JP2005040005A

JP2005040005A - 組換えｄｎａ及びその用途

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Publication number: JP2005040005A
Application number: JP2003199628A
Authority: JP
Inventors: Ikuo Toyama; 育夫遠山; Katsunori Oshima; 桂典大島; Katsuya Egawa; 克哉江川
Original assignee: Toray Industries Inc
Current assignee: Toray Industries Inc
Priority date: 2003-07-22
Filing date: 2003-07-22
Publication date: 2005-02-17

Abstract

【課題】核内作用ペプチド遺伝子を細胞質で発現したペプチドを細胞核内に移行させてそこで機能発現させる手段を提供すること及びＡＬＳのような運動ニューロン疾患の治療手段を提供すること。
【解決手段】細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結してなり、細胞核内へ前記ペプチドを移行可能な組換えＤＮＡ及び細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結してなり、生体内で発現した前記ペプチドを細胞核内に移行可能な組換えＤＮＡであって、前記ペプチドが神経栄養因子である組換えＤＮＡを有効成分として含有する運動ニューロン疾患治療剤を提供した。
【選択図】なし

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、細胞核内で所望のペプチドを発現させるための組換えＤＮＡ及びそれを利用した、筋萎縮性側索硬化症（以下、「ＡＳＬ」と言うことがある）などの運動ニューロン疾患の治療剤に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ＡＬＳをはじめとする運動ニューロン疾患は運動ニューロンが徐々に変性していくために全身の筋肉の萎縮と筋力の低下を引き起こす原因不明の神経難病である。ＡＬＳ患者は、徐々に筋力が衰え、歩行不能、嚥下困難、発語不能となり、呼吸筋の障害により人工呼吸器を必要とするに至る。この間、感覚機能や知的機能は正常に保たれることから、極めて悲惨な病気であり、治療用材料や治療法の開発が強く望まれている。
【０００３】
ＡＬＳの原因は不明であるものの、ＡＬＳの本質は、脊髄から脳幹部にかけて分布する運動ニューロンが徐々に死んでいくことにある（非特許文献２）。本来、運動ニューロンを含むニューロンは、生後は分裂せずにほぼ一生にわたって長期生存すると一般に考えられている。これには生存を維持する神経栄養因子が重要な役割を果たしていると考えられており（非特許文献３）、ＡＬＳ患者の運動ニューロンの生存を助ける目的で、各種の神経栄養因子や神経栄養因子効果を持つペプチドおよび／もしくはタンパク質（例えば、神経成長因子ＮＧＦ（ＮｅｒｖｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ）、脳由来神経栄養因子ＢＤＮＦ（ＢｒａｉｎＤｅｒｉｖｅｄＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ）、毛様体神経栄養因子ＣＮＴＦ（ＣｉｌｉａｒｙＮｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ）、グリア由来神経栄養因子ＧＤＮＦ（ＧｌｉａｌＤｅｒｉｖｅｄＮｅｕｔｒｏｐｈｉｃＦａｃｔｏｒ）、エリスロポエチン、トロンポエチンなど）を利用しようとする試みが為されている（非特許文献４，５）。すなわち、これらのペプチドやタンパク質を中枢神経系や脳脊髄液中に投与することが試みられているが、所期の効果は得られていない。効果が認められない原因の一つは、中枢神経系の神経細胞（ニューロン）が均一ではないことがあるのではないかと推測される。すなわち、特定のニューロンは特定の神経栄養因子に対する受容体をもち、特定の神経栄養因子にのみ反応する（非特許文献２）。従って、ＡＬＳの運動ニューロンの細胞死を防ぐには、ヒトの運動ニューロンが生存維持に利用している神経栄養因子ないしその誘導体を使用することが、有効ではないかと期待される。本発明者らは、正常のヒト運動ニューロンの生存を維持している神経栄養因子を見いだすべく鋭意努力し、ヒト運動ニューロンが、神経栄養因子のひとつである酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ；ＦＧＦ−１）を産生していることを見いだした（非特許文献６）。ＡＬＳ患者では、ａＦＧＦの産生が有意に減少している（非特許文献６）。また、ａＦＧＦをもっとも豊富に産生する運動ニューロンは動眼神経系の運動ニューロンであり、この運動ニューロンはＡＬＳで最も障害を受けにくい運動ニューロンとしても知られている。
