JPH09509059A - アルツハイマー病の動物モデル、調製方法および使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明はアルツハイマー病の動物モデル、組換えウイルスによるその調製方法、および特に活性化合物を見出すためのその利用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 アルツハイマー病の動物モデル、調製方法および使用 本発明はアルツハイマー病の動物モデル、組換えウイルスの助力を用いるその 調製方法および特に活性化合物を検出するためのその使用に関する。さらに詳し くは、本発明は、アミロイドペプチドの前駆物質の一つの形態をコードするＤＮ Ａ配列を含有する組換えアデノウイルス、それらの調製方法およびアルツハイマ ー病の動物モデルを調製するためのそれらの使用に関する。本発明はまた、特に アルツハイマー病に対して効果を有する化合物を検出するためのこれらの動物モ デルの使用、並びに同定された化合物に関する。 現在、アルツハイマー病は、６５才以上の人々の１０％、また８０才以上の人 々の２０％を冒している。推定によれば、２０００年には、合衆国では５〜８百 万の患者、全世界では２３百万人の患者となると予想される。この老化性痴呆は 老化性局面（中央アミロイド沈着物からなる）および神経原繊維変性の死後の存 在を特徴とする。疾病の病因は未だ必ずしも完全には理解されていないが、アミ ロイド沈着物の形成が初期の決定的な兆候に対応するようである。 これらの沈着物の主要な成分は３９〜４３個のアミノ酸のペプチドβＡ４であ り、その前駆物質はアミロイドペプチド前駆物質（ＡＰＰは「アミロイド前駆物 質プロテイン」“ａｍｙｌｏｉｄ ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ”の略 語）と呼称されているが、クローン化され、配列決定されている（Ｋａｎｇ等， Ｎａｔｕｒｅ，３２５（１９８７）７３３）。それ以来、アミロイドペプチド前 駆物質の種々のアイソフォー ム（ｉｓｏｆｏｒｍ）が、プレメッセンジャーＲＮＡの選択スプライシングに対 応して、同定された（Ｐｏｎｔｅ等，Ｎａｔｕｒｅ，３３１（１９８８）５２５ ）。さらに、アルツハイマー病のある家族特有の形態において、ＡＰＰ中の突然 変異が最近に同定されたことによって、このプロテインがこの疾病の病因に関与 している説が強化された。 現在、アルツハイマー病の研究、またはこの疾病に効果を有する化合物の開発 は、特にこの病理の動物モデルがないために、極めて困難である。現在利用でき る唯一つのモデルは、培養中の細胞について、βアミロイドペプチドの凝集また はこのペプチドの毒性を試験管内で研究することに基づいている。しかし、この 種のモデルは、特にアルツハイマー病のように複雑な病理の場合、生体内の活性 を予測することができない。本発明はこの問題点に対する解答を提供するもので ある。従って、本発明にはアルツハイマー病の動物モデルの調製方法、並びにこ の病理に効果のある化合物を検出するためにこれらのモデルを使用することの可 能性が記載される。本発明によるモデルは、ウイルス性ベクターの助力を用いて 、さらに具体的にはアデノウイルスから誘導され、アミロイドペプチド前駆物質 の一つの形態をコードするＤＮＡ配列を含有するベクターの助力を用いて調製さ れた。従って、本出願人は、アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコード しているかかる配列を含有する組換えアデノウイルスを構築し、そしてこれらの 組換えアデノウイルスを動物に投与することが可能であること、この投与によっ てこの配列が前記動物中、特に前記動物の神経系中で発現することができること 、および得られる発現によってアルツハイマー病のある種の解剖組織学的おおよ び／または行動的特徴が前記動物中で誘発され得ることを明らかにした。 それ故、本発明の第一は、アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコード するＤＮＡ配列を含有する欠陥組換えアデノウイルスに関するものである。 生体内で神経系中に遺伝子を転移させるために、アデノウイルスを使用するこ とが可能であることは、同時係属中の出願、国際特許ＥＰ９３／０２５１９号明 細書に示された。本発明の組換えアデノウイルスは、動物中にアルツハイマー病 の症状の出現を誘発することができるから、特に有利である。