JP2002523106A - 誘導的発現系 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、真核生物またはウイルス起源の転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を用いる誘導的発現系、および前記転写アクチベーターによってトランスで誘導可能なプロモーターの制御下に置かれた目的とする遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターに関する。本発明は、転写活性化をコードする第一の発現カセットと、前記転写アクチベーターによってトランスで誘導できるプロモーターの制御下に置かれた目的とする遺伝子を有する第二のカセットを有する組換えアデノウイルスベクターにも関する。本発明は、感染性ウイルス粒子、その製造法、真核細胞、およびこのようなベクターまたは発現系を含んでなる医薬組成物、並びに治療または予防目的でのそれらの使用にも関する。
Description
【０００１】
発明の分野 本発明は、転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列、および前記転
写アクチベーターによってトランス活性化形態に誘導することができるプロモー
ターで制御される目的遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターを用い
る誘導的発現系に関する。本発明は、前記転写アクチベーターをコードする第一
の発現カセットと、前記転写アクチベーターによってトランスで誘導することが
できるプロモーターで制御される目的とする遺伝子を有する第二のカセットとを
有する組換えアデノウイルスベクターにも関する。本発明は、このようなベクタ
ーまたは発現系を含んでなる感染性ウイルス粒子、細胞、医薬組成物、および治
療または予防目的でのそれらの使用にも関する。本発明は、特にヒトにおける遺
伝子療法の観点から極めて重要である。
写アクチベーターによってトランス活性化形態に誘導することができるプロモー
ターで制御される目的遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターを用い
る誘導的発現系に関する。本発明は、前記転写アクチベーターをコードする第一
の発現カセットと、前記転写アクチベーターによってトランスで誘導することが
できるプロモーターで制御される目的とする遺伝子を有する第二のカセットとを
有する組換えアデノウイルスベクターにも関する。本発明は、このようなベクタ
ーまたは発現系を含んでなる感染性ウイルス粒子、細胞、医薬組成物、および治
療または予防目的でのそれらの使用にも関する。本発明は、特にヒトにおける遺
伝子療法の観点から極めて重要である。
【０００２】 背景技術 遺伝子療法は、遺伝情報の宿主細胞または生物への伝達として定義される。ヒ
トで用いられた最初の実験は、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺
伝子に影響を与える突然変異による遺伝的免疫不全の患者について１９９０年９
月に米国で開始された。これは、機能障害が遺伝病の原因である欠陥遺伝子を機
能性遺伝子で修正または置換することを含む。この最初の実験の相対的成功によ
りこの手法の開発が助長され、病状を改良する治療遺伝子をインシテューで放出
することを目的とし、他の遺伝的および後天的疾患（癌、ＡＩＤＳのような感染
症など）を治療しようとされるようになった。ほとんどの方法は、治療遺伝子を
その細胞性標的に運ぶためにベクターを用いている。多数のウイルス性および合
成ベクターが最近までに開発されており、当業者が入手可能な多くの公表物の主
題となっている。
トで用いられた最初の実験は、アデニンデアミナーゼ（ＡＤＡ）をコードする遺
伝子に影響を与える突然変異による遺伝的免疫不全の患者について１９９０年９
月に米国で開始された。これは、機能障害が遺伝病の原因である欠陥遺伝子を機
能性遺伝子で修正または置換することを含む。この最初の実験の相対的成功によ
りこの手法の開発が助長され、病状を改良する治療遺伝子をインシテューで放出
することを目的とし、他の遺伝的および後天的疾患（癌、ＡＩＤＳのような感染
症など）を治療しようとされるようになった。ほとんどの方法は、治療遺伝子を
その細胞性標的に運ぶためにベクターを用いている。多数のウイルス性および合
成ベクターが最近までに開発されており、当業者が入手可能な多くの公表物の主
題となっている。
【０００３】 アデノウイルスの遺伝子療法のベクターとしての利点は、既に従来の技術の多
くの文献に記載されている。それらは分裂細胞および静止期細胞など多くの種類
の細胞に感染するが、組込まれず、かつ比較的非病原性である。また、それらは
気道に対し天然の親和性を有する。これらの特異的な特性により、アデノウイル
スは多くの治療用およびワクチン用のベクターと選択されている。例えば、それ
らのゲノムは、ウイルスサイクルに関与した約３０の遺伝子を有する約３６kbの
線状および二本鎖ＤＮＡ分子からなっている。初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４；Ｅは初
期）は、ゲノム中に分散した４つの領域に分布している。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４
領域はウイルス複製に本質的であるが、宿主の抗アデノウイルス免疫応答の改質
に関与するＥ３領域は本質的ではない。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５；Ｌは後期）は
主として構造タンパク質をコードし、部分的に初期転写単位をカバーしている。
それらは、ほとんどが主要後期プロモーターＭＬＰから転写される。また、アデ
ノウイルスゲノムは、その末端にキャプシド化に本質的な５′および３′末端に
位置する逆方向末端配列（ＩＴＲ）と５′ＩＴＲに続くキャプシド化領域からな
るシス作用領域を有する。
くの文献に記載されている。それらは分裂細胞および静止期細胞など多くの種類
の細胞に感染するが、組込まれず、かつ比較的非病原性である。また、それらは
気道に対し天然の親和性を有する。これらの特異的な特性により、アデノウイル
スは多くの治療用およびワクチン用のベクターと選択されている。例えば、それ
らのゲノムは、ウイルスサイクルに関与した約３０の遺伝子を有する約３６kbの
線状および二本鎖ＤＮＡ分子からなっている。初期遺伝子（Ｅ１〜Ｅ４；Ｅは初
期）は、ゲノム中に分散した４つの領域に分布している。Ｅ１、Ｅ２およびＥ４
領域はウイルス複製に本質的であるが、宿主の抗アデノウイルス免疫応答の改質
に関与するＥ３領域は本質的ではない。後期遺伝子（Ｌ１〜Ｌ５；Ｌは後期）は
主として構造タンパク質をコードし、部分的に初期転写単位をカバーしている。
それらは、ほとんどが主要後期プロモーターＭＬＰから転写される。また、アデ
ノウイルスゲノムは、その末端にキャプシド化に本質的な５′および３′末端に
位置する逆方向末端配列（ＩＴＲ）と５′ＩＴＲに続くキャプシド化領域からな
るシス作用領域を有する。
【０００４】 遺伝子療法実験に一般に用いられるアデノウイルスベクターは、環境や宿主生
物での伝播を防止するため、Ｅ１領域の主要部分を欠いている。更にＥ３領域を
欠くことにより、クローニング容量を増加することができる。目的とする遺伝子
を、一方または他方の欠失領域の代わりにウイルスＤＮＡに導入する。しかしな
がら、ウイルスタンパク質の潜在的免疫原性が発現し続けるため、ある種の特定
な用途では、形質導入した細胞の残存および導入遺伝子の安定発現が妨げられる
可能性がある。これらの欠点により、キャプシド化に本質的なシス領域（ＩＴＲ
およびキャプシド化配列）を保存しているが、ウイルス遺伝子のほとんどのイン
・ビボ発現の抑制を目的とする他の遺伝子改質を含んでなる発生ベクター(gener
ation vectors)の構築が正当化されてきた（例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１
５２号明細書を参照されたい）。これに関して、総てのアデノウイルス機能を欠
いているいわゆる最小ベクターが選択される。
物での伝播を防止するため、Ｅ１領域の主要部分を欠いている。更にＥ３領域を
欠くことにより、クローニング容量を増加することができる。目的とする遺伝子
を、一方または他方の欠失領域の代わりにウイルスＤＮＡに導入する。しかしな
がら、ウイルスタンパク質の潜在的免疫原性が発現し続けるため、ある種の特定
な用途では、形質導入した細胞の残存および導入遺伝子の安定発現が妨げられる
可能性がある。これらの欠点により、キャプシド化に本質的なシス領域（ＩＴＲ
およびキャプシド化配列）を保存しているが、ウイルス遺伝子のほとんどのイン
・ビボ発現の抑制を目的とする他の遺伝子改質を含んでなる発生ベクター(gener
ation vectors)の構築が正当化されてきた（例えば、国際出願ＷＯ９４／２８１
５２号明細書を参照されたい）。これに関して、総てのアデノウイルス機能を欠
いているいわゆる最小ベクターが選択される。
【０００５】 現在開発されているベクターのほとんどは、導入遺伝子の構成的発現に基づい
ている。しかしながら、治療遺伝子の発現は、少数の種類の細胞に限定するのが
望ましいことがある。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターおよびエンハ
ンサー、または特異的な一時的または細胞性事象に応答する誘導的発現系によっ
て伝達することができる。
ている。しかしながら、治療遺伝子の発現は、少数の種類の細胞に限定するのが
望ましいことがある。組織特異的発現は、組織特異的プロモーターおよびエンハ
ンサー、または特異的な一時的または細胞性事象に応答する誘導的発現系によっ
て伝達することができる。
【０００６】 現在提供されている多くの誘導的発現系は、特異的インデューサーリガンド（
ステロイドホルモン、インターフェロン、重金属など）によって活性化される内
在性転写因子によって調節されるプロモーターの使用に基づいている。第一の欠
点は、これらの系が標的細胞に内在性活性化因子が存在していなければならない
ことである。更に、内在性の細胞性物質により「バックグラウンドノイズ」が活
性化されるため、規定水準の発現が高くなることが多く、無視し得ない副作用を
生じる可能性がある。
ステロイドホルモン、インターフェロン、重金属など）によって活性化される内
在性転写因子によって調節されるプロモーターの使用に基づいている。第一の欠
点は、これらの系が標的細胞に内在性活性化因子が存在していなければならない
ことである。更に、内在性の細胞性物質により「バックグラウンドノイズ」が活
性化されるため、規定水準の発現が高くなることが多く、無視し得ない副作用を
生じる可能性がある。
【０００７】 原核性因子の使用に基づく若干数の発現系が、近年報告されている。例えば、
単純疱疹ウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６トランス活性化タンパク質）または
酵素Ｇａ１４タンパク質（Webster et al., 1988, Cell 52, 169-178)のテトラ
サイクリン(Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-
551), ラクトース(Miller and Reznikoff監修, オペロン(The operons), Cold S
pring Harbor Laboratory)、またはトリプトファン(Yanofsky et al., 1981, Nu
cleic Acids Res., 9, 6647-6668)細菌性オペロンの発現系が挙げられる。
単純疱疹ウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６トランス活性化タンパク質）または
酵素Ｇａ１４タンパク質（Webster et al., 1988, Cell 52, 169-178)のテトラ
サイクリン(Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-
551), ラクトース(Miller and Reznikoff監修, オペロン(The operons), Cold S
pring Harbor Laboratory)、またはトリプトファン(Yanofsky et al., 1981, Nu
cleic Acids Res., 9, 6647-6668)細菌性オペロンの発現系が挙げられる。
【０００８】 一般に、テトラサイクリン耐性オペロンは、Ｔｎ１０トランスポゾンによって
コードされる(Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol., 172, 185-201)。調節は、
多様なレギュレーターの結合部位を構成する「オペレーター」（ｔｅｔＯ）と呼
ばれる短いヌクレオチド配列によって行われる。従って、テトラサイクリンリプ
レッサー（ｔｅｔＲ）または抗生物質テトラサイクリンが結合することにより、
転写水準がかなり減少する。一方、文献で「テトラサイクリントランスアクチベ
ーター（ｔＴＡ）」と命名されておりｔｅｔＲと単純疱疹ウイルスＶＰ１６タン
パク質の活性化ドメインの１３０Ｃ−末端アミノ酸との融合によって得られるタ
ンパク質を用いて、活性化効果が得られる。基本転写の上流のｔｅｔＯの数コピ
ー（ＴＡＴＡボックス、転写開始部位など）によって制御されるレポーター遺伝
子の発現は、ｔＴＡの同時発現によって検出され、テトラサイクリンの添加によ
って阻害される。テトラサイクリンはｔＴＡと結合することによって、転写を防
止する。この系は、レトロウイルス(Paulus et al., 1996, J. Virol. 70, 62-6
7)およびアデノウイルス(Neering et al., 1996, Blood 4, 1147-1155; Yoshida and Hamada, 1997, Biochem. Biophys. Comm. 230, 426-430; Massie et al.,
1998, J. Virol. 72, 2289-2296)ベクターに関して機能性である。後者の場合に
は、トランスアクチベーターは、ｔＴＡを発現する確立された系をｔｅｔＯエレ
メントおよびＣＭＶプロモーターによって制御される目的とする遺伝子を含むア
デノウイルスベクターに感染させることによって、またはこれらの細胞を２つの
アデノウイルスベクターであって、一方が目的とするカセットを含み他方がｔＴ
Ａを発現するものに同時感染させることによってトランスで提供される。導入遺
伝子の発現がテトラサイクリンの存在下で活性化される逆系は、ｔＴＡ融合タン
パク質の突然変異によって開発されている(Gossen et al., 1995, Science 268,
1766-1769)。ｒｔＴＡ改質タンパク質は、実際にテトラサイクリンの存在下で
のみｔｅｔＯエレメントに結合する。もう一つの変異体であって、これによって
発現が２水準（テトラサイクリンの非存在下およびエストラジオールの存在下）
で制御される変異体は、ｔＴＡをエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイ
ンに融合することによって得られる(Iida et al., 1996, J. Virol. 70, 6054-6
059)。
コードされる(Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol., 172, 185-201)。調節は、
多様なレギュレーターの結合部位を構成する「オペレーター」（ｔｅｔＯ）と呼
ばれる短いヌクレオチド配列によって行われる。従って、テトラサイクリンリプ
レッサー（ｔｅｔＲ）または抗生物質テトラサイクリンが結合することにより、
転写水準がかなり減少する。一方、文献で「テトラサイクリントランスアクチベ
ーター（ｔＴＡ）」と命名されておりｔｅｔＲと単純疱疹ウイルスＶＰ１６タン
パク質の活性化ドメインの１３０Ｃ−末端アミノ酸との融合によって得られるタ
ンパク質を用いて、活性化効果が得られる。基本転写の上流のｔｅｔＯの数コピ
ー（ＴＡＴＡボックス、転写開始部位など）によって制御されるレポーター遺伝
子の発現は、ｔＴＡの同時発現によって検出され、テトラサイクリンの添加によ
って阻害される。テトラサイクリンはｔＴＡと結合することによって、転写を防
止する。この系は、レトロウイルス(Paulus et al., 1996, J. Virol. 70, 62-6
7)およびアデノウイルス(Neering et al., 1996, Blood 4, 1147-1155; Yoshida and Hamada, 1997, Biochem. Biophys. Comm. 230, 426-430; Massie et al.,
1998, J. Virol. 72, 2289-2296)ベクターに関して機能性である。後者の場合に
は、トランスアクチベーターは、ｔＴＡを発現する確立された系をｔｅｔＯエレ
メントおよびＣＭＶプロモーターによって制御される目的とする遺伝子を含むア
デノウイルスベクターに感染させることによって、またはこれらの細胞を２つの
アデノウイルスベクターであって、一方が目的とするカセットを含み他方がｔＴ
Ａを発現するものに同時感染させることによってトランスで提供される。導入遺
伝子の発現がテトラサイクリンの存在下で活性化される逆系は、ｔＴＡ融合タン
パク質の突然変異によって開発されている(Gossen et al., 1995, Science 268,
1766-1769)。ｒｔＴＡ改質タンパク質は、実際にテトラサイクリンの存在下で
のみｔｅｔＯエレメントに結合する。もう一つの変異体であって、これによって
発現が２水準（テトラサイクリンの非存在下およびエストラジオールの存在下）
で制御される変異体は、ｔＴＡをエストロゲンレセプターのリガンド結合ドメイ
ンに融合することによって得られる(Iida et al., 1996, J. Virol. 70, 6054-6
059)。
【０００９】 もう一つの誘導的系は原核性トランス活性化の潜在的免疫原性の治療薬を見出
すための内在性レセプターの使用に基づいている。これに関して、ステロイドホ
ルモンレセプターは、多くの公表物の主題となっている。更に具体的には、糖質
コルチコイドレセプター（ＧＲ）(Israel and Kaufman, 1989, Nucleic Acids R
es. 17, 4589-4604)、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）(Gronemeyer et al.,
1987, EMBO J, 6, 3985-3994)、およびエストロゲンレセプター（ＥＲ）(Klein-
Hitpass et al., 1986, Cell 46, 1053-1061; Koike et al., 1987, Nucleic Ac
ids Res. 15, 2499-2513)が挙げられる。それらは使用する標的細胞、ホルモン
リガンドおよび調節エレメントによって転写をトランス活性化またはトランス抑
制することができるので、それらの作用様式は変化する。トランス活性化につい
ては、ステロイドレセプターはある種の熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）などの
多様な細胞性因子に複合体形成した不活性形態をしている。アゴニストリガンド
（ステロイドホルモン）が結合すると、レセプターのコンホメーションに変化が
生じる。この活性化は細胞性因子の解離および核トランスロケーションを伴い、
レセプターの特異的な短いＤＮＡ配列（標的配列）への結合能を増加し、転写機
構と相互作用し、転写を誘導する。それらの機能を行うために、これらのレセプ
ターは、一般に３つの機能性ドメイン、すなわちそれぞれ転写を活性化するトラ
ンス活性化ドメイン、ＤＮＡ（標的配列）結合ドメイン、およびリガンド結合ド
メインに組織化されている。
すための内在性レセプターの使用に基づいている。これに関して、ステロイドホ
ルモンレセプターは、多くの公表物の主題となっている。更に具体的には、糖質
コルチコイドレセプター（ＧＲ）(Israel and Kaufman, 1989, Nucleic Acids R
es. 17, 4589-4604)、プロゲステロンレセプター（ＰＲ）(Gronemeyer et al.,
1987, EMBO J, 6, 3985-3994)、およびエストロゲンレセプター（ＥＲ）(Klein-
Hitpass et al., 1986, Cell 46, 1053-1061; Koike et al., 1987, Nucleic Ac
ids Res. 15, 2499-2513)が挙げられる。それらは使用する標的細胞、ホルモン
リガンドおよび調節エレメントによって転写をトランス活性化またはトランス抑
制することができるので、それらの作用様式は変化する。トランス活性化につい
ては、ステロイドレセプターはある種の熱ショックタンパク質（ｈｓｐ）などの
多様な細胞性因子に複合体形成した不活性形態をしている。アゴニストリガンド
（ステロイドホルモン）が結合すると、レセプターのコンホメーションに変化が
生じる。この活性化は細胞性因子の解離および核トランスロケーションを伴い、
レセプターの特異的な短いＤＮＡ配列（標的配列）への結合能を増加し、転写機
構と相互作用し、転写を誘導する。それらの機能を行うために、これらのレセプ
ターは、一般に３つの機能性ドメイン、すなわちそれぞれ転写を活性化するトラ
ンス活性化ドメイン、ＤＮＡ（標的配列）結合ドメイン、およびリガンド結合ド
メインに組織化されている。
【００１０】 非天然の合成リガンドに優先的に応答する改質レセプターも、文献に記載され
ている。例えば、Wang et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8
184)は、ＲＵ４８６分子によって活性化することができるが、内在性プロゲステ
ロンによっては活性化されず、切りつめたプロゲステロンレセプター（ΔＰＲ）
のリガンド結合ドメイン、酵母Ｇａ１４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、およ
びＶＰ１６タンパク質のトランス活性化ドメインの融合によって生じるキメラを
構築した。しかしながら、基本活性は高いままであり、キメラタンパク質は細胞
性転写因子を潜在的に妨げることがある。リガンド結合ドメインで改質されたＥ
ＲおよびＧＲレセプターの変異体も、報告されている。例えば、ＥＲレセプター
の５２１位のグリシンをアルギニンで置換することによって得られるＥＲＴ突然
変異体は内在性エストロゲンを結合することができないが、タモキシフェンのよ
うな合成リガンドで活性化してＥＲＥ（エストロゲン応答性エレメント(estroge
n responsive element)）標的配列によって調節される転写を活性化することが
できる。同様な変異体が、７４７位でイソロイシンをトレオニンで置換すること
によって改質したＧＲレセプターについても構築されている(Roux et al., 1996
, Molecular Endocrinology 10, 1214-1226)。ＧＲｄｅｘと呼ばれるこの変異体
は内在性糖質コルチコイドを結合することができないが、デキサメタゾンのよう
な合成リガンドで活性化することができる。活性化されてしまうと、これはＧＲ
Ｅ（糖質コルチコイド応答性エレメント; Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237
-2240)標的配列を認識し、それと結合したプロモーターから転写を刺激する。
ている。例えば、Wang et al. (1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8180-8
184)は、ＲＵ４８６分子によって活性化することができるが、内在性プロゲステ
ロンによっては活性化されず、切りつめたプロゲステロンレセプター（ΔＰＲ）
のリガンド結合ドメイン、酵母Ｇａ１４タンパク質のＤＮＡ結合ドメイン、およ
びＶＰ１６タンパク質のトランス活性化ドメインの融合によって生じるキメラを
構築した。しかしながら、基本活性は高いままであり、キメラタンパク質は細胞
性転写因子を潜在的に妨げることがある。リガンド結合ドメインで改質されたＥ
ＲおよびＧＲレセプターの変異体も、報告されている。例えば、ＥＲレセプター
の５２１位のグリシンをアルギニンで置換することによって得られるＥＲＴ突然
変異体は内在性エストロゲンを結合することができないが、タモキシフェンのよ
うな合成リガンドで活性化してＥＲＥ（エストロゲン応答性エレメント(estroge
n responsive element)）標的配列によって調節される転写を活性化することが
できる。同様な変異体が、７４７位でイソロイシンをトレオニンで置換すること
によって改質したＧＲレセプターについても構築されている(Roux et al., 1996
, Molecular Endocrinology 10, 1214-1226)。ＧＲｄｅｘと呼ばれるこの変異体
は内在性糖質コルチコイドを結合することができないが、デキサメタゾンのよう
な合成リガンドで活性化することができる。活性化されてしまうと、これはＧＲ
Ｅ（糖質コルチコイド応答性エレメント; Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237
-2240)標的配列を認識し、それと結合したプロモーターから転写を刺激する。
【００１１】 もう一つの誘導的発現系は、エクジソンに応答する昆虫ステロイドレセプター
を用いる（ＥｃＲ）。このレセプターはエクジソンによって活性化され、ショウ
ジョウバエの超過気孔タンパク質（ＵＳＰ）とヘテロダイマーを形成し、特異的
標的配列（エクジソン応答性エレメントについてはＥｃＲＥ）に結合して、転写
を活性化する。No et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)
は、ＥｃＲレセプターのＬＢＤ、ＥｃｒのＤＮＡ結合ドメインとＧＲレセプター
とのハイブリッド、およびＶＰ１６のトランス活性化ドメインを融合することに
よって得られるＶｇＥｃＲ突然変異体レセプターを作成した。突然変異体は、エ
クジソンまたはその類似体であるムリストンＡの存在下でＵＳＰタンパク質また
はそのヒト同族体であるレチノイン酸Ｘレセプター（ＲＸＲ）とヘテロダイマー
を形成し、ＥｃＲおよびＧＲレセプターに応答するモチーフを含んでなるハイブ
リッド配列（５ｘＥ／ＧＲＥ）によって制御される遺伝子の転写を活性化するこ
とができる。このような系は、可能性のある内因性活性化を防止する。
を用いる（ＥｃＲ）。このレセプターはエクジソンによって活性化され、ショウ
ジョウバエの超過気孔タンパク質（ＵＳＰ）とヘテロダイマーを形成し、特異的
標的配列（エクジソン応答性エレメントについてはＥｃＲＥ）に結合して、転写
を活性化する。No et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)
は、ＥｃＲレセプターのＬＢＤ、ＥｃｒのＤＮＡ結合ドメインとＧＲレセプター
とのハイブリッド、およびＶＰ１６のトランス活性化ドメインを融合することに
よって得られるＶｇＥｃＲ突然変異体レセプターを作成した。突然変異体は、エ
クジソンまたはその類似体であるムリストンＡの存在下でＵＳＰタンパク質また
はそのヒト同族体であるレチノイン酸Ｘレセプター（ＲＸＲ）とヘテロダイマー
を形成し、ＥｃＲおよびＧＲレセプターに応答するモチーフを含んでなるハイブ
リッド配列（５ｘＥ／ＧＲＥ）によって制御される遺伝子の転写を活性化するこ
とができる。このような系は、可能性のある内因性活性化を防止する。
【００１２】 文献記載のもう一つの誘導的発現系は、イムノフィリンを用いている。Rivera
et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032)は、リガンドの存在下で組み立てた２
成分を有する系を開発した。更に具体的には、第一の成分はＺＦＨＤ１転写因子
（ＤＮＡ結合ドメインを有する）とＦＫＢＰ１２イムノフィリンとの融合体であ
り、第二の成分はＮＦκＢｐ６５因子のトランス活性化ドメインとＦＲＡＰ（Ｆ
ＫＢＰ１２−ラパマイシン結合タンパク質）との融合体である。トランスアクチ
ベーターは、これらの２成分と、ＦＫＢＰ１２とＦＲＡＰ部分を連結するラパマ
イシンとを結合するヘテロダイマーの形態で活性化され、ＺＦＨＤ１標的エレメ
ントによって制御される導入遺伝子の発現を誘導することができる。
et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032)は、リガンドの存在下で組み立てた２
成分を有する系を開発した。更に具体的には、第一の成分はＺＦＨＤ１転写因子
（ＤＮＡ結合ドメインを有する）とＦＫＢＰ１２イムノフィリンとの融合体であ
り、第二の成分はＮＦκＢｐ６５因子のトランス活性化ドメインとＦＲＡＰ（Ｆ
ＫＢＰ１２−ラパマイシン結合タンパク質）との融合体である。トランスアクチ
ベーターは、これらの２成分と、ＦＫＢＰ１２とＦＲＡＰ部分を連結するラパマ
イシンとを結合するヘテロダイマーの形態で活性化され、ＺＦＨＤ１標的エレメ
ントによって制御される導入遺伝子の発現を誘導することができる。
【００１３】 最後に、Dolwick et al. (1993, Mol. Pharmacol. 44, 911-917)は、生体異物
およびヒトによって創り出された化学物質の代謝に関与するアリール炭化水素レ
セプター（ＡｈＲ）を同定した。ＡｈＲは、不活性形態では、ｈｓｐ９０シャペ
ロンタンパク質など様々な細胞性因子に複合体形成される。生体異物リガンドの
結合により、複合体の解離、ＡｈＲの核へのトランスロケーション、およびＡｒ
ｎｔタンパク質（アリール炭化水素レセプター核トランスロケーター; Hoffman
et al., 1991, Science 252, 954-958)によるヘテロダイマーの形成が誘導され
る。ヘテロダイマーがＸＲＥ（生体異物応答性エレメント）と呼ばれるＤＮＡの
標的エレメントへ結合することによって、下流の遺伝子配列の転写が誘導される
。ＸＲＥ配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはシトクロムＰ４
５０１Ａ１のような薬剤の代謝に関与する酵素をコードする多数の遺伝子のプロ
モーター領域に含まれる。ＡｈＲおよびＡｒｎｔは、標的配列の認識、ヘテロダ
イマリゼーション(heterodimerization)およびリガンドへの結合に関与するドメ
インを有する。ＡｈＲ／Ａｒｎｔ複合体によるトランス活性化の研究の多くは、
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）リガンド
を用いている。
およびヒトによって創り出された化学物質の代謝に関与するアリール炭化水素レ
