EP1108051A2 - Systeme d'expression inductible - Google Patents

Systeme d'expression inductible

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EP1108051A2
EP1108051A2 EP99940240A EP99940240A EP1108051A2 EP 1108051 A2 EP1108051 A2 EP 1108051A2 EP 99940240 A EP99940240 A EP 99940240A EP 99940240 A EP99940240 A EP 99940240A EP 1108051 A2 EP1108051 A2 EP 1108051A2
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
adenoviral vector
expression system
expression
transcriptional activator
receptor
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP99940240A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Majid Mehtali
Tania Sorg-Guss
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Transgene SA
Original Assignee
Transgene SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Transgene SA filed Critical Transgene SA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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    • C12N2830/15—Vector systems having a special element relevant for transcription chimeric enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to an inducible expression system using the nucleotide sequences coding for a transcriptional activator and a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of a promoter inducible in trans by said transcriptional activator in a form activated. It also relates to a recombinant adenoviral vector carrying a first expression cassette coding for said transcriptional activator and a second cassette carrying a gene of interest placed under the control of a promoter inducible in trans by said transcriptional activator.
  • the invention also relates to an infectious viral particle, a cell, a pharmaceutical composition comprising such a vector or expression system as well as their use for therapeutic or prophylactic purposes. The invention is of particular interest for gene therapy perspectives, especially in humans.
  • Gene therapy is defined as the transfer of genetic information into a host cell or organism.
  • the first protocol applied to humans was initiated in the United States in September 1990 on a genetically immunodeficient patient due to a mutation affecting the gene coding for Adenine Deaminase (AD A). It was a question of correcting or replacing the defective gene whose dysfunction is at the origin of a genetic disease by a functional gene.
  • AD A Adenine Deaminase
  • the relative success of this first experiment encouraged the development of this technology which has since been extended to the treatment of other diseases, both genetic and acquired (cancers, infectious diseases like AIDS ...) with the aim of delivering in situ therapeutic genes that improve pathology.
  • Most strategies use vectors to convey the therapeutic gene to its cell target. Many vectors, both viral and synthetic, have been developed in recent years and have been the subject of numerous publications accessible to those skilled in the art.
  • adenoviruses as gene therapy vectors has already been mentioned in numerous documents of the prior art. They infect many cell types, both dividing and quiescent, are non-integrative and not very pathogenic. In addition, they have a natural tropism for the respiratory tract. These particular properties make adenoviruses vectors of choice for many therapeutic and even vaccine applications. As an indication, their genome consists of a linear and double-stranded DNA molecule of around 36 kb which carries around thirty genes involved in the viral cycle. The early genes (E1 to E4; E for early in English) are distributed in 4 regions dispersed in the genome.
  • the E1, E2 and E4 regions are essential for viral replication while the E3 region involved in the modulation of the anti-adenovirus immune response in the host is not.
  • the late genes (L1 to L5; L for late meaning late in English) mainly code for structural proteins and partially cover the early transcription units. They are mostly transcribed from the major late promoter MLP (for Major Late Promoter in English).
  • the adenoviral genome carries at its ends regions acting in cis essential for packaging consisting of inverted terminal sequences (ITR) located at the 5 ′ and 3 ′ ends and of an packaging region which follows the ITR 5. '.
  • the adenoviral vectors currently used in gene therapy protocols lack most of the E1 region in order to avoid their dissemination in the environment and the host organism. Additional deletions in the E3 region allow increased cloning capabilities.
  • the genes of interest are introduced into viral DNA in place of either deleted region.
  • the potential immunogenicity of the viral proteins still expressed can, in certain particular applications, oppose the persistence of the transduced cells and the stable expression of the transgene.
  • These drawbacks have justified the construction of new generation vectors which conserve the cis regions (ITRs and packaging sequences) essential for packaging but include additional genetic modifications aimed at suppressing the expression in vivo of most viral genes (see for example international application WO94 / 28152).
  • a so-called minimal vector deficient for all of the adenoviral functions, represents an alternative of choice.
  • Tissue-specific expression can be mediated through tissue-specific promoters and enhancers or inducible expression systems responding to a specific cellular or temporal event.
  • inducible expression systems currently proposed rely on the use of promoters regulated by endogenous transcription factors activated by a particular inducing ligand (steroid hormones, interferon, heavy metals, etc.).
  • a first drawback is that these systems require the presence of endogenous activating factors within the target cell.
  • the basal expression level is often high due to “background noise” activation due to endogenous cellular substances, which can generate significant side effects.
  • the tetracycline resistance operon is coded by the Tn10 transposon (Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). Regulation is ensured by a short nucleotide sequence called "operator" (tet O) which constitutes a binding site for various regulators.
  • tet O a short nucleotide sequence
  • tet R the binding of the tetracycline repressor
  • tetracycline antibiotic considerably decreases the level of transcription.
  • tTA tetracycline trans-activator
  • the trans-activator is supplied in trans either by infection of an established line expressing tTA with an adenoviral vector containing a gene of interest placed under the control of tetO elements and of the CMV promoter, or by co- infection of the cells by two adenoviral vectors, one containing the cassette of interest and the other expressing tTA.
  • glucocorticoid receptors (GR) (Israel and Kaufinan, 1989, Nucleic Acids Res. 17, 4589-4604)
  • PR progesterone
  • ER estrogens
  • the steroid receptor In terms of trans-activation, the steroid receptor is in its inactive form complexed with various cellular factors including certain heat shock proteins (hsp for heat shock protein in English). The binding of an agonist ligand (steroid hormone) causes a change in the conformation of the receptor. This activation is accompanied by the dissociation of cellular factors, a nuclear translocation and increases the receptor's capacity to fix a short specific DNA sequence (target sequence), which allows interaction with the transcriptional machinery and the transcription induction. To fulfill their function, these receptors are generally organized into 3 functional domains, respectively a trans-activation domain allowing activation of transcription, a DNA binding domain (target sequence) and a ligand binding domain ( DLL).
  • DLL ligand binding domain
  • Modified receptors preferentially responding to non-natural synthetic ligands are also proposed in the literature.
  • Wang et al. (1994, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 8180-8184) constructed a chimera activatable by the molecule RU486 but not by endogenous progesterone, which results from the fusion of the ligand-binding domain of the truncated progesterone receptor ( ⁇ PR), the DNA binding domain of the yeast protein Gal4 and the trans-activation domain of the protein VP16.
  • ⁇ PR truncated progesterone receptor
  • the basal activity remains high and the chimeric protein can potentially interfere with cellular transcription factors.
  • ER and GR receptor variants modified in their ligand binding domains have also been described.
  • the ER T mutant obtained by substitution of glycine at position 521 of the ER receptor with an arginine is unable to fix endogenous estrogens, but can be activated by synthetic ligands such as Tamoxifen, to activate transcription regulated by the ERE target sequence (for estrogen responsive element).
  • An analogous variant has also been constructed for the GR receptor, modified at position 747 by substitution of isoleucine with a threonine (Roux et al., 1996, Molecular Endocrynology 10, 1214-1226).
  • This variant designated GR dex is unable to bind endogenous glucocorticoids, but can be activated by synthetic ligands such as Dexamethasone. Once activated, it recognizes the GRE target sequence (for glucocorticoid responsive element; Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237-2240) and stimulates the transcription of the promoter associated with it.
  • EcR steroid insect receptor responding to Pecdysone
  • the receptor is activated by ecdysone and forms a heterodimer with the Drosophila ultraspiracle protein (USP) which binds to a specific target sequence (EcRE for ecdysone responsive element) to activate transcription.
  • USP Drosophila ultraspiracle protein
  • EcRE ecdysone responsive element
  • the mutant can form, in the presence of ecdysone or its muristone analog A, a heterodimer with the protein USP or its human counterpart, the receptor for retinoic acid X ( RXR), and activate the transcription of genes placed under the control of a hybrid sequence (5xE / GRE) comprising the motifs responding to the EcR and GR receptors.
  • a hybrid sequence (5xE / GRE) comprising the motifs responding to the EcR and GR receptors.
  • Another inducible expression system described in the literature uses the immunophilins. Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) have developed a two-component system assembled in the presence of a ligand. More precisely, the first component is a fusion between the factor of transcription ZFHD1 (carrying a DNA binding domain) and the immunophilin FKBP12 and the second component is a fusion between the transactivation domain of the factor NFKB p65 and FRAP (FKBP12-rapamycin-associated protein).
  • the trans-activator is activated in the form of a heterodimer associating the two components and rapamycin linking the FKBP 12 and FRAP portions which can induce the expression of a transgene placed under the control of the target elements of ZFHD1.
  • AhR aryl hydrocarbon receptor
  • XRE for xenobiotic responsive elements
  • the binding of the heterodimer to the target elements of DNA called XRE induces the transcription of the gene sequences downstream.
  • the XRE sequence is present in the promoter region of many genes coding for enzymes involved in the metabolism of drugs, such as glutathione-S-transferase or cytochrome P4501 Al.
  • AhR and Arnt have a domain responsible for the recognition of the target sequence, heterodimerization and binding to the ligand.
  • the majority of trans-activation studies using the AhR / Arnt complex use the 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin ligand (TCDD)
  • the present invention provides an inducible expression system using an adenoviral vector comprising a gene of interest whose expression is regulated by a trans-activator activatable by the supply of exogenous pharmacological molecules.
  • This system is based more particularly on the use of a steroid receptor. Once activated, the receptor / ligand complex will bind to its target sequence and allow trans activation of expression of the therapeutic gene.
  • adenoviral vector containing, in replacement of the E1 region, an expression cassette for the GR mutant steroid receptor ex expressed constitutively by the early cytomegalovirus promoter (CMN) and, in replacement of the E3 region, a human factor IX (FIX) gene expression cassette placed downstream of the mouse mammary tumor virus (MMTN) promoter containing the GRE target sequence.
  • CPN early cytomegalovirus promoter
  • FIX human factor IX
  • the inducible FIX gene cassette is regulated by the ERE sequence associated with the minimal promoter of the TK (thymidine kinase) gene from HSN (herpes simplex virus).
  • the third system studied in the context of the present invention uses the modified NgEcR receptor and the human RXR receptor whose sequences have been introduced into the E1 region of an adenovirus.
  • the inducible cassette present in the E3 region places the AD ⁇ c of the FIX under the control of the 5xE / GRE hybrid elements.
  • the purpose of the present invention is to remedy the drawbacks of current gene therapy vectors, in particular by improving specificity (activation by non-toxic exogenous substances and not by endogenous cellular factors) and inducibility (basal activity in the absence minimal inducer and strong expression of the transgene in the activated state).
  • the object of the present invention can be applied to various gene therapy protocols requiring the expression of soluble molecules, such as antitumor molecules (antibodies, cytokines, chemokines) or in all cases where the expression of the therapeutic gene must be regulated according to the needs of the organism. It also allows the analysis of genes whose expression is cytotoxic or reduced at certain stages of development.
  • nucleotide sequences coding for a transcriptional activator of eukaryotic or viral origin and placed under the control of regulatory elements appropriate for their expression in a host cell or organism, and
  • a recombinant adenoviral vector comprising a gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated in trans by said transcriptional activator.
  • transcriptional activator defines a polypeptide or a set of polypeptides exerting a positive action on transcription, ie having the capacity to initiate or stimulate the transcription of any gene to from appropriate regulatory elements responding to said transcriptional activator.
  • the positive effect on transcription is preferably mediated directly by the binding of the activator to the regulatory elements but can be indirectly mediated by means of cellular factor (s).
  • a ligand-dependent transcriptional activator capable of binding a characteristic DNA sequence (target sequence) and of activating the promoter associated with it.
  • the transcriptional activator can be a single polypeptide in the form of a monomer or multimer (preferably dimer) or can also result from the association of a set of polypeptides forming a heteromer (preferably a set of two polypeptides forming a heterodimer).
  • the transcriptional activator in use in the present invention may be derived from any organism of eukaryotic or viral origin, in particular from a yeast, an insect, a vertebrate or a virus or may have an origin mixed, that is to say being made up of components of various origins.
  • a transcriptional activator suitable for implementing the present invention comprises at least 3 types of functional domains, respectively a trans-activation domain, a DNA binding domain (target sequence) and a ligand binding domain (DLL).
  • the order of the different fields is immaterial.
  • they can be distributed in the amino acid sequence continuously or discontinuously (possibly with an overlap of the residues involved in each function) and localized on one or more polypeptides forming said transcriptional activator.
  • it can include several areas of the same type.
  • An adequate example is the heterodimer developed by Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) activated by the binding of rapamycin to the FKBP12 and FRAP portions.
  • ligand binding domain refers to the portion of the transcriptional activator that interacts with an appropriate ligand-inducer.
  • the DLL-inducer interaction places the transcriptional activator in an activated state, a step necessary for transcriptional activation.
  • the DLL is preferably located at the C-terminal end of or of a polypeptide composing said transcriptional activator.
  • DNA binding domain refers to the portion of the transcriptional activator that interacts with the target DNA sequence present within the inducible promoter controlling the expression of the gene of interest and specific for the transcriptional activator chosen.
  • Said target sequence is generally placed upstream of a promoter region containing at least one TATA box and is composed of motifs recognized by the transcriptional activator. These patterns can form a particular structure (palindrome, repetitions in direction or reverse orientation ... etc).
  • the target sequences adapted to each transcriptional activator are described in the literature.
  • the GRE target sequence for glucocorticoid responsive element
  • a TGTTCT motif or its complement
  • GR ex a DNA binding domain derived from the GR receptor or from a analogous (GR ex ).
  • a preferred example is constituted by the sequence 5'GGTACANNNTGTTCT3 'where N represents any nucleotide
  • the ERE target sequence for estrogen responsive element
  • the ERE target sequence comprising a 5 ⁇ GGTCA3 'motif (or its complement) recognized by a DNA binding domain derived from the ER receptor or an analog (ER).
  • a preferred example is constituted by the sequence 5 ⁇ GGTCANNNTGACC3 'where N represents any nucleotide; - the target sequence UAS (for upstream activating sequence) of sequence 5 'CGGAGTACTGTCCTCCG3' (or its complement) recognized by a DNA binding domain derived from the Gai 4 receptor of yeast or an analog; the EcRE target sequence (for ecdysone responsive element) comprising a GACAAG motif (or its complement) recognized by a DNA binding domain derived from the EcR receptor or an analog.
  • a preferred example is constituted by the sequence 5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3 '; the 5xE / GRE sequence of sequence 5 'AGGTC AN AGAACA3' (or its complement) recognized by a hybrid DNA binding domain between EcR and GR or an analog, the target sequence 5 'TAATTANGGGNG3' where N represents a any nucleotide, recognized by the transcription factor ZFHD1 - the target sequence XRE (for xenobiotic responsive element) of sequence 5'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3 'recognized by a DNA binding domain derived from the AhR receptor or the like.
  • trans-activation domain refers to the portion of the transcriptional activator that interacts with cellular machinery to initiate or stimulate gene transcription dependent on the target sequence responding to said activator.
  • This domain can come from a conventional transcription factor (NFKB, SP-1 %) or from a ligand-dependent factor (steroid receptor, immunophilin, AhR ).
  • a domain comprising the 130 C-terminal amino acids of NP16 is particularly suitable.
  • trans-activation induced by the transcriptional activator in use in the context of the present invention can be verified simply by conventional techniques, for example by following the expression of a given gene placed under the control of the appropriate target sequence or the synthesis of its expression product (analysis according to Northern, Western, immunofluorescence, etc.) in the presence of the receptor activated by the inducer.
  • a detailed protocol is given in the examples below.
  • a difference of a factor of at least 2, advantageously of at least 5 and, preferably, of at least 10 reflects the capacity for trans-activation of the expression system according to the invention.
  • trans-activation domain is located in the N-terminal part between residues 272 and 400 (Jonat et al., 1990, Cell 62, 1189-1204), the DNA binding domain of 66 amino acids between residues 421 and 487 (Lucibello et al., 1990, EMBO J. 9, 2827-2834) and the hormone ligand binding domain of approximately 300 amino acids in the C-terminal part (Kerpolla et al., 1993, Mol Cell Biol. 13, 3782-3791).
  • the latter domain also includes the sequences responsible for the dimerization of GR, its nuclear localization and the interaction with hsp proteins. Trans-activation is mediated by the binding of a receptor dimer to the GRE target sequence.
  • the transcriptional activator included in the inducible expression system comprises all or part of a domain derived from a steroid hormone receptor chosen from the group consisting of estrogen (ER), glucocorticoid (GR), progesterone (PR), Vitamin D, ecdysone (EcR), mineralocorticoid, androgen, thyroid hormone, retinoic acid and retinoic acid X or an immunophilin or aryl receptor receptor hydrocarbon (AhR).
  • ER estrogen
  • GR glucocorticoid
  • PR progesterone
  • Vitamin D ecdysone
  • mineralocorticoid androgen
  • thyroid hormone retinoic acid and retinoic acid X
  • AhR immunophilin or aryl receptor receptor hydrocarbon
  • the modified functional domain has a sequence identity with its native equivalent of at least 70%, advantageously at least 80%, preferably at least 90% and, very preferably, at least 95%.
  • a receptor modified in its DLL so as to be activatable by an unnatural inducer.
  • Preferred examples are constituted by the mutants GR ex (I747T) and ER (G521R) already mentioned.
  • a chimeric transcriptional activator comprising various polypeptides or polypeptide fragments.
  • it results from the merger or association of functional areas of different origins.
  • a non-human receptor of viral or animal origin or lower eukaryote
  • an animal steroid receptor for example an animal steroid receptor, a yeast receptor (Gal4) ...
  • the only condition being to adapt the target sequence to the DNA binding domain selected.
  • Such an adaptation is within the reach of those skilled in the art.
  • the inducible promoter used will contain the UAS (Upstream Activating Sequences) elements responding to Gal4.
  • the trans-activation domain can come from any known transcriptional activation domain, in particular from protein 16 of the herpes simplex virus (VP16) or from p65 of factor NFKB and in particular, from its end C-terminal.
  • a transcriptional activator associating a DLL derived from a steroid receptor, a trans-activation domain derived from VP16 and a DNA binding domain from Gal4 or from a steroid receptor is suitable for the implementation of the present invention.
  • residues 1 to 74 of Gal4 will preferably be used.
  • other combinations are also possible.
  • a possible example consists of a hybrid DNA binding domain between the EcR and GR receptors, recognizing a hybrid target sequence comprising the motifs responding to ecdysone and to glucocorticoids.
  • a preferred transcriptional activator in the context of the present invention is chosen from:
  • a polypeptide designated GR ex comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from a glucocorticoid receptor, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of the isoleucine in position 747 with a threonine;
  • a polypeptide designated ER comprising a DNA binding domain, a trans-activation domain and a DLL derived from an estrogen receptor, said receptor being modified in its DLL, in particular by substitution of glycine in position 521 with an arginine;
  • a transcriptional activator comprising a first polypeptide comprising a DLL derived from the ecdysone receptor, a hybrid DNA binding domain derived from those of the EcR and GR receptors and a trans-activation domain derived from the viral protein VP 16 and a second polypeptide derived from the protein USP from Drosophila or from a homolog such as the human retinoic
  • a transcriptional activator comprising a first polypeptide comprising a DNA binding domain derived from the transcription factor ZFHD1 and a DLL derived from the immunophilin FKBP12 and a second polypeptide comprising a trans-activation domain derived from the factor NFKB p65 and a FRAP-derived DLL (FKBP12-rapamycin-associated protein); and
  • transcriptional activator comprising a first polypeptide derived from the AhR receptor and a second polypeptide derived from the Arnt protein.
  • the transcriptional activators (i) and (ii) are in the form of homodimers and (iii) (iv) and (v) are in the form of heterodimers associating the first and the second polypeptide and, optionally, the inducer .
  • the transcriptional activator is activated by binding to an unnatural inducer and is not or only slightly activated by a natural human compound.
  • unnatural inducer refers to a compound which is not found naturally in the human or animal organism for which therapy using the inducible expression system according to the invention is intended. It is preferably a synthetic inducer which is not found naturally in a human organism and whose structure is slightly different from that of a human compound (endogenous).
  • an unnatural inducer is capable of activating the transcriptional activator in use in the context of the present invention, in particular by binding to the DLL, in order to initiate or stimulate the transcription dependent on the target sequence responding to said activator.
  • the choice of an unnatural inductor adapted to the selected transcriptional activator is within the reach of those skilled in the art on the basis of the state of the art.
  • Activation of the transcriptional activator by the non-natural inducer can be done by a covalent or non-covalent interaction (electrostatic, hydrophobic, hydrogen bonding, etc.).
  • the inductor can be constituted by a single compound or by a set of molecules. It preferably belongs to the family of steroids, retinoids, fatty acids, vitamins, hormones, xenobiotics or antibiotics.
  • said unnatural inducer is a synthetic substance which can be administered orally.
  • it is chosen from the group consisting of dexamethasone, tamoxifen, muristerone A, ecdysone, rapamycin and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) or any analog of these compounds, preferably little or not toxic.
  • the sequences coding for the transcriptional activator included in the inducible expression system according to the invention are placed under the control of the appropriate regulatory elements allowing expression in a host cell or organism.
  • appropriate regulatory elements groups together all of the elements allowing the transcription of said sequences into RNA and the translation into protein.
  • the promoter is of particular importance. It can be isolated from any gene of eukaryotic, prokaryotic or even viral origin. Alternatively, it may be the natural promoter of the endogenous gene. Furthermore, it can be constitutive or regulable. In addition, it can be modified so as to improve the promoter activity, to suppress a region inhibiting transcription, to make a constitutive promoter regulable or vice versa, to introduce a restriction site.
  • PGK Phospho Glycerate Kinase
  • MT metalothioneine
  • Me Ivor et al. 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-8082
  • MLP late adenoviral
  • El A, E2A, E3 or E4 genes promoters governing the expression of late adenoviral genes.
  • its expression can be controlled by its specific target sequence (self-activation and / or activation by the endogenous wild-type receptor activated by the endogenous ligand).