【０００４】
ａＦＧＦ（ＦＧＦ−１）はこれまでにも中枢神経系に豊富に存在する神経栄養因子・グリア増殖因子として知られていた（非特許文献７）。ａＦＧＦの特徴は、分泌シグナルを持たず分子のＮ端に核移行シグナルを有することである。こうした構造から、ａＦＧＦは細胞内（基本的には細胞質内）で産生された後、核膜に存在するａＦＧＦ受容体を介したりして核内に侵入して効果を発揮していると考えられる（非特許文献７）。
【０００５】
このように、神経栄養因子たるａＦＧＦは細胞外に分泌されずに主として細胞核内に入って核膜に存在する受容体に作用したり、細胞質から核内に入って、栄養因子としての作用を発揮することが知られている（非特許文献８）。また転写制御因子は、細胞の核内に入って転写制御を行う。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】
本発明者らはａＦＧＦを補うことにより、ＡＬＳにおける運動ニューロン死を防止し、ＡＬＳの治療を行うことが可能であるかもしれないと考えた。しかし、核内で作用するこうした物質は、細胞外から投与しても無効なことが多い。そこで、細胞質でａＦＧＦ遺伝子から発現したａＦＧＦを核内に移行させる遺伝子治療によってＡＬＳの治療が可能であるかもしれないと考えた。しかしながら、遺伝子治療は、培養細胞や末梢の組織では一般的に行われているが、運動ニューロンのような中枢神経系内の特定の神経細胞の核内にａＦＧＦのような核内作用ペプチドを送り込む方法は未だ開発されていない。
【０００７】
従って、本発明の目的は、核内作用ペプチド遺伝子を細胞質で発現したペプチドを細胞核内に移行させてそこで機能発現させる手段を提供することである。また、本発明の目的は、ＡＬＳのような運動ニューロン疾患の治療手段を提供することである。
【０００８】
【非特許文献１】Ｍｅｒｒｉｔｔ’ｓＴｅｘｔｂｏｏｋｏｆＮｅｕｒｏｌｏｇｙ，ｅｄｉｔｅｄｂｙＬｅｗｉｓＰ．ＲｏｗｌａｎｄＮｉｎｅｔｈＥｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ＷｉｌｋｉｎｓＰｕｂｌｉｓｈｅｒ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９９５．
【非特許文献２】日下博文運動ニューロン疾患Ｉｎ：神経内科学テキスト（江藤文夫、飯島節編集）ｐ．１７０−１８２，２０００年南江堂
【非特許文献３】古川美子、古川昭栄神経細胞死を防ぐ生存栄養因子Ｄｅｍｅｎｔｉａ９：３５１−３５９，１９９５．
【非特許文献４】ＤＷＣｌｅａｖｅｌａｎｄ，ＪＤＲｏｔｈｓｔｅｉｎ：ＦｒｏｍＣｈａｒｃｏｔｔｏＬｏｕＧｅｈｒｉｃ：ＤｅｃｉｆｅｒｉｎｇｓｅｌｅｃｔｉｖｅｍｏｔｏｒｎｅｕｒｏｎｄｅａｔｈｉｎＡＬＳ．ＮａｔｕｒｅＲｅｖｉｅｗＮｅｕｒｏｓｓｉｃｅｎｃｅ２：８０６−９１９，２００１．
【非特許文献５】ＭＤｉｂ：Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃｌａｔｅｒａｌｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：ｐｒｏｇｒｅｓｓａｎｄｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅｆｏｒｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ．Ｄｒｕｇｓ６３：２８９−３１０，２００３．
【非特許文献６】Ｋａｇｅｅｔａｌ．，Ａｃｉｄｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＦＧＦ−１）ｉｎｔｈｅａｎｔｅｒｉｏｒｈｏｒｎｃｅｌｌｓｏｆＡＬＳａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｃａｓｅｓ．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ１２：３７９９−３８０３，２００１）
【非特許文献７】Ｂａｉｒｄ，Ａ．ａｎｄＢｏｈｌｅｎ，Ｐ．（１９９０）Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓ．Ｉｎ：ＳｐｏｒｎＭＢ，ＲｏｂｅｒｔｓＡＢ（ｅｄ）ＰｅｐｔｉｄｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓａｎｄｔｈｅｉｒｒｅｃｅｐｔｏｒｓＩ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，ｐｐ３６９−４１８
