TWI382848B - 治療神經損傷及再生神經細胞的載體建構 - Google Patents

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Description

治療神經損傷及再生神經細胞的載體建構
本發明係關於一種治療神經損傷或再生神經細胞的方法及其載體構築體，特別係關於一種治療神經損傷或再生神經細胞之載體構築體的製備方法與用途。
在發生物理橫切傷、外傷、挫傷、擠壓傷、手術損傷或血管藥理傷害包括出血性或缺氧傷害、神經退化、其他精神疾病所造成之急性或慢性神經系統損傷後，可能需要再生神經細胞並恢復切除神經組織(denervated tissues)內之神經連結。
在神經系統損傷後，一般修復受損神經的方式是對病患進行神經縫合手術以及神經移植，其他可行的神經損傷治療包括移植新的神經細胞與支撐細胞、遞送蛋白質以刺激在脊椎神經內之細胞再生及減低抑制腦細胞再生之策略。部分研究發現在大鼠脊椎神經損害部位或附近直接施以神經修復劑能修復受損的脊椎神經(Cheng等人，1996，Science 273：510－513)。
美國專利申請公開號US20040267289之內容揭露了修復神經根的方法，包括將脊椎動物之一部分末梢神經系統移近脊椎動物之一部分中樞或末梢神經系統，並在兩部分間之縫隙敷上包含生長因子、纖維素源及其他重要元素的纖維蛋白膠混合物，使脊椎動物的該部分末梢神經系統與該部分中樞或末梢神經系統之間形成功能性連結。
本發明一方面提供了一種治療神經損傷的方法，包括遞送酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)之編碼基因至神經損傷位置，並在神經損傷位置表現該基因。
本發明另一方面提供了一種治療神經損傷的載體構築，包括承載aFGF之編碼基因的病毒載體。
本發明再一方面提供了一種再生神經細胞的方法，包括遞送aFGF之編碼基因至神經細胞，並在神經細胞表現該基因。
本發明又另一方面提供了一種再生神經細胞的載體構築，包括承載aFGF之編碼基因的病毒載體。
為使本發明內容清楚易懂，以下將對所使用的專有名詞做更詳盡的解釋。
在此所使用的冠詞“一”意指一或多於一(也就是至少一)的文法物件之冠詞，除非另行解釋該冠詞僅為以單一觀念的特定使用。
“載體”係指包括分離核酸的一物質組合，並可將該分離核酸輸送至細胞內部。多數的習知載體包括但不限於線性聚核苷酸、與離子性或兩親性化合物(ionic or amphiphilic compounds)有關之聚核苷酸、質體及病毒。因此“載體”一詞包括自主複製質體或病毒，也應解釋為包括能加速核酸轉入細胞之非質體與非病毒化合物，例如多離胺酸化合物、微脂體及其類似物。病毒載體的例子包括但不限於腺病毒載體、腺相關病毒載體、反轉錄病毒載體及類似物。
“腺相關病毒(AAV)載體”係取自於血清型腺相關病毒的載體，包括但不限於AAV－1、AAV－2、AAV－3、AAV－4、AAV－5及AAVX7。
AAV載體也包括轉錄序列，如聚腺苷酸化位置(polyadenylation site)，還有選擇性標記或報導基因、促進子序列及其他能誘導轉錄之控制要素。
AAV病毒粒子係指完整的病毒粒子，AAV病毒粒子可為野生型AAV病毒粒子(包括線性單股AAV核酸基因體與AAV外殼結合，也就是蛋白質外鞘)或重組AAV病毒粒子。AAV病毒粒子能裝入單股AAV核酸分子(如一般定義的意股/編碼股或反意股/反編碼股)，意股與反意股均具有相同感染力。
“基因”係指聚核苷酸，包含至少一個開放讀碼區能在轉錄或轉譯後編碼特定多肽或蛋白質，可使用在此所述之任何多核苷酸序列來辨識相關基因的較大片段或全長編碼序列，而分離較大片段序列的方法為一般技藝人士所熟知。
互補去氧核糖核酸庫只包含由細胞內信息核糖核酸分子所合成之互補去氧核糖核酸分子。
引子係指聚核苷酸，能與特定聚核苷酸模板產生專一性雜合並在合成互補聚核苷酸時提供起始點。在引發合成條件下(也就是當核苷酸、互補聚核苷酸模板及聚合化試劑，如DNA聚合酵素存在時)放置聚核苷酸引子會發生此合成。引子一般為單股，但也可能為雙股。引子一般為去氧核糖核酸，但在許多應用中亦可使用多種合成及天然引子。引子係與模板互補並可設計為與模板雜合以作為合成的起始位置，但不必反映模板的確切序列。在此情況下，引子與模板的專一性雜合取決於雜合條件之嚴苛度。可以發色性、放射活性或螢光性分子部分標示引子，並作為可檢測之分子部分。
寡核苷酸一般是指不超過大約50核苷酸的短聚核苷酸，並且當核苷序列係由DNA序列(也就是腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、鳥嘌呤(G)、胞嘧啶(C))所表示時，也包括了RNA序列(也就是A、尿嘧啶(U)、G、C)，其中U取代T。
