JP2002507384A - アデノウイルスベクターの製造方法、それによって製造したベクターおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 転写因子ＭＡＺおよびＳｐ１のための多数の結合部位が、ＤＮＡ分解酵素Ｉ保護実験により５型アデノウイルスの主要後期プロモータ内に特定された。このプロモータの基部領域において、ＭＡＺおよびＳｐ１は両方ともＴＡＴＡボックスに接するＧＣ富裕配列と相互反応する。２つのＭＡＺ結合部位は、転写開始部位に対して−１８および−３６に集中する。Ｓｐ１は−１８ＧＣ富裕配列にのみ結合した。プロモータの遠位部領域にもまたいくつかの相互作用部位が存在した。ＭＡＺおよびＳｐ１は両方とも−１６６に集中する配列と相互作用し。ＭＡＺは−１３０に集中する別の部位と弱く結合した。ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発現は、一過性発現アッセイで主要後期プロモータからの発現を活性化させた。主要後期プロモータのＧＣ富裕配列の変異分析によって、ＭＡＺ活性化の主要標的はＴＡＴＡ配列に接するＧＣ富裕配列であり、一方、Ｓｐ１は遺伝子発現を刺激するために遠位部ＧＣ富裕配列成分を必要とすることが示唆された。この活性化は、アデノウイルスＥ１Ａ蛋白質によって強化され、さらに、Ｅ１Ａと両転写因子との間の相互作用の証拠が免疫沈澱アッセイを用いて得られた。ＭＡＺおよびＳｐ１による活性化もまた、標的として完全な５型アデノウイルスゲノムを用いたトランスフェクション実験で観察された。Ｌ１およびＬ５両領域からの後期ｍＲＮＡレベルの増加は、ＭＡＺまたはＳｐ１発現プラスミドがウイルスＤＮＡとともにトランスフェクトされたときに観察された。予想に反して、ＭＡＺおよびＳｐ１による主要後期プロモータの活性化は、ウイルスＤＮＡが複製できるか否かにかかわらず検出された。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願の基礎となる研究は、米国立癌研究所のグラント番号ＣＡ３８９６５に
より部分的に補助された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。発明の属する技術分野 本発明は一般にベクターの製造に関し、より具体的にはアデノウイルスベクタ
ーの製造、このベクターによるウイルス粒子の製造、さらに、興味のある特定の
ＤＮＡを挿入するために、このベクターで細胞を核酸感染（トランスフェクト）
させてベクター含有細胞を製造することに関する。本発明は転写因子ＭＡＺおよ
びＳｐ１を利用してアデノウイルスの主要後期プロモータ(major late promoter
, ＭＬＰ）を活性化させる。順をおってＭＬＰを活性化することによって、アデ
ノウイルスゲノムの２つの末端セグメント（これは挿入された任意の非アデノウ
イルスＤＮＡと接する）を含むベクターが複製、増幅および被包化収納される。
したがって、本発明はまた、治療用蛋白質、アンチセンスＲＮＡ、およびリボザ
イム（これらのコード配列は、ベクター内の上記アデノウイルスゲノム配列と接
している）のin vivo発現系に関する。

【０００２】従来技術 アデノウイルス主要後期プロモータ（ＭＬＰ）は、ウイルスの構造蛋白質の大
半およびいくつかの非構造蛋白質をコードする主要後期転写ユニットの発現を制
御する（文献２２に概説）。ＭＬＰは感染初期および後期で活性を示すが、ＤＮ
Ａ複製の開始後に最大活性に達する。遺伝的および生化学的研究によって、多数
の転写因子結合部位および発現を調節する対応するＤＮＡ結合蛋白質がＭＬＰで
特定された。これらには、ＴＡＴＡボックス結合蛋白質（ＴＢＰ）およびＴＦＩ
ＩＤ複合体（ＴＡＴＡ成分と結合する）、−５０のＵＳＦ／ＭＬＴＦ結合部位、
−７０近くのＣＡＡＴボックス、＋１のイニシエーター部位、並びに、細胞因子
とウイルスＩＶａ２蛋白質を含む蛋白質複合体と結合する下流成分が含まれる（
文献２２に概説）。これら因子結合部位の大半は多様なアデノウイルス血清タイ
プのＭＬＰで保存されていて、これらの部位が適切な転写調節に重要であるとい
う結論を有力視させる（図１および文献２５）。

【０００３】 ＭＬＰの興味深い構造的特性はＴＡＴＡボックス周辺のＧＣ富裕配列の存在で
ある（図１）。これらの配列は、ヒトのアデノウイルスおよび他のいくつかのア
デノウイルスで良好に保存されていて（図１および文献２５）、ＭＬＰに対する
これら配列の機能的重要性を暗示する。このＧＣ富裕成分はＡＴ塩基対で広範囲
に置換しても完全細胞抽出物での主要後期プロモータの活性を抑制しないが（２
９）、上流のＴＡＴＡ近傍のＧＣ富裕成分の変異はウイルス感染細胞でのＭＬＰ
の活性を低下させた（３）。さらに、Yuら（３０）は、ＴＡＴＡ近傍のＧＣ富裕
配列は、ＭＬＰが高次コイル形成プラスミドＤＮＡに存在するときヌクレアーゼ
感受性構造を形成することを見出したが、この観察の生理学的意義は明らかでは
ない。

【０００４】 我々は、これまで亜鉛フィンガー蛋白質ＭＡＺおよびＳｐ１によるＧＣ富裕プ
ロモータの転写調節に関心をもってきた（２０）。ＭＬＰのＧＣ富裕配列はＭＡ
ＺおよびＳｐ１の強力な結合部位であるので、プロモータと相互反応してその活
性を調節するこれらの因子の能力を調べていた。本明細書に示したこれらの結果
は、両因子はＭＬＰのＧＣ富裕配列と相互反応してＭＬＰ活性を刺激し、Ｅ１Ａ
蛋白質に反応することができることを示唆した。

【０００５】発明が解決しようとする課題 一般に本発明は、アデノウイルスベクター、特に２つの細胞性転写因子の過剰
発現によってそれら自身を複製できるベクターの製造に関する。 本発明は、アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配
列遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベ
クターを提供する。ある実施態様では、ベクターはさらにＥ１Ａ遺伝子を欠失し
ている。別の実施態様では、ベクターはさらにＥ１Ｂ遺伝子を欠失している。別
の実施態様では、ベクターはさらにアデノウイルスゲノムの領域内に１つまたは
２つ以上の転写因子の核酸の挿入を含む。ある実施態様では、転写因子はＭＡＺ
および／またはＳＰ１である。

【０００６】 本発明は以下の（ａ）−（ｃ）および適切な担体の希釈剤を含む医薬組成物を
提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントおよび直線状ア
デノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核酸を含むアデノウイル
スベクター、ここで末端セグメントはアデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸
およびパッケージング配列遺伝子を含み；（ｂ）アデノウイルスゲノムの複製開
始点の核酸とパッケージング配列遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを
含むヘルパーアデノウイルスベクター；および（ｃ）１つまたは２つ以上の転写
因子の核酸を含むベクター。

【０００７】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）で細胞をトランスフェクトさせ、それによっ
てアデノウイルス主要後期プロモータを活性化させることを含むアデノウイルス
主要後期プロモータ活性化方法を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノム
の末端セグメントおよび直線状アデノウイルスゲノムのそれら末端セグメントの
間に挿入された核酸を含むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントはア
デノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含み
；（ｂ）アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸とパッケージング配列遺伝子
を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベクター；
および（ｃ）１つまたは２つ以上の転写因子の核酸を含むベクター。ある実施態
様では、転写因子はＭＡＺおよび／またはＳＰ１である。また別の実施態様では
、本方法はさらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターで細胞をトラン
スフェクトすることを含む。

【０００８】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）で細胞をトランスフェクトし、それによって
ウイルス粒子を製造することを含む、問題の蛋白質をコードする核酸を含有する
ウイルス粒子の製造方法を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノムの末端
セグメントおよび直線状アデノウイルスゲノムのそれら末端セグメントの間に挿
入された核酸を含むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントはアデノウ
イルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含み；（ｂ
）アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を
欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベクター；お
よび（ｃ）転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。ある実施態様
では、転写因子はＭＡＺおよび／またはＳＰ１である。また別の実施態様では、
本方法はさらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターで細胞をトランス
フェクトすることを含む。別の実施態様では細胞はヒトの細胞である。

【０００９】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）および適切な希釈剤または担体を含む医薬組
成物を対象者に投与し、それによって対象者に遺伝子を挿入することを含む遺伝
子の治療方法を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメント
および直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核酸を含
むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントはアデノウイルスゲノムの複
製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含み；（ｂ）アデノウイルス
ゲノムの複製開始点の核酸とパッケージング配列遺伝子を欠失しているアデノウ
イルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベクター；および（ｃ）転写因子の
１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。ある実施態様では、転写因子はＭＡ
Ｚおよび／またはＳＰ１である。また別の実施態様では、本方法はさらにＥ１Ａ
遺伝子をコードする核酸を含む医薬組成物を投与することを含む。

【００１０】 当然のこととして、本発明は、所望の治療用蛋白質をコードする遺伝子を含有
するベクター、ヘルパーＤＮＡ配列を含有するベクターおよびＭＡＺおよび／ま
たはＳｐ１遺伝子を含有するベクターを製造するいくつかの手段を意図している
が、これらには本明細書で詳述するように既知の組換え技術が含まれ、したがっ
て、本発明はそのような合成製造物をも包含しようとするものである。

【００１１】 同様に、本発明は、適切なホスト細胞に挿入されたとき問題の蛋白質を発現す
ることができるウイルス粒子の製造、および治療のためにそのような構築物の細
胞への直接導入を達成する遺伝子治療にも及ぶ。 本発明の他の用途および利点は、以下の説明図に続く詳細な説明により当業者
には明らかとなろう。

【００１２】課題を解決するための手段 一般に本発明は、アデノウイルスベクター、特にアデノウイルス主要後期プロ
モータ（ＭＬＰ）と相互反応することが判明した２つの細胞性転写因子の過剰発
現によってそれら自身で複製することができるベクターの製造に関する。類似の
ＤＮＡ配列と相互反応する２つの細胞性転写因子のアデノウイルス主要後期プロ
モータ内の結合部位が特定された。これらの転写因子はＭＡＺおよびＳｐ１と称
される。本明細書で示すように、ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発現はアデノウイル
スの主要後期プロモータの活性を顕著に誘発し、両因子はアデノウイルスによっ
てコードされるＥ１Ａ転写活性化蛋白質と相互反応し、さらにそれら両因子はＥ
１Ａ蛋白質と協力して主要後期プロモータを活性化させることができる。完全な
アデノウイルスＤＮＡが細胞にトランスフェクトされ、アデノウイルスＤＮＡの
複製がヒドロキシウレアによって阻害された場合、ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発
現は、主要後期転写ユニットのＬ１およびＬ５領域によってコードされるｍＲＮ
Ａ蓄積を増進する。このウイルスゲノム領域の発現にＤＮＡ複製が通常は要求さ
れるので、Ｌ５ＲＮＡ蓄積の増進は予想に反していた。