特に、驚くべきこ とには、本発明のアデノウイルスは、アルツハイマー病の解剖組織学的および／ または行動的特徴の出現を誘発することができ、そのことによって、この疾病を 研究し、その治療法を開発するために特に有利である生理病理学的動物モデルの 開発を達成することができる。 本発明の特に有利であるモデルの性質は実質的には、使用されたウイルス（幾 つかのウイルス性領域が欠失している欠陥アデノウイルス）から、ＡＰＰをコー ドしている配列を発現させるために使用されたプロモーター（好適にはウイルス プロモーター）から、そして前記ベクトルを投与する方法、即ちＡＰＰ配列を効 率的にかつ適切な組織中で発現させることができる方法から、もたらされるもの である。 本発明の範囲内では、好適には、標的細胞中でそれが複製するために必要であ るゲノムの領域を欠損するアデノウイルスが使用される。結果として、本発明の 欠陥アデノウイルスは標的細胞中で自己複製することができない。 一般的に、本発明の範囲内で使用される欠陥アデノウイルスのゲノムは、少な くとも感染細胞中で前記ウイルスが複製するのに必要である配 列を欠損している。これらの領域は、除去されるか（全部または一部）、非機能 的にされるか、または他の配列、特に前駆物質の一つの形態をコードしている配 列によって置換されることができる。 好適には、それにもかかわらず、欠陥ウイルスはウイルス粒子の被包に必要で あるそのゲノムの配列を保持する。 種々の血清型のアデノウイルスが存在し、その構造および性質は或る程度まで 異なる。これらの血清型のうち、本発明の範囲内では、ヒト２型もしくは５型ア デノウイルス（Ａｄ２もしくはＡｄ５）または動物起源のアデノウイルスを使用 することが好適である。本発明の範囲内で使用することができる動物起源のアデ ノウイルスのうち、挙げることができるものは、イヌ、ウシ、マウス（例えば、 Ｍａｖｌ，Ｂｅａｒｄ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，７５（１９９０）８１）、ヒツジ 、ブタ、鳥またはサル（例えば、ＳＡＶ）起源（フランス特許第９３ ０５９５ ４号明細書参照）のアデノウイルスである。好適には、動物起源のアデノウイル スはイヌアデノウイルス、さらに好適にはＣＡＶ２株（例えば、Ｍａｎｈａｔｔ ａｎまたはＡ２６／６１株（ＡＴＣＣ ＶＲ−８００））から得られるアデノウ イルスである。アデノウイルスはまた混合起源のアデノウイルス（ヒトの配列と 動物の配列を含有する）とすることができる。 好適な態様では、本発明のアデノウイルスはヒトＡｄ２型またはヒトＡｄ５ア デノウイルスである。 他の好適な態様では、本発明のアデノウイルスはイヌＣＡＶ−２型アデノウイ ルスである。 上記のように、本発明のアデノウイルスは、アミロイドペプチド前駆物質の一 つの形態をコードするＤＮＡ配列を保持する。本発明の意味内 では、用語「アミロイドペプチド前駆物質」は、アミロイドペプチドに成熟する ことができるものであればいずれのペプチドをも表す。好適には、本発明による アミロイドペプチド前駆物質は、βＡ４アミロイドペプチドの一つの形態または この後者のペプチドの変種に成熟することができる。特に有利的には、それは、 ３９〜４３個のアミノ酸からなるβＡ４ペプチドの形態の一つに成熟することが できなければならない。好適には、本発明の意味内では、アミロイドペプチド前 駆物質はＡＰＰのいずれの天然または人工変種によっても表される。上記のよう に、ＡＰＰの幾つかの成熟形態が存在するように、ＡＰＰの種々の天然変種が存 在する。前駆物質の天然形態のうち、さらに具体的に記載することができるもの は、アイソフォームＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１およびＡＰＰ７７０である。さ らに、ＡＰＰの人工変種、特に切断されたＮ−末端領域を含有する変種を使用す ることができる。従って、ＡＰＰの天然変種では、特に６９５個のアミノ酸を有 するＡＰＰアイソフォームの場合では、成熟アミロイドペプチドは分子の中央、 残基５９７から６３８の間に位置する（Ｋａｎｇ等，Ｎａｔｕｒｅ，３２５（１ ９８７）７３３）。本発明の有利な態様では、Ｎ−末端領域で切断されたアミロ イドペプチド前駆物質をコードするＤＮＡ配列が使用される。さらに好適には、 アミロイドペプチドの前のＮ−末端領域が切断されているアミロイドペプチド前 駆物質をコードするＤＮＡ配列が使用される［変種Ａ４ＣＴまたは変種ＳｐＡ４ ＣＴ（シグナル配列の後の）］。 好適には、本発明のアデノウイルスは、ＡＰＰのいずれの天然または合成変種 をもコードするＤＮＡ配列を含有する。 