula
huésped. Tales secuencias virales incluyendo retrovirus tales como
virus de leucemia felina (FeLV), HTLVI y HTLVII], y lentivirus [por
ejemplo, virus de inmunodeficiencia humana (HIV), virus de
inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de inmunodeficiencia del
felino (FIV), virus de anemia infecciosa equina, y spumavirinal)],
entre otros. Otros usos apropiados para el método de la invención
fácilmente serán evidentes para alguien de habilidad en el
oficio.
Según lo utilizado en esta, una muestra es
cualquier fuente que contiene ácidos nucleicos, por ejemplo, tejido,
cultivo de tejido, células, cultivo celular, tumores sólidos, y
fluidos biológicos incluyendo, sin limitación, orina y sangre.
Estas secuencias de ácido nucleico pueden ser ADN o ARN de
plásmidos, ADN o ARN natural de cualquier fuente, incluyendo
bacterias, levaduras, virus, y organismos superiores tales como
plantas o animales. En una modalidad deseable, las células son de
fuente de primate no humano o fuente humana. Sin embargo, también
pueden ser utilizadas las células de una variedad de especies de
mamífero y no-mamífero. El origen de la muestra y
el método mediante el cual los ácidos nucleicos se obtienen para la
aplicación del método de la invención no es una limitación de la
presente invención. Opcionalmente, el método de la invención puede
ser llevada a cabo directamente sobre la fuente de ADN, o sobre los
ácidos nucleicos obtenidos de una fuente (por ejemplo,
extractos).
El ADN celular se extrae de extractos de la
fuente celular utilizando cualquiera de una variedad de técnicas
convencionales. El ADN o ARN se extrae de la muestra por una
variedad de técnicas conocidas por aquellos de habilidad en el
oficio, tales como aquellas descritas por Sambrook, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor
Laboratory).
El ADN de la muestra se incuba en la presencia
de una enzima de restricción de corte rara que es seleccionada
preferencialmente para dividir el ADN genómico nativo en el
organismo huésped sin dividir el ADN extraño integrado diana (por
ejemplo, AAV).
Típicamente, la cantidad del ADN extraño
integrado diana (por ejemplo, AAV) es pequeña comparada con la
cantidad de ADN huésped en la muestra. De esta manera, esta etapa
de digestión resulta en la digestión del ADN huésped en la muestra
celular en múltiples fragmentos, mientras se mantiene el AAV
intacto. Una enzima de restricción seleccionada la cual contiene
múltiples sitios de reconocimiento en el ADN huésped y en cualquiera
de los vectores auxiliares utilizados, pero no contiene ningún
sitio de reconocimiento en el ADN integrado diana. En la presente
aplicación, dicha enzima de restricción se llama enzima de corte
rara. Ejemplos de tales enzimas de corte raras incluyen aquellas
que tienen sitios de reconocimiento para siete, ocho, o más bases,
incluyendo, por ejemplo, FseI, Pad, PmeI, PsrI, BcgI, BgII, BsabI,
BstXI, DrdI, EcoNI, FseI, MaM I, Msl I, Mwo I, Psha I, Sfi I, Swa
I, Xcm I, y Xmn I, y similares. Apropiadas enzimas de corte raras
pueden ser identificadas utilizando información fácilmente
disponible por aquellos de habilidad en el oficio en la literatura y
en una variedad de bases de datos en línea, por ejemplo, la base de
datos REBASE™. Por ejemplo, una enzima de corte rara apropiada para
emplear en el método de la invención cuando el ADN integrado diana
es serotipo AAV 8, incluye, por ejemplo, PmeI. Otras enzimas de
corte apropiadas para el método se pueden determinar fácilmente
utilizando una variedad de programas de ordenador y/o bases de
datos en línea. Apropiadas enzimas de restricción están disponibles
de una variedad de fuentes comerciales incluyendo, por ejemplo,
England Biolabs, Obiogene, Lift Technology, Roche, BB Clontech,
Stratagene, Amersham Pharmacia, entre otros.
Una vez la muestra apropiada y la enzima de
digestión se seleccionan, se utilizan técnicas de digestión
convencionales. Típicamente, la muestra de ADN mezclada con la
enzima de restricción se incuba por aproximadamente 12 a
aproximadamente 48 horas. Seguido a esto, se realiza una etapa de
extracción fenol/cloroformo convencional. Por ejemplo, puede ser
utilizada la extracción fenol/cloroformo, seguida por la
precipitación con etanol, y la disolución del precipitado (por
ejemplo, en TE u otra solución reguladora apropiada) para emplear en
el resto de las etapas del método. Ver, por ejemplo, Sambrook,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed.,
5.28-5.32, Appendix E.3-E.4 (Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). Otros
métodos apropiados pueden ser proporcionados por el fabricante o
vendedor de la enzima de restricción utilizada, o por otra parte
conocidos por aquellos de habilidad en el oficio.
Después de que el ADN celular en la muestra ha
sido digerido, utilizando técnicas convencionales el ADN digerido
se transfecta a una apropiada célula. En conformidad, el ADN
digerido se transfecta para maximizar la concentración de ADN
celular transfectado en las células. Por ejemplo, puede ser una
cantidad de aproximadamente 0.2 \mug a aproximadamente 2 \mug
de ADN por 5 x 10^{5} células con células a una densidad de 50% a
80%. Sin embargo, estas cantidades se pueden ajustar según se
necesite o se desee, tomando en consideración el tamaño de la placa
de la célula, y los tipos de célula, entre otras
consideraciones.
La célula huésped por sí misma puede ser
seleccionada entre cualquier organismo biológico, incluyendo células
procariotas (por ejemplo, bacterianas), y células eucariotas,
incluyendo, células de insecto, células de levadura y células de
mamífero. La célula huésped es capaz de infectar o transfectar el
ADN y la expresión del ADN transfectado. Particularmente las
células huésped deseables se seleccionan entre cualquier especie de
mamífero, incluyendo, sin limitación, células tales como A549,
WEHI, 3T3, 10T1/2, BHK, MDCK, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40, BMT 10,
VERO, WI38, HeLa, células 293 (las cuales expresan E1 adenoviral
funcional), Saos, C2C12, L células, HT1080, HepG2 y células de
fibroblasto primario, hepatocito y mioblasto derivadas de mamíferos
incluyendo humano, mono, ratón, rata, conejo, y hámster. La
selección de la especie de mamífero que proporciona las células no
es una limitación de esta invención; ni lo es el tipo de célula de
mamífero, i.e., fibroblasto, hepatocito, célula tumoral, etc.
En conformidad, para el aislamiento y la
amplificación de un AAV, la célula contiene, o se provee con, las
funciones auxiliares necesarias para la replicación de AAV. Estas
funciones auxiliares incluyen, en un mínimo, las funciones del ARN
E1a, E1b, E2a, E4, y VAI a partir de un adenovirus. Ver, por
ejemplo, WO 99/47691, published September 23, 1999; RM Kotin, Hu
Gene Ther., 5: 793-801 (1994); WO 99/15685,
published Apr. 1, 1999. Además, las funciones de AAV auxiliares
opcionalmente se pueden suplir y son deseables cuando se sospecha
números de copia bajos de AAV en la muestra.