  • ERE or GRE elements for the expression of a transcriptional activator comprising a DNA binding domain derived from ER or GR (ER T or GR dcx ).
  • a regulatable promoter chosen from those of the prior art.
  • the use of a promoter stimulating expression in a tumor or cancer cell may be advantageous.
  • the promoters of the MUC-1 genes overexpressed in breast and prostate cancers Chen et al., 1995, J. Clin. Invest.
  • CMV Cytomegalovirus
  • the appropriate regulatory elements may also include additional elements improving expression (intronic sequence, transcription terminator sequence, etc.) or even maintenance in a host cell. Such elements are known to those skilled in the art.
  • the transcriptional activator in use in the context of the present invention is composed of a set of polypeptides
  • these can be produced from polycistronic nucleotide sequences (placed under the control of a single promoter) implementing a site initiation of IRES-type translation to initiate the translation of the second cistron.
  • polycistronic nucleotide sequences placed under the control of a single promoter
  • a bidirectional promoter directing the expression of two genes placed on both sides.
  • the cassettes can be carried by the same expression vector or by different vectors.
  • sequences used in the context of the present invention can be obtained by conventional molecular biology techniques, for example by bank screening using specific probes, by expression bank immuno-screening, by PCR using primers adequate or by chemical synthesis.
  • the mutants can be generated from the native sequences by substitution, deletion and / or addition of one or more nucleotides by using the techniques of site-directed mutagenesis, PCR, digestion by restriction enzymes and ligation or by synthesis chemical. The functionality of the mutants and the constructs can be verified by the techniques of the art.
  • the second component of the inducible expression system is a recombinant adenoviral vector comprising at least one gene of interest placed under the control of an inducible promoter capable of being activated in trans by said transcriptional activator.
  • a deletion from the majority of the El region is preferred.
  • it extends from nt 454 to 3328 but can also include additional sequences in 5 ′ and 3 ′ provided that it does not interfere with the packaging function.
  • the pIX gene is not included in the E1 deletion.
  • it can be combined with other modification (s) affecting in particular the E2, E4 and / or L1-L5 regions, insofar as essential defective functions are complemented in trans by means of a complementation line and / or an auxiliary virus.
  • E1 and E4 use may be made of defective second generation vectors for the functions E1 and E4. or E1 and E2 (see for example international applications WO94 / 28152 and WO97 / 04119).
  • E1 and E2 see for example international applications WO94 / 28152 and WO97 / 04119.
  • the E4 region it can be deleted in whole or in part.
  • a partial deletion of the E4 region with the exception of the sequences coding for open reading frames (ORF) 3 and / or 6/7 is advantageous insofar as it does not require complementation of the E4 function (Ketner et al ., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048).
  • the recombinant adenoviral vector can also be devoid of all or part of the non-essential E3 region. According to this alternative, it may nevertheless be advantageous to keep the E3 sequences coding for the polypeptides allowing escape to the immune system of the host, in particular the glycoprotein gpl9k (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53- 71).
  • the origin of the adenoviral vector of the inducible expression system according to the invention can be varied both from the point of view of the species and of the serotype. It can be derived from the genome of a human or animal adenovirus (canine, avian, bovine, murine, sheep, pig, simian, etc.) or else from a hybrid comprising fragments of the adenoviral genome from at least two different origins. Mention may more particularly be made of the adenoviruses CAV-1 or CAV-2 of canine origin, DAN of avian origin or else Bad of type 3 of bovine origin (Zakharchuk et al., Arch.
  • an adenoviral vector of human origin preferably derived from a serotype C adenovirus, will be preferred, especially type 2 or 5.
  • the gene of interest in use in the present invention can come from a eukaryotic organism, from a prokaryote from a parasite or from a virus other than an adenovirus. It can be isolated by any conventional technique in the art, for example by cloning, PCR or chemical synthesis. It can be of genomic type (comprising all or part of all the introns), of complementary DNA type (cDNA, devoid of intron) or of mixed type (minigene). Furthermore, it can code for an antisense RNA and / or a messenger RNA (mRNA) which will then be translated into the polypeptide of interest, which may be (i) intracellular, (ii) incorporated into the membrane of the host cell or (iii) secreted.
  • mRNA messenger RNA
  • the gene of interest can code for an antisense RNA, a ribozyme, or even a polypeptide of interest.
  • chemokines and cytokines interferon ⁇ , ⁇ or ⁇ , interleukin (IL), in particular IL-2, IL-6, IL-10 or else IL-12, tumor necrotizing factor (TNF), colony stimulating factor (GM-CSF, C-CSF, M-CSF ...), MEP-l ⁇ , MLP-l ⁇ , RANTES, monocyte chemoattraction protein such as MCP-1 ”), cell receptors (especially recognized by the HTV virus), receptor ligands, coagulation factors (Factor VIII, Factor IX, thrombin, protein C), growth factors (FGF for Fibroblast Growth Factor, NEGF for Vascular Endothelial Growth Factor), enzymes (urease, renin, metalloproteinase, nitric oxide synthetase NOS, SOD, catalase, lecithin cholesterol acyl transferase LCAT
  • a functional copy of the defective gene will be used, for example a gene coding for factor NIII or IX in the context of hemophilia A or B, dystrophin (or minidystrophin) in in the context of Duchenne and Becker's myopathies, insulin in the context of diabetes, the CFTR protein (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) in the context of cystic fibrosis.
  • factor NIII or IX in the context of hemophilia A or B
  • dystrophin or minidystrophin
  • insulin in the context of diabetes
  • the CFTR protein Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator
  • TK-HSN-1 simplex virus l herpes 1
  • ricin thymidine kinase of
  • an immunoprotective polypeptide for example a CD4-immunoglobulin IgG hybrid; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670
  • an immunotoxin for example fusion of the antibody 2F5 or of the immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499
  • a trans-dominant variant for example fusion of the antibody 2F5 or of the immunoadhesin CD4-2F5 to angiogenin
  • One of the genes of interest can also be a selection gene making it possible to select or identify the transfected or transduced cells.
  • neo genes coding for neomycin phosphotransferase which confer resistance to the antibiotic G418, dhfr (Dihydrofolate Reductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transferase), pac (Puromycin Acetyl-Transferase) or gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transferase) ).
  • the selection genes are known to those skilled in the art.
  • the expression cassette for the gene of interest can, in addition, include additional elements improving its expression or its maintenance in the host cell (origins of replication, elements of integration into the cell genome, intronic sequences, sequences poly A transcription termination, tripartite leaders ). These elements are known to those skilled in the art.
  • the gene of interest can also comprise, upstream of the coding region, a sequence coding for a signal peptide allowing its secretion from the host cell.
  • the signal peptide can be that of the gene in question or heterologous (from any secreted or synthetic gene).
  • the gene of interest expression cassette can be inserted at any location in the adenoviral genome.
  • it is introduced to replace the E3 region.
  • the recombinant adenoviral vector comprises several genes of interest, these can be placed under the control of the same genetic elements (polycistronic cassette using an internal translation initiation site of the IRES type to reinitiate the translation of the second cistron) or independent elements.
  • they can be inserted into a same adenoviral region (for example in replacement of E3) or in different regions (for example in replacement of E3 and another deleted region).
  • an inducible promoter comprises at least one target sequence responding to the transcriptional activator used and operatively associated with a minimal promoter.
  • the target sequences have been defined previously and are described in the literature accessible to those skilled in the art (as a reminder, ERE, GRE, EcRE, UAS, 5xE / GRE, XRE ). It is indicated that one can use a homologous sequence modified with respect to the native sequence but exercising a similar or improved regulatory function.
  • One or more target sequences can be used, for example from 1 to 25, advantageously from 1 to 10 and, preferably, from 1 to 7, optionally placed in tandem and in any orientation relative to the TATA box. It (s) is (are) generally inserted (s) in the inducible promoter upstream of the minimal promoter, up to several hundred base pairs thereof.
  • An example of a promoter inducible by a transcriptional activator derived from GR is the LTR of the MMTV virus (mouse mammary tumor virus) which contains the GRE element and suitable promoter sequences.
  • a minimal promoter essentially comprises a TATA box and a functional transcription initiation site in a host cell or organism. These elements are classic in the field of the art concerned. Mention may more particularly be made of the minimal promoters of the TK, CMN and HSP genes (minimal promoter of the Drosophila heat shock protein gene devoid of Penhancer).
  • the inducible promoter in use in the context of this The invention may include additional elements which improve the level of transcription or limit it to certain specific tissues (of the enhancer type). These additional elements can alternatively be inserted into a non-coding gene region.
  • the nucleotide sequences coding for the transcriptional activator and their regulatory elements are carried by the recombinant adenoviral vector of the expression system according to the invention.
  • the expression cassettes of the gene of interest and of the transcriptional activator can be located in the same region of the adenoviral genome or in different places and in sense or antisense orientation relative to each other. The anti-sense orientation is preferred.
  • a preferred example is provided by an El " E3 " vector in which each of the cassettes is inserted in place of the deleted adenoviral sequences.
  • the nucleotide sequences are carried by an independent expression vector other than the recombinant adenoviral vector in use in the expression system according to the invention.
  • It can be a synthetic vector (cationic lipids, polymer liposomes, etc.), a plasmid or even a viral vector. It can optionally be combined with one or more substances improving the transfection efficiency and / or the stability of the vector. These substances are widely documented in the literature accessible to those skilled in the art (see for example Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc.
  • lipids may be polymers, in particular cationic lipids, liposomes, nuclear proteins or even neutral lipids. These substances can be used alone or in combination.
  • a possible combination is a recombinant plasmid vector associated with cationic lipids (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc.) and neutral lipids (DOPE).
  • plasmids which can be used in the context of the present invention are vast. They may be cloning and / or expression vectors. In general, they are known to humans and many of them are commercially available, but it is also possible to construct or modify them by genetic manipulation techniques. Mention may be made, as examples, of the plasmids derived from pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagene), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) or also p Poly (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201).
  • a plasmid used in the context of the present invention contains an origin of replication ensuring the initiation of replication in a producer cell and / or a host cell (for example, the ColEl origin will be retained for a plasmid intended to be produced in E. coli and the oriP / EBNAl system if it is desired to be self-replicating in a mammalian host cell, Lupton and Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542; Yates and al., Nature 313, 812-815). It can also comprise a selection gene making it possible to select or identify the transfected cells (complementation of an auxotrophy mutation, gene coding for resistance to an antibiotic, etc.).
  • cer sequence which promotes the monomeric maintenance of a plasmid (Summers and Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, sequences of integration into the cell genome).
  • a viral vector it is possible to envisage a vector derived from an adenovirus, a retrovirus, a virus associated with the adenovirus (AAN), a virus of the herpes, an alphavirus, a parvovirus, a poxvirus (fowlpox, canaripox, vaccinia virus, in particular of the MVA (Modified Virus Ankara) or Copenhagen strain, etc.) or a foamyvirus.
  • AAN a virus associated with the adenovirus
  • AAN virus associated with the adenovirus
  • a virus of the herpes an alphavirus
  • a parvovirus a poxvirus
  • poxvirus canaripox
  • vaccinia virus in particular of the MVA (Modified Virus Ankara) or Copenhagen strain, etc
  • Retroviruses have the property of infecting and integrating mainly in dividing cells and in this respect are particularly suitable for cancer application.
  • a retroviral vector suitable for implementing the present invention comprises the LTR terminal sequences, a region packaging and the nucleotide sequences coding for the transcriptional activator whose expression is controlled by the retroviral promoter (in the 5 ′ LTR) or by an internal promoter as mentioned above. It can be derived from a retrovirus of any origin (murine, primate, feline, human, etc.) and in particular from MoMuLV (Moloney murine leukemia virus), MNS (Murine sarcoma virus) or Friend murine retrovirus (Fb29).
  • MoMuLV Moloney murine leukemia virus
  • MNS Murine sarcoma virus
  • Fb29 Friend murine retrovirus
  • the retroviral vector according to the invention may include modifications in particular at the level of the LTRs (replacement of the promoter region by a eukaryotic promoter) or of the packaging region (replacement by a heterologous packaging region, for example of the VL30 type). (see French applications 94 08300 and 97 05203).
  • An adenoviral vector is particularly suitable for the expression of the transcriptional activator envisaged in the context of the present invention.
  • a defective vector having one of the above characteristics will be used.
  • the recombinant (carrying the inducible expression cassette for the gene of interest) and independent (carrying the expression cassette of the transcriptional activator) adenoviral vectors are preferably both deficient for the E1 function by deletion of any or part of the El region or non-functional mutation. If necessary, one or the other or both can be further deficient for at least one of the functions E2, E4, L1, L2, L3, L4 and / or L5. Similarly, a deletion of all or part of the E3 region can be envisaged for one or both of the vectors.
  • the viral vectors (recombinant adenoviral vector and, where appropriate, said independent viral vector) forming part of the expression system according to the invention can be in the form of DNA vector or of infectious viral particle.
  • the present invention also relates to a recombinant adenoviral vector comprising
  • nucleotide sequences coding for a transcriptional activator placed under the control of regulatory elements appropriate for their expression in a host cell or organism
  • the recombinant adenoviral vector according to the invention can code for a transcriptional activator having the characteristics defined above which, in the form activated by an inducer as described above, has the capacity to initiate or activate the transcription of a gene controlled by an inducible promoter comprising a target sequence specific for said transcriptional activator as described above.
  • the recombinant adenoviral vector according to the invention can code for a prokaryotic transcriptional activator and, in particular, a polypeptide comprising a DLL and a DNA binding domain derived from a repressor of the tetracycline operon (tetR) and any transcription activation domain.
  • tetR tetracycline operon
  • an unnatural inducer activating tTA will be used, such as doxycycline, tetracycline or an agonist analog.
  • the characteristics of the inducible expression cassette for the gene of interest are the same as above, apart from the presence of one or more target sequence (s) responding to the prokaryotic transcriptional activator.
  • the target sequence consists of the tetracycline operator (tetO).
  • tet O - minimum promoter is particularly preferred, giving rise to a promoter whose base level of transcription is naturally very weak but can be activated by the tTA inducer and repressible by tetracycline.
  • the present invention also relates to an infectious viral particle comprising a recombinant adenoviral vector according to the invention.
  • adenoviral vectors The techniques for preparing adenoviral vectors are widely documented in the literature.
  • the genome is reconstituted by homologous recombination in line 293 (see in particular Graham and Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gene Transfer and Expression Protocols; Ed EJ Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) or in Escherichia coli (Charrier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810; WO96 / 17070). It is then necessary to propagate the vector in order to constitute a stock of viral particles containing it. Complementation lines are used for this purpose, providing in viral expression products for which the vector is defective.
  • viruses deleted from E1 can be propagated in line 293, established from human embryonic kidney cells (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72).
  • second generation vectors it is possible to have recourse to lines complementing two essential viral functions, such as those described by Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak and Graham (1995, Human Gene Therapy 6, 1575-1586), Wang et al. (1995 Gene Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033) and in international applications WO94 / 28152 and WO97 / 04119.
  • helper virus an additional viral element, designated "helper virus” to at least partially complement the defective functions of a recombinant adenoviral vector.
  • helper viruses of the prior art consist of an adenoviral genome, possibly deleted from an essential region for which the recombinant vector does not require complementation.
  • the invention also relates to a process for preparing a viral particle, according to which:
  • a recombinant adenoviral vector according to the invention is introduced into a complementation cell capable of complementing said vector in trans, so as to obtain a transfected complementation cell,
  • the viral particle can be recovered from the culture supernatant but also from the cells.
  • One of the commonly used methods is to lyse the cells by consecutive freeze / thaw cycles to collect the virions in the lysis supernatant. These can be amplified and purified according to the techniques of the art (chromatographic process, ultracentrifugation in particular through a gradient of cesium chloride ).
  • the present invention also relates to a eukaryotic cell comprising an inducible expression system, a recombinant adenoviral vector according to the invention or infected with a viral particle according to the invention.
  • a eukaryotic cell comprising an inducible expression system, a recombinant adenoviral vector according to the invention or infected with a viral particle according to the invention.
  • a cell is constituted by any cell transfectable by a vector or infectable by a viral particle, as defined above.
  • a mammalian and in particular human cell is particularly suitable.
  • It may be a primary or tumor cell of any origin, in particular hematopoietic (totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage ...), muscle (satellite cell, myocyte, myoblast, smooth muscle ..) .), cardiac, pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • hematopoietic totipotent stem cell, leukocyte, lymphocyte, monocyte or macrophage
  • muscle satellite cell, myocyte, myoblast, smooth muscle ..) .
  • cardiac pulmonary, tracheal, hepatic, epithelial or fibroblast.
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition, an inducible expression system, an adenoviral vector. recombinant, a viral particle or a host cell according to the invention in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • a composition according to the invention is more particularly intended for the preventive or curative treatment of diseases by gene therapy (including immunotherapy) and is more particularly intended for proliferative diseases (cancers, tumors, dysplasias, etc.), infectious diseases and especially viral (induced by hepatitis B or C viruses, HIV, herpes, retroviruses, etc.), genetic diseases (cystic fibrosis, myopathies, hemophilia, diabetes, etc.) and cardiovascular diseases (restenosis, ischemia, dislipidemia ).
  • a composition according to the invention can be manufactured in a conventional manner for administration by the local, parenteral or digestive route. In particular, a therapeutically effective amount of the therapeutic or prophylactic agent is combined with a pharmaceutically acceptable carrier.
  • routes of administration Mention may be made, for example, of the intragastric, subcutaneous, intracardiac, intramuscular, intravenous, intraarterial, intraperitoneal, intratumoral, intranasal, intrapulmonary or intratracheal route.
  • administration by aerosol or instillation is advantageous.
  • the administration can take place in single dose or repeated one or more times after a certain interval of interval.
  • the route of administration and the appropriate doses of virus vary depending on various parameters, for example, the individual, the pathology, the gene of interest to be transferred, the route of administration.
  • preparations based on viral particles can be formulated in doses of between 10 4 and 10 14 pfu (units forming plaques), advantageously 10 5 and 10 pfu and, preferably, 10 and 10 pfu.
  • doses comprising from 0.01 to 100 mg of DNA, preferably 0.05 to 10 mg and, most preferably, 0.5 to 5 mg can be considered.
  • the formulation may also include a pharmaceutically acceptable diluent, adjuvant or excipient, as well as solubilizers, stabilizers, preservatives.
  • a preferred composition is in injectable form.
  • saline phosphate, monosodium, disodium, magnesium, potassium .
  • isotonic solution It can be presented as a single dose or in multidose in liquid or dry form (powder, lyophilisate, etc.) capable of being reconstituted extamporanally with an appropriate diluent.
  • the present invention also relates to the therapeutic or prophylactic use of an inducible expression system, a recombinant adenoviral vector, a viral particle or a host cell according to the invention for the preparation of a medicament intended for the transfer and expression of said gene of interest in a cell or a host organism and, in particular, for the treatment of the human or animal body by gene therapy.
  • the medicament can be administered directly in vivo (for example by intravenous injection, in an accessible tumor, in the lungs by aerosol, in the vascular system by means of an appropriate probe ).
  • the prevention and treatment of many pathologies can be considered.
  • a preferred use is to treat or prevent cancers, tumors and diseases resulting from unwanted cell proliferation.
  • cancers of the breast, of the uterus in particular those induced by papillomas virus
  • the prostate in particular those induced by papillomas virus
  • the lung of the bladder
  • the liver in particular those induced by papillomas virus
  • the pancreas of the stomach
  • cardiovascular diseases for example to inhibit or delay the proliferation of smooth muscle cells in the vascular wall (restenosis).
  • restenosis smooth muscle cells in the vascular wall
  • the invention also extends to a method for the treatment of diseases by gene therapy, characterized in that an organism or a host cell in need of such treatment is administered an inducible expression system, a recombinant adenoviral vector, a viral particle or a host cell according to the invention.
  • the invention also relates to a transcriptional activator comprising a DLL and a trans-activation domain derived from a steroid receptor and a heterologous DNA binding domain, in particular derived from the yeast protein Gal4.
  • a transcriptional activator is obtained by exchanging by molecular biology techniques the domain of binding to the DNA of the steroid receptor by that of Gal4 (in particular carried by residues 1 to 74).
  • An ER T or GR dex and Gal4 hybrid is most preferred.
  • Figure 1 is a schematic representation of the amount of FIX produced 144 h after transient transfection of 293 cells with the plasmids pTG13064 (CMV-GR dex ), pTG6242 (LTR MMTV-FIX, sense) and pTG13063 (LTR MMTV-FIX, anti -meaning).
  • Figure 2 Evaluation of the Dexamethasone Dose / Response effect in A549 cells.
  • Dexamethasone induction is performed in varying the concentration from 10 "9 to 10 " 7 M.
  • FIG. 3 Schematic representation of the constructions AdTG13075, AdTG13088, AdTG13092 and AdTG13245.
  • Figure 4 (a, b, c and d): In vivo evaluation of the Grdex / Dexamethasone inducible system with the different constructs tested in C57B1 / 6 mice. The values presented are the means of the values measured in each of the treated mice.
  • Figure 5 (a, b, c and d): In vivo evaluation of the Grdex / Dexamethasone inducible system with the different constructs tested in SCID mice. The values presented are the means of the values measured in each of the treated mice.
  • Figure 6 Evaluation of a Dexamethasone Dose / Response effect in vivo in SCID mice.
  • Figure 7 Schematic representation of adenoviral vectors derived from the first and second generation plasmid pTg6401.
  • coli 5K (hsdR, mer A), DH5 ⁇ [(recAl, endAl, hodR17 (rm-), supE44 thi-1, gyrA (nalr)] or NM522 strains (supE, thi, ⁇ (lac-proAB), ⁇ hsd5, (rm-), (F 'proAB, lacl q , Z ⁇ M15) and those of homologous recombination in the strain E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). restriction site repair, the technique used consists of filling the protruding 5 'ends with the large fragment of DNA polymerase I of E.