定序引子是寡核苷酸引子，能與至少部分聚合苷酸互補並能藉由DNA或RNA聚合酵素，如DNA聚合酶所延長，其中以習知方法結合定序引子到聚核苷酸並延長引子產生了與至少部分聚合苷酸互補的寡核苷酸轉錄本。
“報導基因”在此係指可由已知方法檢測表現之基因，例如大腸桿菌的半乳糖酶(lacZ)基因可作為培養基內的報導基因，因為能使用已知方法藉由對培養基添加呈色基質o－硝基苯－β－半乳糖甘脢，檢測lacZ基因的表現(Gerhardt等人，1994，Method for General and Molecular Bacteriology，美國微生物學會，哥倫比亞特區，華盛頓，第574頁)。
“啟動子/調節序列”係指需要表現與啟動子/調節序列連結運作之基因產物的核酸序列。例如，此序列可為核心啟動子序列，又例如，此序列也可包括促進子序列及需要表現基因產物之其他調節要件。啟動子/調節序列能以組織專一性方式表現基因產物。
限制位置係指由限制性核酸內切酶所辨識之部分雙股核酸。當核酸與內切酵素接觸時，如限制性核酸內切酶可在該部分切割核酸的兩股，限制性核酸內切酶便能辨識部分的雙股核酸。
“轉染”是將基因物質，如核酸放入培養細胞內的一種方法。
“感染”根據醫學字典的解釋係以感染生物或包括細菌、寄生蟲、真菌、病毒、朊毒體(prions)及類病毒(viroids)等利用宿主生物加倍繁殖之病源體對宿主生物的有害群聚。根據本發明的一較佳實施例，“感染”一詞為無害的病毒感染，使病毒基因物質能引進適當的宿主細胞，且病毒能透過最外表面的蛋白進行辨識。病毒核酸使用細胞內宿主械具(host machinery)複製病毒核酸、病毒所需酵素及病毒包覆蛋白。
神經損傷一詞是指物理橫切傷、外傷、挫傷、擠壓傷、手術損傷、血管藥理傷害包括出血性或缺氧傷害、神經退化、其他精神疾病或造成神經受損或有害情況之其他因素所造成的急性或慢性神經損傷或有害情況。
多肽是指由胺基酸殘基、相關天然結構變異及其非天然合成同源物透過胜肽鍵連結所組成的聚合物、相關天然結構變異及其非天然合成同源物，合成多肽能使用自動多肽合成機進行合成，在此使用已知記號描繪多肽序列：多汰序列的左手端為胺基，多汰序列的右手端為羧基。
本發明是關於一種改善神經損傷的方法，包括傳遞酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)之編碼基因到一神經損傷區域，接著在該神經損傷區域表現該基因，其中aFGF基因可轉錄成aFGF訊息核糖核酸或更進一步轉譯為aFGF多胜肽。神經損傷區域可為神經器官、神經組織、可轉導載體之神經細胞系統、或神經細胞或其突起所存在位置，包括但不限於神經軸凸路徑。
根據本發明一較佳實施例，aFGF基因具有序列識別碼1之DNA序列。請參照圖1A至1D，載體的建構包括序列識別碼1之aFGF基因，載體可為病毒載體，包括將載體裝入病毒粒子的病毒基因體，病毒基因體可為重組病毒，如重組腺病毒、腺相關病毒、皰疹病毒、痘病毒或反轉錄病毒的基因體。根據本發明，可使用任何病毒載體將aFGF基因併入宿主細胞基因體，而較佳的病毒載體至少包括腺相關病毒基因與腺病毒基因的其中之一。載體建構也包括報導子基因，較佳為細菌lacZ的互補去氧核糖核酸(cDNA)。可使用熟悉該項技術之人士所熟知的方法建構表現載體，包含結合了適當的轉錄/轉譯控制訊號的aFGF編碼序列，這些方法包括Sambrook等人1992年在紐約冷泉港實驗室實驗手冊之分子選殖部分所描述的體外重組DNA技術。
根據本發明的另一較佳實施例，載體可建構為包括具有序列識別碼2之胺基酸序列的aFGF編碼基因，序列識別碼2的aFGF包括序列識別碼2之aFGF多胜肽摺疊成不同型式與蛋白質構型。
根據本發明的又一實施例，載體包括人腦cDNA庫所取得的aFGF cDNA。然而載體建構體不應僅限於此，視所需的神經損傷治療或神經再生種類，建構載體時可使用其他物種的aFGF基因。
此外，載體至少是質體與噬菌體的其中之一，例如AAV質體，如Samulski等人首先揭露的pSub201(Journal of Virology,1987,Vol.61,No.10,pp.3096－3101)，此載體包含所有選殖入質體骨幹的腺相關病毒第二型(AAV－2)野生型編碼區域以及順式調控終端重複區域(cis－acting terminal repeats)，此載體相當適合選殖，因其設計使限制酵素XbaI的限制消化能移除AAV編碼區域而維持質體骨幹內的AAV終端重複區域不受破壞。
載體更包含輔助質體pDG(Grimm等人(1998))具有AAV繁殖所需的AAV基因(rep及cap)以及輔助基因以產生重組AAV，此質體提供放大及包裝AAV載體所需的AAV與腺病毒基因功能。