Las funciones auxiliares proporcionadas por un
adenovirus pueden ser suministradas por un adenovirus de
tipo-salvaje, y pueden ser de origen humano o no
humano, preferiblemente de origen primate no humano (NHP). Las
secuencias de ADN de un número de tipos de adenovirus humanos están
disponibles en Genbank, incluyendo tipo Ad5 [Genbank Accession No.
M73260]. Las secuencias de adenovirus se pueden obtener de cualquier
serotipo de adenovirus conocido, tales como serotipos 2, 3, 4, 7,
12 y 40, y adicionalmente incluyendo cualquiera de los tipos humanos
identificados en breve [ver, por ejemplo, Horwitz, "Adenoviridae
y Their Replication", in VIROLOGY, 2d ed., pp.
1679-1721 (1990)]. Del mismo modo los adenovirus
conocidos para infectar primates no humanos (por ejemplo,
chimpancés, rhesus, macaco, y otra especie de simio) u otros
mamíferos no humanos también pueden ser empleados en las
construcciones del vector de esta invención. Por ejemplo, apropiados
adenovirus son disponibles del ATCC e incluyen, sin limitación,
adenovirus chimpancé Pan 5 [VR-591], Pan6
[VR-592], Pan7 [VR-593], y C1 y
C68 (Pan9), descrita en la Patente US No. 6,083,716; y adenovirus de
simio incluyendo, sin limitación SV1 [VR-195]; SV25
[SV-201]; SV35; SV15; SV-34;
SV-36; SV-37, y adenovirus de
babuino [VR-275], entre otros. Además pueden ser
utilizados los adenovirus tipo-salvaje, virus
recombinante o vectores no-virales (por ejemplo,
plásmidos infeccioso y no-infeccioso, episomas,
etc.) que llevan las funciones auxiliares necesarias. Tales virus
recombinantes son conocidos en el oficio y pueden ser preparados de
acuerdo con técnicas publicadas. Ver, por ejemplo, Patente US No.
5, 871,982 y Patente US 6, 251,677, las cuales describen un híbrido
Ad/virus de AAV. La selección del tipo de adenovirus no se anticipa
para limitar la siguiente invención. Una variedad de cepas de
adenovirus están disponibles de American Type Culture Collection,
Manassas, Virginia, o disponibles a pedido de una variedad de
fuentes comerciales e institucionales. Adicionalmente, las
secuencias de muchas de tales cepas están disponibles de una
variedad de bases de datos incluyendo, por ejemplo, PubMed y
GenBank. En los siguientes ejemplos, un tipo de adenovirus 5 (Ad5),
Pan6, y Pan9 se utilizan por conveniencia. Sin embargo, alguien de
habilidad en el oficio entenderá que las regiones comparables
derivadas de otras cepas adenovirales pueden ser fácilmente
seleccionadas y utilizadas en la presente invención en lugar de (o
en combinación con) estos serotipos.
En una modalidad, la célula contiene solamente
el adenovirus E1, E2a y/o E4 ORF6 con el fin de evitar la
recombinación de homólogos de un virus contaminante cuando se
realiza el pasaje para amplificar el AAV. En otra modalidad, la
célula establemente expresa las funciones del gen adenoviral E1a y
E1b y se provee con las otras funciones auxiliares adenovirales
necesarias en trans. Un ejemplo de una apropiada célula es
una célula 293, la cual es de una línea celular disponible de
American Type Culture Collection [ATCC], Manassas, Virginia
20110-2209. Otras apropiadas líneas celulares están
disponibles de ATCC, de fuentes comerciales, o han sido descritas
en la literatura.
Dónde las funciones auxiliares de AAV se
suministran, por ejemplo, cuando se sospechan números de copia bajos
de AAV en la muestra, la célula huésped puede opcionalmente
contener establemente o puede por otra parte estar provista con las
funciones auxiliares AAV. En una modalidad, las funciones auxiliares
AAV con funciones rep las cuales están presentes en la
ausencia de cap. En esta modalidad, las funciones rep
pueden ser suministradas por un único serotipo AAV.
Alternativamente, pueden ser seleccionadas las funciones rep
de dos, tres o más diferentes serotipos de AAVs. En conformidad,
las funciones rep pueden ser seleccionadas entre cualquier
serotipo de AAV deseado.
Serotipos de AAVs apropiados incluyen, AAV1,
AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, o AAV6, los cuales han sido descritos en la
literatura, serotipos de AAVs tal como AAV8, el cual es el tema de
la Aplicación de la Patente Internacional No. PCT/US02/33630,
archivada Noviembre 12, 2002 (publicada como WO 03/052051 el 26 de
Junio de 2003); El AAV9 que es el tema de la Aplicación de la
Patente Internacional No. PCT/US02/33631 (publicada como WO
03/052052 el 26 de Junio de 2003); y AAV7, AAV10, AAV11, AAV12, y
otras que son identificadas en la Aplicación de la Patente US
co-pendiente No. 10/291,583 (publicada como US
2003/0138772). Adicionalmente, las secuencias de AAV7 y AAV8 han
sido descritas [G-P. Gao, et al, Proc Natl
Acad. Sci USA, 99 (18):11854-11859 (Sep
3, 2002); base de datos GenBank No. de acceso. AF513851 (AAV7) y
Número de acceso AF513852 (AAV8). Una variedad de serotipos AAVs
pueden ser aislados de acuerdo con procedimientos descritos en estas
aplicaciones co-pendientes, u obtenidos de una
variedad de fuentes, incluyendo American Type Culture Collection
(ATCC), Manassas Virginia. Las secuencias para estos serotipos AAVs
han sido publicados y muchas están disponibles de las bases de datos
tales como PubMed y GenBank.
En otra modalidad, ambas rep y cap
se utilizan como las funciones auxiliares AAV. En esta modalidad,
las funciones rep y las funciones cap pueden ser
suministradas por el mismo serotipo de AAV o de diferentes serotipos
AAVs. Cuando se desee, las funciones rep y/o las funciones
cap pueden ser suministradas por dos, tres o más diferentes
serotipos de AAVs, en los cuales las fuentes de AAV para las
rep son iguales o diferentes de las fuentes de serotipos de
AAVs para las cap. En conformidad, las funciones rep y
cap pueden ser seleccionadas entre cualquier serotipo de AAV
deseado.
Una célula huésped útil en la presente invención
es una célula huésped establemente transformada con las secuencias
que codifican a rep y cap, y que se transfectan con
los adenovirus E1, E2a, y E4ORF6 ADN. De modo semejante, también se
pueden emplear, rep y/o cap estables que expresan
líneas celulares, tales como B-50 (WO 99/15685), o
aquellos descritos en la Patente U.S. No. 5, 658,785. Otra célula
huésped deseable contiene el mínimo ADN adenoviral que es
suficiente para expresar E4 ORF6. No obstante otras líneas celulares
se pueden construir utilizando las otras secuencias rep y/o
cap del AAV. Tales técnicas incluyen ADNc y clonación
genómica, las cuales son bien conocidas y se describen en Sambrook
et al., citado arriba, el uso de secuencias de
oligonucleótido superpuestas del adenovirus y genomas del AAV,
combinadas con la reacción en cadena de la polimerasa, métodos
sintéticos, y cualesquiera otros métodos apropiados que proporcionen
la secuencia de nucleótidos deseada.