  • adenoviral genome fragments used in the various constructions described below are indicated precisely according to their position in the nucleotide sequence of the Ad5 genome as disclosed in the Genebank database under the reference M73260.
  • cell lines 293 (Graham et al, 1977, supra; available from ATCC under reference CRL1573), A549 E1 + (WO94 / 28152), A549 (ATCC CCL-185) and Vero (ATCC CCL-81). It is understood that other cell lines can be used.
  • the cells are maintained in culture at 37 ° C. in a humid atmosphere enriched with 5% CO 2 in DMEM medium (Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL) supplemented with 1 mM glutamine, 1% amino acids (Gibco BRL) , 40 ⁇ g / l gentamycin and 10% fetal calf serum (SVF, Gibco BRL).
  • DMEM medium Dulbecco's Modified Eagle Medium, Gibco BRL
  • 1 mM glutamine 1 mM glutamine
  • 1% amino acids Gibco BRL
  • 40 ⁇ g / l gentamycin 40 ⁇ g / l gentamycin
  • EXAMPLE 1 Construction of an adenoviral vector coexpressing the t'raacctivivatateuurr ttrraannscriptionnel ER T and the FIX gene regulated by the ERE sequences.
  • the cDNA of the wild-type ER gene is contained in the plasmid pSG1-HEO (Tora et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989).
  • the estrogen binding domain is contained in the plasmid pSG1-HEO (Tora et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989).
  • ER sequences are inserted in the EcoKI site of the transfer vector pTG6600.
  • pTG6600 is a polyll p vector (Lathe et al., 1987, Gene 57, 193-201) into which are inserted the Ad5 sequences 1 to 458, the CMN early promoter, the hybrid splicing sequences found in the plasmid pCI (Promega Corp, comprising the splice donor site of the intron 1 of the human ⁇ -globin gene and the splice acceptor site of the mouse immunoglobulin gene), the polyadenylation sequences of the SN40 virus and the sequences Ad5 3328-5788.
  • the vector thus obtained pTG6237 contains the CMN-ER expression cassette present in the E1 region.
  • pTG6246 The final construction designated pTG6246 is reconstituted by homologous recombination (Charrier et al., 1996, J. Nirol. 70, 4805-4810) between the Pacl-Bst EU fragment isolated from the preceding vector and pTG4656 linearized by ClaI.
  • the latter is an adenoviral plasmid El " E3 " containing in El the LacZ gene under the control of the MLP promoter (described in application FR97 06757).
  • the adenoviral genome carried by pTG6246 comprises the CMN-ER cassette in the E 1 region and is deleted from the E3 region.
  • the AD ⁇ c of human FIX (Anson et al, 1984, EMBO J. 3, 1053-1060) is cloned in the form of a Bam ⁇ l fragment isolated from a plasmid of the anterior part (for example described in patent 88 14635) and inserted downstream of the minimal promoter TK-HSN preceded by the ERE sequence (Klein-Hitpass et al, 1986, Cell 46, 1053-1061).
  • the cassette is introduced into the BglI site of pTG4664 in sense and antisense orientation (giving pTG13227 and pTG13228 respectively).
  • Plasmid pTG4664 comprises nucleotides 25838 to 320004 of PAd5 deleted from nucleotides 27871 to 30748 of the E3 region. Homologous recombination with the plasmid pTG6401 digested by Sfr1 (comprising the genome Ad5 deleted from the regions El and E3) makes it possible to generate the adenoviral vectors El " E3 " carrying the inducible cassette ERE / TKp-FIX in sense and antisense orientation in the region E3 .
  • the construction sense (corresponding to the sense of transcription of E3) is called pTG13235 and the anti-sense construction pTG13236.
  • CMN-ER and ERE / TKp-FIX in place of the regions El and E3 respectively are generated by homologous recombination between the fragments carrying the inducible FIX cassette isolated from the vectors pTGl 3227 and pTGl 3228 and the vector pTG6246.
  • PTG13233 and pTG13234 are obtained according to the orientation of the inducible cassette.
  • EXAMPLE 2 Construction of an adenoviral vector co-expressing the t'raaccttiivvaatteeuurr ttrraannsscc ⁇ riptionnel GR ex and the FIX gene regulated by the GRE sequences.
  • the AD ⁇ c of the GR receptor ex carried by the EcoRI fragment (2.7Kb) of the plasmid pHGl (Kumar et al, 1987, Cell 51, 941-951) is cloned in the Ec ⁇ KL site of the vector pTG6600, to give pTG13064.
  • the adenoviral vector pTG13075 containing the expression cassette CMNp-GR ex in replacement of the El region and deleted from the majority of the E3 region is obtained by homologous recombination between the Pacl-Bst EU fragment isolated from the preceding vector and pTG4656 linearized by CM .
  • the BamHI fragment containing P AD ⁇ c of human FIX is inserted downstream of the LTR of MMTV containing the sequence GRE (Cato et al, 1986, EMBO J. 5, 2237-2240).
  • the cassette is then introduced in sense and antisense orientation into the BgH1 site of pTG4664 bordering on the deleted E3 sequences.
  • the transfer vectors are designated pTG6242 (sense) and pTG13063 (antisense).
  • Homologous recombination with the plasmid pTG13075 makes it possible to generate the adenoviral vectors El " E3 " carrying the inducible LTR cassette MMTV-FIX in sense and antisense orientation in the E3 region and the CMV-GR ex cassette in the El region.
  • the sense construction (identical to the transcription direction of E3) is called pTG13083 and the antisense construction pTG13092 (reverse transcription direction for FIX and GR ex cassettes).
  • EXAMPLE 3 Construction of an adenoviral vector co-expressing the transcriptional activator VgEcR and the FTX gene regulated by the 5xE / GRE sequences.
  • the plasmid pNgRXR (In Nitrogen) comprises the two subunits composing the transcriptional activator activatable by ecdysone or its analog muristerone A.
  • the first is composed of the receptor of ecdysone (VgEcR) modified at the level of three amino acids P DNA binding domain so as to obtain a sequence analogous to that of the GR receptor and fused in phase to the trans-activation domain of VP16 and the second of the human retinoic acid receptor RXR (No et al, 1996, Proc Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351).
  • the two cDNAs coding for VgEcR and RXR directed by the promoters CMV and RSV respectively are modified by the introduction of an intron at 5 ′ of the coding sequences (pCI intron for CMVp-VgEcR and rabbit ⁇ -globin intron for RSVp-RXR) and are introduced into the El region of an adenoviral vector according to the preceding technique.
  • the sequences coding for human FIX are introduced downstream of an inducible promoter comprising the target sequence 5xE / GRE coupled to the minimal promoter ⁇ hsp (pIND; In Vitogen).
  • the cassette is introduced in the two orientations into the BgU1 site of pTG4664.
  • the homologous recombination with pTG6401 digested with Sfr1 makes it possible to generate the plasmids carrying the inducible cassette in the E3 region in sense or antisense orientation.
  • the doubly recombinant adenoviral vector is obtained by homologous recombination with the transfer vector containing the sequences VgEcR and RXR.
  • the recombinant adenoviral vectors containing the activator and / or FIX expression cassettes are released from the corresponding plasmids (pTG13083, pTG13092, pTG13233, pTG13234 ...) by Pacl digestion before being transfected into the complementation line 293.
  • Le cell lysate is harvested, subjected to three successive stages of freezing / thawing in order to release the viral particles then clarified by centrifugation at 3500 rpm for 5 min.
  • the virions present in the supernatant can optionally be amplified by passage over a permissive line (293 or A 549-E 1+) and purified on a cesium chloride gradient according to Part techniques.
  • the adenoviral stock is dialyzed in an appropriate formulation buffer as described in WO98 / 02522 (for example IM sucrose, 150 mM NaCl, MgCl 2 ImM, 10 mM Tris-HCl and 0.1% Tween 80).
  • the viral titer is determined in infectious units by assaying the DBP protein by immunofluorescence (Lusky et al, 1998, J. Virol. 72, 2022-2032) or in number of viral particles by spectrophotometric measurement at 260 nm.
  • a control vector is constructed by inserting P cDNA of human TX factor under the control of the CMV promoter isolated from the plasmid pCI (Proméga).
  • the constitutive expression cassette is introduced into the E3 region, giving pTG13231 (sense orientation) and pTG13232 (antisense orientation). Virions are produced according to the same methodology as above.
  • EXAMPLE 5 In vitro evaluation of the system inducible by GR dex .
  • the transfer vectors pTG13064, pTG6242 and pTG13063 carrying respectively the CMN-GR dex , LTR MMTV-FIX (sense) and LTR MMTV-FLX (antisense) cassettes are transiently transfected in 293 cells (5 ⁇ g of DNA for 10 6 cells).
  • the plasmid pTG13064 is cotransfected with either pTG6242 or pTG13063.
  • Cultures are continued in the presence of dexamethasone (10 M) or in its absence. Cell supernatants are removed 48, 96, 120 and 144 hours after transfection and the quantity of FIX produced is determined by ELISA (Asserachrom kit; Diagnostica Stago). The results presented in FIG.
  • the receptor expressed by pTG13064 is therefore functional insofar as in the activated state (in the presence of dexamethasone), it can bind to the GRE motifs of MMTV and induce the transcription of the FIX gene.
  • the basal activity of the system is very low. In fact, the quantity of FLX produced in the absence of dexamethasone or pTG13064 is low, even negligible.
  • the kinetics of expression of the FIX as a function of time show that the maximum production level is reached 120 h after the transfection.
  • the non-permissive Vero or A549 host cells are infected with the AdTG13083 or AdTG13092 virions carrying the CMV-GR ex and MMTN-FIX cassettes (sense for the first virus and antisense for the second) or co-infected with the adenovirus AdTG13075 ( CMV-GR dex) and AdTG13082 (MMTV-FIX sense) or AdTG13088 (MMTV-FIX anti-sense).
  • MOI multipleplicity of infection
  • 100 is used for the infection experiments and 50 for each of the viruses in the case of co-infection.
  • the quantity of FLX produced in the culture supernatants is assayed by ELISA.
  • Vero cells the expression of FIX can only be quantified after infection with the AdTG13092 virions carrying the two cassettes and in the presence of the inducer. No induction takes place in the absence of dexamethasone or the GR dex receptor. It should be noted that these cells do not express wild GR.
  • FIX is produced in the presence of dexamethasone in cells infected with AdTG13088 or AdTG13092. It should be noted that these cells express wild GR. However, the level of FIX is delayed over time in the absence of GR dex (virion AdTG13088).
  • the inducible system using the GR dex receptor and dexamethasone is functional in constructions in which the inducible MMTV-FIX cassette is in antisense orientation (AdTG13088 and AdTG13092).
  • the cis induction system (cassettes carried by a single virus) is significantly more productive than a trans system using two viruses, in particular in Vero cells.
  • Vero cells are infected with the AdTG13092 virus at an MOI of 10, 50 or 100.
  • PAdTG13075 is used as a control.
  • the FIX assay is performed 48 and 72 hours after infection. A production of FIX is observed whatever the MOI used, but the optimal level of expression is obtained for an MOI of 50.
  • the inducer concentration was also varied from 10 "9 to 10 " 5 M. At high concentration, dexamethasone proves to be cytotoxic, resulting in a lesser expression of the FIX. At low concentration (10 " M and above), the induction ⁇ is not effective. The optimum is located at 10 M.
  • induction of the reporter gene can be carried out in a controlled and selective manner, including in the presence of the wild-type GR receptor, using lower doses of ligand. This aspect is important for in vivo applications, natural conditions for which the wild-type GR receptor is expressed.
  • EXAMPLE 6 In vivo evaluation of the system inducible by GR eg .
  • the AdTG13092 virus is injected intravenously into immunocompetent C57B1 / 6 mice at the rate of 4x10 8 or 8x108 iu.
  • Dexamethasone is administered to animals intraperitoneally at a concentration of 100 ⁇ g for 3 consecutive days (D0, D1 and D2).
  • the serums are collected regularly from the 3rd day following infection and the quantity of FIX produced is evaluated by ELISA. Under these conditions, a significant production of FIX is observed.
  • EXAMPLE 7 In vivo evaluation of the inducible GR dex system in immunocompetent mice.
  • the AdTG13092, AdTG13088 and AdTG13245 viruses are injected intravenously into immunocompetent C57BI / 6 mice at the rate of 5 ⁇ 10 8 iu.
  • the viruses AdTG13088 and AdTG13075 ( Figure 3) are also co-injected at the rate of 5 ⁇ 10 8 iu each.
  • the induction phase is carried out by intraperitoneally injecting 100 ⁇ g of Dexamethasone for 3 consecutive days (D0-D1-D2, D21-D22-D23 and D42-D43-D44).
  • This induction is carried out through the wild-type GR receptor, expressed by murine cells and activatable by Dexamethasone.
  • the level of expression of the FIX is 10 times lower than that obtained in the case of mice expressing the modified GR ex receptor;
  • the viruses AdTG13092, AdTG13088 and AdTG13245 are injected intravenously into immunodeficient scid / scid mice at the rate of 5 ⁇ 10 8 iu.
  • the AdTG13088 and AdTG13075 viruses are also co-injected at the rate of 5 ⁇ 10 8 iu each.
  • Induction is carried out by injecting 100 ⁇ g of Dexamethasone intraperitoneally for 3 consecutive days (D0-D1-D2, D21-D22-D23 and D42-I43-D44).
  • mice sera are taken at different times in order to evaluate the production of FIX by the ELISA technique.
  • - FIX expression is induced by Dexamethasone after injection of the vector AdTG13088, through the wild-type GR receptor.
  • the induction level is stable over time;
  • the level of induction in the presence of GR dex is comparable to the expression of the gene linked to the constitutive promoter CMN (at least during the first induction);
  • the vectors AdTG13092 and AdTG13088 are injected intravenously into immunodeficient sciaVscid mice at the rate of 5 ⁇ 10 8 iu.
  • the induction is carried out by injecting 50 or 5 ⁇ g of Dexamethasone intraperitoneally for 3 consecutive days (D0-D1-D2 and D21-D22-D23). The sera are taken at different times in order to evaluate the production of FIX by ELISA.
  • EXAMPLE 10 Development of an inducible expression system capable of preventing the development of an immune response after in vivo administration of adenoviral vector.
  • Adenoviral vectors represent a system of choice for transferring a therapeutic gene to a patient.
  • expression of the transgene is generally transient. For this reason, it is necessary to repeat the administrations of the adenoviral vector in order to ensure prolonged expression of the therapeutic gene.
  • a first injection of adenovirus frequently leads to the development of an immune response which prevents any further administration.
  • the inventors have developed a new approach based on the expression of an immunosuppressive molecule capable of preventing the establishment of this anti-adeno virus immune response. For this, the inventors have inserted the gene coding for interleukin-10 (DL-10) in an inducible expression system carried by an adenoviral vector.
  • DL-10 interleukin-10
  • the deletions of the E4 or E2a regions make any residual expression of viral protein disappear. However, the toxicity is not reduced by eliminating the E2a region. On the other hand, the deletion of the E4 region leads to a significant reduction in hepatic toxicity after intravenous injection. Despite DNA persistence, however, expression of the transgene is often significantly reduced.
  • Interleukin-10 is known to have immunosuppressive properties and has shown promising results in transplant rejection and in anti-inflammatory treatments.
  • IL-10 is secreted by many cells (monocytes / macrophages, T cells, B cells after activation by an antigen) and has many target cells (including monocytes
  • Human and rat interleukins-10 are very homologous, 84% homology at the nucleotide level and 73% at the protein level.
  • IL-10 has an immunosuppressive effect on monocytes / macrophages.
  • EL-10 stimulates the viability, the secretion of antibodies and the expression of MHC class II of B lymphocytes. It also has a stimulating role on mast cells and on CD8 + T cells. Overall, PE - 10 however has a very strong immunosuppressive effect.
  • the anti-inflammatory and immunosuppressive properties of PIL-10 could be involved in suppressing the production of neutralizing antibodies against recombinant adenovirus. Indeed, the co-injection of adenovirus coding for IL-10 and for ⁇ -galactosidase prevents the induction of the immune response against the virus and the production of CTL, thus allowing prolonged expression of the reporter gene.
  • the system we have developed is based on induction by hormones. Indeed, these will bind to their nuclear receptor, consisting of a hormone binding domain, a DNA binding domain and a transactivation domain. After conformational change and fixation on the target elements located at the DNA level, the transcription of the gene located downstream of the regulatable promoter will thus be activated.
  • the inventors have chosen to use modified receptors at the level of the hormone binding domain. These mutated receptors such as estrogen or progesterone receptors are able to respond to synthetic exogenous ligands, but not to endogenous hormones.
  • the inventors have developed a system based on the modified glucocorticoid receptor, GR dex , capable of inducing the expression of the transgene located downstream of the GRE elements (Glucocortico ⁇ d Responsive Element) after activation by dexamethasone, but not by endogenous glucocorticoids.
  • GRE elements Glucocortico ⁇ d Responsive Element
  • dexamethasone Glucocortico ⁇ d Responsive Element
  • adenoviral vectors derive from the plasmid pTg6401 comprising the genome of the human adenovirus type 5 deleted from nucleotides 459 to 3327 (region) E1) and from nucleotides 28 592 to 30 470 (region) E3).
  • the modified GR dex gene is introduced into the El region of the genome of the adenovirus type 5 by homologous recombination between the plasmid pTg6401 and the transfer plasmid containing the GR d6X cDNA under the control of CMN promoter (Cytomegalovirus), a chimeric intron (pCI, Promega) and a polyadenylation signal of SN40.
  • CMN promoter Cytomegalovirus
  • pCI chimeric intron
  • Promega polyadenylation signal of SN40.
  • the cDNA is placed downstream of 4 elements of response to glucocorticoids GRE (Glucocortico ⁇ d Responsive Element) contained in the LTR promoter of MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus).
  • GRE Glucocortico ⁇ d Responsive Element
  • MMTV Mouse Mammary Tumor Virus
  • Ad-GR dex or ⁇ Tg6401 Homologous recombination of this transfer vector with the adenoviral vectors Ad-GR dex or ⁇ Tg6401 makes it possible to generate either a vector carrying the expression cassette of the activator in El and the inducible cassette in E3 in antisense orientation (Ad-GR dex -MMTV / TL-10-E4 wild) or a vector containing only the E3 induction cassette (Ad- ⁇ El-MMTV / TL10-E4 wild).
  • the rat EL-10 cDNA was also placed under the control of the CMV promoter.
  • This constitutive expression cassette was inserted into the E3 region of pTg6401 in antisense orientation (Ad- ⁇ EI-CMV / TLIO). All the second generation constructs are obtained by homologous recombination between the transfer plasmid containing the reading frames 3 and 4 (ORF3.4) of the E4 region and the preceding first generation vectors.
  • the 293 cells are transfected with the transfer plasmids containing the expression cassettes of rat interleukin-10 in the presence or not of the expression cassette of the GR dex activator. They are cultured in the presence or absence of dexamethasone (10 "7 M) in DMEM 10% FCS. The supernatants are removed at different times in order to analyze the expression of the transgene.
  • the A549 and VERO cells are seeded the day before at 3.10 5 cells in 6-well plates.
  • the cells are infected at an MOI of 50 with the various viral preset in 250 ⁇ l DMEM 2% SVF. After 30 minutes of adsorption at 37 ° C., 3 ml of DMEM 2% FCS are added to the cells in the presence or absence of 10 "7 M dexamethasone. The supernatants are removed at different times in order to analyze the expression of the transgene.
  • Detection of rat PIL-10 is carried out using the OptEIA TM kit (Pharmingen). The kits are used according to manufacturers' specifications.
  • the induction of IL-10 by dexamethasone was evaluated by transient transfection of the transfer plasmids in 293 cells.
  • the induction capacity is analyzed by co-transfecting the transfer vector MMTV-ILIO with the vector expressing the GR dex trans-activator.
  • the transfection of the plasmid MMTV-IL10 alone will indicate the level of expression of IL-10 in the absence of the trans-activator.
  • the level of induction is compared with the constitutive expression of PIL-10 under control of the CMN promoter, by also transfecting this plasmid into 293 cells. Induction is carried out in the presence or not of dexamethasone at a concentration of 10 7 M.
  • the culture supernatants are removed 72 and 120 hours after transfection in order to quantify PIL-10 per ELIS A kit.
  • the co-transfection of the MMTN-ILIO and GR dex plasmids in the presence of dexamethasone allows the induction of PIL-10 (50 ng / ml at 120 H post-transfection).
  • the inventors have demonstrated that the contribution of the GR dex trans-activator and of the dexamethasone ligand allows an induction of the expression of IL-10 under the control of the inducible promoter MMTV.
  • the efficacy of induction of IL-10 by dexamethasone coupled to GR dex was evaluated in vitro by infection of human A549 cells and simian VERO cells with the vectors Ad-MMTV-ILIO ⁇ AdGR dex or Ad-GR dex - MMTV-IL10. These two types of infection make it possible to evaluate the efficiency of induction in trans or in cis.
  • the cell cultures are carried out in the presence or not of dexamethasone 10 "7 M.
  • IL-10 obtained will be compared with that obtained after infection with Ad-CMNIL-10 expressing this cytokine constitutively.
  • the PE -IO induction is compared to that of human factor IX inserted in the same constructions, evaluated in vitro beforehand. The supernatants are removed at 24, 48, 72 and 96 hours post-infection in order to quantify IL-10. and factor IX produced, using ELIS A kits.
  • the expression of P IL-10 is induced when the cells are co-infected with Ad-MMTV-ILIO + Ad-CMV-GR dex in the presence of dexamethasone, to reach 50.8 ng / ml 96 hours after infection.
  • IL-10 is barely detectable (1.2 ng / ml).
  • the GR dex trans-activator no significant induction of the expression of IL-10 can be noted (3 ng / ml in the presence of dexamethasone, corresponding to the residual expression obtained in transient transfection; 0.7 ng / ml in the absence of dexamethasone).
  • the inventors were therefore able to demonstrate that in VERO cells, the expression PIL-10 can be induced by dexamethasone coupled to GR dex in "trans", when the two expression cassettes are carried by two different adenoviral vectors.