さらに好適には、本発明のアデノウイルスは、ＡＰＰ６９５、ＡＰＰ ７５１またはＡＰＰ７７０をコードするＤＮＡ配列を含有する。 独特の態様では、本発明のアデノウイルスは、特に変種Ａ４ＣＴまたは変種Ｓ ｐＡ４ＣＴのように、Ｎ−末端領域中で切断されているアミロイドペプチド前駆 物質をコードするＤＮＡ配列を含有する。 さらに、ＤＮＡ配列は、上記のものと相同であり、上記のようにアミロイドペ プチド前駆物質の一つの形態をコードするものであればいずれの配列とすること もできると理解されるべきである。かかる相同の配列は特に、当業者に既知の技 術、例えば成熟、欠失、付加および／または上記の配列とのハイブリッド形成を 使用して得ることができる。成熟形態のうち、例示することができるものは、ア ルツハイマー病の家族特有の形態中に観察される突然変異である。 有利的には、アミロイドペプチド前駆物質をコードする配列は、配列を感染細 胞中で発現させることができる異種の発現シグナルの制御下にある。本発明の意 味内では、異種の発現シグナルは本来、アミロイドペプチド前駆物質を発現させ る原因であるものとは異なるシグナルを意味すると理解される。これらのシグナ ルは特に、他のプロテインを発現させる原因である配列、または合成配列とする ことができる。特に、それらは真核性またはウイルス性遺伝子からのプロモータ ー配列とすることができる。例えば、それらは、それが感染することが望まれる 細胞のゲノムから誘導されたプロモーター配列とすることができる。同様に、そ れらは、使用されるアデノウイルスを含めて、ウイルスのゲノムから誘導される プロモーター配列とすることができる。 好適には、ＤＮＡ配列は、それを動物の神経系中で発現させることができ、そ して好適にはウイルス起源のプロモーターのうちから選ばれる 発現シグナルの制御下にある。 さらに具体的には、Ｅ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＬＴＲなどのプロモー ターを例示することができる。 さらに、発現配列は、活性化配列、調節配列、または組織特異性の発現を可能 にする配列を付加することによって修正することができる。従って、ウイルスが 実際に神経細胞に感染した場合、ＤＮＡ配列のみが発現して、その効果を奏する ように、特異的にまたは主として神経細胞中で活性である発現シグナルを使用す ることが特に有利であり得る。例えば、この点で、ＧＦＡＰプロモーターを記載 することができる。 特に有利な態様では、本発明のアデノウイルスは、ＲＳＶ ＬＴＲの制御下の 、アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコードするＤＮＡ配列を含有する 。従って、実施例で示すように、この構築物によって、前記ＤＮＡ配列が動物の 神経系中で極めて効率的かつ長持ちする様式で発現し、そしてアルツハイマー病 の容易に検出できる症状の出現を誘発することができる。 本発明による欠陥組換えアデノウイルスは、当業者に既知のいずれの技術によ っても調製することができる（Ｌｅｖｒｅｒｏ等、Ｇｅｎｅ，１０１（１９９１ １９５、欧州特許第１８５５７３号明細書；Ｇｒａｈａｍ，ＥＭＢＯ Ｊ．，３ （１９８４）２９１７））。特に、それらは、アデノウイルスと、とりわけＤＮ Ａ配列を保持するプラスミドとの間の相同的組換えによって調製することができ る。相同的組換えは、前記アデノウイルスとプラスミドが適切な細胞株中にコト ランスフェクトされた後起こる。使用される細胞株は好適には、（ｉ）前記エレ メントにより形質転換可能であり、（ｉｉ）欠陥アデノウイルスのゲノム部分を 補 足することができ、好適には組換えの危険を回避するために統合形態にある、配 列を含有するべきである。細胞株の例として、特にそのゲノム中に統合されて、 Ａｄ５アデノウイルスのゲノムの左手部分（１２％）を含有するヒト胚腎臓細胞 株２９３（Ｇｒａｈａｍ等，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，３６（１９７７）５９ ）を挙げることができる。アデノウイルスから誘導されるベクターを構築する戦 略は、フランス特許第９３ ０５９５４号明細書とフランス特許第９３ ０８５ ９６号明細書に記載された。 その後、増殖したアデノウイルスを回収し、実施例で説明する標準分子生物学 的技術を使用して精製する。 本発明はまた、アルツハイマー病の動物モデルを調製するために、上記のよう なアデノウイルスを使用することに関する。 