\newpage
Opcionalmente, las deseadas funciones auxiliares
de AAV, por ejemplo, rep y/o cap se proporcionan a la
célula huésped mediante uno o más vectores que llevan las secuencias
que codifican las deseadas funciones auxiliares. Ver, por ejemplo,
Patente US 6, 203,975 [plasmid carrying rep/cap proteins optionally
conjugated to a recombinant adenovirus] y Patente US No. 6, 258,595
[describing a number of plasmids carrying rep and/or cap functions].
Las secuencias rep y cap, junto con sus secuencias
control de expresión, pueden ser suministradas sobre un vector
único, o cada secuencia puede ser suministrada sobre su propio
vector. Preferiblemente, las secuencias rep y cap se
suministran sobre el mismo vector. Alternativamente, las secuencias
rep y cap pueden ser suministradas sobre un vector que
contiene otras secuencias de ADN que son para ser introducidas en
las células huésped, por ejemplo, las funciones auxiliares
adenovirales. Preferiblemente, el promotor de los cuales las
proteínas rep o cap se expresen puede ser cualquiera
de los promotores constitutivo, inducible o nativo conocidos por
alguien de habilidad en el oficio o según lo discutido
anteriormente. En una modalidad, una secuencia promotor AAV P5 se
emplea para la expresión de las proteínas rep. Mientras esto
se puede obtener de cualquier fuente AAV, el promotor P5 parvovirus
es preferiblemente del mismo serotipo como el serotipo que
proporciona las secuencias del gen rep y cap.
Alternativamente, el promotor puede ser un promotor P5 de otro tipo
AAV el cual es el que proporciona las secuencias rep y
cap. Los AAVs conocidos para infectar otros humanos u otros
animales también pueden proporcionar el promotor P5. La selección
del AAV para proporcionar cualquiera de estas secuencias no limita
la invención. En otra modalidad, el promotor para rep es un
promotor inducible. Según lo discutido arriba, los promotores
inducibles incluyen, sin limitación, el promotor metalotionina (MT);
el promotor del virus de tumor mamario de ratón dexametasona
(Dex)-inducible (MMTV); el sistema promotor
polimerasa T7; el promotor insecto ecdysone; el sistema
tetraciclina-reprimible; el sistema de
tetraciclina-inducible; el sistema
RU486-inducible; y el sistema
rapamicina-inducible. Un promotor preferido para la
expresión rep es el promotor T7. El vector que comprende el
gen rep regulado por el promotor T7 y el gen cap, se
transfecta o transforma en una célula la cual tanto constitutiva
como induciblemente expresa la polimerasa T7. Ver WO 98/10088,
publicado Marzo 12, 1998.
Las moléculas ejemplares que proporcionan las
proteínas rep y cap AAV son plásmidos, por ejemplo,
pMT-Rep/Cap, pP5-Rep/Cap y
pMMTV-Rep/Cap. Estos plásmidos contienen un gen
marcador selectivo de neomicina y expresan los genes rep/cap
AAV conducidos por ya sea su promotor P5 nativo
(pP5-Rep/Cap), el promotor de metalotionina oveja
zinc-inducible (pMTRep/Cap), como el promotor (MMTV)
del virus de tumor de ratón mamario dexametasona
(Dex)-inducible (pMMTV-Rep/Cap). A
pesar de que estas proteínas pueden ser proporcionadas a la célula
por varios medios, métodos de la invención ejemplares incluyen el
uso de varios plásmidos. Para la construcción del plásmido
pMT-Rep/Cap, la secuencia ORF6 se retiró a partir de
un plásmido pMTE4ORF6 [G. P. Gao et al, J. Virol.,
70:8934-8943 (1996)] por la digestión de
BamHI y se reemplazó con un fragmento rep/cap de 4.1 kb que se
preparó por amplificación PCR utilizando el plásmido pSub201 [RJ
Samulski, et al., J. Virol.,
63:3822-3828 (1989)] como un molde. El
plásmido pMMTV-Rep/Cap se construyó de la misma
forma como el pMT-Rep/Cap, excepto que un plásmido
pMMTVE4ORF6 [Gao et al, citado arriba] se utilizó como el
vector esqueleto. Para la construcción del
P5-Rep/Cap, las secuencias promotor MT y ORF6 se
retiraron a partir de un plásmido pMTE4ORF6 [G. P. Gao et al,
J. Virol., 70:8934-8943 (1996)] por la
digestión del EcoRI/BamHI y se reemplazaron con un fragmento 4.3 kb
P5-Rep/Cap que fue aislado de un plásmido pSub201
[RJ Samulski, et al, J. Virol.,
63:3822-3828 (1989)] por la digestión del
XbaI. La construcción del plásmido involucra métodos de ingeniería
genética convencionales, tales como aquellos descritos en Sambrook
et al, citado arriba.
Una variedad de otras construcciones del
plásmido que proporcionan las proteínas rep y/o cap se conocen en
el oficio y pueden ser empleadas en la célula huésped de la
invención. Por ejemplo, las construcciones rep y/o cap pueden
omitir el espaciador entre el promotor y los genes rep y/o cap
referidos en la construcción descrita arriba. Otras construcciones
del oficio, tales como esta descrita en Patente US No. 5,622,856,
que colocan el promotor P5 3' en los genes rep/cap, también se
pueden emplear en este contexto.
La molécula que proporciona las proteínas rep
y/o cap puede estar en cualquier forma que transfiera estos
componentes a la célula huésped. En una modalidad, esta molécula
esta en la forma de un plásmido, la cual puede contener otras
no-secuencias virales, tales como aquellas para
genes marcadores. En conformidad, esta molécula no contiene los AAV
ITRs y generalmente no contiene las secuencias de empaquetamiento
AAV. De esta manera, una variedad de vectores son conocidos para
entregar las funciones auxiliares de AAV a una célula huésped. Sin
embargo, la selección de un vector apropiado para la entrega de las
funciones auxiliares de AAV no es una limitación de la presente
invención.
De acuerdo con la presente invención, cualquiera
de las funciones auxiliares deseadas (por ejemplo, adenovirus, AAV
rep, AAV cap, u otras funciones auxiliares) que no están
establemente contenidas en la célula se proporcionan a la célula
mediante un vector apropiado. Según lo utilizado en esta, un vector
es cualquier elemento genético que puede ser entregado a una célula
huésped, por ejemplo, ADN desnudo, un plásmido (infeccioso o
no-infeccioso), fago, episoma, transposón, cósmido,
virus, etc. que transfieren las secuencias llevadas en estos. El
vector seleccionado se puede entregar a las células por cualquier
método apropiado, incluyendo transfección, electroporación, entrega
del liposoma, técnicas de fusión de membrana, pellets de
ADN-cubierto de velocidad alta, infección y fusión
de protoplasto. La transfección se refiere durante toda esta
especificación para propósitos de conveniencia solamente, no es una
limitación sobre el método de transferencia del elemento genético a
la célula.