  • A549 cells they were also able to verify the functionality of the “trans” inducible system. Indeed, the concentration of EL-10 reaches 32.3 ng / ml in the presence of dexamethasone after co-infection with the vectors Ad-MMTV-ILIO + Ad-CMV-GR dex . In the absence of a ligand, the cytokdne is undetectable. The expression of PIL-10 is also induced by dexamethasone after infection with the vector Ad-MMTV-ILIO alone. This activation takes place through the wild-type GR receptor expressed by A549 cells.

Abstract

La présente invention concerne un système d'expression inductible mettant en oeuvre les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel d'origine eucaryote ou virale et un vecteur adénoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel. Elle a également pour objet un vecteur adénoviral recombinant portant une première cassette d'expression codant pour un activateur transcriptionnel et une seconde cassette portant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel. L'invention a également trait à une particule virale infectieuse, son procédé de préparation, une cellule eucaryote et une composition pharmaceutique comprenant un tel vecteur ou système d'expression ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques.

Description

SYSTEME D'EXPRESSION INDUCTIBLE
La présente invention concerne un système d'expression inductible mettant en oeuvre les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel et un vecteur adenoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel sous une forme activée. Elle a également pour objet un vecteur adenoviral recombinant portant une première cassette d'expression codant pour ledit activateur transcriptionnel et une seconde cassette portant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible en trans par ledit activateur transcriptionnel. L'invention a également pour objet une particule virale infectieuse, une cellule, une composition pharmaceutique comprenant un tel vecteur ou système d'expression ainsi que leur utilisation à des fins thérapeutiques ou prophylactiques. L'invention présente un intérêt tout particulier pour des perspectives de thérapie génique, notamment chez l'homme.
La thérapie génique se définit comme le transfert d'information génétique dans une cellule ou un organisme hôte. Le premier protocole appliqué à l'homme a été initié aux Etats Unis en septembre 1990 sur un patient génétiquement immunodéficient en raison d'une mutation affectant le gène codant pour l'Adénine Désaminase (AD A). Il s'agissait de corriger ou remplacer le gène défectueux dont le dysfonctionnement est à l'origine d'une maladie génétique par un gène fonctionnel. Le succès relatif de cette première expérimentation a encouragé le développement de cette technologie qui a été depuis étendue au traitement d'autres maladies aussi bien génétiques qu'acquises (cancers, maladies infectieuses comme le SIDA...) dans le but de délivrer in situ des gènes thérapeutiques améliorant la pathologie. La plupart des stratégies utilisent des vecteurs pour véhiculer le gène thérapeutique vers sa cible cellulaire. De nombreux vecteurs tant viraux que synthétiques ont été développés au cours de ces dernières années et ont fait l'objet de nombreuses publications accessibles à l'homme du métier.
L'intérêt des adénovirus à titre de vecteurs de thérapie génique a déjà été évoqué dans de nombreux documents de l'art antérieur. Us infectent de nombreux types cellulaires, aussi bien des cellules en division que quiescentes, sont non intégratifs et peu pathogènes. En outre, ils possèdent un tropisme naturel pour les voies respiratoires. Ces propriétés particulières font des adénovirus des vecteurs de choix pour de nombreuses applications thérapeutiques et même vaccinales. A titre indicatif, leur génome est constitué d'une molécule d'ADN linéaire et bicaténaire d'environ 36 kb qui porte une trentaine de gènes intervenant dans le cycle viral. Les gènes précoces (El à E4 ; E pour early en anglais) sont répartis en 4 régions dispersées dans le génome. Les régions El, E2 et E4 sont essentielles à la réplication virale alors que la région E3 impliquée dans la modulation de la réponse immunitaire anti-adénovirus chez l'hôte ne l'est pas. Les gènes tardifs (Ll à L5 ; L pour late signifiant tardif en anglais) codent majoritairement pour les protéines de structure et recouvrent en partie les unités de transcription précoces. Ils sont pour la plupart transcrits à partir du promoteur majeur tardif MLP (pour Major Late Promoter en anglais). En outre, le génome adenoviral porte à ses extrémités des régions agissant en cis essentielles à l'encapsidation constituées de séquences terminales inversées (ITR) situées aux extrémités 5' et 3' et d'une région d'encapsidation qui suit l'ITR 5'.
Les vecteurs adénoviraux actuellement utilisés dans les protocoles de thérapie génique sont dépourvus de la majeure partie de la région El afin d'éviter leur dissémination dans l'environnement et l'organisme hôte. Des délétions supplémentaires dans la région E3 permettent d'accroître les capacités de clonage. Les gènes d'intérêt sont introduits dans l'ADN viral à la place de l'une ou l'autre région délétée. Cependant, l'immunogénécité potentielle des protéines virales encore exprimées peut dans certaines applications particulières s'opposer à la persistance des cellules transduites et à l'expression stable du transgène. Ces inconvénients ont justifié la construction de vecteurs de nouvelles générations qui conservent les régions en cis (ITRs et séquences d'encapsidation) essentielles à l'encapsidation mais comportent des modifications génétiques supplémentaires visant à supprimer l'expression in vivo de la plupart des gènes viraux (voir par exemple la demande internationale WO94/28152). A cet égard, un vecteur dît minimal, déficient pour l'ensemble des fonctions adénovirales représente une alternative de choix.
La plupart des vecteurs développés à l'heure actuelle sont basés sur une expression constitutive du transgène. Or il peut être souhaitable de limiter l'expression du gène thérapeutique à un nombre restreint de types cellulaires. L'expression tissu-spécifique peut être médiée par le biais de promoteurs et d'enhancers tissu-spécifiques ou de systèmes d'expression inductibles répondant à un événement cellulaire ou temporel spécifique.
De nombreux systèmes d'expression inductibles proposés actuellement reposent sur l'emploi de promoteurs régulés par des facteurs de transcription endogènes activés par un ligand inducteur particulier (hormones stéroïdes, interféron, métaux lourds...). Un premier inconvénient est que ces systèmes nécessitent la présence des facteurs activateurs endogènes au sein de la cellule cible. De plus, le niveau d'expression basai est souvent élevé en raison d'une activation «bruit du fond» due aux substances cellulaires endogènes, qui peut générer des effets secondaires non négligeables.
Un certain nombre de systèmes d'expression basés sur l'utilisation de facteurs procaryotiques ont été mis en évidence au cours de ces dernières années. On peut citer par exemple ceux des opérons bactériens tétracycline (Gossen et Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551), lactose (Miller et Reznikoff (Eds), The opérons, Cold Spring Harbor Laboratory), tryptophane (Yanofsky et al., 1981, Nucleic acids Res. 9, 6647-6668), de la protéine 16 du virus simplex de l'herpès (protéine trans-activatrice VP16), ou de la protéine Gal4 de levure (Webster et al., 1988, Cell 52, 169-178).
D'une manière générale, l'opéron de résistance à la tétracycline est codé par le transposon TnlO (Hillen et al., 1984, J. Mol. Biol. 172, 185-201). La régulation est assurée par une courte séquence nucléotidique dite "opérateur" (tet O) qui constitue un site de fixation de divers régulateurs. Ainsi, la fixation du répresseur tétracycline (tet R) ou de l'antibiotique tétracycline diminue considérablement le niveau de transcription. Au contraire, un effet d'activation est obtenu en mettant en oeuvre une protéine, désignée dans la littérature "trans-activateur tétracycline (tTA)" qui résulte de la fusion entre le tet R et les 130 acides aminés C-terminaux du domaine d'activation de la protéine VP16 du virus simplex de l'herpès. L'expression d'un gène rapporteur placé sous le contrôle de plusieurs copies de tet O en amont de séquences de base de la transcription (TATA box, site d'initiation de la transcription..) est détectable par co-expression du tTA et inhibée par ajout de tétracycline. La Tétracycline lie le tTA et empêche ainsi la transcription. Ce système est fonctionnel dans un contexte vecteur rétroviral (Paulus et al., 1996, J. Nirol. 70, 62-67) et adenoviral (Νeering et al., 1996, Blood 4, 1147-1155 ; Yoshida and Hamada, 1997, Biochem. Biophy. Comm. 230, 426-430 ; Massie et al., 1998, J. Nirol. 72, 2289-2296). Dans ce dernier cas, le trans-activateur est fourni en trans soit par infection d'une lignée établie exprimant le tTA par un vecteur adenoviral contenant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'éléments tetO et du promoteur CMV soit par co-infection des cellules par deux vecteurs adénoviraux, l'un contenant la cassette d'intérêt et l'autre exprimant le tTA. Un système réverse dans lequel l'expression du transgène est activée en présence de la tétracycline, a été développé en mutant la protéine de fusion tTA (Gossen et al., 1995, Science 268, 1766-1769). La protéine modifiée rtTA ne lie en effet les éléments tetO qu'en présence de tétracycline. Une autre variante selon laquelle l'expression est contrôlée à deux niveaux (en absence de tétracycline et en présence d'oestradiol), est obtenue en fusionnant le tTA au domaine de liaison au ligand du récepteur aux oestrogènes (Iida et al., 1996, J. Virol. 70, 6054-6059).
Un autre système inductible repose sur l'emploi de récepteurs endogènes afin de remédier à l'immunogénicité potentielle des trans-activateurs procaryotiques. A cet égard, les récepteurs des hormones stéroïdes ont fait l'objet de nombreuses publications. On peut citer plus particulièrement les récepteurs aux glucocorticoïdes (GR) (Israël et Kaufinan, 1989, Nucleic Acids Res. 17, 4589- 4604), à la progestérone (PR) (Gronemeyer et al., 1987, EMBO J. 6, 3985-3994) et aux oestrogènes (ER) (Klein-Hitpaβ et al., 1986, Cell 4.5,1053-1061 ; Koike et al., 1987, Nucleic Acids Res. 15, 2499-2513). Leur mode d'action est variable puisqu'ils sont capables de trans-activer ou de trans-réprimer la transcription selon la cellule cible, le ligand hormonal et les éléments de régulation employés. Pour ce qui est de la trans-activation, le récepteur stéroïdien est sous sa forme inactive complexé à divers facteurs cellulaires dont certaines protéines de choc thermique (hsp pour heat shock protein en anglais). La fixation d'un ligand agoniste (hormone stéroïde) entraîne un changement de la conformation du récepteur. Cette activation s'accompagne de la dissociation des facteurs cellulaires, d'une translocation nucléaire et augmente la capacité du récepteur à fixer une courte séquence d'ADN spécifique (séquence cible), ce qui permet l'interaction avec la machinerie transcriptionnelle et l'induction de la transcription. Pour remplir leur fonction, ces récepteurs sont généralement organisés en 3 domaines fonctionnels, respectivement un domaine de trans-activation permettant l'activation de la transcription, un domaine de liaison à l'ADN (séquence cible) et un domaine de liaison au ligand (DLL).
Des récepteurs modifiés répondant préférentiellement à des ligands synthétiques non naturels sont également proposés dans la littérature. Par exemple, Wang et al. (1994, Proc. Natl Acad. Sci. USA 91, 8180-8184) ont construit une chimère activable par la molécule RU486 mais pas par la progestérone endogène, qui résulte de la fusion du domaine de liaison au ligand du récepteur tronqué de la progestérone (ΔPR), du domaine de liaison à l'ADN de la protéine de levure Gal4 et du domaine de trans-activation de la protéine VP16. Toutefois, l'activité basale reste élevée et la protéine chimère peut potentiellement interférer avec les facteurs transcriptionnels cellulaires. Des variants des récepteurs ER et GR modifiés dans leurs domaines de liaison au ligand ont également été décrits. Ainsi, le mutant ERT obtenu par substitution de la glycine en position 521 du récepteur ER par une arginine, est incapable de fixer les oestrogènes endogènes, mais peut être activé par des ligands synthétiques tel que le Tamoxifen, pour activer la transcription régulée par la séquence cible ERE (pour estrogen responsive élément). Un variant analogue a également été construit pour le récepteur GR, modifié en position 747 par substitution de l'isoleucine par une thréonine (Roux et al., 1996, Molecular Endocrynology 10, 1214-1226). Ce variant désigné GRdex est incapable de fixer les glucocorticoïdes endogènes, mais peut être activé par des ligands synthétiques tels que la Dexaméthasone. Une fois activé, il reconnaît la séquence cible GRE (pour glucocorticoïde responsive élément ; Cato et al., 1986, EMBO J. 5, 2237-2240) et stimule la transcription du promoteur qui lui est associé.
Un autre système d'expression inductible utilise le récepteur stéroïdien d'insecte répondant à Pecdysone (EcR). Le récepteur est activé par l'ecdysone et forme un hétérodimère avec la protéine ultraspiracle (USP) de la Drosophile qui se fixe à une séquence cible spécifique (EcRE pour ecdysone responsive élément) pour activer la transcription. No et al. (1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346-3351) ont créé un récepteur mutant VgEcR obtenu par fusion du DLL du récepteur EcR, d'un hybride entre le domaine de liaison à l'ADN des récepteurs EcR et GR et du domaine de trαra-activation de VP 16. Le mutant peut former, en présence de l'ecdysone ou de son analogue muristone A, un hétérodimère avec la protéine USP ou son homologue humain, le récepteur de l'acide rétinoïque X (RXR), et activer la transcription de gènes placés sous le contrôle d'une séquence hybride (5xE/GRE) comprenant les motifs répondant aux récepteurs EcR et GR. Un tel système évite une éventuelle activation endogène.
Un autre système d'expression inductible décrit dans la littérature met en oeuvre les immunophilines. Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) ont développé un système à deux composantes assemblées en présence d'un ligand. Plus précisemment, la première composante est une fusion entre le facteur de transcription ZFHD1 (portant un domaine de liaison à l'ADN) et l'immunophiline FKBP12 et la deuxième composante est une fusion entre le domaine de trans- activation du facteur NFKB p65 et FRAP (FKBP12-rapamycine-associated protein). Le trans-activateur est activé sous forme d'un hétérodimère associant les deux composantes et la rapamycine liant les portions FKBP 12 et FRAP qui peut induire l'expression d'un transgène placé sous le contrôle des éléments-cibles de ZFHD1.
Enfin, Dolwick et al. (1993, Mol. Pharmacol. 44, 911-917) ont identifié le récepteur aryl hydrocarbon (AhR) impliqué dans le métabolisme des xénobiotiques et des substances chimiques élaborées par l'homme. L'AhR, sous forme inactive est complexé à divers facteurs cellulaires dont la protéine chaperonne hsp90. La fixation d'un ligand xénobiotique induit la dissociation du complexe, la translocation du AhR dans le noyau, la formation d'un hétérodimère avec la protéine Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator ; Hofftnan et al., 1991, Science 252, 954-958). La fixation de l'hétérodimère sur les éléments cibles de l'ADN nommés XRE (pour xénobiotique responsive éléments) induit la transcription des séquences géniques en aval. La séquence XRE est présente dans la région promotrice de nombreux gènes codant pour des enzymes impliquées dans le métabolisme de drogues, telles que glutathione-S-transférase ou cytochrome P4501 Al . AhR et Arnt possèdent un domaine responsable de la reconnaissance de la séquence cible, de l'hétérodimérisation et de la liaison au ligand. La majorité des études de trans-activation par le biais du complexe AhR/ Arnt utilise le ligand 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD)
La présente invention propose un système d'expression inductible mettant en oeuvre un vecteur adenoviral comportant un gène d'intérêt dont l'expression est régulée par un trans-activateur activable par l'apport de molécules pharmacologiques exogènes. Ce système est basé plus particulièrement sur l'utilisation d'un récepteur stéroïdien. Une fois activé, le complexe récepteur/ligand va se fixer sur sa séquence cible et permettre une activation en trans de l' expression du gène thérapeutique. On a maintenant construit un vecteur adenoviral recombinant contenant, en remplacement de la région El, une cassette d'expression du récepteur stéroïdien mutant GR ex exprimé de façon constitutive par le promoteur précoce du cytomégalovirus (CMN) et, en remplacement de la région E3, une cassette d'expression du gène facteur IX (FIX) humain placé en aval du promoteur du virus MMTN (mouse mammary tumor virus) contenant la séquence cible GRE. Les expériences qui suivent montrent la fonctionnalité d'un tel système inductible in vitro et in vivo. De façon analogue, le récepteur ER a également été inséré dans la région El d'un adénovirus sous le contrôle du promoteur CMN. Dans ce cas, la cassette inductible du gène FIX est régulée par la séquence ERE associée au promoteur minimal du gène TK (thymidine kinase) de HSN (herpès simplex virus). Le troisième système étudié dans le cadre de la présente invention met en oeuvre le récepteur modifié NgEcR et le récepteur humain RXR dont les séquences ont été introduites dans la région El d'un adénovirus. La cassette inductible présente dans la région E3 place l' ADΝc du FIX sous le contrôle des éléments hybrides 5xE/GRE.
La finalité de la présente invention est de remédier aux inconvénients des vecteurs de thérapie génique actuels, en améliorant notamment la spécificité (activation par des substances exogènes non toxiques et non par des facteurs cellulaires endogènes) et l'inductibilité (activité basale en l'absence d'inducteur minimale et forte expression du transgène à l'état activé). L'objet de la présente invention peut être appliqué à divers protocoles de thérapie génique nécessitant l'expression de molécules solubles, telles que des molécules antitumorales (anticorps, cytokines, chimiokines) ou dans tous les cas où l'expression du gène thérapeutique devra être régulée en fonction des besoins de l'organisme. Il permet également l'analyse des gènes dont l'expression est cytotoxique ou réduite à certaines étapes du développement.
C'est pourquoi la présente invention a pour objet un système d'expression inductible comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel d'origine eucaryote ou virale et placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte , et
(ii) un vecteur adenoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
Aux fins de la présente invention, le terme «activateur transcriptionnel» définit un polypeptide ou un ensemble de polypeptides exerçant une action positive sur la transcription c'est à dire ayant la capacité d'initier ou de stimuler la transcription d'un gène quelconque à partir d'éléments de régulation appropriés répondant audit activateur transcriptionnel. L'effet positif sur la transcription est de préférence médié directement par la liaison de l'activateur aux éléments de régulation mais peut l'être indirectement par l'intermédiaire de facteur(s) cellulaire(s). De préférence, on a recours à un activateur transcriptionnel ligand- dépendant apte à lier une séquence d'ADN caractéristique (séquence cible) et à activer le promoteur qui lui est associé. De tels activateurs transcriptionnels sont décrits dans l'état de la technique. On indique également que dans le cadre de la présente invention, l'activateur transcriptionnel peut être un polypeptide unique sous forme de monomère ou de multimère (de préférence dimère) ou encore peut résulter de l'association d'un ensemble de polypeptides formant un hétéromère (de préférence un ensemble de deux polypeptides formant un hétérodimère).
L'activateur transcriptionnel en usage dans la présente invention peut être dérivé d'un organisme quelconque d'origine eucaryote ou virale, notamment d'une levure, d'un insecte, d'un vertébré ou d'un virus ou peut avoir une origine mixte c'est à dire être formé de composantes d'origines diverses.
Un activateur transcriptionnel convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comprend au moins 3 types de domaines fonctionnels, respectivement un domaine de trans-activation, un domaine de liaison à l'ADN (séquence cible) et un domaine de liaison au ligand (DLL). Dans le cadre de la présente invention, l'ordre des différents domaines est sans importance. De plus, ils peuvent être répartis dans la séquence en acides aminés de manière continue ou discontinue (avec éventuellement un chevauchement des résidus impliqués dans chaque fonction) et localisés sur un ou les polypeptide(s) formant ledit activateur transcriptionnel. Par ailleurs, il peut comprendre plusieurs domaines d'un même type. Un exemple adéquate est constitué par l'hétérodimère développé par Rivera et al. (1996, Nat. Med. 2, 1028-1032) activé par la liaison de la rapamycine aux portions FKBP12 et FRAP.
Le terme «domaine de liaison au ligand» fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec un ligand-inducteur approprié. L'interaction DLL-inducteur place l'activateur transcriptionnel en état activé, étape nécessaire à l'activation transcriptionnelle. Le DLL est de préférence localisé à l'extrémité C-terminale du ou d'un polypeptide composant ledit activateur transcriptionnel.
Le terme «domaine de liaison à l'ADN» fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec la séquence d'ADN cible présente au sein du promoteur inductible contrôlant l'expression du gène d'intérêt et spécifique de l'activateur transcriptionnel choisi. Ladite séquence cible est généralement placée en amont d'une région promotrice contenant au moins une TATA box et est composée de motifs reconnus par l'activateur transcriptionnel. Ces motifs peuvent former une structure particulière (palindrome, répétitions en orientation sens ou inversée ...etc). Les séquences cibles adaptées à chaque activateur transcriptionnel sont décrites dans la littérature. Pour illustrer, on peut citer : la séquence cible GRE (pour glucocorticoïd responsive élément) comportant un motif TGTTCT (ou son complémentaire) reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur GR ou d'un analogue (GR ex). Un exemple préféré est constitué par la séquence 5'GGTACANNNTGTTCT3' où N représente un nucléotide quelconque ; la séquence cible ERE (pour oestrogen responsive élément) comportant un motif 5ΑGGTCA3' (ou son complémentaire) reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur ER ou d'un analogue (ER ). Un exemple préféré est constitué par la séquence 5ΑGGTCANNNTGACC3' où N représente un nucléotide quelconque ; - la séquence cible UAS (pour upstream activating séquence) de séquence 5' CGGAGTACTGTCCTCCG3' (ou son complémentaire) reconnue par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur Gai 4 de levure ou d'un analogue ; la séquence cible EcRE (pour ecdysone responsive élément) comportant un motif GACAAG (ou son complémentaire) reconnu par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur EcR ou d'un analogue. Un exemple préféré est constitué par la séquence 5'GACAAGGGTTCAATGCACTTGTC3' ; la séquence 5xE/GRE de séquence 5 'AGGTC AN AGAACA3 ' (ou son complémentaire) reconnue par un domaine de liaison à l'ADN hybride entre EcR et GR ou d'un analogue, la séquence cible 5' TAATTANGGGNG3' où N représente un nucléotide quelconque, reconnue par le facteur de transcription ZFHD1 - la séquence cible XRE (pour xénobiotique responsive élément) de séquence 5'CCTCCAGGCTTCTTCTCACGCAACTCC3' reconnue par un domaine de liaison à l'ADN dérivé du récepteur AhR ou d'un analogue. Le terme «domaine de trans-activation» fait référence à la portion de l'activateur transcriptionnel qui interagit avec la machinerie cellulaire pour initier ou stimuler la transcription génique dépendante de la séquence cible répondant audit activateur. Ce domaine peut être issu d'un facteur de transcription classique (NFKB, SP-1...) ou d'un facteur ligand-dépendant (récepteur stéroïdien, immunophiline, AhR...). Un domaine comprenant les 130 acides aminés C- terminaux de NP16 convient tout particulièrement.