セプター（ＡｈＲ）を同定した。ＡｈＲは、不活性形態では、ｈｓｐ９０シャペ
ロンタンパク質など様々な細胞性因子に複合体形成される。生体異物リガンドの
結合により、複合体の解離、ＡｈＲの核へのトランスロケーション、およびＡｒ
ｎｔタンパク質（アリール炭化水素レセプター核トランスロケーター; Hoffman
et al., 1991, Science 252, 954-958)によるヘテロダイマーの形成が誘導され
る。ヘテロダイマーがＸＲＥ（生体異物応答性エレメント）と呼ばれるＤＮＡの
標的エレメントへ結合することによって、下流の遺伝子配列の転写が誘導される
。ＸＲＥ配列は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼまたはシトクロムＰ４
５０１Ａ１のような薬剤の代謝に関与する酵素をコードする多数の遺伝子のプロ
モーター領域に含まれる。ＡｈＲおよびＡｒｎｔは、標的配列の認識、ヘテロダ
イマリゼーション(heterodimerization)およびリガンドへの結合に関与するドメ
インを有する。ＡｈＲ／Ａｒｎｔ複合体によるトランス活性化の研究の多くは、
２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）リガンド
を用いている。
【００１４】
本発明は、外来薬理学的分子を提供することによって活性化することができる
トランスアクチベーターによって発現が調節される目的遺伝子を含んでなるアデ
ノウイルスベクターを用いる誘導的発現系を提供する。この系は、更に詳細には
ステロイドレセプターの使用に基づいている。活性化されてしまうと、レセプタ
ー／リガンド複合体はその標的配列に結合し、治療遺伝子の発現をトランス活性
化することができる。Ｅ１領域の置換としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初
期プロモーターによって構成的に発現されるＧＲｄｅｘ突然変異体ステロイドレ
セプターの発現のためのカセット、およびＥ３領域の置換としてＧＲＥ標的配列
を含むＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）プロモーターの下流にあるヒトIX
因子（ＦIX）遺伝子の発現のためのカセットを含む組換えアデノウイルスベクタ
ーを構築した。下記の実験により、イン・ビトロおよびイン・ビボでの誘導的系
の機能性を示す。同様に、ER（商品名）レセプターも、ＣＭＶプロモーターの制
御下でアデノウイルスのＥ１領域に挿入した。この場合には、ＦIX遺伝子の誘導
カセットは、ＨＳＶ（単純疱疹ウイルス）ＴＫ（チミジンキナーゼ）遺伝子と結
合したＥＲＥ配列によって調節される。本発明に関して検討を行った第三の系で
は、ＶｇＥｃＲ改質レセプターおよびヒトＲＸＲレセプターを用いており、その
配列はアデノウイルスのＥ１領域に導入されている。Ｅ３領域にある誘導カセッ
トにより、ＦIXｃＤＮＡは５ｘＥ／ＧＲＥハイブリッドエレメントの制御下に置
かれる。
トランスアクチベーターによって発現が調節される目的遺伝子を含んでなるアデ
ノウイルスベクターを用いる誘導的発現系を提供する。この系は、更に詳細には
ステロイドレセプターの使用に基づいている。活性化されてしまうと、レセプタ
ー／リガンド複合体はその標的配列に結合し、治療遺伝子の発現をトランス活性
化することができる。Ｅ１領域の置換としてサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初
期プロモーターによって構成的に発現されるＧＲｄｅｘ突然変異体ステロイドレ
セプターの発現のためのカセット、およびＥ３領域の置換としてＧＲＥ標的配列
を含むＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）プロモーターの下流にあるヒトIX
因子（ＦIX）遺伝子の発現のためのカセットを含む組換えアデノウイルスベクタ
ーを構築した。下記の実験により、イン・ビトロおよびイン・ビボでの誘導的系
の機能性を示す。同様に、ER（商品名）レセプターも、ＣＭＶプロモーターの制
御下でアデノウイルスのＥ１領域に挿入した。この場合には、ＦIX遺伝子の誘導
カセットは、ＨＳＶ（単純疱疹ウイルス）ＴＫ（チミジンキナーゼ）遺伝子と結
合したＥＲＥ配列によって調節される。本発明に関して検討を行った第三の系で
は、ＶｇＥｃＲ改質レセプターおよびヒトＲＸＲレセプターを用いており、その
配列はアデノウイルスのＥ１領域に導入されている。Ｅ３領域にある誘導カセッ
トにより、ＦIXｃＤＮＡは５ｘＥ／ＧＲＥハイブリッドエレメントの制御下に置
かれる。
【００１５】 本発明の目的は、特に特異性（内在性の細胞性因子ではなく毒性のない外来性
物質による活性化）および誘導性（インデューサーの非存在下での最小基本活性
および活性化状態における導入遺伝子の高発現）を改良することによって現在用
いられている遺伝子療法ベクターの欠陥を除くことである。本発明の主題は、抗
腫瘍分子（抗体、サイトカイン、ケモカイン）のような可溶性分子の発現を必要
とする様々な遺伝子療法実験、または治療遺伝子の発現を生体の要求によって調
節しなければならない総ての場合に応用することができる。本発明は、遺伝子の
発現が発生の所定の段階で細胞傷害性であるかまたは減少する遺伝子を分析する
こともできる。
物質による活性化）および誘導性（インデューサーの非存在下での最小基本活性
および活性化状態における導入遺伝子の高発現）を改良することによって現在用
いられている遺伝子療法ベクターの欠陥を除くことである。本発明の主題は、抗
腫瘍分子（抗体、サイトカイン、ケモカイン）のような可溶性分子の発現を必要
とする様々な遺伝子療法実験、または治療遺伝子の発現を生体の要求によって調
節しなければならない総ての場合に応用することができる。本発明は、遺伝子の
発現が発生の所定の段階で細胞傷害性であるかまたは減少する遺伝子を分析する
こともできる。
【００１６】 これが、本発明の主題が、 (i) 真核生物またはウイルス起源の転写アクチベーターをコードし、宿主細
胞または生物での発現に適する調節エレメントによって制御されるヌクレオチド
配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される目的遺伝子を含んでなる、組換えアデノウイルスベク
ター を含んでなる、誘導的発現系である理由である。
胞または生物での発現に適する調節エレメントによって制御されるヌクレオチド
配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される目的遺伝子を含んでなる、組換えアデノウイルスベク
ター を含んでなる、誘導的発現系である理由である。
【００１７】
【発明の具体的説明】 本発明の目的のためには、「転写アクチベーター」という用語は、転写時に積
極的作用を発揮する、すなわち前記転写アクチベーターに応答する適当な調節エ
レメントを用いて任意の遺伝子の転写を開始しまたは刺激する能力を有するポリ
ペプチド、またはポリペプチドの組を表す。転写に対する積極的効果は、アクチ
ベーターの調節エレメントへの結合によって直接伝達するのが好ましいが、１以
上の細胞性因子によって間接的に伝達することができる。特徴的なＤＮＡ配列（
標的配列）を結合し、これと結合するプロモーターを活性化することができるリ
ガンド依存性転写アクチベーターを用いるのが好ましい。このような転写アクチ
ベーターは、当該技術分野の状態で記載されている。本発明に関して、転写アク
チベーターはモノマーまたはマルチマー（好ましくは、二量体）の形態の単一ポ
リペプチドであることができ、またはヘテロマーを形成するポリペプチドの組（
好ましくは、ヘテロマーを形成する２つのポリペプチドの組）の結合によって得
ることができる。本発明で用いる転写アクチベーターは、真核またはウイルス性
の任意の生物、特に酵母、昆虫、脊椎動物またはウイルスから誘導することがで
き、または混合起源を有する、すなわち多様な起源の成分から形成することがで
きる。
極的作用を発揮する、すなわち前記転写アクチベーターに応答する適当な調節エ
レメントを用いて任意の遺伝子の転写を開始しまたは刺激する能力を有するポリ
ペプチド、またはポリペプチドの組を表す。転写に対する積極的効果は、アクチ
ベーターの調節エレメントへの結合によって直接伝達するのが好ましいが、１以
上の細胞性因子によって間接的に伝達することができる。特徴的なＤＮＡ配列（
標的配列）を結合し、これと結合するプロモーターを活性化することができるリ
ガンド依存性転写アクチベーターを用いるのが好ましい。このような転写アクチ
ベーターは、当該技術分野の状態で記載されている。本発明に関して、転写アク
チベーターはモノマーまたはマルチマー（好ましくは、二量体）の形態の単一ポ
リペプチドであることができ、またはヘテロマーを形成するポリペプチドの組（
好ましくは、ヘテロマーを形成する２つのポリペプチドの組）の結合によって得
ることができる。本発明で用いる転写アクチベーターは、真核またはウイルス性
の任意の生物、特に酵母、昆虫、脊椎動物またはウイルスから誘導することがで
き、または混合起源を有する、すなわち多様な起源の成分から形成することがで
きる。
【００１８】 本発明での使用にて記する転写アクチベーターは、少なくとも３種類の機能性
ドメイン、すなわちそれぞれトランス活性化ドメイン、ＤＮＡ（標的配列）結合
ドメイン、およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含んでなる。本発明に関し
ては、各種ドメインの順序は重要ではない。また、それらは、（場合によっては
それぞれの機能に関与する残基が重なり合って）連続的または不連続的にアミノ
酸配列に分布させ、前記転写アクチベーターを形成する１以上のポリペプチドに
配置することができる。更に、これは、数個の同種のドメインを含んでなること
ができる。適当な例は、Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032)によっ
て開発されたヘテロダイマーからなり、これはラパマイシンのＦＫＢＰ１２およ
びＦＲＡＰ部分への結合によって活性化される。
ドメイン、すなわちそれぞれトランス活性化ドメイン、ＤＮＡ（標的配列）結合
ドメイン、およびリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含んでなる。本発明に関し
ては、各種ドメインの順序は重要ではない。また、それらは、（場合によっては
それぞれの機能に関与する残基が重なり合って）連続的または不連続的にアミノ
酸配列に分布させ、前記転写アクチベーターを形成する１以上のポリペプチドに
配置することができる。更に、これは、数個の同種のドメインを含んでなること
ができる。適当な例は、Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032)によっ
て開発されたヘテロダイマーからなり、これはラパマイシンのＦＫＢＰ１２およ
びＦＲＡＰ部分への結合によって活性化される。
【００１９】 「リガンド結合ドメイン」という用語は、適当なインデューサー−リガンドと
相互作用する転写アクチベーターの部分を表す。ＬＢＤ−インデューサー相互作
用によって転写アクチベーターが活性化状態になり、これは転写活性化に必要な
段階である。ＬＢＤは、好ましくは前記転写アクチベーターを構成するポリペプ
チドのＣ末端に配置される。
相互作用する転写アクチベーターの部分を表す。ＬＢＤ−インデューサー相互作
用によって転写アクチベーターが活性化状態になり、これは転写活性化に必要な
段階である。ＬＢＤは、好ましくは前記転写アクチベーターを構成するポリペプ
チドのＣ末端に配置される。
【００２０】 「ＤＮＡ結合ドメイン」という用語は、目的とする遺伝子の発現を制御しかつ
選択された転写アクチベーターに特異的な誘導プロモーターに存在する標的ＤＮ
Ａ配列と相互作用する転写アクチベーターの部分を表す。前記標的配列は、一般
的には少なくとも１つのＴＡＴＡボックスを含むプロモーター領域の上流に配置
され、転写アクチベーターによって認識されるモチーフから構成される。これら
のモチーフは、特異的構造（パリンドローム、センスまたは逆方向反復配列など
）を形成することができる。それぞれの転写アクチベーターに適する標的配列は
、文献に記載されている。例えば、 ＧＲレセプターまたは類似体（ＧＲｄｅｘ）由来のＤＮＡ結合ドメインによっ
て認識されるTGTTCTモチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＧＲＥ（糖
質コルチコイド応答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'GGTACANNNT
GTTCT3'（但し、Nは任意のヌクレオチドを表す）からなる； ＥＲレセプターまたは類似体（ＥＲＴ）由来のＤＮＡ結合ドメインによって認
識される5'AGGTCA3'モチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＥＲＥ（エ
ストロゲン応答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'AGGTCANNNTGACC
3'（但し、Nは任意のヌクレオチドを表す）からなる； 酵母Ｇａｌ４レセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識
される配列5'CGGAGTACTGTCCTCCG3'（またはその相補的配列）のＵＡＳ（上流活
性化配列）標的配列； ＥｃＲレセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識される
GACAAGモチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＥｃＲＥ（エクジソン応
答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3'
からなる； ＥｃＲとＧＲのハイブリッドまたは類似体であるＤＮＡ結合ドメインによって
認識される配列5'AGGTCANAGAACA3'（またはその相補的配列）の５ｘＥ／ＧＲＥ
配列； ＺＦＨＤ１転写因子によって認識される標的配列5'TAATTANGGGNG3'（但し、N
は任意のヌクレオチドを表す）； ＡｈＲレセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識される
配列5'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3'のＸＲＥ（生体異物応答性エレメント）
標的配列 が挙げられる。
選択された転写アクチベーターに特異的な誘導プロモーターに存在する標的ＤＮ
Ａ配列と相互作用する転写アクチベーターの部分を表す。前記標的配列は、一般
的には少なくとも１つのＴＡＴＡボックスを含むプロモーター領域の上流に配置
され、転写アクチベーターによって認識されるモチーフから構成される。これら
のモチーフは、特異的構造（パリンドローム、センスまたは逆方向反復配列など
）を形成することができる。それぞれの転写アクチベーターに適する標的配列は
、文献に記載されている。例えば、 ＧＲレセプターまたは類似体（ＧＲｄｅｘ）由来のＤＮＡ結合ドメインによっ
て認識されるTGTTCTモチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＧＲＥ（糖
質コルチコイド応答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'GGTACANNNT
GTTCT3'（但し、Nは任意のヌクレオチドを表す）からなる； ＥＲレセプターまたは類似体（ＥＲＴ）由来のＤＮＡ結合ドメインによって認
識される5'AGGTCA3'モチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＥＲＥ（エ
ストロゲン応答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'AGGTCANNNTGACC
3'（但し、Nは任意のヌクレオチドを表す）からなる； 酵母Ｇａｌ４レセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識
される配列5'CGGAGTACTGTCCTCCG3'（またはその相補的配列）のＵＡＳ（上流活
性化配列）標的配列； ＥｃＲレセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識される
GACAAGモチーフ（またはその相補的配列）を含んでなるＥｃＲＥ（エクジソン応
答性エレメント）標的配列。好ましい例は、配列5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3'
からなる； ＥｃＲとＧＲのハイブリッドまたは類似体であるＤＮＡ結合ドメインによって
認識される配列5'AGGTCANAGAACA3'（またはその相補的配列）の５ｘＥ／ＧＲＥ
配列； ＺＦＨＤ１転写因子によって認識される標的配列5'TAATTANGGGNG3'（但し、N
は任意のヌクレオチドを表す）； ＡｈＲレセプターまたは類似体由来のＤＮＡ結合ドメインによって認識される
配列5'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3'のＸＲＥ（生体異物応答性エレメント）
標的配列 が挙げられる。
【００２１】 「トランス活性化ドメイン」という用語は、細胞組織と相互作用し、転写アク
チベーターに応答する標的配列によって遺伝子転写を開始しまたは刺激するよう
にする前記アクチベーターの部分を表す。このドメインは、通常の転写因子（Ｎ
ＦκＢ、ＳＰ−１など）またはリガンド依存因子（ステロイドレセプター、イム
ノフィリン、ＡｈＲなど）から誘導することができる。ＶＰ１６の１３０のＣ末
端アミノ酸を含んでなるドメインが、特に適当である。
チベーターに応答する標的配列によって遺伝子転写を開始しまたは刺激するよう
にする前記アクチベーターの部分を表す。このドメインは、通常の転写因子（Ｎ
ＦκＢ、ＳＰ−１など）またはリガンド依存因子（ステロイドレセプター、イム
ノフィリン、ＡｈＲなど）から誘導することができる。ＶＰ１６の１３０のＣ末
端アミノ酸を含んでなるドメインが、特に適当である。
【００２２】 本発明に関連して使用される転写アクチベーターによって誘導されるトランス
活性化は、単に通常の手法を用いて、例えばインデューサーで活性化したレセプ
ターの存在下にて適当な標的配列またはその発現生成物（ノーザンブロット、ウ
ェスタンブロット、免疫蛍光分析法）の合成の制御下にある所定の遺伝子の発現
を追跡することによって立証することができる。詳細な実験は、以下の例に示し
ている。少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０
倍の差は、本発明による発現系のトランス活性化能を反映している。
活性化は、単に通常の手法を用いて、例えばインデューサーで活性化したレセプ
ターの存在下にて適当な標的配列またはその発現生成物（ノーザンブロット、ウ
ェスタンブロット、免疫蛍光分析法）の合成の制御下にある所定の遺伝子の発現
を追跡することによって立証することができる。詳細な実験は、以下の例に示し
ている。少なくとも２倍、有利には少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０
倍の差は、本発明による発現系のトランス活性化能を反映している。
【００２３】 これらの定義は、ＧＲレセプターの例を用いて示すことができる。そのトラン
ス活性化ドメインは残基２７２と４００の間のＮ末端部分に配置され(Jonat et
al., 1990, Cell 62, 1189-1204)、６６アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインは残基４
２１と４８７の間に配置され(Lucibello et al., 1990, EMBO J. 9, 2827-2834)
、約３００アミノ酸のホルモン−リガンド結合ドメインはＣ末端部分に配置され
る(Kerpolla et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13, 3782-3791)。この後者のド
メインは、ＧＲの二量体化、その核配置およびｈｓｐタンパク質との相互作用に
関与する配列も含んでなる。トランス活性化は、レセプター二量体のＧＲＥ標的
配列への結合によって伝達される。
ス活性化ドメインは残基２７２と４００の間のＮ末端部分に配置され(Jonat et
al., 1990, Cell 62, 1189-1204)、６６アミノ酸のＤＮＡ結合ドメインは残基４
２１と４８７の間に配置され(Lucibello et al., 1990, EMBO J. 9, 2827-2834)
、約３００アミノ酸のホルモン−リガンド結合ドメインはＣ末端部分に配置され
る(Kerpolla et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13, 3782-3791)。この後者のド
メインは、ＧＲの二量体化、その核配置およびｈｓｐタンパク質との相互作用に
関与する配列も含んでなる。トランス活性化は、レセプター二量体のＧＲＥ標的
配列への結合によって伝達される。
【００２４】 本発明による誘導的発現系に含まれる転写アクチベーターは、エストロゲン（
ＥＲ）、糖質コルチコイド（ＧＲ）、プロゲステロン（ＰＲ）、ビタミンＤ、エ
クジソン（ＥｃＲ）、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、胸腺ホルモン、レチノ
イン酸およびレチノイン酸Ｘレセプターからなる群から選択されるステロイドホ
ルモンレセプター、またはイムノフィリン、またはアリール炭化水素レセプター
（ＡｈＲ）由来のドメインの全部または一部を含んでなることが有利である。
ＥＲ）、糖質コルチコイド（ＧＲ）、プロゲステロン（ＰＲ）、ビタミンＤ、エ
クジソン（ＥｃＲ）、鉱質コルチコイド、アンドロゲン、胸腺ホルモン、レチノ
イン酸およびレチノイン酸Ｘレセプターからなる群から選択されるステロイドホ
ルモンレセプター、またはイムノフィリン、またはアリール炭化水素レセプター
（ＡｈＲ）由来のドメインの全部または一部を含んでなることが有利である。
【００２５】 本発明に関しては、改質レセプターを用いることができる。有利なことには、
改質レセプターは天然インデューサーによりその活性化能を喪失し、非天然イン
デューサーにより活性化能を獲得しており、本来のレセプターのトランス活性化
能を保持している。当業者であれば、これに関して改質を行うことを知っている
。それらは様々であることができ（天然レセプターの１以上の残基の欠失、置換
および／または付加）、１以上のドメインに関係している。好ましくは、改質し
た機能性ドメインはその本来の同等物と少なくとも７０％、有利には少なくとも
８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列
同一性を有する。
改質レセプターは天然インデューサーによりその活性化能を喪失し、非天然イン
デューサーにより活性化能を獲得しており、本来のレセプターのトランス活性化
能を保持している。当業者であれば、これに関して改質を行うことを知っている
。それらは様々であることができ（天然レセプターの１以上の残基の欠失、置換
および／または付加）、１以上のドメインに関係している。好ましくは、改質し
た機能性ドメインはその本来の同等物と少なくとも７０％、有利には少なくとも
８０％、好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の配列
同一性を有する。
【００２６】 第一の態様によれば、ＬＢＤで改質されたレセプターを用いて、非天然インデ
ューサーによって活性化されるようにすることができる。好ましい例は、前記の
ＧＲｄｅｘ（Ｉ７４７Ｔ）およびＥＲＴ（Ｇ５２１Ｒ）突然変異体からなってい
る。
ューサーによって活性化されるようにすることができる。好ましい例は、前記の
ＧＲｄｅｘ（Ｉ７４７Ｔ）およびＥＲＴ（Ｇ５２１Ｒ）突然変異体からなってい
る。
【００２７】 様々なポリペプチドまたはポリペプチド断片を含んでなるキメラ転写アクチベ
ーターの使用を考えることもできる。これは、異なる起源の機能性ドメインの融
合または結合によって生じるのが有利である。具体的には、様々なレセプター間
で機能性ドメインを交換することができ、総ての可能な組合せは本発明の範囲内
にある。例えば、内在性レセプター／リガンド複合体による妨害を減少させるた
めに、ステロイドレセプターのＤＮＡ結合ドメインを非ヒトレセプター（ウイル
スまたは動物起源、または下等真核生物）、例えば、動物ステロイドレセプター
、酵母レセプター（Ｇａｌ４）などに置換するすることが考えられ、唯一の条件
は標的配列を選択されるＤＮＡ結合ドメインに適合させることである。このよう
な適合は、当業者の範囲内にある。例えば、ＤＮＡ結合ドメインがＧａｌ４由来
であるときには、用いられる誘導プロモーターはＧａｌ４に応答するＵＡＳ（上
流活性化配列）を含む。更に、トランス活性化ドメインは、任意の既知転写活性
化ドメイン、特に単純疱疹ウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）またはＮＦＫＢ
因子ｐ６５、詳細にはそのＣ末端から誘導することができる。ステロイドレセプ
ター由来のＬＢＤ、ＶＰ１６由来のトランス活性化ドメイン、およびＧａｌ４ま
たはステロイドレセプター由来のＤＮＡ結合ドメインを組み合わせる転写アクチ
ベーターは、本発明の使用に適している。これに関しては、Ｇａｌ４の残基１〜
７４を用いるのが好ましい。しかしながら、他の組合せを考えることもできる。
ーターの使用を考えることもできる。これは、異なる起源の機能性ドメインの融
合または結合によって生じるのが有利である。具体的には、様々なレセプター間
で機能性ドメインを交換することができ、総ての可能な組合せは本発明の範囲内
にある。例えば、内在性レセプター／リガンド複合体による妨害を減少させるた
めに、ステロイドレセプターのＤＮＡ結合ドメインを非ヒトレセプター（ウイル
スまたは動物起源、または下等真核生物）、例えば、動物ステロイドレセプター
、酵母レセプター（Ｇａｌ４）などに置換するすることが考えられ、唯一の条件
は標的配列を選択されるＤＮＡ結合ドメインに適合させることである。このよう
な適合は、当業者の範囲内にある。例えば、ＤＮＡ結合ドメインがＧａｌ４由来
であるときには、用いられる誘導プロモーターはＧａｌ４に応答するＵＡＳ（上
流活性化配列）を含む。更に、トランス活性化ドメインは、任意の既知転写活性
化ドメイン、特に単純疱疹ウイルスタンパク質１６（ＶＰ１６）またはＮＦＫＢ
因子ｐ６５、詳細にはそのＣ末端から誘導することができる。ステロイドレセプ
ター由来のＬＢＤ、ＶＰ１６由来のトランス活性化ドメイン、およびＧａｌ４ま
たはステロイドレセプター由来のＤＮＡ結合ドメインを組み合わせる転写アクチ
ベーターは、本発明の使用に適している。これに関しては、Ｇａｌ４の残基１〜
７４を用いるのが好ましい。しかしながら、他の組合せを考えることもできる。
【００２８】 更に、異なるポリペプチド断片のハイブリッドである機能性ドメインを用いる
ことができる。一つの考えられる例は、ＥｃＲおよびＧＲレセプターのハイブリ
ッドであり、エクジソンおよび糖質コルチコイドに応答するモチーフを含んでな
るハイブリッド標的配列を認識するＤＮＡ結合ドメインからなっている。
ことができる。一つの考えられる例は、ＥｃＲおよびＧＲレセプターのハイブリ
ッドであり、エクジソンおよび糖質コルチコイドに応答するモチーフを含んでな
るハイブリッド標的配列を認識するＤＮＡ結合ドメインからなっている。
【００２９】 本発明に関する好ましい転写アクチベーターは、 (i) ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、および糖質コルチコイド
レセプター由来のＬＢＤを含んでなる、ＧＲｄｅｘと表されるポリペプチドであ
って、前記レセプターがそのＬＢＤにおいて７４７位のイソロイシンをトレオニ
ンで置換することによって改質されたポリペプチド、 (ii) ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、およびエストロゲンレセ
プター由来のＬＢＤを含んでなる、ＥＲＴと表されるポリペプチドであって、前
記レセプターがそのＬＢＤにおいて特に５２１位のグリシンをアルギニンで置換
することによって改質されたポリペプチド、 (iii) エクジソンレセプター、ＥｃＲおよびＧＲレセプターのドメイン由来の
ハイブリッドＤＮＡ結合ドメイン、およびＶＰ１６ウイルスタンパク質由来のト
ランス活性化ドメインを含んでなる第一のポリペプチドと、Drosophila USPタン
パク質またはヒトレチノイン酸Ｘレセプター（ＲＸＲ）のような同族体由来の第
二のポリペプチドとを含んでなる転写アクチベーター、 (iv) ＺＦＨＤ１転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインおよびＦＫＢＰ１２イムノ
フィリン由来のＬＢＤを含んでなる第一のポリペプチドと、ＮＦκＢ Ｐ６５因
子由来のトランス活性化ドメインおよびＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン
関連タンパク質）由来のＬＢＤを含んでなる第二のポリペプチドとを含んでなる
転写アクチベーター、および (v) ＡｈＲレセプター由来の第一のポリペプチドと、Ａｒｎｔタンパク質（ア
リール炭化水素レセプター核トランスロケーター）由来の第二のポリペプチドと
を含んでなる転写アクチベーター から選択される。
レセプター由来のＬＢＤを含んでなる、ＧＲｄｅｘと表されるポリペプチドであ
って、前記レセプターがそのＬＢＤにおいて７４７位のイソロイシンをトレオニ
ンで置換することによって改質されたポリペプチド、 (ii) ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、およびエストロゲンレセ
プター由来のＬＢＤを含んでなる、ＥＲＴと表されるポリペプチドであって、前
記レセプターがそのＬＢＤにおいて特に５２１位のグリシンをアルギニンで置換
することによって改質されたポリペプチド、 (iii) エクジソンレセプター、ＥｃＲおよびＧＲレセプターのドメイン由来の
ハイブリッドＤＮＡ結合ドメイン、およびＶＰ１６ウイルスタンパク質由来のト
ランス活性化ドメインを含んでなる第一のポリペプチドと、Drosophila USPタン
パク質またはヒトレチノイン酸Ｘレセプター（ＲＸＲ）のような同族体由来の第
二のポリペプチドとを含んでなる転写アクチベーター、 (iv) ＺＦＨＤ１転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインおよびＦＫＢＰ１２イムノ
フィリン由来のＬＢＤを含んでなる第一のポリペプチドと、ＮＦκＢ Ｐ６５因
子由来のトランス活性化ドメインおよびＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン
関連タンパク質）由来のＬＢＤを含んでなる第二のポリペプチドとを含んでなる
転写アクチベーター、および (v) ＡｈＲレセプター由来の第一のポリペプチドと、Ａｒｎｔタンパク質（ア
リール炭化水素レセプター核トランスロケーター）由来の第二のポリペプチドと
を含んでなる転写アクチベーター から選択される。
【００３０】 好ましくは、転写アクチベーター(i)および(ii)はホモダイマーの形態であり
、(iii)、(iv)および(v)は第一および第二のポリペプチド、および場合によって
はインデューサーを結合しているヘテロダイマーの形態である。
、(iii)、(iv)および(v)は第一および第二のポリペプチド、および場合によって
はインデューサーを結合しているヘテロダイマーの形態である。
【００３１】 極めて有利な態様によれば、転写アクチベーターは非天然インデューサーに結
合することによって活性化されるが、天然のヒト化合物によって活性化されない
かまたは余り活性化されない。
合することによって活性化されるが、天然のヒト化合物によって活性化されない
かまたは余り活性化されない。
【００３２】 「非天然インデューサー」という用語は、本発明による誘導的発現系を用いて
治療を行おう予定のヒトまたは動物体には天然では見られない化合物を表す。こ
れは、好ましくはヒト生体には天然では見られず、構造がヒト（内在性）化合物
の構造と若干異なっている合成インデューサーである。本発明の目的には、非天
然インデューサーは、特にＬＢＤに結合することによって本発明に関して使用す
る転写アクチベーターを活性化して、このアクチベーターに応答する標的配列に
依存する転写を介しまたは刺激することができる。選択された転写アクチベータ
ーに適する非天然インデューサーの選択は、当該技術分野の状態に基づいて当業
者の範囲内にある。非天然インデューサーによる転写アクチベーターの活性化は
、共有または非共有（静電、疎水性、水素結合など）相互作用によって行うこと
ができる。更に、インデューサーは、単一化合物または分子の組からなることが
できる。好ましくは、これはステロイド、レチノイド、脂肪酸、ビタミン、ホル
モン、生体異物または抗生物質のグループに属している。
治療を行おう予定のヒトまたは動物体には天然では見られない化合物を表す。こ
れは、好ましくはヒト生体には天然では見られず、構造がヒト（内在性）化合物
の構造と若干異なっている合成インデューサーである。本発明の目的には、非天
然インデューサーは、特にＬＢＤに結合することによって本発明に関して使用す
る転写アクチベーターを活性化して、このアクチベーターに応答する標的配列に
依存する転写を介しまたは刺激することができる。選択された転写アクチベータ
ーに適する非天然インデューサーの選択は、当該技術分野の状態に基づいて当業
者の範囲内にある。非天然インデューサーによる転写アクチベーターの活性化は
、共有または非共有（静電、疎水性、水素結合など）相互作用によって行うこと
ができる。更に、インデューサーは、単一化合物または分子の組からなることが
できる。好ましくは、これはステロイド、レチノイド、脂肪酸、ビタミン、ホル
モン、生体異物または抗生物質のグループに属している。
【００３３】 １つの有利な態様によれば、前記の非天然インデューサーは経口投与すること
ができる合成物質である。好ましくは、これは、デキサメタゾン、タモキシフェ
ン、ムリステロンＡ、エクジソン、ラパマイシンおよび２，３，７，８−テトラ
クロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）、またはこれらの化合物の類似体
であって、好ましくは無毒性または比較的毒性のないものからなる群から選択さ
れる。
ができる合成物質である。好ましくは、これは、デキサメタゾン、タモキシフェ
ン、ムリステロンＡ、エクジソン、ラパマイシンおよび２，３，７，８−テトラ
クロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）、またはこれらの化合物の類似体
であって、好ましくは無毒性または比較的毒性のないものからなる群から選択さ
れる。
【００３４】 本発明による誘導的発現系に含まれる転写アクチベーターをコードする配列は
、宿主細胞または生物で発現させることができる適当な調節エレメントによって
制御される。「適当な調節エレメント」という用語は、前記配列をＲＮＡへ転写
およびタンパク質へ翻訳することができる総てのエレメントを包含する。これら
の中で、プロモーターは特に重要である。これは、真核、原核またはウイルス起
源の任意の遺伝子から単離することができる。あるいは、これは、内在性遺伝子
の天然プロモーターであることができる。更に、これは、構成的または調節可能
であることができる。また、これを改質して、プロモーター活性を改良し、転写
阻害領域を欠失し、構成的プロモーターを調節可能にし、または逆に制限部位を
導入するなどを行うことができる。例えば、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナー
ゼ）およびＭＴ（メタロチオネイン; McIvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7
, 838-848）遺伝子の真核プロモーター、ＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス
）初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１
プロモーター、ＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）初期プロモーター、お
よび後期アデノウイルス遺伝子（ＭＬＰ）および初期アデノウイルス遺伝子（Ｅ
１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ３またはＥ４）の発現を支配するプロモーターを挙げることが
できる。 更に、転写アクチベーターの発現を調節するのも有利であることがある。第一
の変法では、その特異的標的配列によって制御することができる（自己活性化お
よび／または内在性リガンドによって活性化した内在性の野生型レセプターによ
る活性化）。例えば、ＥＲまたはＧＲ（ＥＲＴまたはＧＲｄｅｘ）由来のＤＮＡ
結合ドメインを含んでなる転写アクチベーターの発現のために、ＥＲＥまたはＧ
ＲＥエレメントを用いる。もう一つの可能性は、従来の技術から選択された調節
可能なプロモーターの使用である。これについては、腫瘍または癌細胞での発現
を刺激するプロモーターを用いるのが有利である。特に、乳癌および前立腺癌で
過剰発現したＭＵＣ−１遺伝子のプロモーター(Chen et al., 1995, J. Clin. I
nvest 96, 2775-2782)、結腸癌で過剰発現したＣＥＡ（癌胎児性抗原）遺伝子(S
chrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748)、黒色腫で過剰発現し
たチロシナーゼ遺伝子(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)、乳癌
および膵臓癌で過剰発現したＥＲＢ−２遺伝子(Harris et al., 1994, Gene The
rapy 1, 170-175)、および肝臓癌で過剰発現したα−フェトプロテイン遺伝子(K
anai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465)を挙げることができる。サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが特に好ましいことが示されている
。
、宿主細胞または生物で発現させることができる適当な調節エレメントによって
制御される。「適当な調節エレメント」という用語は、前記配列をＲＮＡへ転写
およびタンパク質へ翻訳することができる総てのエレメントを包含する。これら
の中で、プロモーターは特に重要である。これは、真核、原核またはウイルス起
源の任意の遺伝子から単離することができる。あるいは、これは、内在性遺伝子
の天然プロモーターであることができる。更に、これは、構成的または調節可能
であることができる。また、これを改質して、プロモーター活性を改良し、転写
阻害領域を欠失し、構成的プロモーターを調節可能にし、または逆に制限部位を
導入するなどを行うことができる。例えば、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナー
ゼ）およびＭＴ（メタロチオネイン; McIvor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7
, 838-848）遺伝子の真核プロモーター、ＳＶ４０ウイルス（シミアンウイルス
）初期プロモーター、ＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）ＬＴＲ、ＴＫ−ＨＳＶ−１
プロモーター、ＣＭＶウイルス（サイトメガロウイルス）初期プロモーター、お
よび後期アデノウイルス遺伝子（ＭＬＰ）および初期アデノウイルス遺伝子（Ｅ
１Ａ、Ｅ２Ａ、Ｅ３またはＥ４）の発現を支配するプロモーターを挙げることが
できる。 更に、転写アクチベーターの発現を調節するのも有利であることがある。第一
の変法では、その特異的標的配列によって制御することができる（自己活性化お
よび／または内在性リガンドによって活性化した内在性の野生型レセプターによ
る活性化）。例えば、ＥＲまたはＧＲ（ＥＲＴまたはＧＲｄｅｘ）由来のＤＮＡ
結合ドメインを含んでなる転写アクチベーターの発現のために、ＥＲＥまたはＧ
ＲＥエレメントを用いる。もう一つの可能性は、従来の技術から選択された調節
可能なプロモーターの使用である。これについては、腫瘍または癌細胞での発現
を刺激するプロモーターを用いるのが有利である。特に、乳癌および前立腺癌で
過剰発現したＭＵＣ−１遺伝子のプロモーター(Chen et al., 1995, J. Clin. I
nvest 96, 2775-2782)、結腸癌で過剰発現したＣＥＡ（癌胎児性抗原）遺伝子(S
chrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748)、黒色腫で過剰発現し
たチロシナーゼ遺伝子(Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864)、乳癌
および膵臓癌で過剰発現したＥＲＢ−２遺伝子(Harris et al., 1994, Gene The
rapy 1, 170-175)、および肝臓癌で過剰発現したα−フェトプロテイン遺伝子(K
anai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465)を挙げることができる。サイト
メガロウイルス（ＣＭＶ）初期プロモーターが特に好ましいことが示されている
。
【００３５】 当然ながら、適当な調節エレメントは、宿主細胞での発現（イントロン配列、
転写終止配列など）または持続を改良する追加のエレメントを含んでなることも
できる。このようなエレメントは、当業者に知られている。
転写終止配列など）または持続を改良する追加のエレメントを含んでなることも
できる。このようなエレメントは、当業者に知られている。
【００３６】 本発明に関して用いられる転写アクチベーターが１組のポリペプチドからなる
ときには、これらのポリペプチドはＩＲＥＳ型翻訳開始部位を用いて（単一プロ
モーターによって制御される）ポリシストロン性ヌクレオチド配列から産生し、
第二のシストロンの翻訳を開始することができる。いずれかの側におかれた２つ
の遺伝子の発現を指定する２方向プロモーターを用いることもできる。それぞれ
が前記で引用したような適当な調節エレメントを含んでなる独立した発現カセッ
トを生成することもできる。これらのカセットは、同一の発現ベクターによって
または異なるベクターによって収容することができる。
ときには、これらのポリペプチドはＩＲＥＳ型翻訳開始部位を用いて（単一プロ
モーターによって制御される）ポリシストロン性ヌクレオチド配列から産生し、
第二のシストロンの翻訳を開始することができる。いずれかの側におかれた２つ
の遺伝子の発現を指定する２方向プロモーターを用いることもできる。それぞれ
が前記で引用したような適当な調節エレメントを含んでなる独立した発現カセッ
トを生成することもできる。これらのカセットは、同一の発現ベクターによって
または異なるベクターによって収容することができる。
【００３７】 本発明に関して用いられる配列は、通常の分子生物学の手法によって、例えば
特異的プローブを用いるライブラリースクリーニングによって、発現ライブラリ
ーの免疫スクリーニングによって、適当なプライマーを用いるＰＣＲによって、
または化学合成によって得ることができる。突然変異体は、位置指定突然変異誘
発、ＰＣＲ、および制限酵素を用いる消化および連結の手法を用いる１以上のヌ
クレオチドの置換、欠失および／または付加によって、あるいは化学合成によっ
て本来の配列から生成させることができる。突然変異体および構築物の機能性は
、従来の技術の手法を用いて明らかにすることができる。
特異的プローブを用いるライブラリースクリーニングによって、発現ライブラリ
ーの免疫スクリーニングによって、適当なプライマーを用いるＰＣＲによって、
または化学合成によって得ることができる。突然変異体は、位置指定突然変異誘
発、ＰＣＲ、および制限酵素を用いる消化および連結の手法を用いる１以上のヌ
クレオチドの置換、欠失および／または付加によって、あるいは化学合成によっ
て本来の配列から生成させることができる。突然変異体および構築物の機能性は
、従来の技術の手法を用いて明らかにすることができる。
【００３８】 本発明による誘導的発現系の第二のエレメントは、前記転写アクチベーターに
よってトランス活性化することができる誘導プロモーターによって制御される目
的とする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターで
ある。
よってトランス活性化することができる誘導プロモーターによって制御される目
的とする少なくとも１つの遺伝子を含んでなる組換えアデノウイルスベクターで
ある。
【００３９】 Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、およびＬ１〜Ｌ５領域から選択される複製に本質的な少な
くとも１つの領域の全部または一部を欠いているアデノウイルスベクターを用い
て、宿主生物または環境におけるその増殖を防止するのが好ましい。Ｅ１領域の
ほとんどを欠失しているものが好ましい。これは、ｎｔｓ４５４から３３２８ま
で伸張するが、キャプシド化機能を妨げないという条件で５′および３′におけ
る付加配列も包含することができるのが有利である。好ましくは、ｐIX遺伝子は
Ｅ１欠失に包含されない。また、欠陥に本質的な機能は相補系および／または補
助ウイルスによってトランスで相補されるので、特にＥ２、Ｅ４および／または
Ｌ１〜Ｌ５領域に英国特許第供与体を与える他の改質と組み合わせることができ
る。これに関して、Ｅ１およびＥ４、またはＥ１およびＥ２機能に欠陥のある第
二の発生ベクター(generation vectors)を用いることができる（例えば、国際出
願ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書を参照さ
れたい）。この態様を説明するため、Ｅ１領域の欠失とＥ２Ａ領域のＤＢＰ（Ｄ
ＮＡ結合タンパク質）遺伝子に影響を与える熱感受性突然変異を組み合わせたベ
クターを挙げることができる(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339)
。Ｅ４領域に関しては、これは完全にまたは部分的に欠失していることができる
。Ｅ４領域の部分欠失は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）３および／
または６／７をコードする配列を除き、Ｅ４機能の相補性を全く必要としないの
で、有利である(Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048)。
クローニング能を増加させるため、組換えアデノウイルスベクターは、非本質的
Ｅ３領域の全部または一部を欠くこともできる。しかしながら、この代替法によ
れば、宿主の免疫系を回避することができるポリペプチド、特にｇｐ１９ｋ糖タ
ンパク質をコードするＥ３配列の保存が有利であることがある(Gooding et al.,
1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71)。もう一つの代替法によれ
ば、５′および３′ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）とキャプシド化領域を本質的
に保持しかつ総てのウイルス機能を欠いている最小アデノウイルスベクターを用
いることができる。
くとも１つの領域の全部または一部を欠いているアデノウイルスベクターを用い
て、宿主生物または環境におけるその増殖を防止するのが好ましい。Ｅ１領域の
ほとんどを欠失しているものが好ましい。これは、ｎｔｓ４５４から３３２８ま
で伸張するが、キャプシド化機能を妨げないという条件で５′および３′におけ
る付加配列も包含することができるのが有利である。好ましくは、ｐIX遺伝子は
Ｅ１欠失に包含されない。また、欠陥に本質的な機能は相補系および／または補
助ウイルスによってトランスで相補されるので、特にＥ２、Ｅ４および／または
Ｌ１〜Ｌ５領域に英国特許第供与体を与える他の改質と組み合わせることができ
る。これに関して、Ｅ１およびＥ４、またはＥ１およびＥ２機能に欠陥のある第
二の発生ベクター(generation vectors)を用いることができる（例えば、国際出
願ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書を参照さ
れたい）。この態様を説明するため、Ｅ１領域の欠失とＥ２Ａ領域のＤＢＰ（Ｄ
ＮＡ結合タンパク質）遺伝子に影響を与える熱感受性突然変異を組み合わせたベ
クターを挙げることができる(Ensinger et al., 1972, J. Virol. 10, 328-339)
。Ｅ４領域に関しては、これは完全にまたは部分的に欠失していることができる
。Ｅ４領域の部分欠失は、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）３および／
または６／７をコードする配列を除き、Ｅ４機能の相補性を全く必要としないの
で、有利である(Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048)。
クローニング能を増加させるため、組換えアデノウイルスベクターは、非本質的
Ｅ３領域の全部または一部を欠くこともできる。しかしながら、この代替法によ
れば、宿主の免疫系を回避することができるポリペプチド、特にｇｐ１９ｋ糖タ
ンパク質をコードするＥ３配列の保存が有利であることがある(Gooding et al.,
1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71)。もう一つの代替法によれ
ば、５′および３′ＩＴＲ（逆方向末端反復配列）とキャプシド化領域を本質的
に保持しかつ総てのウイルス機能を欠いている最小アデノウイルスベクターを用
いることができる。
【００４０】 更に、本発明による誘導的発現系のアデノウイルスベクターの起源は、種およ
び血清型の観点から変化する可能性がある。これは、ヒトまたは動物（イヌ、ト
リ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サルなど）アデノウイルスのゲノム、または
少なくとも２種類の異なる起源のアデノウイルスゲノムの断片を含んでなるハイ
ブリッドから誘導することができる。更に詳細には、イヌ起源のＣＡＶ−１また
はＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルス、またはウシ起
源の３Ｂａｄ型アデノウイルスを挙げることができる(Zakharchuk et al., Arch
. Virol. 1993, 128: 171-176; Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol. 1989, 7
0: 165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal et al., J. Ge
n. Virol., 1995, 76: 93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Ｃのアデノウ
イルス、特に２または５型アデノウイルスに由来するヒト起源のアデノウイルス
ベクターの方が好ましい。
び血清型の観点から変化する可能性がある。これは、ヒトまたは動物（イヌ、ト
リ、ウシ、ネズミ、ヒツジ、ブタ、サルなど）アデノウイルスのゲノム、または
少なくとも２種類の異なる起源のアデノウイルスゲノムの断片を含んでなるハイ
ブリッドから誘導することができる。更に詳細には、イヌ起源のＣＡＶ−１また
はＣＡＶ−２アデノウイルス、トリ起源のＤＡＶアデノウイルス、またはウシ起
源の３Ｂａｄ型アデノウイルスを挙げることができる(Zakharchuk et al., Arch
. Virol. 1993, 128: 171-176; Spibey and Cavanagh, J. Gen. Virol. 1989, 7
0: 165-172; Jouvenne et al., Gene, 1987, 60: 21-28; Mittal et al., J. Ge
n. Virol., 1995, 76: 93-102)。しかしながら、好ましくは血清型Ｃのアデノウ
イルス、特に２または５型アデノウイルスに由来するヒト起源のアデノウイルス
ベクターの方が好ましい。
【００４１】 本発明で用いる目的とする遺伝子は、真核生物、原核生物、寄生生物、または
アデノウイルス以外のウイルスから誘導することかできる。これは、従来の技術
における任意の通常の手法によって、例えばクローニング、ＰＣＲまたは化学合
成によって単離することができる。これは、ゲノム型（イントロンの組の全部ま
たは一部を含んでなる）、相補性ＤＮＡ型（ｃＤＮＡ、イントロンを欠いている
）、または混合型（ミニ遺伝子(minigene)）であることができる。更に、これは
、アンチセンスＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコー
ドし、次にこれらを目的とするポリペプチドに翻訳することができ、このポリペ
プチドは(i)細胞内、(ii)宿主細胞の膜に組込まれ、または(iii)分泌されること
がある。これは、天然に見出されるような（本来の）ポリペプチド、このポリペ
プチドの部分（切りつめ）、特に改良または改質した生物学的特性を有する突然
変異体、または多様な起源の配列の融合から得られるキメラポリペプチドである
ことができる。更に、目的とする遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、
または目的とするポリペプチドをコードすることができる。
アデノウイルス以外のウイルスから誘導することかできる。これは、従来の技術
における任意の通常の手法によって、例えばクローニング、ＰＣＲまたは化学合
成によって単離することができる。これは、ゲノム型（イントロンの組の全部ま
たは一部を含んでなる）、相補性ＤＮＡ型（ｃＤＮＡ、イントロンを欠いている
）、または混合型（ミニ遺伝子(minigene)）であることができる。更に、これは
、アンチセンスＲＮＡおよび／またはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコー
ドし、次にこれらを目的とするポリペプチドに翻訳することができ、このポリペ
プチドは(i)細胞内、(ii)宿主細胞の膜に組込まれ、または(iii)分泌されること
がある。これは、天然に見出されるような（本来の）ポリペプチド、このポリペ
プチドの部分（切りつめ）、特に改良または改質した生物学的特性を有する突然
変異体、または多様な起源の配列の融合から得られるキメラポリペプチドである
ことができる。更に、目的とする遺伝子は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、
または目的とするポリペプチドをコードすることができる。
【００４２】 用いることができる目的とするポリペプチドの中では、更に詳細にはケモカイ
ン、およびサイトカイン（α−、β−またはγ−インターフェロン、インターロ
イキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳ
Ｆなど）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１のような単
球走化性タンパク質など）、細胞レセプター（特に、ＨＩＶウイルスによって認
識される）レセプターリガンド、凝固因子（VIII因子、IX因子、トロンビン、プ
ロテインＣ）、増殖因子（ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管細胞
内皮増殖因子））、酵素（ウレアーゼ、レニン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒
素シンテターゼ、ＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、レシチンコレステロールアシル
トランスフェラーゼＬＣＡＴなど）、酵素阻害剤（α１−アンチトリプシン、ア
ンチトロンビンIII、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、ＰＡＩ−１（プラスミノー
ゲンアクチベーター阻害剤）、クラスＩまたはIIの主要組織適合遺伝子複合体抗
原または相当する遺伝子の発現に作用するポリペプチド、ウイルス、細菌または
寄生生物の感染またはその発生を抑制することができるポリペプチド、アポトー
シスに積極的または消極的に作用するポリペプチド（Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ
Ｘなど）、細胞分裂抑制剤（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ）、全体的または部分的（Ｆ
ａｂ、ＳｃＦｖなど）免疫グロブリン、毒素、免疫毒素、アポリポタンパク質（
ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど）、血管新生抑制因子（アンギオスタ
チン、エンドスタチンなど）、マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラー
ゼなど）、または標的設定した傷害に対して治療効果を有する任意の他のポリペ
プチドを挙げることができる。
ン、およびサイトカイン（α−、β−またはγ−インターフェロン、インターロ
イキン（ＩＬ）、特にＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１０またはＩＬ−１２、腫瘍
壊死因子（ＴＮＦ）、コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ、Ｃ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳ
Ｆなど）、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＣＰ−１のような単
球走化性タンパク質など）、細胞レセプター（特に、ＨＩＶウイルスによって認
識される）レセプターリガンド、凝固因子（VIII因子、IX因子、トロンビン、プ
ロテインＣ）、増殖因子（ＦＧＦ（繊維芽細胞増殖因子）、ＶＥＧＦ（血管細胞
内皮増殖因子））、酵素（ウレアーゼ、レニン、メタロプロテイナーゼ、酸化窒
素シンテターゼ、ＮＯＳ、ＳＯＤ、カタラーゼ、レシチンコレステロールアシル
トランスフェラーゼＬＣＡＴなど）、酵素阻害剤（α１−アンチトリプシン、ア
ンチトロンビンIII、ウイルスプロテアーゼ阻害剤、ＰＡＩ−１（プラスミノー
ゲンアクチベーター阻害剤）、クラスＩまたはIIの主要組織適合遺伝子複合体抗
原または相当する遺伝子の発現に作用するポリペプチド、ウイルス、細菌または
寄生生物の感染またはその発生を抑制することができるポリペプチド、アポトー
シスに積極的または消極的に作用するポリペプチド（Ｂａｘ、Ｂｃｌ２、Ｂｃｌ
Ｘなど）、細胞分裂抑制剤（ｐ２１、ｐ１６、Ｒｂ）、全体的または部分的（Ｆ
ａｂ、ＳｃＦｖなど）免疫グロブリン、毒素、免疫毒素、アポリポタンパク質（
ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥなど）、血管新生抑制因子（アンギオスタ
チン、エンドスタチンなど）、マーカー（β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラー
ゼなど）、または標的設定した傷害に対して治療効果を有する任意の他のポリペ
プチドを挙げることができる。
【００４３】 更に具体的には、遺伝的機能障害の治療目的で、欠陥遺伝子の機能性コピー、
例えば血友病ＡまたはＢに関してVIIIまたはIX因子をコードする遺伝子、ドゥチ
ェンヌおよびベッカーミオパシーに関してジストロフィン、糖尿病に関してイン
スリン、嚢胞性繊維症に関してＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質）
が用いられる。腫瘍または癌の開始または進行の阻止に関しては、アンチセンス
ＲＮＡをコードする目的とする遺伝学、リボザイム、細胞傷害性産物（単純疱疹
ウイルス−１チミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、リシン、コレラ毒素、ジ
フテリア毒素、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼおよびシトシンデア
ミナーゼをコードするＦＣＹ１およびＦＵＲ１酵母遺伝学の産物など）、免疫グ
ロブリン、細胞分裂または形質導入シグナルの阻害剤、腫瘍抑制遺伝学発現産物
（ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３、ＤＣＣなど）、免疫系刺激ポリペプチド、腫瘍関連抗
原（ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶパピローマウイルスの初期または後期抗