本発明はまた、上記のような組換えアデノウイルスを含有する非ヒトを哺乳類 を含むでなる、いずれのアルツハイマー病のいずれの動物モデルにも関する。 上記のように、上記のベクターの使用によって、極めて有利な方法で、信頼性 がありかつ使用し易い、アルツハイマー病の動物モデルを調製することが可能に なる。さらに具体的には、これらのモデルでは、組換えアデノウイルスは注入に よって、なおさらに好適には、中枢神経系中への直接注入によって投与される。 投与のこの様式は、ベクターを、迅速にかつ効率的にかつ生体の残余部中に散在 されることなく神経細胞に実質的に感染させることができるから、特に有利であ る。 中枢神経系中への直接注入は好適には、定位的注入のための装置を使用して行 われる。従って、この種の装置を使用すると、注入部位は、実 施例で示されるように、高い正確度をもって目標を定めることができる。 有利的には、組換えアデノウイルスは、溶液の形態特に無菌の等張溶液の形態 か、または場合により滅菌水もしくは生理食塩の付加によって注入溶液を作成す ることができる、乾燥特に凍結乾燥した組成物の形態で投与される。 注入に使用される欠陥組換えアデノウイルスの投与量および注入の回数は種々 のパラメーターによって、特に使用される投与様式、使用される動物などによっ て調節することができる。一般的に、本発明による組換えアデノウイルスは、１ ０⁴〜１０¹⁴ｐｆｕ／ｍｌ、好適には１０⁶〜１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの投与量の形態 に配合され、投与される。用語ｐｆｕ（「プラーク形成単位」）は、ウイルス溶 液の感染力を示し、適切な細胞培養物に感染させ、一般的に４８時間後、感染細 胞のプラーク数を測定することによって決定される。ウイルス溶液のｐｆｕ力価 を決定する技術は文献に十分に記載されている。 状況によって、注入の回数は１〜５回の間で変えることができる。 好適には、組換えアデノウイルスは、１〜２５週令、好適には４〜２０週令の 動物に投与される。さらに好適には、注入は８〜１０週令の動物に行われる。 本発明によるモデルを調製するのに使用される非ヒト哺乳類は有利的には齧歯 類のうちから選ばれる。さらに好適には、哺乳類はマウス、ラット、モルモット またはウサギである。しかし、レムールのような他の動物も使用することができ る。 本発明にはまた、アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコードしている ＤＮＡ配列を含有する組換えアデノウイルスを非ヒト哺乳類に 投与することによって、アルツハイマー病の動物モデルを調製する方法が記載さ れる。 本発明はまた、アルツハイマー病に関して活性である化合物または組成物を検 出する方法、即ち前記化合物または前記組成物を上記のような動物に投与し、そ して組換えアデノウイルスによって誘発された症状に対するその活性を決定する 方法に関する。 有利的には、化合物または組成物は経口的、局所的、非経口的、鼻腔内的、静 脈内的、筋肉内的、皮下的、眼内的または経皮的経路によって投与される。 本発明はまた、アルツハイマー病に関して活性であり、そして上記の方法によ って得られるものであればいずれの化合物または組成物をも包含する。 以下の実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、それらは本発明を説 明するためのものであって制限するものではない。図面の説明 図１：ベクターｐＸＬ２２４４の表示。 図２：ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５の表示。一般分子生物学的技術 分子生物学で使用される標準方法、例えば、プラスミドＤＮＡの予備抽出、塩 化セシウム勾配中でのプラスミドＤＮＡの遠心分離、アガロースまたはアクリル アミドゲル上の電気泳動、電気溶出（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｎ）によるＤ ＮＡフラグメントの精製、フェノールまたはフェノール／クロロホルムによるプ ロテインの抽出、食塩媒体中でのエタノールまたはイソプロパノールによるＤＮ Ａの沈殿、大腸菌（Ｅｓｃ ｈｅｒｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の形質転換などは当業者に良く知られていて、文献 に十分に記載されている［Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．