La trans-activation induite par l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente invention peut être vérifiée simplement par des techniques conventionnelles, par exemple en suivant l'expression d'un gène donné placé sous le contrôle de la séquence cible adéquate ou la synthèse de son produit d'expression (analyse selon Northern, Western, immunofluorescence...etc) en présence du récepteur activé par l'inducteur. Un protocole détaillé est donné dans les exemples ci-après. Une différence d'un facteur d'au moins 2, avantageusement d'au moins 5 et, de préférence, d'au moins 10 reflète la capacité de trans-activation du système d'expression selon l'invention.
On peut illustrer ces définitions par l'exemple du récepteur GR. Son domaine de trans-activation est localisé dans la partie N-terminale entre les résidus 272 et 400 (Jonat et al., 1990, Cell 62, 1189-1204), le domaine de liaison à l'ADN de 66 acides aminés entre les résidus 421 et 487 (Lucibello et al., 1990, EMBO J. 9, 2827-2834) et le domaine de liaison au ligand hormonal d'environ 300 acides aminés dans la partie C-terminale (Kerpolla et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 13, 3782- 3791). Ce dernier domaine comprend également les séquences responsables pour la dimérisation du GR, sa localisation nucléaire et l'interaction avec les protéines hsp. La trans-activation est médiée par la liaison d'un dimère de récepteur à la séquence cible GRE.
Avantageusement, l'activateur transcriptionnel inclu dans le système d'expression inductible selon l'invention comporte tout ou partie d'un domaine dérivé d'un récepteur d'hormones stéroïdes choisi parmi le groupe constitué par les récepteurs oestrogène (ER), glucocorticoïde (GR), progestérone (PR), Vitamine D, ecdysone (EcR), minéralocorticoïde, androgène, hormone thyroïde, acide rétinoïque et acide rétinoïque X ou encore d'une immunophiline ou d'un récepteur aryl hydrocarbon (AhR). Dans le cadre de la présente invention, on peut mettre en oeuvre un récepteur modifié. Avantageusement, le récepteur modifié a perdu sa capacité d'activation par un inducteur naturel et acquis une capacité d'activation par un inducteur non naturel et retient la capacité de trans-activation du récepteur natif. L'homme de l'art connaît la ou les modifications à effectuer à cet égard. Elles peuvent être diverses (délétion, substitution et/ou addition d'un ou plusieurs résidus du récepteur naturel) et concerner un ou plusieurs domaines. De manière préférée, le domaine fonctionnel modifié présente une identité de séquence avec son équivalent natif d'au moins 70 %, avantageusement d'au moins 80 %, de préférence d'au moins 90 % et, de manière tout à fait préférée d'au moins 95%. Selon un premier mode de réalisation, on a recours à un récepteur modifié dans son DLL de manière à être activable par un inducteur non naturel. Des exemples préférés sont constitués par les mutants GR ex (I747T) et ER (G521R) déjà cités.
On peut également envisager de mettre en oeuvre un activateur transcriptionnel chimère comprenant des polypeptides ou fragments polypeptidiques variés. Avantageusement, il résulte de la fusion ou de l'association de domaines fonctionnels d'origines différentes. En effet, il est possible d'échanger les domaines fonctionnels entre les différents récepteurs et toutes les combinaisons possibles entrent dans le cadre de la présente invention. Par exemple, pour réduire l'interférence avec les complexes récepteurs / ligands endogènes, on peut envisager de remplacer le domaine de liaison à l' ADN d'un récepteur stéroïdien par celui d'un récepteur non humain (d'origine virale ou animale ou d'eucaryote inférieur), par exemple un récepteur stéroïdien animal, un récepteur de levure(Gal4)..., la seule condition étant d'adapter la séquence cible au domaine de liaison à l'ADN retenu. Une telle adaptation est à la portée de l'homme de l'art. A titre indicatif, lorsque le domaine de liaison à l'ADN est issu de Gal4, le promoteur inductible mis en oeuvre contiendra les éléments UAS (Upstream Activating Séquences) répondant à Gal4. Par ailleurs, le domaine de trans-activation peut être issu de n'importe quel domaine d'activation transcriptionnel connu, notamment de la protéine 16 du virus herpès simplex (VP16) ou de la p65 du facteur NFKB et en particulier, de son extrémité C-terminale. Un activateur transcriptionnel associant un DLL dérivé d'un récepteur stéroïdien, un domaine de trans-activation dérivé de VP16 et un domaine de liaison à l'ADN de Gal4 ou d'un récepteur stéroïdien convient à la mise en oeuvre de la présente invention. A cet égard, on utilisera de préférence les résidus 1 à 74 de Gal4. Mais d'autres combinaisons sont également envisageables.
Par ailleurs, on peut employer également un domaine fonctionnel hybride entre des fragments polypeptidiques différents. Un exemple possible est constitué par un domaine de liaison à l'ADN hybride entre les récepteurs EcR et GR, reconnaissant une séquence cible hybride comportant les motifs répondant à l'ecdysone et aux glucocorticoïdes.
Un activateur transcriptionnel préféré dans le cadre de la présente invention est choisi parmi :
(i) un polypeptide désigné GR ex comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivés d'un récepteur aux glucocorticoïdes, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de Pisoleucine en position 747 par une thréonine ; (ii) un polypeptide désigné ER comprenant un domaine de liaison à l' ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivé d'un récepteur à l'oestrogène, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de la glycine en position 521 par une arginine ; (iii) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un DLL dérivé du récepteur à l'ecdysone, un domaine de liaison à l'ADN hybride dérivé de ceux des récepteurs EcR et GR et un domaine de trans-activation dérivé de la protéine virale VP 16 et un second polypeptide dérivé de la protéine USP de drosophile ou d'un homologue tel que le récepteur de l'acide rétinoïque X (RXR) humain ;
(iv) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé du facteur de transcription ZFHD1 et un DLL dérivé de l'immunophiline FKBP12 et un second polypeptide comportant un domaine de trans-activation dérivé du facteur NFKB p65 et un DLL dérivé de FRAP (FKBP12-rapamycine- associated protein) ; et
(v) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide dérivé du récepteur AhR et un deuxième polypeptide dérivé de la protéine Arnt. De préférence, les activateurs transcriptionnels (i) et (ii) sont sous forme d'homodimères et (iii) (iv) et (v) sont sous forme d'hétérodimères associant le premier et le second polypeptide et, éventuellement, l'inducteur.
Selon un mode de réalisation tout à fait avantageux, l'activateur transcriptionnel est activé par liaison à un inducteur non naturel et n'est pas ou peu activé par un composé humain naturel.
Le terme «inducteur non naturel» se réfère à un composé qui n'est pas trouvé naturellement dans l'organisme humain ou animal à qui la thérapie utilisant le système d'expression inductible selon l'invention est destinée. Il s'agit de préférence d'un inducteur synthétique qui n'est pas trouvé naturellement dans un organisme humain et dont la structure est légèrement différente de celle d'un composé humain (endogène). Aux fins de la présente invention, un inducteur non naturel est capable d'activer l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente invention, en particulier par liaison au DLL, afin d'initier ou stimuler la transcription dépendante de la séquence cible répondant audit activateur. Le choix d'un inducteur non naturel adapté à l'activateur transcriptionnel retenu est à la portée de l'homme de l'art sur la base de l'état de la technique. L'activation de l'activateur transcriptionnel par l'inducteur non naturel peut se faire par une interaction covalente ou non covalente (électrostatique, hydrophobe, liaison hydrogène ... etc). Par ailleurs, l'inducteur peut être constitué par un composé unique ou par un ensemble de molécules. Il appartient de préférence à la famille des stéroïdes, rétinoïdes, acides gras, vitamines, hormones, xénobiotiques ou antibiotiques.
Selon un mode de réalisation avantageux, ledit inducteur non naturel est une substance synthétique administrable par voie orale. De préférence, il est choisi parmi le groupe constitué par la dexaméthasone, le tamoxifène, le muristérone A, l'ecdysone, la rapamycine et le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p-dioxine (TCDD) ou un analogue quelconque de ces composés, de préférence peu ou pas toxique.
Les séquences codant pour l'activateur transcriptionnel compris dans le système d'expression inductible selon l'invention sont placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés permettant l'expression dans une cellule ou un organisme hôte. Le terme «éléments de régulation appropriés» regroupent l'ensemble des éléments permettant la transcription desdites séquences en ARN et la traduction en protéine. Parmi ceux-ci, le promoteur revêt une importance particulière. Il peut être isolé d'un gène quelconque d'origine eucaryote, procaryote ou même virale. Alternativement, il peut s'agir du promoteur naturel du gène endogène. Par ailleurs, il peut être constitutif ou régulable. En outre, il peut être modifié de manière à améliorer l'activité promotrice, supprimer une région inhibitrice de la transcription, rendre un promoteur constitutif régulable ou vice versa, introduire un site de restriction On peut mentionner, à titre d'exemples, les promoteurs eucaryotes des gènes PGK (Phospho Glycérate Kinase), MT (metallothioneine ; Me Ivor et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7, 838-848), le promoteur précoce du virus SV40 (Simian Nirus), le LTR du RSV (Rous Sarcoma Virus), le promoteur TK-HSV-1, le promoteur précoce du virus CMV (Cytomegalovirus) et les promoteurs gouvernant l'expression des gènes adénoviraux tardifs (MLP) et précoces (El A, E2A, E3 ou E4). Mais, il peut également être intéressant de réguler l'expression de l'activateur transcriptionnel. Selon une première variante, son expression peut être contrôlée par sa séquence cible spécifique (autoactivation et/ou activation par le récepteur sauvage endogène activé par le ligand endogène). Par exemple, on aura recours aux éléments ERE ou GRE pour l'expression d'un activateur transcriptionnel comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé de ER ou GR (ERT ou GRdcx). Une autre possibilité est l'emploi d'un promoteur régulable choisi parmi ceux de l'art antérieur. A cet égard, l'utilisation d'un promoteur stimulant l'expression dans une cellule tumorale ou cancéreuse peut être avantageuse. On peut citer notamment les promoteurs des gènes MUC-1 surexprimé dans les cancers du sein et de la prostate (Chen et al., 1995, J. Clin. Invest. 96, 2775-2782), CEA (pour carcinoma embryonic antigen) surexprimé dans les cancers du colon (Schrewe et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10, 2738-2748), tyrosinose surexprimé dans les melanomes (Vile et al., 1993, Cancer Res. 53, 3860-3864), ERB-2 surexprimé dans les cancers du sein et du pancréas (Harris et al., 1994, Gène Therapy /, 170-175) et α-fétoprotéine surexprimée dans les cancers du foie (Kanai et al., 1997, Cancer Res. 57, 461-465). On indique que le promoteur précoce du Cytomégalovirus (CMV) est tout particulièrement préféré. Bien entendu, les éléments de régulation appropriés peuvent en outre comprendre des éléments additionnels améliorant l'expression (séquence intronique, séquence terminatrice de la transcription...) ou encore le maintien dans une cellule hôte. De tels éléments sont connus de l'homme de l'art.
Lorsque l'activateur transcriptionnel en usage dans le cadre de la présente invention est composé par un ensemble de polypeptides, ceux-ci peuvent être produits à partir de séquences nucléotidiques polycistroniques (placées sous le contrôle d'un promoteur unique) mettant en oeuvre un site d'initiation de la traduction de type IRES pour initier la traduction du second cistron. On peut également employer un promoteur bidirectionnel dirigeant l'expression de deux gènes placés de part et d'autre. On peut aussi générer des cassettes d'expression indépendantes comportant chacunes des éléments de régulation appropriés tels que ceux cités auparavant. Les cassettes peuvent être portées par un même vecteur d'expression ou par des vecteurs différents. Les séquences employées dans le cadre de la présente invention peuvent être obtenues par les techniques classiques de biologie moléculaire, par exemple par criblage de banque à l'aide de sondes spécifiques, par immunocriblage de banque d'expression, par PCR au moyen d'amorces adéquates ou par synthèse chimique. Les mutants peuvent être générés à partir des séquences natives par substitution, délétion et/ou addition d'un ou plusieurs nucléotides en mettant en oeuvre les techniques de mutagénèse dirigée, de PCR, de digestion par les enzymes de restriction et ligation ou encore par synthèse chimique. La fonctionnalité des mutants et des constructions peut être vérifiée par les techniques de l'art.
La deuxième composante du système d'expression inductible selon l'invention est un vecteur adenoviral recombinant comportant au moins un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
On aura de préférence recours à un vecteur adenoviral dépourvu de tout ou partie d'au moins une région essentielle à la réplication sélectionnée parmi les régions El, E2, E4 et Ll à L5, afin d'éviter sa propagation au sein de l'organisme hôte ou de l'environnement. Une délétion de la majorité de la région El est préférée. Avantageusement, elle s'étend des nt 454 à 3328 mais peut également englober des séquences additionnelles en 5' et 3' à la condition de ne pas interférer avec la fonction d'encapsidation. De préférence, le gène pIX n'est pas inclu dans la délétion de El. En outre, elle peut être combinée à d'autres modification(s) touchant notamment les régions E2, E4 et/ou L1-L5, dans la mesure où les fonctions essentielles défectives sont complémentées en trans au moyen d'une lignée de complémentation et/ou d'un virus auxilliaire. A cet égard, on peut avoir recours aux vecteurs de seconde génération défectifs pour les fonctions El et E4 ou El et E2 (voir par exemple les demandes internationales WO94/28152 et WO97/04119). Pour illustrer ce mode de réalisation, on peut citer un vecteur combinant une délétion au sein de la région El et une mutation thermosensible affectant le gène DBP (pour DNA Binding Protein en anglais) de la région E2A (Ensinger et al., 1972, J. Nirol. 10, 328-339). Pour ce qui est de la région E4, elle peut être délétée en totalité ou en partie. Une délétion partielle de la région E4 à l'exception des séquences codant pour les cadres de lecture ouverts (ORF) 3 et/ou 6/7 est avantageuse dans la mesure où elle ne nécessite pas de complémentation de la fonction E4 (Ketner et al., 1989, Nucleic Acids Res. 17, 3037-3048). Dans le but d'augmenter les capacités de clonage, le vecteur adenoviral recombinant peut en outre être dépourvu de tout ou partie de la région E3 non essentielle. Selon cette alternative, il peut être intéressant de conserver néanmoins les séquences E3 codant pour les polypeptides permettant l'échappement au système immunitaire de l'hôte, notamment la glycoprotéine gpl9k (Gooding et al., 1990, Critical Review of Immunology 10, 53-71). Selon une autre alternative, on peut employer un vecteur adenoviral minimal retenant essentiellement les ITRs (Inverted Terminal Repeat) 5' et 3' et la région d'encapsidation et défectif pour l'ensemble des fonctions virales.
Par ailleurs, l'origine du vecteur adenoviral du système d'expression inductible selon l'invention, peut être variée aussi bien du point de vue de l'espèce que du sérotype. Il peut dériver du génome d'un adénovirus humain ou animal (canin, aviaire, bovin, murin, ovin, porcin, simien...) ou encore d'un hybride comprenant des fragments de génome adenoviral d'au moins deux origines différentes. On peut citer plus particulièrement les adénovirus CAV-1 ou CAV-2 d'origine canine, DAN d'origine aviaire ou encore Bad de type 3 d'origine bovine (Zakharchuk et al., Arch. Virol., 1993, 128: 171-176 ; Spibey et Cavanagh, J. Gen. Virol., 1989, 70: 165-172 ; Jouvenne et al., Gène, 1987, 60: 21-28 ; Mittal et al., J. Gen. Nirol., 1995, 76: 93-102). Cependant, on préférera un vecteur adenoviral d'origine humaine dérivant de préférence d'un adénovirus de sérotype C, notamment de type 2 ou 5.
Le gène d'intérêt en usage dans la présente invention, peut être issu d'un organisme eucaryote, d'un procaryote d'un parasite ou d'un virus autre qu'un adénovirus. Il peut être isolé par toute technique conventionnelle dans le domaine de l'art, par exemple par clonage, PCR ou synthèse chimique. Il peut être de type génomique (comportant tout ou partie de l'ensemble des introns), de type ADN complémentaire (ADNc, dépourvu d'intron) ou de type mixte (minigène). Par ailleurs, il peut coder pour un ARN antisens et/ou un ARN messager (ARNm) qui sera ensuite traduit en polypeptide d'intérêt celui-ci pouvant être (i) intracellulaire, (ii) incorporé dans la membrane de la cellule hôte ou (iii) sécrété. Il peut s'agir d'un polypeptide tel que trouvé dans la nature (natif), d'une portion de celui-ci (tronqué), d'un mutant présentant notamment des propriétés biologiques améliorées ou modifiées ou encore d'un polypeptide chimère provenant de la fusion de séquences d'origines diverses. Par ailleurs, le gène d'intérêt peut coder pour un ARN anti-sens, un ribozyme, ou encore un polypeptide d'intérêt.
Parmi les polypeptides d'intérêt utilisables, on peut citer plus particulièrement les chémokines et cytokines (interféron α, β ou γ, interleukine (IL), notamment l'IL-2, l'IL-6, l'IL-10 ou encore l'IL-12, facteur nécrosant des tumeurs (TNF), facteur stimulateur de colonies (GM-CSF, C-CSF, M-CSF...), MEP-lα, MLP-lβ, RANTES, protéine de chémoattraction des monocytes telle que MCP-1...), les récepteurs cellulaires (notamment reconnus par le virus HTV), les ligands de récepteur, les facteurs de coagulation (Facteur VIII, Facteur IX, thrombine, protéine C), les facteurs de croissance (FGF pour Fibroblast Growth Factor, NEGF pour Vascular Endothelial Growth Factor), les enzymes (uréase, rénine, métalloprotéinase, nitric oxide synthétase NOS, SOD, catalase, lécithine cholestérol acyl transférase LCAT...), les inhibiteurs d'enzyme (αl-antitrypsine, antithrombine III, inhibiteur de protéase virale, PAI-1 pour plasminogen activator inhibitor), les antigènes du complexe majeur d'histocompatibilité de classe I ou II ou polypeptides agissant sur l'expression des gènes correspondants, les polypeptides capables d'inhiber une infection virale, bactérienne ou parasitaire ou son développement, les polypeptides agissant positivement ou négativement sur l'apoptose (Bax, Bcl2, BclX...), les agents cytostatiques (p21, p 16, Rb), les immunoglobulines en totalité ou en partie (Fab, ScFv...), les toxines, les immunotoxines, les apolipoprotéines (ApoAI, ApoAIV, ApoE...), les inhibiteurs d'angiogénèse (angiostatine, endostatine...), les marqueurs (β-galactosidase, luciférase....) ou tout autre polypeptide ayant un effet thérapeutique pour l'affection ciblée. Plus précisemment, dans le but de traiter un dysfonctionnement héréditaire, on utilisera une copie fonctionnelle du gène défectueux, par exemple un gène codant pour le facteur NIII ou IX dans le cadre de l'hémophilie A ou B, la dystrophine (ou minidystrophine) dans le cadre des myopathies de Duchenne et Becker, l'insuline dans le cadre du diabète, la protéine CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) dans le cadre de la mucoviscidose. S'agissant d'inhiber l'initiation ou la progression de tumeurs ou cancers, on mettra de préférence en oeuvre un gène d'intérêt codant pour un ARΝ anti-sens, un ribozyme, un produit cytotoxique (thymidine kinase de virus simplex de l'herpès 1 (TK-HSN-1), ricine, toxine cholérique, diphtérique, produit des gènes de levure FCYl et FURl codant pour l'uracyle phosphoribosyl transférase et la cytosine désaminase ), une immunoglobuline, un inhibiteur de la division cellulaire ou des signaux de transduction, un produit d'expression d'un gène suppresseur de tumeur (p53, Rb, p73, DCC....), un polypeptide stimulateur du système immunitaire, un antigène associé à une tumeur (MUC-1, BRCA-1, antigènes précoces ou tardifs (E6, E7, Ll, L2...) d'un virus à papillome HPV....), éventuellement en combinaison avec un gène de cytokine. Enfin, dans le cadre d'une thérapie anti-HIV, on peut avoir recours à un gène codant pour un polypeptide immunoprotecteur, un épitope antigénique, un anticorps (2F5; Buchacher et al., 1992, Vaccines 92, 191-195), le domaine extracellulaire du récepteur CD4 (sCD4 ; Traunecker et al., 1988, Nature 331, 84-86) une immunoadhésine (par exemple un hybride CD4-immunoglobuline IgG ; Capon et al., 1989, Nature 337, 525-531 ; Byrn et al., 1990, Nature 344, 667-670), une immunotoxine (par exemple fusion de l'anticorps 2F5 ou de l'immunoadhésine CD4-2F5 à l'angiogénine ; Kurachi et al., 1985, Biochemistry 24, 5494-5499), un variant trans-dominant (EP 0614980, WO95/ 16780), un produit cytotoxique tel que l'un de ceux mentionné ci-dessus ou encore un IFNα ou β.