原（Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２など）など）を、場合によってはサイトカイン遺伝
学と組み合わせて用いるのが好ましい。最後に、抗ＨＩＶ治療に関しては、免疫
保護ポリペプチドをコードする遺伝子、抗原性エピトープ、抗体（２Ｆ５；Buch
acher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195)、ＣＤ４レセプターの細胞外ドメ
イン（ｓＣＤ４；Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86)、免疫接着（
例えば、ＣＤ４−ＩｇＧ−免疫グロブリンハイブリッド；Capon et al., 1989,
Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670)、免疫毒素（
例えば、２Ｆ５抗体またはＣＤ４−２Ｆ５免疫接着のアンギオゲニンへの融合;
Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499)、トランス支配変異体（
ＥＰ０６１４９８０号明細書、ＷＯ９５／１６７８０号明細書）、前記したもの
の１つのような細胞傷害性産物、またはα−またはβ−ＩＦＮを用いることがで
きる。
例えば血友病ＡまたはＢに関してVIIIまたはIX因子をコードする遺伝子、ドゥチ
ェンヌおよびベッカーミオパシーに関してジストロフィン、糖尿病に関してイン
スリン、嚢胞性繊維症に関してＣＦＴＲ（嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質）
が用いられる。腫瘍または癌の開始または進行の阻止に関しては、アンチセンス
ＲＮＡをコードする目的とする遺伝学、リボザイム、細胞傷害性産物（単純疱疹
ウイルス−１チミジンキナーゼ（ＴＫ−ＨＳＶ−１）、リシン、コレラ毒素、ジ
フテリア毒素、ウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼおよびシトシンデア
ミナーゼをコードするＦＣＹ１およびＦＵＲ１酵母遺伝学の産物など）、免疫グ
ロブリン、細胞分裂または形質導入シグナルの阻害剤、腫瘍抑制遺伝学発現産物
（ｐ５３、Ｒｂ、ｐ７３、ＤＣＣなど）、免疫系刺激ポリペプチド、腫瘍関連抗
原（ＭＵＣ−１、ＢＲＣＡ−１、ＨＰＶパピローマウイルスの初期または後期抗
原（Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、Ｌ２など）など）を、場合によってはサイトカイン遺伝
学と組み合わせて用いるのが好ましい。最後に、抗ＨＩＶ治療に関しては、免疫
保護ポリペプチドをコードする遺伝子、抗原性エピトープ、抗体（２Ｆ５；Buch
acher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195)、ＣＤ４レセプターの細胞外ドメ
イン（ｓＣＤ４；Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86)、免疫接着（
例えば、ＣＤ４−ＩｇＧ−免疫グロブリンハイブリッド；Capon et al., 1989,
Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670)、免疫毒素（
例えば、２Ｆ５抗体またはＣＤ４−２Ｆ５免疫接着のアンギオゲニンへの融合;
Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499)、トランス支配変異体（
ＥＰ０６１４９８０号明細書、ＷＯ９５／１６７８０号明細書）、前記したもの
の１つのような細胞傷害性産物、またはα−またはβ−ＩＦＮを用いることがで
きる。
【００４４】 目的とする遺伝子の１つは、トランスフェクションまたは形質導入した細胞を
選択または同定することができる選択遺伝子であることもできる。抗生物質Ｇ４
１８に耐性を賦与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを
コードする）、ｄｈｆｒ（ジヒドロホレートレダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマ
イシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、またはｇｐｔ（キサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を挙げることができる。一般に、
選択遺伝子は、当業者に知られている。
選択または同定することができる選択遺伝子であることもできる。抗生物質Ｇ４
１８に耐性を賦与するｎｅｏ遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを
コードする）、ｄｈｆｒ（ジヒドロホレートレダクターゼ）遺伝子、ＣＡＴ（ク
ロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、ｐａｃ（ピューロマ
イシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子、またはｇｐｔ（キサンチングアニ
ンホスホリボシルトランスフェラーゼ）遺伝子を挙げることができる。一般に、
選択遺伝子は、当業者に知られている。
【００４５】 更に、目的とする遺伝子の発現のためのカセットとして、宿主細胞中でのその
発現または持続性を改良する追加エレメント（複製の起源、細胞ゲノムへの組込
みのためのエレメント、イントロン配列、転写終止ポリＡ配列、トリパータイト
リーダー(tripartite leaders)など）を挙げることもできる。これらのエレメン
トは、当業者に知られている。また、目的とする遺伝子は、コード領域の上流に
宿主細胞から分泌できるようにするシグナルペプチドをコードする配列を含んで
なることもできる。シグナルペプチドは、問題となっている遺伝子または異種遺
伝子（任意の分泌されたまたは合成遺伝子由来）のシグナルペプチドであること
ができる。
発現または持続性を改良する追加エレメント（複製の起源、細胞ゲノムへの組込
みのためのエレメント、イントロン配列、転写終止ポリＡ配列、トリパータイト
リーダー(tripartite leaders)など）を挙げることもできる。これらのエレメン
トは、当業者に知られている。また、目的とする遺伝子は、コード領域の上流に
宿主細胞から分泌できるようにするシグナルペプチドをコードする配列を含んで
なることもできる。シグナルペプチドは、問題となっている遺伝子または異種遺
伝子（任意の分泌されたまたは合成遺伝子由来）のシグナルペプチドであること
ができる。
【００４６】 目的とする遺伝子の発現のためのカセットは、アデノウイルスゲノムの任意の
位置に挿入することができる。これは、Ｅ３領域の置換として導入するのが有利
である。組換えアデノウイルスベクターが目的とする数個の遺伝子を含んでなる
ときには、それらは同一の遺伝子エレメント（１つのＩＲＥＳ型の内部翻訳開始
部位を用いて第二のシストンの翻訳を再開するためのポリシストンカセット）ま
たは独立したエレメントの制御下に置くことができる。この場合には、それらは
、同一のアデノウイルス領域に（例えば、Ｅ３の置換として）、または異なる領
域に（例えば、Ｅ３およびもう一つの欠失領域の置換として）挿入することがで
きる。
位置に挿入することができる。これは、Ｅ３領域の置換として導入するのが有利
である。組換えアデノウイルスベクターが目的とする数個の遺伝子を含んでなる
ときには、それらは同一の遺伝子エレメント（１つのＩＲＥＳ型の内部翻訳開始
部位を用いて第二のシストンの翻訳を再開するためのポリシストンカセット）ま
たは独立したエレメントの制御下に置くことができる。この場合には、それらは
、同一のアデノウイルス領域に（例えば、Ｅ３の置換として）、または異なる領
域に（例えば、Ｅ３およびもう一つの欠失領域の置換として）挿入することがで
きる。
【００４７】 本発明に関して、目的とする遺伝子の発現は、前記の転写アクチベーターによ
って誘導可能なプロモーターによって制御される。本発明の目的のためには、誘
導プロモーターは、用いられる転写アクチベーターに応答しかつ最小プロモータ
ーと機能的に結合している少なくとも１つの標的配列を含んでなる。標的配列は
以前に定義されており、文献に記載されており、当業者には入手可能である（例
えば、ＥＲＥ、ＧＲＥ、ＥｃＲＥ、ＵＡＳ、５ｘＥ／ＧＲＥ、ＸＲＥなど）。本
来の配列に関して改質されているが、同様のまたは改良された調節機能を示す相
同配列を用いることができることが示唆されている。これらの改質は、１以上の
ヌクレオチドの付加、欠失および／または置換によって、または２種類の異なる
標的配列の融合によって得ることができる。１以上の標的配列、例えば１〜２５
、有利には１〜１０、好ましくは１〜７個の標的配列が、場合によってはＴＡＴ
Ａボックスに対して縦一列および任意の方向におかれたものを用いることができ
る。それ（ら）は、一般にそれから数百塩基対までの最小プロモーターの上流の
誘導プロモーターに挿入される。ＧＲ由来の転写アクチベーターによって誘導さ
れるプロモーターの一例は、ＧＲＥエレメントおよび適当なプロモーター配列を
含むＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）ＬＴＲである。
って誘導可能なプロモーターによって制御される。本発明の目的のためには、誘
導プロモーターは、用いられる転写アクチベーターに応答しかつ最小プロモータ
ーと機能的に結合している少なくとも１つの標的配列を含んでなる。標的配列は
以前に定義されており、文献に記載されており、当業者には入手可能である（例
えば、ＥＲＥ、ＧＲＥ、ＥｃＲＥ、ＵＡＳ、５ｘＥ／ＧＲＥ、ＸＲＥなど）。本
来の配列に関して改質されているが、同様のまたは改良された調節機能を示す相
同配列を用いることができることが示唆されている。これらの改質は、１以上の
ヌクレオチドの付加、欠失および／または置換によって、または２種類の異なる
標的配列の融合によって得ることができる。１以上の標的配列、例えば１〜２５
、有利には１〜１０、好ましくは１〜７個の標的配列が、場合によってはＴＡＴ
Ａボックスに対して縦一列および任意の方向におかれたものを用いることができ
る。それ（ら）は、一般にそれから数百塩基対までの最小プロモーターの上流の
誘導プロモーターに挿入される。ＧＲ由来の転写アクチベーターによって誘導さ
れるプロモーターの一例は、ＧＲＥエレメントおよび適当なプロモーター配列を
含むＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）ＬＴＲである。
【００４８】 最小プロモーターは、本質的に宿主細胞または生物で機能性のＴＡＴＡボック
スおよび転写開始部位を含んでなる。これらのエレメントは、関連の従来技術で
は通常のものである。更に詳細には、ＴＫ遺伝子、ＣＭＶ遺伝子およびＨＳＰ遺
伝子の最小プロモーター（エンハンサーを欠いているショウジョウバエ熱ショッ
クタンパク質遺伝子の最小プロモーター）を挙げることができる。
スおよび転写開始部位を含んでなる。これらのエレメントは、関連の従来技術で
は通常のものである。更に詳細には、ＴＫ遺伝子、ＣＭＶ遺伝子およびＨＳＰ遺
伝子の最小プロモーター（エンハンサーを欠いているショウジョウバエ熱ショッ
クタンパク質遺伝子の最小プロモーター）を挙げることができる。
【００４９】 更に、本発明に関して用いられる誘導プロモーターは、転写の水準を改良しま
たは所定の特異的組織に限定する追加エレメントを含んでなることができる（エ
ンハンサー型エレメント）。これらの追加エレメントは、非コード遺伝子領域に
挿入することもできる。
たは所定の特異的組織に限定する追加エレメントを含んでなることができる（エ
ンハンサー型エレメント）。これらの追加エレメントは、非コード遺伝子領域に
挿入することもできる。
【００５０】 第一の態様によれば、転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列およ
びそれらの調節エレメントは、本発明による発現系の組換えアデノウイルスベク
ターによって収容されている。目的とする遺伝子および転写アクチベーターの発
現のためのカセットは、アデノウイルスゲノムの同じ領域または異なる場所に、
互いにセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。アンチセンス配
向が好ましい。好ましい例は、カセットのそれぞれが欠失アデノウイルス配列の
代わりに挿入されているＥ１−Ｅ３−ベクターによって提供される。
びそれらの調節エレメントは、本発明による発現系の組換えアデノウイルスベク
ターによって収容されている。目的とする遺伝子および転写アクチベーターの発
現のためのカセットは、アデノウイルスゲノムの同じ領域または異なる場所に、
互いにセンスまたはアンチセンス配向で配置することができる。アンチセンス配
向が好ましい。好ましい例は、カセットのそれぞれが欠失アデノウイルス配列の
代わりに挿入されているＥ１−Ｅ３−ベクターによって提供される。
【００５１】 もう一つの変法によれば、ヌクレオチド配列は、本発明による発現系で用いら
れる組換えアデノウイルスベクター以外の独立した発現ベクターによって収容さ
れる。これは、合成ベクター（カチオン性脂質、ポリマー性リポソームなど）、
プラスミド、またはウイルスベクターであることができる。これは、場合によっ
てはトランスフェクションの効率および／またはベクターの安定性を改良する１
以上の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、当業者が入手可能な
文献に広汎に記載されている（例えば、Felgner et al., 1987, Proc. West. Ph
armacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnol
ogy 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654を
参照されたい）。制限を目的としない説明では、それらはポリマー、脂質、特に
カチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質または中性脂質であることができる
。これらの物質は、単独でまたは組み合わせて用いることができる。考えられる
組合せは、カチオン性脂質（ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、スペルミン−ｃｈｏｌ
、スペルミジン−ｃｈｏｌなど）、および中性脂質（ＤＯＰＥ）と組み合わせた
組換えプラスミドベクターである。
れる組換えアデノウイルスベクター以外の独立した発現ベクターによって収容さ
れる。これは、合成ベクター（カチオン性脂質、ポリマー性リポソームなど）、
プラスミド、またはウイルスベクターであることができる。これは、場合によっ
てはトランスフェクションの効率および／またはベクターの安定性を改良する１
以上の物質と組み合わせることができる。これらの物質は、当業者が入手可能な
文献に広汎に記載されている（例えば、Felgner et al., 1987, Proc. West. Ph
armacol. Soc. 32, 115-121; Hodgson and Solaiman, 1996, Nature Biotechnol
ogy 14, 339-342; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654を
参照されたい）。制限を目的としない説明では、それらはポリマー、脂質、特に
カチオン性脂質、リポソーム、核タンパク質または中性脂質であることができる
。これらの物質は、単独でまたは組み合わせて用いることができる。考えられる
組合せは、カチオン性脂質（ＤＯＧＳ、ＤＣ−ＣＨＯＬ、スペルミン−ｃｈｏｌ
、スペルミジン−ｃｈｏｌなど）、および中性脂質（ＤＯＰＥ）と組み合わせた
組換えプラスミドベクターである。
【００５２】 本発明に関して用いることができるプラスミドは、広汎に選択される。それら
は、クローニングおよび／または発現ベクターであることができる。一般に、そ
れらは当業者に知られており、それらの多くは市販されているが、遺伝子操作の
手法を用いてそれらを構築しまたはそれらを改質することもできる。例えば、ｐ
ＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratag
ene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、またはｐＰｏｌｙ(Lathe et al.
, 1987, Gene 57, 193-201)由来のプラスミドを挙げることができる。好ましく
は、本発明に関して用いられるプラスミドは、プロデューサー細胞および／また
は宿主細胞における複製を確実に開始させる複製の起源を含むのが好ましい（例
えば、ＣｏｌＥ１起源はE. coliで産生する予定のプラスミドについて選択され
、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系は、哺乳類宿主細胞で自己複製させようとするときに
選択される；Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol.. 5, 2533-2542; Yat
es et al., Nature 313, 812-815）。これは、トランスフェクション細胞を選択
または同定することができる選択遺伝子を含んでなることもできる（栄養要求性
突然変異の相補性、抗生物質耐性をコードする遺伝子など）。これは、所定の細
胞におけるその持続性および／または安定性を改良する追加エレメントを含んで
なることができるのは勿論である（プラスミドのモノマー性持続性を促進するｃ
ｅｒ配列(Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103)、細胞性ゲノムへ
の組込みのための配列）。
は、クローニングおよび／または発現ベクターであることができる。一般に、そ
れらは当業者に知られており、それらの多くは市販されているが、遺伝子操作の
手法を用いてそれらを構築しまたはそれらを改質することもできる。例えば、ｐ
ＢＲ３２２(Gibco BRL)、ｐＵＣ(Gibco BRL)、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ(Stratag
ene)、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４(Invitrogene)、またはｐＰｏｌｙ(Lathe et al.
, 1987, Gene 57, 193-201)由来のプラスミドを挙げることができる。好ましく
は、本発明に関して用いられるプラスミドは、プロデューサー細胞および／また
は宿主細胞における複製を確実に開始させる複製の起源を含むのが好ましい（例
えば、ＣｏｌＥ１起源はE. coliで産生する予定のプラスミドについて選択され
、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１系は、哺乳類宿主細胞で自己複製させようとするときに
選択される；Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol.. 5, 2533-2542; Yat
es et al., Nature 313, 812-815）。これは、トランスフェクション細胞を選択
または同定することができる選択遺伝子を含んでなることもできる（栄養要求性
突然変異の相補性、抗生物質耐性をコードする遺伝子など）。これは、所定の細
胞におけるその持続性および／または安定性を改良する追加エレメントを含んで
なることができるのは勿論である（プラスミドのモノマー性持続性を促進するｃ
ｅｒ配列(Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103)、細胞性ゲノムへ
の組込みのための配列）。
【００５３】 ウイルスベクターに関しては、アデノウイルス由来、レトロウイルス由来、ア
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来、ヘルペスウイルス由来、アルファウイルス由
来、パルボウイルス由来、ポックスウイルス（鶏痘、カナリア痘、ワクシニアウ
イルス、特にＭＶＡ（改質アンカラウイルス）またはコペンハーゲン株など）由
来、またはフォーミーウイルス由来のベクターが考えられる。非複製の場合によ
っては非組込型ベクターを用いるのが好ましい。
デノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）由来、ヘルペスウイルス由来、アルファウイルス由
来、パルボウイルス由来、ポックスウイルス（鶏痘、カナリア痘、ワクシニアウ
イルス、特にＭＶＡ（改質アンカラウイルス）またはコペンハーゲン株など）由
来、またはフォーミーウイルス由来のベクターが考えられる。非複製の場合によ
っては非組込型ベクターを用いるのが好ましい。
【００５４】 レトロウイルスは主として分割細胞で感染し、組込む特性を有し、これに関し
て、癌への応用に特に適している。本発明での使用に適するレトロウイルスウイ
ルスベクターは、ＬＴＲ末端配列、キャプシド化領域、およびレトロウイルスプ
ロモーター（５′ＬＴＲにおいて）または前記のような内部プロモーターによっ
て発現が制御される転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含んで
なる。これは、任意の起源（ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイル
ス、特にＭｏＭｕＬＶ（モロネイネズミ白血病ウイルス）、ＭＶＳ（ネズミ肉腫
ウイルス）、またはフロイントネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９）から誘導する
ことができる。これは、ウイルス粒子の構成に必要なｇａｇ、ｐｏｌおよび／ま
たはｅｎｖウイルスポリペプチドをトランスで提供することができるキャプシド
化系で増殖する。このような系は、文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ
、ＣＲＩＰＧＰ＋Ａｍ−１２など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、
改質、特にＬＴＲ（プロモーター領域の真核プロモーターによる置換）またはキ
ャプシド化領域（異種キャプシド化領域、例えばＶＬ３０型による置換）の改質
を含んでなることができる（フランス国特許出願第９４／０８３００号明細書お
よび第９７／０５２０３号明細書を参照されたい）。
て、癌への応用に特に適している。本発明での使用に適するレトロウイルスウイ
ルスベクターは、ＬＴＲ末端配列、キャプシド化領域、およびレトロウイルスプ
ロモーター（５′ＬＴＲにおいて）または前記のような内部プロモーターによっ
て発現が制御される転写アクチベーターをコードするヌクレオチド配列を含んで
なる。これは、任意の起源（ネズミ、霊長類、ネコ、ヒトなど）のレトロウイル
ス、特にＭｏＭｕＬＶ（モロネイネズミ白血病ウイルス）、ＭＶＳ（ネズミ肉腫
ウイルス）、またはフロイントネズミレトロウイルス（Ｆｂ２９）から誘導する
ことができる。これは、ウイルス粒子の構成に必要なｇａｇ、ｐｏｌおよび／ま
たはｅｎｖウイルスポリペプチドをトランスで提供することができるキャプシド
化系で増殖する。このような系は、文献に記載されている（ＰＡ３１７、Ｐｓｉ
、ＣＲＩＰＧＰ＋Ａｍ−１２など）。本発明によるレトロウイルスベクターは、
改質、特にＬＴＲ（プロモーター領域の真核プロモーターによる置換）またはキ
ャプシド化領域（異種キャプシド化領域、例えばＶＬ３０型による置換）の改質
を含んでなることができる（フランス国特許出願第９４／０８３００号明細書お
よび第９７／０５２０３号明細書を参照されたい）。
【００５５】 アデノウイルスベクターは、本発明に関して考えられる転写アクチベーターの
発現に特に適している。前記の特徴の１つを有する欠陥ベクターを用いるのが好
ましい。特に、組換えアデノウイルスベクター（目的とする遺伝子の誘導的発現
用のカセットを有する）および独立したアデノウイルスベクター（転写アクチベ
ーターの発現用のカセットを有する）は、両方ともＥ１領域の全部または一部の
欠失によるＥ１機能または非機能性突然変異を欠いているのが好ましい。適当な
場合には、いずれか一方または両方が、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４お
よび／またはＬ５機能の少なくとも１個をさらに欠くこともできる。同様に、Ｅ
３領域の全部または一部の欠失を、一方または両方のベクターについて考えるこ
とができる。
発現に特に適している。前記の特徴の１つを有する欠陥ベクターを用いるのが好
ましい。特に、組換えアデノウイルスベクター（目的とする遺伝子の誘導的発現
用のカセットを有する）および独立したアデノウイルスベクター（転写アクチベ
ーターの発現用のカセットを有する）は、両方ともＥ１領域の全部または一部の
欠失によるＥ１機能または非機能性突然変異を欠いているのが好ましい。適当な
場合には、いずれか一方または両方が、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４お
よび／またはＬ５機能の少なくとも１個をさらに欠くこともできる。同様に、Ｅ
３領域の全部または一部の欠失を、一方または両方のベクターについて考えるこ
とができる。
【００５６】 有利な態様によれば、本発明による発現系の一部を形成するウイルスベクター
（組換えアデノウイルスベクター、および適当な場合には、前記の独立したウイ
ルスベクター）は、ＤＮＡベクターまたは感染性ウイルス粒子の形態であること
ができる。
（組換えアデノウイルスベクター、および適当な場合には、前記の独立したウイ
ルスベクター）は、ＤＮＡベクターまたは感染性ウイルス粒子の形態であること
ができる。
【００５７】 本発明は、 (i) 転写アクチベーターをコードし、宿主細胞または生物での発現に適する
調節エレメントによって制御されるヌクレオチド配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される目的遺伝子 を含んでなる組換えアデノウイルスベクターにも関する。
調節エレメントによって制御されるヌクレオチド配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される目的遺伝子 を含んでなる組換えアデノウイルスベクターにも関する。
【００５８】 本発明による組換えアデノウイルスベクターは、前記の特徴を有する転写アク
チベーターであって、前記のようなインデューサーによって活性化される形態で
は、前記のような転写アクチベーターに特異的な標的配列を含んでなる誘導プロ
モーターによって制御される遺伝子の転写を介しまたは活性化する能力を有する
ものをコードすることができる。
チベーターであって、前記のようなインデューサーによって活性化される形態で
は、前記のような転写アクチベーターに特異的な標的配列を含んでなる誘導プロ
モーターによって制御される遺伝子の転写を介しまたは活性化する能力を有する
ものをコードすることができる。
【００５９】 あるいは、本発明による組換えアデノウイルスベクターは、原核性転写アクチ
ベーター、特にＬＢＤとテトラサイクリンオペロンリプレッサー（tetR）由来の
ＤＮＡ結合ドメイン、および任意の転写活性化ドメインを含んでなるポリペプチ
ドをコードすることができる。これは、好ましくは文献において「テトラサイク
リントランスアクチベーター」ｔＴＡと命名されているポリペプチドであり(Gos
sen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551)、Ｔｎ１０
トランスポゾンから単離されたｔｅｔＲがＶＰ１６ウイルスタンパク質の１３０
のＣ末端アミノ酸にフレームで融合している。この場合には、ドキシサイクリン
、テトラサイクリンまたは類似作動薬のようなｔＴＡを活性化する非天然インデ
ューサーが用いられる。目的とする遺伝子の誘導的発現用のカセットの特徴は、
原核性転写アクチベーターに応答する１以上の標的配列が含まれることを除き前
記と同一であることは勿論である。ｔＴＡに関しては、標的配列は、テトラサイ
クリンオペロン（ｔｅｔＯ）からなっている。本発明に関しては、特に天然での
基本転写水準は極めて低いが、ｔＴＡインデューサーによって活性化し、テトラ
サイクリンによって抑制することができるプロモーターを生じる「ｔｅｔＯ−最
小プロモーター」の組合せが好ましい。
ベーター、特にＬＢＤとテトラサイクリンオペロンリプレッサー（tetR）由来の
ＤＮＡ結合ドメイン、および任意の転写活性化ドメインを含んでなるポリペプチ
ドをコードすることができる。これは、好ましくは文献において「テトラサイク
リントランスアクチベーター」ｔＴＡと命名されているポリペプチドであり(Gos
sen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551)、Ｔｎ１０
トランスポゾンから単離されたｔｅｔＲがＶＰ１６ウイルスタンパク質の１３０
のＣ末端アミノ酸にフレームで融合している。この場合には、ドキシサイクリン
、テトラサイクリンまたは類似作動薬のようなｔＴＡを活性化する非天然インデ
ューサーが用いられる。目的とする遺伝子の誘導的発現用のカセットの特徴は、
原核性転写アクチベーターに応答する１以上の標的配列が含まれることを除き前
記と同一であることは勿論である。ｔＴＡに関しては、標的配列は、テトラサイ
クリンオペロン（ｔｅｔＯ）からなっている。本発明に関しては、特に天然での
基本転写水準は極めて低いが、ｔＴＡインデューサーによって活性化し、テトラ
サイクリンによって抑制することができるプロモーターを生じる「ｔｅｔＯ−最
小プロモーター」の組合せが好ましい。
【００６０】 本発明による組換えアデノウイルスベクターの主鎖は既に前記の特徴を満足し
ているので、これに戻る必要はない。
ているので、これに戻る必要はない。
【００６１】 本発明は、本発明による組換えアデノウイルスベクターを含んでなる感染性ウ
イルス粒子にも関する。
イルス粒子にも関する。
【００６２】 アデノウイルスベクターの製造技術は、文献に広く報告されている。最初に、
ゲノムを、２９３系（特に、Graham and Prevect, 1991, 分子生物学の方法，第
７巻，遺伝子伝達および発現実験(Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene
Transfer and Expression Protocols); E.J. Murray監修, The Human Press In
c, クリントン, ニュージャージー）またはEscherichia coli（Chartier et al.