等，「分子クローニング−実 験操作法」“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ”，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｕｓｕｂ ｅｌ Ｆ．Ｍ．等編，「分子生物学における現在のプロトコール」“Ｃｕｒｒｅ ｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｊ ｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７］。 ｐＢＲ３２２とｐＵＣ型のプラスミド、およびＭ１３系列のファージは市販品 から得た（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ） 。 連結の場合、ＤＮＡフラグメントをそれらの大きさに従って、アガロースまた はアクリルアミドゲル中の電気泳動によって分離し、フェノールおよび／または フェノール／クロロホルム混合物により抽出し、エタノールにより沈殿させ、次 いでファージＴ４のＤＮＡ配列リガーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で供給者の 推奨基準に従ってインキュベートした。 突出５′末端は、大腸菌のＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメント（Ｂ ｉｏｌａｂｓ）を使用して供給者の推奨基準に従って充填することができる。突 出３′末端は、調製者の推奨基準に従って使用されるファージＴ４のＤＮＡポリ メラーゼ（Ｂｉｏｌａｂｓ）の存在下で切断される。突出５′末端はヌクレアー ゼＳ１による注意深い処理によって切断される。 合成オリゴデオキシヌクレチドを使用する試験管内の部位特異的突然変異誘発 は、Ｔａｙｌｏｒ等［Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，１３（１９８５） ８７４９−８７６４］によって開発された方法に従って、Ａｍｅｒｓｈａｍ社に よって販売されているキットを使用して行うことができる。 ＰＣＲと呼称される技術によるＤＮＡフラグメントの酵素的増幅［ポリメラー ゼ触媒連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ−ｃａｔａｌｙｓｅｄ ｃｈａｉｎ ｒ ｅａｃｔｉｏｎ），Ｓａｉｋｉ Ｒ．Ｋ．等、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３０（１９８ ５）１３８５−１３５４；Ｍｕｌｌｉｓ Ｋ．Ｂ．とＦａｌｏｏｎａ Ｆ．Ａ． ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍ．，１５５（１９８７）３３５−３５０］は、ＤＮＡ熱 サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ社）を使用して調製者の推 奨基準に従って行うことができる。 ヌクレオチドの配列決定はＳａｎｇｅｒ等［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４（１９７７）５４６３−５４６７］によって開発された方 法を使用して確認することができる。実施例 実施例１ ． ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５の構築 この実施例では、ラウス肉腫ウイルスのＬＴＲ（ＲＳＶ ＬＴＲ）からなるプ ロモーターの制御下の、アミロイドペプチド前駆物質ＡＰＰ６９５をコードする ＤＮＡ配列を含有するベクターの構築が記載される。 １．１． 出発ベクター： −ベクターｐＸＬ２２４４：プラスミドｐＸＬ２２４４は、ＲＳＶウイルスの ＬＴＲプロモーターの制御下のＡｐｏＡＩのｃＤＮＡ、並びに Ａｄ５アデノウイルスからの配列を含有する（図１）。それは、ｐｒｅｐｒｏＡ ｐｏＡＩをコードしているｃＤＮＡを含有するＣｌａＩ−ＥｃｏＲＶフラグメン トを、同一の酵素によって消化されたベクターｐＬＴＲ ＲＳＶ−βｇａｌ（Ｓ ｔｒａｔｆｏｒｄ−Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ等，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ． ，９０（１９９２）６２６）中に挿入することによって構築した。 −ベクターｐＡＶｋ３ ＡＰＰ６９５：このベクターはアミロイドペプチド前 駆物質の６９５アイソフォーム（Ｄｒ．