Un des gènes d'intérêt peut également être un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées ou transduites. On peut citer les gènes néo (codant pour la néomycine phosphotransférase) conférant une résistance à l'antibiotique G418, dhfr (Dihydrofolate Réductase), CAT (Chloramphenicol Acetyl transférase), pac (Puromycine Acétyl-Transferase) ou encore gpt (Xanthine Guanine Phosphoribosyl Transférase). D'une manière générale, les gènes de sélection sont connus de l'homme de l'art.
Par ailleurs, la cassette d'expression du gène d'intérêt peut, en outre, inclure des éléments additionnels améliorant son expression ou son maintien dans la cellule hôte (origines de réplication , éléments d'intégration dans le génome cellulaire, séquences introniques, séquences poly A de terminaison de la transcription, leaders tripartites...). Ces éléments sont connus de l'homme de l'art. En outre, le gène d'intérêt peut également comporter en amont de la région codante une séquence codant pour un peptide signal permettant sa sécrétion de la cellule hôte. Le peptide signal peut être celui du gène en question ou hétérologue (issu d'un gène quelconque sécrété ou synthétique).
La cassette d'expression du gène d'intérêt peut être insérée à un endroit quelconque du génome adenoviral. Avantageusement, elle est introduite en remplacement de la région E3. Lorsque le vecteur adenoviral recombinant comporte plusieurs gènes d'intérêt, ceux-ci peuvent être placés sous le contrôle des mêmes éléments génétiques (cassette polycistronique utilisant un site interne d'initiation de la traduction de type IRES pour réinitier la traduction du second cistron) ou d'éléments indépendants. Dans ce cas, ils peuvent être insérés dans une même région adénovirale (par exemple en remplacement de E3) ou dans des régions différentes (par exemple en remplacement de E3 et d'une autre région délétée).
Dans le cadre de la présente invention, l'expression du gène d'intérêt est contrôlée par un promoteur inductible par un activateur transcriptionnel tel que défini ci-avant. Au sens de la présente invention, un promoteur inductible comprend au moins une séquence cible répondant à l'activateur transcriptionnel mis en oeuvre et associée de manière opérationnelle à un promoteur minimal. Les séquences cibles ont été définies auparavant et sont décrites dans la littérature accessible à l'homme de l'art (pour rappel, ERE, GRE, EcRE, UAS, 5xE/GRE, XRE...). On indique que l'on peut employer une séquence homologue modifiée par rapport à la séquence native mais exerçant une fonction de régulation similaire ou améliorée. Ces modifications peuvent résulter de l'addition, de la délétion et/ou de la substitution d'un ou plusieurs nucléotides ou de fusion entre deux séquences cibles différentes. On peut mettre en oeuvre une ou plusieurs séquences cibles, par exemple de 1 à 25, avantageusement de 1 à 10 et, de préférence, de 1 à 7, éventuellement placées en tandem et dans une orientation quelconque par rapport à la TATA box. Elle(s) est (sont) généralement insérée(s) dans le promoteur inductible en amont du promoteur minimal, jusqu'à plusieurs centaines de paires de bases de celui-ci. Un exemple de promoteur inductible par un activateur transcriptionnel dérivé du GR, est le LTR du virus MMTV (mouse mammary tumor virus) qui contient l'élément GRE et des séquences promotrices adéquates.
Un promoteur minimal comprend essentiellement une TATA box et un site d'initiation de la transcription fonctionnels dans une cellule ou un organisme hôte. Ces éléments sont classiques dans le domaine de l'art concerné. On peut citer plus particulièrement les promoteurs minimaux des gènes TK, CMN et HSP (promoteur minimal du gène de protéine de choc thermique de drosophile dépourvu de Penhancer).
En outre, le promoteur inductible en usage dans le cadre de la présente invention peut comporter des éléments supplémentaires améliorant le niveau de transcription ou le limitant à certains tissus particuliers (de type enhancer). Ces éléments supplémentaires peuvent de manière alternative être insérés dans une région génique non codante. Selon un premier mode de réalisation, les séquences nucléotidiques codant pour l'activateur transcriptionnel et leurs éléments de régulation sont portées par le vecteur adenoviral recombinant du système d'expression selon l'invention. Les cassettes d'expression du gène d'intérêt et de l'activateur transcriptionnel peuvent être localisées dans la même région du génome adenoviral ou en des endroits différents et en orientation sens ou anti-sens l'une par rapport à l'autre. L'orientation anti-sens est préférée. Un exemple préféré est fourni par un vecteur El" E3" dans lequel chacune des cassettes est insérée à la place des séquences adénovirales délétées.
Selon une autre variante, les séquences nucléotidiques sont portées par un vecteur d'expression indépendant autre que le vecteur adenoviral recombinant en usage dans le système d'expression selon l'invention. Il peut s'agir d'un vecteur synthétique (lipides cationiques, liposomes polymères ...), d'un plasmide ou encore d'un vecteur viral. Il peut être éventuellement associé à une ou plusieurs substances améliorant l'efficacité transfectionnelle et/ou la stabilité du vecteur. Ces substances sont largement documentées dans la littérature accessible à l'homme de l'art (voir par exemple Felgner et al., 1987, Proc. West. Pharmacol. Soc. 32, 115-121 ; Hodgson et Solaiman , 1996, Nature Biotechnology 14, 339-342 ; Remy et al., 1994, Bioconjugate Chemistry 5, 647-654). A titre illustratif mais non limitatif, il peut s'agir de polymères, de lipides notamment cationiques, de liposomes, de protéines nucléaires ou encore de lipides neutres. Ces substances peuvent être utilisées seules ou en combinaison. Une combinaison envisageable est un vecteur recombinant plasmidique associé à des lipides cationiques (DOGS, DC-CHOL, spermine-chol, spermidine-chol etc..) et des lipides neutres (DOPE).
Le choix des plasmides utilisables dans le cadre de la présente invention est vaste. Il peut s'agir de vecteurs de clonage et/ou d'expression. D'une manière générale, ils sont connus de l'homme de Part et nombre d'entre eux sont disponibles commercialement mais il est également possible de les construire ou les modifier par les techniques de manipulation génétique. On peut citer à titre d'exemples les plasmides dérivés de pBR322 (Gibco BRL), pUC (Gibco BRL), pBluescript (Stratagène), pREP4, pCEP4 (Invitrogene) ou encore p Poly (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201). De préférence, un plasmide mis en oeuvre dans le cadre de la présente invention contient une origine de replication assurant l'initiation de la replication dans une cellule productrice et/ou une cellule hôte (par exemple, on retiendra l'origine ColEl pour un plasmide destiné à être produit dans E. coli et le système oriP/EBNAl si l'on désire qu'il soit autoreplicatif dans une cellule hôte mammifère, Lupton et Levine, 1985, Mol. Cell. Biol. 5, 2533-2542 ; Yates et al., Nature 313, 812-815). Il peut en outre comprendre un gène de sélection permettant de sélectionner ou identifier les cellules transfectées (complémentation d'une mutation d'auxotrophie, gène codant pour la résistance à un antibiotique...). Bien entendu, il peut comprendre des éléments supplémentaires améliorant son maintien et/ou sa stabilité dans une cellule donnée (séquence cer qui favorise le maintien monomérique d'un plasmide (Summers et Sherrat, 1984, Cell 36, 1097-1103, séquences d'intégration dans le génome cellulaire). S'agissant d'un vecteur viral, on peut envisager un vecteur dérivant d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus associé à Padénovirus (AAN), d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowlpox, canaripox, virus de la vaccine notamment de la souche MVA (Modified Virus Ankara) ou Copenhagen... etc) ou d'un foamyvirus. On aura de préférence recours à un vecteur non réplicatif et, éventuellement, non intégratif.
Les rétrovirus ont la propriété d'infecter et de s'intégrer majoritairement dans les cellules en division et à cet égard sont particulièrement appropriés pour l'application cancer. Un vecteur rétroviral convenant à la mise en oeuvre de la présente invention comporte les séquences terminales LTR, une région d'encapsidation et les séquences nucléotidiques codant pour l'activateur transcriptionnel dont l'expression est contrôlée par le promoteur rétroviral (dans le LTR 5') ou par un promoteur interne tel que cité ci-dessus. Il peut dériver d'un rétrovirus d'une origine quelconque (murin, primate, félin, humain etc..) et en particulier du MoMuLV (Moloney murine leukemia virus), MNS (Murine sarcoma virus) ou Friend murine rétrovirus (Fb29). Il est propagé dans une lignée d'encapsidation capable de fournir en trans les polypeptides viraux gag, pol et/ou env nécessaires à la constitution d'une particule virale. De telles lignées sont décrites dans la littérature (PA317, Psi CRIP GP + Am-12 etc.). Le vecteur rétroviral selon l'invention peut comporter des modifications notamment au niveau des LTRs (remplacement de la région promotrice par un promoteur eucaryote) ou de la région d'encapsidation (remplacement par une région d'encapsidation hétérologue, par exemple de type VL30) (voir les demandes françaises 94 08300 et 97 05203). Un vecteur adenoviral convient tout particulièrement pour l'expression de l'activateur transcriptionnel envisagé dans le cadre de la présente invention. On aura de préférence recours à un vecteur défectif ayant l'une des caractéristiques précitées. En particulier, les vecteurs adénoviraux recombinant (portant la cassette d'expression inductible du gène d'intérêt) et indépendant (portant la cassette d'expression de l'activateur transcriptionnel) sont de préférence tous deux déficients pour la fonction El par délétion de tout ou partie de la région El ou mutation non fonctionnelle. Le cas échéant, l'un ou l'autre ou les deux peuvent être en outre déficient(s) pour au moins l'une des fonctions E2, E4, Ll, L2, L3, L4 et/ou L5. De même, une délétion de tout ou partie de la région E3 peut être envisagée pour l'un ou les deux vecteurs.
Selon un mode de réalisation avantageux, les vecteurs viraux (vecteur adenoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur viral indépendant) faisant partie du système d'expression selon l'invention peuvent être sous la forme de vecteur ADN ou de particule virale infectieuse. La présente invention concerne également un vecteur adenoviral recombinant comprenant
(i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte, et
(ii) un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
Le vecteur adenoviral recombinant selon l'invention peut coder pour un activateur transcriptionnel ayant les caractéristiques définies auparavant qui, sous forme activé par un inducteur tel que décrit précédemment, a la capacité d'initier ou d'activer la transcription d'un gène contrôlé par un promoteur inductible comprenant une séquence cible spécifique dudit activateur transcriptionnel telle que décrite ci-dessus.
De manière alternative, le vecteur adenoviral recombinant selon l'invention peut coder pour un activateur transcriptionnel procaryotique et, notamment, un polypeptide comprenant un DLL et un domaine de liaison à l'ADN dérivé d'un répresseur de l'opéron tétracycline (tetR) et un domaine d'activation de la transcription quelconque. Il s'agit de préférence du polypeptide désigné dans la littérature «trans-activateur tétracycline» tTA (Gossen et Bujard, 1992, Proc Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-551) dans lequel le tetR isolé du transposon TnlO est fusionné en phase aux 130 acides aminés C-terminaux de la protéine virale VP16. Dans ce cas, on mettra en oeuvre un inducteur non naturel activant le tTA, tel que la doxycycline, la tétracycline ou un analogue agoniste. Bien entendu, les caractéristiques de la cassette d'expression inductible du gène d'intérêt sont les mêmes que précédemment, mis à part la présence d'une ou plusieurs séquence(s) cible(s) répondant à l'activateur transcriptionnel procaryotique. S'agissant de tTA, la séquence cible est constituée par l'opérateur tétracycline (tetO). Dans le cadre de la présente invention, on préfère tout particulièrement la combinaison "tet O - promoteur minimal" donnant lieu à un promoteur dont le niveau de base de la transcription est naturellement très faible mais activable par l'inducteur tTA et répressible par la tétracycline.
Il n'est pas nécessaire de revenir sur le squelette du vecteur adenoviral recombinant selon l'invention dans la mesure où il répond aux caractéristiques déjà mentionnées.
La présente invention concerne également une particule virale infectieuse comprenant un vecteur adenoviral recombinant selon l'invention.
Les techniques de préparation des vecteurs adénoviraux sont largement documentées dans la littérature. Dans un premier temps, le génome est reconstitué par recombinaison homologue dans la lignée 293 (voir notamment Graham et Prevect, 1991, Methods in Molecular Biology, Vol 7, Gène Transfer and Expression Protocols ; Ed E. J. Murray, The Human Press Inc, Clinton, NJ) ou dans Escherichia coli (Charrier et al., 1996, J. Virol. 70, 4805-4810 ; WO96/17070). Il est ensuite nécessaire de propager le vecteur afin de constituer un stock de particules virales le contenant. On utilise à cet effet des lignées de complémentation fournissant en trans les produits d'expression viraux pour lesquels le vecteur est defectif. Par exemple, les virus délétés de El peuvent être propagés dans la lignée 293, établie à partir de cellules de rein embryonnaire humain (Graham et al., 1977, J. Gen. Virol. 36, 59-72). Pour ce qui est des vecteurs de seconde génération, on peut avoir recours à des lignées complémentant deux fonctions virales essentielles, telles que celles décrites par Yeh et al. (1996, J. Virol. 70, 559-565), Krougliak et Graham (1995, Human Gène Therapy 6, 1575- 1586), Wang et al. (1995 Gène Therapy 2, 775-783), Lusky et al. (1998, J. Virol. 72, 2022-2033) et dans les demandes internationales WO94/28152 et WO97/04119. Une autre alternative repose sur l'emploi d'un élément viral supplémentaire, désigné "virus auxiliaire" pour complémenter au moins en partie les fonctions défectives d'un vecteur adenoviral recombinant. Les virus auxiliaires de l'art antérieur consistent en un génome adenoviral, éventuellement délété d'une région essentielle pour laquelle le vecteur recombinant ne nécessite pas de complémentation.
L'invention concerne également un procédé de préparation d'une particule virale, selon lequel :
(i) on introduit un vecteur adenoviral recombinant selon l'invention dans une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée,
(ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et
(iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire. Bien entendu, la particule virale peut être récupérée du surnageant de culture mais également des cellules. Une des méthodes couramment employée consiste à lyser les cellules par des cycles consécutifs de congélation/décongélation pour recueillir les virions dans le surnageant de lyse. Ceux-ci peuvent être amplifiés et purifiés selon les techniques de l'art (procédé chromatographique, ultracentrifugation notamment à travers un gradient de chlorure de césium...).
La présente invention concerne également une cellule eucaryote comprenant un système d'expression inductible, un vecteur adenoviral recombinant selon l'invention ou infectée par une particule virale selon l'invention. Aux fins de la présente invention, une telle cellule est constituée par toute cellule transfectable par un vecteur ou infectable par une particule virale, tels que définis ci-avant. Une cellule de mammifère et notamment humaine convient tout particulièrement. Il peut s'agir d'une cellule primaire ou tumorale d'une origine quelconque, notamment hématopoïétique (cellule souche totipotente, leucocyte, lymphocyte, monocyte ou macrophage...), musculaire (cellule satellite, myocyte, myoblaste, muscle lisse...), cardiaque, pulmonaire, trachéale, hépatique, épithéliale ou fibroblaste.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique un système d'expression inductible, un vecteur adenoviral recombinant, une particule virale ou une cellule hôte selon l'invention en association avec un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
Une composition selon l'invention est plus particulièrement destinée au traitement préventif ou curatif de maladies par thérapie génique (y compris immunothérapie) et s'adresse plus particulièrement aux maladies prolifératives (cancers, tumeurs, dysplasies...etc), aux maladies infectieuses et notamment virales (induites par les virus de l'hépatite B ou C, le HIV, l'herpès, les rétrovirus.... etc), aux maladies génétiques (mucoviscidose, myopathies, hémophilie, diabète...) et aux maladies cardiovasculaires (resténose, ischémie, dislipidémie...). Une composition selon l'invention peut être fabriquée de manière conventionnelle en vue d'une administration par voie locale, parentérale ou digestive. En particulier, on associe une quantité thérapeutiquement efficace de l'agent thérapeutique ou prophylactique à un support acceptable d'un point de vue pharmaceutique. Les voies d'administration envisageables sont multiples. On peut citer par exemple la voie intragastrique, sous-cutanée, intracardiaque, intramusculaire, intraveineuse, intraartérielle, intrapéritonéale, intratumorale, intranasale, intrapulmonaire ou intratrachéale. Pour ces trois derniers modes de réalisation, une administration par aérosol ou instillation est avantageuse. L'administration peut avoir lieu en dose unique ou répétée une ou plusieurs fois après un certain délai d'intervalle. La voie d'administration et les doses de virus appropriées varient en fonction de divers paramètres, par exemple, de l'individu, de la pathologie, du gène d'intérêt à transférer, de la voie d'administration. A titre indicatif, les préparations à base de particules virales peuvent être formulées sous forme de doses comprises entre 104 et 1014 ufp (unités formant des plages), avantageusement 105 et 10 ufp et, de préférence, 10 et 10 ufp. Lorsque l'on met en oeuvre un ou des vecteur(s), des doses comprenant de 0,01 à 100 mg d'ADN, de préférence 0,05 à 10 mg et, de manière tout à fait préférée, 0,5 à 5 mg peuvent être envisagées. La formulation peut également inclure un diluant, un adjuvant ou un excipient acceptable d'un point de vue pharmaceutique, de même que des agents de solubilisation, de stabilisation, de préservation. Une composition préférée est sous forme injectable. Elle peut être formulée en solution aqueuse, saline (phosphate, monosodique, disodique, magnésium, potassium....) ou isotonique. Elle peut être présentée en dose unique ou en multidose sous forme liquide ou sèche (poudre, lyophilisât...) susceptible d'être reconstituée de manière extamporanée par un diluant approprié.
La présente invention est également relative à l'utilisation thérapeutique ou prophylactique d'un système d'expression inductible, d'un vecteur adenoviral recombinant, d'une particule virale ou d'une cellule hôte selon l'invention pour la préparation d'un médicament destiné au transfert et à l'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte et, en particulier, au traitement du corps humain ou animal par thérapie génique. Selon une première possibilité, le médicament peut être administré directement in vivo (par exemple par injection intraveineuse, dans une tumeur accessible, dans les poumons par aérosol, dans le système vasculaire au moyen d'une sonde appropriée...). On peut également adopter l'approche ex vivo qui consiste à prélever des cellules du patient (cellules souches de la moelle osseuse, lymphocytes du sang périphérique, cellules musculaires...), de les transfecter ou infecter in vitro selon les techniques de l'art et de les réadminister au patient après une étape d'amplification éventuelle. La prévention et le traitement de nombreuses pathologies peuvent être envisagés. Une utilisation préférée consiste à traiter ou prévenir les cancers, tumeurs et maladies résultant d'une prolifération cellulaire non désirée. Parmi les applications envisageables, on peut citer les cancers du sein, de l'utérus (notamment ceux induits par les papillomas virus), de la prostate, du poumon, de la vessie, du foie, du colon, du pancréas, de l'estomac, de l'oesophage, du larynx du système nerveux central et du sang (lymphomes, leucémie etc.). Elle est également utile dans le cadre des maladies cardiovasculaires, par exemple pour inhiber ou retarder la prolifération des cellules de muscles lisses de la paroi vasculaire (resténose). Enfin pour ce qui est des maladies infectieuses, l'application au SIDA peut être envisagée.
L'invention s'étend également à une méthode pour le traitement des maladies par thérapie génique, caractérisée en ce que l'on administre à un organisme ou à une cellule hôte ayant besoin d'un tel traitement un système d'expression inductible, un vecteur adenoviral recombinant, une particule virale ou une cellule hôte selon l'invention.
Enfin, l'invention concerne également un activateur transcriptionnel comprenant un DLL et un domaine de trans-activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4. Un tel activateur transcriptionnel est obtenu en échangeant par les techniques de biologie moléculaire le domaine de liaison à l'ADN du récepteur stéroïdien par celui de Gal4 (en particulier porté par les résidus 1 à 74). Un hybride ERT ou GRdex et Gal4 est tout à fait préféré.
On indique que l'ensemble des dénominations utilisées dans la présente demande sont conventionnelles dans le domaine de Part et que la portée inclut aussi les équivalents fonctionnels, c'est à dire tout polypeptide, domaine, gène, composé obtenu par modification d'un polypeptide, domaine, gène, composé natif et présentant une activité de même nature, voire sensiblement augmentée.
La Figure 1 est une représentation schématique de la quantité de FIX produite 144 h après transfection transitoire des cellules 293 par les plasmides pTG13064 (CMV-GRdex), pTG6242 (LTR MMTV-FIX, sens) et pTG13063 (LTR MMTV-FIX, anti-sens).
La Figure 2 : Evaluation de l'effet Dose / Réponse Dexaméthasone dans des cellules A549. L'infection des cellules est réalisée avec une MOI = 50 avec AdTG13092 ou AdTG13088. L'induction par la dexaméthasone est réalisée en faisant varier la concentration de 10"9 à 10"7M.
La Figure 3 : Représentation schématique des constructions AdTG13075, AdTG13088, AdTG13092 et AdTG13245.
La Figure 4 (a, b, c et d) : Evaluation in vivo du système inductible Grdex / Dexaméthasone avec les différentes constructions testées dans les souris C57B1/6. Les valeurs présentées sont les moyennes des valeurs mesurées dans chacune des souris traitées.
La Figure 5 (a, b, c et d) : Evaluation in vivo du système inductible Grdex / Dexaméthasone avec les différentes constructions testées dans les souris SCID. Les valeurs présentées sont les moyennes des valeurs mesurées dans chacune des souris traitées.
La Figure 6 : Evaluation d'un effet Dose / Réponse Dexaméthasone in vivo dans des souris SCID.
La Figure 7 : Représentation schématique de vecteurs adénoviraux dérivant du plasmide pTg6401 de première et de deuxième générations.
La présente invention est illustrée, sans pour autant être limitée, par les exemples suivants.