因此，較佳的AAV粒子包裝是以磷酸鈣質體轉染的方式對細胞共同轉染載有aFGF cDNA的pSub201質體以及包裝AAV的pDG輔助質體，在宿主細胞內包裝成熟病毒粒子，而本實施例的宿主細胞可為HEK293細胞。
有關治療神經損傷的方法，遞送包含aFGF基因之載體至神經損傷部位的其他方式包括以病毒載體感染神經損傷部位，注射載有aFGF基因的病毒粒子至神經損傷部位，以及利用熟悉該項技藝者所熟知的細胞轉染方式，如電穿孔法(electroporation)、顯微鏡下注射法(microinjection)、微脂體轉染試劑、多聚乙烯亞胺(polyethylenimine,PEI)、脂類轉染試劑(effectene)、以及活化樹枝狀高分子(activated－dendrimers)將aFGF基因轉染到神經損傷部位。
另外，改善神經損傷的方法包括以具有aFGF基因的病毒粒子感染神經損傷部位，而使aFGF表現在神經損傷部位。病毒粒子可根據溶原性路徑(lysogenic pathway)感染神經損傷部位，其中在神經損傷部位之細胞基因體的特定位置併入aFGF基因並在複製細胞時複製基因。病毒載體可為含病毒載體包裝成載有aFGF cDNA的病毒粒子，較佳的病毒粒子為pPAM－AAV質體包含人類aFGF及/或細菌lacZ的cDNA。
根據本發明另一實施例，也提供了一種神經再生的方法，包括遞送一載體包括aFGF基因到神經細胞，在神經細胞內表現aFGF基因，接著轉錄並轉譯aFGF基因以便在神經細胞內產生aFGF多胜肽。表現aFGF的神經細胞也可能包括星狀細胞、寡凸細胞、神經膠細胞、脈絡叢細胞、室管膜細胞、腦脊椎神經膜細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)、神經母細胞、微膠細胞、脊椎神經組織內細胞及可以上述載體建構轉型的神經源細胞株，如嗜鉻細胞瘤(pheochromocytoma,PC12)細胞。
根據本發明的一較佳實施例，aFGF基因可為具有序列識別碼1之DNA序列的基因，或具有序列識別碼2之胺基酸序列的aFGF之編碼基因，aFGF基因可與多種不同啟動子/促進子要件結合，其包括但不限於啟動子、促進子、轉錄因子結合位置及其他基因表現調控序列，如延長因子、聚腺苷酸化序列、長終端重複區域、及抗生素抗藥性基因。這些載體之表現要件可具有不同強度與專一性，並且視所使用之宿主/載體系統，可使用多數適當轉錄及轉譯要件的其中之一。啟動子的形式可能是與所需基因自然結合的啟動子。另外，DNA的位置可能受重組或異性啟動子，也就是通常不與此基因聯合之啟動子所控制。啟動子在任何情況下包括有效連結的啟動子，係指啟動子在上述任何實施例啟動序列識別碼1之aFGF基因轉錄的情況。
本發明將由以下之實例做進一步說明，但不應以此限定本發明之範圍。
實例1：建構pPAM－AAV質體包含全長人類aFGFcDNA並產生AAV－aFGF粒子
建構pPAM－AAV質體包含人類aFGF及/或細菌lac Z的cDNA如下，首先選殖並放大人類aFGF cDNA，使用擴充高精確度PCR系統(Roche Diagnostics有限公司，德國Nonnenwald)對由人腦cDNA基因庫(Clontech Laboratories公司，美國，加州，山景市)所取得之人類aFGF cDNA以下列條件，包括在95℃進行30秒、60℃進行60秒、及72℃進行30秒的30個循環之PCR步驟，進行人類aFGF的PCR分析。對於控制載體，則以下列條件，在95℃進行30秒、55℃進行60秒、及72℃進行30秒的30個循環之PCR反應由pDNR－lac Z供體報導子(Clontech Laboratories公司，美國，加州，山景市)放大全長細菌lac Z cDNA的報導基因。aFGF及/或細菌lac Z的引子係取自於生工有限公司(台灣，台北)，其序列所列如下。
人類aFGF的引子：(正向定序引子位置為序列識別碼3的5’－ATGGCTGAAGGGGAAATC－3’；及反向定序引子位置為序列識別碼4的5’－TTAATCAGAAGAGACTGGCAGGGG－3’)細菌lacZ的引子：(正向定序引子位置為序列識別碼5的5’－ATGTCGTTTACTTTACTTTGACCAACAAG－3’；及反向定序引子位置為序列識別碼6的5’－CTTTTTTTGACACCAGACCAACTGG－3’)。