Ｊ．Ｎ．Ｏｃｔａｖｅによって供与され た）をコードする配列を含有する（Ｋａｎｇ等、上記）。 １．２．ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５の構築 この実施例では、ＲＳＶウイルスのＬＴＲの制御下の、アミロイドベプチド前 駆物質の６９５アイソフォームをコードしている配列並びに生体内での組換えを 可能にするＡｄ５アデノウイルスからの配列を含有するベクターｐＳｈ−Ａｄ− ＡＰＰ６９５の構築が記載される。 ベクターｐＳＶＫ３ ＡＰＰ６９５は酵素ＥｃｏＲＶとＳａｌＩによって消化 した。次いで、アミロイドペプチド前駆物質の６９５アイソフォームをコードし ている配列を含有する２ｋｂのＥｃｏＲＶ−ＳａｌＩフラグメントを単離し、Ｌ ＭＰ（「低融点」）アガロースゲル上での電気泳動によって精製した。平行して 、ベクターｐＸＬ２２４４を制限酵素ＣｌａＩによって処理した（部位は図１中 の位置１０８９にある）。次いで、末端を、ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラ グメントの存在下でそれらを処理することによって平滑にした。次いで、ベクタ ーを酵素ＳａｌＩによって消化した（部位は図１中の位置１９３０にある）。次 い で、得られた７ｋｂの線状ベクターを単離し、ＬＭＰアガロースゲル上の電気泳 動によって精製した。次いで、こうようにして得られた２ｋｂと７ｋｂとのフラ グメントを連結して、ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５を生成させた（図２ ）。実施例２ ． ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５の機能的能力 ベクターｐＳＨ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５が細胞培養物中でＡＰＰの６９５アイソ フォームを発現する能力は，ＣＯＳ１細胞の一過性トランスフェクションによっ て示された。このためには、細胞（１０ｃｍ径のデッシュ当たり１０⁶細胞）を トランスフェクタンの存在下でトランスフェクトした（８μｇのベクター）。７ ２時間後、総プロテインと分泌プロテインをウエスタンブロット法によって分析 した。これを行うために、プロテインをそれらの大きさに従ってポリアクリルア ミドゲル上の電気泳動によって分離し、次いでニトロセルロース膜に移した。次 いで、ＡＰＰの存在を、特異的抗体２２Ｃ１１（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ社）を使 用してＥＣＬ法（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）による免疫学的方法によって確認した。実施例３ ． アデノウイルスＡｄ−ＡＰＰ６９５の構築 ベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５を線状化して、欠失アデノウイルスベク ターと共に、アデノウイルスＥ１領域（Ｅ１Ａと１Ｂ）によってコードされた機 能を完全に与えるヘルパー細胞（細胞株２９３）中にコトランスフェクトした。 さらに詳しくは、Ａｄ−ＡＰＰ６９５アデノウイルスは、変異株アデノウイルス Ａｄ−ｄ１１３２４（Ｔｈｉｍｍａｐｐａｙａ等，Ｃｅｌｌ，３１（１９８２） ５４３）とベクターｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５との間の生体内の相同的組換え によって、以下 のプロトコールに従って得られた。即ち、酵素ＣｌａＩによって線状化した、プ ラスミドｐＳｈ−Ａｄ−ＡＰＰ６９５とアデノウイルスＡｄ−ｄ１１３２４とを 、相同的組換えが起こることができるために、リン酸カルシウムの存在下で、細 胞株２９３中にコトランスフェクトさせた。このようにして生成した組換えアデ ノウイルスはプラーク精製によって選択された。単離した後、組換えアデノウイ ルスのＤＮＡを細胞株２９３中で増幅し、約１０¹⁰ｐｆｕ／ｍｌの力価を有する 未精製の欠陥組換えアデノウイルスを含有する培養上澄液を得た。 次いでウイルス粒子を、塩化セシウム勾配中の遠心分離によって、既知の技術 に従って（特に、Ｇｒａｈａｍ等，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，５２（１９７３）４５６ ）精製した。アデノウイルスＡｄ−ＡＰＰ６９５は２０％グリセロール中で−８ ０℃で貯蔵することができる。