JPH09510358A - 脳−誘導神経栄養因子（ｂｄｎｆ）をコードする組み換えアデノウィルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする異種ＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルス、それらの製造、ならびに変性神経疾患の処置及び／又は予防のためのそれらの利用。

Description

【発明の詳細な説明】 脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードする組み換えアデノウィルス 本発明はウィルス起源の組み換えベクター、ならびに神経変性疾患の処置及び ／又は予防のためのそれらの利用に関する。さらに特定的に本発明は、脳−誘導 神経栄養因子（ＢＤＮＦ、脳−誘導神経栄養因子）をコードするＤＮＡ配列を含 む組み換えアデノウィルスに関する。本発明は又、これらのベクターの製造、そ れらを含む製薬学的組成物、ならびに特に遺伝子療法におけるそれらの治療的利 用に関する。 神経変性疾患は人口の老化の結果としてますます増加しつつある西欧諸国にお ける健康の消耗（ｈｅａｌｔｈ ｅｘｐｅｎｄｉｔｕｒｅ）の実質的部分となっ ている。これらの状態の例として特にアルツハイマー病、パーキンソン病、ハン ティングトン舞踏病、筋萎縮性側索硬化症などを挙げることができる。これらの 疾患の病理学的兆候及び病因は全く異なっているが、それらはすべて中枢神経系 におけるニューロン細胞が徐々に失われることから生じ、いくつかの場合にはパ ーキンソン病における黒物質（ｂｌａｃｋ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）などの高度に 局所的な構造を生ずる。いくつかの待期的処置がすでに利用できるが、それらの 効果は比較的限られている。本発明はこれらの疾患の処置のための新規な、特に 有利な治療的方法につき記載する。さらに特定的に本発明はある種の栄養因子の 有効で局所的な発現により、これらの病理学に含まれるニューロン細胞の残存を 直接促進することを可能にするベクターにつ き記載する。 栄養因子は神経成長又は神経細胞の残存を刺激するための性質を有する種類の 分子である。神経栄養性を有する第１の因子、ＮＧＦ（神経成長因子）は約４０ 年前に特性化された（再調査のためにＬｅｖｉ−Ｍｏｎｔａｌｃｉｎｉ ａｎｄ Ａｎｇｅｌｌｅｔｉ，Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．４８（１９６８）５３４を参 照されたい）。他の神経栄養因子、特に脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）（Ｔ ｈｅｏｎｅｎ，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ ＮｅｕｒｏＳｃｉ．１４（１９９１）１６ ５）が同定されたのは最近になって初めてであった。ＢＤＮＦは１１８アミノ酸 及び１３．５ｋＤの分子量を有するタンパク質である。試験管内においてＢＤＮ Ｆは軸索の形成、ならびに網膜の神経節ニューロン、脊髄の運動ニューロン、中 隔のコリン作用性ニューロン及び中脳のドパミン作用性ニューロンの培養におけ る残存を刺激する（Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｅｄ，（１９ ９３）２５７，Ａｃａｄｅｍｉｃ ＰｒｅｓｓにおけるＬｉｎｄｓａｙによる総 説）。しかしその性質は有利であるが、ＢＤＮＦの治療的適用は種々の障害と直 面している。特にＢＤＮＦの生物利用性の不在がいずれの治療的利用も制限して いる。さらにＢＤＮＦを体のある所望の領域に持続的で局所的方法で送達できる ようにする有効な手段がない。最後に、送達されるＢＤＮＦが活性であり、生体 内において治療的活性を働かせることができることが必須である。 本発明はこれらの問題に特に有利な解答を与える。実際に本発明は生体内にお いて、及び局所的に治療的活性量のＢＤＮＦを送達するための特に有効なベクタ ーの開発にある。同時係属出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／０２５１９において、生 体内において遺伝子を神経系中に転移させる ためにアデノウィルスを用いることができることが示された。本発明は、神経系 中に特定の遺伝子を転移させるために特に適応させられ、有効である新規な構築 物に関する。さらに特定的に本発明は、脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコ ードするＤＮＡ配列を含む組み換えアデノウィルス、その製造、ならびに神経変 性疾患の処置及び／又は予防のためのその利用に関する。 今回出願人は、ＢＤＮＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルスを構 築し、これらの組み換えアデノウィルスを生体内において投与することが可能で あること、ならびにこの投与が生体内において、特に神経系において、細胞病理 学的影響なく、治療的活性量のＢＤＮＦの安定で局所的発現を可能にすることを 示した。本発明のベクターの特に有利な性質は、特に用いられる構築物（あるウ ィルス領域が欠失した欠失アデノウィルス）、ＢＤＮＦをコードする配列の発現 のために用いられるプロモーター（好ましくはウィルス又は組織−特異的プロモ ーター）、ならびに該ベクターの投与のための方法に由来し、ＢＤＮＦの有効な 、及び適した組織における発現を可能にしている。かくして本発明は遺伝子療法 において直接用いることができるウィルスベクターを提供し、それは特に生体内 におけるＢＤＮＦの発現を方向付けるために適応させられ、有効である。かくし て本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防のための特に有利な新規な方法を 提供する。 従って本発明の第１の主題は脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）又はそれらの 誘導体をコードするＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルスにある。 本発明の主題は神経変性疾患の処置又は予防を目的とする製薬学的組 成物の製造のためのそのような欠失組み換えアデノウィルスの利用でもある。 本発明の枠内で生産される脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）はヒトＢＤＮＦ 又は動物のＢＤＮＦであることができる。ヒトＢＤＮＦ及びラットＢＤＮＦをコ ードするＤＮＡ配列（Ｍａｉｓｏｎｐｉｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｉ ｃｓ １０（１９９１）５５８）、ならびに特にブタＢＤＮＦをコードする配列 （Ｌｅｉｂｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３４１（１９８９）１４９ はクローニングされ、配列決定されている。本発明のアデノウィルスベクターへ のそれらの挿入の前に、これらの配列は、例えば部位特異的突然変異誘発により 、特に適した制限部位の挿入のために有利に改変される。先行技術において記載 されている配列は実際に本発明で用いるために構築されてはおらず、実質的発現 を得るためにはあらかじめ適応させることが必要であることが証明され得る（実 施例１．