直接將放大的片段選殖到pGEM－T easy TA載體系統(Promega公司，美國，威斯康辛州，麥迪遜市)，以取得如圖1A所示的A2殖株包含人類aFGF之cDNA，接著以限制酵素EcoRI消化A2殖株並溶離，使含有人類aFGF序列的溶離片段與EcoRI－消化pBluescript－SK質體(Stratagene公司，美國，加州，拉荷雅市)連接，結果產生含aFGF序列之pBluescript質體並與兩個可能方向的精確序列查對後，顯示為圖1B的A4殖株。隨後藉由連接A4殖株之較小片段與限制酵素HindIII/XbaI所共同消化之pSub201質體，產生含有人類aFGF cDNA的AAV質體。載有人類aFGF cDNA的AAV質體如圖1C顯示為pPAM－AAV並在隨後的實例簡稱為AAV－aFGF。含有野生型AAV基因體以及重組輔助質體pDG的質體pSub201係由馬許醫生(台北榮民總醫院，整形手術科)(參考資料：The Journal of Trauma,March 2003；54(3)：569－73，“以腺相關病毒載體進入蟹足腫組織的基因療法”)所贈。
藉由磷酸鈣質體轉染法在HEK293細胞(Life Technology公司，美國，紐約州，長島市)包裝成熟病毒粒子。AAV粒子的包裝係如圖1D所示，以載有aFGFcDNA的pPAM－AAV質體以及含有野生型AAV與AAV包裝所需之腺病毒基因的pDG輔助質體共同轉染細胞。在轉染後48小時以棉棒收集細胞，懸浮在Opti－MEN溶液(GibcoInvitrogen公司，美國，加州，卡爾斯巴德)並以高頻聲波分裂細胞，接著對細胞懸浮液與三分之一容量的三氟二氯乙烷(1,1,2－tri－chloro－trifluoroethane)進行兩輪的氯化銫密度梯度離心(cesium chloride density gradient centrifugation)以進一步純化AAV－aFGF粒子。接著進行病毒製備的第一型去氧核糖核酸水解酶(DNase I)處理，以消化未用病毒核子包覆的去氧核糖核酸，並且將含有純化AAV－aFGF粒子的上清液保存在－80℃，藉由Progen生技有限公司(德國，海德堡)所取得的三明治酵素連結免疫吸附檢測法(ELISA)套組預測純化AAV－aFGF粒子的滴定濃度，並同樣根據製備AAV－aFGF粒子的步驟製備AAV－lac Z粒子。
實例2：在培養PC12神經細胞之重組AAV－aFGF的活體外功能性檢測
在含有85%(v/v)RPMI－1640(GibcoInvitrogen公司，美國，加州，卡爾斯巴德)、10%(v/v)熱鈍化馬血清、5%(v/v)胎牛血清(Biochrom有限公司，德國柏林)、2 mM麩醯胺、以及25 mM HEPES緩衝液在pH 7.3具有100 U/ml盤尼西林與100 μg/ml鏈黴素的培養基內培養大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞(美國菌種中心編號：CRL－1721T M )，在具有5%二氧化碳的保濕保溫箱內維護PC12細胞。在分析PC12細胞時，以補充2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基培養PC12細胞。此外，對細胞培養添加100 ng/ml神經生長因子(CytoLab公司，以色列，雷霍沃特)以提供分析PC12細胞之分化及/或增生的正控制組。其他所有材料都是購自於Sigma化學公司(美國，密蘇里州，聖路易市)。
在神經細胞的分化分析，以每孔5x105 細胞的密度再次於6孔培養盤培養細胞。為要測量AAV－aFGF所誘發的神經突外長，以含有控制載體或不同量之AAV－aFGF(每細胞具有200、2000或20000病毒粒子)的無血清RPMI替換培養基。將細胞暴露於AAV－aFGF8小時後，移除含病毒之無血清培養基，再以補充2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基培養細胞24或48小時。以含4%三聚甲醛的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(phosphate buffer saline,PBS)溶液固定細胞後，在顯微鏡(EclipseT100T M ，Nikon公司，日本，東京)下觀察並拍攝神經突外生長的程度。神經突之全長測量係取自於每個條件至少100個細胞、三個重複培養孔及三個獨立實驗，並使用美國國家衛生研究院(National Health Institute,NIH)影像軟體ImageJ所量化，該影像軟體可由NIH網站http：//rsb.info.nih.gov/ij/ 所取得。
請參照圖2A，當細胞以AAV－aFGF粒子處理時，可於PC12細胞發現神經突外生長，顯示AAV－aFGF引起腦神經細胞分化，在滴定濃度增加到200、2000及20000個AAV－aFGF粒子時，會增加神經突外生長的全長(以μm為測量單位)，而當培養期由24小時延長到48小時，也會在特定滴定濃度增加PC12細胞的腦神經細胞分化。