, 1996, J. Virol. 70, 4805-4810; ＷＯ９６／１７０７０号明細書）で相同組
換えにより再構成する。次に、ベクターを増殖させ、これを含むウイルス粒子の
保存物を構成する必要がある。このために、ベクターが欠陥を有するウイルス発
現産物をトランスで提供する相補系を用いる。例えば、Ｅ１が欠失したウイルス
を、ヒト胚細胞から確立した２９３系で増殖させることができる(Graham et al.
, 1977, J. Gen. Virol 36, 59-72)。第二の発生ベクター(generation vectors)
に関しては、Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak and Grah
am (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995, Gene Ther
apy 2, 775-783)およびLusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033)、およ
び国際出願ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書
に記載されているような２つの本質的ウイルス機能を相補する系を用いることが
できる。もう一つのの代替法は、組換えアデノウイルスベクターの欠陥機能を少
なくとも部分的に相補するための「補助ウイルス」と呼ばれる追加のウイルスエ
レメントの使用に基づいている。従来の技術による補助ウイルスは、場合によっ
ては組換えベクターが相補性を必要としない本質的領域を欠いているアデノウイ
ルスゲノムからなっている。
ゲノムを、２９３系（特に、Graham and Prevect, 1991, 分子生物学の方法，第
７巻，遺伝子伝達および発現実験(Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene
Transfer and Expression Protocols); E.J. Murray監修, The Human Press In
c, クリントン, ニュージャージー）またはEscherichia coli（Chartier et al.
, 1996, J. Virol. 70, 4805-4810; ＷＯ９６／１７０７０号明細書）で相同組
換えにより再構成する。次に、ベクターを増殖させ、これを含むウイルス粒子の
保存物を構成する必要がある。このために、ベクターが欠陥を有するウイルス発
現産物をトランスで提供する相補系を用いる。例えば、Ｅ１が欠失したウイルス
を、ヒト胚細胞から確立した２９３系で増殖させることができる(Graham et al.
, 1977, J. Gen. Virol 36, 59-72)。第二の発生ベクター(generation vectors)
に関しては、Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak and Grah
am (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995, Gene Ther
apy 2, 775-783)およびLusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033)、およ
び国際出願ＷＯ９４／２８１５２号明細書およびＷＯ９７／０４１１９号明細書
に記載されているような２つの本質的ウイルス機能を相補する系を用いることが
できる。もう一つのの代替法は、組換えアデノウイルスベクターの欠陥機能を少
なくとも部分的に相補するための「補助ウイルス」と呼ばれる追加のウイルスエ
レメントの使用に基づいている。従来の技術による補助ウイルスは、場合によっ
ては組換えベクターが相補性を必要としない本質的領域を欠いているアデノウイ
ルスゲノムからなっている。
【００６３】 本発明は、 (i) 本発明による組換えアデノウイルスベクターを、前記ベクターをトラン
ス相補することができる相補細胞に導入して、トランスフェクション相補細胞を
得て、 (ii) 前記トランスフェクション相補細胞を、前記ウイルス粒子を産生するの
に適した条件下で培養し、 (iii) 前記ウイルス粒子を、細胞培養物から回収する ことを特徴とする、ウイルス粒子の製造法にも関する。
ス相補することができる相補細胞に導入して、トランスフェクション相補細胞を
得て、 (ii) 前記トランスフェクション相補細胞を、前記ウイルス粒子を産生するの
に適した条件下で培養し、 (iii) 前記ウイルス粒子を、細胞培養物から回収する ことを特徴とする、ウイルス粒子の製造法にも関する。
【００６４】 ウイルス粒子は培養上清から回収することができるが、細胞からも回収できる
ことは勿論である。一般に用いられる方法の１つは、凍結／融解を連続的に循環
しながら細胞をリーシスして、リーシス上清のビリオンを回収することからなっ
ている。これらのビリオンを、従来の技術の手法（クロマトグラフィー法、特に
塩化セシウムグラディエントによる超遠心など）によって増幅し、精製すること
ができる。
ことは勿論である。一般に用いられる方法の１つは、凍結／融解を連続的に循環
しながら細胞をリーシスして、リーシス上清のビリオンを回収することからなっ
ている。これらのビリオンを、従来の技術の手法（クロマトグラフィー法、特に
塩化セシウムグラディエントによる超遠心など）によって増幅し、精製すること
ができる。
【００６５】 本発明は、本発明による誘導的発現系または組換えアデノウイルスベクターを
含んでなる、または本発明によるウイルス粒子を感染させた真核細胞にも関する
。本発明の目的について、このような細胞は、ベクターでトランスフェクション
することができ、または前記のようなウイルス粒子に感染した任意の細胞からな
っている。哺乳類、特にヒト細胞が、特に適している。これは、任意の起源、特
に造血（全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージなど）、筋
肉（衛星細胞、筋細胞、筋原細胞、平滑筋細胞など）、心臓、肺、気管、肝臓、
上皮または繊維芽細胞起源の、始原または腫瘍細胞であることができる。
含んでなる、または本発明によるウイルス粒子を感染させた真核細胞にも関する
。本発明の目的について、このような細胞は、ベクターでトランスフェクション
することができ、または前記のようなウイルス粒子に感染した任意の細胞からな
っている。哺乳類、特にヒト細胞が、特に適している。これは、任意の起源、特
に造血（全能幹細胞、白血球、リンパ球、単球またはマクロファージなど）、筋
肉（衛星細胞、筋細胞、筋原細胞、平滑筋細胞など）、心臓、肺、気管、肝臓、
上皮または繊維芽細胞起源の、始原または腫瘍細胞であることができる。
【００６６】 本発明の主題は、本発明に記載の誘導的発現系、組換えアデノウイルスベクタ
ー、ウイルス粒子、または宿主細胞を薬学上の観点から許容可能な賦形剤［脱落
］医薬組成物でもある。
ー、ウイルス粒子、または宿主細胞を薬学上の観点から許容可能な賦形剤［脱落
］医薬組成物でもある。
【００６７】 本発明による組成物は、更に詳細には遺伝子療法（免疫療法など）による疾患
の予防または治療を行おうとするものであり、更に詳細には増殖性疾患（癌、腫
瘍、形成異常など）、感染性の、特にウイルス性疾患（ＢまたはＣ型肝炎ウイル
ス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどによって誘発される）、遺
伝子疾患（嚢胞性繊維症、筋疾患、血友病、糖尿病など）、および循環器疾患（
再狭窄、虚血、ディスリピデミア(dislipidemia)など）に対するものである。
の予防または治療を行おうとするものであり、更に詳細には増殖性疾患（癌、腫
瘍、形成異常など）、感染性の、特にウイルス性疾患（ＢまたはＣ型肝炎ウイル
ス、ＨＩＶ、ヘルペスウイルス、レトロウイルスなどによって誘発される）、遺
伝子疾患（嚢胞性繊維症、筋疾患、血友病、糖尿病など）、および循環器疾患（
再狭窄、虚血、ディスリピデミア(dislipidemia)など）に対するものである。
【００６８】 本発明による組成物は、局所、非経口または消化投与の目的で常法によって製
造することができる。特に、治療または予防薬の治療上有効量は、薬学上の観点
から許容可能な支持体と組み合わせる。多数の投与経路を考えることができる。
例えば、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻内
、肺内または気管内経路を挙げることができる。後者の３つの態様については、
エアゾールまたは点滴による投与が有利である。投与は、単回投与量として、ま
たは一定の時間間隔を置いて１回以上の反復投与量として行うことができる。ウ
イルスの適当な投与経路および投与量は、様々なパラメーター、例えば個人、病
因、伝達を行う目的とする遺伝子、投与経路によって変化する。例えば、ウイル
ス粒子を基剤とする製剤は、１０４〜１０１４pfu（プラーク形成単位）、有利
には１０５〜１０１３pfu、好ましくは１０６〜１０１２pfuの投与量の形態で処
方することができる。１以上のベクターを用いるときには、０．０１〜１００mg
のＤＮＡ、好ましくは０．０５〜１０mg、最も好ましくは０．０５〜５mgを含ん
でなる投与量が考えられる。
造することができる。特に、治療または予防薬の治療上有効量は、薬学上の観点
から許容可能な支持体と組み合わせる。多数の投与経路を考えることができる。
例えば、胃内、皮下、心臓内、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、腫瘍内、鼻内
、肺内または気管内経路を挙げることができる。後者の３つの態様については、
エアゾールまたは点滴による投与が有利である。投与は、単回投与量として、ま
たは一定の時間間隔を置いて１回以上の反復投与量として行うことができる。ウ
イルスの適当な投与経路および投与量は、様々なパラメーター、例えば個人、病
因、伝達を行う目的とする遺伝子、投与経路によって変化する。例えば、ウイル
ス粒子を基剤とする製剤は、１０４〜１０１４pfu（プラーク形成単位）、有利
には１０５〜１０１３pfu、好ましくは１０６〜１０１２pfuの投与量の形態で処
方することができる。１以上のベクターを用いるときには、０．０１〜１００mg
のＤＮＡ、好ましくは０．０５〜１０mg、最も好ましくは０．０５〜５mgを含ん
でなる投与量が考えられる。
【００６９】 処方物は、薬学上の観点から許容可能な希釈剤、アジュバントまたは賦形剤、
並びに可溶化剤、安定剤および防腐剤を含むこともできる。好ましい組成物は、
注射可能な形態である。これは、水溶液、食塩溶液（リン酸一ナトリウム、二ナ
トリウム、マグネシウム、カリウムなど）または等張溶液で処方することができ
る。これは、液体形態または適当な希釈剤で即座に再構成することができる乾燥
形態（粉末、凍結乾燥物など）で単一投与量または複数回投与量とすることがで
きる。
並びに可溶化剤、安定剤および防腐剤を含むこともできる。好ましい組成物は、
注射可能な形態である。これは、水溶液、食塩溶液（リン酸一ナトリウム、二ナ
トリウム、マグネシウム、カリウムなど）または等張溶液で処方することができ
る。これは、液体形態または適当な希釈剤で即座に再構成することができる乾燥
形態（粉末、凍結乾燥物など）で単一投与量または複数回投与量とすることがで
きる。
【００７０】 本発明は、宿主細胞または生物で目的とする前記遺伝子を伝達し、発現させる
ための、特にヒトまたは動物体の遺伝子療法による治療を目的とする医薬生成物
の製造のための、本発明による誘導的発現系、組換えアデノウイルスベクター、
ウイルス粒子または宿主細胞の使用にも関する。最初の可能性によれば、医薬生
成物は、直接イン・ビボで（例えば、接近可能な腫瘍へ静脈内注射により、肺に
エアゾールにより、血管系に適当なプローブを用いて、など）投与することがで
きる。患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など）を採取し、従
来の技術による手法でイン・ビトロでそれらをトランスフェクションまたは感染
させ、それらを任意の増幅段階の後に患者に再投与することからなるエクス・ビ
ボ法を採用することもできる。多数の病状の予防および治療を、考えることがで
きる。好ましい使用は、癌、腫瘍および望ましくない細胞増殖により生じる疾患
の治療または予防を行うことである。考えられる用途としては、乳癌、子宮癌（
特に、パピローマウイルスによって誘発される癌）、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、
肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、中枢神経系の癌、および血液
の癌（リンパ腫、白血病など）を挙げることができる。これは、循環器疾患に関
しても、例えば血管壁の平滑筋の増殖を阻害しまたは遅延させるのにも有用であ
る（再狭窄）。最後に、感染症疾患に関しても、ＡＩＤＳにおける使用が考えら
れる。
ための、特にヒトまたは動物体の遺伝子療法による治療を目的とする医薬生成物
の製造のための、本発明による誘導的発現系、組換えアデノウイルスベクター、
ウイルス粒子または宿主細胞の使用にも関する。最初の可能性によれば、医薬生
成物は、直接イン・ビボで（例えば、接近可能な腫瘍へ静脈内注射により、肺に
エアゾールにより、血管系に適当なプローブを用いて、など）投与することがで
きる。患者から細胞（骨髄幹細胞、末梢血リンパ球、筋細胞など）を採取し、従
来の技術による手法でイン・ビトロでそれらをトランスフェクションまたは感染
させ、それらを任意の増幅段階の後に患者に再投与することからなるエクス・ビ
ボ法を採用することもできる。多数の病状の予防および治療を、考えることがで
きる。好ましい使用は、癌、腫瘍および望ましくない細胞増殖により生じる疾患
の治療または予防を行うことである。考えられる用途としては、乳癌、子宮癌（
特に、パピローマウイルスによって誘発される癌）、前立腺癌、肺癌、膀胱癌、
肝臓癌、結腸癌、膵臓癌、胃癌、食道癌、喉頭癌、中枢神経系の癌、および血液
の癌（リンパ腫、白血病など）を挙げることができる。これは、循環器疾患に関
しても、例えば血管壁の平滑筋の増殖を阻害しまたは遅延させるのにも有用であ
る（再狭窄）。最後に、感染症疾患に関しても、ＡＩＤＳにおける使用が考えら
れる。
【００７１】 本発明は、本発明による誘導的発現系、組換えアデノウイルスベクター、ウイ
ルス粒子、または宿主細胞を、前記のような治療を必要としている宿主細胞また
は生物に投与することを特徴とする、遺伝子療法による疾患の治療法にも敷衍さ
れる。
ルス粒子、または宿主細胞を、前記のような治療を必要としている宿主細胞また
は生物に投与することを特徴とする、遺伝子療法による疾患の治療法にも敷衍さ
れる。
【００７２】 最後に、本発明は、ＬＢＤ、およびステロイドレセプター由来のトランス活性
化ドメイン、および特にＧａｌ４酵母タンパク質由来の異種ＤＮＡ結合ドメイン
を含んでなる、転写アクチベーターにも関する。このような転写アクチベーター
は、分子生物学の手法を用いてステロイドレセプターのＤＮＡ結合ドメインをＧ
ａｌ４（特に、残基１〜７４によって支持されたもの）のＤＮＡ結合ドメインと
交換することによって得られる。ＥＲＴまたはＧＲｄｅｘおよびＧａｌ４ハイブ
リッドが、断然好ましい。
化ドメイン、および特にＧａｌ４酵母タンパク質由来の異種ＤＮＡ結合ドメイン
を含んでなる、転写アクチベーターにも関する。このような転写アクチベーター
は、分子生物学の手法を用いてステロイドレセプターのＤＮＡ結合ドメインをＧ
ａｌ４（特に、残基１〜７４によって支持されたもの）のＤＮＡ結合ドメインと
交換することによって得られる。ＥＲＴまたはＧＲｄｅｘおよびＧａｌ４ハイブ
リッドが、断然好ましい。
【００７３】 本明細書で用いられる名称の総ては従来の技術分野で通常のものであり、範囲
は機能的に同等なもの、すなわち天然ポリペプチド、ドメイン、遺伝子または化
合物の改質によって得られ、同一または著しく増加した性質の活性化を有する任
意のポリペプチド、ドメイン、遺伝子または化合物も包含することが示唆される
。
は機能的に同等なもの、すなわち天然ポリペプチド、ドメイン、遺伝子または化
合物の改質によって得られ、同一または著しく増加した性質の活性化を有する任
意のポリペプチド、ドメイン、遺伝子または化合物も包含することが示唆される
。
【００７４】 本発明を、下記の例によって説明するが、発明を制限するものではない。
【００７５】
下記の構造体は、Maniatis et al. (1989, 実験室便覧(Laboratory Manual),
Cold Spring Harbor, Laboratory Press, コールドスプリングハーバー，ニュー
ヨーク、または最新版）に詳記されている遺伝子工学および分子クローニングの
一般的手法によって、または市販のキットを使用するときには製造業者の推奨に
準じて製造する。クローニング段階は、E. coli株５Ｋ（ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ）
、ＤＨ５α［（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｏｄＲ１７（ｒ−ｍ−）、ｓｕｐＥ
４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ（ｎａｌｒ）］、またはＭＮ５２２（ｓｕｐＥ、ｔ
ｈｉ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Δｈｓｄ５、（ｒ−ｍ−）、（Ｆ′ｐｒｏＡ
Ｂ、ｌａｃＩｑ、ＺΔＭ１５）で行い、相同組換えのクローニング段階はE. col
i 株ＢＪ５１８３(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 577-580)で行う。制限
部位の修復に関しては、用いた手法は、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな
断片を用いる５′突出末端を充填することからなる（クレノウ, Boehringer Man
nheim）。ＤＮＡ断片は、GeneCleanIIＲＤＮＡ精製キット(Bio101Inc.)を用いて
精製する。更に、下記の様々な構築体で用いられるアデノウイルスゲノムの断片
は、Genebankデーターベースに参照番号Ｍ７３２６０で開示されているように、
Ａｄ５のゲノムのヌクレオチド配列中の位置によって正確に示される。
Cold Spring Harbor, Laboratory Press, コールドスプリングハーバー，ニュー
ヨーク、または最新版）に詳記されている遺伝子工学および分子クローニングの
一般的手法によって、または市販のキットを使用するときには製造業者の推奨に
準じて製造する。クローニング段階は、E. coli株５Ｋ（ｈｓｄＲ、ｍｃｒＡ）
、ＤＨ５α［（ｒｅｃＡ１、ｅｎｄＡ１、ｈｏｄＲ１７（ｒ−ｍ−）、ｓｕｐＥ
４４、ｔｈｉ−１、ｇｙｒＡ（ｎａｌｒ）］、またはＭＮ５２２（ｓｕｐＥ、ｔ
ｈｉ、Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）、Δｈｓｄ５、（ｒ−ｍ−）、（Ｆ′ｐｒｏＡ
Ｂ、ｌａｃＩｑ、ＺΔＭ１５）で行い、相同組換えのクローニング段階はE. col
i 株ＢＪ５１８３(Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 577-580)で行う。制限
部位の修復に関しては、用いた手法は、E. coli ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな
断片を用いる５′突出末端を充填することからなる（クレノウ, Boehringer Man
nheim）。ＤＮＡ断片は、GeneCleanIIＲＤＮＡ精製キット(Bio101Inc.)を用いて
精製する。更に、下記の様々な構築体で用いられるアデノウイルスゲノムの断片
は、Genebankデーターベースに参照番号Ｍ７３２６０で開示されているように、
Ａｄ５のゲノムのヌクレオチド配列中の位置によって正確に示される。
【００７６】 細胞生物学に関しては、２９３−細胞系（Graham et al., 1977, 前記引用;
参照番号ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣで利用可能）、Ａ５４９Ｅ１＋細胞系（ＷＯ
９４／２８１５２号明細書）、Ａ５４９細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、
およびベロ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）が用いられる。他の細胞系を用い
ることもできることが理解される。細胞は、グルタミン１mM、アミノ酸１％(Gib
co BRL)、ゲンタマイシン４０μg/l、およびウシ胎児血清１０％（ＦＣＳ，Gibc
o BRL)を補足したＤＭＥＭ（ダルベッコーの改質イーグル培地，Gibco BRL)中で
、ＣＯ２を５％に増加した湿潤大気中で３７℃で培養物中に保持する。細胞のト
ランスフェクションおよび形質導入は、従来の技術の手法によって行う（リン酸
カルシウム沈澱など）。
参照番号ＣＲＬ１５７３でＡＴＣＣで利用可能）、Ａ５４９Ｅ１＋細胞系（ＷＯ
９４／２８１５２号明細書）、Ａ５４９細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１８５）、
およびベロ細胞系（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−８１）が用いられる。他の細胞系を用い
ることもできることが理解される。細胞は、グルタミン１mM、アミノ酸１％(Gib
co BRL)、ゲンタマイシン４０μg/l、およびウシ胎児血清１０％（ＦＣＳ，Gibc
o BRL)を補足したＤＭＥＭ（ダルベッコーの改質イーグル培地，Gibco BRL)中で
、ＣＯ２を５％に増加した湿潤大気中で３７℃で培養物中に保持する。細胞のト
ランスフェクションおよび形質導入は、従来の技術の手法によって行う（リン酸
カルシウム沈澱など）。
【００７７】例１： ＥＲＴ転写アクチベーターおよびＥＲＥ配列によって調節されるＦＩＸ 遺伝子を同時発現するアデノウイルスベクターの構築 野生型ＥＲいててのｃＤＮＡは、プラスミドｐＳＧ１−ＨＥＯに含まれている
(Tora et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989)。ＥＲレセプターのエストロゲン
結合ドメインを、ｐＣｒｅ−ＥＲＴのＮｏｔＩ−ＸｂａＩ断片によって支持され
たＥＲＴ突然変異体（Ｇ５２１Ｒ）のものに置換する(Feil et al., 1996, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10887-10890)。ＥＲＴ配列を、転移ベクターｐＴ
Ｇ６６００のＥｃｏＲＩ部位に挿入する。例えば、ｐＴＧ６６００は、Ａｄ５配
列１〜４５８、ＣＭＶ初期プロモーター、プラスミドｐＣＩに見出されるハイブ
リッドスプライシング配列（Promega Corp, ヒトβ−グロブリン遺伝子のイント
ロン１のドナースプライシング部位とマウス免疫グロブリン遺伝子のアクセプタ
ースプライシング部位を含んでなる）、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列、
およびＡｄ５配列３３２８〜５７８８が挿入されているｐｐｏｌｙIIベクター(L
athe et al., 1987, Gene 57, 193-201)である。このような構築物は、当業者の
範囲内にある。このようにして得られたベクターｐＴＧ６２３７は、Ｅ１領域に
含まれるＣＭＶ−ＥＲＴ発現カセットを含む。ｐＴＧ６２４６と命名された最終
構築物を、前記ベクターから単離したＰａｃＩ−ＢｓｔＥII断片とＣｌａＩで線
形化したｐＴＧ４６５６との相同組換え(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70
, 4805-4810)によって再構成する。後者は、Ｅ１に、（フランス国特許出願第９
７／０６７５７号明細書に記載の）ＭＬＰプロモーターの制御下にあるＬａｃＺ
遺伝子を含むＥ１−Ｅ３−アデノウイルスプラスミドである。従って、ｐＴＧ６
２４６によって支持されたアデノウイルスゲノムはＥ１領域にＣＭＶ−ＥＲＴカ
セットを含んでなり、Ｅ３領域を欠失している。
(Tora et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989)。ＥＲレセプターのエストロゲン
結合ドメインを、ｐＣｒｅ−ＥＲＴのＮｏｔＩ−ＸｂａＩ断片によって支持され
たＥＲＴ突然変異体（Ｇ５２１Ｒ）のものに置換する(Feil et al., 1996, Proc
. Natl. Acad. Sci. USA 93, 10887-10890)。ＥＲＴ配列を、転移ベクターｐＴ
Ｇ６６００のＥｃｏＲＩ部位に挿入する。例えば、ｐＴＧ６６００は、Ａｄ５配
列１〜４５８、ＣＭＶ初期プロモーター、プラスミドｐＣＩに見出されるハイブ
リッドスプライシング配列（Promega Corp, ヒトβ−グロブリン遺伝子のイント
ロン１のドナースプライシング部位とマウス免疫グロブリン遺伝子のアクセプタ
ースプライシング部位を含んでなる）、ＳＶ４０ウイルスポリアデニル化配列、
およびＡｄ５配列３３２８〜５７８８が挿入されているｐｐｏｌｙIIベクター(L
athe et al., 1987, Gene 57, 193-201)である。このような構築物は、当業者の
範囲内にある。このようにして得られたベクターｐＴＧ６２３７は、Ｅ１領域に
含まれるＣＭＶ−ＥＲＴ発現カセットを含む。ｐＴＧ６２４６と命名された最終
構築物を、前記ベクターから単離したＰａｃＩ−ＢｓｔＥII断片とＣｌａＩで線
形化したｐＴＧ４６５６との相同組換え(Chartier et al., 1996, J. Virol. 70
, 4805-4810)によって再構成する。後者は、Ｅ１に、（フランス国特許出願第９
７／０６７５７号明細書に記載の）ＭＬＰプロモーターの制御下にあるＬａｃＺ
遺伝子を含むＥ１−Ｅ３−アデノウイルスプラスミドである。従って、ｐＴＧ６