De esta manera, a menos que todas las funciones
auxiliares necesarias estén establemente contenidas en la célula
huésped, las funciones auxiliares se suministran mediante
co-transfección, infección o superinfección, según
lo descrito en esta. En conformidad, las células se
co-transfectadan/infectan con el auxiliar en una
cantidad de aproximadamente 0.2 \mug a aproximadamente 2 \mug de
ADN por 1 a 5 x 10^{5} células, y más preferiblemente
aproximadamente 1 \mug a aproximadamente 1.8 \mug ADN por 5 x
10^{5} células. La invención no se limita a esta concentración de
células, la cual puede ser variada (por ejemplo, de 10^{3} o de
pocas células a 10^{12} o más células) dependiendo del pozo de la
placa, del tipo de célula, u otros factores conocidos por aquellos
de habilidad en el oficio. El ADN digerido-enzima de
restricción y el vector auxiliar son apropiadamente proporcionados
a la célula a una relación de 1:1 a 1:10 ADN digerido: auxiliar.
Alternativamente, una cantidad mayor de ADN digerido puede ser
proporcionada a la célula que la del vector auxiliar.
De esta manera, de acuerdo con el método de la
invención, el ADN digerido se transfecta en las células huésped por
rescate y amplificación de las secuencias diana. En un ejemplo, el
método de la invención se utiliza para el rescate de un AAV a
partir de un tejido de primate (humano o no humano).
En una modalidad, el ADN digerido se transfecta
durante la noche en las células huésped; las células se incuban
durante la noche y luego se superinfectan con un adenovirus
auxiliar; se cosechan siguiendo el efecto citopático completo (CPE)
y opcionalmente además se realiza un pasaje. Según lo utilizado en
esta, la superinfección se refiere a la entrega de un virus
auxiliar que proporciona cualquiera de las funciones auxiliares
necesarias no provistas por la célula huésped. Por ejemplo, cuando
las funciones auxiliares se proporcionan por un adenovirus, el
empaquetamiento y la replicación de AAV requiere, en un mínimo, de
las funciones E1 (i.e., E1a y E1b), E2a, E4 (o un fragmento
funcional de estos, tal como el fragmento ORF6) y VAI ARN. Si la
célula huésped no provee de las funciones E1, un vector auxiliar,
por ejemplo, el adenovirus auxiliar, suple estas funciones.
Preferiblemente, las funciones E1 están contenidas establemente en
la célula huésped.
De esta manera, siguiendo la transfección de la
célula huésped seleccionada, después las células se cultivan por la
célula huésped seleccionada con el fin de permitir la expresión de
las funciones auxiliares y la replicación de AAV. Típicamente, las
células se cultivan bajo condiciones convencionales por
aproximadamente 18 a aproximadamente 30 horas, o por conveniencia,
aproximadamente 24 horas, tiempo en el cual se superinfectan con un
virus auxiliar adenoviral.
Para la superinfección, un vector viral que
proporciona las funciones del gen adenoviral
tipo-salvaje puede ser utilizado o se provee un
genoma adenoviral recombinante que proporcione las funciones E1
adenovirales. Alternativamente, cuando la línea celular proporciona
las funciones del gen E1, se puede utilizar un vector viral que
contenga todas las funciones del gen adenoviral con la excepción de
E1. En conformidad, sin embargo, la célula huésped se provee con un
mínimo, de funciones E1a, E1b, E2a, y VAI ARN. Las funciones
auxiliares adenovirales pueden ser a partir del mismo serotipo de
adenovirus como se proporciona de las otras funciones auxiliares en
la célula, o de un serotipo de transcomplementación. Por ejemplo, se
puede utilizar una línea celular que expresa Ad5 E1a y E1b humano y
un virus auxiliar que lleva funciones auxiliares de adenovirus
humano o simio (por ejemplo, chimpancé C68). Alternativamente, uno
puede utilizar una línea celular que exprese Ad5 E1a y E1b humano,
un primer vector auxiliar que lleva las funciones auxiliares de
adenovirus, y un adenovirus para la etapa de superinfección. Muchas
otras combinaciones son posibles, y serán fácilmente evidentes para
alguien de habilidad en el oficio. En conformidad, el virus auxiliar
se provee en una multiplicidad de infección (MOI) en el rango de 2
a 5. Sin embargo, otra MOI apropiada puede ser fácilmente
determinada por alguien de habilidad en el oficio.
Cualquiera de las funciones AAV auxiliares
deseadas puede ser suministrada en el tiempo de la transfección del
ADN digerido o en el tiempo de superinfección. Las células se
cosechan típicamente después de que se observe el CPE completo, lo
cual usualmente es aproximadamente a las 72 a aproximadamente 96
horas después de la superinfección. Las células se cosechan
utilizando técnicas convencionales. Típicamente, el cultivo se
somete a uno o preferiblemente varios ciclos de
congelación/descongelación, y el lisado crudo resultante se colecta
para el siguiente pasaje o detección del ADN diana.
Opcionalmente, el pellet, que contiene el ADN
celular total y las proteínas del primer pasaje, se somete a un
pasaje adicional para las etapas de repetición del cultivo y de
colección. Opcionalmente, un vector apropiado puede proveer
funciones auxiliares de AAV adicionales durante una o más de la
etapa de pasajes adicionales. Estas etapas se pueden repetir como
sea necesario, por ejemplo, para un total de dos a cincuenta
pasajes. Sin embargo, la etapa de realizar los pasajes puede ser
menor, por ejemplo, para un total de dos a treinta pasajes, dos a
veinte pasajes, dos a diez pasajes, dos a cinco pasajes, o más,
cuando se desee.
En una segunda modalidad, el ADN digerido se
co-transfecta a una célula huésped la cual expresa
las funciones E1 adenovirales con un plásmido auxiliar adenoviral
que proporciona solamente las mínimas funciones adenoviral E2a, E4
(o un fragmento funcional de estos) y VAI ARN; cosechando; y
superinfectando con el virus en el primer pasaje. Alternativamente,
la célula huésped no proporciona las funciones E1 y estas funciones
se suministran en un vector auxiliar el cual puede ser igual o
diferente de aquel que proporciona las otras funciones auxiliares.
Cualquiera de las funciones AAV auxiliares deseadas puede ser
suministrada en el tiempo de la transfección del ADN digerido o en
el tiempo de la superinfección.
En esta segunda modalidad, no se observa el CPE,
y las células se cosechan típicamente después de aproximadamente 72
a aproximadamente 96 horas de post-transfección
utilizando técnicas convencionales. Típicamente, el cultivo se
somete a congelación-descongelación según lo
descrito arriba y el lisado crudo se colecta para realizar un
pasaje. A este tiempo, es necesario suplir la función auxiliar
adenoviral, preferiblemente en la forma de un plásmido o virus
infeccioso. Después de esto, al cultivo se le realiza un pasaje
según lo descrito en la primera modalidad arriba. Además, la línea
celular opcionalmente puede estar provista con cualquiera de las
funciones AAV deseadas mediante co-transfección o
infección en el tiempo de la transfección inicial con el ADN
digerido, o preferiblemente, en el tiempo del inicio del primer
pasaje (i.e., con superinfección). Opcionalmente, funciones
auxiliares de AAV adicionales (por ejemplo, rep) pueden ser
suministradas durante uno o más de los pasajes adicionales.