【非特許文献８】ＳｚｅｂｅｎｙｉＧ，ＦａｌｌｏｎＪＦ．Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｓａｓｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｉｇｎａｌｉｎｇｆａｃｔｏｒｓ．ＩｎｔＲｅｖＣｙｔｏｌ．；１８５：４５−１０６，１９９９．
【非特許文献９】ＴＩｍａｍｕｒａ，ＫＥｎｇｌｅｋａ，ＸＺｈａｎｅｔａｌ．：Ｒｅｃｏｖｅｒｙｏｆｍｉｔｏｇｅｎｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｏｆａｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒｍｕｔａｎｔｗｉｔｈａｎｕｃｌｅａｒｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５６７− １５７０，１９９０．
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、鋭意研究の結果、核内作用ペプチド遺伝子をアデノウイルスベクターに組み込んで投与することにより、細胞質内で発現したペプチドを細胞核内に移行させることが可能であることを見出し、本発明を完成した。
【００１０】
すなわち、本発明は、細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結してなり、細胞質内でＤＮＡからＲＮＡへの転写、ＲＮＡからの翻訳により発現した前記ペプチドを細胞核内に移行可能な組換えＤＮＡを提供する。
【００１１】
また、本発明者らは、上記本発明の組換えＤＮＡにおいて、細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとして、ａＦＧＦのような神経栄養因子をコードするＤＮＡを組み込み、これを投与することにより、ＡＬＳのような運動ニューロン疾患を治療できることに想到し、かつ、これを実験的に確認し、本発明を完成した。
【００１２】
すなわち、本発明は、細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結してなり、生体内で発現した前記ペプチドを細胞核内に移行可能な組換えＤＮＡであって、前記ペプチドが神経栄養因子である組換えＤＮＡを有効成分として含有する運動ニューロン疾患治療剤を提供する。
【００１３】
【発明の実施の形態】
本明細書において、「ペプチド」とは、複数のアミノ酸がペプチド結合により結合したものを意味し、オリゴペプチド及びポリペプチドが包含され、ポリペプチドにはタンパク質が包含される。
【００１４】
「細胞核内で作用するペプチド」は、多くの場合に主たる構成成分が核内に存在するペプチドのことであり、細胞質内での存在傾向が少ないもののことである。「細胞核内で作用するペプチド」としては神経栄養因子が好ましく、神経成長因子（Ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ））、脳由来神経栄養因子（Ｂｒａｉｎｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＢＤＮＦ））、ＮＴ−３あるいはＮＴ−４などを含むいわゆるニューロトロフィン（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ）やＦＧＦ−１（ａＦＧＦ）、ＦＧＦ−２（ｂＦＧＦ）、ＦＧＦ−３など多くのＦＧＦファミリー（各種線（繊）維芽細胞成長因子類）、毛様体神経栄養因子（Ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ））、グリア細胞由来神経栄養因子（Ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒ（ＧＤＮＦ））、血小板由来増殖因子（Ｐｌａｔｅｌｅｔｄｅｒｉｖｅｄｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ（ＰＤＧＦ））などのことであるが、これらのうち酸性線（繊）維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ−１（ａＦＧＦ））が特に有効である。なお、２種以上のペプチドを組み込むことも可能である。
【００１５】