２を参照されたい）。本発明の枠内において、ヒト脳−誘導神経栄養因 子（ｈＢＤＮＦ）をコードするＤＮＡ配列を用いるのが好ましい。さらに上記の 通り、ＢＤＮＦの誘導体、特にヒトＢＤＮＦの誘導体をコードする構築物を用い ることもできる。そのような誘導体は例えば本来の配列と比較して突然変異、欠 失及び／又は付加により得られ、ＢＤＮＦの生物学的性質（栄養的及び／又は確 認剤（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｏｒ）効果）の少なくとも１つを保存している 産物をコードするいずれかの配列を含む。これらの改変は当該技術分野における 熟練者に既知の方法により行うことができる（下記の一般的分子生物学法及び実 施例２を参照されたい）。かくして得られる誘導体の生物学的活性を実施例３に おいて特に示される通り、次いで容易に決定す ることができる。本発明の誘導体は、プローブとして本来の配列又はそのフラグ メントを用いた核酸ライブラリからのハイブリッド形成により得ることもできる 。 これらの誘導体は特に、それらの結合部位に関するより高い親和力を有する分 子、生体内における発現を強化させる配列、プロテアーゼに対するより大きな抵 抗性を有する分子、より大きな治療的有効性又はより少ない副作用、あるいは新 規な生物学的性質の可能性を有する分子である。 好ましい誘導体の中でさらに特定的に自然の変異体、１つ又はそれ以上の残基 が置換された分子、考慮されている結合部位との相互作用に含まれない、又はほ とんど含まれない、あるいは望ましくない活性を発現する領域の欠失により得ら れる誘導体、本来の配列と比較して例えば分泌シグナル及び／又は結合ペプチド などの付加的残基を含む誘導体を挙げることができる 特に有利な方法の場合、 本発明の配列は、本来のプロ領域に先行されるＢＤＮＦをコードする（プロＢＤ ＮＦ）。 さらに、本発明をより良く遂行するために、用いられる配列は合成されるＢＤ ＮＦが細胞外区画において放出され、そのレセプターを活性化できるように、合 成されるＢＤＮＦを感染細胞の分泌経路において方向付けることを可能にする分 泌シグナルも含むのが特に重要である。分泌シグナルはＢＤＮＦシグナル自身で あるのが好ましい。しかしそれは異種であることも、人工的分泌シグナルである ことさえできる。 本発明の枠内で用いられる脳−誘導神経栄養因子をコードするＤＮＡ配列はｃ ＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、あるいは例えば１つ又はそれ以上のイント ロンが挿入されていることができるｃＤＮＡを含むハ イブリッド構築物であることができる。これは又、合成又は半合成配列であるこ ともできる。ＢＤＮＦをコードするゲノム配列の場合、イントロンが非−コード 領域に置かれることに注意しなければならない。特に有利な方法の場合、ｃＤＮ Ａ又はｇＤＮＡが用いられる。特にｇＤＮＡの使用はヒト細胞における発現を強 化させることができる。 従って本発明の最初の実施態様の場合、アデノウィルスは脳−誘導神経栄養因 子（ＢＤＮＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む。本発明の他の好ましい実施態 様の場合、アデノウィルスは脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）をコードするｇ ＤＮＡ配列を含む。ＤＮＡ配列はプロＢＤＮＦ、及び好ましくはプレプロＢＤＮ Ｆをコードするのが有利である。 ＢＤＮＦをコードする配列は神経細胞におけるその発現を可能にするシグナル の調節下に置かれるのが有利である。それらは異種発現シグナル、すなわちＧＭ Ｆ−βの発現を自然に担っているシグナルと異なるシグナルであるのが好ましい 。それらは特に他のタンパク質又は合成配列の発現を担う配列であることができ る。特にそれらは真核又はウィルス遺伝子のプロモーター配列であることができ る。例えばそれらは感染することが望まれている細胞のゲノムから誘導されるプ ロモーター配列であることができる。同様にそれらは、用いられるアデノウィル スを含むウィルスのゲノムから誘導されるプロモーター配列であることができる 。これに関し、例えばＥＩＡ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターな どを挙げることができる。さらにこれらの発現配列は、活性化又は調節配列、あ るいは組織−特異的発現を可能にする配列の付加により改変することができる。 事実、神経細胞において特異的に、又は優先的に活性である発現シグナルを用い 、ウィルスが実際に神経細胞に感染し た場合のみにＤＮＡ配列が発現され、その効果を生み出すようにするのが特に有 利であり得る。これに関し、例えばニューロン−特異的エノラーゼプロモーター 、ＧＦＡＰプロモーターなどを挙げることができる。 第１の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節 下に脳−誘導神経栄養因子（ｈＢＤＮＦ）をコードするｃＤＮＡ配列を含む欠失 組み換えアデノウィルスに関する。 他の特定の実施態様において、本発明はＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下 に脳−誘導神経栄養因子（ｈＢＤＮＦ）をコードするｇＤＮＡ配列を含む欠失組 み換えアデノウィルスに関する。 実際に出願人は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーターが神経、 特に中枢神経系の細胞におけるＢＤＮＦの持続的及び実質的発現を可能にするこ とを示した。 さらに好ましい実施態様において、本発明は神経系における優先的発現を可能 にするプロモーターの調節下にヒト脳−誘導神経栄養因子（ｈＢＤＮＦ）をコー ドするＤＮＡ配列を有する欠失組み換えアデノウィルスに関する。本発明の特に 好ましい実施態様は、ＩＴＲ配列、包膜を可能にする配列、ヒト脳−誘導神経栄 養因子（ｈＢＤＮＦ）又はそれらの誘導体を、神経系における優先的発現を可能 にするプロモーターの調節下に含み、Ｅ１遺伝子、ならびにＥ２、Ｅ４及びＬ１ 〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つが非−機能性である欠失組み換えアデノウィルス にある。 本発明の欠失アデノウィルスは、標的細胞において自律的に複製することがで きないアデノウィルスである。従って一般に本発明の枠内で用いられる欠失アデ ノウィルスのゲノムは、少なくとも感染細胞における該ウィルスの複製に必要な 配列が欠けている。これらの領域は除去され るか（完全に、又は部分的に）、又は非−機能性とされるか、あるいは他の配列 により、特にＢＤＮＦをコードするＤＮＡにより置換されていることができる。 本発明の欠失ウィルスはウィルス粒子の包膜に必要な配列をそのゲノムに保存 しているのが好ましい。さらに好ましくは上記の通り、本発明の欠失組み換えア デノウィルスのゲノムはＩＴＲ配列、包膜を可能にする配列、非−機能性Ｅ１遺 伝子、及び少なくとも１つの非−機能性Ｅ２、Ｅ４又はＬ１〜Ｌ５遺伝子を含む 。 構造及び性質がいくらか異なる種々のアデノウィルス血清型が存在する。これ らの血清型の中で、２又は５型ヒトアデノウィルス（Ａｄ２又はＡｄ５）、ある いは動物起源（出願ＦＲ９３ ０５９５４を参照されたい）のアデノウィルスの 利用が本発明の枠内で好ましい。