【００１３】 上記で述べたように、ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発現が予想に反してＬ５ＲＮ
Ａの蓄積を活性化させることができるということが観察されたので、それ自身で
複製できないアデノウイルスベクターを補足させる実験を企画した。直線状アデ
ノウイルス染色体の末端由来の短いＤＮＡセグメント（数百塩基対）を含有する
ベクターＤＮＡ分子を調製する。これらの末端セグメントはアデノウイルスのＤ
ＮＡ複製開始点（ベクターＤＮＡ分子の複製と増幅に必要）およびパッケージン
グ配列（ベクターＤＮＡ分子のウイルス粒子内への被包化収納に必要）を含む。
非アデノウイルスＤＮＡ（例えば治療用蛋白質をコードするＤＮＡ）はアデノウ
イルスゲノムのこれら２つの末端セグメントの間に挿入される。正常なアデノウ
イルスとは対照的に、このアデノウイルスベクターは、ウイルスＤＮＡの複製お
よびウイルス粒子内へのその集合組立（アッセンブリー）に必要な生成物をコー
ドするアデノウイルス遺伝子の全てを欠いているためにヒトの細胞で増殖できな
い。末端配列（ベクター分子に存在する）を除くアデノウイルスゲノムの全てを
含有するヘルパーＤＮＡ分子を製造する。このヘルパーＤＮＡ分子は、ベクター
ＤＮＡの複製および被包化収納に必要なトランス作用性機能の全てを提供するで
あろう。ヘルパーＤＮＡそれ自体は、複製開始点を欠いているために複製および
増幅が不能で、パッケージング配列を欠いているためにウイルス粒子中にパッケ
ージングされず、さらに２種のＤＮＡが、効率的相同的組換えのために必要な共
通配列を共有していないためにベクターＤＮＡと効率的に組換えを起こすことが
できない。

【００１４】 ベクターおよびヘルパーＤＮＡを混合してヒトの細胞（通常アデノウイルスが
複製できる）にトランスフェクトした場合、ほとんどまたは全くベクター粒子は
生成されない。なぜならば、ヘルパーＤＮＡは複製されず、したがって主要後期
転写ユニット内でコードされる遺伝子生成物の全てが発現されないからである。
主要後期プロモータの完全な発現の活性化のため、および主要後期転写ユニット
の" 下流"部分によってコードされるＬ３、Ｌ４およびＬ５族ｍＲＮＡの蓄積を 誘発するために複製が必要であることが示された（Shenk(1996）で概説）。しか
しながら、上記で特記したように、ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発現は予想に反し
て、ＤＮＡ複製がなくてもアデノウイルス主要後期転写ユニットの下流部分から
生じるＲＮＡの蓄積を活性化することができることが現時点で判明した。したが
って、これらの結果によって、ベクターおよびヘルパーＤＮＡがＭＡＺおよび／
またはＳｐ１をコードするプラスミドと一緒に、アデノウイルスが複製できるヒ
トの細胞にトランスフェクトされる場合、ベクターＤＮＡは複製し、さらにウイ
ルス粒子にパッケージングされるであろうと予想される。ヘルパーＤＮＡが複製
されなくとも、ＭＡＺおよび／またはＳｐ１はヘルパー内の主要後期ユニットの
発現を活性化させるためにベクターは複製される。ヘルパーＤＮＡによってコー
ドされるウイルス性生成物は、ベクターＤＮＡの複製およびウイルス粒子へのパ
ッケージングを可能にする。トランスフェクションを成功させるために、非常に
効率的にトランスフェクすることができる細胞株を用いなければならない。この
要求に適合する２９３細胞クローンがある。

【００１５】 本発明にしたがって、当技術分野で通常の分子生物学、微生物学および組換え
ＤＮＡ技術を用いることができる。そのような技術は文献で完全に説明されてい
る。例えば以下の文献を参照されたい：Sambrook et al., "Molecular Cloning:
A Laboratory Manual"(1989); "Current Protocols in Molecular Biology" Vo
lumes I-III [R.M. Ausubel, ed.(1994)]; "Cell Biology: A Laboratory Handb
ook" Volumes I-III[J.E. Celis, ed.(1994)]; "Current Protocols in Immunol
ogy" Volumes I-III[J.E. Coligan ed.(1994)]; "Oligonucleotide Synthesis"
(M.J. Gait ed.(1984)); "Nucleic Acid Hybridization"[B.D. Hames & S.J. Hi
ggins eds.(1985)]; "Transcription and Translation"[B.D. Hames & S.J. Hig
gins, eds.(1984)]; "Animal Cell Culture"[R.I. Freshney, ed.(1986)]; "Imm
obilized Cells and Enzymes"[IRL Press, (1986)]; B.perbal, "A Practical G
uide to Molecular Cloning"(1984)。

【００１６】 " レプリコン"とは、in vivoで自律的ＤＮＡ複製ユニット（すなわちそれ自体
の制御にしたがって複製できる）として機能する一切の遺伝的成分（すなわちプ
ラスミド、染色体、ウイルス）である。" ベクター"は、プラスミド、ファージ またはコスミドのようなレプリコンで、それに別のＤＮＡセグメントを結合させ
て、この結合セグメントの複製を惹起させることができる。

【００１７】 " ＤＮＡ"とは、一本鎖形または二本鎖螺旋を有するデオキシリボヌクレオチ ド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形を指す。この用
語は、この分子の一次または二次構造のみを指し、特定の三次元構造に限定され
ない。したがってこの用語は、とりわけ直鎖状ＤＮＡ分子（例えば制限フラグメ
ント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体で見出される二本鎖ＤＮＡを含む。
特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を考察する場合、配列は、ＤＮＡの非転写鎖（す
なわちｍＲＮＡと相同な配列を有する鎖）に沿って５'から３'方向の配列のみを
示す通常の方法にしたがって本明細書では記載されている。 " 複製開始点"とは、ＤＮＡ合成に加わるＤＮＡ配列を指す。

【００１８】 ＤＮＡ" コード配列"とは、適切な調節配列の制御下に置かれたとき、転写さ れポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コード配列の境界は５' （アミノ）末端の開始コドンおよび３'（カルボキシ）末端の翻訳終止コドンに よって定められる。コード配列には原核細胞の配列、真核細胞ｍＲＮＡ由来のｃ
ＤＮＡ、真核細胞（例えば哺乳類細胞）ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列、および
合成ＤＮＡ配列が含まれるが、ただしこれらに限定されない。ポリアデニル化シ
グナルおよび転写終止配列は、通常はコード配列の３'側に位置している。 転写および翻訳制御配列は、ＤＮＡ調節配列（例えばプロモータ、エンハンサ
ー、ポリアデニル化シグナル、ターミネータなど）で、これらはホスト細胞での
コード配列の発現のために備えられる。

【００１９】 " プロモータ配列"は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３'方向
）のコード配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明
を明らかにするために、プロモータ配列は、転写開始部位によってその３'末端 の境界が仕切られ、上流（５'方向）に伸長し、バックグラウンドを越えるレベ ルで転写を開始させるために必要な最小限の塩基または成分を含む。プロモータ
配列内で、転写開始部位（ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって簡便に限
定される）は、ＲＮＡポリメラーゼの結合に必要な蛋白質結合ドメイン（コンセ
ンサス配列）と同様に見出されるであろう。真核細胞プロモータは、しばしば（
常にというわけではない）" ＴＡＴＡ"ボックスおよび" ＣＡＴ"ボックスを含む
。原核細胞プロモータは、−１０および−３５コンセンサス配列の他にシャイン
＝ダルガーノ配列を含む。これらプロモータには、細菌、酵母、昆虫または哺乳
類のプロモータが含まれる。プロモータの例には以下が含まれる：ＣＭＶ、ＨＭ
ＣＶ、ＳＶ４０およびＲＳＶ。

【００２０】 " 発現制御配列"は、別のＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する ＤＮＡ配列である。コード配列は、ＲＮＡポリメラーゼがこのコード配列をｍＲ
ＮＡに転写し、続いてこれがコード配列によってコードされる蛋白質に翻訳され
るとき、転写および翻訳制御配列の" 制御下"にある。 " シグナル配列"はコード配列の前に包含させることができる。この配列はポ リペプチドのＮ−末端側にシグナルペプチドをコードし、このペプチドは、ホス
ト細胞に情報を伝えて細胞表面にポリペプチドを誘導するか、または媒体中にポ
リペプチドを分泌させる。さらに、シグナルペプチドは、蛋白質が細胞を出る前
にホスト細胞によって切り取られる。シグナル配列は、原核細胞および真核細胞
に本来存在する多様な蛋白質に付随して見出される。

【００２１】 外因性または異種ＤＮＡが細胞内部に導入されたとき、細胞はそのようなＤＮ
Ａによって" 形質転換"されたという。形質転換ＤＮＡは、その細胞のゲノムを 構成している染色体ＤＮＡ中に組み込まれ（共有結合により連結され）てもよい
し、組み込まれてなくてもよい。例えば原核細胞、酵母および哺乳類細胞では、
形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソーム成分で維持されることもある。
真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが染色体に
組み込まれ、その結果、染色体の複製を介して娘細胞により形質転換ＤＮＡが受
け継がれる細胞である。この安定性は、形質転換細胞を含む娘細胞集団で構成さ
れた細胞株またはクローンを樹立する真核細胞の能力によって示される。" クロ
ーン"とは、ただ１つの細胞または共通の先祖から有糸分裂によって得られた細 胞集団である。" 細胞株"とは、何代にもわたってin vitroで安定に増殖できる 初代培養細胞のクローンである。

【００２２】 一定の長さのＤＮＡ配列で、少なくとも約７５％（好ましくは少なくとも約８
０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）のヌクレオチドが適合す
るとき、２つのＤＮＡ配列は" 実質的に相同"である。実質的に相同な配列は、 配列データバンクで利用できる標準的ソフトを用いるか、またはサザンハイブリ
ダイゼーションを用いて例えば具体的な系について規定されるように厳格な（ス
トリンジェントな）条件下で比較して特定できる。適切なハイブリダイゼーショ
ン条件を規定することは当技術分野で既知である。例えば以下を参照されたい:M
aniatis et al., 上掲書；DNA Clonig, Vols. I-II, 上掲書；Nucleic Acid Hyb
ridization, 上掲書。 少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なく
とも約９０または９５％）のアミノ酸残基が同一であるとき、または保存的置換
を示すとき、２つのアミノ酸配列は" 実質的に相同"である。

【００２３】 ＤＮＡ構築物の" 異種"領域とは、大きなＤＮＡ分子内で特定可能なＤＮＡセ グメントであって、自然の中ではこの大きな分子と結合した状態で見出されるこ
とがないものである。したがって、異種領域が哺乳類の遺伝子をコードする場合
、通常この遺伝子は本来の生物のゲノム内で哺乳類のゲノムＤＮＡと接していな
いＤＮＡと接するであろう。異種コード配列のまた別の例は、そのコード配列自
体が天然ではその中に存在しない構築物である（例えば、そのゲノムコード配列
がイントロンまたは天然と異なるコドンを有する合成配列を含むｃＤＮＡ）。対
立遺伝子座変種または天然に存在する変異現象は、本明細書で規定するＤＮＡ異
種領域を発生させない。

【００２４】 " 治療的に有効な量"という語句は、標的細胞集団のＳ期活性における臨床的 に顕著な変化、または他の病理的特徴（例えばそのような変化の存在および活性
に付随する血圧上昇、熱または白血球数の上昇）を防止するために、および好ま
しくは少なくとも約３０％、より好ましくは少なくとも５０％、最も好ましくは
少なくとも９０％減少させるために十分な量を指すために本明細書では用いられ
る。

【００２５】 ＤＮＡ配列は発現制御配列に" 機能的に連結"され、このとき当該発現制御配 列はこのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御および調節する。" 機能的に連結" という用語は、発現されるべきＤＮＡ配列の前に適切な開始シグナル（例えばＡ
ＴＧ）を有すること、並びに発現制御配列の制御下でこのＤＮＡ配列の発現およ
びこのＤＮＡ配列によってコードされる所望の生成物の産生を可能にするために
正確な読み枠を維持することを含む。組換えＤＮＡ分子に挿入することを所望す
る遺伝子が適切な開始シグナルを含まない場合は、そのような開始シグナルをこ
の遺伝子の前に挿入することができる。