これらの神経栄養因子のアミノ酸配列及びそれらをコードする遺伝子の塩基配列はいずれも公知である。したがって、これらの公知の配列を有するＤＮＡをアデノウイルスベクターに組み込むことができる。
【００１６】
なお、一般に、生理活性を有するペプチドでは、該ペプチドのアミノ酸配列において少数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加された場合であっても、その生理活性が維持される場合があることは当業者によって認められているところである。従って、天然の神経栄養因子のアミノ酸配列において、少数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加されたペプチドあって、その生理活性を維持するものは、天然の神経栄養因子と同様に利用することができ、本明細書において、これらのものも「神経栄養因子」という語に含めて解釈する。ここで、「少数」とは、１個ないし数個であることが好ましく、又は天然の神経栄養因子のアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するものが好ましい。なお、アミノ酸配列の相同性は、ＦＡＳＴＡのような周知のコンピューターソフトを用いて容易に算出することができ、このようなソフトはインターネットによっても利用に供されている。
【００１７】
特に好ましい神経栄養因子であるヒトａＦＧＦのアミノ酸配列を配列番号１に示す。上記の通り、配列番号１で示されるアミノ酸配列のうち、少数のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加されたペプチドあって、ａＦＧＦの生理活性を有するもの、好ましくは、配列番号１に示すアミノ酸配列のうち１個ないし数個のアミノ酸が置換し、欠失し、挿入され又は付加されたペプチドあって、ａＦＧＦの生理活性を有するもの、及び配列番号１に示すアミノ酸配列と９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するペプチドであって、ａＦＧＦの生理活性を有するものも本明細書における「ヒト酸性線維芽細胞成長因子」に包含される。
【００１８】
本発明に用いられるアデノウイルスベクターは、アデノウィルスを利用した遺伝子導入用ベクターであって、遺伝子機能の評価や遺伝子治療用の検討に一般に用いられているものでよい。アデノウイルスベクターは、アデノウイルスの増殖に必要なＥ１領域を欠損させ、感染はしても増殖できなくしたアデノウイルスを基本としている。このウイルスベクターは恒常的にＥ１タンパクを発現している２９３細胞（ヒトの胎児の腎臓由来の細胞株）でのみ増殖可能である。アデノウイルスベクターに所望の遺伝子を組み込んで組換えＤＮＡを作成するためのキットは市販されているので（例えばタカラバイオ株式会社製ＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＶｅｃｔｏｒＫｉｔ及びＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓＣｒｅ／ｌｏｘＰＫｉｔ）、このような市販の組換えアデノウイルス作製キットを用いることもできる。
【００１９】
アデノウイルスベクターに組み込む上記ペプチドをコードする遺伝子の上流又は内部には、核移行シグナルをコードするＤＮＡ領域が存在することが好ましい。核移行シグナルとはＮｕｃｌｅａｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎｓｉｇｎａｌ（ＮＬＳ）と通称されているオリゴペプチドであって、アミノ酸配列としては、ＡｓｎＴｙｒＬｙｓＬｙｓＰｒｏＬｙｓＬｅｕ（各アミノ酸３文字略号）が特に有効であるが、リジン（Ｌｙｓ）、ヒスチジン（ＨＩＳ）、アルギニンン（Ａｒｇ）で代表される塩基性アミノ酸を多く含むものが有効である。
【００２０】
アデノウイルスベクターに組み込む上記ペプチドをコードする遺伝子の上流もしくは下流には、転写（制御）因子をコードする領域が存在してもよい。転写因子ないしは転写制御因子とは、基本的にはいわゆるＲＮＡポリメラーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩの作用を助けてＤＮＡから正しいＲＮＡを形成（転写）作用を有するものであって、種々のものが多様的に作用するが、たとえば、Ｓｔａｔ１、Ｓｔａｔ２、Ｐ５３、ｃｙｃｌｉｎ、ＳＬＩ，ＵＢＦ，ＴＦＩＩＡ，ＩＩＢ，ＩＩＤ，ＩＩＥ，ＩＩＦ，ＩＩＨ，ＩＩＪ，ＩＩＫ，ＴＦＩＩＩＡ，ＩＩＩＢ，ＩＩＩＣ等が挙げられる。これらはいずれも公知であり、そのアミノ酸配列及び遺伝子の塩基配列も公知である。
【００２１】