本発明の枠内で用いることができる動物起源の アデノウィルスの中で、イヌ、ウシ、ネズミ（例えばＭａｖ１：Ｍａｖ１，Ｂｅ ａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７５（１９９０）８１）、ヒツジ、 ブタ、トリ又は別の場合サル（例えば：ＳＡＶ）起源のアデノウィルスを挙げる ことができる。動物起源のアデノウィルスはイヌアデノウィルスが好ましく、又 はＣＡＶ２アデノウィルスがさらに好ましい［例えばＭａｎｈａｔｔａｎ株又は Ａ２６／６１（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００）］。好ましくは本発明の枠内でヒト又 はイヌ、あるいは混合起源のアデノウィルスが用いられる。 本発明の欠失組み換えアデノウィルスは当該技術分野における熟練者に既知の いずれの方法によっても製造することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ ｅｔ ａｌ． ，Ｇｅｎｅ １０１（１９９１）１９５，ＥＰ １８ ５ ５７３；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．３（１９８４）２９１７）。特にそ れらはアデノウィルス及び、中でもＢＤＮＦをコードするＤＮＡ配列を有するプ ラスミドの間の相同的組み換えにより製造することができる。相同的組み換えは 適した細胞系中に該アデノウィルス及びプラスミドをコトランスフェクションし た後に起こる。用いられる細胞系は好ましくは（ｉ）該要素により形質転換可能 でなくてはならず、（ｉｉ）アデノウィルスゲノムのゲノムの欠失部分を補足で きる配列を、組み換えの危険を避けるために好ましくは組み込まれた形態で含ま なければならない。細胞系の例としてヒト胚腎臓系２９３（Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６（１９７７）５９）を挙げることがで き、それは特にＡｄ５アデノウィルスのゲノムの左部分（１２％）をそのゲノム に組み込んで含む。アデノウィルスから誘導されるベクターの構築のための戦術 も出願番号ＦＲ９３ ０５９５４及びＦＲ９３ ０８５９６に記載されており、 それらは引用することにより本明細書の内容となる。 次に増殖したアデノウィルスを回収し、実施例に記載の従来の分子生物学法に 従って精製する。 上記の通り、本発明は神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学 的組成物の製造のための、上記のアデノウィルスの利用にも関する。さらに特定 的に本発明はパーキンソン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ ）、ハンティングトン舞踏病、てんかん及び血管性痴呆の処置及び／又は予防を 目的とする製薬学的組成物の製造のためのこれらのアデノウィルスの利用に関す る。 本発明は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスを含 む製薬学的組成物にも関する。これらの製薬学的組成物は局所的、経口的、非経 口的、鼻内、静脈内、筋肉内、皮下、眼内又は経皮的投与などのために調製する ことができる。本発明の製薬学的組成物は注入用調剤のための、特に患者の神経 系に直接注入するための製薬学的に許容され得るビヒクルを含むのが好ましい。 これは特に等張無菌溶液、あるいは場合に依存して無菌水又は生理食塩水を添加 すると注入用溶液を調製できる乾燥、特に凍結乾燥組成物であることができる。 患者の神経系中への直接の注入は、冒された組織のレベルに治療効果を集中させ ることを可能にするので有利である。患者の中枢神経系中への直接の注入は、定 位的注入装置を用いて行うのが有利である。そのような装置の使用により実際に 、注入部位を非常に正確に狙うことができるようになる。 これに関し、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスを患者に投与 することを含む、神経変性疾患の処置のための方法にも関する。さらに特定的に 、本発明は上記で定義された組み換えアデノウィルスの定位的投与を含む神経変 性疾患の処置のための方法に関する。 注入のために用いられる欠失組み換えアデノウィルスの投薬量は種々のパラメ ーターに従って、特に用いられる投与様式、関連する病理学、あるいは別の場合 処置の所望の持続期間に従って調節することができる。一般に本発明の組み換え アデノウィルスは１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ ／ｍｌの投薬量の形態で調製され、投与される。ｐｆｕ（プラーク形成単位）と いう用語はウィルス溶液の感染力に対応し、適した細胞培養に感染させ、次いで 一般に４８時間後に感染細胞のプラークの数を測定することにより決定される。 ウィルス溶液のｐｆｕ力価の決定のための方法は文献において十分に例証されて い る。 本発明の他の主題は、１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルス に感染した哺乳類細胞に関する。さらに特定的に本発明は、これらのアデノウィ ルスに感染したヒト細胞集団に関する。それらは特に繊維芽細胞、筋芽細胞、肝 細胞、表皮細胞、内皮細胞、神経膠細胞などであることができる。 本発明の細胞は一次培養から得ることができる。それらを当該技術分野におけ る熟練者に既知の方法により集め、次いでそれらの増殖を可能にする条件下で培 養することができる。さらに特定的に繊維芽細胞に関しては、これらを例えばＨ ａｍ［Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２１ａ（１９８０）２５５］によ り記載の方法に従って生検から容易に得ることができる。これらの細胞をアデノ ウィルスによる感染に直接用いることができ、あるいは後の使用のためのオート ロガスライブラリの確立のために例えば凍結により保存することができる。本発 明の細胞は例えばあらかじめ確立されたライブラリから得られる二次培養である こともできる。 次いで培養細胞を組み換えアデノウィルスに感染させ、それらにＢＤＮＦを生 産する能力を与えるようにする。感染は当該技術分野における熟練者に既知の方 法に従って試験管内において行われる。特に用いられる細胞の型及び細胞当たり のウィルスコピーの所望の数に従い、当該技術分野における熟練者は感染多重度 、及び場合により、行われる感染のサイクルの数を調節することができる。これ らの段階は、細胞が生体内投与を目的とされている場合は適した無菌条件下で行 われるべきであることは明らかに理解される。細胞の感染のために用いられる組 み換えア デノウィルス投薬量は、所望の目的に従って当該技術分野における熟練者が調節 することができる。生体内投与のための上記の条件は、試験管内における感染に も適用され得る。 本発明の他の主題は１種又はそれ以上の上記の欠失組み換えアデノウィルスに 感染した哺乳類細胞及び細胞外マトリックスを含む体内埋植物に関する。本発明 の体内埋植物は１０⁵〜１０¹⁰個の細胞を含むのが好ましい。それらは１０⁶〜１ ０⁸個を含むのがより好ましい。 さらに特定的に、本発明の体内埋植物において、細胞外マトリックスはゲル化 化合物及び場合により細胞の固定を可能にする担体を含む。 本発明の体内埋植物の製造のために種々の型のゲル化剤を用いることができる 。ゲル化剤はゲルの構造を有するマトリックスに細胞を含み、適宜、担体上への 細胞の固定を強化するために用いられる。