【００２６】 本発明は主に、非アデノウイルス性ＤＮＡ配列を含むアデノウイルス性ベクタ
ーを治療として使用することに関する。このベクターは直線状のアデノウイルス
染色体の末端に由来する２つの短いＤＮＡセグメント（数百塩基対）を含有し、
このセグメントは、アデノウイルスの複製開始点（ベクターＤＮＡ分子の複製お
よび増幅に必要）およびパッケージング配列（ベクターＤＮＡ分子をウイルス粒
子に被包化収納するために必要）を含み、任意の非アデノウイルス性ＤＮＡ配列
と接している。ヘルパーＤＮＡ分子（ベクター分子に存在する末端配列を除く全
てのアデノウイルスゲノムを含有する）は、ベクターＤＮＡの複製および被包化
収納に必要なトランス作用性機能の全てを提供する。ＭＡＺおよび／またはＳｐ
１および／またはＥ１Ａのin vivoもしくはin vitro発現は、アデノウイルスの 主要後期プロモータ、または配列番号：１−１５の配列（これらはヘルパーＤＮ
Ａに含まれる）のいずれかを活性化させ、したがって所望の治療用ＤＮＡ配列を
含有するベクターの複製、増幅および被包化収納を惹起させるであろう。

【００２７】 ある実施態様では、本発明は、本明細書で述べるアデノウイルス構築物および
転写因子（ＭＡＺ、Ｓｐ１およびＥ１Ａ）を用いて任意の治療用蛋白質もしくは
治療用アンチセンスＲＮＡ配列または治療用リボザイムを発現させる方法のよう
な遺伝子治療を包含する。 本発明は、直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントおよびこの直線状ア
デノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核酸を含むアデノウイル
スベクターを提供し、ここで末端セグメントは、アデノウイルスゲノムの複製開
始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含む。ある実施態様では、アデノ
ウイルスベクターは５型アデノウイルスである。本明細書で意図されるように、
この核酸は蛋白質、アンチセンスＲＮＡ、またはリボザイムをコードする。蛋白
質は興味をもたれる任意の治療用蛋白質であろう。さらに、ベクターは選別可能
なマーカーを含む。選別可能マーカーはベータガラクトシダーゼまたはベータラ
クタマーゼである。

【００２８】 本発明は、アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配
列遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベ
クターを提供する。ある実施態様では、ベクターはさらにＥ１Ａ遺伝子が欠失し
ている。別の実施態様では、ベクターはさらにＥ１Ｂ遺伝子が欠失している。別
の実施態様では、さらにベクターは、アデノウイルスゲノム内に１つまたは２つ
以上の転写因子核酸の挿入を含む。ある実施態様では、転写因子はＭＡＺおよび
／またはＳＰ１である。本発明では、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子領域内の核酸の
欠失は、完全な核酸配列の欠失であるか、またはこの遺伝子の機能を失わせるた
めに十分な欠失であることが意図されている。ＭＡＺおよびＳＰ１は、ＭＡＺお
よびＳＰ１（すなわち転写因子として）の機能的活性をもつ、任意のおよび全て
のその類似体、フラグメント、同族体、変異体または変種を指す。

【００２９】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）および適切な希釈剤または賦形剤を含む医薬
組成物を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントおよび
この直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核酸を含む
アデノウイルスベクター、ここで末端セグメントは、アデノウイルスゲノムの複
製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含み；（ｂ）アデノウイルス
ゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を欠失しているアデ
ノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベクター；および（ｃ）転写因
子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。

【００３０】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）で細胞をトランスフェクトし、それによって
アデノウイルスの主要後期プロモータを活性化させることを含むアデノウイルス
主要後期プロモータの活性化方法を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノ
ムの末端セグメントおよびこの直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの
間に挿入された核酸を含むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントは、
アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含
み；（ｂ）アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列
遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベク
ター；および（ｃ）転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。ある
実施態様では転写因子はＭＡＺおよび／またはＳＰ１である。別の実施態様では
、本方法はさらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターで細胞をトラン
スフェクトすることを含む。

【００３１】 本発明は、問題の蛋白質をコードする核酸を含むウイルス粒子を製造する方法
を提供する。本方法は、以下の（ａ）−（ｃ）をで細胞をトランスフェクトし、
それによってウイルスを製造することを含む：（ａ）直線状アデノウイルスゲノ
ムの末端セグメントおよびこの直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの
間に挿入された核酸を含むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントは、
アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含
み；（ｂ）アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列
遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベク
ター；および（ｃ）転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。ある
実施態様では転写因子はＭＡＺおよび／またはＳＰ１である。別の実施態様では
、本方法はさらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターで細胞をトラン
スフェクトすることを含む。

【００３２】 本発明は、以下の（ａ）−（ｃ）および適切な希釈剤または賦形剤を含む医
薬組成物を対象者に投与し、それによって対象者に遺伝子を挿入すること含む遺
伝子治療の方法を提供する：（ａ）直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメン
トおよびこの直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核
酸を含むアデノウイルスベクター、ここで末端セグメントは、アデノウイルスゲ
ノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含み；（ｂ）アデノ
ウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を欠失して
いるアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウイルスベクター；および（ｃ
）転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター。ある実施態様では転写
因子はＭＡＺおよび／またはＳＰ１である。別の実施態様では、本方法はさらに
Ｅ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含む医薬組成物を投与することを含む。

【００３３】 さらに本ベクターは、以下を含む（ただしこれらに限定されない）他のサイト
カインまたは増殖因子と一緒に投与できる：ＩＦＮγまたはα、ＩＦＮ−β；イ
ンターロイキン（ＩＬ）１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−
１２；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α、ＴＮＦ−β；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−
ＣＳＦ）；顆粒球／マクロファージＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；付属分子（インテ
グリン上科に属するものおよびＩｇ上科に属するものを含み、例えばＬＦＡ−１
、ＬＦＡ−３、ＣＤ２２およびＢ７−１、Ｂ７−２並びにＩＣＡＭ−１Ｔ細胞副
刺激因子であるが、ただしこれらに限定されない）。本発明では、アデノウイル
スベクターは化学療法または放射線療法と同様に併用して使用するすることも意
図される。ＤＮＡ損傷薬剤または因子は当業者には知られており、細胞に用いた
ときＤＮＡ損傷を誘発する化学物質または治療方法の一切を指す。そのような薬
剤および因子にはＤＮＡ損傷を誘発する照射および波動、例えばγ線照射、Ｘ線
、ＵＶ照射、マイクロ波、電子照射などが含まれる。

【００３４】 本発明の好ましい実施態様では、２９３細胞がトランスフェクトされ、ヘルパ
ーＤＮＡはアデノウイルスＥ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子を欠失しているであろう（
Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子は腫瘍原性で、アデノウイルス核酸感染２９３細胞に
存在し発現される）。この系のデザインがベクターＤＮＡとヘルパーＤＮＡの組
換えを防止できるとしても、Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ遺伝子をヘルパーから分離し、
その結果ベクターの増殖時に野性型アデノウイルスが生成されるためには２つの
別個の組換え事象が要求されるとことになるということはこのベクター系に安全
性と利点を付加するであろう。

【００３５】 さらに別の実施態様ではベクター増殖系の変型が示されるであろう。これはＭ
ＡＺおよび／またはＳｐ１遺伝子のヘルパー構築物へのクローニングおよびヘル
パーＤＮＡではなくヘルパーウイルスの使用を含む。 さらに別の実施態様では、アデノウイルスＬ４−１００ｋＤａ蛋白質の発現は
プラスミドまたは２９３細胞のゲノム内から指令される。なぜならば、この蛋白
質は後期ウイルスｍＲＮＡの効率的な翻訳に必要で（文献３１で概説）、その構
造性発現は、ヘルパーウイルスによってコードされるｍＲＮＡによる蛋白質の生
産を強力に高めるからである。

【００３６】 また別の特徴では、本発明は、転写因子ＭＡＺおよびＳｐ１をコードする遺伝
子の使用、およびアデノウイルスのＭＬＰを活性化するためにそれらの遺伝子生
成物を使用することを包含する。さらに別の特徴では、ＭＡＺおよびＳｐ１を用
いて上記のようにヘルパーＤＮＡのＭＬＰを活性化し、したがって治療用蛋白質
をコードするＤＮＡを含むベクターを含有するアデノウイルス粒子の複製および
被包化収納を上記のように刺激することができる。

【００３７】 本明細書で用いられるように、" 医薬組成物"とは、適切な希釈剤、保存料、 可溶化剤、乳化剤、アジュバントおよび／または賦形剤と混合された治療的に有
効な量のベクター指す。本明細書で用いられる" 治療的に有効な量"とは、ある 症状および投与計画について治療効果を提供する量を指す。そのような組成物は
液体または凍結乾燥されているか、そうでなければ乾燥薬剤で以下を含む：種々
の緩衝成分を含む希釈剤（例えばトリス−ＨＣｌ、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液）
、ｐＨ、イオン強度、表面に吸収されるのを防止するアルブミンまたはゼラチン
のような添加物、洗剤（例えばトゥイーン２０、トゥイーン８０、プルロニック
Ｆ６８、胆汁酸塩）、可溶化剤（例えばグリセロール、ポリエチレングリコール
）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存料（例
えばチオメロサール、ベンジルルコール、パラベン）、膨張剤または張度改変剤
（例えばラクトース、マンニトール）、ポリエチレングリコールのようなポリマ
ーの蛋白質への共有結合、金属イオンとの複合化、または材料の以下の調製物へ
の取り込み；ポリマー化合物（例えばポリ乳酸、ポリグリコール酸、ヒドロゲル
など）の粒子化調製物、またはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、一
層または多層小胞、赤血球ゴーストまたはスフェロプラスト。そのような組成物
は、物理的状態、可溶性、安定性、in vivo放出速度、およびin vivoクリアラン
スに影響を与えるであろう。制御放出組成物または徐放性組成物には親油性蓄積
体（例えば脂肪酸、ワックス、油）製剤が含まれる。さらに本発明に包含される
ものはポリマー（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）被覆粒子化組成物で
ある。本発明の組成物の他の実施態様では、粒状形に保護被覆、種々の投与ルー
ト（非経口、経肺、経鼻、および経口ルートを含む）のためにプロテアーゼ抑制
物質または浸透強化物質が包含される。ある実施態様では、医薬組成物は以下の
ルートで投与される：非経口、癌周辺、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、
皮下、腹腔内、脳室内、頭蓋内、および腫瘍内。

【００３８】 さらに、本明細書で用いられるように、" 医薬的に許容できる担体"は当業者 には周知で、０．０１−０．１Ｍ、好ましくは０．０５Ｍのリン酸緩衝液または
０．８％食塩水が含まれるが、ただしこれらに限定されない。さらに、そのよう
に医薬的に許容できる担体は、水溶液もしくは非水性溶液、分散液および乳剤で
あろう。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
植物油（例えばオリーブ油）および注射可能有機エステル（例えばオレイン酸エ
チル）である。水性担体には、水、アルコール／水溶液、乳剤または分散剤（食
塩水および緩衝媒体を含む）が含まれる。非経口賦形剤には、塩化ナトリウム溶
液、リンゲルデキストロース液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リ
ンゲル液または固定油が含まれる。静脈内用担体には、体液栄養物補液、電解質
補液、例えばリンゲルデキストロースなどを基剤にした補液が含まれる。保存料
および他の添加物、例えば抗菌剤、抗酸化剤、照合薬剤、不活性ガスなどもまた
含むことができる。

【００３９】 " アジュバント"という用語は、抗原に対する免疫反応を強化する化合物また は混合物を指す。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織の蓄積所とし
て、さらに非特異的に免疫反応を強化する類リンパ系の活性化物質として機能す
ることができる（Hood et al., Immunology, 2nd Ed.,(1984), Benjamin/Cummin
gs:Menlo Park, California, p.384）。アジュバントを用いない抗原のみによる
初回攻撃は、しばしば液性または細胞性免疫反応を誘発することができないであ
ろう。アジュバントにはフロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全ア
ジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リゾレシチンの
ような界面活性剤、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油また
は炭水化物乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノールおよ
び潜在的に有用なヒトのアジュバント、例えばＢＣＧ（Bacille Calmette-Gueri
n)およびコリネバクテリウム・パルブム（Corynebacterium parvum）が含まれる
が、ただしこれらに限られない。好ましくは、アジュバントは医薬的に許容でき
るものである。