２４６によって支持されたアデノウイルスゲノムはＥ１領域にＣＭＶ−ＥＲＴカ
セットを含んでなり、Ｅ３領域を欠失している。
【００７８】 ヒトＦＩＸｃＤＮＡ(Anson et al., 1984, EMBO J. 3, 1053-1060)は、従来の
技術のプラスミドから単離したＢａｍＨＩ断片の形態でクローニングされ（例え
ば、特許第８８／１４６３５号明細書に記載されている）、ＥＲＥ配列が先行し
たＴＫ−ＨＳＶ最小プロモーターの下流に挿入される(Klein-Hitpass et al., 1
986, Cell 46, 1053-1061)。このカセットを、センスおよびアンチセンス配向の
ｐＴＧ４６６４のＢｇｌII部位に導入し（それぞれ、ｐＴＧ１３２２７およびｐ
ＴＧ１３２２８を生じる）。プラスミドｐＴＧ４６６４は、Ｅ３領域のヌクレオ
チド２７８７１〜３０７４８を欠失したＡｄ５のヌクレオチド２５８３８〜３２
０００４を含んでなる。（Ｅ１およびＥ３領域の欠失したＡｄ５ゲノムを含んで
なる）ＳｆｒＩで消化したプラスミドｐＴＧ６４０１を用いる相同組換えにより
、Ｅ３領域にセンスおよびアンチセンス配向でＥＲＥ／ＴＫｐ−ＦＩＸ誘導カセ
ットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルスベクターを生成することができる。セ
ンス構築物（Ｅ３の転写の方向に相当する）はｐＴＧ３２３５と呼ばれ、アンチ
センス構築物はｐＴＧ１３２３６と呼ばれる。
技術のプラスミドから単離したＢａｍＨＩ断片の形態でクローニングされ（例え
ば、特許第８８／１４６３５号明細書に記載されている）、ＥＲＥ配列が先行し
たＴＫ−ＨＳＶ最小プロモーターの下流に挿入される(Klein-Hitpass et al., 1
986, Cell 46, 1053-1061)。このカセットを、センスおよびアンチセンス配向の
ｐＴＧ４６６４のＢｇｌII部位に導入し（それぞれ、ｐＴＧ１３２２７およびｐ
ＴＧ１３２２８を生じる）。プラスミドｐＴＧ４６６４は、Ｅ３領域のヌクレオ
チド２７８７１〜３０７４８を欠失したＡｄ５のヌクレオチド２５８３８〜３２
０００４を含んでなる。（Ｅ１およびＥ３領域の欠失したＡｄ５ゲノムを含んで
なる）ＳｆｒＩで消化したプラスミドｐＴＧ６４０１を用いる相同組換えにより
、Ｅ３領域にセンスおよびアンチセンス配向でＥＲＥ／ＴＫｐ−ＦＩＸ誘導カセ
ットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルスベクターを生成することができる。セ
ンス構築物（Ｅ３の転写の方向に相当する）はｐＴＧ３２３５と呼ばれ、アンチ
センス構築物はｐＴＧ１３２３６と呼ばれる。
【００７９】 Ｅ１およびＥ３領域の代わりにそれぞれＣＭＶ−ＥＲＴおよびＥＲＥ／ＴＫｐ
−ＦＩＸ発現カセットを含む二重組換えベクターを、ベクターｐＴＧ１３２７７
およびｐＴＧ１３２２８、およびベクターｐＴＧ６２４６から単離されるＦＩＸ
誘導カセットを有する断片の相同組換えによって生成する。誘導カセットの配向
によっては、ｐＴＧ１３２３３およびｐＴＧ１３２３４が得られる。
−ＦＩＸ発現カセットを含む二重組換えベクターを、ベクターｐＴＧ１３２７７
およびｐＴＧ１３２２８、およびベクターｐＴＧ６２４６から単離されるＦＩＸ
誘導カセットを有する断片の相同組換えによって生成する。誘導カセットの配向
によっては、ｐＴＧ１３２３３およびｐＴＧ１３２３４が得られる。
【００８０】例２： ＧＲｄｅｘ転写アクチベーターとＧＲＥ配列によって調節されるＦＩＸ 遺伝子を同時発現するアデノウイルスベクターの構築 プラスミドｐＨＧ１のＥｃｏＲＩ断片（２．７Kb）によって支持されているＧ
ＲｄｅｘレセプターｃＤＮＡをベクターｐＴＧ６６００のＥｃｏＲＩ部位にクロ
ーニングして、ｐＴＧ１３０６４を得る。Ｅ１領域の代わりにＣＭＶｐ−ＧＲｄ
ｅｘ発現カセットを含み、Ｅ３領域のほとんどを欠失しているアデノウイルスベ
クターｐＴＧ１３０７５を、前記ベクターから単離したＰａｃＩ−ＢｓｔＥII断
片およびＣｌａＩで線形化したｐＴＧ４６５６の相同組換えによって得る。
ＲｄｅｘレセプターｃＤＮＡをベクターｐＴＧ６６００のＥｃｏＲＩ部位にクロ
ーニングして、ｐＴＧ１３０６４を得る。Ｅ１領域の代わりにＣＭＶｐ−ＧＲｄ
ｅｘ発現カセットを含み、Ｅ３領域のほとんどを欠失しているアデノウイルスベ
クターｐＴＧ１３０７５を、前記ベクターから単離したＰａｃＩ−ＢｓｔＥII断
片およびＣｌａＩで線形化したｐＴＧ４６５６の相同組換えによって得る。
【００８１】 ヒトＦＩＸｃＤＮＡを含むＢａｍＨＩ断片を、ＧＲＥ配列を含むＭＭＴＶＬＴ
Ｒの下流に挿入する(Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237-2240)。次に、カセ
ットをセンスおよびアンチセンス配向で、欠失Ｅ３配列に接しているｐＴＧ４６
６４のＢｇｌII部位に導入する。転移ベクターは、ｐＴＧ６２４２（センス）お
よびｐＴＧ１３０６３（アンチセンス）と呼ばれる。（Ｅ１およびＥ３領域の欠
失したアデノウイルスゲノムを含んでなる）ＳｆｒＩで消化したプラスミドｐＴ
Ｇ６４０１による相同組換えにより、Ｅ３領域にセンスおよびアンチセンス配向
でＬＴＲ ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルス
ベクターを生成することができる。センス構築物（Ｅ３の転写方向と同一）はｐ
ＴＧ１３０８２と呼ばれ、アンチセンス構築物はｐＴＧ１３０８８と呼ばれる。
Ｒの下流に挿入する(Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237-2240)。次に、カセ
ットをセンスおよびアンチセンス配向で、欠失Ｅ３配列に接しているｐＴＧ４６
６４のＢｇｌII部位に導入する。転移ベクターは、ｐＴＧ６２４２（センス）お
よびｐＴＧ１３０６３（アンチセンス）と呼ばれる。（Ｅ１およびＥ３領域の欠
失したアデノウイルスゲノムを含んでなる）ＳｆｒＩで消化したプラスミドｐＴ
Ｇ６４０１による相同組換えにより、Ｅ３領域にセンスおよびアンチセンス配向
でＬＴＲ ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルス
ベクターを生成することができる。センス構築物（Ｅ３の転写方向と同一）はｐ
ＴＧ１３０８２と呼ばれ、アンチセンス構築物はｐＴＧ１３０８８と呼ばれる。
【００８２】 プラスミドｐＴＧ１３０７５を用いる相同組換えにより、Ｅ３領域にセンスお
よびアンチセンス配向でＬＴＲ ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを、およびＥ１
領域にＣＭＶ−ＧＲｄｅｘカセットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルスベクタ
ーを生成することができる。センス構築物（Ｅ３の転写方向と同一）はｐＴＧ１
３０８３と呼ばれ、アンチセンス構築物はｐＴＧ１３０９２（ＦＩＸおよびＧＲ ｄｅｘ カセットについての転写と逆方向）と呼ばれる。
よびアンチセンス配向でＬＴＲ ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを、およびＥ１
領域にＣＭＶ−ＧＲｄｅｘカセットを有するＥ１−Ｅ３−アデノウイルスベクタ
ーを生成することができる。センス構築物（Ｅ３の転写方向と同一）はｐＴＧ１
３０８３と呼ばれ、アンチセンス構築物はｐＴＧ１３０９２（ＦＩＸおよびＧＲ ｄｅｘ カセットについての転写と逆方向）と呼ばれる。
【００８３】例３： ＶｇＥｃＲ転写アクチベーターおよび５ｘＥ／ＧＲＥ配列によって調節
されるＦＩＸ遺伝子を同時発現するアデノウイルスベクターの構築 プラスミドｐＶｇＲＸＲ(In Vitrogen)は、エクジソンまたはその類似体であ
るムリステロンＡによって活性化することができる転写アクチベーターを含んで
なる２つのサブユニットを含んでなる。第一のものは、ＤＮＡ結合ドメインの３
アミノ酸で改質してＧＲレセプターと類似の配列が得られるようにしかつＶＰ１
６のトランス活性化ドメインにフレームで融合しているエクジソンレセプター（
ＶｇＥｃＲ）からなり、第二のものは、ヒトレチノイン酸レセプターＲＸＲ(No
et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)からなる。ＣＭＶ
およびＲＳＶプロモーターによって指定されたそれぞれＶｇＥｃＲおよびＲＸＲ
をコードする２つのｃＤＮＡを、コード配列の５′位のイントロン（ＣＭＶｐ−
ＶｇＥｃＲについてはｐＣＩイントロン、およびＲＳＶｐ−ＲＸＲについてはβ
−グロブリンイントロン）を導入することによって改質し、前記の手法によりア
デノウイルスベクターのＥ１領域に導入する。
されるＦＩＸ遺伝子を同時発現するアデノウイルスベクターの構築 プラスミドｐＶｇＲＸＲ(In Vitrogen)は、エクジソンまたはその類似体であ
るムリステロンＡによって活性化することができる転写アクチベーターを含んで
なる２つのサブユニットを含んでなる。第一のものは、ＤＮＡ結合ドメインの３
アミノ酸で改質してＧＲレセプターと類似の配列が得られるようにしかつＶＰ１
６のトランス活性化ドメインにフレームで融合しているエクジソンレセプター（
ＶｇＥｃＲ）からなり、第二のものは、ヒトレチノイン酸レセプターＲＸＲ(No
et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351)からなる。ＣＭＶ
およびＲＳＶプロモーターによって指定されたそれぞれＶｇＥｃＲおよびＲＸＲ
をコードする２つのｃＤＮＡを、コード配列の５′位のイントロン（ＣＭＶｐ−
ＶｇＥｃＲについてはｐＣＩイントロン、およびＲＳＶｐ−ＲＸＲについてはβ
−グロブリンイントロン）を導入することによって改質し、前記の手法によりア
デノウイルスベクターのＥ１領域に導入する。
【００８４】 ヒトＦＩＸをコードする配列を、Δｈｓｐ最小プロモーター（ｐＩＮＤ；In V
itrogen)に結合した５ｘＥ／ＧＲＥ標的配列を含んでなる誘導プロモーターの下
流に導入する。前記のように、カセットを両配向で、ｐＴＧ４６６４のＢｇｌII
部位に導入する。ＳｆｒＩで消化したｐＴＧ６４０１を用いる相同組換えにより
、Ｅ３領域にセンスまたはアンチセンス配向で誘導カセットを支持するプラスミ
ドを生成させることができる。
itrogen)に結合した５ｘＥ／ＧＲＥ標的配列を含んでなる誘導プロモーターの下
流に導入する。前記のように、カセットを両配向で、ｐＴＧ４６６４のＢｇｌII
部位に導入する。ＳｆｒＩで消化したｐＴＧ６４０１を用いる相同組換えにより
、Ｅ３領域にセンスまたはアンチセンス配向で誘導カセットを支持するプラスミ
ドを生成させることができる。
【００８５】 二重組換えアデノウイルスベクターは、ＶｇＥｃＲおよびＲＸＲ配列を含む転
移ベクターを用いる相同組換えによって得られる。
移ベクターを用いる相同組換えによって得られる。
【００８６】例４： アデノウイルスの産生 アクチベーターおよび／またはＦＩＸの発現カセットを含む組換えアデノウイ
ルスベクターを、ＰａｃＩ消化により相当するプラスミド（ｐＴＧ１３０８３、
ｐＴＧ１３０９２、ｐＴＧ１３２３３、ｐＴＧ１３２３４など）から放出させた
後、２９３相補性系にトランスフェクションした。細胞溶解産物を回収し、３回
連続した凍結／融解の段階を施してウイルス粒子を放出させた後、３５００rpm
で５分間遠心分離によって透明にする。上清に含まれるビリオンを許容系（２９
３またはＡ５４９−Ｅ１＋）について継代培養によって増幅し、従来技術の手法
による塩化セシウムグラディエント上で精製する。アデノウイルス保存物をＷＯ
９８／０２５２２号明細書に記載の適当な処方緩衝液（例えば、１Ｍスクロース
、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ２、１０mMトリス−ＨＣｌ、および０．
１％Tween 80）で投石する。ウイルス力価を感染単位でＤＢＰタンパク質を免疫
蛍光によって分析し(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2032)、または
ウイルス粒子の数を２６０nmで分光光度法による測定によって測定する。
ルスベクターを、ＰａｃＩ消化により相当するプラスミド（ｐＴＧ１３０８３、
ｐＴＧ１３０９２、ｐＴＧ１３２３３、ｐＴＧ１３２３４など）から放出させた
後、２９３相補性系にトランスフェクションした。細胞溶解産物を回収し、３回
連続した凍結／融解の段階を施してウイルス粒子を放出させた後、３５００rpm
で５分間遠心分離によって透明にする。上清に含まれるビリオンを許容系（２９
３またはＡ５４９−Ｅ１＋）について継代培養によって増幅し、従来技術の手法
による塩化セシウムグラディエント上で精製する。アデノウイルス保存物をＷＯ
９８／０２５２２号明細書に記載の適当な処方緩衝液（例えば、１Ｍスクロース
、１５０mM ＮａＣｌ、１mM ＭｇＣｌ２、１０mMトリス−ＨＣｌ、および０．
１％Tween 80）で投石する。ウイルス力価を感染単位でＤＢＰタンパク質を免疫
蛍光によって分析し(Lusky et al., 1998, J. Virol. 72, 2022-2032)、または
ウイルス粒子の数を２６０nmで分光光度法による測定によって測定する。
【００８７】 コントロールベクターを、プラスミドpCI (Promega)から単離したＣＭＶプロ
モーターの制御下にてヒトIX因子ｃＤＮＡを挿入することによって構築する。構
成的発現カセットをＥ３領域に導入して、ｐＴＧ１３２３１（センス配向）およ
びｐＴＧ１３２３２（アンチセンス配向）を得る。ビリオンを、前記と同じ方法
によって産生させる。
モーターの制御下にてヒトIX因子ｃＤＮＡを挿入することによって構築する。構
成的発現カセットをＥ３領域に導入して、ｐＴＧ１３２３１（センス配向）およ
びｐＴＧ１３２３２（アンチセンス配向）を得る。ビリオンを、前記と同じ方法
によって産生させる。
【００８８】 プラスミドｐＴＧ１３２３１およびｐＴＧ１３２３２とＳｒｆＩで線形化した
プラスミドｐＴＧ６４０１との相同組換えによって、それぞれＥ３領域にセンス
およびアンチセンス配向でＣＭＶ−ＦＩＸ構成的発現カセットを有するプラスミ
ドｐＴＧ１３２４４およびｐＴＧ１３２４５を得ることができる。
プラスミドｐＴＧ６４０１との相同組換えによって、それぞれＥ３領域にセンス
およびアンチセンス配向でＣＭＶ−ＦＩＸ構成的発現カセットを有するプラスミ
ドｐＴＧ１３２４４およびｐＴＧ１３２４５を得ることができる。
【００８９】例５： ＧＲｄｅ誘導系のイン・ビトロでの評価 それぞれＣＭＶ−ＧＲｄｅｘ、ＬＴＲＭＭＴＶ−ＦＩＸ（センス）およびＬＴ
ＲＭＭＴＶ−ＦＩＸ（アンチセンス）カセットを有する転移ベクターｐＴＧ１３
０６４、ｐＴＧ６２４２およびｐＴＧ１３０６３を、２９３細胞（ＤＮＡ５μg
／１０６個の細胞）に一過的にトランスフェクションする。更に、プラスミドｐ
ＴＧ１３０６４を、ｐＴＧ６２４２またはｐＴＧ３０６３と同時トランスフェク
ションする。培養物は、デキサメタゾン（１０−６Ｍ）の存在下またはその非存
在下で保持する。細胞上清をトランスフェクションから４８、９６、１２０およ
び１４４時間後に取り出し、産生したＦＩＸの量をＥＬＩＳＡ(Asserachromキッ
ト；Diagnostica Stago)によって測定する。図１に示した結果は、デキサメタゾ
ンによって活性化したＧＲｄｅｘアクチベーターの存在下でのＦＩＸ産生の誘導
を示す。従って、ｐＴＧ１３０６４によって発現したレセプターは、活性化状態
（デキサメタゾンの存在下）ではＭＭＴＶのＧＲＥモチーフに結合して、ＦＩＸ
遺伝子の転写を誘導することができるので、機能性である。この系の基本活性は
、極めて低い。具体的には、デキサメタゾンまたはｐＴＧ１３０６４の非存在下
で産生したＦＩＸの量は低いかまたはごく僅かである。
ＲＭＭＴＶ−ＦＩＸ（アンチセンス）カセットを有する転移ベクターｐＴＧ１３
０６４、ｐＴＧ６２４２およびｐＴＧ１３０６３を、２９３細胞（ＤＮＡ５μg
／１０６個の細胞）に一過的にトランスフェクションする。更に、プラスミドｐ
ＴＧ１３０６４を、ｐＴＧ６２４２またはｐＴＧ３０６３と同時トランスフェク
ションする。培養物は、デキサメタゾン（１０−６Ｍ）の存在下またはその非存
在下で保持する。細胞上清をトランスフェクションから４８、９６、１２０およ
び１４４時間後に取り出し、産生したＦＩＸの量をＥＬＩＳＡ(Asserachromキッ
ト；Diagnostica Stago)によって測定する。図１に示した結果は、デキサメタゾ
ンによって活性化したＧＲｄｅｘアクチベーターの存在下でのＦＩＸ産生の誘導
を示す。従って、ｐＴＧ１３０６４によって発現したレセプターは、活性化状態
（デキサメタゾンの存在下）ではＭＭＴＶのＧＲＥモチーフに結合して、ＦＩＸ
遺伝子の転写を誘導することができるので、機能性である。この系の基本活性は
、極めて低い。具体的には、デキサメタゾンまたはｐＴＧ１３０６４の非存在下
で産生したＦＩＸの量は低いかまたはごく僅かである。
【００９０】 ＦＩＸ発現の時間の関数としての動態は、産生はトランスフェクションの１２
０時間後には最高水準に到達することを示している。これを超えると、濃度は停
滞するが、これは細胞の状態（コンフルエンス時）、および培地の消耗、恐らく
はデキサメタゾンの消耗によって説明することができる。
０時間後には最高水準に到達することを示している。これを超えると、濃度は停
滞するが、これは細胞の状態（コンフルエンス時）、および培地の消耗、恐らく
はデキサメタゾンの消耗によって説明することができる。
【００９１】 系の有効性も、デキサメタゾンの存在下または非存在下でのアデノウイルス感
染によって評価した。ＶｅｒｏまたはＡ５４９非許容宿主細胞をＣＭＶ−ＧＲｄ ｅｘ およびＭＭＴＶ−ＦＩＸカセット（第一のウイルスについてはセンスであり
、第二のウイルスについてはアンチセンス）を有するビリオンＡｄＴＧ１３０８
３またはＡｄＴＧ１３０９２に感染させ、またはアデノウイルスＡｄＴＧ１３０
７５（ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘ）およびＡｄＴＧ１３０８２（センスＭＭＴＶ−ＦＩ
Ｘ）またはＡｄＴＧ１３０８８（アンチセンスＭＭＴＶ−ＦＩＸ）に同時感染さ
せた。感染実験には、ＭＯＩ（感染多重度）１００を用い、同時感染の場合のウ
イルスのそれぞれについては、ＭＯＩ５０を用いる。培養上清に産生したＦＩＸ
の量は、ＥＬＩＳＡによって分析する。
染によって評価した。ＶｅｒｏまたはＡ５４９非許容宿主細胞をＣＭＶ−ＧＲｄ ｅｘ およびＭＭＴＶ−ＦＩＸカセット（第一のウイルスについてはセンスであり
、第二のウイルスについてはアンチセンス）を有するビリオンＡｄＴＧ１３０８
３またはＡｄＴＧ１３０９２に感染させ、またはアデノウイルスＡｄＴＧ１３０
７５（ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘ）およびＡｄＴＧ１３０８２（センスＭＭＴＶ−ＦＩ
Ｘ）またはＡｄＴＧ１３０８８（アンチセンスＭＭＴＶ−ＦＩＸ）に同時感染さ
せた。感染実験には、ＭＯＩ（感染多重度）１００を用い、同時感染の場合のウ
イルスのそれぞれについては、ＭＯＩ５０を用いる。培養上清に産生したＦＩＸ
の量は、ＥＬＩＳＡによって分析する。
【００９２】 Ｖｅｒｏ細胞では、ＦＩＸの発現は、両カセットを有するビリオンＡｄＴＧ１
３０９２での感染後およびインデューサーの存在下でのみ定量可能である。デキ
サメタゾンまたはＧＲｄｅｘレセプターの非存在下では、誘導は起こらない。こ
れらの細胞は野生型ＧＲを発現しないことを留意すべきである。
３０９２での感染後およびインデューサーの存在下でのみ定量可能である。デキ
サメタゾンまたはＧＲｄｅｘレセプターの非存在下では、誘導は起こらない。こ
れらの細胞は野生型ＧＲを発現しないことを留意すべきである。
【００９３】 Ａ５４９細胞では、ＦＩＸは、デキサメタゾンの存在下にてＡｄＴＧ１３０８
８またはＡｄＴＧ１３０９２に感染した細胞で産生される。これらの細胞は野生
型ＧＲを発現することを留意すべきである。しかしながら、ＦＩＸの水準は、Ｇ
Ｒｄｅｘ（ビリオンＡｄＴＧ１３０８８）の非存在下では経時変化する。
８またはＡｄＴＧ１３０９２に感染した細胞で産生される。これらの細胞は野生
型ＧＲを発現することを留意すべきである。しかしながら、ＦＩＸの水準は、Ｇ
Ｒｄｅｘ（ビリオンＡｄＴＧ１３０８８）の非存在下では経時変化する。
【００９４】 結論として、ＧＲｄｅｘレセプターおよびデキサメタゾンを用いる誘導系は、
ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットがアンチセンス配向である構築物（ＡｄＴＧ１３
０８８およびＡｄＴＧ１３０９２）では機能性である。更に、シス誘導の系（単
一ウイルスによって支持されたカセット）は、２つのウイルスを用いるトランス
系、特にＶｅｒｏ細胞でよりも著しく産生力を有する。
ＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットがアンチセンス配向である構築物（ＡｄＴＧ１３
０８８およびＡｄＴＧ１３０９２）では機能性である。更に、シス誘導の系（単
一ウイルスによって支持されたカセット）は、２つのウイルスを用いるトランス
系、特にＶｅｒｏ細胞でよりも著しく産生力を有する。
【００９５】 更に、ＭＯＩを変化させながら、検討を再現した。Ｖｅｒｏ細胞を、ＭＯＩ１
０、５０または１００でウイルスＡｄＴＧ１３０９２に感染させる。ＡｄＴＧ１
３０７５を、コントロールとして用いる。ＦＩＸを、感染から４８および７２時
間後に分析する。ＦＩＸ産生は°のようなＭＯＩを用いても見られるが、発現の
最適水準はＭＯＩ５０について得られる。
０、５０または１００でウイルスＡｄＴＧ１３０９２に感染させる。ＡｄＴＧ１
３０７５を、コントロールとして用いる。ＦＩＸを、感染から４８および７２時
間後に分析する。ＦＩＸ産生は°のようなＭＯＩを用いても見られるが、発現の
最適水準はＭＯＩ５０について得られる。
【００９６】 インデューサーの濃度も、１０−９〜１０−５Ｍで変化させた。高濃度では、
デキサメタゾンは細胞傷害性であり、ＦＩＸの発現を低下させた。低濃度（１０
−８Ｍ以下）では、誘導は効果的ではない。最適値は１０−７Ｍである。
デキサメタゾンは細胞傷害性であり、ＦＩＸの発現を低下させた。低濃度（１０
−８Ｍ以下）では、誘導は効果的ではない。最適値は１０−７Ｍである。
【００９７】 「容量−応答」効果の更に詳細な分析は、デキサメタゾン濃度を１０−９〜１
０−７Ｍの範囲で変化させて行った。この検討は、野生型ＧＲレセプターを発現
するＡ５４９細胞で行った。従って、活性化はデキサメタゾンによって活性化す
ることができるこのレセプターによって起こすことができる。実際に、デキサメ
タゾン濃度１０−８Ｍでは、IX因子の発現はＧＲｄｅｘ改質レセプターをコード
するベクターＡｄＴＧ１３０９２で感染させた後にのみ誘導することができるこ
とが観察される。更に、この濃度は低すぎて、内在性ＧＲレセプターを活性化す
ることができない（図１）。従って、レポーター遺伝子の誘導は、抵当四両のリ
ガンドを用いて野生型ＧＲレセプターの存在下など制御された選択的方法で起こ
すことができることを示した。この態様は、野生型ＧＲレセプターを発現する天
然条件下でイン・ビボで使用するのに重要である。
０−７Ｍの範囲で変化させて行った。この検討は、野生型ＧＲレセプターを発現
するＡ５４９細胞で行った。従って、活性化はデキサメタゾンによって活性化す
ることができるこのレセプターによって起こすことができる。実際に、デキサメ
タゾン濃度１０−８Ｍでは、IX因子の発現はＧＲｄｅｘ改質レセプターをコード
するベクターＡｄＴＧ１３０９２で感染させた後にのみ誘導することができるこ
とが観察される。更に、この濃度は低すぎて、内在性ＧＲレセプターを活性化す
ることができない（図１）。従って、レポーター遺伝子の誘導は、抵当四両のリ
ガンドを用いて野生型ＧＲレセプターの存在下など制御された選択的方法で起こ
すことができることを示した。この態様は、野生型ＧＲレセプターを発現する天
然条件下でイン・ビボで使用するのに重要である。
【００９８】例６： ＧＲｄｅｘ誘導系のイン・ビボでの評価 ウイルスＡｄＴＧ１３０９２を、免疫担当Ｃ５７Ｂ１／６マウスに４×１０８ または８×１０８iuの割合で静脈内投与する。デキサメタゾンを、１００μgの
濃度で３日間連続して（Ｄ０、Ｄ１およびＤ２）動物の腹腔内に投与する。血清
を感染後３日目から定期的に採取し、産生したＦＩＸの量をＥＬＩＳＡによって
評価する。これらの条件下では、有意なＦＩＸ産生が見られる。
濃度で３日間連続して（Ｄ０、Ｄ１およびＤ２）動物の腹腔内に投与する。血清
を感染後３日目から定期的に採取し、産生したＦＩＸの量をＥＬＩＳＡによって
評価する。これらの条件下では、有意なＦＩＸ産生が見られる。
【００９９】例７： 免疫担当マウスにおけるＧＲｄｅｘ誘導系のイン・ビボでの評価 ウイルスＡｄＴＧ１３０９２、ＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３２４５
を、免疫担当Ｃ５７Ｂ１／６マウスに５×１０８iuの割合で静脈内投与する。ウ
イルスＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３０７５（図３）も、それぞれ５×
１０８iuの割合で同時投与する。
を、免疫担当Ｃ５７Ｂ１／６マウスに５×１０８iuの割合で静脈内投与する。ウ
イルスＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３０７５（図３）も、それぞれ５×
１０８iuの割合で同時投与する。
【０１００】 誘導期は、デキサメタゾン１００μgを３連続日（Ｄ０−Ｄ１−Ｄ２、Ｄ２１
−Ｄ２２−Ｄ２３およびＤ４２−Ｄ４３−Ｄ４４）腹腔内投与することによって
行う。
−Ｄ２２−Ｄ２３およびＤ４２−Ｄ４３−Ｄ４４）腹腔内投与することによって
行う。
【０１０１】 投与マウスの血清を様々な時点で採取し、IX因子産生をＥＬＩＳＡ法によって
評価する。
評価する。
【０１０２】 結果（図４ａ、ｂ、ｃおよびｄ）は、 IX因子レポーター遺伝子の発現は、ＧＲｄｅｘトランスアクチベーターの発
現用カセット並びにＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを含むベクターＡｄＴＧ１３