従って種々の細胞接着剤、特にコラー ゲン、ゼラチン、グリコサミノグリカン類、フィブロネクチン、レクチン類など をゲル化剤として用いることができる。本発明の枠内ではコラーゲンを用いるの が好ましい。これはヒト、ウシ又はネズミ起源のコラーゲンであることができる 。さらに特定的には、Ｉ型コラーゲンが用いられる。 上記の通り、本発明の組成物は細胞の固定を可能にすることにより担体を含む のが好ましい。固定という用語は、担体上への細胞の接着及び／又は結合を生ず るいずれの形態の生物学的及び／又は化学的及び／又は物理的相互作用をも称す る。さらに細胞は用いられる担体を覆うか、又はこの担体の内部に浸透する、あ るいは両方であることができる。固体の無毒性及び／又は生物適合性担体の使用 が本発明の枠内で好ましい。特にポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）繊維 又は生物起源の担体 を用いることができる。 本発明の体内埋植物は体における種々の部位において体内埋植することができ る。特に体内埋植は腹腔において、皮下組織（恥骨上領域、腸骨窩及び猟径窩な ど）において、臓器、筋肉、腫瘍、中枢神経系において、又は別の場合粘膜下に おいて行うことができる。本発明の体内埋植は、それらが体における治療的産物 の放出を制御することを可能にするという意味で特に有利である：この放出は第 １に感染の多重度により、及び感染細胞の数により決定される。次に放出は処置 を永久に停止する体内埋植物の除去により制御されるか、あるいは治療的遺伝子 の発現を誘導又は抑制することを可能にする調節可能な発現系の使用により制御 される。 かくして本発明は神経変性疾患の処置又は予防のために非常に有効な手段を提 供する。それは最も特定的にはアルツハイマー、パーキンソン病、ハンティング トン舞踏病又はＡＬＳ疾患の処置に適応させられる。さらに本発明のアデノウィ ルスベクターは、特に神経細胞の感染の非常に高いそれらの効率と結び付いた実 質的利点を有し、それは小容積のウィルス懸濁液を用いて感染を行うことを可能 にする。さらに本発明のアデノウィルスによる感染は注入の部位に高度に局在化 しており、それは隣接する脳構造への拡散の危険を避ける。 さらに、この処置はヒト、ならびにヒツジ、ウシ、家畜（イヌ、ネコなど）、 ウマ、サカナなどのいずれの動物にも適用することができる。 本発明を以下の実施例によりさらに完全に説明するが、それは例示であり制限 ではないと考えられるべきである。図面の説明 図１：ベクターｐＸＬ２２４４の図 図２：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦの図一般的分子生物学法 分子生物学において従来用いられる方法、例えばプラスミドＤＮＡの調製的抽 出、塩化セシウム勾配におけるプラスミドＤＮＡの遠心、アガロース又はアクリ ルアミドゲル電気泳動、電気溶出によるＤＮＡフラグメントの精製、タンパク質 のフェノール又はフェノール−クロロホルム抽出、食塩水媒体中のＤＮＡのエタ ノール又はイソプロパノール沈降、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ ａ ｃｏｌｉ）における形質転換などは当該技術分野における熟練者に周知であ り、文献に広く記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ＭａｎｕａｌＦ ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ｍ． ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ），“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ ｌｅｃｕｌａｒ ＢｉｏｌｏｇｙＦ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２−及びｐＵＣ型プラスミド及びＭ１３系列のファージは市販のも のである（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 。 連結のために、ＤＮＡフラグメントをアガロース又はアクリルアミドゲル電気 泳動によりそれらの寸法に従って分離し、フェノールを用いて、又はフェノール ／クロロホルム混合物を用いて抽出し、エタノールを用いて沈降させ、次いで供 給者の勧告に従ってファージＴ４ ＤＮＡリガ ーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下でインキュベートすることができる。 突出５’末端の充填は、供給者の規格に従ってＥ．コリ ＤＮＡポリメラーゼ Ｉのクレノウフラグメント（Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて行うことができる。突出 ３’末端の破壊はファージＴ４ ＤＮＡポリメラーゼの存在下で、それを製造者 の勧告に従って用いて行われる。突出５’末端の破壊はＳ１ヌクレアーゼを用い た、制御された処理により行われる。 合成オリゴデオキシヌクレオチドによる試験管内における特定部位の突然変異 誘発は、Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３ （１９８５）８７４９−８７６４］により開発された方法に従い、Ａｍｅｒ ｓｈａｍにより販売されるキットを用いて行うことができる。 いわゆるＰＣＲ法［Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｚｅｄ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ３０ （１９８５）１３５０−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．ａｎｄ Ｆａ ｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．１５５（１９８７）３３５−３ ５０］によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅は、ＤＮＡサーマルサイクラー（ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ）を用い、製造者の規格に従って行うこ とができる。 ヌクレオチド配列の確認はＳａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］により開 発された方法により、Ａｍｅｒｓｈａｍにより販売されるキットを用いて行うこ とができる。実施例 実施例１：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦの構築 この実施例はラウス肉腫ウィルスＬＴＲ（ＲＳＶ−ＬＴＲ）を含むプロモータ ーの調節下にＢＤＮＦをコードするＤＮΛ配列を含むベクターの構築を記載する 。 １．１．出発ベクター（ｐＸＬ２２４４）：プラスミドｐＸＬ２２４４はＲＳ ＶウィルスＬＴＲプロモーターの調節下におけるＡｐｏＡＩｃＤＮＡ、及びＡｄ ５アデノウィルス配列を含む（図１）。