En aún una tercera modalidad, el ADN digerido se
co-transfecta en la célula huésped con un plásmido
infeccioso. Típicamente, un plásmido infeccioso contiene el genoma
del adenovirus completo. Sin embargo, cuando se transfecta en una
línea celular que expresa las funciones E 1, un plásmido
contagiosamente infeccioso puede contener el genoma adenoviral
completo con la excepción de que la E1 se suprime o se da
no-funcional. Opcionalmente, la célula también se
transfecta con cualquiera de las funciones auxiliares de AAV
deseadas. Después de cultivar las células, se observa el CPE
utilizando técnicas convencionales. Típicamente, el cultivo se
somete a congelamiento/descongelamiento, según lo descrito arriba,
y el lisado crudo se colecta para el próximo pasaje o la detección
del ADN diana.
Independientemente de cual de las tres
modalidades alternativas de arriba se utilice, el lisado crudo que
contiene el total de ADN celular y las proteínas del primer pasaje
opcionalmente se somete además a un pasaje repitiendo las etapas de
transfección, cultivo y colección. Estas etapas se pueden repetir
como sea necesario, por ejemplo, por un total de dos a cincuenta
pasajes. Sin embargo, la etapa de realizar un pasaje puede ser
menor, por ejemplo, para un total de dos a treinta, dos a veinte,
dos a diez, dos a cinco, o más, cuando se desee.
Siguiendo la colección del pellet celular a
partir de la etapa final del pasaje realizada, se analizan el ADN
celular y las proteínas en el pellet para detectar la presencia del
ADN diana integrado, por ejemplo, AAV. Esta etapa de detección
puede ser llevada a cabo utilizando cualquier método apropiado. En
una modalidad, se utilizan las técnicas de PCR TaqMan. Ver,
generalmente, Sambrook et al, citado en esta. En otra
alternativa, el AAV infeccioso puede ser aislado utilizando la
tecnología walking del genoma (Siebert et al., 1995,
Nucleic Acid Research, 23:1087-1088,
Friezner-Degen et al., 1986, J. Biol.
Chem. 261:6972-6985, BD Biosciences
Clontech, Palo Alto, CA). En otra modalidad, un método de detección
novedoso desarrollado en el laboratorio de los inventores puede ser
utilizado. Este método es particularmente bien conveniente para la
detección de AAV de un serotipo novedoso y/o desconocido y es el
tema de una aplicación co-pendiente, Patente US
Aplicación No. 10/291,583, archivado Noviembre 12, 2001, titulado
"A Method of Detecting and/or Identifying
Adeno-Associated Virus (AAV) Sequences and
Isolating Novel Sequences Identified Thereby" (publicado como US
2003/0138772).
Alternativamente, siguiendo el pasaje, los
pellet celulares se cosechan para la purificación del virión AAV
siguiendo procedimientos estándar. Entre tales procedimientos
estándar están, la purificación por gradiente de cloruro de cesio
(CsCl), cromatografía de columna, y técnicas tales como aquellas
descritas [Gao et al, Hu Gene Therapy,
11:2079-2091 (Oct 2002)] y en algún otro
sitio en la literatura.
Por ejemplo, las células juntas con el medio de
transfección se pueden cosechar mediante raspadores y se someten a
tres ciclos de congelación/descongelación en
etanol-hielo seco y 37ºC baño de agua. Las células
se pueden centrifugar, por ejemplo, por 15 minutos a 4ºC. Ver,
usualmente, Sambrook et al, citado en esta.
De esta manera, el método de la invención
permite la detección, identificación, y aislamiento de las
secuencias diana virales, particularmente las secuencias virales
integradas. La invención además proporciona un novedoso virus
identificado y aislado utilizando el método de la invención. Una vez
así aislado e identificado, el novedoso virus puede ser
caracterizado utilizando los métodos conocidos por aquellos de
habilidad en el oficio y utilizados para una variedad de propósitos
que serán fácilmente evidentes para alguien de habilidad en el
oficio.
Los métodos de la invención son particularmente
bien convenientes para emplear en la detección, identificación y
aislamiento de las secuencias AAV, que puedan incluir novedosos
serotipos AAVs. Los métodos de la invención pueden ser fácilmente
utilizados por una variedad de estudios de epidemiología, estudios
de biodistribución, monitoreo de terapia génica vía vectores de AAV
y vectores derivados de otros virus integrados. De esta manera, los
métodos son bien convenientes para emplear en kits
pre-empacados para emplear por clínicos,
investigadores, y epidemiólogos.
En otro aspecto, la invención proporciona un kit
de diagnóstico para la detección de la presencia de un blanco
integrado conocido o desconocido, por ejemplo, un virus
adeno-asociado (AAV), en una muestra. Tale kit puede
contener viales que contienen la enzima de restricción rara, las
células para un pasaje del ADN extraído, plásmidos virales
auxiliares y/o virus, entre otros materiales.
La invención además proporciona un kit útil para
la identificación de un serotipo AAV detectado de acuerdo con el
método de la invención y/o para distinguir el novedoso AAV de un
conocido AAV. Además, los kits de la invención pueden incluir,
instrucciones, un control negativo y/o positivo, envases, diluentes
y soluciones reguladoras para la muestra, cartas indicadoras para
comparaciones distintivas, guantes desechables, instrucciones de
descontaminación, barritas aplicadores o envases, y tazas de
preparación de la muestra, así como cualquiera de los reactivos
deseados, incluyendo medios, reactivos de lavado y reactivos de
concentración. Tales reactivos pueden ser fácilmente seleccionados
entre los reactivos descritos en esta, y entre reactivos de
concentración convencional. En una modalidad deseable, el reactivo
de lavado es una solución salina isotónica que ha sido regulado a
un pH fisiológico, tal como solución salina reguladora de fosfato
(PBS); el reactivo de elución es PBS que contiene NaCl 0.4 M, y los
reactivos y dispositivos de concentración. Por ejemplo, alguien de
habilidad en el oficio reconocerá que los reactivos tales como
polietilenglicol (PEG), o NH_{4}SO_{4} pueden ser útiles, o que
los dispositivos tales como dispositivos de filtración. Por ejemplo,
un dispositivo de filtración con una membrana 100 K concentraría el
rAAV.
Los kits proporcionados por la presente
invención son útiles para realizar los métodos descritos en esta, y
para el estudio de la biodistribución, epidemiología, modo de
transmisión de serotipo AAVs novedoso en humano y NHPs.
De esta manera, los métodos y kits de la
invención permiten la detección, identificación, y aislamiento de
secuencias virales diana, particularmente secuencias virales
integradas. Los métodos y kits son particularmente bien
convenientes para emplear en la detección, identificación y
aislamiento de las secuencias AAV, las cuales pueden incluir los
serotipos AAVs novedosos.
Los siguientes ejemplos ilustran muchos aspectos
y modalidades de la invención.
Ejemplo
1
Un conjunto de cebadores y sondas se designaron
basados en un tramo de la secuencia localizada dentro de la región
4 hiper-variable del gen de la cápside del AAV8 para
un análisis PCR a tiempo real (TaqMan). El análisis TaqMan se llevó
a cabo para más de 110 muestras de ADN a partir de 10 tejidos cada
uno de 11 monos rehesus de dos diferentes colonias. Se encontró que
los tejidos del corazón e hígado de un mono (98E056) se
enriquecieron más en la secuencia AAV8. Las copias del genoma de la
secuencia AAV8 por 1 \mug de ADN son 88000 para el corazón y
22000 para el hígado. Con tal abundancia de la secuencia AAV8 en
estas dos muestras de ADN, estas fueron objeto para ser buenas
candidatas para el rescate del virus AAV8.