上記した本発明の組換えＤＮＡにおいて、細胞核内作用ペプチドとして神経栄養因子を用いたものは、運動ニューロン疾患治療剤として用いることができる。好ましい態様では、上記の通り、細胞核内作用ペプチドがａＦＧＦであり、これはＡＬＳの治療に用いることができる。投与経路は、筋肉内注射のような非経口投与が好ましく、例えば、生理リン酸緩衝液等の緩衝液中に上記アデノウイルスベクターを溶解したものを注射剤として好ましく用いることができる。
【００２２】
投与の部位は、運動ニューロン疾患で冒される骨格筋であることがよい。また、投与量は、疾患の種類及び症状に基づいて適宜設定されるが、通常、成人１回当たりベクターのプラーク形成単位（ｐｆｕ）として１０^７〜１０^１１ｐｆｕ程度が適当であり、好ましくは１ｘ１０^９〜５ｘ１０^９ｐｆｕ程度である。また、投与の頻度は、理論的にはひとつの運動ニューロンが支配する領域に１回でよいが、効果をみながら１ヶ月〜１年に１回程度でよい。
【００２３】
【実施例】
実施例１
ａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターの作製
ヒトａＦＧＦのｃＤＮＡは、インフォームドコンセントを得ている患者さんのヒト剖検脳から、本発明者の一人がクローニングしたものを用いた。クローニングは、具体的には次のようにして行った。
【００２４】
ヒト中脳をＴｒｉｚｏｌ試薬（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）でホモジネートした後、クロロホルムを加え、遠心分離機（１２０００ｇ，１５分）で水相とクロロホルム相に分離した。水相を回収し、エエタノールを加えて、総ＲＮＡを沈殿させた。回収した沈殿をＲＮａｓｅｆｒｅｅ，ＤＮａｓｅｆｒｅｅの滅菌水で５００ｎｇ／ｍｌの濃度に溶解した。ついで、５ μｇのＲＮＡをｏｌｉｇｏｄＴ１２−１８（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、ｄＮＴＰｓ（ＬｉｅｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ；ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の入ったバッファー中で反応させて、ｃＤＮＡを作製した。
【００２５】
このｃＤＮＡを鋳型とし、ヒトａＦＧＦの全コード領域を増幅可能なプライマー（Ｕｐｐｅｒｐｒｉｍｅｒ；ａｔｇｇｃｔｇａａｇｇｇｇａａａｔｃａｃｃａｃｃ，Ｌｏｗｅｒｐｒｉｍｅｒ；ｔｔａａｔｃａｇａａｇａｇａｃｔｇｇｃａｇｇｇｇ）とＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（パーキンエルマー社）を用いて、ＰＣＲ装置（ＰＥ２０００；パーキンエルマー社）で３２回のＰＣＲ反応を行い、ヒトａＦＧＦ遺伝子を増幅させた。増幅したａＦＧＦ遺伝子は、ＴＡクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてｐＣＲ２．１ｖｅｃｔｏｒにクローニングされた。
【００２６】
なお、クローニングしたｃＤＮＡの塩基配列及びそれがコードするアミノ酸配列を配列表の配列番号２に示す。配列番号１にはそのアミノ酸配列を取り出して示す。配列番号１に示すアミノ酸配列中、第２２番目〜第２８番目の領域が核移行ペプチドである。
【００２７】
アデノウイルスベクターの作製方法はすでに公知であり、教科書（羊土社、島田隆、斉藤泉、小澤敬也編、バイオマニュアルＵＰシリーズ、遺伝子治療の基礎技術）に載っている方法で行った。すなわち、Ｅ１領域を欠損させたアデノウイルスベクターとヒトａＦＧＦのｃＤＮＡを入れた発現カセットを組み込んだプラスミドを同時に２９３細胞に投与した。投与には、Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ（キアゲン社）を用いた。これらの操作は具体的には次のようにして行った。広く使われている第一世代のアデノウイルスベクターに属し、滋賀医科大学内科学講座所有のアデノウイルスベクターＪＭ１７−ｂａｓｅｄｖｅｃｔｏｒからなるＡｄ５プラスミドとシャトルベクタープラスミドｐＡＣＣＭＶ．ＰＬＰＡＳＲ（＋）を用いた。ヒトａＦＧＦ遺伝子の５’端にＸｂａ１ｓｉｔｅを３’端にＨｉｎｄＩＩＩｓｉｔｅを挿入し、制限酵素Ｘｂａ１とＨｉｎｄＩＩＩを用いて、シャトルベクタープラスミドのマルチプルクローニングサイトにａＦＧＦ遺伝子を挿入した。Ａｄ５プラスミドとａＦＧＦ遺伝子を入れたシャトルベクタープラスミドを各５μｇをＳｕｐｅｒｆｅｃｔ試薬に混和させ、６０ｍｍｄｉｓｈに培養した２９３細胞に添加した。
【００２８】