【００４０】 制御放出または徐放性組成物は親油性蓄積体（例えば脂肪酸、ワックス、油）
中に製剤を含む。本発明に包含されるものはまた、ポリマー（例えばポロキサマ
ーまたはポロキサミン）で被覆した粒子化組成物、および組織特異的レセプター
、リガンドもしくは抗原に対して製造した抗体と結合させた化合物、または組織
特異的レセプターのリガンドと結合させた化合物である。本発明の組成物の他の
実施態様では、種々の投与ルート（非経口、経肺、経鼻および経口投与を含む）
のために保護被覆、プロテアーゼ抑制物質または浸透強化物質が粒子化形態に包
含される。

【００４１】 投与時に化合物はしばしば迅速に粘膜表面または循環系から除去され、したが
って比較的短時間の薬理活性を生じる。結果として、治療効果の維持のために比
較的大量の生物活性化合物の頻回投与が要求される。水溶性ポリマー（例えばポ
リエチレングリコール、ポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールの
コポリマー、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコー
ル、ポリビニルピロリドンまたはポリプロピレン）の共有結合によって改変され
た化合物は、対応する未改変化合物よりも静脈注射後の血中半減期が実質的に長
くなることが知られている（Abuchowski et al., 1981; Newmark et al., 1982;
およびKatre et al., 1987）。そのような改変はまた、水溶液中での化合物の溶
解性を高め、凝集を防ぎ、化合物の物理的および化学的安定性を高め、さらに化
合物の免疫原性および反応性を大きく減少させる。結果として、未改変化合物の
場合よりも少ない回数または低い投与量で、そのようなポリマー化合物付加物に
よりin vivoで所望の生物学的活性が達成できる。

【００４２】 投与量：十分な量は、約１μｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇを含むがただ
しこの量に限定されない。十分な量は１０ｍｇ／ｋｇであろう。医薬的に許容で
きる組成物は医薬的に許容できる担体を含む。活性な成分を含有する治療用組成
物の調製は当技術分野で周知である。典型的には、そのような組成物は、鼻咽頭
に到達させるポリペプチドエアロゾルとして、または注射可能な溶液もしくは分
散剤のどちらかとして調製されるが、注射前の溶液用もしくは分散剤用に適した
固体または液体も調製できる。調製物はまた乳化させてもよい。活性な治療用成
分はしばしば、医薬的に許容できる活性成分と適合する賦形剤と混合される。適
切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロース、エタノール
など、またはそれらの組み合わせである。所望の場合は、さらに組成物は、微量
の湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような活性成分の効果を高める補助物質
を含むことができる。

【００４３】 活性成分は、医薬的に許容できる中和塩として治療用組成物に製剤化できる。
医薬的に許容可能な塩には、酸付加塩（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミ
ノ基により生成される）が含まれ、これらは、無機酸（例えば塩酸、燐酸）また
は有機酸（例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸など）により生成される。遊
離カルボキシル基で生成される塩もまた、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、
カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは鉄）および有機塩基（例えばイソプ
ロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、
プロカインなど）から得ることができる。

【００４４】 " Ａ"（ここで" Ａ"は単一の蛋白質、ＤＮＡ分子、ベクターなど）を含む組成
物が、実質的に" Ｂ"（ここで" Ｂ"は１つまたは２つ以上の夾雑蛋白質、ＤＮＡ
分子、ベクターなど）を含まないときは、その組成物中で重量で少なくとも約７
５％の蛋白質、ＤＮＡ、ベクター（ＡおよびＢが属する物質種のカテゴリーに応
じて）が" Ａ"である。好ましくは" Ａ"は重量で少なくとも９０％、最も好まし
くは重量で少なくとも約９９％のＡ＋Ｂ物質種を含む。

【００４５】 本発明の治療用組成物を指して用いられる場合" 単位用量"という用語は、ヒ ト用の分割できない単位投薬量として適切である物理的に特定される単位量を指
し、各単位量は、必要な希釈剤（すなわち担体）と結合させた、所望の治療効果
を生じるように計算された予め決定した量の活性物質を含有する。典型的には、
本発明のキットはまた、販売のためにぴったりと格納された状態でバイアルを収
納する手段、例えば所望のバイアルをその中に保持することができる注入または
吹き込み成形プラスチック容器を含む。容器の数またはタイプに関係なく、本発
明のキットはまた、動物の体内にこの完全な複合組成物を注射／投与または静置
することを補助する器具を含み、またはそれらと一緒に包装することができる。
そのような器具は、吸入器、注射筒、ピペット、ピンセット、計量スプーン、点
眼器、または任意の医療用として承認された投薬用媒体である。

【００４６】 以下の実施例は、本発明の好ましい態様をさらに完全に説明するために提示さ
れる。しかしながらこれら実施例は一切本発明の範囲を限定するものと解しては
ならない。本発明は、その特徴を外れることなく他の形態または態様で具現化ま
たは実施できる。したがって、本実施例は説明的なもので、添付の請求の範囲に
よって示される本発明の範囲を制限するものではなく、同等な意味および範囲内
に含まれる一切の変形は本発明の範囲内に包含される。多様な参考文献が本明細
書を通して引用され、それらの各々は参照により本明細書に含まれる。

【００４７】実施例 実施例１： アデノウイルス主要後期プロモータ（ＭＬＰ）は、ウイルスの構造蛋白質の大
半およびいくつかの非構造蛋白質をコードする主要後期転写ユニットの発現を制
御する（２２に概説）。ＭＬＰは感染初期および後期に活性を示すが、ＤＮＡ複
製の開始後に最大活性に達する。遺伝学的および生化学的研究によって、多数の
転写因子結合部位およびＭＬＰによる発現を調節する対応するＤＮＡ結合蛋白質
が特定された。これらには、ＴＡＴＡ成分に結合するＴＡＴＡボックス結合蛋白
質（ＴＢＰ）およびＴＦＩＩＤ複合体、−５０のＵＳＦ／ＭＬＴＦ結合部位、−
７０近傍のＣＡＡＴボックス、＋１のイニシエータ部位、および蛋白複合体（細
胞因子およびウイルスＩＶａ２蛋白質を含む）と結合する下流の成分が含まれる
（２２に概説）。これらの因子結合部位の大半は多様なアデノウイルス血清型を
もつＭＬＰで保存されており、これらの部位が適切な転写調節に重要であると考
えざるをえない（図１および参考文献２５）。

【００４８】 ＭＬＰの興味深い構造的特性は、ＴＡＴＡボックス周囲のＧＣ富裕配列の存在
である（図１）。これらの配列は、いくつかの他のアデノウイルスと同様にヒト
アデノウイルスで良好に保存されており（図１および文献２５）、このことは、
ＭＬＰにとってこの配列が機能的に重要であることを暗示している。ＧＣ富裕成
分は、広範囲にＡＴ塩基で置換しても全細胞抽出物での主要後期プロモータ活性
を抑制しないが、上流のＴＡＴＡ基部ＧＣ富裕成分における変異はウイルス感染
細胞でのＭＬＰ活性を低下させた（３）。さらに、Yuら（３０）は、ＭＬＰが高
次螺旋形成プラスミドに存在するときは、ＴＡＴＡ基部ＧＣ富裕配列はヌクレア
ーゼ感受性構造を形成することを見出した。しかしながら、この発見の生理学的
重要性は明らかではない。

【００４９】 我々は、亜鉛フィンガー蛋白質ＭＡＺおよびＳｐ１によるＧＣ富裕プロモータ
転写調節に興味をもってきた（２０）。ＭＬＰのＧＣ富裕配列はＭＡＺおよびＳ
ｐ１のための潜在的結合部位であるので、これら因子のプロモータと相互反応す
る能力およびその活性を調節する能力を調べた。結果は、両因子はＭＬＰのＧＣ
富裕配列と相互反応し、ＭＬＰ活性を刺激し、さらにＥ１Ａ蛋白質と反応するこ
とを示唆した。

【００５０】 材料と方法 プラスミド、ウイルスおよび細胞： ｆｌｕエピトープタグ付きＭＡＺおよびＳｐ１を産生する発現プラスミドにつ
いては以前に記載した（２０）。２８９アミノ酸残基のＥ１Ａ蛋白質のｃＤＮＡ
（１３ＳのＥ１Ａ）はＣＭＶプロモータから発現された（２３）。エピトープタ
グ付きＹＹ１発現プラスミドはＹＹ１ｃＤＮＡをプラスミドｐＲｅｐ４（InVitr
ogen）にＹＹ１ｃＤＮＡを挿入して調製した。ＭＬＰ構築物（ｐＭＬＰ−２６０
／＋１１）は、ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）を用いてポリメラーゼ
連鎖反応によって生成したＤＮＡフラグメントをクローニングすることによって
調製した。プロモータフラグメントは、ルシフェラーゼレポータープラスミドｐ
ＧＬ２−ベーシック（Promega)でクローニングした。最小ＭＬＰ構築物は、主要
後期開始部位（ｐＧＬ２−ベーシックでクローニング）に対して−４８から＋１
１の配列を含んでいる。これらは、二本鎖オリゴヌクレオチドをルシフェラーゼ
ベクターでクローニングして調製した。主要後期Ｌ１ＲＮＡ５'末端の検出のた めのハイブリダイゼーションプローブを供給するプラスミドは、第一のリーダー
および第二のリーダーの一部分を含むｃＤＮＡを生成することにより調製した。
このｃＤＮＡを−２６０から＋１までのプロモータ配列と融合させ、ベクターｐ
ＳＰ７２（Promega)でクローニングした。Ｌ５領域の一部分を含むゲノムＤＮＡ
クローンは、８９から９２マップユニットのＡｄ５ＤＮＡ配列をｐＧｅｍ４（Pr
omega)でクローニングして調製した。

【００５１】 ５型アデノウイルス（Ａｄ５）Ｅ１Ａマイナス変異体であるｄｌ３１２（１１
）は、Ｅ１Ａ蛋白質を発現している２９３細胞で増殖させ（６）、ウイルスＤＮ
Ａは以前に記載（１９）されたように精製ウイルスから調製した。感染は２０ｐ
ｆｕ／細胞の感染数で実施した。 ＨｅＬａ細胞は，１０％の胎児クローンＩＩ血清（HyClone Laboratories）補
充ダルベッコー（Dulbecco's）最少必須培養液で維持した。２９３細胞は、１０
％のウシ胎児血清（HyClone Laboratories）補充イスコブ（Iscoves)改変ダルベ
ッコー培養液（ＩＭＤＭ）で増殖させた。

【００５２】 発現アッセイ： ＨｅＬａおよび２９３細胞を燐酸カルシウム沈殿法によりトランスフェクトし
、採集して以前に記載（２０）したようにルシフェラーゼアッセイのために処理
した。ウイルスＤＮＡを２９３細胞にトランスフェクトする場合は改変プロトコ
ルを用いた。ウイルスＤＮＡおよび発現プラスミドを混合し、この溶液を１ｍｌ
の総容積とし０．３ＭのＣａＣｌ₂最終濃度に調製した。沈澱を生成させるため に、１ｍｌのヘペス緩衝食塩水（２）をＤＮＡ−カルシウム混合物に添加し、ピ
ペットで５回出し入れして混合した。１分間沈殿を形成させ、この２ｍｌ全部を
１０％ウシ胎児血清を補充した９ｍｌのＩＭＤＭを含む２９３細胞の１０ｃｍプ
レート上に加えた。沈殿物を細胞とともに１２−１６時間保温し、続いてこの細
胞を洗浄し、新しい培養液を加えた。トランスフェクションの開始後４４−４８
時間でＲＮＡ調製のために細胞を採集した。ＤＮＡ複製をヒドロキシウレア（Ca
lbiochem）で阻害させる場合は、薬剤（１０ｍＭ）をトランスフェクションの開
始後１時間で添加し、採集までこの培養液を維持した。