Ejemplo
2
Con el fin de rescatar el AAV8 a partir de ADNs
de tejido mono, la entrega del ADN en las células apropiadas es la
primera etapa. La transfección directa de ADN celular de alto peso
molecular en células de mamíferos usualmente resulta en un pobre
rendimiento de la transferencia génica. Para vencer esta barrera, 5
\mugs de ADN de hígado de mono #98E056 se trataron con Pme I, una
no-cortadora en el genoma AAV8 durante la noche y
luego se extrajo con fenol/cloroformo, se precipitó con etanol y se
disolvió en TE (Tris 1 M, pH 8.0, EDTA 0.5 M, pH 8.0,
dH_{2}0).
Ejemplo
3
En este estudio, las células 293, una línea
celular de fibroblasto de riñón embrionario humano que se transformó
por los genes E1 de serotipo de adenovirus humano 5, se seleccionó
como huésped para rescate debido a su alta capacidad de
transfección y las exitosas aplicaciones en la producción de una
variedad de vectores de AAV de diferentes serotipos. El método de
fosfato de calcio, un método que se utilizó comúnmente en la triple
transfección de células 293 para la producción de recombinante AAVs
de serotipos diferentes, fue el método de transfección en este
experimento.
El otro crucial requerimiento para el rescate de
genomas de AAV es la presencia de apropiadas funciones auxiliares
de adenovirus. En este experimento, seleccionamos serotipo de
adenovirus humano 5 como el auxiliar para iniciar con base en dos
observaciones. La primera fue que el uso del plásmido auxiliar Ad5
en la triple transfección de células 293 resulta en una producción
de alto rendimiento de los vectores AAV2/8, sugiriendo que Ad5 es
un buen auxiliar. La segunda observación fue que el mono 98E056 en
el cual se detectaron los altos números de copia de la secuencia
AAV8 en hígado y corazón se trató con un vector adenovirus
recombinante a través de la administración por la vena hepática
antes de que fuera sacrificado. Esto podría conducir a una
especulación de que la infección de adenovirus dio lugar al rescate
y amplificación de los genomas AAV8 en algunos tejidos de este
mono.
Las células 293 se sembraron en placas de 12
pozos a una densidad de 5 x 10^{5} células por pozo. El
experimento de transfección y rescate se realizó como sigue.
Grupo A-1: 1\mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1 \mug de ADN pBluescript (ADN
portador)
Grupo A-2: 0.2 \mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1.8 \mug de ADN pBluescript (ADN
portador)
Grupo B-1: 1 \mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1 \mug de ADN pAd\DeltaF6 (plásmido
auxiliar Ad no-infeccioso)
Grupo B-2: 0.2 \mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1.8 \mug de ADN pAd\DeltaF6 (plásmido
auxiliar Ad no-infeccioso)
Grupo C-1: \mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1 \mug de pAdCMVLacZ (plásmido Ad
infeccioso)
Grupo C-2: 0.2 \mug de ADN de
hígado tratado con Pme I + 1.8 \mug de pAdCMVLacZ (plásmido Ad
infeccioso)
A las 24 horas de
pos-transfección, las células en A-1
y A-2 se infectaron con el virus Ad5wt en una MOI de
2. Las células en A-1, A-2,
B-1 y B-2 se cosecharon a 96 horas
de pos-transfección y se lisaron por 3 ciclos de
congelación/descongelación. Las células en C-1 y
C-2 se cosecharon para la preparación del lisado
crudo después del efecto citopático completo (CPE) y se observaron
a los 15 días de pos-transfección.
El lisado de la célula cruda completa de cada
grupo se paso luego en una placa de 100 mm de células 293. Para el
grupo B- 1 y B-2, las células también se
superinfectaron con el virus Ad5wt E1-suprimido en
una MOI de 5. Como un control, una placa de 100 mm de células 293
se infecta con el mismo virus Ad5wt en una MOI de 5. Cuando se
observó el CPE completo, cada infección se cosechó. La décima parte
de cada infección se guardó para tres ciclos de
congelación/descongelación y se pasaron a otras placas de 100 mm de
las células 293 para el próximo pasaje. La infección remanente se
centrifugó para colectar el pellet celular para la preparación de
ADN celular total y las proteínas. El proceso se repitió para cada
muestra para 2 y 3 pasajes para las caracterizaciones
iniciales.
Ejemplo
4
Para examinar si la secuencia AAV8 se rescató y
amplifico durante los pasajes seriales, los extractos de ADN total
a partir de diferentes pasajes de cada grupo experimental se sometió
a un análisis TaqMan para la secuencia del gen AAV8 cap. Los
resultados se resumen abajo (GC = copia del genoma). Ver Tabla
1.
Los datos sugirieron lo siguiente:
El virus AAV8 se rescató en el proceso de
transfección y además se amplificó durante los pasajes seriales en
los grupos A-1, B-1 y
B-2 y C-1. Tal amplificación no es
dramática durante los pasajes, probablemente debido a la capacidad
de empaquetamiento limitado de AAV en las células 293 y a las
inhibiciones de crecimiento competitivo entre Adenovirus y AAV.
Cuando se utilizaron 0.2 \mug de mono ADN en
A-2 y C-2, no hubo secuencia de AAV8
significante detectada en ningún pasaje. Esto puede implicar que un
umbral de la copia del genoma inicial del AAV se requiere para
vencer la inhibición del adenovirus para el rescate y amplificación
en las células 293. Pero en el caso de B-2, dado
que los rescates de AAV8 y Adenovirus ocurrieron simultáneamente, la
inhibición del rescate, la replicación y el empaquetamiento de AAV8
mediante la replicación y empaquetamiento del adenovirus es menos
perjudicial, conduciendo al éxito del rescate y amplificación de
AAV8 aún en copias del genoma bajas.
Esto sugiere que como y cuando las funciones
auxiliares de adenovirus se proporcionan son importantes para el
rescate y amplificación de AAV por este método.
Los datos TaqMan sugieren alguna reactividad en
cruz entre sondas/cebadores de AAV8 y las secuencias de ADN de
células 293. Para confirmar la presencia de la secuencia AAV en las
infecciones, se realizaron dos pruebas adicionales.
Los lisados crudos de
A-1-P3.
C-1-P3 y
Ad-control-P3 se trataron con DNase
I por 1 hora a 37°C para digerir los genomas AAV8
no-empacados. 0.4 \mul de cada uno del lisado
tratado se utilizó por la amplificación PCR de 50 \mul. Los
productos PCR se examinaron por electroforesis de gel agarosa 2%.
Los resultados revelados contaban con productos PCR distintivos de
250 bp en las muestras A-1-P3 y
C-1-P3, mientras que el
Ad-control-P3 no mostró ninguna
banda en todos. Esto confirma que las señales recogidas por TaqMan
in A-1 y C-1 eran de la secuencia
AAV.
Para identificar que los tipo(s)
molecular(s) de las secuencias AAV se rescataron y empacaron
en este experimento, un par del conjunto universal de cebadores se
designaron para amplificar una secuencia 3.1 kb abarcando el gen
cap total y el terminal 3' del gen rep. El producto PCR se clona y
se secuencia parcialmente para la identificación.