EXEMPLES Les constructions décrites ci-dessous sont réalisées selon les techniques générales de génie génétique et de clonage moléculaire, détaillées dans Maniatis et al., (1989, Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY ou une édition plus récente) ou selon les recommandations du fabricant lorsqu'on utilise un kit commercial. Les étapes de clonage sont réalisées dans les souches E. coli 5K (hsdR, mer A), DH5α [(recAl, endAl, hodR17 (r-m-), supE44 thi-1, gyrA (nalr)] ou NM522 (supE, thi, Δ(lac-proAB), Δhsd5, (r-m-), (F' proAB, laclq, ZΔM15) et celles de recombinaison homologue dans la souche E. coli BJ 5183 (Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166, 557-580). S'agissant de la réparation des sites de restriction, la technique employée consiste en un remplissage des extrémités 5' protubérantes à l'aide du grand fragment de l'ADN polymérase I d'E. coli (Klenow, Boehringer Mannheim). Les fragments d'ADN sont purifiés à l'aide du kit de purification d'ADN GeneCleanlI (BiolOlInc). Par ailleurs, les fragments de génome adenoviral employés dans les différentes constructions décrites ci-après, sont indiqués précisément selon leur position dans la séquence nucléotidique du génome de l'Ad5 telle que divulguée dans la banque de données Genebank sous la référence M73260.
En ce qui concerne la biologie cellulaire, on a recours aux lignées cellulaires 293 (Graham et al, 1977, supra ; disponible à l'ATCC sous la référence CRL1573), A549 E1+ (WO94/28152), A549 (ATCC CCL-185) et Vero (ATCC CCL-81). H est entendu que d'autres lignées cellulaires peuvent être utilisées. Les cellules sont maintenues en culture à 37°C en atmosphère humide enrichie à 5% de CO2 dans du milieu DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Médium, Gibco BRL) complémenté avec 1 mM de glutamine, 1% d'acides aminés (Gibco BRL), 40μg/l de gentamycine et 10% de sérum de veau foetal (SVF,Gibco BRL). La transfection et la transduction des cellules est réalisée selon les techniques de l'art (précipitation au phosphate de calcium...)
EXEMPLE 1 : Construction d'un vecteur adenoviral co-exprimant ll''aaccttiivvaatteeuurr ttrraannscriptionnel ER T et le gène FIX régulé par les séquences ERE.
L'ADNc du gène sauvage ER est contenu dans le plasmide pSGl-HEO (Tora et al., 1989, EMBO J. 8, 1981-1989). Le domaine de liaison aux oestrogènes
T du récepteur ER (fragment Bam L-Xbaï) est remplacé par celui du mutant ER (G521R) porté par le fragment Notl-Xbal de pCre-ERT (Feil et al., 1996, Proc Natl. Acad. Sci. USA 93, 10887-10890). Les séquences ER sont insérées dans le site EcoKI du vecteur de transfert pTG6600. A titre indicatif, pTG6600 est un vecteur p polyll (Lathe et al., 1987, Gène 57, 193-201) dans lequel sont insérées les séquences Ad5 1 à 458, le promoteur précoce CMN, les séquences d'épissage hybrides trouvées dans le plasmide pCI (Promega Corp, comprenant le site donneur d'épissage de l'intron 1 du gène β-globine humaine et le site accepteur d'épissage du gène d'immunoglobuline de souris), les séquences de polyadénylation du virus SN40 et les séquences Ad5 3328-5788. Une telle construction est à la portée de l'homme de Part. Le vecteur ainsi obtenu pTG6237 contient la cassette d'expression CMN-ER présente dans la région El. La construction finale désignée pTG6246 est reconstituée par recombinaison homologue (Charrier et al., 1996, J. Nirol. 70, 4805-4810) entre le fragment Pacl- Bst EU isolé du vecteur précédent et pTG4656 linéarisé par Clal. Ce dernier est un plasmide adenoviral El" E3" contenant dans El le gène LacZ sous le contrôle du promoteur MLP (décrit dans la demande FR97 06757). Ainsi le génome adenoviral porté par pTG6246 comprend la cassette CMN-ER dans la région E 1 et est délété de la région E3.
L'ADΝc du FIX humain (Anson et al, 1984, EMBO J. 3, 1053-1060) est clone sous forme d'un fragment BamΗl isolé d'un plasmide de Part antérieur (par exemple décrit dans le brevet 88 14635) et inséré en aval du promoteur minimal TK-HSN précédé de la séquence ERE (Klein-Hitpass et al, 1986, Cell 46, 1053- 1061). La cassette est introduite dans le site Bglï de pTG4664 en orientation sens et antisens (donnant respectivement pTG13227 et pTG13228). Le plasmide pTG4664 comprend les nucléotides 25838 à 320004 de PAd5 délétés des nucléotides 27871 à 30748 de la région E3. Une recombinaison homologue avec le plasmide pTG6401 digéré par Sfrl (comportant le génome Ad5 délété des régions El et E3) permet de générer les vecteurs adénoviraux El" E3" portant la cassette inductible ERE/TKp-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3. La construction sens (correspondant au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13235 et la construction anti-sens pTG13236.
Les vecteurs doublement recombinants contenant les cassettes d'expression
CMN-ER et ERE/TKp-FIX à la place des régions El et E3 respectivement sont générés par recombinaison homologue entre les fragments portant la cassette inductible FIX isolés des vecteurs pTGl 3227 et pTGl 3228 et le vecteur pTG6246.
On obtient pTG13233 et pTG13234 selon l'orientation de la cassette inductible.
EXEMPLE 2 : Construction d'un vecteur adenoviral co-exprimant ll''aaccttiivvaatteeuurr ttrraannssccπriptionnel GR ex et le gène FIX régulé par les séquences GRE.
L'ADΝc du récepteur GR ex porté par le fragment EcoRI (2,7Kb) du plasmide pHGl (Kumar et al, 1987, Cell 51, 941-951) est clone dans le site EcόKL du vecteur pTG6600, pour donner pTG13064. Le vecteur adenoviral pTG13075 contenant la cassette d'expression CMNp-GR ex en remplacement de la région El et délété de la majorité de la région E3 est obtenu par recombinaison homologue entre le fragment Pacl-Bst EU isolé du vecteur précédent et pTG4656 linéarisé par CM.
Le fragment BamHl contenant P ADΝc du FIX humain est inséré en aval du LTR de MMTV contenant la séquence GRE (Cato et al, 1986, EMBO J. 5, 2237-2240). La cassette est ensuite introduite en orientation sens et antisens dans le site BgHl de pTG4664 bordant les séquences E3 délétées. Les vecteurs de transfert sont désignés pTG6242 (sens) et pTG13063 (anti-sens). Une recombinaison homologue avec le plasmide pTG6401 digéré par Sfrl (comportant le génome adenoviral délété des régions El et E3) permet de générer les vecteurs adénoviraux El" E3" portant la cassette inductible LTR MMTV-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3. La construction sens (identique au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13082 et la construction anti-sens pTG13088.
Une recombinaison homologue avec le plasmide pTG13075 permet de générer les vecteurs adénoviraux El" E3" portant la cassette inductible LTR MMTV-FIX en orientation sens et antisens dans la région E3 et la cassette CMV- GR ex dans la région El . La construction sens (identique au sens de transcription de E3) est dénommée pTG13083 et la construction anti-sens pTG13092 (sens de transcription inverse pour les cassettes FIX et GR ex).
EXEMPLE 3 : Construction d'un vecteur adenoviral co-exprimant l'activateur transcriptionnel VgEcR et le gène FTX régulé par les séquences 5xE/GRE.
Le plasmide pNgRXR (In Nitrogen) comprend les deux sous-unités composant l'activateur transcritionnel activable par l'ecdysone ou son analogue muristérone A. La première est composée du récepteur de l'ecdysone (VgEcR) modifié au niveau de trois acides aminés du domaine de liaison à P ADN de façon à obtenir une séquence analogue à celle du récepteur GR et fusionné en phase au domaine de trans-activation de VP16 et la seconde du récepteur de l'acide rétinoïque humain RXR (No et al, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 3346- 3351). Les deux ADNc codant pour VgEcR et RXR dirigés par les promoteurs CMV et RSV respectivement sont modifiés par introduction d'un intron en 5' des séquences codantes (intron de pCI pour CMVp- VgEcR et intron β-globine de lapin pour RSVp-RXR) et sont introduits dans la région El d'un vecteur adenoviral selon la technique précédente. Les séquences codant pour le FIX humain sont introduites en aval d'un promoteur inductible comprenant la séquence cible 5xE/GRE couplée au promoteur minimal Δhsp (pIND ; In Vitogen). Comme précédemment, la cassette est introduite dans les deux orientations dans le site BgUl de pTG4664. La recombinaison homologue avec pTG6401 digéré par Sfrl permet de générer les plasmides portant la cassette inductible dans la région E3 en orientation sens ou anti-sens.
On obtient le vecteur adenoviral doublement recombinant par recombinaison homologue avec le vecteur de transfert contenant les séquences VgEcR et RXR.
EXEMPLE 4 : Production des adénovirus.
Les vecteurs adénoviraux recombinants contenant les cassettes d'expression des activateurs et/ou du FIX sont libérés des plasmides correspondants (pTG13083, pTG13092, pTG13233, pTG13234...) par digestion Pacl avant d'être transfectés dans la lignée de complémentation 293. Le lysat cellulaire est récolté, soumis à trois étapes successives de congélation/décongélation afin de libérer les particules virales puis clarifié par centrifugation à 3500 rpm pendant 5 min. Les virions présents dans le surnageant peuvent être éventuellement amplifiés par passage sur une lignée permissive (293 ou A 549-E 1+) et purifiés sur gradient de chlorure de césium selon les techniques de Part. Le stock adenoviral est dialyse dans un tampon de formulation approprié tel que décrit dans WO98/02522 (par exemple saccharose IM, NaCl 150 mM, MgCl2 ImM, Tris-HCl 10 mM et Tween 80 0,1%). Le titre viral est déterminé en unités infectieuses par dosage de la protéine DBP par immunofluorescence (Lusky et al, 1998, J. Virol. 72, 2022-2032) ou en nombre de particules virales par mesure spectrophotométrique à 260 nm. Un vecteur contrôle est construit en insérant P ADNc du facteur TX humain sous le contrôle du promoteur CMV isolé du plasmide pCI (Proméga). La cassette d'expression constitutive est introduite dans la région E3, donnant pTG13231 (orientation sens) et pTG13232 (orientation anti-sens). Les virions sont produits selon la même méthodologie que ci-dessus.
Une recombinaison homologue entre les plasmides pTG13231 et pTG13232 et le plasmide pTG6401 linéarisé par Srβ permet d'obtenir respectivement les plasmides pTG13244 et pTG13245 portant la cassette d'expression constitutive CMN-FLX en orientation sens et antisens dans la région
E3.
EXEMPLE 5 : Evaluation in vitro du système inductible par GRdex.
Les vecteurs de transfert pTG13064, pTG6242 et pTG13063 portant respectivement les cassettes CMN-GRdex, LTR MMTV-FIX (sens) et LTR MMTV-FLX (anti-sens) sont transfectées de manière transitoire dans les cellules 293 (5μg d'ADN pour 106 cellules). En outre, le plasmide pTG13064 est co- transfecté avec soit pTG6242 ou pTG13063. Les cultures sont poursuivies en présence de dexaméthasone (10 M) ou en son absence. Les surnageants cellulaires sont prélevés 48, 96, 120 et 144 heures après transfection et la quantité de FIX produite est déterminée par ELISA (kit Asserachrom ; Diagnostica Stago). Les résultats présentés dans la Figure 1 montrent une induction de la production de FIX en présence de l'activateur GR cx activé par la dexaméthasone. Le récepteur exprimé par pTG13064 est donc fonctionnel dans la mesure où à l'état activé (en présence de dexaméthasone), il peut se fixer sur les motifs GRE du MMTV et induire la transcription du gène FIX. L'activité basale du système est très faible. En effet, la quantité de FLX produite en l'absence de dexaméthasone ou de pTG13064 est faible, voire négligeable. La cinétique d'expression du FIX en fonction du temps montre que le niveau de production maximal est atteint 120 h après la transfection. Au delà, la concentration stagne ce qui peut s'expliquer par l'état des cellules (à confluence) et un appauvrissement du milieu et probablement en dexaméthasone. L' efficacité du système a également été évalué par infection adénovirale en présence de dexaméthasone ou non. Les cellules hôtes non permissives Vero ou A549 sont infectées par les virions AdTG13083 ou AdTG13092 portant les cassettes CMV-GR ex et MMTN-FIX (sens pour le premier virus et anti-sens pour le second) ou co-infectées par les adénovirus AdTG13075 (CMV-GRdex) et AdTG13082 (MMTV-FIX sens) ou AdTG13088 (MMTV-FIX anti-sens). On utilise une MOI (multiplicité d'infection) de 100 pour les expériences d'infection et 50 pour chacun des virus dans les cas de co-infection. La quantité de FLX produite dans les surnageants de culture est dosée par ELISA. Dans les cellules Vero, l'expression du FIX n'est quantifiable qu'après infection par les virions AdTG13092 portant les deux cassettes et en présence de l'inducteur. Aucune induction n'a lieu en absence de dexaméthasone ou du récepteur GRdex. Il est à noter que ces cellules n'expriment pas le GR sauvage.
En cellule A549, le FIX est produit en présence de dexaméthasone dans les cellules infectées par AdTG13088 ou AdTG13092. Il est à noter que ces cellules expriment le GR sauvage. Cependant le niveau de FIX est différé dans le temps en l'absence de GRdex (virion AdTG13088).
En conclusion, le système inductible mettant en oeuvre le récepteur GRdex et la dexaméthasone est fonctionnel dans les constructions dans lesquelles la cassette inductible MMTV-FIX est en orientation anti-sens (AdTG13088 et AdTG13092). Par ailleurs, le système d'induction en cis (cassettes portées par un seul virus) est sensiblement plus productif qu'un système en trans mettant en oeuvre deux virus, notamment dans les cellules Vero.
Par ailleurs, l'étude a été reproduite en faisant varier les MOI. Les cellules Vero sont infectées par le virus AdTG13092 à une MOI de 10, 50 ou 100. A titre de contrôle, on utilise PAdTG13075. Le dosage du FIX est effectué 48 et 72 h après l'infection. On observe une production de FIX quelque soit la MOI employée, mais le niveau optimal d'expression est obtenu pour une MOI de 50. On a également fait varier la concentration en inducteur de 10"9 à 10"5 M. A forte concentration, la dexaméthasone s'avère cytotoxique se traduisant par une moindre expression du FIX. A faible concentration (10" M et au delà), l'induction η n'est pas efficace. L'optimum se situe à 10 M. Une analyse de l'effet « dose-réponse » plus détaillée a été conduite en faisant varier la concentration en Dexaméthasone de 10"9 à 10"7 M. Cette étude a été réalisée en cellules A549 exprimant le récepteur GR sauvage. Une activation peut par conséquent avoir lieu par le biais de ce récepteur activable par la Dexaméthasone. En réalité, on observe pour une concentration en Dexaméthasone de 10"8 M, que l'expression du Facteur IX ne peut être induite qu'après infection par le vecteur AdTG13092 codant pour le récepteur modifié GRdex. Cette concentration est ailleurs trop faible pour permettre P activation du récepteur GR endogène (Figure 1). Par conséquent, nous avons montré que l'induction du gène rapporteur peut se faire de façon contrôlée et sélective, y compris en présence du récepteur GR sauvage, en utilisant des doses de ligand plus faibles. Cet aspect est important en vue d'applications in vivo, conditions naturelles pour lesquelles le récepteur GR sauvage est exprimé.
EXEMPLE 6 : Evaluation in vivo du système inductible par GR ex.
Le virus AdTG13092 est injecté par voie intraveineuse à des souris immunocompétentes C57B1/6 à raison de 4x10 8 ou 8x108 ui. La dexaméthasone est administrée aux animaux par voie intrapéritonéale à une concentration de 100 μg pendant 3 jours consécutifs (à J0, Jl et J2). Les sérum sont prélevés régulièrement à partir du 3ième jour suivant l'infection et la quantité de FIX produite est évaluée par ELISA. On observe dans ces conditions une production significative de FIX. EXEMPLE 7 : Evaluation in vivo du système inductible GRdex dans des souris immunocompetentes.
Les virus AdTG13092, AdTG13088 et AdTG13245 sont injectés par voie intraveineuse à des souris immunocompetentes C57BI/6 à raison de 5X108 iu. Les virus AdTG13088 et AdTG13075 (Figure 3) sont également co-injectés à raison de 5X108 iu chacun.
La phase d'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 100 μg de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à J0-J1-J2, J21-J22-J23 et J42-J43-J44).
Les sérums des souris traitées sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du Facteur IX par la technique ELISA. Les résultats (Figures 4a, b, c et d) montrent que : l'expression du gène rapporteur Facteur IX est induite par la Dexaméthasone aussi bien après injection du vecteur AdTG13092 contenant la cassette d'expression du trans-activateur GRdex ainsi que la cassette inductible MMTV-FIX, qu'après co-injection de deux vecteurs portant chacun l'une de ces cassettes d'expression ; l'expression du FIX est également induite par la Dexaméthasone après injection du vecteur AdTG13088 seul. Dans ce cas, le niveau d'expression du FIX reste stable au cours des trois inductions. Cette induction est réalisée par le biais du récepteur GR sauvage, exprimé par les cellules murines et activable par la Dexaméthasone. Néanmoins, on peut noter qu'à la première induction, le niveau d'expression du FIX est 10 fois inférieur à celui obtenu dans le cas des souris exprimant le récepteur modifié GR ex ;
- aucune expression n'est détectée en absence de Dexaméthasone, quel que soit le vecteur injecté. On peut valablement en conclure que les quantités de glucocorticoïdes endogènes sont trop faibles pour permettre l'activation du promoteur MMTV via le récepteur GR sauvage ; - en présence du récepteur modifié GRdex, le niveau d'expression du FLX est comparable au promoteur constitutif CMV.
EXEMPLE 8 : Evaluation in vitro du système inductible par GRdexdans des souris immunodéficientes.
Les virus AdTG13092, AdTG13088 et AdTG13245 (voir Figure 3) sont injectés par voie intraveineuse à des souris immunodéficientes scid/scid à raison de 5X108 iu. Les virus AdTG13088 et AdTG13075 sont également co-injectés à raison de 5X108 iu chacun. L'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 100 μg de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à J0-J1-J2, J21 -J22-J23 et J42-I43-J44).
Les sérums des souris sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du FIX par la technique ELISA.
Les résultats (Figures 5 a, b, c et d) sont comparables à ceux observés dans le cas de souris immunocompetentes : - l'expression du FIX est induite après injection de Dexaméthasone chez les souris exprimant le récepteur modifié GRdex (injection AdTG13092 ou AdTG13088+AdTG13075). Le niveau d'induction chute d'un log après la deuxième et la troisième injections de ligand, puis reste stable pendant la durée de l'expérience (7 mois). Les niveaux d'induction sont comparables en cis (injection d'un vecteur adenoviral unique) et en trans (injection de deux vecteurs adénoviraux) ;
- l'expression du FIX est induite par la Dexaméthasone après injection du vecteur AdTG13088, par le biais du récepteur GR sauvage. Le niveau d'induction est stable au cours du temps ;
- aucune expression basale du FIX n'est détectée en absence de Dexaméthasone, quel que soit le vecteur injecté ;
- le niveau d'induction en présence du GRdex est comparable à l'expression du gène liée au promoteur constitutif CMN (du moins lors de la première induction) ;
- des études complémentaires ont permis de montrer la présence de PADΝ viral par Southern blot, ainsi que l'expression du GRdex par Northern blot, après injection du vecteur AdTG13092 ou AdTG13075 (au moins jusqu'à 56 jours après injection des vecteurs adénoviraux).
EXEMPLE 9 : Evaluation d'une dose-réponse in vivo dans des souris immunodéficientes..
Les vecteurs AdTG13092 et AdTG13088 sont injectés par voie intraveineuse à des souris immunodéficientes sciaVscid à raison de 5X108 iu. L'induction est réalisée en injectant par voie intrapéritonéale 50 ou 5 μg de Dexaméthasone pendant 3 jours consécutifs (à J0-J1-J2 et J21-J22-J23). Les sérums sont prélevés à différents temps afin d'évaluer la production du FIX par ELISA.
Des études préalables ont permis de montrer que l'injection de 3X100 μg, 3X50 μg ou 3X20 μg de Dexaméthasone permet d'obtenir des niveaux d'induction équivalents. Dans cette étude, les inventeurs ont identifié une dose de ligand permettant d'activer l'expression du gène rapporteur via le récepteur modifié GRdex apporté par un vecteur adenoviral (AdTG13092), mais incapable d'activer cette expression par le biais du GR endogène (injection AdTG13088).
L'injection de 3X5 μg de Dexaméthasone permet d'activer l'expression du FIX en présence du GRdcx, mais est incapable d'activer cette expression par P intermédiaire du GR endogène (Figure 6). Cette dose permet par conséquent d'activer l'expression du transgène de façon contrôlée et sélective, même en présence du récepteur sauvage.
EXEMPLE 10 : Mise au point d'un système d'expression inductible capable de prévenir le développement d'une réponse immunitaire après administration in vivo de vecteur adenoviral.