０９２の投与後、およびそれぞれがこれらの発現カセットの１つを有する２個の
ベクターの同時投与後のいずれにもデキサメタゾンによって誘導され、 ＦＩＸの発現は、ベクターＡｄＴＧ１３０８８単独の投与後にデキサメタゾ
ンによっても誘導される。この場合には、ＦＩＸの発現水準は３誘導中は安定な
ままである。この誘導は、ネズミ細胞によって発現されかつデキサメタゾンによ
って活性化することができる野生型ＧＲレセプターを介して行われる。しかしな
がら、最初の誘導では、ＦＩＸの発現水準は、ＧＲｄｅｘ改質レセプターを発現
するマウスの場合に得られるものの１０分の１であることに注目することができ
、 デキサメタゾンの非存在下では、ベクターを投与しても、発現は見られない
。従って、内在性糖質コルチコイドの量が低すぎて、野生型ＧＲレセプターによ
るＭＭＴＶプロモーターを活性化することができないと確実に結論することがで
き、 ＧＲｄｅｘ改質レセプターの存在下では、ＦＩＸの発現水準はＣＭＶ構成的
プロモーターに匹敵する ことを示している。
現用カセット並びにＭＭＴＶ−ＦＩＸ誘導カセットを含むベクターＡｄＴＧ１３
０９２の投与後、およびそれぞれがこれらの発現カセットの１つを有する２個の
ベクターの同時投与後のいずれにもデキサメタゾンによって誘導され、 ＦＩＸの発現は、ベクターＡｄＴＧ１３０８８単独の投与後にデキサメタゾ
ンによっても誘導される。この場合には、ＦＩＸの発現水準は３誘導中は安定な
ままである。この誘導は、ネズミ細胞によって発現されかつデキサメタゾンによ
って活性化することができる野生型ＧＲレセプターを介して行われる。しかしな
がら、最初の誘導では、ＦＩＸの発現水準は、ＧＲｄｅｘ改質レセプターを発現
するマウスの場合に得られるものの１０分の１であることに注目することができ
、 デキサメタゾンの非存在下では、ベクターを投与しても、発現は見られない
。従って、内在性糖質コルチコイドの量が低すぎて、野生型ＧＲレセプターによ
るＭＭＴＶプロモーターを活性化することができないと確実に結論することがで
き、 ＧＲｄｅｘ改質レセプターの存在下では、ＦＩＸの発現水準はＣＭＶ構成的
プロモーターに匹敵する ことを示している。
【０１０３】例８： 免疫不全マウスにおけるＧＲｄｅｘ誘導系のイン・ビトロでの評価 ウイルスＡｄＴＧ１３０９２、ＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３２４５
（図３参照）を、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ免疫不全マウスに５×１０８iuの割合で静
脈内投与する。ウイルスＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３０７５（図３）
も、それぞれ５×１０８iuの割合で同時投与する。誘導は、デキサメタゾン１０
０μgを３連続日（Ｄ０−Ｄ１−Ｄ２、Ｄ２１−Ｄ２２−Ｄ２３およびＤ４２−
Ｄ４３−Ｄ４４）腹腔内投与することによって行う。
（図３参照）を、ｓｃｉｄ／ｓｃｉｄ免疫不全マウスに５×１０８iuの割合で静
脈内投与する。ウイルスＡｄＴＧ１３０８８およびＡｄＴＧ１３０７５（図３）
も、それぞれ５×１０８iuの割合で同時投与する。誘導は、デキサメタゾン１０
０μgを３連続日（Ｄ０−Ｄ１−Ｄ２、Ｄ２１−Ｄ２２−Ｄ２３およびＤ４２−
Ｄ４３−Ｄ４４）腹腔内投与することによって行う。
【０１０４】 投与マウスの血清を様々な時点で採取し、ＦＩＸ産生をＥＬＩＳＡ法によって
評価する。
評価する。
【０１０５】 結果（図５ａ、ｂ、ｃおよびｄ）は、免疫担当マウスの場合に見られたものに
匹敵し、 ＦＩＸの発現は、ＧＲｄｅｘ改質レセプターを発現するマウスでデキサメタ
ゾンの投与後に誘導される（ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０８８＋Ａ
ｄＴＧ１３０７５投与）。誘導の水準は、リガンドの二回目および三回目の投与
後に対数的に減少した後、実験期間中（７ヶ月）安定なままである。誘導の水準
は、シス（単一アデノウイルスベクターの投与）およびトランス（２個のアデノ
ウイルスベクターの投与）で同等であり、 ＦＩＸの発現は、ベクターＡｄＴＧ１３０８８の投与後に野生型ＧＲレセプ
ターを介してデキサメタゾンによって誘導される。誘導の水準は、経時的に安定
であり、 ＦＩＸの基本発現は、どのようなベクターを投与してもデキサメタゾンの非
存在下では見られず、 ＧＲｄｅｘの存在下での誘導の水準は、（少なくとも最初の誘導の際には）
ＣＭＶ構成的プロモーターに連結した遺伝子の発現に匹敵し、 更に検討を行うことにより、ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０７５
の投与後には（アデノウイルスベクターの投与から少なくとも５６日後まで）、
サザンブロット法によりウイルスＤＮＡの存在およびノーザンブロット法により
ＧＲｄｅｘの発現を示すことができた。
匹敵し、 ＦＩＸの発現は、ＧＲｄｅｘ改質レセプターを発現するマウスでデキサメタ
ゾンの投与後に誘導される（ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０８８＋Ａ
ｄＴＧ１３０７５投与）。誘導の水準は、リガンドの二回目および三回目の投与
後に対数的に減少した後、実験期間中（７ヶ月）安定なままである。誘導の水準
は、シス（単一アデノウイルスベクターの投与）およびトランス（２個のアデノ
ウイルスベクターの投与）で同等であり、 ＦＩＸの発現は、ベクターＡｄＴＧ１３０８８の投与後に野生型ＧＲレセプ
ターを介してデキサメタゾンによって誘導される。誘導の水準は、経時的に安定
であり、 ＦＩＸの基本発現は、どのようなベクターを投与してもデキサメタゾンの非
存在下では見られず、 ＧＲｄｅｘの存在下での誘導の水準は、（少なくとも最初の誘導の際には）
ＣＭＶ構成的プロモーターに連結した遺伝子の発現に匹敵し、 更に検討を行うことにより、ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０７５
の投与後には（アデノウイルスベクターの投与から少なくとも５６日後まで）、
サザンブロット法によりウイルスＤＮＡの存在およびノーザンブロット法により
ＧＲｄｅｘの発現を示すことができた。
【０１０６】例９： 免疫不全マウスにおけるイン・ビボでの容量−応答の評価 ベクターＡｄＴＧ１３０９２およびＡｄＴＧ１３０８８を、ｓｃｉｄ／ｓｃｉ
ｄ免疫不全マウスに５×１０８iuの割合で静脈内投与する。誘導は、デキサメタ
ゾン５０または５μgを３連続日（Ｄ０−Ｄ１−Ｄ２およびＤ２１−Ｄ２２−Ｄ
２３）腹腔内投与することによって行う。血清を様々な時点で採取し、ＦＩＸ産
生をＥＬＩＳＡ法によって評価する。
ｄ免疫不全マウスに５×１０８iuの割合で静脈内投与する。誘導は、デキサメタ
ゾン５０または５μgを３連続日（Ｄ０−Ｄ１−Ｄ２およびＤ２１−Ｄ２２−Ｄ
２３）腹腔内投与することによって行う。血清を様々な時点で採取し、ＦＩＸ産
生をＥＬＩＳＡ法によって評価する。
【０１０７】 先行する研究により、デキサメタゾン３×１００μｇ、３×５０μｇ、または
３×２０μｇを投与することによって、同等な水準の誘導が得られることを示す
ことができた。この研究では、本発明者らは、アデノウイルスベクターによって
提供されるＧＲｄｅｘ改質レセプターによるレポーター遺伝子の発現を活性化す
ることができるが、内在性ＧＲによっては（ＡｄＴＧ１３０８８投与）この発現
を活性化することができないリガンドの投与量を同定した。
３×２０μｇを投与することによって、同等な水準の誘導が得られることを示す
ことができた。この研究では、本発明者らは、アデノウイルスベクターによって
提供されるＧＲｄｅｘ改質レセプターによるレポーター遺伝子の発現を活性化す
ることができるが、内在性ＧＲによっては（ＡｄＴＧ１３０８８投与）この発現
を活性化することができないリガンドの投与量を同定した。
【０１０８】 デキサメタゾン３×５μｇを投与することによって、ＧＲｄｅｘの存在下では
ＦＩＸの発現を活性化することができるが、この発現は内在性ＧＲによって活性
化することができない（図６）。従って、この投与量では、野生型レセプターの
存在下でも導入遺伝子を制御された選択的方法で活性化することができる。
ＦＩＸの発現を活性化することができるが、この発現は内在性ＧＲによって活性
化することができない（図６）。従って、この投与量では、野生型レセプターの
存在下でも導入遺伝子を制御された選択的方法で活性化することができる。
【０１０９】例１０： アデノウイルスベクターのイン・ビボ投与後の免疫応答の発生を防止
することができる誘導的発現系の改良 アデノウイルスベクターは、治療遺伝子を患者に伝達するための好ましい系で
ある。しかしながら、導入遺伝子の発現は、一般的には一過性である。このため
、治療遺伝子の発現を持続させるには、アデノウイルスベクターの投与を反復す
る必要がある。不運なことには、アデノウイルスを最初に投与すると、任意の新
たな投与を妨げる免疫応答を生じることが多い。本発明に関して、本発明者らは
、この抗アデノウイルス免疫応答の発生を防止することができる免疫抑制分子の
発現に基づく新規な方法を開発した。このため、本発明者らは、アデノウイルス
ベクターによって支持される誘導的発現系にインターロイキン−１０（ＩＬ−１
０）をコードする遺伝子を挿入した。従って、ＩＬ−１０の調節された制御発現
により、治療遺伝子を有するベクターの再投与が可能な実験を開発することがで
きる。
することができる誘導的発現系の改良 アデノウイルスベクターは、治療遺伝子を患者に伝達するための好ましい系で
ある。しかしながら、導入遺伝子の発現は、一般的には一過性である。このため
、治療遺伝子の発現を持続させるには、アデノウイルスベクターの投与を反復す
る必要がある。不運なことには、アデノウイルスを最初に投与すると、任意の新
たな投与を妨げる免疫応答を生じることが多い。本発明に関して、本発明者らは
、この抗アデノウイルス免疫応答の発生を防止することができる免疫抑制分子の
発現に基づく新規な方法を開発した。このため、本発明者らは、アデノウイルス
ベクターによって支持される誘導的発現系にインターロイキン−１０（ＩＬ−１
０）をコードする遺伝子を挿入した。従って、ＩＬ−１０の調節された制御発現
により、治療遺伝子を有するベクターの再投与が可能な実験を開発することがで
きる。
【０１１０】 ａ）組換えアデノウイルスの持続性における免疫応答の関与 細胞の免疫応答： Ｅ１およびＥ３領域の欠失したベクター 免疫応答の重要性は、免疫担当または免疫不全マウスで行った実験で説明され
ている(Yang Y., F.A. Nunes, K. Berencsi, E.E. Furth, E. Gonczol and J.M.
Wilson, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411)。例えば、ｌａｃ
Ｚレポーター遺伝子の発現は、アデノウイルスベクターの免疫担当マウスの投与
後には一過性であるが、免疫不全マウスでは安定である。従って、これらの研究
は、形質導入細胞が細胞傷害性のＴリンパ球（ＣＴＬ）によって破壊されること
を示している。更に、ＣＴＬの発生は、投与したウイルス粒子によって誘導され
るが、新たに合成したウイルス粒子だけではない。
ている(Yang Y., F.A. Nunes, K. Berencsi, E.E. Furth, E. Gonczol and J.M.
Wilson, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 4407-4411)。例えば、ｌａｃ
Ｚレポーター遺伝子の発現は、アデノウイルスベクターの免疫担当マウスの投与
後には一過性であるが、免疫不全マウスでは安定である。従って、これらの研究
は、形質導入細胞が細胞傷害性のＴリンパ球（ＣＴＬ）によって破壊されること
を示している。更に、ＣＴＬの発生は、投与したウイルス粒子によって誘導され
るが、新たに合成したウイルス粒子だけではない。
【０１１１】 Ｅ１、Ｅ３およびＥ４またはＥ２ａ領域の欠失したベクター Ｅ４またはＥ２ａ領域の欠失により、ウイルスタンパク質の総ての残余発現が
消失する。しかしながら、毒性はＥ２ａ領域の削除によっては減少しない。一方
、Ｅ４領域の欠失により、静脈内投与後には肝臓毒性が有意に減少する。しかし
ながら、ＤＮＡは持続しているが、導入遺伝子の発現はかなり減少することが多
い。
消失する。しかしながら、毒性はＥ２ａ領域の削除によっては減少しない。一方
、Ｅ４領域の欠失により、静脈内投与後には肝臓毒性が有意に減少する。しかし
ながら、ＤＮＡは持続しているが、導入遺伝子の発現はかなり減少することが多
い。
【０１１２】 体液性免疫応答 世界中の人口の８５％を上回る数がアデノウイルスに対して免役されており、
血清型２または５に対して指定した抗アデノウイルス抗体を有する。再感染が起
こらなければ、中和抗体力価は低下して、２年後には検出不能な水準に到達する
。これらの抗体は、膜レセプターへのウイルスの結合および細胞質へのそのトラ
ンスロケーションを防止することができる。
血清型２または５に対して指定した抗アデノウイルス抗体を有する。再感染が起
こらなければ、中和抗体力価は低下して、２年後には検出不能な水準に到達する
。これらの抗体は、膜レセプターへのウイルスの結合および細胞質へのそのトラ
ンスロケーションを防止することができる。
【０１１３】 アデノウイルスゲノムが欠失していても、体液性免疫応答はウイルスキャプシ
ドのタンパク質を認識し、抗アデノウイルス中和抗体を産生することができる。
従って、免疫抑制法が、再投与に必要である。
ドのタンパク質を認識し、抗アデノウイルス中和抗体を産生することができる。
従って、免疫抑制法が、再投与に必要である。
【０１１４】 ｂ）体液性免疫応答の免疫抑制法 インターロイキン−１０は、免疫抑制特性を有することが知られており、臓器
移植拒絶反応の場合および抗炎症治療における有望な結果を示している。ＩＬ−
１０は多くの細胞（抗原によって活性化後の単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ
細胞）によって分泌され、多数の標的細胞（単球／マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ
細胞、好中球、および内皮細胞など）を有する。これは、多面発現効果を有し、
細胞の種類によって免疫刺激または免疫抑制活性を有する。ヒトおよびラットイ
ンターロイキン−１０は極めて相同性であり、ヌクレオチドレベルで８４％の相
同性であり、タンパク質レベルでは７３％の相同性である。
移植拒絶反応の場合および抗炎症治療における有望な結果を示している。ＩＬ−
１０は多くの細胞（抗原によって活性化後の単球／マクロファージ、Ｔ細胞、Ｂ
細胞）によって分泌され、多数の標的細胞（単球／マクロファージ、Ｂ細胞、Ｔ
細胞、好中球、および内皮細胞など）を有する。これは、多面発現効果を有し、
細胞の種類によって免疫刺激または免疫抑制活性を有する。ヒトおよびラットイ
ンターロイキン−１０は極めて相同性であり、ヌクレオチドレベルで８４％の相
同性であり、タンパク質レベルでは７３％の相同性である。
【０１１５】 ＩＬ−１０は、単球／マクロファージに対して免疫抑制効果を有する。これは
、前炎症性サイトカイン(pro-inflammatory cytokines)およびケモカインの産生
、およびクラスIIＭＨＣおよび副刺激分子の発現を阻害する。これは、顆粒球お
よび好酸球の炎症反応の期間も制限する。
、前炎症性サイトカイン(pro-inflammatory cytokines)およびケモカインの産生
、およびクラスIIＭＨＣおよび副刺激分子の発現を阻害する。これは、顆粒球お
よび好酸球の炎症反応の期間も制限する。
【０１１６】 一方、ＩＬ−１０は、Ｂリンパ球の成長力、Ｂリンパ球による抗体の分泌、お
よびＢリンパ球によるクラスIIＭＨＣの発現を刺激する。これは、マスト細胞お
よびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する刺激作用も有する。しかしながら、ＩＬ−１０は全
般的に見て極めて強力な免疫抑制効果を有する。
よびＢリンパ球によるクラスIIＭＨＣの発現を刺激する。これは、マスト細胞お
よびＣＤ８＋Ｔ細胞に対する刺激作用も有する。しかしながら、ＩＬ−１０は全
般的に見て極めて強力な免疫抑制効果を有する。
【０１１７】 ＩＬ−１０の抗炎症性および免疫抑制特性は、組換えアデノウイルスに対する
中和抗体の産生の抑制に関与している可能性がある。具体的には、ＩＬ−１０お
よびβ−ガラクトシダーゼの同時投与によって、ウイルスに対する免疫応答の誘
導およびＣＴＬの産生は防止され、従って、レポーター遺伝子を持続発現させる
ことができる。
中和抗体の産生の抑制に関与している可能性がある。具体的には、ＩＬ−１０お
よびβ−ガラクトシダーゼの同時投与によって、ウイルスに対する免疫応答の誘
導およびＣＴＬの産生は防止され、従って、レポーター遺伝子を持続発現させる
ことができる。
【０１１８】 しかしながら、持続的免疫抑制は無視し得ない副作用と関連しており、従って
、一過性で調節可能な免疫抑制を得るのが望ましい。
、一過性で調節可能な免疫抑制を得るのが望ましい。
【０１１９】 ｃ）本発明による誘導的系 本発明者らが開発した系は、ホルモンによる誘導に基づいている。具体的には
、これらのホルモンは、ホルモン結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびトラ
ンス活性化ドメインからなるその核レセプターに結合する。立体配座変化および
ＤＮＡ上に配置された標的エレメントへの結合の後、調節可能なプロモーターの
下流に配置された遺伝子の転写が活性化される。しかしながら、制御することが
できないエレメントである内在性ホルモンによる活性化を防止するため、本発明
者らはホルモン結合ドメインデカ遺失されたレセプターを使用する選択を行った
。エストロゲンまたはプロゲステロンレセプターのようなこれらの突然変異レセ
プターは、合成的な外来性リガンドに応答することができるが、内在性ホルモン
には応答できない。
、これらのホルモンは、ホルモン結合ドメイン、ＤＮＡ結合ドメインおよびトラ
ンス活性化ドメインからなるその核レセプターに結合する。立体配座変化および
ＤＮＡ上に配置された標的エレメントへの結合の後、調節可能なプロモーターの
下流に配置された遺伝子の転写が活性化される。しかしながら、制御することが
できないエレメントである内在性ホルモンによる活性化を防止するため、本発明
者らはホルモン結合ドメインデカ遺失されたレセプターを使用する選択を行った
。エストロゲンまたはプロゲステロンレセプターのようなこれらの突然変異レセ
プターは、合成的な外来性リガンドに応答することができるが、内在性ホルモン
には応答できない。
【０１２０】 本発明者らは、内在性糖質コルチコイドではなくデキサメタゾンによる活性化
の後にＧＲＥエレメント（糖質コルチコイド応答性エレメント）の下流に配置さ
れた導入遺伝子の発現を誘導することができる改質した糖質コルチコイドレセプ
ターに基づく系を開発した。この研究中に、ＩＬ−１０を誘導的に発現する各種
のアデノウイルスベクターを得て、抗アデノウイルス免疫応答に対するそれらの
効果を評価した。
の後にＧＲＥエレメント（糖質コルチコイド応答性エレメント）の下流に配置さ
れた導入遺伝子の発現を誘導することができる改質した糖質コルチコイドレセプ
ターに基づく系を開発した。この研究中に、ＩＬ−１０を誘導的に発現する各種
のアデノウイルスベクターを得て、抗アデノウイルス免疫応答に対するそれらの
効果を評価した。
【０１２１】 ｄ）アデノウイルスベクターの発生 総てのアデノウイルスベクターは、ヌクレオチド４５９〜３３２７（Ｅ１領域
）およびヌクレオチド２８５９２〜３０４７０（Ｅ３領域）を欠失した５型のヒ
トアデノウイルスのゲノムを含んでなるプラスミドｐＴｇ６４０１から誘導され
る。
）およびヌクレオチド２８５９２〜３０４７０（Ｅ３領域）を欠失した５型のヒ
トアデノウイルスのゲノムを含んでなるプラスミドｐＴｇ６４０１から誘導され
る。
【０１２２】 Ｅ１におけるインサート： ＧＲｄｅｘ改質遺伝子を、ＣＭＶ（サイトメガロ
ウイルス）プロモーター、キメライントロン（ｐＣＩ，Promega）およびＳＶ４
０ポリアデニル化シグナルの制御下でプラスミドｐＴｇ６４０１とＧＲｄｅｘｃ
ＤＮＡを含む転移プラスミドとの相同組換えによって５型アデノウイルスのゲノ
ムのＥ１領域に導入する。
ウイルス）プロモーター、キメライントロン（ｐＣＩ，Promega）およびＳＶ４
０ポリアデニル化シグナルの制御下でプラスミドｐＴｇ６４０１とＧＲｄｅｘｃ
ＤＮＡを含む転移プラスミドとの相同組換えによって５型アデノウイルスのゲノ
ムのＥ１領域に導入する。
【０１２３】 Ｅ３におけるインサート： ラットＩＬ−１０ｃＤＮＡ(Feng L., W.W. Tang,
J.C. Chang and C.B. Wilson, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun., 192:
452-45)を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１２２３７（CTAGTCTAGA CCACCATGCT TGG
CTCAGCA CTGCT＝配列番号１）およびＯＴＧ１２２４３（TTTATAGCGG CCGCTCAATT
TTTCATTTTG AGTG＝配列番号２）を用いるラット細胞の全ｍＲＮＡについての逆
ＰＣＲによって、変性（９５℃で１分）、プライマーのハイブリダイゼーション
（６５℃で１分）および伸張（７２℃で１分）の３０サイクルを行って得た。ｃ
ＤＮＡを、ＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）ＬＴＲプロモーターに含まれ
る４個の糖質コルチコイド応答性エレメントの下流に置く。この発現カセットを
、アデノウイルスの野生型Ｅ３領域についてアンチセンス配向のＥ３領域を欠失
した転移プラスミドに導入する。
J.C. Chang and C.B. Wilson, 1993, Biochem. Biophys. Res. Commun., 192:
452-45)を、オリゴヌクレオチドＯＴＧ１２２３７（CTAGTCTAGA CCACCATGCT TGG
CTCAGCA CTGCT＝配列番号１）およびＯＴＧ１２２４３（TTTATAGCGG CCGCTCAATT
TTTCATTTTG AGTG＝配列番号２）を用いるラット細胞の全ｍＲＮＡについての逆
ＰＣＲによって、変性（９５℃で１分）、プライマーのハイブリダイゼーション
（６５℃で１分）および伸張（７２℃で１分）の３０サイクルを行って得た。ｃ
ＤＮＡを、ＭＭＴＶ（マウス哺乳類腫瘍ウイルス）ＬＴＲプロモーターに含まれ
る４個の糖質コルチコイド応答性エレメントの下流に置く。この発現カセットを
、アデノウイルスの野生型Ｅ３領域についてアンチセンス配向のＥ３領域を欠失
した転移プラスミドに導入する。
【０１２４】 この転移ベクターとアデノウイルスベクターＡｄ−ＧＲｄｅｘまたはｐＴｇ６
４０１との相同組換えによって、Ｅ１にアクチベーターの発現のためのカセット
およびＥ３にアンチセンス配向での誘導カセットを有するベクター（Ａｄ−ＧＲ ｄｅｘ −ＭＭＴＶ／ＩＬ−１０−野生型Ｅ４）、またはＥ３に誘導カセットのみ
を含むベクター（Ａｄ−ΔＥ１−ＭＭＴＶ／ＩＬ１０−野生型−Ｅ４）をそれぞ
れ生成させることができる。
４０１との相同組換えによって、Ｅ１にアクチベーターの発現のためのカセット
およびＥ３にアンチセンス配向での誘導カセットを有するベクター（Ａｄ−ＧＲ ｄｅｘ −ＭＭＴＶ／ＩＬ−１０−野生型Ｅ４）、またはＥ３に誘導カセットのみ
を含むベクター（Ａｄ−ΔＥ１−ＭＭＴＶ／ＩＬ１０−野生型−Ｅ４）をそれぞ
れ生成させることができる。
【０１２５】 ラットＩＬ−１０ｃＤＮＡも、ＣＭＶプロモーターの制御下に置いた。この構
成的発現カセットをアンチセンス配向のｐＴｇ６４０１のＥ３領域に挿入した（
Ａｄ−ΔＥ１−ＣＭＶ／ＩＬ１０）。
成的発現カセットをアンチセンス配向のｐＴｇ６４０１のＥ３領域に挿入した（
Ａｄ−ΔＥ１−ＣＭＶ／ＩＬ１０）。
【０１２６】 総ての第二の発生構築物は、Ｅ４領域のリーディングフレーム３および４（Ｏ
ＲＦ３，４）を含む転移プラスミドと先行する第一の発生ベクターとの相同組換
えによって得られる。
ＲＦ３，４）を含む転移プラスミドと先行する第一の発生ベクターとの相同組換
えによって得られる。
【０１２７】 第一および第二の発生構築物の総ては、図７に例示する。
【０１２８】 ｅ） イン・ビトロでのＩＬ−１０の発現の評価 ２９３細胞における一過性トランスフェクション ２９３細胞を、ＧＲｄｅｘアクチベーターの発現用のカセットの存在下または
非存在下でラットインターロイキン−１０の発現用カセットを含む転移プラスミ
ドでトランスフェクションする。これらを、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中デキサメタ
ゾン（１０−７Ｍ）の存在下または非存在下で培養する。上清を様々な時点で採
取し、導入遺伝子の発現を分析する。
非存在下でラットインターロイキン−１０の発現用カセットを含む転移プラスミ
ドでトランスフェクションする。これらを、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ中デキサメタ
ゾン（１０−７Ｍ）の存在下または非存在下で培養する。上清を様々な時点で採
取し、導入遺伝子の発現を分析する。
【０１２９】 Ａ５４９およびＶＥＲＯ細胞における組換えアデノウイルスのイン・ビトロで
のバリデーション Ａ５４９およびＶＥＲＯ細胞を、６穴プレートに３×１０５個ずつ前日に播種
する。細胞を、ＤＭＥＭ２％ＦＣＳ ２００μl中の様々なウイルスプレストッ
クでＭＯＩ５０で感染させる。３７℃で３０分間吸着させた後、ＤＭＥＭ２％Ｆ
ＣＳ３mlを１０−７Mのデキサメタゾンの存在下または非存在下にて細胞に加え
る。上清を様々な時点で採取し、導入遺伝子の発現を分析する。
のバリデーション Ａ５４９およびＶＥＲＯ細胞を、６穴プレートに３×１０５個ずつ前日に播種
する。細胞を、ＤＭＥＭ２％ＦＣＳ ２００μl中の様々なウイルスプレストッ
クでＭＯＩ５０で感染させる。３７℃で３０分間吸着させた後、ＤＭＥＭ２％Ｆ