Como otra manera de confirmar la presencia del
virus de AAV en el lisado crudo, proteína expresión Rep y Cap de
AAV en diferentes pasajes se examinaron. En un experimento previo,
se encontró que el Clon B1, un anticuerpo monoclonal del ratón para
las proteínas de la cápside de AAV2, podría reaccionar en cruz con
las proteínas de la cápside de AAV1, 5, 7 y 8. La comparición de la
secuencia extensiva de todos los tipos de AAVs reveló una similitud
fuerte en la región Rep. Se decidió usar el Clon 259.5, un
anticuerpo monoclonal de ratón para la proteína Rep AAV2, para el
análisis Western blot.
Las proteínas celulares totales se extrajeron
del pellet celular del pasaje 3 de algunas infecciones y se
cuantificaron. Cinco \mugs cada uno de la proteína total se
utilizaron para el análisis Western blot. Los resultados se resumen
en la Tabla 2 abajo.
Los datos sugieren una correlación entre las
copias del genoma de la secuencia AAV8 y la expresión Rep/Cap,
indicando que la secuencia AAV8 presentada en las células fue activa
transcripcional y translacionalmente.
Ejemplo
5
El análisis TaqMan, la PCR/clonación y el
análisis Western blot documentaron la presencia de la secuencia AAV
y la expresión génica rep/cap según lo descrito en esta.
Utilizando la tecnología TaqMan, se ha
determinado que dos tejidos en el mono #98E056 están más
enriquecidos en la secuencia AAV8. Ellos son el corazón y el hígado
(88,000 y 22,000 GC de AAV8 por \mug de ADN respectivamente).
Para estudiar si la secuencia AAV8 en ADN de tejido es rescatable y
empacable en los viriones, el ADN de hígado de este mono se
restringió con Pme 1, un no-cortador en el genoma
AAV8 y se transfectó en las células 293 con plásmidos auxiliares de
adenovirus infeccioso o no-infeccioso o seguido por
la infección de adenovirus 24 horas después. El lisado crudo de
cada transfección o transfección/infección se cosechó en 72 horas
post-transfección y se sometió a pasajes
seriales.
Más particularmente, el ADN celular preparado
del hígado de mono se restringió con Pme I endonucleasa y se
co-transfectó con plásmidos adenovirus infecciosos y
no-infecciosos o plásmido control en las células 293
utilizando la metodología convencional de fosfato de calcio (ADN de
hígado de mono rhesus). Un plásmido control se utilizó para la
transfección mock (pBluescript). El plásmido auxiliar adenovirus
no-infeccioso proporcionó las funciones auxiliares
E2a, E4 y VARNA. Un plásmido adenoviral recombinante
E1-suprimido infeccioso se utilizó para infectar a
las células 293 (pAd\DeltaF6). Para los grupos A-1
y A-2, el adenovirus auxiliar se adicionó a las 24
horas post-transfección y el lisado de célula se
cosechó 48 horas después para los pasajes (pAdCMVLacZ). Para
C-1, C-2 y el grupo control, lisado
de célula se preparó a las 72 horas
post-transfección y el virus auxiliar se adicionó a
las células 293 en el primer pasaje (virus Ad5 wt). Ver, Tabla
3.
Como una manera para confirmar la presencia del
virus de AAV en el lisado crudo, la proteína expresión AAV Rep y
Cap se examinó en diferentes pasajes. En un experimento previo, se
encontró que el Clon B1, un anticuerpo monoclonal de ratón para las
proteínas de la cápside AAV2, podría reaccionar en cruz con las
proteínas de la cápside de AAV1, 5, 7 y 8 (datos no mostrados). La
comparación de la secuencia extensiva de todos los tipos de AAVs
también revelaron una fuerte similaridad en la región Rep.
Un anticuerpo monoclonal de ratón para la
proteína AAV2 Rep (Clon 259.5) se seleccionó para emplear en el
análisis Western blot. Las proteínas celulares totales se extrajeron
de los pellet celulares del pasaje 1 de los experimentos
B-1 y B-2 y se cuantificaron. Dos
\mugs cada uno de la proteína total se utilizaron para el
análisis Western blot de rep y cap. La presencia de las secuencias
del gen AAV8 cap en el ADN celular se extrajeron del pasaje 1 del
grupo B-1 y B-2 también se
cuantificaron por TaqMan utilizando los cebadores y las sondas
específicas AAV8 cap.
Para determinar que el genoma AAV rescatado era
efectivamente AAV8, se realizaron la amplificación PCR y la
clonación de la región 3.1 kb cap a partir de lisados crudos
tratados con DNase I del pasaje 3 de C-1 y la
transfección mock. Como era esperado, no se detecta una banda PCR en
la muestra transfectada mock pero el análisis de la secuencia de
los clones C-1 confirmó que los genomas que fueron
rescatados y empacados en las células 293 en la presencia de
adenovirus auxiliar son AAV8 (datos no mostrados).
La siguiente etapa es aislar los viriones de AAV
de esta entidad molecular. Como se describe adicionalmente en el
Ejemplo 6, el lisado crudo de A-1,
B-1, C-1 y
Ad-control se pasaron continuamente sobre placas de
1, 5, y 50 de 150 mm de las células 293. Los pellets celulares se
cosecharon en 42 horas post-infección para una
purificación por gradiente de CsCl del virión AAV siguiendo
procedimientos estándar.
Ejemplo
6
Una vez los viriones de AAV se aislaron, se
realizaron los análisis de microscopía electrónica por transmisión
de las muestras teñidas negativamente para demostrar la morfología
de los viriones de AAV. Además, los clones moleculares infecciosos
de los genomas de AAV empacados en los viriones se crearon para una
caracterización adicional, siguiendo el procedimiento descrito en
Xiao et al., J. Virol.,
73(5):3994-4003 (May 1999).
Para examinar los viriones físicos de AAV8, el
lisado crudo del pasaje serial del grupo C-1 junto
con ese del grupo de transfección mock se expandieron para 50
infecciones de placa y se sometieron a gradiente de centrifugación
CsCl para la purificación de los viriones de AAV. La concentración
de la copia del genoma de AAV8 se determinó mediante el análisis
TaqMan. Se realizó el análisis por microscopía electrónica por
transmisión de las muestras teñidas negativamente. En los
resultados (no mostrados) la muestra C-1 ilustra los
viriones típicos de AAV pero la transfección Mock no tiene
estructuras visibles de AAV.
Ejemplo
7
Utilizando los métodos descritos en esta (ver,
ejemplo 3), se llevó a cabo un experimento para rescatar el
novedoso AAV de simio identificado en tejido de bazo de un mono
rhesus. El ADN celular se trató con PmeI y
co-transfecta en cantidades iguales (1 \mug cada
uno) con un clon molecular E1-suprimido de
adenovirus de simio Pan 6, un clon molecular
E1-suprimido de adenovirus de simio Pan9, y un clon
molecular E1-suprimido de Ad5humano en células 293.
Los títulos de AAV se determinaron mediante el análisis TaqMan en el
pasaje 1 de post-transfección según lo descrito en
estos ejemplos.
Estos datos sugieren que los serotipos de
adenovirus de simio pueden ser más eficientes en el rescate de los
serotipos de AAVs de simio.