為測量AAV－aFGF的增生效果，在37℃補充2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基以每孔5x103 個細胞的密度於96孔培養盤培養PC12細胞。以含有控制載體或不同量之AAV－aFGF(每細胞具有200、2000或20000病毒粒子)的無血清RPMI替換培養基。將細胞暴露在AAV－aFGF 8小時後，移除含病毒之無血清培養基，再以補充2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基培養24小時。培養24小時後，利用溫的無血清RPMI－1640清洗細胞並在所檢測的孔內添加0.1ml MTT
(3－[4,5－dimethyl－thiazol－2－yl]2,5－diphenyltetraZoli um bromide)(Promega公司，美國，加州，聖路易歐比斯波)工作溶液(5 mg/ml MTT在無血清RPMI－1640)，在37℃培養3小時後，移除工作溶液並對細胞添加MTT溶解緩衝液(20% SDS與50% DMF溶於二次水)反應6小時。使用TecanSunriseT M ELISA閱讀機(Phenix研究產品公司，美國，加州，海沃市)在波長570 nm測量吸光值，並在波長650 nm減除背景值。並且也利用顯微鏡的tryptan blue排除檢測法及具有碘化丙啶染色的流式細胞技術分析aFGF所引起的細胞增生。藉由比較每一組所測量的吸光值與作為100%之控制組所測量的吸光值(在波長570 nm具有在波長650 nm的背景減除)，計算出每一組之細胞增生百分比。
如圖2B所示，當劑量增加到每個細胞200、2000及20000個AAV－aFGF粒子時會增加PC12細胞的增生。例如，在以每個細胞2000或20000個病毒粒子的劑量處理細胞會增加120%的細胞增生，因此AAV－aFGF對PC12細胞的分裂效果係呈劑量依存反應(dose－dependent response)。
實例3：重組AAV－aFGF在活體外表現的定性與定量分析
以無血清RPMI內的重組AAV－aFGF感染PC12細胞8小時，接著在補充2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基內培養細胞24小時以進行免疫細胞化學分析，並分別在培養基內培養24、48及72小時以進行西方點漬分析。
進行免疫細胞化學分析時，在AAV感染24小時後以甲醇/丙酮/PBS(容積比為1：1：8，溶於10mM MES，pH 6.9、0.1mM乙二醇二乙醚二胺四乙酸(EGTA)及氯化鎂溶於1倍PBS)於4℃固定PC12細胞25分鐘，接著以1倍PBS(含0.1%吐溫20)清洗兩次，在室溫以溶於PBS的1%胎牛血清阻隔細胞大約2至3小時。以PBS清洗細胞後，在室溫以抗aFGF多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，聖塔克魯斯市)培養細胞兩個小時，隨後以PBS與水清洗細胞並進一步以溶於PBS之50%與70%乙醇及100%乙醇進行梯度溶劑清洗，接著在顯微鏡下觀察細胞。當細胞以每個細胞2x103 或2x104 個AAV－aFGF粒子處理時會發現細胞因顯性特徵改變，如神經突的形成而產生細胞分化。
在進行序列識別碼2之aFGF蛋白質層次的西方點渍分析時，於每一時間點(AAV感染後24、48及72小時)收集細胞，藉由離心收集細胞並將其溶解於溶解緩衝液(1% NP－40含30mM焦磷酸鈉(Na4 P2 O7 )、30mM氟化鈉(NaF)、1mM釩酸鈉(Na3 VO4 )及1倍的蛋白酶抑制劑綜合錠(Roche Diagnostics有限公司，德國，Nonnenwald))。隨後藉由十二烷基磺酸鈉－聚丙烯醯胺膠電泳(SDS－PAGE)分離10μg的樣本並使用抗aFGF多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，聖塔克魯斯市)分析序列識別碼2的aFGF表現層次，進行SDS－PAGE及免疫點漬的方法是根據Conway等人(Conway et al.,1999,Biochemical Journal 337：171－177)所述的方法。請參照圖3A，由於以每個細胞20000個AAV－aFGF粒子的劑量感染PC12細胞超過72小時比以較低劑量並較短時間感染的細胞具有較高的表現層次，以絕對光密度所測量的分析序列識別碼2之aFGF蛋白質層次是以時間與劑量依存方式增加。