それはプレプロＡｐｏＡＩをコードする ｃＤＮＡを含むＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメントを、同じ酵素で消化されたベ クターｐＬＴＲ ＲＳＶ−βｇａｌ（Ｓｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄ ｅｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０（１９９２）６２６） 中に挿入することにより構築された。 １．２．プレプロ−ＢＤＮＦをコードするＣＤＮＡのクローニング ラットプレプロ−ＢＤＮＦをコードする完全ｃＤＮＡ（７９０ｐｂ）をラット ゲノムＤＮＡライブラリから以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用い 、ＰＣＲ法によりクローニングした： ５’オリゴヌクレオチド：５’−ＴＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＣＣＡＧＧＴＧ ＡＧＡＡＧ−３’（配列番号１） ３’オリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴＡＡ ＡＴＣＣ−３’（配列番号２） 得られる配列の５’領域を次いでＡＴＧの２５塩基上流においてＣｌａＩ制限 部位を挿入することにより改変した。この部位は以下のオリゴヌクレオチドを用 いたＰＣＲ法により導入された： ５’オリゴヌクレオチド：５’−ＴＡＧＣＴＴＣＡＴＣＧＡＴＴＴＣＣＡＣＣＡ Ｇ−３’（配列番号３） ３’オリゴヌクレオチド：５’−ＡＡＴＡＴＡＡＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴＡＡ ＡＴＣＣ−３’（配列番号４） かくして得られる配列をプラスミドｐＣＲＩＩ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に サブクローニングしてプラスミドｐＣＲＩＩ−ＢＤＮＦを生成した。 １．３．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦの構築 この実施例はＲＳＶウィルスＬＴＲの調節下でプレプロＢＤＮＦをコードする 配列、ならびに生体内における組み換えを可能にするＡｄ５アデノウィルス配列 を含むベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦの構築を記載する。 ベクターｐＣＲＩＩ−ＢＤＮＦを酵素ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、得られ るプレプロ−ＢＤＮＦをコードする配列を含む０．８５ｋｂのフラグメントを次 いで単離し、ＬＭＰ（低融点）アガロースゲル電気泳動により精製した。平行し て、ベクターｐＸＬ２２４４を同じＣｌａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素を用いて消化 し、次いで後者の不活性化の後に沈降させた。あらかじめ単離され、アガロース ゲル電気泳動により精製された、得られる線状ベクター及び０．８５ｋｂのフラ グメントを次いで連結し、ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦを生成した（図２） 。 実施例２：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇの構築 この実施例は、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ−ＬＴＲ）を含むプロモーターの 調節下に、ＢＤＮＦをコードする融合ＤＮＡ配列を含む第２のベクターの構築を 記載する。 ２．１．融合ＤＮＡの生成：この実施例では、プレプロ−ＢＤＮＦをコードす るＤＮＡ配列の別の形態を構築した。この形態は実施例１．２． に記載されている配列の３’末端において、商業的に入手可能な抗体（ＩＢＩ、 Ｉｎｔｅｇｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅａｕｂｏｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ） により認識される７つのアミノ酸エピトープ（ｔａｇ）をコードする配列を挿入 することにより得た。かくして融合される領域の配列は以下の通りである（配列 番号５）： Arg Gly Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp *** AGA GGC GAC TAC AAG GAC GAC GAT GAC TAG ------- Ｃ−末端 融合配列 ＢＤＮＦ かくして得られる配列を次いでプラスミドｐＣＲＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ） 中にサブクローニングし、プラスミドｐＣＲＩＩ−ＢＤＮＦｔａｇを生成した。 ２．２．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇの構築 この実施例はＲＳＶウィルスＬＴＲの調節下にプレプロ−ＢＤＮＦをコード する融合配列、ならびに生体内における組み換えを可能にするＡｄ５アデノウィ ルス配列を含むベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇの構築を記載する。 ベクターｐＣＲＩＩ−ＢＤＮＦｔａｇを酵素ＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、 得られるプレプロ−ＢＤＮＦｔａｇをコードする配列を含む０．８７ｋｂのフラ グメントを次いで単離し、ＬＭＰ（低融点）アガロースゲル電気泳動により精製 した。平行して、ベクターｐＸＬ２２４４（実施例１．１．）を同じＣｌａＩ及 びＫｐｎＩ制限酵素を用いて消化し、次いで後者の不活性化の後に沈降させた。 あらかじめ単離され、アガロ ースゲル電気泳動により精製された、得られる線状ベクター及び０．８７ｋｂの フラグメントを次いで連結し、ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇを生成し た。 実施例３．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦ及びｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇ の機能性 細胞培養において生物学的に活性な形態のＢＤＮＦを発現する、ベクターｐＳ ｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦ及びｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇの能力をＣＯＳＩ細胞の 過渡的（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ）トランスフェクションにより示した。そのために 、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍの存在下で細胞（直径が１０ｃｍの皿当たりに２ｘ１ ０⁶個の細胞）をトランスフェクトした（８μｇのベクター）。４８時間後、細 胞培養上澄み液を収穫した。この上澄み液の系列希釈液（１／２００及び１／５ ０）を次いで中隔ニューロンの一次培養（Ｈｅｆｔｉ ｅｔ ａｌ．Ｉｎ Ｄｉ ｓｓｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅｓ：Ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｒｖｏｕｓ Ｓｙｓｔｅｍ（１９８９）１７２，Ａｌａｎ Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．）