【００５３】 一般に、ＲＮＡはグアニジニウム溶解およびＣｓＣｌ₂中での遠心によって調 製した。トリゾール試薬（Life Technologies)を用いて、いくつかのＲＮＡ調製
物をグアニジニウム／フェノール抽出法（４）によって作製した。ヌクレアーゼ
Ｓ１分析は本質的に以前に記載（２０）したようにいくつかの改変を加えて実施
した：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは１３００ユニットＳ１（Boehringer Mannh
eim)／ｍｌで消化した；Ｌ５ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドは３０℃で消化した；
さらにヌクレアーゼ消化は１時間実施した。末端標識プローブの調製手順および
ハイブリダイゼーション条件は文献に記載されている(Parks & Shenk, ２０）。
ＭＬＰ５'末端プローブはＳｃａＩ部位（Ａｄ５ヌクレオチド７１４８）で標識 した。Ｌ５プローブはＢｇ１ＩＩ部位（Ａｄ５ヌクレオチド３２４９１）で標識
した。ルシフェラーゼＲＮＡの検出のために、ＭＬＰルシフェラーゼプラスミド
ＤＮＡをルシフェラーゼコード領域のＸｂａＩ部位で標識した。ハイブリダイゼ
ーションは、４７℃（ＭＬＰ５'末端プローブまたはルシフェラーゼプローブ） または５０℃（Ｌ５プローブ）で８−１６時間実施した。

【００５４】 トランスフェクト細胞抽出物の蛋白質の免疫沈澱は、文献（２）にしたがって
ｆｌｕエピトープタグ（１４）に特異的な単クローン性（モノクローナル）抗体
１２ＣＡ５および" Ｅ１Ａ"緩衝液条件（９）を用いて実施した。ウェスタン分 析は以前の記載（２０）にしたがって実施し、ｆｌｕエピトープタグに対する抗
体またはＥ１Ａ蛋白質（８）に対するＭ７３モノクローナル抗体を用いた。

【００５５】 ウイルスＤＮＡの複製をモニターするために細胞を上記のようにトランスフェ
クトしたが、ただしリン酸カルシウムトランスフェクション混合物の規模を５０
％に落とし、１穴につき２．５ｍｇのＡｄＤＮＡおよび５ｍｇの適切なプラスミ
ドで６穴プレートの２９３細胞をトランスフェクトした。文献に記載(Volkert &
Young, ２８）された改変ハート（Hirt）法を用いてトランスフェクション後４
８−７２時間でＤＮＡを採集した。ＨｉｎｄＩＩＩでＤＮＡを消化し、サザンブ
ロット（２）で分析した。Ａｄ５の配列５７８８−６０９５と相補的な³²Ｐ標識
リボプローブを上記のブロットとハイブリダイズさせた。

【００５６】 ＤＮＡ分解酵素Ｉによるフットプリンティングおよびin vitro転写： ＤＮＡ分解酵素Ｉによるフットプリンティングおよびin vitro転写アッセイの
詳細は文献に記載されている(Parks & Shenk, ２０）。精製組換えＭＡＺは以前
に記載（２０）されたように調製し、組換えＳｐ１は購入した（Promega)。完 全細胞の粗抽出物を調製してin vitro転写に用いた（１５）。転写反応は以前の
実験と少し異なり、非特異的ＤＮＡとしてポリｄＧ／ｄＣ−ｄＧ／ｄＣではなく
pBluescript SKを用いた。スーパースクリプト（Superscript)ＩＩ逆転写酵素（
Life Technologies)を用いて５０℃で実施するプライマー伸長（２０）によって
、反応混合物から単離したＲＮＡを分析した。

【００５７】 結果 ＭＡＺおよびＳｐ１はＭＬＰ内の多数の部位に結合する： 転写因子ＭＡＺおよびＳｐ１についての興味から、これらの因子が、転写開始
部位に対して−１８（−１８ＧＣ）、−３６（−３６ＧＣ）および−１６６（−
１６６ＧＣ）に集中するＧＣ富裕配列を介してＭＬＰの活性に影響を与える可能
性を調べた。ＭＬＰについて−１６６の部位は、異なって転写されるＩＶａ２プ
ロモータの−４５に位置する。−１８ＧＣおよび−３６ＧＣ配列（図１）は、Ｔ
ＡＴＡモチーフに接し、さらに多様なアデノウイルスで保存されているので特に
興味をそそる実験対象物である。ＭＡＺおよびＳｐ１と相互反応する−１８ＧＣ
および−３６ＧＣ配列の能力を先ず調べた。フットプリント反応によって、ＭＡ
Ｚは多数の部位でＭＬＰと結合することが明らかになった（図２Ａ）。２つの部
位は−１００の上流で、残りの２つの部位はＴＡＴＡボックス近くのＧＣ富裕配
列に一致する。アッセイに添加したＭＡＺの量を定量することによって、ＴＡＴ
Ａボックスに接する２つの結合部位の存在が明らかになった。−１８ＧＣ結合部
位はより低い蛋白質濃度で占領され、さらにもっと高い濃度ではより低い親和性
でＭＡＺは−３６ＧＣ結合部位と結合した。Ｓｐ１とプロモーターとの相互反応
はＭＡＺほど広範囲ではなかった（図２Ｂ）。ＭＬＰの遠位部領域では、Ｓｐ１
は−１６６部位とのみ結合し、プロモータの基部では、Ｓｐ１は−１８ＧＣ配列
とだけ結合する。

【００５８】 ＭＡＺとＳｐ１はＥ１Ａと協調してＭＬＰを活性化させる： ＭＬＰのＧＣ富裕配列はＭＡＺおよびＳｐ１と相互作用することを確認した後
、転写因子はプロモータの活性に影響を与えるか否かを調べた。この実験を実施
するために、ＭＬＰレポータープラスミドの活性に対するＭＡＺまたはＳｐ１の
過剰発現の影響を調べる一過性発現アッセイを用いた。主要後期開始部位に対す
る−２６０から＋１１の配列をルシフェラーゼレポータープラスミドでクローニ
ングし、エピトープタグ付きＭＡＺまたはＳｐ１をコードする発現プラスミドと
ともにこの構築物を同時トランスフェクトした。Ａｄ５の１３ＳｍＲＮＡによっ
てコードされる２８９アミノ酸残基のＥ１Ａアクチベータ蛋白質の過剰発現の影
響を調べた（２２に概説）。ＭＡＺはルシフェラーゼ活性を４０−５０倍増加さ
せ、一方、Ｅ１ＡまたはＳｐ１は４−１０倍のより穏やかな増加を与えた（図３
Ａ）。興味深いことには、ＭＡＺおよびＥ１Ａを一緒に同時トランスフェクトし
たとき、２つの蛋白質の効果は増大し、ベクターだけで認められた値と比較して
２００倍の増加が得られた。同様に、Ｅ１ＡおよびＳｐ１の組み合わせは、いく
つかの実験で２００倍に達するような非常に高い増加をもたらした。

【００５９】 ＭＡＺおよびＳｐ１がトランスフェクトしたプラスミドから産生されることを
確認するために、エピトープタグ付き蛋白質の存在について細胞抽出物をウェス
タンブロットアッセイによって分析した。両蛋白質が発現され（図３Ｂ、レーン
２、５）、さらに、Ｅ１Ａをともに与えられた細胞で再現可能な強いＳｐ１発現
強化が得られることが認められた（図３Ｂ、レーン６）。このＳｐ１レベルの増
加は、Ｅ１ＡプラスＳｐ１をトランスフェクトされた細胞で検出されるレポータ
ーの活性化の一因となるであろう。Ｅ１Ａの発現の影響は、ＭＡＺ蛋白質発現レ
ベルに対しては無視できる程度のものである（図３Ｂ、レーン４）。

【００６０】 安定したレベルのルシフェラーゼＲＮＡ（図３Ｃ）が測定され、ＭＡＺまたは
Ｓｐ１またはＥ１Ａとの組み合わせ効果による活性化はＭＬＰによるＲＮＡ蓄積
増加のためであることが確認された。トランスフェクトされた細胞から得られた
全ＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびヌクレアーゼＳ１による定量によって
、一過性発現アッセイで得られた結果と一致する結果が得られた。ルシフェラー
ゼのＲＮＡレベルは、レポーター遺伝子およびからの発現ベクターをトランスフ
ェクトした細胞では検出できなかった（図３Ｃ、レーン２）。同様に、Ｅ１Ａ単
独またはＳｐ１単独ではルシフェラーゼＲＮＡ検出のために必要なレベルの刺激
は得られなかった（図３Ｃ、レーン４、６）。これは、Ｅ１ＡまたはＳｐ１単独
では比較的軽度な程度でレポーターが活性化することを示した一過性アッセイと
一致した（図３Ａ）。ＭＡＺによる刺激はルシフェラーゼアッセイでより強く、
これはｍＲＮＡの検出でも同じであった（図３Ｃ、レーン３）。約７５ヌクレオ
チドのバンドが明瞭で、そのサイズはＭＬＰ−ルシフェラーゼ発現プラスミドに
由来する正確に開始されたｍＲＮＡと一致する。さらに、ルシフェラーゼアッセ
イから予想されたように、ＭＡＺプラスＥ１ＡまたはＳｐ１プラスＥ１Ａの組み
合わせ効果によって、ＲＮＡレベルで最高の増加が得られ（図３Ｃ、レーン５、
７）、ＭＡＺのみがレポーター遺伝子とともに発現される場合よりも約３−４倍
多いレポーターＲＮＡが生成された。

【００６１】 Ｅ１ＡおよびＭＡＺまたはＥ１ＡおよびＳｐ１の組み合わせ効果は、Ｅ１Ａは
これら亜鉛フィンガー蛋白質と相互作用する可能性を示唆し、以前の実験ではＳ
ｐ１およびＥ１Ａはin vitroで複合体を形成することができることが示された（
１６）。この以前のＳｐ１に関する結果を確認し、さらにＥ１ＡとＭＡＺとの可
能な相互反応を調べるために、免疫沈澱実験を実施した。ｆｌｕエピトープタグ
付きＭＡＺを発現するベクターまたはＳｐ１発現ベクターをＥ１Ａの存在下また
は非存在下でＨｅＬａ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクトした細胞
の抽出物から得た蛋白質を抗ｆｌｕエピトープタグ抗体で免疫沈澱させ、ＳＤＳ
ポリアクリルアミドゲルで電気泳動し、ニトロセルロースにブロットを移した。
続いて２組のウェスタンブロットを抗Ｅ１Ａまたは抗エピトープタグ抗体をプロ
ーブとして分析した。エピトープタグに対する抗体によって、ＭＡＺおよびＳｐ
１はトランスフェクトされた細胞から免疫沈澱することが示された（図３Ｄ、左
パネル）。以前のin vitroの結果と符合し、Ｅ１Ａに対する抗体によって、Ｅ１
ＡはＳｐ１とともに共沈することが示された（図３Ｄ、右パネルのレーン１）。
ＭＡＺおよびＥ１Ａをトランスフェクトした細胞の抽出物では、ある程度のＥ１
ＡがＭＡＺと共沈することが明瞭である（図３Ｄ、右パネルのレーン３）が、た
だしＳｐ１と共沈するよりもＭＡＺと共沈するＥ１Ａの方が実質的に少ない。こ
のことは、ＭＡＺ−Ｅ１Ａ相互反応は、Ｅ１ＡとＳｐ１との相互反応よりもこの
免疫沈澱条件に対してより不安定であることを示しているのかもしれない。しか
しながら、エピトープタグ付きＭＡＺに対する抗体と共沈するＥ１Ａのレベルの
低下は、転写因子プラスＥ１Ａを発現するプラスミドを与えられたトランスフェ
クト細胞ではＳｐ１と比較してＭＡＺ発現レベルが実質的に低いことを少なくと
も部分的に反映している可能性が高い。