投与後、相同組換えを起こした非増殖性アデノウイルスベクターをａＦＧＦプライマーを用いたＰＣＲ法をマーカーにしながら、上記教科書の方法に従って単離した。この操作は具体的には次のようにして行った。
【００２９】
ＳｕｐｅｒｆｅｃｔでＣｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎした２９３細胞を３日ごとに培養液を交換しながら１０−１４日間、培養器で培養する。２９３細胞が変性したら、２９３細胞を含めて培養液ごと回収する。回収液の一部（０．５ｍｌ）を用いて、ＤＮＡを回収し、ａＦＧＦプライマーを用いたＰＣＲ法を行った。ａＦＧＦ遺伝子の存在することを確認したら、この回収液を一次ウイルスベクター液とする。
【００３０】
ついで５０ μＬの一次ウイルスベクター液をコンフルエントになった２９３細胞の培養液中に添加し、３７Ｃで１時間反応させて感染させる。ついで、培養液で０．６５％に薄めた０アガロースを手添加して固める。この状態で培養器で培養する。目に見えるプラークが出現したら、プラークをパスツールピペットで吸引して、０．５ｍｌの培養液の入ったエッペンドルッフチューブに回収する（二次ウイルスベクター液）。回収した二次ウイルスベクター液をさらにンフルエントになった２９３細胞の培養液中に添加し、３７Ｃで１時間反応させて感染させて培養。細胞が変性したら回収して、ＰＣＲ法を行い、ａＦＧＦ遺伝子の入ったプラークを選ぶ。この操作を繰り返すことによって、ａＦＧＦ遺伝子が組み込まれたアデノウイルスベクターを単離した。
【００３１】
ＰＣＲ産物を電気泳動した結果、ＮＯ．２のサンプルにヒトａＦＧＦ遺伝子のバンドが認めらた。すなわち、このサンプルが、ヒトａＦＧＦ遺伝子が組み込まれたアデノウイルスベクターであることを示している。
【００３２】
実施例２
ａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターの哺乳動物細胞（２９３細胞）への導入とａＦＧＦ遺伝子の発現
ＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ社ＢＲＬ）に１０％胎児馬血清（ＦＢＳ）とペニシリンとストレプトマイシンからなる抗生物質を加えた培養液を作製した。６０ｍｍｄｉｓｈに培養液４ｍｌを加え、その中で２９３細胞（ヒトの胎児の腎臓由来の細胞株）を培養した。そこに、１ｘ１０^８ｐｆｕ／ｍｌアデノウイルスベクター液を０．１ｍｌ加えて感染させ、３７℃で培養した。４日後に細胞を回収した。アデノウイルスベクター液を加えなかった細胞をコントロールにした。
【００３３】
上記細胞をタンパク分解阻害剤入りのトリス塩酸バッファーで再溶解し、ウエスタンブロット法に供した。すなわち、５０ μｇのタンパクを１５％ポリアクリルアミドゲルに電気泳動した後、ニトロセルロース膜に電気的に転写した。転写したニトロセルロース膜を１０％スキムミルクと反応させ、タンパクの非特的結合をブロックした。ついで、抗ヒトａＦＧＦマウスモノクローナル抗体（Ｗａｋｏ純薬、ＡＦ１−１１４）、ペルオキシダーゼラベル抗マウスＩｇＧ抗体（ニチレイ社、ヒストファイン）と順次反応させ、化学的発光で検出した。
【００３４】
その結果、ＦＧＦ−１遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターを投与した２９３細胞では、約１７ｋＤａの分子量のａＦＧＦを検出した。また、二量体と思われる約３４ｋＤａの分子量のバンドも検出された。一方、ベクターを加えなかったコントロールサンプルでは、何も検出されなかった。すなわち、このａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターは、ヒトの細胞の中でａＦＧＦを産生することが明らかとなった。
【００３５】
実施例３
ａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターのマウス舌への投与と舌下神経核の運動ニューロンでのヒトａＦＧＦの発現
６カ月齢のＣ５７Ｂｌａｃｋマウスを用いた。マウスを麻酔した後、１ｘ１０^９ｐｆｕ／ｍｌの濃度のａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターをマウスの舌に約３０ μｌ投与した。翌日、３日後、７日後、１カ月後にマウスを大量の麻酔で安楽死させた後、マウスの心臓から１０ｍＭリン酸緩衝液を加えた生理食塩水と流して脱血し、その後固定液を流して固定した。その後、脳幹部と舌を取り出し、さらに２４時間浸潤固定した。ついで、１５％蔗糖液の入ったリン酸緩衝液に４８時間以上浸して組織の水分を抜いた後、ドライアイスで凍結させ、クリオスタット装置で２０ μｍの厚さの連続切片を作製した。
【００３６】