進行進一步分析以判斷序列識別碼2之aFGF是否能分泌到胞外環境(extracellular environment)。以無血清RPMI培養基內之AAV－aFGF(1μl)感染PC12細胞8小時後，在含有2%馬血清與1%胎牛血清的RPMI培養基內培養細胞24小時。在培養24小時後，移除含血清培養基並另以無血清RPMI培養基培養細胞3小時，接著收集以AAV感染之PC12細胞所產生的無血清條件培養基。此外，在條件培養基內注射1 ng的重組人類aFGF蛋白以提供正控制組。使用透析膜管(3號：3.5kDa的截斷大小，Spectrum Microgon公司，美國，加州，拉古納崗)透析條件培養基，並以冷凍乾燥機(Labconco公司，美國，密蘇里州，堪薩斯市)進行冷凍乾燥及濃縮，接著對完全冷凍乾燥樣本進行上述SDS－PAGE分離及西方點漬分析。
請參照圖3B，以1μl AAV－aFGF感染的細胞在條件培養液顯示很少或沒有增加aFGF的表現，表示序列識別碼2之aFGF沒有從細胞溶質分泌或釋放到胞外區域。
實例4：Sprague－Dawley(SD)大鼠的脊椎神經挫傷及使用重組AAV－aFGF轉導活體內人類aFGF基因進入非受傷或受傷成鼠的脊椎神經
由台灣國科會動物中心取得SD大鼠，在此實驗選取重量為240至280克的SD母鼠引發脊椎神經受損(Spinal Cord Injury,SCI)，動物處理與實驗步驟係由榮民總醫院動物研究次委員會所仔細審核與通過，麻醉SD母鼠並在脊椎神經的T9－10層進行椎弓切除減壓手術(laminectomy)，在椎弓切除減壓手術後使用紐約大學(New York University,NYU)重量墜落元件，如NYU衝擊式損傷機，從25至50 mm的高度墜落10公克的棒子以引發脊椎神經受損，使挫傷組的脊椎神經背面受損。沒有脊椎神經受損的SD鼠作為模擬組，與挫傷組及沒有進行任何前處理與椎弓切除減壓手術的正常組形成對照，同時在脊椎神經受損的7、14、21及28天後，以移動評比等級(locomotor rating scale)對受損程度進行定量測量。
此外，在椎弓切除減壓手術後於模擬＋AAV－aFGF組之SD鼠脊椎神經的T8與T10段注射AAV－aFGF，挫傷＋AAV－aFGF組之SD鼠在脊椎神經受損5分鐘後於神經受損中心點前後大約1至2 mm處注射AAV－aFGF。為要給予AAV－aFGF，先將大鼠放在立體定位籠(stereotaxic frame)，再透過裝有標準規格33之斜口針頭的5 μl注射器(Hamilton syringe)以每分鐘0.5 μl的注射速率，以兩分鐘注射1μl重組AAV－aFGF至脊椎神經的目標位置。注射後一分鐘向後退回針頭0.5 mm，並多維持一分鐘後，再由脊椎神經抽離。
為要在脊椎神經找出人類aFGF轉植基因的表現，解剖大鼠的脊椎神經後固定及冷凍保存，並在七天後使用冷凍切片機製作連續橫向切片以進行免疫組織分析。在手術後七天以正常生理食鹽水及溶於PBS的4%仲甲醛(paraformaldehyde)灌注模擬組的大鼠，接著移除脊椎神經並以溶於PBS的4%仲甲醛固定兩小時。在0.8M蔗糖溶液內儲存脊椎神經兩週後，於－20℃使用冷凍切片機水平切割脊椎神經成厚度10 μm的切片。在AAV感染14天後，以抗aFGF單株或多株抗體(Santa Cruz生技公司，美國，加州，聖塔克魯斯市，R&D SyStems公司，美國，明尼蘇達州，明尼亞波里斯)來對脊椎神經切片的aFGF免疫反應進行染色並拍攝。請參照圖4，在脊椎神經的腹角區(ventral horn area)發現了具有aFGF的神經細胞。
為要分析在AAV－aFGF刺激後aFGF的表現層次，即刻移除脊椎神經組織、解剖成切片或區域並在手術後冷凍3及7天。對使用高純度RNA萃取分離套組(Roche Diagnostics有限公司，德國，Nonnenwald)，從有或沒有AAV感染之脊椎神經T9段所分離的total RNA(5 μg)進行反轉錄PCR分析，使用SuperScript單一步驟RT－PCR系統(Invitrogen公司)進行反應(RT步驟：55℃進行30分鐘；30個循環的PCR步驟：95℃進行30秒、60℃進行55秒及72℃進行30秒)以判斷人類aFGF的mRNA層次。人類aFGF的引子：(正向引子為序列識別碼7的5’－CGAATTCACTAGTGATTATGG－3’及反向引子為序列識別碼8的5’－CTGCAGGAATTCGATTTTAATC－3’)。
大鼠肌動蛋白的引子：(正向引子為序列識別碼9的5’－AAGATCCTGACCGAGCGTGG－3’及反向引子為序列識別碼10的5’－AGCGATGCCTGG－GTACATGG－3’)。