【００６２】 ＭＡＺはＴＡＴＡモチーフと接するＧＣ配列を介して転写を活性化させる： ＭＬＰとＧＣ富裕結合因子との間の極めて興味深いＤＮＡ蛋白質相互反応は、
ＴＡＴＡボックスと直接接する−１８ＧＣおよび−３６ＧＣ配列で生じる（図１
）。プロモータのこの領域内のＭＡＺおよびＳｐ１によって生成されたフットプ
リントは実際ＴＡＴＡ配列に及ぶ（図２）。変異分析を実施し、これらのＧＣ富
裕配列がＭＬＰの活性化に関与しているのか否かを調べた。−３６ＧＣ配列、Ｔ
ＡＴＡ成分、−１８ＧＣ配列およびイニシエーター領域のみを含む最小ＭＬＰ（
−４５から＋１１）を構築し、−１８ＧＣモチーフ（Ｍ１）、−３６ＧＣモチー
フ（Ｍ２）、両モチーフ（Ｍ３）または両モチーフとともにＴＡＴＡおよびイニ
シエーター成分（Ｍ４）を破壊する塩基対置換を含む変異誘導体を作製した（図
４Ａ）。ＤＮＡ蛋白質相互反応に対する変異の影響をフットプリントアッセイに
よって調べた（図４ＢおよびＣ）。野性型最小プロモータの場合、−１８ＧＣお
よび−３６ＧＣ配列での相互反応パターンは、完全な長さのプロモータで観察さ
れるものと同一であった。すなわち、２つのＭＡＺ結合部位および１つのＳｐ１
部位が明瞭であった。−１８ＧＣ配列の変異（Ｍ１）は、１つのＭＡＺ結合部位
の破壊と一致するＭＡＺフットプリントのサイズを減少させ、Ｍ１変異はＳｐ１
との相互反応を完全に阻害した。したがって、−１８ＧＣ変異体によって、ＭＡ
Ｚは最小プロモータ領域内の２つの別々の部位と相互反応すること、およびただ
１つのＳｐ１結合部位が存在することが確認された。−３６ＧＣ変異（Ｍ２）は
ＭＡＺによって保護される領域のサイズを減少させて、−３６ＧＣ配列もまたＭ
ＡＺ結合部位を確認させたが、Ｓｐ１フットプリントには変化を与えなかった。
二重ＧＣ配列変異（Ｍ３）は、ＭＡＺおよびＳｐ１がプロモータと相互反応する
能力を実質的に阻害した。

【００６３】 プロモータ活性に対するこれらの変異の効果を調べるために、変種プロモータ
を含む高次コイル形成鋳型ＤＮＡを用い、完全細胞抽出物中でin vitro転写を実
施し、反応生成物をプライマー伸長によってアッセイした。ＧＣ配列の変異は転
写効率を低下させた（図５Ａ、レーン２−５）。−１８配列の変異（Ｍ１）は野
性型プロモーターと比較して約２倍転写を減少させ、−３６ＧＣ配列の変異（Ｍ
２）は約３倍転写を減少させた。両ＧＣ配列の変異（Ｍ３）はさらに顕著な減少
（５倍）をもたらした。両ＧＣ配列、ＴＡＴＡボックスおよびイニシエーター内
に変異をもつプロモータ（Ｍ４）でプログラムされた転写反応は、プロモータ配
列を含まないベクターの場合または鋳型ＤＮＡを含まない場合と同様に、検出可
能な生成物を生じなかった（図５Ａ、レーン６−８）。過剰発現ＭＡＺおよびＳ
ｐ１による最小プロモータおよびその変異誘導体をトランスフェクト細胞内で活
性化させる能力を調べた。２９３細胞はアデノウイルスＥ１Ａ蛋白質を含み、さ
らにＭＡＺおよびＳｐ１はウイルス転写アクチベータの存在下でＭＬＰを非常に
強く活性化するので、２９３細胞を用いた。ｆｌｕエピトープタグ付きＭＡＺま
たはＳｐ１のどちらかを発現するエフェクタープラスミドとともに各ＭＬＰ構築
物を細胞にトランスフェクトした。ＧＣ変異はＭＡＺによる活性化に影響を与え
たが、Ｓｐ１による軽度の活性化に対してはほとんど影響を示さなかった（図５
Ｂ）。単一ＧＣ変異（Ｍ１またはＭ２）はいずれもＭＡＺによる活性化に対して
ほとんど影響をもたなかったが、両方のＧＣ変異が存在する場合（Ｍ３）は、Ｍ
ＡＺによる活性化は、野性型最小プロモータの場合の３０−５０倍と比較して約
１０−１５倍まで減少した。そのモチーフの全てに変異を含むＭＬＰ（Ｍ４）お
よびプロモータのないルシフェラーゼプラスミドはＭＡＺによって５倍の活性化
を示した。この活性化は、Ｓｐ１による全ての構築物の定常的な２−３倍の活性
化と同様に、おそらくＭＬＰの外側にあるルシフェラーゼベクター内のＧＣ富裕
配列によるものであろう。

【００６４】 Ｓｐ１がＴＡＴＡモチーフと接するＧＣ配列を介して最小プロモータを活性化
できない（図５Ｂ）ということは、Ｓｐ１は−１６６に集中するその上流の結合
部位（図２）を介して作用しＭＬＰの転写に影響を与えることを示唆している。
この仮説と一致して、Ｓｐ１はＥ１Ａと協調して、この上流のＧＣ成分を含むレ
ポーターを強く活性化した（図３Ａ）。

【００６５】 ＭＡＺおよびＳｐ１によるウイルスゲノムに存在するＭＬＰの活性化： ＭＡＺおよびＳｐ１がＭＬＰを活性化する能力をさらに調べるために、ウイル
スゲノム内のＭＬＰの活性化を調べた。この場合は、プラスミド構築物に存在し
ない、上流または下流のさらに別の配列がプロモータの活性に影響を与えるかも
しれず、他のウイルス遺伝子生成物がプロモータの調節に影響を与えるかもしれ
ず、さらにウイルスＤＮＡの複製がプロモータの活性に影響を与えるかもしれな
い。発現ベクターによる同時トランスフェクションによって添加ＭＡＺおよびＳ
ｐ１の影響が効果的にモニターできるように、ウイルスによる感染ではなくウイ
ルスＤＮＡ分子のトランスフェクションを用いた。ＤＮＡ複製が生じる条件下、
またはＤＮＡ複製を阻害するヒドロキシウレアの存在下で２９３細胞にアデノウ
イルスＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクション後４８時間してＲ
ＮＡを採集し、ウイルスゲノムのＬ１またはＬ５領域によってコードされるＲＮ
Ａを検出するプローブを用いハイブリダイゼーションによって分析した。Ｌ１お
よびＬ５ＲＮＡは両方ともＭＬＰで開始する転写物から生成される。ウイルス感
染細胞では、Ｌ１ＲＮＡはウイルスＤＮＡ複製開始の前後の両方で発現され、一
方、Ｌ５ＲＮＡはＤＮＡ複製が開始した後でのみ生成される（１７、２２、２７
に概説）。

【００６６】 レポータープラスミドを用いた実験によって予想したように（図３Ａ、５Ｂ）
、ウイルスゲノムＤＮＡとＭＡＺまたはＳｐ１発現プラスミドとの同時トランス
フェクションは、ＭＬＰからの発現を刺激した。Ｌ１ＲＮＡのレベルはＭＡＺお
よびＳｐ１の両方によって２から５倍増加した（図６Ａ、レーン１、３、５）。
ヒドロキシウレアの添加は、Ｌ１ＲＮＡ（図６Ａ、レーン１、２を比較）と同様
にウイルスＤＮＡ（図６Ｃ）の蓄積を抑制し、ＤＮＡ複製開始前の感染細胞での
主要後期プロモータの活性化の低下と符合する（２０に概説）。薬剤の存在下で
は、ＭＡＺまたはＳｐ１はＬ１ＲＮＡの蓄積を１７倍も刺激した（図６Ａ、レー
ン４、６）。ＭＡＺおよびＳｐ１は類似の効果をもたらし、これは、より完全な
（−２６０から＋１１）ＭＬＰを含むルシフェラーゼレポーターを用いる一過性
アッセイと一致した（図３Ａ）。ゲノムＤＮＡプラスＭＡＺまたはＳｐ１を同時
トランスフェクトした細胞のＬ１ＲＮＡレベルは非常に高く、これは２０ｐｆｕ
／細胞の感染数でＡｄ５を感染させた２９３細胞で蓄積される量に匹敵する（図
６Ａ、レーン８）。

【００６７】 この転写因子はまた、主要後期転写ユニットのＬ５領域を介して転写を刺激し
た。Ｌ５ＲＮＡの蓄積は、ＭＡＺまたはＳｐ１発現プラスミドなしにウイルスゲ
ノムを与えられた細胞でヒドロキシウレアによって実質的に阻害された（図６Ｂ
、レーン２）。ヒドロキシウレア処理はまた感染細胞でＬ５ＲＮＡの蓄積を阻害
した。この阻害は、主要後期転写ユニット（Ｌ１およびＬ５）の５'基部ドメイ ンのみがウイルスＤＮＡ複製がなくても転写されることを示した以前の実験（１
７、２２、２７で概説）と一致する。ＭＡＺをウイルスＤＮＡと同時トランスフ
ェクトした場合、ヒドロキシウレアの非存在下でＬ５ＲＮＡ蓄積は軽度に増加し
、ＤＮＡ合成が薬剤で阻害された場合はＬ５ＲＮＡの蓄積は強く刺激された（図
６Ｂ、レーン３、４）。Ｓｐ１は、ＤＮＡの複製がないときＭＡＺと同じように
は効果的にＬ５ＲＮＡの蓄積を刺激せず（図６Ｂ、レーン６）、トランスフェク
トしたＤＮＡに由来するＬ５ＲＮＡレベルは、ＭＡＺが存在する場合でも感染後
に達成されるレベルよりも実質的に低い（図６Ｂ、レーン８）。最後に、コント
ロールとしてＹＹ１（別の亜鉛フィンガー蛋白質（２３))をコードする発現プラ
スミドによるＭＬＰの活性化を調べた。ＭＬＰにはＹＹ１のための既知の結合部
位は存在せず（１０）、予想したようにＹＹ１の過剰発現は発現に影響を与えな
かった。

【００６８】 考察 本明細書で示したように、ＭＡＺおよびＳｐ１はＭＬＰと多くの部位で結合で
きる。これらの部位にはＴＡＴＡモチーフと接するＧＣ富裕成分が含まれる（図
１Ｃ）。ＭＡＺはＴＡＴＡ配列の上流および下流の両方で結合し、一方、Ｓｐ１
は下流部位と結合するが上流では結合しない（図１Ａ）。過剰発現ＭＡＺまたは
Ｓｐ１は、相応に大きいＭＬＰセグメント（−２６０から＋１１）を含むルシフ
ェラーゼレポーターを用いるトランスフェクションアッセイ（図２ＡおよびＣ）
、または完全なＡｄ５ゲノムが細胞にトランスフェクトされるアッセイ（図６）
でＭＬＰを活性化することができる。対照的に、最小ＭＬＰ（−４５から＋１１
）を含むレポーターは過剰発現ＭＡＺと反応するが、Ｓｐ１とは反応しない（図
５Ｂ）。このことは、大きなＭＬＰセグメントを含むレポーターは、−１６６に
集中する上流の結合部位を介してＳｐ１と反応することを示唆している。以前に
ゲノムフットプリントによって、感染細胞内でこの上流部位は占領されているこ
とが示された（１）。最後に、ＭＡＺおよびＳｐ１はともにＥ１Ａと協力してＭ
ＬＰの転写を誘発する（図３ＡおよびＣ）。この協調作用と符合して、トランス
フェクトされた細胞抽出物から得られたＥ１Ａは、エピトープタグ付きＭＡＺお
よびＳｐ１蛋白質に対するモノクローナル抗体により同時に免疫沈澱する（図３
Ｄ）。以前の実験によって、Ｓｐ１およびＥ１Ａはin vitroで相互作用すること
が示された（１６）。