Claims (29)
1. Un método de rescate directo de virus
adeno-asociados (AAV) del ADN celular de tejidos,
que comprende las etapas de
- (a)
- digestión del ADN en una muestra de ADN genómico a partir de una fuente celular de mamífero con una enzima de restricción de corte rara la cual no divide el genoma nativo de AAV;
- (b)
- transfección del ADN digerido a las células;
- (c)
- cultivo de las células transfectadas bajo condiciones en las cuales se expresen en las células, al menos las, funciones adenovirales mínimas necesarias para el empaque y la replicación del AAV;
- (d)
- realizar un pasaje del lisado obtenido de la etapa de cultivo (c) a células que expresan funciones auxiliares;
- (e)
- opcionalmente, someter el lisado de la etapa de pasaje a un pasaje adicional; y
- (f)
- detección, identificación y/o aislamiento del AAV a partir del lisado.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1,
en donde la etapa de digestión se realiza utilizando una enzima de
restricción seleccionada del grupo que consiste de PmeI, FseI, Pad,
PsrI, BcgI, BglI, BsabI, BstXI, DrdI, EcoNI, y MaM I.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1
o 2, en donde la etapa de digestión además comprende las etapas de
incubación del ADN de la muestra con PmeI, de realización de una
extracción de fenol/cloroformo, de precipitación con etanol, y de
disolución del precipitado.
4. Un método de acuerdo con la reivindicación 3,
en donde la etapa de incubación se realiza por aproximadamente 12 a
48 horas.
5. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en donde la fuente celular de mamífero es
tejido de un primate no humano o de un humano.
6. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde las células de la etapa (b) se
transforman establemente con los genes E1a y E1b de adenovirus bajo
el control de elementos de control reguladores que dirigen la
expresión de los productos de los genes E1a y E1b.
7. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde las células de la etapa (b) son de
células 293.
8. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde las células de la etapa (b)
expresan las funciones auxiliares de AAV.
9. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde las células de la etapa (b)
expresan las proteínas rep del AAV.
10. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde las células de la etapa (b) son
co-transfectadas con un vector que contiene
secuencias adenovirales que consisten de los adenovirus E1a, E1b,
E2a, E4 (o un fragmento funcional de estos) y del ARN VAI.
11. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde las células de la etapa (b) son
co-transfectadas con un vector que contiene las
secuencias adenovirales que consisten de adenovirus E2a, E4 (o un
fragmento funcional de estos) y del ARN VAI.
12. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde las funciones auxiliares
adenovirales se suministran sobre un plásmido.
13. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en donde las funciones auxiliares se
proporcionan por uno o más serotipos de adenovirus.
14. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en donde las funciones E1a y E1b de los
adenovirus se proporcionan por un adenovirus humano.
15. Un método de acuerdo con la reivindicación
14, en donde las otras funciones auxiliares adenovirales necesarias
se proporcionan por un serotipo de adenovirus de chimpancé.
\newpage
16. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14, en donde las células de la etapa (b) se
transfectaron con 0.2 \mug a 2 \mug. de ADN por 5x10^{5}
células.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
1, que adicionalmente comprende la etapa de transfección con
plásmido adenoviral auxiliar no-infeccioso y
superinfeccioso de las células con un adenovirus de
tipo-salvaje cuando se realiza el pasaje.
18. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, que adicionalmente comprende la etapa de
transfección con un plásmido adenoviral auxiliar
no-infeccioso y superinfeccioso de las células con
adenovirus suprimido de E1 cuando se realiza el pasaje.
19. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en donde la etapa del pasaje se realiza en
las células 293.
20. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en donde la etapa del pasaje se repite.
21. Un método de rescate directo del AAV de
acuerdo con la reivindicación 1, adicionalmente caracterizado
en que:
las células transfectadas de la etapa (b) se
incuban y se superinfectan con las funciones auxiliares adenovirales
así que las células contienen al menos las funciones adenovirales
mínimas necesarias para el empaquetamiento y la replicación del
AAV;
las células transfectadas y superinfectadas se
cultivan; el lisado crudo se cosecha del cultivo superinfectado; y
el lisado crudo se pasa, por consiguiente permitiendo el rescate
directo y la detección del AAV.
22. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, en donde la etapa de cosecha adicional comprende sometimiento
del cultivo celular superinfectado a
congelación-descongelación para obtener el lisado
crudo.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
21, cuando el lisado crudo se somete a dos o más pasajes.
24. Un método de rescate directo de AAV de
acuerdo con la reivindicación 1, además caracterizado
por:
co-transfección de un plásmido
auxiliar adenoviral no-infeccioso que comprende las
secuencias de adenovirus que consiste de las funciones adenovirales
mínimas necesarias para el empaquetamiento y la replicación del AAV
las cuales no son proporcionadas por la célula huésped con el ADN
digerido en la etapa (b); tratamiento el cultivo celular para
obtener el lisado crudo de la siguiente etapa (b);
el sometimiento del lisado crudo a un primer
pasaje mediante la transfección del lisado crudo en las células y
la superinfección de las células con las funciones auxiliares
adenovirales así que las células contienen al menos las funciones
adenovirales mínimas necesarias para el empaquetamiento y la
replicación del AAV; y opcionalmente realizar un pasaje uno, dos o
más veces adicionales.
25. Un método de rescate directo del AAV de
acuerdo con la reivindicación 1, además caracterizado
por:
co-transfección en células de un
plásmido auxiliar adenoviral infeccioso que comprende las funciones
adenovirales mínimas necesarias para el empaquetamiento y la
replicación del AAV las cuales no se suministran por la célula
huésped en la etapa (b); tratamiento del cultivo celular (c) para
obtener el lisado crudo; y opcionalmente el sometimiento del lisado
crudo a dos o más pasajes por transfección del lisado crudo en las
células.
26. Un método de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, incluyendo la etapa del ensayo del lisado
crudo obtenido con cualquiera de los métodos de las reivindicaciones
1, 22, 24 o 25 para la presencia del AAV.
27. Un método de purificación del virus
adeno-asociados (AAV) a partir del ADN celular en
tejidos, que comprende las etapas de:
- (a)
- obtención del lisado crudo del AAV por un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1, 22, 24 y
- (b)
- centrifugación del lisado crudo para proporcionar un pellet celular; y
- (c)
- purificación del AAV a partir del pellet celular.
28. Un kit útil para el rescate directo del
virus adeno-asociados (AAV) a partir del ADN celular
de los tejidos de acuerdo con el método de la reivindicación 1 que
comprende
- (i)
- una enzima de restricción de corte rara la cual no se divide en un genoma nativo AAV, la enzima que es capaz de digerir el ADN en una muestra del ADN genómico a partir de una fuente de mamífero; y
- (ii)
- células que expresan las funciones auxiliares, las células que son capaces de pasar el lisado obtenido mediante la digestión del ADN en una muestra del ADN genómico a partir de una fuente de mamífero en la enzima de restricción seguido por la transfección del ADN digerido en las células y el cultivo de la célula transfectada bajo las condiciones en las cuales al menos las funciones adenovirales necesarias mínimas para el empaquetamiento y la replicación del AAV se expresan en las células.
29. Un kit de acuerdo con la reivindicación 28
útil para la detección y/o purificación de virus
adeno-asociados (AAV) a partir del ADN celular de
tejidos de acuerdo con el método de la reivindicación 26 o 27.
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