ａＦＧＦの発現は、抗ヒトａＦＧＦマウスモノクローナル抗体（Ｗａｋｏ純薬社、ＡＦ１−１１４）を用いた免疫組織化学法で検定した。
【００３７】
その結果、舌を支配する運動神経の神経細胞体の存在する舌下神経核の運動ニューロンにａＦＧＦを検出した。すなわち、ａＦＧＦ遺伝子は舌の運動ニューロン末端（神経筋接合部など）から取り込まれ、運動ニューロンまで逆行性に運ばれて、運動ニューロン内でａＦＧＦ遺伝子を発現しているものと考えられた。また、舌での発現は、１週間以内に消失するが、運動ニューロンでの発現は１カ月後も続いていた。
【００３８】
ａＦＧＦは、運動ニューロンの細胞質のみならず核にも染色された。これは、ａＦＧＦのＮ端側に存在する核以行シグナルによって、ａＦＧＦが細胞質から核内へと移動したと考えられる。
【００３９】
比較例１
ａＦＧＦ遺伝子を組み込んだアデノウイルスベクターとＨＶＪ−Ｅ（センダイウイルスエンベロープ）との比較実験
アデノウイルスベクターではなく、センダイウイルスエンベロープを用いて、マウス舌への投与実験を行った。センダイウイルスベクターエンベロープは、動物個体へ遺伝子導入が可能な試薬として市販されている（石原産業株式会社、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ）。
【００４０】
方法は、哺乳動物細胞での発現用のプラスミド（インビトロジェン社、ｐＣＭＳ−ＥＧＦＰ）にヒトａＦＧＦ遺伝子を組み込んだ。このプラスミドをＨＶＪ−Ｅ（石原産業株式会社、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ）で包み込み、２９３細胞に投与した。投与後、実施例２に従って、細胞を回収しウエスタンブロット法でヒトａＦＧＦの発現を検討した。その結果、ヒトａＦＧＦの発現を認めた。
【００４１】
次に、実施例３にしたがって、マウス個体への投与実験を行った。
すなわち、ヒトａＦＧＦ遺伝子を組み込んだプラスミドをＨＶＪ−Ｅ（石原産業株式会社、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅ）で包み込み、Ｃ５７Ｂｌａｃｋマウスの舌に投与した。投与方法は、ＧｅｎｏｍｅＯｎｅに添付されているプロトコールに従った。３日後、７日後に脳と舌を取り出した。ついで、ａＦＧＦの発現を抗ヒトａＦＧＦマウスモノクローナル抗体（和光純薬、ＡＦ１−１１４）を用いた免疫組織化学法で検定した。
【００４２】
その結果、舌下神経核の運動ニューロンに、ヒトａＦＧＦの発現は認めなかった。すなわち、培養細胞ではいずれもａＦＧＦの発現を認めたが、個体への投与では、ＨＶＪ−Ｅに比較してアデノウイルスベクターの優位性が示された。
【００４３】
【発明の効果】
本発明により、核内作用ペプチド遺伝子を細胞核内へ移行させ作用させる手段が初めて提供された。また、本発明により、ＡＬＳのような運動ニューロン疾患の治療剤が初めて提供された。本発明のヒト酸性線維芽細胞成長因子をコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結した遺伝子複合体を筋肉内に注射することによって、ヒト運動ニューロンが産生している神経栄養因子ａＦＧＦの産生量を長期にわたって増加させることができ、運動ニューロンの細胞死を防いでＡＬＳの治療に貢献できる。また、本発明によれば、脳内に神経関連物質を投与するのではなく、末梢の筋肉に投与することで目的が達成され、安全、簡潔かつ大きな効果、有意な改善をもたらす。
【００４４】
【配列表】

【００４５】

【００４６】

Claims

細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡとアデノウイルスベクターとが機能的に連結してなり、細胞核内へ前記ペプチドを移行可能な組換えＤＮＡ。
前記細胞が、運動神経細胞（運動ニューロン）である請求項１記載の組換えＤＮＡ。
前記ペプチドが神経栄養因子である請求項１又は２記載の組換えＤＮＡ。
核移行ペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれ、その下流に細胞核内で作用するペプチドをコードするＤＮＡが組み込まれたものである請求項１、２または３記載の組換えＤＮＡ。
核移行ペプチドがＡｓｎＴｈｒＬｙｓＬｙｓＰｒｏＬｙｓＬｅｕのアミノ酸構成である請求項４記載の組換えＤＮＡ。
前記神経栄養因子がヒト酸性線維芽細胞成長因子である請求項３記載の組換えＤＮＡ。
請求項３記載の組換えＤＮＡを有効成分として含有する運動ニューロン疾患治療剤。
請求項４記載の組換えＤＮＡを有効成分として含有する筋萎縮性側索硬化症の遺伝子治療剤。
注射剤の形態にある請求項５又は６記載の遺伝子治療剤。
筋内への注射剤の形態にある請求項９の遺伝子治療剤。