【００６９】 ＭＡＺまたはＳｐ１によるウイルスゲノムに存在するＭＬＰの活性化は、ＤＮ
Ａ複製がヒドロキシウレアで阻害されたときに極めて顕著であった（図６）。こ
のことは、ＭＡＺまたはＳｐ１の過剰発現は、通常ＤＮＡ複製によって仲介され
るＭＬＰ活性化機能を代替できることを示しているのかもしれない。これまでの
ところ、このプロモータの活性化におけるＤＮＡ複製の役割は明かではない（２
２に概説）。おそらく、ＭＡＺおよびＳｐ１は、ＤＮＡ複製に依存する転写活性
化機構の正常な一部分として機能している。複製は、ＭＡＺおよびＳｐ１により
接近しやすいゲノム性鋳型を生じ、順々にこれら因子の補充が増加することによ
って、転写開始複合体の他の成分が引きつけられるのであろう。より高濃度のＭ
ＡＺまたはＳｐ１は、トランスフェクションによる裸出ＤＮＡの細胞への配送と
相まって、より接近しやすい鋳型の必要性を排除し、さらにヒドロキシウレアに
よるＤＮＡ複製の抑制を代償するのかもしれない。驚くべきことには、ＭＡＺの
過剰発現はＤＮＡが複製されないときにＬ５ＲＮＡの蓄積を（Ｓｐ１ではより限
定された範囲で）強化した（図６）。通常、ＤＮＡ複製は主要後期ユニットの遠
位部（Ｌ５領域を含む）の転写に必須であるが、このユニットが転写される強さ
を制御する機構は分かっていない（２２に概説）。ＤＮＡが複製されていないと
きのＭＬＰの活性化はＬ５ＲＮＡの蓄積をもたらすといういう観察は、完全な長
さの転写は単なる質量作用効果であることを示唆している。すなわち、プロモー
タがより活性化し、より多くのＲＮＡポリメラーゼがそのユニットの転写を開始
し、引続きより多くの分子がユニットの末端に移動しＬ５ＲＮＡを生成する。

【００７０】 Yu & Manley(２９）は、ＴＡＴＡモチーフと接しているＧＣ富裕成分中に塩基
対の置換を含む大量のＭＬＰ誘導体セットのＨｅＬａ完全細胞抽出物における転
写活性を調べた。ＧＣ富裕配列中に多数のＧからＡへの遷移をもつそれら変種の
いくつかは、無細胞アッセイで野性型活性を示した。対照的に、本明細書の置換
変異体（これらはＭＡＺおよびＳｐ１のＧＣ富裕成分との結合を妨げる（図４))
は、野性型の最小ＭＬＰよりもいくぶん活性が低い（２．５倍）。これらの明ら
かに矛盾する結果についてはいくつかの可能な説明が考えられる。２つの実験で
は異なる変異が調べられ、以前の実験で分析された変異はＭＡＺおよびＳｐ１の
結合を阻害するか否かは不明である。異なる結果は、異なるＭＬＰセグメントを
in vitro転写アッセイで使用したことによるのかもしれない。すなわち、以前の
実験は−６６から＋１９３の配列を用い、この実験は−４５から＋１１の配列を
用いた。より大きなＭＬＰセグメントと結合するが、最小ＭＬＰにアクセスでき
ない因子は、ＴＡＴＡモチーフと接するＧＣ富裕配列内の変異の効果を分かりに
くくするであろう。

【００７１】 Brunetら（３）は、感染細胞内のアデノウイルス染色体に対するＴＡＴＡモチ
ーフと接するＧＣ富裕成分内の変異の影響を調べた。ＴＡＴＡ成分の下流のＧＣ
富裕配列中における多数のＧからＡへの遷移は明らかな影響を示さなかったが、
上流のＧＣ富裕領域における置換は２から６倍ＭＬＰの活性を減少させた。した
がって、最小ＭＬＰに関するこれらの結果（図５）は、ウイルスゲノム上のＭＬ
Ｐの変異分析の結果（３）と同様に、ＴＡＴＡモチーフに隣接するＧＣ富裕配列
はＭＬＰの完全な活性の一助となることを主張している。

【００７２】 これらのＧＣ富裕成分は、ＭＡＺおよびＳｐ１のための結合部位として役立つ
ことによってＭＬＰ活性に寄与しているのであろうか。過剰発現Ｓｐ１は最小Ｍ
ＬＰを活性化しないが、しかしＳｐ１は２９３細胞では数量が限定されておらず
、そのためＳｐ１の添加は最小ＭＬＰレポーターの活性に影響を与えない可能性
がある。さらにまた、Ｓｐ１族の他のもの（７、１３）が活性化に役割を果して
いるかもしれない。ＭＡＺは最小ＭＬＰを明瞭に活性化し（図５Ｂ）、したがっ
てＭＡＺおよびおそらくはＳｐ１族のものはこれら配列を介してＭＬＰ活性に影
響を与える可能性が高い。

【００７３】 ＭＡＺが−１８および−３６に集中するＧＣ配列と結合するとき、そのＤＮＡ
分解酵素ＩのフットプリントはＴＡＴＡモチーフと重なり合う（図２および４Ｂ
）。さらに、ＴＦＩＩＤ／ＴＦＩＩＡ／ＴＦＩＩＢ複合体が開始複合体の形成時
にプロモータと相互作用するとき、ＴＦＩＩＡおよびＴＦＩＩＢは、ＴＡＴＡ配
列の上流および下流の両方でプロモータＤＮＡと接触する（５、１８、２６）。
ＭＬＰの場合、これらの接触はＭＡＺが位置しているＧＣ富裕配列内で生じるで
あろう。ＭＡＺ、ＴＦＩＩＡおよびＴＦＩＩＢはＭＬＰのこれらのドメインと同
時に接触できるかもしれない。これら因子とＭＬＰとの同時に起こる相互作用を
示すための試みでは、これまでのところ決定的な結果は得られていない。さらに
また、ＭＡＺがＴＡＴＡモチーフと接しているＧＣ富裕配列と相互作用するとき
、ＴＢＰはプロモータＤＮＡとの直接結合から除外されるかもしれないというこ
とが考えられる。この場合、ＴＦＩＩＤは、蛋白質−蛋白質相互作用によってプ
ロモータにもたらされるかもしれない。ＴＡＴＡモチーフ内の２つの単塩基対変
化は、感染細胞でのＭＬＰから適切に開始させた転写物の発現を低下させたが、
完全には阻害しなかった（２１）ということは注目すべきことである。おそらく
、ＴＦＩＩＤは、この変異ウイルスではもっぱらＭＡＺとＳｐ１とのその相互作
用を介してプロモーターにもたらされる。以前には、ＭＡＺは、特定可能なＴＡ
ＴＡモチーフがなくてもセロトニン１ａレセプター（ここには対応するＴＡＴＡ
成分をもつようにはみえない一連の転写開始部位の極めて基部にＭＡＺ／Ｓｐ１
部位が見出される）内のプロモータ配列にＴＦＩＩＤをもたらすと説明された（
２０）。直接的なＴＢＰ−ＤＮＡ相互反応がなくても主要後期プロモータにＴＦ
ＩＩＤを誘導するＭＡＺおよびおそらくはＳｐ１族のものの潜在能力は、２つの
別個の開始メカニズムがＭＬＰを作動させるという興味をそそる可能性を提示し
た。開始態様の１つは、ＴＦＩＩＤとＴＡＴＡモチーフの直接結合を必要とし、
他の態様は、ＴＦＩＩＤをＭＡＺまたはＳｐ１結合プロモータにもたらすために
蛋白質−蛋白質相互反応を必要とするであろう。

【００７４】 参考文献 1. Albrecht, G., B. Devaux, and C. Kedinger. 1988. Genomic footprinting
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111-2148.

【００７５】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】 アデノウイルスＭＬＰ配列のアラインメント。比較のために、ＭＬＰ由来の４
つの配列モチーフの略図が示されている。これは、ＴＡＴＡモチーフ、イニシエ
ーター配列およびＴＡＴＡボックスと接するＧＣ富裕配列（−３６ＧＣおよび−
１８ＧＣ）を含む。図の下に、ＭＡＺ（１９）およびＳｐ１（１２）のためのコ
ンセンサス結合部位が、ＭＬＰ内のＴＡＴＡモチーフと接するＧＣ富裕コンセン
サス配列と比較されている。

【図２】 ＤＮＡ分解酵素Ｉ保護によるＭＬＰにおけるＤＮＡ−蛋白質相互反応の分析。
（Ａ）ＭＡＺ蛋白質の量を増加させながら、開始部位に対してヌクレオチド＋４
７から−２６０までのＭＬＰフラグメント（ヌクレオチド＋４７を³²Ｐで末端標
識）と保温した。ＤＮＡ分解酵素Ｉによる限定的消化後にフットプリント反応生
成物を処理し、ＧＡシークェンシング階段標識の隣でシークェンスゲルで電気泳
動した。オートラジオグラムの側面の棒線は保護領域を示す。黒色の棒線は強い
ＭＡＺ結合部位を表し、灰色の棒線は弱いＭＡＺ結合部位を表す。開始部位に対
するヌクレオチドの位置はオートラジオグラムの側面に表示されている。（Ｂ）
このパネルに示した実験は上記のように実施したが、Ｓｐ１蛋白質を含むフット
プリント反応を伴う。Ｓｐ１フットプリントは斜線入り棒線で示されている。（
Ｃ）フットプリント実験の要約で、ＭＡＺおよびＳｐ１のための結合部位を示し
ている。データは、切り取ったものをオフォト（Ofoto)ソフトを用いて走査し、
図はキャンバス（Canvas）３．５ソフトを用いて調製した。

【図３】 ＭＡＺ、Ｓｐ１およびＥ１ＡによるＭＬＰの活性化。（Ａ）ＭＬＰ−ルシフェ
ラーゼレポータープラスミドを活性化させるＭＡＺ、Ｓｐ１およびＥ１Ａの能力
を調べる同時トランスフェクション実験。ＭＬＰ−ルシフェラーゼ構築物は−２
６０から＋１０のＭＬＰ配列を含んでいた。ＨｅＬａ細胞にレポータープラスミ
ド（１０μｇ）および以下の種々のエフェクタープラスミドをトランスフェクト
した：ｐＣＭＶ−Ｅ１Ａ（１μｇ）、ｐＣＭＶ−ＭＡＺ（１０μｇ）またはｐＣ
ＭＶ−Ｓｐ１（１０μｇ）。必要な場合には、挿入物を含まないＣＭＶ発現ベク
ターを加え、一定量のＣＭＶプロモータ含有プラスミドを維持した。結果は、挿
入エフェクター配列を含まない発現プラスミドを加えたときに得られた活性に対
する達成活性レベルとして表されている。棒グラフは、５つの別個の実験から算
出した標準偏差と併せて活性化の平均レベルを表している。（Ｂ）トランスフェ
クト細胞におけるエピトープタグ付きＭＡＺおよびＳｐ１蛋白質の発現をモニタ
ーするウェスタンブロット分析。発現プラスミドの生成物は各レーンの上部に表
示されている。「ベクター」はからの発現プラスミドを与えられた細胞を意味す
る。マーカー蛋白質のキロダルトンによるサイズはオートラジオグラムの右側に
表示されている。（Ｃ）（Ａ）のようにトランスフェクトした細胞で産生された
ルシフェラーゼＲＮＡの分析。ＲＮＡはオートラジオグラムの上部に示したＭＬ
Ｐ−ルシフェラーゼプローブＤＮＡとハイブリダイズさせた。ハイブリダイゼー
ションはＳ１ヌクレアーゼで消化して停止させ、消化生成物は変性ポリアクリル
アミドゲルで電気泳動した。ＭＬＰ特異的シグナルは矢印で示し、マーカーＤＮ
Ａのサイズは表示されている。（Ｄ）（Ａ）のようにトランスフェクトした細胞
抽出物の免疫沈澱アッセイ。各トランスフェクションで用いた蛋白質発現プラス
ミドはオートラジオグラムのレーンの上部に表示されている。パネル上方で、免
疫沈澱はｆｌｕエピトープタグに対して特異的なモノクローナル抗体を用いて実
施した。免疫沈澱蛋白質はウェスタンブロット法のために処理し、再びｆｌｕエ
ピトープタグに対して特異的なモノクローナル抗体を用いた。右側のパネルでは
、同一の免疫沈澱蛋白質セットをＥ１Ａ蛋白質に対するモノクローナル抗体（ａ
−Ｅ１Ａｂｌｏｔ）をプローブとして用いて調べた。