ＣＳ３mlを１０−７Mのデキサメタゾンの存在下または非存在下にて細胞に加え
る。上清を様々な時点で採取し、導入遺伝子の発現を分析する。
【０１３０】 ＥＬＩＳＡ（酵素結合イムノソーベント分析法）試験によるラットＩＬ−１０
の発現の定量 ラットＩＬ−１０を、OptEIAＲキット(Pharmingen)を用いて検出する。キット
は、製造業者の仕様に従って用いる。 デキサメタゾンによるＩＬ−１０の誘導を、２９３細胞への転移プラスミドの
一過性トランスフェクションによって評価した。誘導能は、転移ベクターＭＭＴ
ｖ−ＩＬ１０をＧＲｄｅｘトランスアクチベーターを発現するベクターを用いて
動じトランスフェクションすることによって分析する。プラスミドＭＭＴＶ−Ｉ
Ｌ１０単独のトランスフェクションは、トランスアクチベーターの非存在下での
ＩＬ−１０の発現水準を示す。更に、誘導の水準を、またこのプラスミドを２９
３細胞へトランスフェクションすることによってＣＭＶプロモーターの制御下で
のＩＬ−１０の構成的発現と比較する。誘導は、１０７Mの濃度のデキサメタゾ
ンの存在下または非存在下で行う。培養上清をトランスフェクションの７２およ
び１２０時間後に採取して、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１０を定量する。
デキサメタゾンの存在下におけるプラスミドＭＭＴＶ−ＩＬ１０およびＧＲｄｅ ｘ の同時トランスフェクションによって、ＩＬ−１０を誘導することができる（
トランスフェクションから１２０時間後、５０ng／ml）。
の発現の定量 ラットＩＬ−１０を、OptEIAＲキット(Pharmingen)を用いて検出する。キット
は、製造業者の仕様に従って用いる。 デキサメタゾンによるＩＬ−１０の誘導を、２９３細胞への転移プラスミドの
一過性トランスフェクションによって評価した。誘導能は、転移ベクターＭＭＴ
ｖ−ＩＬ１０をＧＲｄｅｘトランスアクチベーターを発現するベクターを用いて
動じトランスフェクションすることによって分析する。プラスミドＭＭＴＶ−Ｉ
Ｌ１０単独のトランスフェクションは、トランスアクチベーターの非存在下での
ＩＬ−１０の発現水準を示す。更に、誘導の水準を、またこのプラスミドを２９
３細胞へトランスフェクションすることによってＣＭＶプロモーターの制御下で
のＩＬ−１０の構成的発現と比較する。誘導は、１０７Mの濃度のデキサメタゾ
ンの存在下または非存在下で行う。培養上清をトランスフェクションの７２およ
び１２０時間後に採取して、ＥＬＩＳＡキットを用いてＩＬ−１０を定量する。
デキサメタゾンの存在下におけるプラスミドＭＭＴＶ−ＩＬ１０およびＧＲｄｅ ｘ の同時トランスフェクションによって、ＩＬ−１０を誘導することができる（
トランスフェクションから１２０時間後、５０ng／ml）。
【０１３１】 本発明者らは、ＧＲｄｅｘトランスアクチベーターおよびデキサメタゾンリガ
ンドを提供することによって、ＭＭＴＶ誘導プロモーターの制御下でＩＬ−１０
の発現を誘導できることを示した。
ンドを提供することによって、ＭＭＴＶ誘導プロモーターの制御下でＩＬ−１０
の発現を誘導できることを示した。
【０１３２】 ＧＲｄｅｘに結合したデキサメタゾンによるＩＬ−１０の誘導の有効性を、Ａ
５４９ヒト細胞およびＶＥＲＯトリ細胞にベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０±
ＡｄＧＲｄｅｘまたはＡＤ−ＧＲｄｅｘ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０を感染させること
によってイン・ビトロで評価した。これらの２種類の感染によって、トランスま
たはシスでの誘導の有効性を評価することができる。細胞培養物は、１０−７Ｍ
のデキサメタゾンの存在下または非存在下で調製する。得られたＩＬ−１０の量
を、このサイトカインを構成的に発現するＡｄ−ＣＭＶＩＬ−１０を感染させた
後に得られた量と比較する。更に、ＩＬ−１０の誘導を、予めイン・ビトロで評
価した同一の構築物に挿入したヒトIX因子の誘導と比較する。上清を感染から２
４、４８、７２および９６時間後に採取して、産生したＩＬ−１０およびIX因子
をＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。
５４９ヒト細胞およびＶＥＲＯトリ細胞にベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０±
ＡｄＧＲｄｅｘまたはＡＤ−ＧＲｄｅｘ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０を感染させること
によってイン・ビトロで評価した。これらの２種類の感染によって、トランスま
たはシスでの誘導の有効性を評価することができる。細胞培養物は、１０−７Ｍ
のデキサメタゾンの存在下または非存在下で調製する。得られたＩＬ−１０の量
を、このサイトカインを構成的に発現するＡｄ−ＣＭＶＩＬ−１０を感染させた
後に得られた量と比較する。更に、ＩＬ−１０の誘導を、予めイン・ビトロで評
価した同一の構築物に挿入したヒトIX因子の誘導と比較する。上清を感染から２
４、４８、７２および９６時間後に採取して、産生したＩＬ−１０およびIX因子
をＥＬＩＳＡキットを用いて定量する。
【０１３３】 ＶＥＲＯ細胞では、これらの細胞をデキサメタゾンの存在下でＡｄ−ＭＭＴＶ
−ＩＬ１０＋Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘに同時感染させるときに、ＩＬ−１０の
発現を誘導して、感染から９６時間後に５０．８ng／mlとなるようにする。リガ
ンドの非存在下では、ＩＬ−１０は僅かに検出可能である（１．２ng／ml）。一
方、ＧＲｄｅｘトランスアクチベーターの非存在下では、ＩＬ−１０の発現の有
意な誘導はデキサメタゾンの存在下では認めることができず（３ng／ml）、一過
性トランスフェクションで得られた残余発現に相当し、デキサメタゾンの非存在
下では０．７ng／mlである。
−ＩＬ１０＋Ａｄ−ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘに同時感染させるときに、ＩＬ−１０の
発現を誘導して、感染から９６時間後に５０．８ng／mlとなるようにする。リガ
ンドの非存在下では、ＩＬ−１０は僅かに検出可能である（１．２ng／ml）。一
方、ＧＲｄｅｘトランスアクチベーターの非存在下では、ＩＬ−１０の発現の有
意な誘導はデキサメタゾンの存在下では認めることができず（３ng／ml）、一過
性トランスフェクションで得られた残余発現に相当し、デキサメタゾンの非存在
下では０．７ng／mlである。
【０１３４】 従って、本発明者らは、ＶＥＲＯ細胞では、２つの発現カセットが２つの異な
るアデノウイルスベクターによって支持されているときには、ＩＬ−１０の発現
はＧＲｄｅｘに「トランス」で結合したデキサメタゾンによって誘導できること
を示すことができた。
るアデノウイルスベクターによって支持されているときには、ＩＬ−１０の発現
はＧＲｄｅｘに「トランス」で結合したデキサメタゾンによって誘導できること
を示すことができた。
【０１３５】 Ａ５４９細胞では、「トランス」で誘導可能な系の機能性を実証することもで
きた。具体的には、ＩＬ−１０濃度は、ベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０＋Ａ
ｄ−ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘによる同時感染後には、デキサメタゾンの存在下で３２
．３ng／mlに到達する。リガンドの非存在下では、サイトカインは検出できない
。ベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０単独での感染後には、ＩＬ−１０の発現は
デキサメタゾンによっても誘導される。この活性化は、Ａ５４９細胞によって発
現された野生型ＧＲレセプターによって起こる。
きた。具体的には、ＩＬ−１０濃度は、ベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０＋Ａ
ｄ−ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘによる同時感染後には、デキサメタゾンの存在下で３２
．３ng／mlに到達する。リガンドの非存在下では、サイトカインは検出できない
。ベクターＡｄ−ＭＭＴＶ−ＩＬ１０単独での感染後には、ＩＬ−１０の発現は
デキサメタゾンによっても誘導される。この活性化は、Ａ５４９細胞によって発
現された野生型ＧＲレセプターによって起こる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 プラスミドｐＴＧ１３０６４（ＣＭＶ−ＧＲｄｅｘ）、ｐＴＧ６２４２（ＬＴ
ＲＭＭＴＶ−ＦＩＸ，センス）およびｐＴＧ１３０６３（ＬＴＲＭＭＴＶ−ＦＩ
Ｘ，アンチセンス）を用いる２９３細胞の一過性トランスフェクションから１４
４時間後に産生したＦＩＸの量を図解的に示したもの。
ＲＭＭＴＶ−ＦＩＸ，センス）およびｐＴＧ１３０６３（ＬＴＲＭＭＴＶ−ＦＩ
Ｘ，アンチセンス）を用いる２９３細胞の一過性トランスフェクションから１４
４時間後に産生したＦＩＸの量を図解的に示したもの。
【図２】 Ａ５４９細胞でのデキサメタゾンの投与量／応答効果の評価。細胞の感染は、
ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０９８を用いてＭＯＩ＝５０で行う。デ
キサメタゾンを用いる誘導は、濃度を１０−９〜１０−７Mの範囲で変化させて
行う。
ＡｄＴＧ１３０９２またはＡｄＴＧ１３０９８を用いてＭＯＩ＝５０で行う。デ
キサメタゾンを用いる誘導は、濃度を１０−９〜１０−７Mの範囲で変化させて
行う。
【図３】 構築物ＡｄＴＧ３０７５、ＡｄＴＧ１３０８８、ＡｄＴＧ１３０９２およびＡ
ｄＴＧ１３２４５の図解的表現。
ｄＴＧ１３２４５の図解的表現。
【図４ａ】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメ
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
【図４ｂ】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメ
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
【図４ｃ】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメ
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
【図４ｄ】 Ｃ５７Ｂ１／６マウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメ
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
タゾン誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで
測定した値の平均値である。
【図５ａ】 ＳＣＩＤマウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメタゾン
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
【図５ｂ】 ＳＣＩＤマウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメタゾン
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
【図５ｃ】 ＳＣＩＤマウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメタゾン
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
【図５ｄ】 ＳＣＩＤマウスで試験した様々な構築物を用いるＧｒｄｅｘ／デキサメタゾン
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
誘導系のイン・ビボでの評価。示した値は、治療したマウスのそれぞれで測定し
た値の平均値である。
【図６】 ＳＣＩＤマウスでのイン・ビボでのデキサメタゾン投与量／応答効果の評価。
【図７】 プラスミドｐＴｇ６４０１から誘導される第一および第二の発生アデノウイル
スベクターの図解的表現。
スベクターの図解的表現。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 31/00 Ａ６１Ｐ 31/04 31/04 31/18 31/18 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 7/00 5/10 Ａ６１Ｋ 35/76 7/00 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ // Ａ６１Ｋ 35/76 5/00 Ａ 38/00 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 BA03 BA07 BA21 BA31 BA38 BA65 CA01 DA02 DA20 EA02 FA02 FA06 HA17 4B065 AA87X AA95X AA95Y AB01 AC14 BA02 CA24 CA27 CA44 4C084 AA02 AA06 AA13 BA44 CA53 CA56 DA01 DA27 DA39 DB22 DB34 DC01 DC10 DC32 MA52 MA66 NA14 ZA36 ZA39 ZA40 ZA53 ZA94 ZB02 ZB05 ZB11 ZB26 ZB32 ZB33 ZB37 ZC04 ZC19 ZC20 ZC35 ZC55 4C087 AA01 AA02 AA03 BC83 MA66 NA14 ZA36 ZA39 ZA40 ZA53 ZA94 ZB05 ZB11 ZB26 ZB32 ZB33 ZB37 ZC04 ZC19 ZC20 ZC35 ZC55 【要約の続き】
Claims (34)
- 【請求項１】 (i) 真核生物またはウイルス起源の転写アクチベーターをコードし、宿主細
胞または生物での発現に適する調節エレメントによって制御される、ヌクレオチ
ド配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される目的遺伝子を含んでなる、組換えアデノウイルスベク
ター を含んでなる、誘導的発現系。 - 【請求項２】 前記転写アクチベーターが少なくとも１個のトランス活性化ドメイン、１個の
ＤＮＡ結合ドメイン、および１個のリガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）を含んでな
る、請求項１に記載の発現系。 - 【請求項３】 前記転写アクチベーターが、エストロゲン（ＥＲ）、糖質コルチコイド（ＧＲ
）、プロゲステロン（ＰＲ）、ビタミンＤ、エクジソン（ＥｃＲ）、鉱質コルチ
コイド、アンドロゲン、甲状腺ホルモン、レチノイン酸およびレチノイン酸Ｘレ
セプターからなる群から選択されるステロイドホルモンレセプター、イムノフィ
リン、またはアリール炭化水素レセプター（ＡｈＲ）の由来のドメインの全部ま
たは一部を含んでなる、請求項２に記載の発現系。 - 【請求項４】 前記転写アクチベーターが、 (i) ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、および糖質コルチコイ
ドレセプター由来のＬＢＤを含んでなる、ＧＲｄｅｘと表わされるポリペプチド
であって、前記レセプターがそのＬＢＤにおいて７４７位のイソロイシンをトレ
オニンで置換することによって改質されたポリペプチド、 (ii) ＤＮＡ結合ドメイン、トランス活性化ドメイン、およびエストロゲンレ
セプター由来のＬＢＤを含んでなる、ＥＲＴと表わされる、ポリペプチドであっ
て、前記レセプターがそのＬＢＤにおいて特に５２１位のグリシンをアルギニン
で置換することによって改質されたポリペプチド、 (iii) エクジソンレセプター、ＥｃＲおよびＧＲレセプターのドメイン由来
のハイブリッドＤＮＡ結合ドメイン、およびＶＰ１６ウイルスタンパク質由来の
トランス活性化ドメインを含んでなる第一のポリペプチドと、Drosophila USPタ
ンパク質またはヒトレチノイン酸Ｘレセプター（ＲＸＲ）のような同族体由来の
第二のポリペプチドとを含んでなる転写アクチベーター、 (iv) ＺＦＨＤ１転写因子由来のＤＮＡ結合ドメインおよびＦＫＢＰ１２イム
ノフィリン由来のＬＢＤを含んでなる第一のポリペプチドと、ＮＦκＢ Ｐ６５
因子由来のトランス活性化ドメインおよびＦＲＡＰ（ＦＫＢＰ１２−ラパマイシ
ン関連タンパク質）由来のＬＢＤを含んでなる第二のポリペプチドとを含んでな
る転写アクチベーター、および (v) ＡｈＲレセプター由来の第一のポリペプチドと、Ａｒｎｔタンパク質（
アリール炭化水素レセプター核トランスロケーター）由来の第二のポリペプチド
とを含んでなる転写アクチベーター から選択される、請求項３に記載の発現系。 - 【請求項５】 前記転写アクチベーターが、ＬＢＤと、ステロイドレセプター由来のトランス
活性化ドメインと、特にＧａ１４酵母タンパク質由来の異種ＤＮＡ結合ドメイン
とを含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の発現系。 - 【請求項６】 前記転写アクチベーターが、非天然インデューサーの結合によって活性化され
、天然のヒト化合物によっては活性化されないかまたは余り活性化されない、請
求項１〜５のいずれか一項に記載の発現系。 - 【請求項７】 前記非天然インデューサーが経口投与することができる合成物質である、請求
項６に記載の発現系。 - 【請求項８】 前記インデューサーが、デキサメタゾン、タモキシフェン、ムリステロンＡ、
エクジソン、ラパマイシン、および２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ
−ジオキシン、またはこれらの化合物の類似体からなる群から選択される、請求
項７に記載の発現系。 - 【請求項９】 前記目的遺伝子がアンチセンスＲＮＡ、リボザイムまたは目的ポリペプチドを
コードする、請求項１〜８のいずれか一項に記載の発現系。 - 【請求項１０】 前記目的ポリペプチドが、ケモカイン、サイトカイン、細胞性レセプター、リ
ガンド、凝固因子、ＣＦＴＲタンパク質、インスリン、ジストロフィン、成長因
子、酵素、酵素阻害剤、抗腫瘍作用を有するポリペプチド、細菌、寄生生物また
はウイルス感染を阻害することができるポリペプチド、アポトーシスに作用する
ポリペプチド、細胞分裂抑制因子、免疫グロブリン、アポリポタンパク質、細胞
傷害性生成物、腫瘍抑制遺伝子発現生成物、腫瘍関連抗原、イムノトキシン、血
管新生阻害因子、およびマーカーからなる群から選択される、請求項９に記載の
発現系。 - 【請求項１１】 前記誘導プロモーターが、請求項２〜８のいずれか一項に記載の転写アクチベ
ーターに応答する１種類以上の標的配列を含んでなる、請求項１〜１０のいずれ
か一項に記載の発現系。 - 【請求項１２】 前記標的配列が、ＥＲＥ、ＧＲＥ、ＥｃＲ、ＵＡＳ、５ｘＥ／ＧＲＥ、または
ＸＲＥ配列であるか、またはＺＦＤＨ−１転写因子に応答する標的配列である、
請求項１１に記載の発現系。 - 【請求項１３】 前記ヌクレオチド配列およびそれらの調節エレメントが、前記組換えアデノウ
イルスベクターによって収容されている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載
の発現系。 - 【請求項１４】 前記ヌクレオチド配列およびそれらの調節エレメントが、前記組換えアデノウ
イルスベクター以外の独立発現ベクターによって収容されている、請求項１〜１
２のいずれか一項に記載の発現系。 - 【請求項１５】 前記独立ベクターが、合成ベクター、プラスミドまたはウイルスベクター、特
にアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ヘルペス
ウイルス、アルファウイルス、パルボウイルス、ポックスウイルス（鶏痘、カナ
リア痘、ワクシニアウイルスなど）、または泡沫状ウイルス由来のベクターであ
る、請求項１４に記載の発現系。 - 【請求項１６】 前記組換えアデノウイルスベクターおよび適当な場合には前記独立アデノウイ
ルスベクターが、Ｅ１領域の全部または一部の欠失または後者の非機能的突然変
異によってＥ１機能を欠いている、請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の発
現系。 - 【請求項１７】 前記組換えアデノウイルスベクターおよび／または前記独立アデノウイルスベ
クターがさらに、Ｅ２、Ｅ４、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４および／またはＬ５機能
の少なくとも１個を欠いている、請求項１６に記載の発現系。 - 【請求項１８】 前記組換えアデノウイルスベクターおよび／または前記独立アデノウイルスベ
クターがさらに、Ｅ３非必須領域の全部または一部を欠いている、請求項１６ま
たは１７に記載の発現系。 - 【請求項１９】 前記組換えアデノウイルスベクターおよび適当な場合には前記独立ベクターが
、感染性ウイルス粒子の形態をしている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載
の発現系。 - 【請求項２０】 (i) 転写アクチベーターをコードし、宿主細胞または生物での発現に適する
調節エレメントによって制御される、ヌクレオチド配列、および (ii) 前記転写アクチベーターによってトランス活性化することができる誘導
プロモーターで制御される、目的遺伝子 を含んでなる、組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項２１】 前記ヌクレオチド配列が、請求項２〜６のいずれか一項に記載の転写アクチベ
ーター、または原核性転写アクチベーター、特にＬＢＤとテトラサイクリンオペ
ロンリプレッサー由来のＤＮＡ結合ドメインを含んでなるポリペプチドをコード
する、請求項２０に記載の組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項２２】 前記ヌクレオチド配列が、ＶＰ１６ウイルスタンパク質由来の転写活性化ドメ
インのフレームに融合したテトラサイクリンオペロンリプレッサー（tetR）を含
んでなるｔＴＡポリペプチドをコードする、請求項２１に記載の組換えアデノウ
イルスベクター。 - 【請求項２３】 前記非天然インデューサーが、請求項７または８に記載されたとおりであるか
、またはドキシサイクリンまたはテトラサイクリンからなる、請求項２０〜２２
のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項２４】 前記目的遺伝子が、請求項９または１０に記載された通りである、請求項２０
〜２３のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項２５】 前記誘導プロモーターが、請求項１１または１２に記載されたとおりであるか
、または１個以上のｔｅｔＯ標的配列を含んでなる、請求項２０〜２４のいずれ
か一項に記載の組換えアデノウイルスベクター。 - 【請求項２６】 前記組換えアデノウイルスベクターが、請求項１６〜１８のいずれか一項に記
載されたとおりである、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組換えアデノ
ウイルスベクター。 - 【請求項２７】 請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクターを含
んでなる、感染性ウイルス粒子。 - 【請求項２８】 (i) 請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクタ
ーを、前記ベクターをトランス相補することができる相補細胞に導入して、トラ
ンスフェクション相補細胞を得て、 (ii) 前記トランスフェクション相補細胞を、前記ウイルス粒子を産生するの
に適した条件下で培養し、 (iii) 前記ウイルス粒子を、細胞培養物から回収する ことを特徴とする、請求項２７に記載のウイルス粒子の製造法。 - 【請求項２９】 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の発現系、請求項２０〜２６のいずれか
一項に記載の組換えアデノウイルスベクター、または請求項２７に記載の感染性
ウイルス粒子を含んでなる、真核細胞。 - 【請求項３０】 請求項１〜１９のいずれか一項に記載の発現系、請求項２０〜２６のいずれか
一項に記載の組換えアデノウイルスベクター、請求項２７に記載の感染性ウイル
ス粒子、または請求項２９に記載の真核細胞と、薬学上の観点から許容可能な賦
形剤とを含んでなる、医薬組成物。 - 【請求項３１】 注射可能な形態である、請求項３０に記載の医薬組成物。
- 【請求項３２】 前記目的遺伝子を宿主細胞または生物に伝達し、発現させるための医薬生成物
の製造を目的とした、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の発現系、請求項２
０〜２６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスベクター、請求項２７に
記載の感染性ウイルス粒子、または請求項２９に記載の真核細胞の使用。 - 【請求項３３】 遺伝子療法による疾患治療を行うための医薬生成物の製造を目的とした、請求
項１〜１９のいずれか一項に記載の発現系、請求項２０〜２６のいずれか一項に
記載の組換えアデノウイルスベクター、請求項２７に記載の感染性ウイルス粒子
、または請求項２９に記載の真核細胞の使用。 - 【請求項３４】 ＬＢＤと、ステロイドレセプター由来のトランス活性化ドメインと、特にＧａ
ｌ４酵母タンパク質由来の異種ＤＮＡ結合ドメインとを含んでなる、転写アクチ
ベーター。
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