に加えた。これらの培養への栄養効果（細胞の残存及 び神経成長）を染色の後に観察し、分化効果をＦｏｎｎｕｍ（Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃ ｈｅｍ．２４（１９７５）４０７）により記載の方法に従ってコリンアセチルト ランスフェラーゼ酵素（ＣｈａＴ）の発現のアッセイにより観察した。 実施例４．ＢＤＮＦをコードする配列を含む組み換えアデノウィルスの構築 ４．１．アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの構築 ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦを線状化し、欠失アデノウィルスベ クターと共に、アデノウィルスＥ１領域（Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ）によりコードされ る機能をトランスにおいて与えるヘルパー細胞（系２９３）中にコトランスフェ クトした。 さらに特定的に、アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦを突然変異体アデノウィルス Ａｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ３１ （１９８２）５４３）及びベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦの間の生体内におけ る相同的組み換えにより、以下の方法に従って得た：酵素ＣｌａＩを用いて線状 化されたプラスミドｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦ及びアデノウィルスＡｄ−ｄ１１３ ２４をリン酸カルシウムの存在下で系２９３中にコトランスフェクトし、相同的 組み換えをさせた。かくして生成された組み換えアデノウィルスをプラーク精製 により選択した。単離の後、組み換えアデノウィルスＤＮＡを細胞系２９３にお いて増幅し、それは約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する非精製組み換え欠失ア デノウィルスを含む培養上澄み液を与える。 次いでウィルス粒子を既知の方法に従って塩化セシウム勾配遠心により精製し た（特にＧｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２（１９７３）４ ５６を参照されたい）。アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦは２０％グリセロール中 で−８０℃において保存することができる。 ４．２．アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦｔａｇの構築 アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦｔａｇはアデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦと同じ 方法に従い、しかし出発ベクターとしてベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＢＤＮＦｔａｇ を用いることにより構築した。 実施例５．アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの機能性 培養細胞に感染し、培地において生物学的に活性な形態のＢＤＮＦを 発現する、アデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの能力を、ヒト２９３及びラットＰＣ １２系に感染させることにより示す。次いで培養上澄み液における活性ＢＤＮＦ の存在を実施例３の場合と同じ条件下で決定した。 これらの研究は、アデノウィルスが実際に生物学的に活性な形態のＢＤＮＦを 細胞培養において発現することを示すことを可能にする。 実施例６：脳弓采（ｆｉｍｂｒｉａ−ｆｏｒｎｉｘ）の外傷を有するラットへの 、組み換えアデノウィルスによるＢＤＮＦ遺伝子の生体内における転移 この実施例は本発明のアデノウィルスベクターを用いた、生体内におけるＢＤ ＮＦ遺伝子の転移を記載する。それは、脳弓采の外傷の動物モデルに関し、本発 明のベクターが治療的量のＢＤＮＦの生体内における発現の誘導を可能にするこ とを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、中隔−海馬ルート（脳弓采）を左の半 球のレベルにおいて切開した。この機械的外傷は、伸縮自在（ｒｅｔｒａｃｔａ ｂｌｅ）手術用ナイフを用いて形成した。この効果のために用いられる定位座標 はブレグマに対して：ＡＰ：−１．７；ＭＬ：＋１．５；Ｖ：−５．５〜−０． ５である。 ＢＤＮＦ組み換えアデノウィルスを外傷の直後に中隔の中核（ｍｅｄｉａｎ ｎｕｃｌｅｕｓ）中、及び求心路遮断された海馬（外傷側の海馬）の背部中に注 入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは実施例４．１．で製造さ れたアデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中 において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いられる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行 われる。注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す 前にその場所にさらに４分間残す。海馬及び中隔中への注入の容積はそれぞれ３ μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ ／μｌである。 海馬中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝−４；ＭＬ＝３ ．５；Ｖ＝−３．１（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して決定され、Ｖ座標は ブレグマのレベルにおける頭蓋骨の表面に対して決定される。 中隔中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝１；ＭＬ＝１； Ｖ＝−６（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して決定され、Ｖ座標はブレグマの レベルにおける頭蓋骨の表面に対して決定される。この条件下でカニューラは、 中静脈洞を避けるために垂直に対して９度の角度にある（中外側方向）。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果を３種類の分析：組織学的及び免 疫組織化学的分析、定量的分析、ならびに挙動的分析により示した。組織学的免疫組織化学的分析 脳弓采の機械的外傷は中隔におけるコリン作用性ニューロン（抗−コリンアセ チルトランスフェラーゼ、ＣｈａＴ抗体により免疫組織学において視覚化）の損 失、ならびに海馬におけるコリン作用性脱神経（アセチルコリンエステラーゼ、 ＡＣｈＥ活性により組織化学において検出）を誘導する。 