在PCR反應後，由0.5%瓊酯凝膠分離cDNA產物並以50 μM溴化乙錠溶液進行染色，染色的膠體配合Foto/UV－26系統(Fotodyne公司，美國，威斯康辛州，哈特蘭)並使用Polaroid膠體照相機T M ，以黑白即時包軟片(Polaroid公司，英國，赫特福德郡)拍攝，使用NIH發行的軟體ImageJ進行RT－PCR產物層次的定量。
請參照圖5A，在脊椎神經組織所表現的mRNA層次係以計量依存方式所增加。然而，當重組AAV－aFGF的計量增加到1 μ1時，發現表現層次顯著的增加。
在AAV－感染後的每一時間點(24、48及72小時)收集細胞，以西方點漬分析法分析胞內aFGF的蛋白質層次。由脊椎神經收集的細胞質蛋白不需進行進一步蛋白質纯化步驟。將細胞離心並溶於溶解緩衝液(1% NP－40含30mM焦磷酸鈉(Na4 P2 O7 )、30mM氟化鈉(NaF)、1mM釩酸鈉(Na3 VO4 )及1倍的蛋白酶抑制劑綜合錠(Roche Diagnostics有限公司，Nonnenwald，德國))，使用Bio－RadDC套組(Bio－Rad Laboratories公司，美國，加州，Hercules)檢測組織樣本的蛋白質濃度。由脊椎神經組織T9段所取得的30 μg蛋白質以SDS－PAGE分離，並分別以抗aFGF抗體及抗肌動蛋白抗體在西方點漬分析法分析aFGF及肌動蛋白的表現層次。如圖5B所示，感染AAV－aFGF的脊椎神經較沒有感染的脊椎神經稍微表現更高的序列識別碼2之aFGF蛋白。此外，使用50 μg的組織蛋白樣本，利用aFGF ELISA Quantikine套組(R&D Systems公司，美國，明尼蘇達州，明尼亞波里斯)分析準確的蛋白質層次，在每一組50 μg的蛋白樣本內計算序列識別碼2之aFGF的層次(pg/ml)，並如以下表1所示。
如表1所列，不論處理期間為3天或14天，接受AAV感染的模擬組通常較沒有AAV感染的模擬組顯示更高的aFGF表現，接受AAV感染的挫傷組則比沒有AAV感染的挫傷組顯示更顯著的aFGF表現增加。
此外，對這些活體內組織樣本進行進一步的蛋白質纯化。將每一樣本直接通過Ultrafree－0.5離心過濾器(Millipore公司，美國，麻州，比勒瑞卡)並收集殘留上清液，以具有連結緩衝液(10 mM磷酸鈉緩衝液，pH 7.0)的肝磷素親合性管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美國，紐澤西州，Piscataway)分離上清液並以梯度連結緩衝液(包括梯度濃度為0.15M、0.5M、0.8至1.5M的氯化鈉溶於pH 7.0,10 mM磷酸鈉緩衝液)洗脫，洗脫的蛋白質溶液再通過SephadexG25旋轉管柱(Amersham Pharmacia生技公司，美國，紐澤西州，Piscataway)去鹽，並以冷凍乾燥機(Labconco公司，美國，密蘇里州，堪薩斯市)進行冷凍乾燥並濃縮。以SDS－PAGE分離總冷凍乾燥樣本，並分別以抗aFGF抗體及抗肌動蛋白抗體在西方點漬分析法分析序列識別碼2之aFGF的表現層次。
請參照圖5C，感染AAV－aFGF的脊椎神經比沒有以任何AAV－aFGF感染的脊椎神經顯示較高的序列識別碼2之aFGF蛋白表現，以1 μl的AAV－aFGF感染脊椎神經將顯著增加蛋白質表現。
實例6：行為評估
所有動物在手術後1至6週的期間每週接受兩個行為測試，拍攝所有行為測試，且參與行為評估的兩位檢測人員並不清楚那些為經處理之動物。以Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)開放田間移動測試(Basso等人(1995)Journal of Neurotrauma 12：1－21)及綜合行為分數(CBS)評估大鼠的後肢移動行為。
首先，在開放田間(至少150 cm×100 cm)進行大鼠的BBB分析，脊椎神經挫傷的大鼠分別有8隻為控制載體處理組(SCI)、12隻為AAV－aFGF處理組(SCI＋AAV－aFGF)及3隻為AAV－lacZ處理組(SCI＋AAV－lacZ)，每一段時間持續5分鐘。藉由觀察並對涉及臀部動作、膝蓋動作、關節動作以及軀幹與尾巴或後肢之間位置的行為計分以決定開放田間移動分數，另外也決定踏步、腳趾分開、腳掌放置、重量支撐及協調性的詳細預測，分數範圍包括由0到21(0為沒動作，21為正常動作)。請參照圖6A，SCI－AAV－aFGF組顯示顯著的分數增加，表示接受脊椎神經內注射AAV－aFGF之挫傷大鼠比沒有注射AAV－aFGF或注射AAV－lacZ之挫傷大鼠的復原狀況更好。相較於SCI組或SCI＋AAV－lacZ組，SCI－AAV－aFGF組在第四週至第六週的分數增加最為顯著。