Les vecteurs adénoviraux représentent un système de choix pour transférer un gène thérapeutique chez un patient. Cependant, l'expression du transgène est généralement transitoire. Pour cette raison, il est nécessaire de répéter les administrations du vecteur adenoviral afin d'assurer une expression prolongée du gène thérapeutique. Malheureusement, une première injection d'adénovirus entraîne fréquemment le développement d'une réponse immunitaire qui empêche toute nouvelle administration. Dans le cadre de la présente invention, les inventeurs ont développé une nouvelle approche reposant sur l'expression d'une molécule immunosuppressive capable d'empêcher la mise en place de cette réponse immunitaire anti-adéno virus. Pour cela, les inventeurs ont inséré le gène codant pour l'interleukine-10 (DL-10) dans un système d'expression inductible porté par un vecteur adenoviral. L'expression régulée et contrôlée de l'IL-10 permet ainsi la mise au point de protocoles pour lesquels la réadministration de vecteurs portant le gène thérapeutique est possible.
a) Implication de la réponse immunitaire dans la persistance des adénovirus recombinants
- Réponse immunitaire cellulaire : Vecteur délété des régions El et E3
L'importance de la réponse immunitaire a été mise en évidence lors d'expériences réalisées dans des souris immunocompetentes ou immunodéficientes (Yang Y, F. A. Nunes, K. Berencsi, E. E. Furth, E. Gônczόl and J. M. Wilson. 1994, Proc Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4407-4411). Ainsi, l'expression du gène rapporteur lacZ est transitoire après injection du vecteur adenoviral dans des souris immunocompetentes, mais stable dans des souris immunodéficientes. Ces études suggèrent donc que les cellules transduites sont détruites par les lymphocytes T cytotoxiques (CTL). En outre, il a été montré que la génération des CTL est induite par les particules virales injectées, et non seulement par les protéines virales néo-synthétisées.
Vecteur délété des régions El, E3 etE4 ou E2a
Les délétions des régions E4 ou E2a font disparaître toute expression résiduelle de protéine virale. Toutefois, la toxicité n'est pas diminuée en éliminant la région E2a. Par contre la délétion de la région E4 conduit à une diminution significative de la toxicité hépatique après injection intraveineuse. Malgré une persistance de l'ADN, l'expression du transgène est toutefois souvent réduite de façon importante.
- Réponse immunitaire humorale
Plus de 85% de la population mondiale est immunisée contre l'adénovirus et possède des anticorps anti-adénovirus dirigés contre les sérotypes 2 ou 5. Si aucune ré-infection ne se produit, le titre en anticorps neutralisants chute pour atteindre un niveau indétectable au bout de 2 ans. Ces anticorps peuvent empêcher la fixation du virus sur le récepteur membranaire et sa translocation dans le cytoplasme. Quelles que soient les délétions du génome adenoviral, le système immunitaire humoral est susceptible de reconnaître les protéines de la capside virale et de produire des anticorps neutralisants anti-adénovirus. Des stratégies d'immunosuppression sont donc requises pour permettre une réadministration. b) Stratégie d'immunosuppression de la réponse immunitaire humorale
L'interleukine-10 est connue pour avoir des propriétés immunosuppressives et a montré des résultats prometteurs dans le cas des rejets de greffe et dans des traitements anti-inflammatoires. L'IL-10 est sécrétée par de nombreuses cellules (monocytes / macrophages, cellules T, cellules B après activation par un antigène) et a de nombreuses cellules cibles (dont les monocytes
/ macrophages, les cellules B, les cellules T, les neutrophiles et les cellules endothéliales). Elle a un effet pléïotropique et possède des activités immunostimulatrices ou immunosuppressives selon le type cellulaire. Les interleukines-10 humaine et de rat sont très homologues, 84 % d'homologie au niveau nucléotidique et 73% au niveau protéique.
L'IL-10 a un effet immunosuppresseur sur les monocytes/macrophages.
Elle inhibe la production des cytokines pro-inflammatoires et des chimiokines, ainsi que l'expression du CMH de classe II et des molécules de co-stimulation. Elle limite aussi la durée de la réponse inflammatoire des granulocytes et des éosinophiles.
A l'opposé, EL-10 stimule la viabilité, la sécrétion d'anticorps et l'expression du CMH de classe II des lymphocytes B. Elle possède également un rôle de stimulation sur les mastocytes et sur les cellules T CD8+. Globalement, PE - 10 a toutefois un très fort effet immunosuppresseur.
Les propriétés anti-inflammatoires et immunosuppressives de PIL-10 pourraient intervenir dans la suppression de la production d'anticorps neutralisants contre l'adénovirus recombinant. En effet, la co-injection d'adénovirus codant pour l'IL-10 et pour la β-galactosidase empêche l'induction de la réponse immunitaire contre le virus et la production de CTL, permettant ainsi une expression prolongée du gène rapporteur .
Cependant, une immunosuppression prolongée est associée à des effets secondaires non négligeables il est donc souhaitable d'obtenir une immunosuppression de façon transitoire et régulable. c) Système inductible selon l'invention
Le système que nous avons développé est basé sur l'induction par les hormones. En effet, celles-ci vont se fixer sur leur récepteur nucléaire, constitué d'un domaine de fixation à l'hormone, d'un domaine de fixation à l'ADN et d'un domaine de transactivation. Après changement conformationnel et fixation sur les éléments cibles localisés au niveau de l'ADN, la transcription du gène situé en aval du promoteur régulable sera ainsi activée. Afin d'éviter toutefois l'activation par les hormones endogènes, éléments non contrôlables, les inventeurs ont choisi d'utiliser des récepteurs modifiés au niveau du domaine de fixation à l'hormone. Ces récepteurs mutés tels que les récepteurs aux œstrogènes ou à la progestérone sont capables de répondre à des ligands exogènes synthétiques, mais pas aux hormones endogènes.
Les inventeurs ont développé un système basé sur le récepteur aux glucocorticoïdes modifié, GRdex, capable d'induire l'expression du transgène situé en aval des éléments GRE (Glucocorticoïd Responsive Elément) après activation par la dexaméthasone, mais pas par les glucocorticoïdes endogènes. Au cours de cette étude, différents vecteurs adénoviraux exprimant l'IL-10 de façon inductible ont été générés, afin d'évaluer leurs effets sur la réponse immunitaire anti- adénovirus.
d) Génération des vecteurs adénoviraux
Tous les vecteurs adénoviraux dérivent du plasmide pTg6401 comportant le génome de l'adénovirus humain de type 5 délété des nucléotides 459 à 3327 (région )E1) et des nucléotides 28 592 à 30 470 (région )E3).
Insert en El : Le gène modifié GRdex est introduit dans la région El du génome de l'adénovirus de type 5 par recombinaison homologue entre le plasmide pTg6401 et le plasmide de transfert contenant l'ADNc GRd6X sous contrôle du promoteur CMN (Cytomegalovirus), d'un intron chimérique (pCI, Promega) et d'un signal de polyadénylation du SN40.
Insert en E3 : L'ADΝc de PIL-10 de rat (Feng L, W.W. Tang, J.C. Chang and C.B. Wilson. 1993. Biochem. Biophys Res. Commun.. 192 :452-45) a été obtenu par PCR inverse sur les ARΝm totaux de cellules de rat au moyen des oligonucléotides OTG12237 (CTAGTCTAGA CCACCATGCT TGGCTCAGCA CTGCT=SEQ ID Ν° 1) et OTG12243 (TTTATAGCGG CCGCTCAATT TTTCATTTTG AGTG=SEQ ID N° 2), par 30 cycles de dénaturation (1 minute à 95°C), hybridation des amorces (1 minute à 65°C) et extension (1 minute à 72°C). L' ADNc est placé en aval de 4 éléments de réponse aux glucocorticoïdes GRE (Glucocorticoïd Responsive Elément) contenus dans le promoteur LTR du MMTV (Mouse Mammary Tumor Virus). Cette cassette d'expression est introduite dans le plasmide de transfert délété de la région E3 dans l'orientation anti-sens par rapport à la région E3 sauvage de l'adénovirus.
Une recombinaison homologue de ce vecteur de transfert avec les vecteurs adénoviraux Ad-GRdex ou ρTg6401 permet de générer respectivement soit un vecteur portant la cassette d'expression de l'activateur en El et la cassette inductible enE3 en orientation antisens (Ad-GRdex-MMTV/TL-10-E4 sauvage) soit un vecteur contenant uniquement la cassette d'induction en E3 (Ad-ΔEl- MMTV/TL10-E4 sauvage).
L'ADNc de l'EL-10 de rat a également été placé sous contrôle du promoteur CMV. Cette cassette d'expression constitutive a été insérée dans la région E3 de pTg6401 en orientation antisens (Ad-ΔEI-CMV/TLIO). Toutes les constructions de deuxième génération sont obtenues par recombinaison homologue entre le plasmide de transfert contenant les cadres de lecture 3 et 4 (ORF3,4) de la région E4 et les vecteurs de première génération précédents.
L'ensemble des constructions de première et de deuxième générations sont illustrées dans la Figure 7.
e) Evaluation de l'expression de l'IL-10 in vitro
Transfection transitoire dans des cellules 293 Les cellules 293 sont transfectées par les plasmides de transfert contenant les cassettes d'expression de Pinterleukine-10 de rat en présence ou non de la cassette d'expression de l'activateur GRdex. Elles sont mises en culture en présence ou non de dexaméthasone (10"7 M) en DMEM 10% SVF. Les surnageants sont prélevés à différents temps afin d'analyser l'expression du transgène.
Validation in vitro des adénovirus recombinants dans des cellules A549 et VERO
Les cellules A549 et VERO sont ensemencées la veille à 3.105 cellules dans des plaques de 6 puits. Les cellules sont infectées à une MOI de 50 avec les différents préstocks viraux dans 250 μl DMEM 2% SVF. Après 30 minutes d'adsorption à 37°C, 3ml de DMEM 2% SVF sont rajoutés sur les cellules en présence ou non de dexaméthasone 10"7M. Les surnageants sont prélevés à différents temps afin d'analyser l'expression du transgène.
Quantification de l 'expression de l 'IL- 10 de rat par test ELISA (Enzyme
Linked Immunosorbent Assay)
La détection de PIL-10 de rat est réalisée à l'aide du kit OptEIA™ (Pharmingen). Les kits sont utilisés selon les spécifications des fabricants.
L'induction de l'IL-10 par la dexaméthasone a été évaluée par transfection transitoire des plasmides de transfert dans des cellule 293. La capacité d'induction est analysée en co-transfectant le vecteur de transfert MMTV-ILIO avec le vecteur exprimant le trans-activateur GRdex. La transfection du plasmide MMTV-IL10 seul indiquera le niveau d'expression de l'IL-10 en absence du trans-activateur. De plus, le niveau d'induction est comparé à l'expression constitutive de PIL-10 sous contrôle du promoteur CMN, en transfectant également ce plasmide dans les cellules 293. L'induction est réalisée en présence ou non de dexaméthasone à une concentration de 107 M. Les surnageants de culture sont prélevés 72 et 120 heures après la transfection afin de quantifier PIL-10 par kit ELIS A . La co-transfection des plasmides MMTN-ILIO et GRdex en présence de dexaméthasone permet l'induction de PIL-10 (50 ng / ml à 120 H post-transfection).
Les inventeurs ont démontré que l'apport du trans-activateur GRdex et du ligand dexaméthasone permet une induction de l'expression de l'IL-10 sous contrôle du promoteur inductible MMTV. L'efficacité d'induction de l'IL-10 par la dexaméthasone couplée au GRdex a été évaluée in vitro par infection des cellules humaines A549 et des cellules simiennes VERO avec les vecteurs Ad-MMTV-ILIO ± AdGRdex ou Ad-GRdex- MMTV-IL10. Ces deux types d'infection permettent d'évaluer l'efficacité d'induction en trans ou en cis. Les cultures cellulaires sont réalisées en présence ou non de dexaméthasone 10"7 M. Les quantités d'IL-10 obtenues seront comparées à celle obtenues après infection par Ad-CMNIL-10 exprimant cette cytokine de façon constitutive. D'autre part, l'induction de PE -IO est comparée à celle du facteur IX humain inséré dans les mêmes constructions, évaluées in vitro au préalable. Les surnageants sont prélevés à 24, 48, 72 et 96 heures post-infection afin de quantifier l'IL-10 et le facteur IX produits, au moyen de kits ELIS A .
En cellules VERO, l'expression de P IL- 10 est induite lorsque les cellules sont co-infectées par Ad-MMTV-ILIO + Ad-CMV-GRdex en présence de dexaméthasone, pour atteindre 50,8 ng/ml 96 heures après infection. En absence du ligand, l'IL-10 est à peine détectable (1,2 ng/ml). Au contraire, en absence du trans-activateur GRdex, aucune induction significative de l'expression de l'IL-10 ne peut être notée (3 ng/ml en présence de dexaméthasone, correspondant à l'expression résiduelle obtenue en transfection transitoire ; 0,7 ng/ml en absence de dexaméthasone).
Les inventeurs ont donc pu démontrer qu'en cellules VERO, l'expression de PIL-10 peut être induite par la dexaméthasone couplée au GRdex en « trans », lorsque les deux cassettes d'expression sont portées par deux vecteurs adénoviraux différents.
En cellules A549, ils ont également pu vérifier la fonctionnalité du système inductible en « trans ». En effet, la concentration en EL- 10 atteint 32,3 ng/ml en présence de dexaméthasone après co-infection par les vecteurs Ad-MMTV-ILIO + Ad-CMV-GRdex. En absence de ligand, la cytokdne est indétectable. L'expression de PIL-10 est également induite par la dexaméthasone après infection par le vecteur Ad-MMTV-ILIO seul. Cette activation se fait par le biais du récepteur GR sauvage exprimé par les cellules A549.

Claims

RENENDICATIONS
1. Système d'expression inductible comprenant :
(i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel d'origine eucaryote ou virale, placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte, et
(ii) un vecteur adenoviral recombinant comportant un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
2. Système d'expression selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel comprend au moins un domaine de trans-activation, un domaine de liaison à l'ADN et un domaine de liaison au ligand (DLL).
3. Système d'expression selon la revendication 2, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel comporte tout ou partie d'un domaine dérivé d'un récepteur d'hormones stéroïdes choisi parmi le groupe constitué par les récepteurs oestrogène (ER), glucocorticoïde (GR), progestérone (PR), Vitamine D, ecdysone (EcR), minéralocorticoïde, androgène, hormone thyroïde, acide rétinoïque et acide rétinoïque X ou encore d'une immunophiline ou d'un récepteur aryl hydrocarbon (AhR).
4. Système d'expression selon la revendication 3, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel est choisi parmi :
(i) un polypeptide désigné GR ex comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivés d'un récepteur aux glucocorticoïdes, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de l'isoleucine en position 747 par une thréonine ;
(ii) un polypeptide désigné ER comprenant un domaine de liaison à l'ADN, un domaine de trans-activation et un DLL dérivé d'un récepteur à l'oestrogène, ledit récepteur étant modifié dans son DLL, notamment par substitution de la glycine en position 521 par une arginine ;
(iii) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un DLL dérivé du récepteur à l'ecdysone, un domaine de liaison à PADN hybride dérivé de ceux des récepteurs EcR et GR et un domaine de trans-activation dérivé de la protéine virale VP 16 et un second polypeptide dérivé de la protéine USP de drosophile ou d'un homologue tel que le récepteur de l'acide rétinoïque X (RXR) humain ;
(iv) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide comportant un domaine de liaison à l'ADN dérivé du facteur de transcription ZFHD1 et un DLL dérivé de immunophiline FKBP12 et un second polypeptide comportant un domaine de trans-activation dérivé du facteur NFKB p65 et un DLL dérivé de FRAP (FKBP12-rapamycine- associated protein) ; et
(v) un activateur transcriptionnel comprenant un premier polypeptide dérivé du récepteur AhR et un second polypeptide dérivé de la protéine Arnt (aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator).
5. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce en ce que ledit activateur transcriptionnel comprend un DLL et un domaine de trans- activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4.
6. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que ledit activateur transcriptionnel est activé par liaison d'un inducteur non naturel et n'est pas ou peu activé par un composé humain naturel.
7. Système d'expression selon la revendication 6, caractérisé en ce que ledit inducteur non naturel est une substance synthétique administrable par voie orale.
8. Système d'expression selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit inducteur est choisi parmi le groupe constitué par la dexaméthasone, le tamoxifène, le muristérone A, l'ecdysone, la rapamycine et le 2,3,7,8-tétrachlorodibenzo-p- dioxine ou un analogue de ces composés.
9. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt code pour un ARN anti-sens, un ribozyme, ou encore un polypeptide d'intérêt.
10. Système d'expression selon la revendication 9, caractérisé en ce que ledit polypeptide d'intérêt est choisi parmi le groupe constitué par les chémokines, les cytokines, les récepteurs cellulaires, les ligands, les facteurs de coagulation, la protéine CFTR, l'insuline, la dystrophine, les facteurs de croissance, les enzymes, les inhibiteurs d'enzyme, les polypeptides à effet anti-tumoral, les polypeptides capables d'inhiber une infection bactérienne, parasitaire ou virale, les polypeptides agissant sur l'apoptose, les agents cytostatiques, les immunoglobulines, les apolipoprotéines, les produits cytotoxiques, les produits d'expression des gènes suppresseurs de tumeurs, les antigènes associés aux tumeurs, les immunotoxines, les inhibiteurs d'angiogénèse et les marqueurs.
11. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce ledit promoteur inductible comprend une ou plusieurs séquence(s) cible(s) répondant à un activateur transcriptionnel tel que défini dans l'une des revendications 2 à 8.
12. Système d'expression selon la revendication 11, caractérisé en ce que ladite séquence cible est une séquence ERE, GRE, EcR, UAS, 5xE/GRE, XRE ou une séquence cible répondant au facteur de transcription ZFDH-1.
13. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques et leurs éléments de régulation sont portés par ledit vecteur adenoviral recombinant.
14. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques et leurs éléments de régulation sont portés par un vecteur d'expression indépendant autre que ledit vecteur adenoviral recombinant.
15. Système d'expression selon la revendication 14, caractérisé en ce que ledit vecteur indépendant est un vecteur synthétique, un plasmide ou un vecteur viral, notamment dérivé d'un adénovirus, d'un rétrovirus, d'un virus associé à l'adénovirus (AAV), d'un virus de l'herpès, d'un alphavirus, d'un parvovirus, d'un poxvirus (fowlpox, canaripox, virus de la vaccine..) ou d'un foamyvirus.
16. Système d'expression selon l'une des revendications 13 à 15, caractérisé en ce que ledit vecteur adenoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur adenoviral indépendant sont déficients pour la fonction El par délétion de tout ou partie de la région El ou mutation non fonctionnelle de cette dernière.
17. Système d'expression selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit vecteur adenoviral recombinant et/ou ledit vecteur adenoviral indépendant est/sont en outre déficient(s) pour au moins l'une des fonctions E2, E4, Ll, L2, L3, L4 et/ou L5.
18. Système d'expression selon la revendication 16 ou 17, caractérisé en ce que ledit vecteur adenoviral recombinant et/ou ledit vecteur adenoviral indépendant est/sont en outre dépourvu(s) de tout ou partie de la région non essentielle E3.
19. Système d'expression selon l'une des revendications 1 à 18, caractérisé en ce que ledit vecteur adenoviral recombinant et, le cas échéant, ledit vecteur indépendant sont sous forme de particules virales infectieuses.
20. Vecteur adenoviral recombinant comprenant
(i) les séquences nucléotidiques codant pour un activateur transcriptionnel placées sous le contrôle des éléments de régulation appropriés à leur expression dans une cellule ou un organisme hôte, et (ii) un gène d'intérêt placé sous le contrôle d'un promoteur inductible susceptible d'être activé en trans par ledit activateur transcriptionnel.
21. Vecteur adenoviral recombinant selon la revendication 20, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques codent pour un activateur transcriptionnel selon l'une des revendications 2 à 6 ou pour un activateur transcriptionnel procaryotique, notamment un polypeptide comprenant un DLL et un domaine de liaison à l'ADN dérivé d'un répresseur de Popéron tétracycline.
22. Vecteur adenoviral recombinant selon la revendication 21, caractérisé en ce que lesdites séquences nucléotidiques codent pour le polypeptide tTA comprenant un répresseur de Popéron tétracycline (tetR) fusionné en phase à un domaine d'activation de la transcription dérivé de la protéine virale VP16.
23. Vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 22, caractérisé en ce que ledit inducteur non naturel est tel que défini dans la revendication 7 ou 8 ou est constitué par la doxycycline ou la tétracycline.
24. Vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 23, caractérisé en ce que ledit gène d'intérêt est tel que défini dans la revendication 9 ou 10.
25. Vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 24, caractérisé en ce que ledit promoteur inductible est tel que défini dans la revendication 11 ou 12 ou comprend une ou plusieurs séquence(s) cible(s) tetO.
26. Vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 25, caractérisé en ce que ledit vecteur adenoviral recombinant est tel que défini dans l'une des revendications 16 à 18.
27. Particule virale infectieuse comprenant un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26.
28. Procédé de préparation d'une particule virale selon la revendication 27, dans lequel : (i) on introduit un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26 dans une cellule de complémentation capable de complémenter en trans ledit vecteur, de manière à obtenir une cellule de complémentation transfectée, (ii) on cultive ladite cellule de complémentation transfectée dans des conditions appropriées pour permettre la production de ladite particule virale, et (iii) on récupère ladite particule virale dans la culture cellulaire.
29. Cellule eucaryote comprenant un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26 ou une particule virale infectieuse selon la revendication 27.
30. Composition pharmaceutique comprenant un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou une cellule eucaryote selon la revendication 29 et un véhicule acceptable d'un point de vue pharmaceutique.
31. Composition pharmaceutique selon la revendication 30, caractérisée en ce en ce qu'elle est sous forme injectable.
32. Utilisation d'un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, d'un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou d'une cellule eucaryote selon la revendication 29, pour la préparation d'un médicament destiné au transfert et à l'expression dudit gène d'intérêt dans une cellule ou un organisme hôte.
33. Utilisation d'un système d'expression selon l'une des revendications 1 à 19, d'un vecteur adenoviral recombinant selon l'une des revendications 20 à 26, d'une particule virale infectieuse selon la revendication 27 ou d'une cellule eucaryote selon la revendication 29, pour la préparation d'un médicament destiné au traitement des maladies par thérapie génique.
34. Activateur transcriptionnel comprenant un DLL et un domaine de trans- activation dérivé d'un récepteur stéroïdien et un domaine de liaison à l'ADN hétérologue, notamment dérivé de la protéine de levure Gal4.
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