注入された脳の組織学的分析はアデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの脳内注入の３ 週間後に行う。そのために、動物を麻酔下で４％のパラホルム アルデヒドの心臓内輸液により犠牲にする。除去、後固定及び凍結保護の後、脳 をクリオマット（ｃｒｙｏｍａｔ）を用い、前頭面に沿って切開する：中隔の全 長にわたって、ならびに海馬の前、中及び後部において３０μｍの厚さの冠状系 列切片（ｃｏｒｏｎａｌ ｓｅｒｉａｌ ｓｅｃｔｉｏｎｓ）を作る。中隔の場 合、１８０μｍ離れた切片（６切片の中の１切片）をクレシルバイオレットで染 色し（ニューロン密度を評価するため）、抗−ＣｈＡＴ抗体（Ｂｉｏｃｈｅｍ） を用いて免疫標識する（コリン作用性ニューロンの同定のため）。免疫組織化学 的方法は、ＤＡＢを用いて視覚化されるストレプタビジン−ビオチンパーオキシ ダーゼの方法である。海馬の場合、１８０μｍ離れた切片を、コリン作用性脱神 経の検出のためにＡＣｈＥ（アセチルコリンエステラーゼ）に関して組織化学的 方法に従って染色する。切片はガラススライド上に固定する。定量的分析 中隔におけるコリン作用性ニューロン（ＣｈＡＴ−陽性）の数は、アデノウィ ルスＡｄ−ＢＤＮＦの効果の評価のためのパラメーターである。試料（中隔の全 長に及ぶ６切片中の１切片）につき計数を行う。各切片に関し、中隔の両側につ き別々にＣｈＡＴ−陽性ニューロンを計数する。すべての切片に関する累積の結 果を、損傷側のＣｈＡＴ−陽性ニューロンの数対非損傷側のＣｈＡＴ−陽性ニュ ーロンの数の比率により表す。挙動的分析 中隔−海馬ルートの両側の外傷は記憶欠損に導く。この型の外傷へのアデノウ ィルスＡｄ−ＢＤＮＦの注入の保護機能的効果を評価するために、２つの挙動試 験：Ｍｏｒｒｉｓの水泳試験（視覚空間的参照記憶（ｖ ｉｓｕｏｓｐａｔｉａｌ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｍｅｍｏｒｙ））及びＴＭＴＴ 試験（２回−試験記憶仕事（ｔｗｏ−ｔｒｉａｌｓ ｍｅｍｏｒｙ ｔａｓｋ） ；「新環境の短期間記憶」）の間に動物の記憶性能を分析した。 実施例７：黒質線状体ルートの外傷を有するラットへの、組み換えアデノウィル スによるＢＤＮＦ遺伝子の生体内における転移 この実施例は、本発明のアデノウィルスベクターを用いた生体内におけるＢＤ ＮＦ遺伝子の転移を記載する。それは黒質線状体ルートの外傷の動物モデルにお いて、本発明のベクターが治療的量のＢＤＮＦの生体内における発現の誘導を可 能にすることを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、毒素６−ヒドロキシドパミン（６ＯＨ −ＤＡ）の注入により、黒質線状体ルートを中脳束（ＭＦＢ）のレベルで傷付け た。注入によるこの化学的外傷は、以下の定位座標に沿って片側性であった：Ａ Ｐ：０及び−１；ＭＬ：＋１．６；Ｖ：−８．６及び−９（ＡＰ及びＭＬ座標は ブレグマに対して、Ｖ座標は硬膜に対して決定される）。切断バーは＋５ｍｍの レベルに固定する。 組み換えアデノウィルスＧＭＦ−βを外傷の直後に、外傷の側において黒物質 及び線条中に注入した。さらに特定的に、注入されるアデノウィルスは実施例４ ．１．で製造されたアデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶 液（ＰＢＳ）中において精製形態（３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０μｍ）を用いて行われる。 注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す前にその 場所にさらに４分間残す。線条及び黒物質中への注入 容積はそれぞれ２ｘ３μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃度は ３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 黒物質中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝−５．８；Ｍ Ｌ＝＋２；Ｖ＝−７．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して、Ｖ座標は硬膜 に対して決定される）。 線条中への注入の場合、定位座標は以下の通りである：ＡＰ＝＋０．５及び− ０．５：ＭＬ＝３；Ｖ＝−５．５（ＡＰ及びＭＬ座標はブレグマに対して、Ｖ座 標は硬膜に対して決定される）。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果を３種類の分析：組織学的及び免 疫組織学的分析、定量的分析、ならびに挙動的分析により示した。組織学的及び免疫組織化学的分析 黒質線状体ルートの化学的外傷は黒物質におけるニューロン損失、ならびに線 条におけるドパミン作用性脱神経（抗−チロシンヒドロキシラーゼ、ＴＨ抗体に よる免疫組織学において視覚化）を誘導する。 注入された脳の組織学的分析は、実施例６に記載の条件下でアデノウィルスＡ ｄ−ＢＤＮＦの脳内注入の３週間後に行う。黒物質及び線条において３０μｍの 厚さの冠状系列切片を作る。１８０μｍ離れた切片（６切片の中の１切片）をク レシルバイオレットで染色し（ニューロン密度を評価するため）、抗−チロシン ヒドロキシラーゼ（ＴＨ）抗体を用いて免疫標識する（黒物質におけるドパミン 作用性ニューロン及び線条におけるそれらの脱神経を検出するため）。定量的分析 黒物質におけるドパミン作用性ニューロン（ＴＨ−陽性）の数は、ア デノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの効果の評価のためのパラメーターである。試料（ 黒物質の全長に及ぶ６切片中の１切片）につき計数を行う。各切片に関し、黒物 質の両側につき別々にＴＨ−陽性ニューロンを計数する。すべての切片に関する 累積の結果を：損傷側のＴＨ−陽性ニューロンの数対非損傷側のＴＨ−陽性ニュ ーロンの数の割合として表す。挙動的分析 黒質線状体ルートの外傷へのアデノウィルスＡｄ−ＢＤＮＦの注入の保護機能 的効果を評価するために、２つの挙動試験：ドパミン作用性作用薬（アポモルフ ィン、アンフェタミン及びレボドパ）により誘導される回転の試験、及び捕捉（ 手−到達）試験の間に動物の感覚運動性能を分析した。 実施例８：穿孔ルート（ｐｅｒｆｏｒａｔｉｎｇ ｒｏｕｔｅ）の外傷を有する ラットへの、組み換えアデノウィルスによるＢＤＮＦ遺伝子の生体内における転 移 この実施例は、本発明のアデノウィルスベクターを用いた生体内におけるＢＤ ＮＦ遺伝子の転移を記載する。それは穿孔ルートの外傷の動物モデルにおいて、 本発明のベクターが治療的量のＢＤＮＦの生体内における発現の誘導を可能にす ることを示す。 あらかじめ麻酔されたラットにおいて、外科用ナイフを用いて内鼻海馬ルート （ｅｎｔｏｒｈｉｎｏｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ ｒｏｕｔｅ）（穿孔ルート）を 片側的に切開した。この目的に用いられる定位座標は、ラムダに対して：ＡＰ： ＋０．７５；ＭＬ：＋４．１〜６．６；Ｖ：−７．７（Ｖ座標は硬膜に対して決 定される）である。 組み換えアデノウィルスＢＤＮＦを外傷の直後に、外傷のレベルにお いて、又は海馬及び内鼻皮質のレベルにおいて注入した。