接著，CBS分析為綜合了Tarlov計分系統測試、評估單一及複雜反射動作，還有自發與引發運動型態之傾斜面測試的綜合測試，此多重測量包含運動功能、甲趾分開、歸正動作、退縮反應、放置、傾斜面及游泳測試，將記錄的行為層次分級並計分。失去多數活動力的大鼠為100分，最明顯具有活動力改善的大鼠為少於100分並接近0分。如圖6B所示，以AAV－aFGF處理之挫傷大鼠的CBS分數隨著時間降低，處以AAV－aFGF的挫傷大鼠比那些接受AAV－lacZ或控制載體之SCI大鼠的CBS分數較低，因此接受AAV－aFGF處理之挫傷大鼠的活動力具有最顯著的改善。
由以上之描述得知，熟知此技術之人士可輕易瞭解本發明中之必要特徵，且在不悖離其精神及範圍下，可做各種改變及修改以使本發明適用於各種用途及情況。
前述內容及以下的發明詳細說明，當連同所附的圖式被閱讀時，將更佳地被瞭解。為了說明本發明之目的，在圖式中有顯示目前為較佳的具體實施例。然而，應瞭解的是，本發明不限於所顯示之確切排列及方法。
在圖式中：圖1A為一載體圖，繪示了A2殖株載體承載序列識別碼1之人類aFGF基因；圖1B為一載體圖，繪示了A4殖株載體承載序列識別碼1之人類aFGF基因以及rep基因；圖1C為一載體圖，繪示了腺相關病毒(AAV)噬菌體雜合噬質體載體承載序列識別碼1之人類aFGF基因、延長因子、聚腺苷酸化及土撥鼠肝炎病毒後轉錄調節要件(woodchuck hepatitis virus posttranscriptional regulatory element)序列；圖1D為一載體圖，繪示了AAV噬菌體輔助載體承載rep－2與cap－2基因；圖2A為一條狀圖，呈現PC12細胞在AAV－aFGF之不同滴定濃度的腦神經分化。
圖2B為一條狀圖，呈現PC12細胞在AAV－aFGF之不同滴定濃度的細胞增生。
圖3A與3B為條狀圖，呈現活體外AAV－aFGF表現的定量分析，其中圖3A顯示西方點漬分析在PC12細胞所分析的aFGF表現量，圖3B顯示西方點漬分析在胞外區域所分析的aFGF表現量。
圖4為一顯微影像，顯示穩定轉染細胞在大鼠脊椎神經的腹角區域表現aFGF；圖5A－5C為條狀圖，呈現活體內AAV－aFGF表現之定量西方點漬分析，其中圖5A顯示在AAV－aFGF之不同滴定濃度時，aFGF mRNA在脊椎組織的絕對表現量，圖5B顯示在AAV－aFGF之不同滴定濃度時，aFGF在脊椎組織的校準表現量，及圖5C顯示在AAV－aFGF之不同滴定濃度時，纯化aFGF在脊椎組織的校準表現量；以及圖6A與6B為條狀圖，呈現aFGF基因轉導對行為評估的影響。

Claims (14)

  1. 一種治療神經損傷的載體構築體，其係為一腺相關病毒載體承載酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)的編碼基因。
  2. 如專利申請範圍第1項所述的載體構築體，其中該基因具有序列識別碼1之去氧核糖核酸序列。
  3. 如專利申請範圍第1項所述的載體構築體，其中該基因係aFGF的編碼基因具有序列識別碼2之胺基酸序列。
  4. 如專利申請範圍第1項所述的載體構築體，其中以該病毒載體感染一神經損傷部位，使該基因傳遞到該神經損傷部位並在該神經損傷部位表現該基因。
  5. 如專利申請範圍第4項所述的載體構築體，其中該神經損傷部位至少包括神經器官、神經組織、可以載體轉導的神經細胞系統及神 經細胞或其突起所在位置的其中之一。
  6. 如專利申請範圍第1項所述的載體構築體，其中更包括一報導基因。
  7. 如專利申請範圍第6項所述的載體構築體，其中該報導基因係細菌半乳糖酶的互補去氧核糖核酸。
  8. 一種再生神經細胞的載體構築體，其係為一腺相關病毒載體承載酸性纖維母細胞生長因子(aFGF)的編碼基因。
  9. 如專利申請範圍第8項所述的載體構築體，其中該基因具有序列識別碼1之去氧核糖核酸序列。
  10. 如專利申請範圍第8項所述的載體構築體，其中該基因具有序列識別碼2之胺基酸序列。
  11. 如專利申請範圍第8項所述的載體構築體，其中以該病毒載體感染該神經細胞，使該基因傳遞到該神經細胞並在該神經細胞內表現該基因。
  12. 如專利申請範圍第11項所述的載體構築體，其中該神經細胞至少包括星狀細胞、寡凸細胞、神經膠細胞、脈絡叢細胞、室管膜細胞、腦脊椎神經膜細胞、許旺氏細胞(Schwann cell)、神經母細胞、微膠細胞、脊椎神經組織內細胞及以該基因轉型的神經源細胞株的其中之一。
  13. 如專利申請範圍第8項所述的載體構築體，其中更包括一報導基因。
  14. 如專利申請範圍第13項所述的載體構築體，其中該報導基因係細菌半乳糖酶之互補去氧核糖核酸。
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