【図４】 ＭＡＺおよびＳｐ１結合に対するＴＡＴＡモチーフに接するＧＣ富裕配列内の
変異の影響。（Ａ）野性型最小ＭＬＰおよびその変異誘導体の配列。（Ｂ）野性
型および変異ＭＬＰと結合するＭＡＺ（Ｂ）およびＳｐ１（Ｃ）をアッセイする
ためにＤＮＡ分解酵素Ｉフットプリント分析を実施した。プローブＤＮＡはルシ
フェラーゼコード領域内で５'末端標識が施されている。野性型ＤＮＡに対する 強い（黒色）および弱い（灰色）ＭＡＺフットプリントおよびＳｐ１フットプリ
ントがオートラジオグラムの側面に棒線によって指摘されている。開始部位に対
する配列の位置はＧＡ配列反応の隣に示されている。

【図５】 最小ＭＬＰの活性に対するＭＬＰ変異の影響。ルシフェラーゼレポータープラ
スミドを図４Ａに示した最小プロモータフラグメントを用いて調製した。（Ａ）
野性型および変異ＭＬＰのin vitro転写活性を完全細胞抽出物で分析した。反応
生成物は、プライマー伸長および変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
分析した。転写反応に用いた鋳型ＤＮＡはオートラジオグラムのレーンの上部に
表示されている。７５塩基マーカー（Ｍ）の泳動は左側に表示され、ＭＬＰ特異
的バンドは矢印で示されている。（Ｃ）野性型および変異ＭＬＰルシフェラーゼ
プラスミドを用いたトランスフェクション実験。ＭＡＺ（灰色の棒線）またはＳ
ｐ１（斜線入り棒線）を発現するエフェクタープラスミド（１μｇ）とともに、
プラスミド（０．２μｇ）を２９３細胞にトランスフェクトした。活性化は、７
つの別個の実験から算出した。

【図６】 トランスフェクトしたウイルスＤＮＡからの主要後期遺伝子の発現。アデノウ
イルスＤＮＡ（１０μｇ）を各レーンの上部に示した因子を産生する発現プラス
ミド（１０μｇ）とともに２９３細胞にトランスフェクトした。「ベクター」は
挿入物をもたないエフェクター発現プラスミドが加えられたことを示している。
細胞をトランスフェクション後４８時間で採集し、全ＲＮＡを単離した。このＲ
ＮＡをＬ１ＲＮＡ（Ａ）またはＬ５領域からのＲＮＡ（Ｂ）の５'末端を検出で きるようにデザインした〔³²Ｐ〕−末端標識プローブとハイブリダイズさせた。
４８時間のトランスフェクション中にヒドロキシウレアが存在（＋）していたか
または存在していなかった（−）かが表示されている。マーカーＤＮＡのサイズ
はオートラジオグラムの左側に示されている。陰性コントロールＲＮＡは偽似ト
ランスフェクト細胞から調製し、陽性コントロールＲＮＡは２０ｐｆｕ／細胞の
感染数でアデノウイルスを感染させた細胞から単離した。（Ｃ）トランスフェク
トしたアデノウイルスＤＮＡの複製。ウイルスＤＮＡは、トランスフェクション
後７２時間でハート（Hirt）法により採集し、サザンブロットで分析した。Ａｄ
５ＨｉｎｄＩＩＩ−Ｅフラグメントに特異的な〔³²Ｐ〕−標識リボプローブをハ
イブリダイゼーションプローブとして用いた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/19 ４Ｈ０４５ 1/19 1/21 1/21 Ａ６１Ｋ 35/76 5/10 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＤ，ＧＥ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，Ｉ Ｌ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＲ，ＴＴ，Ｕ Ａ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 CA04 DA02 EA02 FA02 GA11 GA19 HA12 HA15 HA17 4B065 AA93X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA44 4C084 AA13 BA35 NA14 4C086 AA01 AA02 AA03 EA16 4C087 AA01 AA02 AA03 BB21 BB33 BC11 BC30 BC83 NA14 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 EA20 FA74 【要約の続き】 作用の証拠が免疫沈澱アッセイを用いて得られた。ＭＡ ＺおよびＳｐ１による活性化もまた、標的として完全な ５型アデノウイルスゲノムを用いたトランスフェクショ ン実験で観察された。Ｌ１およびＬ５両領域からの後期 ｍＲＮＡレベルの増加は、ＭＡＺまたはＳｐ１発現プラ スミドがウイルスＤＮＡとともにトランスフェクトされ たときに観察された。予想に反して、ＭＡＺおよびＳｐ １による主要後期プロモータの活性化は、ウイルスＤＮ Ａが複製できるか否かにかかわらず検出された。

Claims (39)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 直線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントおよび前記直
   線状アデノウイルスゲノムの末端セグメントの間に挿入された核酸を含むアデノ
   ウイルスベクターであって、前記末端セグメントがアデノウイルスゲノムの複製
   開始点の核酸およびパッケージング配列遺伝子を含む前記アデノウイルスベクタ
   ー。
2. 【請求項２】 前記アデノウイルスベクターが５型アデノウイルスである請
   求項１のアデノウイルスベクター。
3. 【請求項３】 前記核酸がｃＤＮＡである請求項１のベクター。
4. 【請求項４】 前記核酸がゲノムＤＮＡである請求項１のベクター。
5. 【請求項５】 前記核酸がＲＮＡである請求項１のベクター。
6. 【請求項６】 前記核酸が蛋白質、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを
   コードする請求項１のベクター。
7. 【請求項７】 さらに機能的に核酸に連結されたＲＮＡ転写プロモータまた
   は核酸に連結された発現成分を含む請求項６のベクター。
8. 【請求項８】 プロモータが、細菌プロモータ、酵母プロモータ、昆虫プロ
   モータまたは哺乳類プロモータを含む請求項６のベクター。
9. 【請求項９】 さらに選択可能なマーカーを含む請求項１のベクター。
10. 【請求項１０】 前記選択可能マーカーがベータガラクトシダーゼまたはベ
    ータラクタマーゼである請求項９のベクター。
11. 【請求項１１】 アデノウイルスゲノムの複製開始点の核酸およびパッケー
    ジング配列遺伝子を欠失しているアデノウイルスゲノムを含むヘルパーアデノウ
    イルスベクター。
12. 【請求項１２】 さらにＥ１Ａ遺伝子を欠失している請求項１１のヘルパー
    アデノウイルスベクター。
13. 【請求項１３】 さらにＥ１Ｂ遺伝子を欠失している請求項１１のヘルパー
    アデノウイルスベクター。
14. 【請求項１４】 さらに、アデノウイルスゲノムの領域内に転写因子の１つ
    または２つ以上の核酸が挿入されている請求項１１のヘルパーアデノウイルスベ
    クター。
15. 【請求項１５】 前記転写因子がＭＡＺである請求項１４のヘルパーアデノ
    ウイルスベクター。
16. 【請求項１６】 前記ＭＡＺの核酸がＭＡＺ核酸の−２６０から＋１１まで
    の配列から成る請求項１４のヘルパーアデノウイルスベクター。
17. 【請求項１７】 前記転写因子がＳＰ１である請求項１４のヘルパーアデノ
    ウイルスベクター。
18. 【請求項１８】 さらに機能的に核酸に連結されたＲＮＡ転写プロモータま
    たは核酸に連結された発現成分を含む請求項１４のベクター。
19. 【請求項１９】 プロモータが、細菌プロモータ、酵母プロモータ、昆虫プ
    ロモータまたは哺乳類プロモータを含む請求項１８のベクター。
20. 【請求項２０】 さらに選択可能なマーカーを含む請求項１１のベクター。
21. 【請求項２１】 前記選択可能マーカーがベータガラクトシダーゼまたはベ
    ータラクタマーゼである請求項２０のベクター。
22. 【請求項２２】 請求項１および１１のベクターを含むホスト細胞。
23. 【請求項２３】 前記ホストが原核細胞または真核細胞である請求項２２の
    ホスト細胞。
24. 【請求項２４】 前記真核細胞が酵母、昆虫、植物または哺乳類細胞である
    請求項２３のホスト細胞。
25. 【請求項２５】 請求項１のベクター、請求項１１のベクター、および転写
    因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクターおよび適切な担体の希釈剤を含
    む医薬組成物。
26. 【請求項２６】 請求項１のベクター、請求項１１のベクター、および転写
    因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクターを細胞にトランスフェクトし、
    それによってアデノウイルス主要後期プロモータを活性化させることを含むアデ
    ノウイルス主要後期プロモータを活性化させる方法。
27. 【請求項２７】 前記転写因子がＭＡＺである請求項２６の方法。
28. 【請求項２８】 前記転写因子がＳＰ１である請求項２６の方法。
29. 【請求項２９】 さらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターで細
    胞をトランスフェクトすることを含む請求項２６の方法。
30. 【請求項３０】 問題の蛋白質をコードする核酸を含有するウイルス粒子の
    製造方法であって、前記方法が請求項１のベクター、請求項１１のベクター、お
    よび転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクターを細胞にトランスフェ
    クトし、それによって前記ウイルス粒子を製造することを含む前記ウイルス粒子
    の製造方法。
31. 【請求項３１】 前記転写因子がＭＡＺである請求項３０の方法。
32. 【請求項３２】 前記転写因子がＳＰ１である請求項３０の方法。
33. 【請求項３３】 さらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターを細
    胞にトランスフェクトすることを含む請求項３０の方法。
34. 【請求項３４】 前記細胞がヒトの細胞である請求項３０の方法。
35. 【請求項３５】 請求項１のベクターおよび適切な希釈剤または担体を含む
    医薬組成物；請求項１０のベクターおよび適切な希釈剤または担体を含む医薬組
    成物；および転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクターおよび適切な
    希釈剤または担体を含む医薬組成物；または請求項１のベクター、請求項１０の
    ベクター、および転写因子の１つまたは２つ以上の核酸を含むベクター並びに適
    切な希釈剤または担体を含む医薬組成物を対象者に投与し、それによって対象者
    に遺伝子を挿入することを含む遺伝子治療方法。
36. 【請求項３６】 前記転写因子がＭＡＺである請求項３５の方法。
37. 【請求項３７】 前記転写因子がＳＰ１である請求項３５の方法。
38. 【請求項３８】 さらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターを含
    む医薬組成物を投与することを含む請求項３５の方法。
39. 【請求項３９】 さらにＥ１Ａ遺伝子をコードする核酸を含むベクターおよ
    び希釈剤または担体を含む医薬組成物を対象者に投与することを含む請求項３５
    の方法。