実施例４ ． アデノウイルスＡｄ−ＡＰＰ６９５の機能的能力 細胞培養物中でＡＰＰの６９５アイソフォームを発現するアデノウイルスＡｄ −ＡＰＰ６９５の能力は、細胞株２９３の細胞を感染させることによって示され た。次いで、細胞中のＡＰＰの存在は実施例２と同一の条件下で決定された。 これらの研究から、アデノウイルスは細胞培養物中でＡＰＰの６９５変種を良 く発現することができることが示される。実施例５ ． 動物モデルの構築 この実施例では、ＡＰＰの６９５変種を発現することができるアデノウイルス を含有する、アルツハイマー病の動物モデルの構築について記載される。 実施例３で調製したアデノウイルスを精製形態で（３．５×１０⁶ｐ ｆｕ／μｌ）中で、リン酸食塩溶液（ＰＢＳ）中で使用する。 動物は、予め麻酔されて、中枢神経系中、さらに具体的には海馬と内側嗅皮質 中への直接注入によって調製される。注入は、ポンプに連結したカニューレ（外 径２８０μｍ）を使用して行う。注入の速度は０．５μｌ／分に固定され、その 後カニューレはさらに４分間その位置に保持された後、再び持上げられる。海馬 と内側嗅皮質中に注射される容量は１μｌである。注入されるアデノウイルスの 投与量は３．５×１０⁶ｐｆｕ／μｌである。 以下は、海馬中への注入の場合の定位的座標である：ＡＰ＝−２．０；ＭＬ＝ １．５；Ｖ＝−２．５（ＡＰとＭＬ座標はブレグマに関して決定され、他方Ｖ座 標はブレグマでの頭側骨の表面に関して決定される）。 以下は、内側嗅皮質中への注入の場合の定位的座標である：ＡＰ＝−３．５； ＭＬ＝３．５；Ｖ＝−３．７。 以下の注入を行う： −２週令の１１匹の雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウスには３．５×１０⁶ｐｆｕのア デノウイルスａｄ−ＡＰＰ／μｌを注入し、一方４週令のマウスには３．５×１ ０⁶ｐｆｕのアデノウイルスａｄ−ＡＰＰ／μｌ＋３．５×１０⁵ｐｆｕのアデノ ウイルスａｄ−βＧａｌ／μｌを注入する（Ｌｅ Ｇａｌ Ｌａ Ｓａｌｌｅ等 ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５９（１９９３）９８８）。 −２週令の５匹の雄性Ｃ５７Ｂ１／６マウスには３．５×１０⁶ｐｆｕのアデ ノウイルスａｄ−βＧａｌ／μｌを注入する。組織学的分析 脳内注入の部位でのＡＰＰ６９５の過発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓ ｉｏｎ）を免疫組織学によって経時的に（注入後７、１５、３０および６０日） 分析する。 動物を麻酔下で４％パラホルムアルデヒドの心臓内灌流によって犠牲にする。 死後硬直の除去の後（２時間）、頭脳をクリオマット中で薄片に切断する。４０ μｍ厚みの切片を緩衝液中に収集する。次いで、これらの浮遊する切片を、ＡＰ Ｐ６９５の免疫組織学的検出のために、特異的抗体、２２Ｃ１１（Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ社）で処理する（ストレプトアビジン／ビオチンペルオキシダーゼ法） 。 ＡＰＰ６９５の過発現を示す組織学的分析の外に、本発明の動物は、アルツハ イマー病に関連する脳病理の発生、例えば、拡散沈着物中またはプラーク中のβ −アミロイドプロテインの存在、神経原繊維変性および神経炎プラークの存在、 およびニューロンとシナプスの消失におけるこの過発現の効果を示すのに使用す ることができる。ＡＰＰ６９５の場合のように、ベーターＡ４、ＰＨＦ、ユビキ チンおよびＧＦＡＰの存在が免疫組織学によって決定される。この場合、免疫組 織学はパラフィン切片について行われ、頭脳は予め脱水してパラフィン中に封入 されている。行動分析 本発明の動物はまた、行動に対する、特に記憶増進の過程に対するＡＰＰ６９ ５の過発現の効果を示すのに使用することができる。この点において、水泳試験 （Ｒ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｊ．，Ｎｅｕｒｏｓｃ．Ｍｅｔｈ．，１１（１９８４）４ ７）によって、これらの過程の幾つかに対する、アデノ−ＡＰＰおよび適切には 試験される化合物または組成物を注入する効果を測定することが可能になる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，Ｃ Ｚ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 メルカン， リユク フランス・エフ−94100サン−モール・ア ベニユード マランビル14 (72)発明者 ペリコーデ， ミシエル フランス・エフ−28320エクロスヌ・リユ ドシヤルトル31 (72)発明者 プラデイエ， ローラン フランス・エフ−75014パリ・リユダレシ ヤ５ビス (72)発明者 ビニユ， エマニユエル フランス・エフ−94200イブリ−シユール −セーヌ・リユジヤン−ル−ガルー60