さらに特定的に、注入 されるアデノウィルスは実施例４．１．で製造されたアデノウィルスＡｄ−ＢＤ ＮＦであり、リン酸塩緩衝食塩溶液（ＰＢＳ）中において精製形態（３．５ｘ１ ０⁶ｐｆｕ／μｌ）で用いる。 注入はポンプに接続されたカニューラ（外径２８０ｐｍ）を用いて行われる。 注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その後カニューラを引き出す前にその 場所にさらに４分間残す。海馬、内鼻皮質及び穿孔ルートの外傷部位中への注入 容積はそれぞれ３μｌ、２μｌ及び２μｌである。注入されるアデノウィルス濃 度は３．５ｘ１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 本発明のアデノウィルスの投与の治療的効果は、実施例６の条件下における挙 動分析により検出することができる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 47/48 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＡＭ 48/00 ＡＡＭ 8615−4Ｃ Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｂ Ｃ０７Ｈ 21/04 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 5/10 9282−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 7/00 9282−4Ｂ Ｃ //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/36 ＡＡＢ Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31 (72)発明者 プラデイエ， ローラン フランス・エフ−75014パリ・リユダレジ ア５ビス (72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ルガルー60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．脳−誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）又はそれらの誘導体をコードするＤＮ Ａ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 ２．ＤＮＡ配列がプレプロ−ＢＤＮＦをコードすることを特徴とする請求の範 囲第１項に記載のアデノウィルス。 ３．ＤＮＡ配列がｃＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１又は２ 項に記載のアデノウィルス。 ４．ＤＮＡ配列がｇＤＮＡ配列であることを特徴とする請求の範囲第１又は２ 項に記載のアデノウィルス。 ５．ＤＮＡ配列がヒトプレプロ−ＢＤＮＦをコードすることを特徴とする請求 の範囲第１〜４項の１つに記載のアデノウィルス。 ６．ＤＮＡ配列が神経細胞におけるその発現を可能にするシグナルの調節下に おかれることを特徴とする請求の範囲第１〜５項の１つに記載のアデノウィルス 。 ７．発現シグナルがウィルスプロモーター、好ましくはＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭ Ｖ及びＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターから選ばれることを特徴とする請求の範囲第 ６項に記載のアデノウィルス。 ８．ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下でヒトプレプロ−ＢＤＮＦをコード するｃＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 ９．ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーターの調節下でヒトプレプロ−ＢＤＮＦをコード するｇＤＮＡ配列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 １０．神経細胞における優先的発現を可能にするプロモーターの調節下でヒト 脳−誘導神経栄養因子（ｈＢＤＮＦ）又はそれらの誘導体をコードするＤＮＡ配 列を含む欠失組み換えアデノウィルス。 １１．プロモーターがニューロン−特異的エノラーゼプロモーター及びＧＦＡ Ｐプロモーターから選ばれることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載の欠失 組み換えアデノウィルス。 １２．標的細胞におけるその複製のために必要なそのゲノムの領域が欠けてい ることを特徴とする請求の範囲第１〜１１項の１つに記載のアデノウィルス。 １３．ＩＴＲ及び包膜を可能にする配列を含み、Ｅ１遺伝子及びＥ２、Ｅ４又 はＬ１〜Ｌ５遺伝子の少なくとも１つが非機能性であることを特徴とする請求の 範囲第１２項に記載のアデノウィルス。 １４．Ａｄ２又はＡｄ５型ヒトアデノウィルス、あるいはＣＡＶ−２型イヌア デノウィルスであることを特徴とする請求の範囲第１２又は１３項に記載のアデ ノウィルス。 １５．神経変性疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造 のための請求の範囲第１〜１４項の１つに記載のアデノウィルスの利用。 １６．パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンティングトン舞踏病又はＡＬ Ｓ疾患の処置及び／又は予防を目的とする製薬学的組成物の製造のための請求の 範囲第１５項に記載の利用。 １７．１種又はそれ以上の請求の範囲第１〜１４項の１つに記載の欠失組み換 えアデノウィルスを含む製薬学的組成物。 １８．注入可能な形態であることを特徴とする請求の範囲第１７項に記載の製 薬学的組成物。 １９．１０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好ましくは１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの 欠失組み換えアデノウィルスを含むことを特徴とする請求の範 囲第１７又は１８項に記載の製薬学的組成物。 ２０．１種又はそれ以上の請求の範囲第１〜１４項の１つに記載の欠失組み換 えアデノウィルスに感染した哺乳類細胞。 ２１．ヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞。 ２２．繊維芽細胞、筋芽細胞、肝細胞、内皮細胞、神経膠細胞又は表皮細胞型 のヒト細胞であることを特徴とする請求の範囲第２０項に記載の細胞。 ２３．請求の範囲第２０〜２２項に記載の感染細胞及び細胞外マトリックスを 含む体内押植物。 ２４．細胞外マトリックスが好ましくはコラーゲン、ゼラチン、グリコサミノ グリカン類、フィブロネクチン及びレクチン類から選ばれるゲル化化合物を含む ことを特徴とする請求の範囲第２３項に記載の体内埋植物。 ２５．細胞外マトリックスが感染細胞の固定を可能にする担体も含むことを特 徴とする請求の範囲第２３又は２４項に記載の体内埋植物。 ２６．担体が好ましくはポリテトラフルオロエチレン繊維から成ることを特徴 とする請求の範囲第２５項に記載の体内埋植物。