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコードしているＤＮＡ配列を 含有する欠陥組換えアデノウイルス。 ２．アデノウイルスが、標的細胞中で複製するために必要であるゲノムの領域 を欠損することを特徴とする請求の範囲１に記載のアデノウイルス。 ３．アデノウイルスがヒトＡｄ２型アデノウイルスもしくはヒトＡｄ５型アデ ノウイルスまたはイヌＣＡＶ−２型アデノウイルスであることを特徴とする請求 の範囲２に記載のアデノウイルス。 ４．異種ＤＮＡ配列が、ＡＰＰのいずれの天然または合成変種をもコードする ことを特徴とする請求の範囲１〜３のいずれか一項に記載のアデノウイルス。 ５．異種ＤＮＡ配列がＡＰＰ６９５、ＡＰＰ７５１またはＡＰＰ７７０をコー ドすることを特徴とする請求の範囲４に記載のアデノウイルス。 ６．異種ＤＮＡ配列が、その末端領域中で切断されているアミロイドペプチド 前駆物質をコードすることを特徴とする請求の範囲４に記載のアデノウイルス。 ７．ＤＮＡ配列が、それを動物の神経系中で発現させることができる発現シグ ナルの制御下にあり、その発現シグナルが好適にはウイルス起源のプロモーター のうちから選ばれることを特徴とする請求の範囲１〜６のいずれか一項に記載の アデノウイルス。 ８．発現シグナルがＥ１Ａ、ＭＬＰ、ＣＭＶおよびＲＳＶ ＬＴＲプロモータ ーのうちから選ばれることを特徴とする請求の範囲７に記載のアデノウイルス。 ９．欠陥組換えアデノウイルスが、ＲＳＶ ＬＴＲの制御下の、アミロイドペ プチド前駆物質の一つの形態をコードしているＤＮＡ配列を含有することを特徴 とする欠陥組換えアデノウイルス。 １０．アルツハイマー病の動物モデルを調製するための、請求の範囲１〜９の いずれか一項に記載のアデノウイルスの使用。 １１．アルツハイマー病の動物モデルが、請求の範囲１〜９のいずれか一項に に記載の組換えアデノウイルスを含有する非ヒト哺乳類であることを特徴とする アルツハイマー病の動物モデル。 １２．組換えアデノウイルスが注入によって投与されることを特徴とする請求 の範囲１１に記載の動物モデル。 １３．組換えアデノウイルスが注入によって中枢神経系中に投与されることを 特徴とする請求の範囲１２に記載の動物モデル。 １４．組換えアデノウイルスが、定位的な注入のための装置の助力を用いて、 中枢神経系中に注入によって投与されることを特徴とする請求の範囲１３に記載 の動物モデル。 １５．組換えアデノウイルスが、１〜２５週令、好適には４〜２０週令である 動物に投与されることを特徴とする請求の範囲１１〜１４のいずれか一項にに記 載の動物モデル。 １６．組換えアデノウイルスが、無菌でかつ部分的に精製された溶液の形態で 投与されることを特徴とする請求の範囲１１〜１５に記載の動物モデル。 １７．非ヒト哺乳類が齧歯類のうちから選ばれることを特徴とする請求の範囲 １１〜１６のいずれか一項にに記載の動物モデル。 １８．動物モデルがマウス、ラット、モルモット、レムーレ（ｌｅｍ ｕｒｅ）またはウサギであることを特徴とする請求の範囲１７に記載の動物モデ ル。 １９．アミロイドペプチド前駆物質の一つの形態をコードしているＤＮＡ配列 を含有する組換えアデノウイルスが、非ヒト哺乳類に投与されることを特徴とす るアルツハイマー病の動物モデルを調製する方法。 ２０．アルツハイマー病に関して活性である化合物または組成物を検出する方 法であって、前記化合物または前記組成物が請求の範囲１１〜１８のいずれか一 項に記載の動物に投与され、そして組換えアデノウイルスによって誘発された症 状（ｅｆｆｅｃｔ）に対するその活性が決定されることを特徴とする化合物また は組成物の検出方法。 ２１．化合物または組成物が、経口的、局所的、非経口的、鼻腔内的、静脈内 的、筋肉内的、皮下的、眼内的または経皮的経路によって投与されることを特徴 とする請求の範囲２０に記載の方法。 ２２．請求の範囲２０〜２１に記載の方法によって得られ、アルツハイマー病 に関して活性である化合物。 ２３．請求の範囲２０〜２１に記載の方法によって得られ、アルツハイマー病 に関して活性である組成物。